JP2012503992A - 酵母における異種性Ｆｅ−Ｓ酵素活性の増大 - Google Patents

Abstract

その活性にＦｅ−Ｓクラスターの結合を必要とする異種性タンパク質の活性を上昇させる酵母株をエンジニアリングした。前記酵母株は、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質の活性を低下させる。異種性真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼおよびＦｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼの活性を上昇させ、したがってバリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸（ビタミンＢ５）、イソブタノール、２−ブタノン、および２−ブタノールなど、これらの酵素を含む生合成経路を使用して作製される生成物の生成を向上させた。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００８年９月２９日出願の米国仮特許出願第６１／１００，８０１号明細書および２００８年９月２９日の米国仮特許出願第６１／１００，８０６号明細書に基づくものであって、それらの優先権の利益を主張するものである。それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、活性化に鉄−硫黄クラスターを必要とするタンパク質の産業微生物学および発現の分野に関する。さらに詳細には、酵母細胞における異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質活性の発現が、特定の宿主遺伝子不活性化により改善される。

商用製品を発酵生成するための酵母のエンジニアリングは、活発で成長している分野である。いくつかの製品を生合成するためにエンジニアリングされた酵素経路には、活性に鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスターの結合を必要とする酵素が含まれる。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）は一例である。ＤＨＡＤは、バリン、イソロイシン、ロイシン、およびパントテン酸（ビタミンＢ５）を生成する天然生合成経路の一部分である。微生物による分枝鎖アミノ酸またはパントテン酸の生成の向上には、ＤＨＡＤ活性の発現の増大が望ましい。さらに、ＤＨＡＤが触媒として働く２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換は、複数のイソブタノール生合成経路における共通のステップであり、同時係属中の特許文献１に開示される。そこには、イソブタノール生成用組換え微生物のエンジリアリングが開示される。イソブタノールは燃料添加剤として有用であり、その利用可能性によって、石油化学燃料の需要を低減することができる。

ジオールデヒドラターゼは、２−ブタノンおよび２−ブタノールを生成するための生合成経路において酵素活性を実現するものであり、同時係属中の特許文献２に開示される。ブタンジオールデヒドラターゼは、それが補酵素Ｂ−１２に非依存性であるため、この経路における発現に有用であることが、特許文献３に開示される。Ｂ１２非依存性ブタンジオールデヒドラターゼの活性化に必要とされるＦｅ−Ｓクラスタータンパク質であるジオールデヒドラターゼレアクティバーゼも、特許文献３に開示される。メチルエチルケトン（ＭＥＫ）とも呼ばれる２−ブタノンは、酸化反応の広く使用される溶媒、抽出溶媒、およびアクチベーター、ならびに２−ブタノールの化学合成用の基質である。２−ブタノールは燃料添加剤として有用であり、その利用可能性によって、石油化学燃料の需要を低減することができる。

米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書 米国特許出願公開第２００７−０２９２９２７（Ａ１）号明細書 米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書

Ｆｅ−Ｓクラスター含有酵素を含む経路で合成される化合物の生成を改善するには、この酵素活性を目的の生成宿主において高いレベルで発現させることができる宿主細胞を提供することが望ましい。商業的に関連性のあるいくつかの細菌および酵母は、Ｆｅ−Ｓクラスター含有タンパク質の活性を発現させることができるが、この活性は、導入された生合成経路を向上させるのに商業的に有用なレベルをはるかに下回るレベルである。したがって、Ｆｅ−Ｓを必要とする導入された経路を向上させるのに十分に高いレベルでＦｅ−Ｓクラスター含有タンパク質の活性を発現させることができる宿主細胞を発見することに対する需要がある。異種性Ｆｅ−Ｓクラスター含有酵素の高い機能発現を得ることは、クラスターの利用可能性とアポタンパク質への適切な添加とを含むＦｅ−Ｓクラスターの要件のため問題となる。

本明細書には、組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質を含み、酵母宿主は、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の発現を低下させる組換え酵母宿主細胞が記載されている。

組換え酵母細胞は、イソブタノール、２−ブタノール、および２−ブタノンを含めて製品の生成に適切な条件下で増殖させることができる。

一態様において、組換え酵母細胞は、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質をコードする遺伝子における分裂を含む。

別の態様において、内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、亜硫酸還元酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビオチン合成酵素、アコニターゼ、ホモアコニターゼ、リポ酸合成酵素、フェレドキシン成熟、ＮＡＤＨユビキノン酸化還元酵素、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ユビキノール−シトクロム−ｃ還元酵素、ＡＢＣタンパク質Ｒｌｉ１、ＮＴＰアーゼＮｂｐ３５、およびヒドロゲナーゼ様タンパク質からなる群から選択される。

別の態様において、酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される。

別の態様において、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質は、ミトコンドリアにおいて発現され、別の実施形態において、内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性およびイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性からなる群から選択される活性を有する。

別の態様において、宿主細胞は、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。

いくつかの実施形態において、少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質は、真菌の２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼおよび植物の２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼからなる群から選択される。一実施形態において、異種性の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼは、サイトゾルにおいて発現される。一実施形態において、異種性の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼは、Ｅ値＜１０^−５の表９のプロファイルＨＭＭに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ポリペプチドは、配列番号１７９に対応するストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素のアミノ酸配列の５６位、１２９位、および２０１位に対応する保存されたシステイン３種類すべてをさらに含む。一実施形態において、異種性の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼは、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一実施形態において、異種性の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いて、配列番号１１４と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

別の態様において、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法が記載され、前記方法は、
ａ）（１）２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１種の異種性遺伝子を含む組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性を低下させる組換え酵母宿主細胞；および（２）２，３−ジヒドロキシイソバレレートの供給源を準備するステップと、
ｂ）（ａ）の組換え宿主細胞を前記２，３−ジヒドロキシイソバレレートの供給源と共に、２，３−ジヒドロキシイソバレレートが宿主細胞によってα−ケトイソバレレートに変換される条件下で増殖させるステップとを含む。

別の態様において、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換方法が記載され、前記方法は、
ａ）（１）Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼをコードする少なくとも１種の異種性遺伝子を含む組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性を低下させる組換え酵母宿主細胞；および（２）２，３−ブタンジオールの供給源を準備するステップと、
ｂ）（ａ）の組換え宿主細胞を前記２，３−ブタンジオールの供給源と共に、２，３−ブタンジオールが宿主細胞によって２−ブタノンに変換される条件下で増殖させるステップと
を含む。

また、イソブタノールの生成方法であって、本明細書に開示する組換え酵母宿主細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップを含む方法も記載される。

他の実施形態において、少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質は、Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性を有する少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有するプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼである。

いくつかの実施形態において、細胞は２−ブタノールを生成し、いくつかの実施形態において、細胞は２−ブタノンを生成する。いくつかの実施形態において、細胞は２−ブタノール生合成経路を含み、いくつかの実施形態において、細胞は２−ブタノン生合成経路を含む。

本出願の一部分をなす以下の詳細な説明、図面、および添付の配列の説明から、本発明をさらに詳しく理解することができる。

イソブタノール生成の生合成経路を示す。 ２−ブタノンおよび２−ブタノール生成の生合成経路を示す。

表９は、実施例１に記載するように調製され、アッセイされた機能を有する酵素に基づくジヒドロキシ酸デヒドラターゼのプロファイルＨＭＭの表である。表９は、本明細書と共に電子媒体で提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

以下の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ」）に従うものであり、Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ） Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５ （１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（Ｒｕｌｅｓ ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびにＳｅｃｔｉｏｎ ２０８およびＡｎｎｅｘ Ｃ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号およびフォーマットは、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２に記載の規則に従う。

配列番号：１７は、合成ｒｄｈｔＡＢ配列である。

配列番号：１８〜２１および３０〜３３は、本明細書の実施例に記載のように使用されるＰＣＲ、クローニング、または配列解析用プライマーである。

配列番号：２２は、デュアルターミネーター配列である。

配列番号：２３は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＡＤＨターミネーターである。

配列番号：２４は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＣＹＣ１ターミネーターである。

配列番号：２５は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＦＢＡプロモーターである。

配列番号：２６は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＧＰＭプロモーターである。

配列番号：２９は、ｐＮＹ１３ベクターである。

配列番号：３４は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＣＵＰ１プロモーターである。

配列番号：１７３は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のＩＬＶ３ ＤＨＡＤのコドン最適化コード領域である。

酵母宿主細胞における外来Ｆｅ−Ｓ含有タンパク質は、内因性Ｆｅ−Ｓ含有タンパク質の発現が阻害または妨害されるとき高い活性レベルを示すという発見を、本明細書に開示する。本発明は、Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質である少なくとも１種の異種性タンパク質の発現を実現するようにエンジニアリングされ、かつ少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の発現を低下させるようにエンジニアリングされたた組換え酵母細胞に関する。これらの細胞において、異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性は、酵素活性を含む生合成経路で作製される製品の生成が改善されるように改善される。Ｆｅ−Ｓタンパク質を含む経路による有用な商業製品の例としては、バリン、イソロイシン、ロイシン、パントテン酸、イソブタノール、２−ブタノンおよび２−ブタノールが挙げられる。

以下の略語および定義は、本明細書および特許請求の範囲の解釈に使用されることになる。

本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの他の何らかの変形は、非排他的な包含を網羅するものとする。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないまたはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、もしくは装置に固有でない他の要素を含むことができる。さらに、別段の明示的記載のない限り、「または」は、包含的またはを意味するが、排他的またはを意味するものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満足される：Ａは真であり（または存在する）かつＢは偽であり（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在しない）かつＢは真であり（または存在する）、ならびにＡとＢが共に真で
ある（または存在する）。

また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、元素または成分の場合の数（すなわち、出現頻度）に関して非制限的であるものとする。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、元素または成分の単数形は、数が明らかに単数であるものとする場合を除いて複数形も包含する。

本明細書では、「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を指すものではなく、本明細書および特許請求の範囲に記載するように可能な実施形態をすべて包含するものである。

本明細書では、本発明の材料または反応物質の使用量を修飾する「約」という用語は、例えば実社会で濃縮物または使用溶液を作製するのに使用される典型的な測定手順および液体取扱い手順；これらの手順における不注意による誤り；組成物の作製または方法の実施に使用する材料の製造、供給源、または純度の差異などによって起こり得る数値量のばらつきを指す。「約」という用語は、特定の初期の混合物によって生ずる組成物の異なる平衡条件のために異なる量も包含する。「約」という用語で修飾されていようがいまいが、特許請求の範囲は、量に対して等価なものを含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。

「Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質」という用語は、鉄−硫黄クラスターを結合し、その活性にクラスターの結合を必要とするタンパク質である。

「２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤ」という用語は、活性に結合［２Ｆｅ−２Ｓ］^２＋クラスターを必要とするＤＨＡＤ酵素を指す。

「Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ」という用語は、活性に結合Ｆｅ−Ｓクラスターを必要とするプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼを指す。

「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールをピルベートから生成するための酵素経路を指す。

「２−ブタノール生合成経路」という用語は、２−ブタノールをピルベートから生成するための酵素経路を指す。

「２−ブタノン生合成経路」という用語は、２−ブタノンをピルベートから生成するための酵素経路を指す。

ＤＨＡＤとも略される「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートをα−ケトイソバレレートに変換する酵素を指す。

「ジオールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」とも呼ばれる「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（または複数のポリペプチド）を指す。補因子アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２またはビタミンＢ１２とも呼ばれるが、ビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２ではない他の形のコバラミンを意味することもある）を利用しないブタンジオールデヒドラターゼは、Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質であるジオールデヒドラターゼレアクティバーゼとの会合を必要とする補酵素Ｂ１２非依存性ジオールデヒドラターゼである。Ｂ１２非依存性ジオールデヒドラターゼの例としては、クロストリジウム・グライコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）（Ｈａｒｔｍａｎｉｓら、（１９８６年） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４５巻：１４４〜１５２頁）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（タンパク質配列番号：１９１；コード領域配列番号：１９０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、（２００４年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻：４６３５〜４６４５頁）、およびロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）（コーディング：配列番号：１５；タンパク質：配列番号：４３；同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示される）に由来するものが挙げられる。

「ジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ」または「ブタンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ」とも呼ばれる「プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ」という用語は、触媒作用時に自殺不活性化を受ける酵素であるジオールデヒドラターゼの再活性化因子を指す。補酵素Ｂ１２非依存性ジオールデヒドラターゼを伴うジオールデヒドラターゼレアクティバーゼは、Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質とすることができる。例としては、クロストリジウム・グライコリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ）（Ｈａｒｔｍａｎｉｓら、（１９８６年） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４５巻：１４４〜１５２頁）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ） （タンパク質配列番号：１９３；コード領域配列番号：１９２；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、（２００４年） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻：４６３５〜４６４５頁）、およびロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）（コーディング：配列番号：１６；タンパク質：配列番号：４４；共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示される）に由来するものが挙げられる。

細胞宿主におけるタンパク質の発現に適用されるような「発現の低下」という用語は、タンパク質の活性が、野生型に比べて（例えば、アンチセンス技術と同様に）減少し、または例えば遺伝子破壊、欠損、もしくは不活性化と同様に実質的になくなる状況を包含することになる。

「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主有機体による代謝が可能な炭素源、特に単糖、オリゴ糖、多糖、および１炭素基質またはそれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。

「遺伝子」という用語は、（５′非コード配列）の直前に制御配列および（３′非コード配列）の後にコード配列を場合によっては含む、特定のタンパク質として発現することが可能な核酸断片を指す。「ネイティブ遺伝子」は、それ独自の制御配列を有する自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」はネイティブ遺伝子でなく、自然界で共には見られない制御およびコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列とコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界に見られる様式とは異なる様式で配置された制御配列とコード配列を含んでもよい。「内在性遺伝子」は、有機体のゲノムのその天然の位置におけるネイティブ遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種性遺伝子」は、宿主有機体に通常は見られないが、遺伝子移入により宿主有機体中に導入されている遺伝子を指す。「異種性遺伝子」は、ネイティブコード領域またはその一部分を含む。これは、対応するネイティブ遺伝子と異なる形で供給源の有機体に再導入される。例えば、異種性遺伝子は、ネイティブ宿主に再導入される非ネイティブ制御領域を含むキメラ遺伝子の一部分であるネイティブコード領域を含むことができる。また、外来遺伝子が、非ネイティブ有機体に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むこともできる。「導入遺伝子」は、形質転換手順でゲノムに導入された遺伝子である。

本明細書では、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５′非コード配列）、範囲内、または下流（３′非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含むことができる。

「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３′に位置する。プロモーターは、全体としてネイティブ遺伝子に由来し、または自然界に見られる様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成され、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。様々なプロモーターは、様々なタイプの組織もしくは細胞において、または様々な発達段階で、または様々な環境もしくは生理的状態に応答して、遺伝子の発現を指示できることを当業者は理解している。大部分のタイプの細胞において大部分の場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、通常「構成プロモーター」と呼ばれる。大部分の場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有する場合があることもさらに認識される。

「機能的に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現をもたらすことができるとき（すなわち、コード配列はプロモーターの転写調節下にあるということ）、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結されている。制御配列にコード配列をセンスまたはアンチセンス方向に機能的に連結させることができる。

本明細書では、「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する場合もある。

本明細書では、「形質転換」という用語は、核酸断片を宿主有機体に移入することによって、遺伝学的に安定な遺伝が行われることを指す。形質転換核酸断片を含む宿主有機体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」有機体と呼ばれる。

本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部分ではない遺伝子を運搬する場合が多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形をとっている染色体外要素を指す。このような要素は、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、線状または環状のファージまたはヌクレオチド配列とすることができ、多くのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３′非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特徴のある構築物に結合または組み換えられている。

本明細書では、「コドン縮重」という用語は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列をもたらすことなく、ヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するのにヌクレオチドコドンを使用する際に、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。したがって、宿主細胞の発現を改善するための遺伝子を合成するとき、遺伝子を、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように設計することが望ましい。

様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを変化させることなく、宿主有機体の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変化を指す。

本明細書では、「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」は同義で使用されることにし、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を場合によっては含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することにする。ＤＮＡのポリマーの形態をとる単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１個または複数のセグメントを含んでもよい。

核酸断片は、核酸断片の一本鎖の形態を温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸断片とアニーリングすることができるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子など別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、その例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９年）、特に第１１章、表１１．１に記載される（参照により本明細書に全体として組み込まれる）。温度およびイオン強度の条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似の断片（遠縁関係にある有機体に由来する相同配列など）、高度に類似の断片（近縁関係にある有機体に由来する機能酵素を覆製する遺伝子など）を求めてスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄操作で、ストリンジェンシー条件が決まる。１組の好ましい条件では、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間で始め、次いで２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を繰り返し、次いで０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄操作が用いられる。１組のより好ましいストリンジェントな条件では、より高い温度が用いられ、洗浄操作は、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の３０分間の洗浄操作２回の温度を６０℃に上げた点以外は上記と同一である。１組の別の好ましい極めてストリンジェントな条件では、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる最後の洗浄操作２回が６５℃で行われる。１組の追加のストリンジェントな条件には、例えば０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、その後に続く０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄操作が含まれる。

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが起こり得るが、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要とされる。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知である変数である核酸の長さおよび相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸配列のハイブリッドのＴｍ値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍを算出する数式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによって、その特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、その長さは、最も好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さなどの要因に応じて適宜調整できることを認識するであろう。

「かなりの割合」のアミノ酸またはヌクレオチド配列とは、当業者が手作業によって配列を評価することにより、またはＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定により、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定同定するのに十分量のポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む割合である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定同定するためには、１０個以上の一続きの隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドが必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存性の遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離方法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）で使用することができる。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅用プライマーとして使用することができる。したがって、「かなりの割合」のヌクレオチド配列は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分量の配列を構成する。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告される配列の恩恵を受ける当業者は、当業者に公知の目的のために、開示された配列をすべてまたはかなりの割合で今度は使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表に報告する完全配列、および上記に定義したかなりの割合の配列を含む。

「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。

当技術分野において公知である「同一性（％）」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野では、「同一性」は、適宜、このような配列のストリング間のマッチで決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ （１９８８年）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ （１９９３年）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編） Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ （１９９４年）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ （１９８７年）；５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）を含めて、公知の方法で容易に算出することができるが、これらに限定されない。

好ましい同一性測定方法は、被検配列間の最高のマッチをもたらすように設計されている。同一性および類似性の測定方法は、一般に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性（％）の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））を使用して行うことができる。配列のマルチプルアライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアライメント方法に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」を含めて、アルゴリズムのいくつかの変形を包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を使用して行われる。マルチプルアライメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性（％）算出のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法」が利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）； Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアラインメント方法に対応するものである。マルチプルアライメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。

多くの配列同一性レベルが、ポリペプチドを他の種から同定するのに有用であり、このようなポリペプチドは、同じまたは同様の機能または活性を有するものであることが当業者にはよく理解されるであろう。同一性（％）の有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、あるいは５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など、５５％から１００％の任意の整数百分率は、本発明を説明するのに有用であり得る。適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。

「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されているものがあり、または独自に開発することができる。典型的な配列解析ソフトウェアは、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）、（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））；２） ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））；３） ＤＮＡＳＴＡＲ （ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））； ４） Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ））；５） Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組込みＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．
Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．］ （１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ， Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）を含むようになるが、これらに限定されるものではない。本出願の文脈において、配列解析ソフトウェアが解析に使用される場合、解析の結果は、別段の指定のない限り記載のプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることが理解されよう。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期化されると、ソフトウェアと共に元々搭載される任意のセットの値またはパラメーターを意味することになる。

ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９年）（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ， Ｔ． Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，
Ｍ． Ｌ．、およびＥｎｑｕｉｓｔ， Ｌ． Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４年）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７年）によって説明されている。ここで使用される追加の方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ． Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載されている。

酵母における改善されたＦｅ−Ｓクラスタータンパク質活性の発見
タンパク質はその活性に必要とされる結合鉄−硫黄クラスター（Ｆｅ−Ｓ）を含むが、異種性発現系で使用されると活性が低い可能性がある。Ｆｅ−Ｓクラスターの形成およびアポタンパク質へのその移入は、システインデスルフラーゼ、足場タンパク質、およびシャペロンを含めて少なくとも数種のタンパク質が関与する多段階プロセスである。したがって、異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質が、内因性宿主系によって効果的に構成されることはできない。出願人らは、酵母宿主細胞において異種性タンパク質として発現されるＦｅ−Ｓタンパク質の活性を増大させる方式を発見した。出願人らは、酵母宿主細胞における内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質の生成を低減することによって、発現された異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性の改善を実現できることを見出した。イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（ＬＥＵ１）をコードする内在性遺伝子またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩＬＶ３）をコードする内在性遺伝子が酵母宿主細胞において不活性化されると、異種性真菌もしくは植物の２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）またはＦｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ（ＲｄｈｔＢ）の酵母における発現が改善された。

内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質をコードする遺伝子が不活性化された酵母宿主細胞において、発現された異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質の活性を、Ｆｅ−Ｓタンパク質をコードする遺伝子が不活性化されていない酵母宿主細胞における活性の少なくとも約１．４倍まで増大させることができる。例えば、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＤＨＡＤは、ＬＥＵ１欠損宿主において、欠損のない宿主に比べて１．４倍の活性を有し；ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ） ＲｄｈｔＢは、活性化されたＲｄｈｔＡタンパク質活性によって測定して、ＬＥＵ欠損宿主において１．７倍の比較活性を有し（以下に記載する）；サイトゾルにおいて発現された出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＤＨＡＤは、ミトコンドリアＩＬＶ３欠損宿主において１．５倍の比較活性を有し；サイトゾルにおいて発現されたクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＤＨＡＤは、ミトコンドリアＩＬＶ３欠損宿主において７．４倍の比較活性を有した。

内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質の発現を低下させた酵母宿主細胞
内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質の発現の低下は、遺伝子操作を受け入れられる任意の酵母細胞においてエンジニアリングすることができる。例としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の酵母が挙げられる。適切な株としては、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に適切である。

これらの酵母のいずれにおいても、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質はどれも、発現低下の標的とすることができる。発現低下の標的とすることができる酵母におけるＦｅ−Ｓタンパク質としては、例えば以下のタンパク質（コードする遺伝子を含む）：アコニターゼ（ＡＣＯ１）、ホモアコニターゼ（ＬＹＳ４）、ＤＨＡＤ（ＩＬＶ３）、リポ酸合成酵素（ＬＩＰ５）、ビオチン合成酵素（ＢＩＯ２）、フェレドキシン成熟化（ＹＡＨ１）、ＮＡＤＨユビキノン酸化還元酵素（ＮＤＩ１）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ２）、ユビキノール−シトクロム−ｃ還元酵素（ＲＩＰ１）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬＥＵ１）、亜硫酸還元酵素（ＥＣＭ１７）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＴ１）、ＡＢＣタンパク質Ｒｌｉ１（ＲＬＩ１）、ＮＴＰアーゼＮｂｐ３５（ＮＢＰ３５）、およびヒドロゲナーゼ様タンパク質（ＮＡＲＩ１）が挙げられる。個々のＦｅ−Ｓタンパク質の発現を低下させた酵母細胞は、当業者に周知であるように特定の栄養素を含む増殖培地の補充などの特殊な増殖条件を必要とすることがある。例えば、ＬＥＵ１を破壊した株にロイシンを補充し、ＤＨＡＤを破壊した株にロイシン、イソロイシン、およびバリンを補充し、ＬＹＳ４を破壊した株にリシンを補充する。破壊させた株には、増殖用の補充を必要としないものもある。発現低下の標的とすることができる特に適切なＦｅ−Ｓタンパク質としては、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬＥＵ１）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩＬＶ３）、亜硫酸還元酵素（ＥＣＭ１７）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＴ１）、およびビオチン合成酵素（ＢＩＯ２）が挙げられる。発現低下は、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質についてエンジニアリングされ、２つ以上の内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質を低下させることができる。

ＬＥＵ１は、分枝鎖アミノ酸生合成、具体的にはロイシンの合成に関与する、ＥＣ ４．２．１．３３に属する酵素であるイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼをコードする。活性に４Ｆｅ−４Ｓクラスターを必要とする酵素であるイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子はいずれも、本開示の酵母宿主細胞において不活性化することができる。酵母ＬＥＵ１不活性化標的遺伝子およびそのコードされたタンパク質の例は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（コーディング配列番号：１；タンパク質配列番号：２）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（コーディング配列番号：３；タンパク質配列番号：４）、カンジダ・ガルブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌｂｒａｔａ）株ＣＢＳ １３８（コーディング配列番号：５；タンパク質配列番号：６）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ） ＳＣ５３１４（コーディング配列番号：７；タンパク質配列番号：８）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）（コーディング配列番号：；タンパク質配列番号：１０）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（コーディング配列番号：１１；タンパク質配列番号：１２）、およびピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（コーディング配列番号：１３；タンパク質配列番号：１４）に由来するものである。

同様に、本明細書に記載される酵母宿主のいずれにおいても、内因性ＩＬＶ３遺伝子を不活性化して、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質の発現を低下させることができる。ＩＬＶ３は、分枝鎖アミノ酸生合成に関与するミトコンドリアＤＨＡＤをコードする。ミトコンドリアＤＨＡＤは核遺伝子によってコードされるものであり、ミトコンドリア標的シグナル配列を有し、したがってミトコンドリアに輸送され、そこに局在する。ＩＬＶ３遺伝子はいずれも、本開示の酵母宿主細胞において不活性化することができる。酵母ＩＬＶ３不活性化標的遺伝子およびそのコードされたタンパク質の例は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＹＪＭ７８（コーディング配列番号：１１１；タンパク質配列番号：１１２）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（コーディング配列番号：９３；タンパク質配列番号：９４）、カンジダ・ガルブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌｂｒａｔａ）株ＣＢＳ １３８（コーディング配列番号：１０７；タンパク質配列番号：１０８）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ） ＳＣ５３１４（コーディング配列番号：１０１；タンパク質配列番号：１０２）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）（コーディング配列番号：１１３；タンパク質配列番号：１１４）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（コーディング配列番号：１０５；タンパク質配列番号：１０６）、およびピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ） ＣＢＳ ６０５４（コーディング配列番号：１０３；タンパク質配列番号：１０４）に由来するものである。

イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子およびＤＨＡＤ酵素遺伝子が周知であるため、かつゲノム配列決定が普及しているため、これらの酵素の適切な別の種を、バイオインフォマティクス手法で配列類似性を基準として当業者が容易に同定することができる。典型的には、本明細書に記載されているものなど、既知のイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼアミノ酸配列を含む一般に利用可能なデータベースの（上述した）ＢＬＡＳＴ検索を使用して、本株において不活性化の標的とすることができるこれらの酵素およびこれらをコードする配列を同定する。例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２および１４のイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼタンパク質と配列番号：９４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、および１１４のＤＨＡＤタンパク質のいずれかに対して少なくとも約７０〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９８％の配列同一性であるアミノ酸配列同一性を有する内因性酵母イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびＤＨＡＤタンパク質は、本株において発現を低下させることができる。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。

さらに、本明細書に記載されているＬＥＵ１コード領域およびＩＬＶ３の配列を使用して、自然界において他の相同体を同定することができる。例えば、本明細書に記載されるコード領域をそれぞれ使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当技術分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２）核酸増幅技術の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ， Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：１０７４頁（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９巻：３９２頁（１９９２年）］；３）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニング方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

例えば、本明細書に記載されているイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびＤＨＡＤをコードする遺伝子と同様のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に周知である方法を使用して、ライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸断片のすべてまたは一部分を使用することによって、任意所望の有機体から直接単離することができる。開示する核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野において公知である方法で設計および合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、配列全体を直接使用して、当業者に公知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技法）でＤＮＡプローブを合成し、または利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成することができる。さらに、本配列の一部分（または完全長）を増幅するように、特定のプライマーを設計および使用することができる。得られた増幅産物を増幅反応時に直接標識し、または増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることによって完全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして使用することができる。

典型的には、ＰＣＲ型増幅技法において、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列を、標的の核酸が効率的かつ忠実に複製されるように設計すべきである。ＰＣＲプライマー設計方法は、当技術分野において共通であり、周知である（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ． Ｅ． Ｄａｖｉｓ編、（１９８６年） ３３〜５０頁、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ；ならびにＲｙｃｈｌｉｋ、Ｗ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｈｉｔｅ， Ｂ． Ａ．編、（１９９３年） １５巻、３１〜３９頁、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）。

一般に、記載された配列の短い２つのセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応は、クローン化核酸断片のライブラリーを用いても行うことができ、一方のプライマーの配列は、記載された核酸断片に由来し、他方のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３′末端へのポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。

あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づくものとすることができる。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５巻：８９９８頁（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の１点と３′または５′末端との間の領域の複製を増幅することによって、ｃＤＮＡを生成することができる。３′方向および５′方向に向けられたプライマーを、本配列から設計することができる。市販の３′ＲＡＣＥまたは５′ＲＡＣＥ系（例えば、ＢＲＬ、（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ））を使用して、特定の３′または５′ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６巻：５６７３頁（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３巻：２１７頁（１９８９年））。

あるいは、準備したイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼおよびＤＨＡＤをコードする配列を相同体の同定用のハイブリダイゼーション試薬として使用することができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的要素には、プローブ、対象となる遺伝子または遺伝子断片を含有するのではないかと疑われる試料、および特定のハイブリダイゼーション方法が含まれる。プローブは、典型的には検出対象の核酸配列に相補的な一本鎖の核酸配列である。プローブは、検出対象の核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５塩基から数万の塩基まで変わることができ、行われる特殊試験次第であろう。典型的には、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部分だけが、検出対象の核酸配列に相補的であればよい。さらに、プローブと標的配列との相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全に相補的な分子間で起こるものであり、その結果としてハイブリダイズされた領域の塩基の一部分は適切な相補的塩基と対をなしていない。

ハイブリダイゼーション方法は詳細に明らかにされている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にすることになる条件下で混合しなければならない。これは、無機塩または有機塩の存在下、適切な濃度および温度条件下でプローブと試料を接触させる必要がある。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸との間で可能な任意のハイブリダイゼーションが起こり得るのに十分長い時間接触していなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度によって、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決まることになる。プローブまたは標的の濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合によっては、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を抑制することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤によって、短いオリゴヌクレオチドプローブの感受性が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションが室温において可能になる（Ｖａｎ ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９巻：５１４３〜５１５１頁（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、とりわけ塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的には、カオトロピック剤は、最終濃度約３Ｍで存在するようになる。望むなら、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加することができる。

様々なハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。典型的には、これらは、極性有機溶媒の約２０から６０体積％、好ましくは３０体積％を構成する。よく見られるハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、約０．１５から１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５から０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ （ｐＨ範囲約６〜９））、約０．０５から０．２％の洗浄剤（例えば、硫酸ドデシルナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．） （約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンが用いられる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、非標識のキャリア核酸約０．１から５ｍｇ／ｍＬ、核ＤＮＡ断片（例えば、ウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合によっては約０．５から２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグリシンも含まれることになる。種々の極性水溶性または膨潤性剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン性サッカライドポリマー（例えば、デキストラン硫酸）が含まれる体積排除剤など、他の添加剤を含めてもよい。

核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイフォーマットに適応可能である。最も適切なものの１つが、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能である。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は、固体支持体である。固体支持体は、非標識であり、かつ配列の一部分に相補的である固定化核酸プローブに吸着または共有結合する。

本発明の酵母細胞における活性低下の標的とすることができる他のＦｅ−Ｓタンパク質のいずれかについて、タンパク質および核酸をコードする配列は、当業者に周知であるバイオインフォマティクスおよび他の方法を使用して同定することができる。例えば、アコニターゼ配列はバイオインフォマティクスデータベースでキーワード検索することによって同定される。この方法で同定されるいくつかの配列は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） （コーディング配列番号：１５３；タンパク質配列番号：１５４）、染色体ＩＩ上のシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（コーディング配列番号：１５５；タンパク質配列番号：１５６）、染色体Ｉ上のシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（コーディング配列番号：１５７；タンパク質配列番号：１５８）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）（コーディング配列番号：１５；タンパク質配列番号：１６０）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ） ＳＣ５３１４（コーディング配列番号：１６１；タンパク質配列番号：１６２）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（コーディング配列番号：１６３；タンパク質配列番号：１６４）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ） ＣＢＳ ６０５４（コーディング配列番号：１６５；タンパク質配列番号：１６６）、カンジダ・ガルブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌｂｒａｔａ） ＣＢＳ １３８ 染色体Ｆ（コーディング配列番号：１６７；タンパク質配列番号：１６８）、カンジダ・ガルブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌｂｒａｔａ） ＣＢＳ １３８ 染色体Ｄ（コーディング配列番号：１６９；タンパク質配列番号：１７０）、およびカンジダ・ガルブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇａｌｂｒａｔａ） ＣＢＳ １３８ 染色体Ｋ（コーディング配列番号：１７１；タンパク質配列番号：１７２）に由来するものである。

Ｆｅ−Ｓタンパク質をコードする遺伝子、例えばＬＥＵ１、ＩＬＶ３、またはＡＣＯ１は、遺伝子改変を使用して、任意の酵母細胞において破壊することができる。標的遺伝子の遺伝子改変方法の多くは当業者に公知であり、本酵母株を生成するのに使用することができる。標的タンパク質の発現を低下またはなくすのに使用することができる改変は、破壊である。これには、遺伝子全体または遺伝子の一部分の欠損、タンパク質が発現しないまたはより低いレベルでしか発現しないように、ＤＮＡ断片を（プロモーターまたはコード領域中の）遺伝子に挿入すること、変異をコード領域に導入し、機能タンパク質を発現させないような終止コドンまたはフレームシフトを加えること、および１種または複数の変異をコード領域に導入して、非機能性または酵素的に活性でないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、遺伝子の発現をアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってブロックすることができ、コサプレッションを生じる構築物を導入することができる。さらに、転写物の合成または安定性は、変異によって低減される可能性がある。同様に、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率は、変異によって調節することができる。これらの方法はすべて、当業者がＬＥＵ１またはＩＬＶ３などの公知のまたは同定されたコード配列を利用して容易に実施することができる。

ＬＥＵ１、ＩＬＶ３、またはＡＣＯ１コード配列を取り囲むＤＮＡ配列は、いくつかの改変手順でも有用であり、ＧＯＰＩＤ １３８３８で確認して、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）によってコーディネートされたゲノムプロジェクトのゲノムプロジェクトＩＤ９５１８によって調整された完全ゲノム配列において出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母に利用可能である。酵母ゲノム配列のさらなる例としては、ＧＯＰＩＣ １３８３７のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のもの、ならびにＧＰＩＤ １０７７１、１０７０１、および１６３７３に含まれるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のものが挙げられる。さらなるゲノムについては、完全配列決定およびアノテーションを行った。これらは、一般に以下の酵母株であるカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ） ＣＢＳ １３８、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＮＲＲＬ Ｙ−１１４０、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ） ＣＢＳ ６０５４、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ） ９７２ｈ−に利用可能である。

特に、ＬＥＵ１またはＩＬＶ３など、標的コード配列を取り囲むＤＮＡ配列は、相同組換えを使用する改変方法に有用である。例えば、この方法において、フランキング配列を配置して、選択マーカー遺伝子の境界を定め、マーカー遺伝子が標的遺伝子に取って代わる相同組換えを媒介する。また、部分標的遺伝子配列、および選択マーカー遺伝子の境界を定めるフランキング配列を使用して、マーカー遺伝子が標的遺伝子の一部分に取って代わる相同組換えを媒介することもできる。さらに、選択マーカーは、部位特異的組換え部位によって結合することができ、したがって対応する部位特異的リコンビナーゼの発現に続いて、耐性遺伝子が標的遺伝子から、後者を再活性化することなく切り出される。部位特異的組換えは、組換え部位を後に残し、それは標的遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を破壊する。当業者に周知であるように、相同組換えベクターも、標的遺伝子に欠損を残し、続いて選択マーカーの切り出しが行われるように構築することができる。

Ｗａｃｈら、（（１９９４年） Ｙｅａｓｔ １０巻：１７９３〜１８０８頁）に記載されるように有糸分裂組換えを使用して欠損を行うことができる。この方法は、２０ｂｐと短くてもよく、標的ＤＮＡ配列の境界を定めるゲノム領域間に選択マーカーを含むＤＮＡ断片を調製するステップを伴う。このＤＮＡ断片は、マーカー遺伝子の両端にハイブリダイズし、酵母ゲノムと組み換えることができるゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した選択マーカー遺伝子のＰＣＲ増幅により調製することができる。直鎖ＤＮＡ断片は、酵母に効率的に形質転換され、ゲノムに組み換えることができ、標的ＤＮＡ配列の欠損を伴うことを含めて遺伝子置換が起こる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖ１９４、２８１〜３０１頁（１９９１年）に記載）。

さらに、プロモーター置換方法を使用して、Ｍｎａｉｍｎｅｈら、（（２００４年） Ｃｅｌｌ １１８巻（１号）：３１〜４４頁）およびこの中の実施例１２に記載されるものなどの別の手段が発現を調節することを可能にする内因性の転写調節要素を交換してもよい。

さらに、任意の酵母細胞中の標的遺伝子を、ランダム変異誘発を用いて破壊してもよく、続いてスクリーニングして、標的遺伝子によってコードされた活性を低下させた株を同定する。このタイプの方法を使用するとき、例えば標的Ｆｅ−Ｓタンパク質の発現に影響を及ぼすゲノムのＬＥＵ１、ＩＬＶ３、または他の何らかの領域のＤＮＡ配列は公知である必要はない。

遺伝子変異を生じる方法は、当技術分野において共通であり、周知であり、変異体を生成する試行に適用することができる。よく使用されるランダム遺伝子改変方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹに概説されている）としては、自然変異誘発、ミューテーター遺伝子によって引き起こされる変異誘発、化学変異誘発、ＵＶ線またはＸ線照射、またはトランスポゾン変異誘発が挙げられる。

酵母の化学変異誘発は、以下のＤＮＡ変異原性物質の１つを用いた酵母細胞の処理を通常伴う：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、ジエチル硫酸、またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）。これらの変異誘発方法は、Ｓｐｅｎｃｅｒら（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ、１９９６年、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）に概説されている。ＥＭＳを用いた化学変異誘発は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００５， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．に記載されるように行うことができる。紫外（ＵＶ）線またはＸ線照射を使用して、酵母 細胞におけるランダム変異誘発をもたらすこともできる。ＵＶ照射による変異誘発の一次作用は、ＤＮＡ複製の忠実度を破壊するピリミジンダイマーの生成である。酵母のＵＶ−変異誘発のプロトコルは、Ｓｐｅｎｃｅｒら（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ， １９９６年、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）に見られる。ミューテーター表現型の導入を使用して、酵母におけるランダム染色体変異をもたらすこともできる。一般的なミューテーター表現型は、以下の遺伝子の１つまたは複数の破壊を介して得ることができる：ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８、またはＲＡＤ５１。非ミューテーター表現型の修復は、野生型対立遺伝子の挿入によって容易に得ることができる。これらまたは他の公知のランダム変異誘発プロセスのいずれかによって生成された改変細胞の回収物を、Ｆｅ−Ｓタンパク質活性の低下についてスクリーニングすることができる。

異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質
任意の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）および任意のＦｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼを、内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質発現の低下を求めて本明細書に開示するようにエンジニアリングされた酵母宿主細胞における異種性タンパク質として発現させることができ、活性の上昇を得ることができる。異種性タンパク質としては、対応する内因性タンパク質の発現と異なる方式で発現されるものが挙げられる。例えば、酵母において、内因性ＤＨＡＤは、核においてＩＬＶ３によってコードされ、発現されたＤＨＡＤタンパク質は、タンパク質がミトコンドリアに局在するようなミトコンドリア標的シグナル配列を有する。Ｆｅ−Ｓクラスターを、分枝鎖アミノ酸生合成におけるその活性のため、ミトコンドリア中のＤＨＡＤタンパク質に添加する。サイトゾルに局在する生合成経路に関与するには、サイトゾルにおいてＤＨＡＤ活性を発現することが望ましい。酵母におけるＤＨＡＤのサイトゾル発現は、未変性タンパク質がミトコンドリアに局在するので異種性発現である。例えば、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＤＨＡＤの異種性発現は、タンパク質がサイトゾルに残留したままであるようにミトコンドリア標的シグナルを除去して、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＤＨＡＤコード領域を発現させることによって得られる。本開示で使用することができる２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤとしては、真菌類および植物に由来するものが挙げられる。代表的な真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤを表１および２に記載する。アミノ酸配列同一性９５％以上の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤは分析から除去し、このリストを単純化した。しかし、これらの配列のいずれかに対してアミノ酸同一性９５％以上の配列はいずれも、本発明において有用である。２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤを得るのに使用された分析は、共有および同時係属中の米国仮特許出願第６１／１００７９２号明細書に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。分析は以下の通りである：そこでは、機能検証された８つのＤＨＡＤのアミノ酸配列に基づくプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を調製した。これらのＤＨＡＤは、ニトロソモナス・ユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）（ＤＮＡ配列番号：１７４；タンパク質配列番号：１７５）、シネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３ （ＤＮＡ配列番号：１７６；タンパク質配列番号：１７７）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ配列番号：１７８；タンパク質配列番号：１７９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ配列番号：１８０；タンパク質配列番号：１８１）、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）（ＤＮＡ配列番号：１８２；タンパク質配列番号：１８３）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ＤＮＡ配列番号：１８４；タンパク質配列番号：１８５）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ配列番号：１８６；タンパク質配列番号：１８７）に由来するものである。さらに、フラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ配列番号：１８８；タンパク質配列番号：１８９）に由来するＤＨＡＤは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現させるとジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有することが判明し、プロファイルを作製する際に使用された。プロファイルＨＭＭは、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを使用して、ＨＭＭＥＲ （Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ、（Ａｓｈｂｕｒｎ， ＶＡ））から入手可能なユーザーガイドに従って調製される（プロファイルＨＭＭの背後にある理論は、Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ、Ｓ． Ｅｄｄｙ、Ａ． ＫｒｏｇｈおよびＧ． Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９８年； Ｋｒｏｇｈら、１９９４年； Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２３５巻：１５０１〜１５３１頁に記載されている）。ＨＭＭＥＲソフトウェアプログラムのアウトプットは、表９に示す入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である。

Ｅ値＜１０^−５のプロファイルＨＭＭとマッチする任意のタンパク質は、ＤＨＡＤ関連タンパク質であり、４Ｆｅ−４Ｓ ＤＨＡＤ、２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤ、アラボン酸デヒドラターゼ、およびホスホグルコン酸デヒドラターゼが含まれる。次いで、プロファイルＨＭＭとマッチする配列を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ） ＤＨＡＤにおける５６位、１２９位、および２０１位に対応する３種類の保存されたシステインの存在について分析する。３種類の保存されたシステインがすべて存在することは、［２Ｆｅ−２Ｓ］^２＋クラスターを有するタンパク質の特徴である。３種類の保存されたシステインを有するタンパク質としては、アラボン酸デヒドラターゼおよび２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤが挙げられる。２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ） ＤＨＡＤアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置において２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤまたはアラボン酸デヒドラターゼに存在することが判明した特徴的な保存されたアミノ酸を分析することによって、アラボン酸デヒドラターゼと区別することができる。これらの特徴的なアミノ酸はそれぞれ、２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤまたはアラボン酸デヒドラターゼ中、以下の位置において存在する（９０％を超える出現率）：８８ アスパラギン対グルタミン酸；１１３ 保存されていない対グルタミン酸；１４２ アルギニンまたはアスパラギン対保存されていない； １６５：保存されていない対グリシン；２０８ アスパラギン対保存されていない；４５４ ロイシン対保存されていない；４７７ フェニルアラニンまたはチロシン対保存されていない；および４８７ グリシン対保存されていない。

配列番号：４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、および１５２など、真菌または植物を起源とする、このプロセスで同定されたタンパク質、ならびにこれらの配列のいずれかに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する任意のタンパク質を本発明において使用することができる。クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） （配列番号：１１４）に由来するＤＨＡＤ、ならびにＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いて、配列番号：１１４に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するＤＨＡＤが特に適切である。

さらに、本発明において使用することができる真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤは、ＤＨＡＤ関連タンパク質の系統樹の真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤ分岐の位置によって同定することができる。さらに、使用することができる２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤは、本明細書に配列が記載されている真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤのいずれかとの配列比較を使用して同定することができ、配列同一性は少なくとも約８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％とすることができる。

さらに、本明細書に記載されている真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓ ＤＨＡＤの配列を使用して、自然界において他の相同体を同定することができる。例えば、配列番号：４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、および１５１として本明細書に示す、ＤＨＡＤをコードする核酸断片をそれぞれ使用して、ＬＥＵ１コード領域について上述されたように相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。

ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼは、活性にＦｅ−Ｓクラスターを必要とするタンパク質である。このタンパク質ＲｄｈｔＢは、参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示される。ＲｄｈｔＢは、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼを再活性化する。これは、ＲｄｈｔＡと呼ばれ、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書にこれも開示されている。ＲｄｈｔＢの活性の評価は、ＲｄｈｔＢがＲｄｈｔＡ活性に必要とされるので、ＲｄｈｔＡの活性をアッセイすることによって行うことができる。ＲｄｈｔＢの活性、ひいてはＲｄｈｔＡの活性は、本明細書に開示する内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質発現を低下させた酵母宿主において発現することによって改善される。活性にＦｅ−Ｓクラスターを必要とする任意の補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼの異種性発現は、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質発現を低下させた酵母株において改善することができる。補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼは、補酵素Ｂ１２の存在または非存在下で関連するプロパンジオールデヒドラターゼ酵素のプロパンジオールデヒドラターゼ活性を評価することによって当業者が容易に同定することができる。一例は、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）のジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ（コード領域配列番号：１９２；タンパク質配列番号：１９３）である。

使用することができる他の補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼは、配列のバイオインフォマティクス分析により、当業者がＲｄｈｔＢ（配列番号：４４）のそれに比べて同定することができる。補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性を有し、配列番号：４４に対する配列同一性が少なくとも約８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％であるタンパク質を使用することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるものが特に適している。

さらに、使用することができる他の補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ相同体は、ＲｄｈｔＢコード領域（配列番号：１６）を使用して、ＬＥＵ１コード領域について上述された方法で同定することができる。

異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質の発現
発現は、Ｆｅ−Ｓタンパク質をコードする配列を用いて形質転換することによって実現される。当業者に周知であるように、発現対象のコード領域を標的宿主細胞にコドン最適化することができる。酵母における遺伝子発現方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ． Ｆｉｎｋ （編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡを参照のこと）。酵母における遺伝子発現は、典型的には対象となるコード領域に機能的に連結したプロモーター、および転写ターミネーターを必要とする。以下の遺伝子：ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、およびＡＯＸ１に由来するプロモーターが含まれるが、これらに限定されないいくつかの酵母プロモーターを、酵母における遺伝子用の発現カセットを構築する際に使用することができる。適切な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、および ＡＤＨ１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびコード領域を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローン化し、酵母細胞に形質転換することができる。これらのベクターによって、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株と酵母株の両方で菌株の伝播（ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）が可能になる。典型的には、使用されるベクターは、所望の宿主における自律増殖または染色体組込みを可能にする選択マーカーおよび配列を含む。典型的には、酵母において使用されるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ））であり、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製開始点、および栄養選択性マーカーを含む。これらの４つのベクター用の選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）、およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。記載されたＦｅ−Ｓタンパク質コード領域をコードするキメラ遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において標準分子クローニング技法で、または酵母においてギャップ修復組換え方法で行うことができる。

ギャップ修復クローニング手法は、酵母における高効率な相同組換えを利用するものである。典型的には、酵母ベクターＤＮＡは（例えば、その複数のクローニング部位において）消化されて、その配列に「ギャップ」を生じる。対象となるいくつかのインサートＤＮＡが生成される。インサートＤＮＡは、≧２１塩基対配列を５′末端と３′末端の両端に含み、５′末端と３′末端は、互いにならびにベクターＤＮＡの５′末端および３′末端と順次重なり合う。例えば、「遺伝子Ｘ」用の酵母発現ベクターを構築するために、発現カセット用の酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターを選択する。プロモーターおよびターミネーターは、酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘは、その供給源有機体からＰＣＲ増幅されるか、または遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られるかのどちらかである。線状化ベクターの５′末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、およびターミネーターと線状化ベクターの３′末端との間には、２１塩基対重複配列が少なくとも存在する。次いで、「ギャップが形成された」ベクターおよびインサートＤＮＡは、酵母株に共形質転換され、プラスミド上で栄養選択性マーカーの相補を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に蒔かれる。正しいインサート組合せの存在は、選択された細胞から調製されたプラスミドＤＮＡを使用したＰＣＲマッピングによって確認することができる。次いで、酵母から単離されたプラスミドＤＮＡ（通常、低濃度）を、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換し、続いてミニプレップおよび制限酵素マッピングを行って、プラスミド構築物をさらに検証することができる。最後に、構築物を配列解析で検証することができる。

ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノムへの組込みも、酵母における相同組換え系を利用する。典型的には、コード領域に調節要素（プロモーターおよびターミネーター）および栄養要求性マーカーを加えたものを含むカセットが、そのカセットにハイブリダイズし、挿入が望まれるゲノム領域の５′および３′の領域に対して配列相同性の４０〜７０塩基対を含むプライマーを使用して、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅される。次いで、ＰＣＲ産物は、酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に蒔かれる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター構築物は、プラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増殖され、ＳＯＥ ＰＣＲ、または一般的な制限酵素消化物およびクローニングによって独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合される。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含む完全カセットは、酵母染色体上の「Ｙ」の位置の５′および３′の領域に対して相同性の４０〜７０塩基対を含むプライマー配列を用いてＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシルを含まない増殖培地上で選別される。コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接配列決定によって、形質転換体を検証することができる。

本酵母細胞において発現されるあらゆるコード領域は、当業者に周知であるようにエンジニアリングされた特定の宿主酵母細胞における発現にコドン最適化され得る。例えば、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）およびＰ．スチピチス（Ｐ． ｓｔｉｐｉｔｉｓ） ＩＬＶ３コード領域の発現の場合、それぞれ、本明細書の実施例１において出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現にコドン最適化された。

異種性Ｆｅ−Ｓタンパク質活性が改善された生成物の生合成
生合成経路に貢献するＦｅ−Ｓタンパク質を有する任意の生成物の生成は、内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質発現が低下された酵母宿主における異種性発現Ｆｅ−Ｓタンパク質の活性の本明細書に開示された改善から利益を得ることができる。例えば、ＤＨＡＤは、イソブタノールの生合成経路におけるステップを提供し、ＲｄｈｔＢは、２−ブタノンまたは２−ブタノールを生成する生合成経路に寄与する。

イソブタノール合成のためにＤＨＡＤによって行われたステップを含む生合成経路は、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に開示され、これは参照により本明細書に組み込まれる。開示されたイソブタノール生合成経路の線図は、図１に記載される。本明細書に開示する株におけるイソブタノールの生成は、ＤＨＡＤ活性の上昇から利益を得る。米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載のように、イソブタノール生合成経路例のステップは、
− 例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの変換（図１経路ステップａ）；
− 例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒されるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（図１経路ステップｂ）；
− 例えばＤＨＡＤとも呼ばれるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換（図１経路ステップｃ）；
− 例えば分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換（図１経路ステップｄ）；および
− 例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図１経路ステップｅ）
を含む。

これらの反応に関与する基質から生成物変換、および酵素は、代替経路のステップｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋの場合、米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されている。

イソブタノール経路用の酵素の発現に使用することができる遺伝子については、米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されており、使用することができる追加の遺伝子は、上述されたようにバイオインフォマティクスまたは実験により当業者が同定することができる。特に高活性のケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素の３経路すべてにおける好ましい使用が、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２６１２３０号明細書に開示される。そこに開示される高活性ＫＡＲＩの例は、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：３５；タンパク質配列番号：３６）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） ＰＡＯ１、（ＤＮＡ：配列番号：３７；タンパク質配列番号：３８）、および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５（ＤＮＡ：配列番号：３９；タンパク質配列番号：４０）に由来するものである。

米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書には、キメラ遺伝子の構築および酵母の遺伝子工学がさらに記載されており、開示された生合成経路を使用するイソブタノール生成には出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が例示されている。

２−ブタノンおよび２−ブタノールの合成のためにプロパンジオールデヒドラターゼを含む生合成経路が共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７０２９２９２７（Ａ１）号明細書に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。開示された２−ブタノンおよび２−ブタノールの生合成経路の線図は、図２に記載される。２−ブタノンは、２−ブタノンを２−ブタノールに変換する最後の記載ステップが省略されて作製される生成物である。本明細書に開示する株における２−ブタノンまたは２−ブタノールの生成は、補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性の上昇の利益を得る。米国特許出願公開第２００７０２９２９２７（Ａ１）号明細書に記載のように、開示された生合成経路におけるステップは、
− 例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの変換（図２ステップａ）；
− 例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されるアセトラクテートからアセトインへの変換（図２ステップｂ）；
− 例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されるアセトインから２，３−ブタンジオールへの変換（図２ステップｉ）；
− 例えばジオールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ、またはプロパンジオールデヒドラターゼによって触媒される２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換（図２ステップｊ）；および
− 例えばブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される２−ブタノンから２−ブタノールへの変換（図２ステップｆ）
を含む。

これらの酵素の発現に使用することができる遺伝子については、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７（Ａ１）号明細書に記載されている。この経路における酵母中でのロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ＲｄｈｔＡ、（タンパク質配列番号：４３、コード領域配列番号：１５）に由来するブタンジオールデヒドラターゼの使用について、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示される。この酵素は、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ＲｄｈｔＢ、（タンパク質配列番号：４４、コード領域配列番号：１６）に由来するブタンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼと共に使用される。このブタンジオールデヒドラターゼは補酵素Ｂ_１２を必要としないので、多くの宿主において望ましい。

米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書には、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７（Ａ１）号明細書によって開示された生合成経路を使用する２−ブタノール生成のためのキメラ遺伝子の構築および酵母の遺伝子工学がさらに記載されている。

発酵培地
本明細書に開示する酵母を、Ｆｅ−Ｓタンパク質を有する生成物を生成するための生合成経路の一部分として発酵培地で増殖させることができる。発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な基質としては、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、シュガービート糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能なフィードストックの未精製混合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、または主要な生化学中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの１炭素基質であってもよい。メチロトローフ有機体が、１炭素および２炭素基質以外に、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための種々のアミノ酸など、いくつかの他の炭素含有化合物を利用することも公知である。例えば、メチロトローフ酵母が、メチルアミン由来の炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを生成することは公知である（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．］， ７ｔｈ （１９９３年）、４１５〜３２頁． 編集者：Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ． Ｃｏｌｌｉｎ； Ｋｅｌｌｙ， Ｄｏｎ Ｐ． 出版社：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＵＫ）。同様に、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝することになる（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５３巻：４８５〜４８９頁（１９９０年））。したがって、本発明において利用される炭素の供給源は、多種多様な炭素含有基質を包含することができ、有機体の選択によって限定されるだけになると考えられる。

上記の炭素基質およびその混合物はすべて、本発明において適切であると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。

発酵培地は、適切な炭素源に加えて、所望の生成物の生成にとって必要である培養物の増殖および酵素経路の促進に適した、当業者に公知の適切な鉱物、塩、補因子、緩衝液、および他の成分を含有しなければならない。

培養条件
典型的には、細胞は適切な培地中、約２０℃から約３７℃の範囲の温度で増殖する。本発明において適切な増殖培地は、酵母窒素原礎、硫酸アンモニウム、およびデキストロースを炭素／エネルギー源）として含むブロスまたはＹＰＤ培地、大部分の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させるのに最適の割合のペプトン、酵母エキス、およびデキストロースのブレンドなど、商業的に調製された一般的な培地である。他の定義されたまたは合成の増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖に適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知であろう。

発酵に適切なｐＨ範囲はｐＨ３．０〜ｐＨ７．５であり、ｐＨ４．５．０〜ｐＨ６．５が初期条件として好ましい。

発酵は、好気性または嫌気性条件下で行うことができ、嫌気性または微好気性条件が好ましい。

発酵培地中で生成されたブタノール量は、当技術分野において公知であるいくつかの方法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を使用して決定することができる。

工業用バッチ式および連続式発酵
本プロセスは、バッチ式発酵方法を用いる。従来のバッチ式発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵時に人工的な変更を受けない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に、培地に所望の１つまたは複数の有機体が接種されると、系に何も添加することなく発酵が起こることが可能である。しかし、典型的には、「バッチ式」発酵は、炭素源の添加に関してバッチ式であり、ｐＨや酸素濃度などの要因を制御する試みがしばしば行われている。バッチシステムにおいて、系の代謝産物およびバイオマス組成物は発酵を止めるときまで常に変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的な誘導期を経由して、高増殖の対数期、最後に増殖速度が減少または停止する定常期へと適度になる。無処理の場合、定常期における細胞は、最終的に死ぬことになる。対数期における細胞は、全体として最終生成物または中間体の生成の大部分を担う。

標準バッチシステムの変形が、与えバッチシステムである。与えバッチ式発酵プロセスは、本発明においても適切であり、発酵が進行するにつれて、基質を段階的に増量しながら添加する点以外は典型的なバッチシステムを含む。

与えバッチシステムは、カタボライトリプレッションが細胞の代謝を抑制しがちであるとき、および培地に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。与えバッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２などの廃ガスの分圧など、測定可能な要因の変化を基準として推定される。バッチ式および与えバッチ式発酵は、当技術分野において共通であり、周知であり、例は、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍａｓ Ｄ． Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年） Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ， Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６巻：２２７頁、（１９９２年）に見ることができる。

本発明はバッチモードで行われるが、本方法であれば、連続発酵方法に適応可能であると考えられる。連続発酵は、所定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を除去して、処理する開放系である。連続発酵は、細胞が主に対数期増殖過程にある場合、一般に培養物を一定の高密度で維持する。

連続発酵によって、細胞増殖または最終生成物濃度に影響する１要因または任意の数の要因の調節が可能になる。例えば、一方法は、炭素源などの制限的栄養素または窒素レベルを一定速度で維持し、他のパラメーターが適度になることを可能にするであろう。他のシステムでは、増殖に影響するいくつかの要因を、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に維持しながら連続的に変更することができる。連続システムでは、定常状態増殖条件を維持する試みが行われ、したがって培地の除去による細胞損失を発酵における細胞増殖速度で埋め合わせなければならない。連続発酵プロセスの栄養素および増殖因子を調節する方法ならびに生成物生成速度を最大限にする技法は、産業微生物学の技術分野において周知であり、種々の方法がＢｒｏｃｋ（上記）によって詳述されている。

本発明は、バッチ、与えバッチ、または連続プロセスを使用して実施することができ、公知の発酵モードが適している。さらに、細胞を基質に全細胞触媒として固定化し、１−ブタノール生成の発酵条件にかけることができると考えられる。

発酵培地からのブタノールの単離方法
バイオ生成されたブタノールは、当技術分野において公知である方法を使用して発酵培地から単離することができる。例えば、固体は、発酵培地から遠心、濾過、デカンテーションなどによって除去することができる。次いで、ブタノールを発酵培地から単離することができ、蒸留、液液抽出、または膜を用いた分離などの方法を使用して、上述されたように処理して固体が除去された。ブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を使用するだけで、混合物をその共沸組成物まで分離することができる。蒸留を別の分離方法と組み合わせて使用して、共沸混合物の分離を行うことができる。蒸留と組み合わせて使用して、ブタノールを単離および精製することができる方法としては、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜を用いた技法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、添加溶剤を用いた共沸蒸留を使用して、ブタノールを単離することができる（例えば、ＤｏｈｅｒｔｙおよびＭａｌｏｎｅ、Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年）。

ブタノール−水混合物は不均一共沸混合物を形成し、したがって蒸留をデカンテーションと組み合わせて使用して、ブタノールを単離および精製することができる。この方法において、ブタノール含有発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留する。次いで、共沸混合物を凝縮し、ブタノールをデカンテーションにより発酵培地から分離する。デカンテーションされた水相を還流液として第１の蒸留塔に戻すことができる。デカンテーションされたブタノールリッチな有機相は、第２の蒸留塔で蒸留することによってさらに精製することができる。

ブタノールは、蒸留と組み合わせて液液抽出を使用して、発酵培地から単離することもできる。この方法において、適切な溶媒を用いた液液抽出を使用して、ブタノールを発酵ブロスから抽出する。次いで、ブタノール含有有機相を蒸留して、ブタノールを溶媒から分離する。

蒸留を吸着と組み合わせて使用することによっても、ブタノールを発酵培地から単離することができる。この方法において、ブタノールを含有する発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留し、次いでモレキュラーシーブなどの 吸着剤の使用により残留する水を除去する（Ａｄｅｎら、Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，
Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００２年６月）。

さらに、蒸留を浸透気化と組み合わせて使用して、ブタノールを発酵培地から単離および精製することができる。この方法において、ブタノールを含有する発酵ブロスを共沸組成物近くまで蒸留し、次いで残留水を、親水性膜に通して浸透気化することにより除去する（Ｇｕｏら、Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｓｃｉ．、２４５巻、１９９〜２１０頁（２００４年））。

下記の実施例において、本発明をさらに説明する。本発明の好ましい実施形態を示すこれらの実施例は、例として挙げられているだけのものであると理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用および条件に適応させるために本発明の様々な変更および修正を行うことができる。

一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９年） （Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ならびにＴ． Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ． Ｌ． Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ． Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８４年）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．
ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７年）、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹによって記載されている。

細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野において周知である。以下の実施例での使用に適した技法は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｇ． Ｅ． Ｍｕｒｒａｙ， Ｒａｌｐｈ Ｎ． Ｃｏｓｔｉｌｏｗ， Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ． Ｎｅｓｔｅｒ， Ｗｉｌｌｉｓ Ａ． Ｗｏｏｄ， Ｎｏｅｌ Ｒ． Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｇ． Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ． （１９９４年））、またはＴｈｏｍａｓ Ｄ． Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ （１９８９年）に記載のように見ることができる。別段の指定のない限り、細菌細胞の増殖および維持に使用される試薬、制限酵素、および材料はすべて、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｓｐａｒｋｓ， ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。微生物株は、別段の注記のない限りＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手した。オリゴヌクレオチドプライマーはすべて、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ （Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ， ＴＸ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ， ＩＡ）によって合成された。

合成完全培地は、Ａｍｂｅｒｇ、ＢｕｒｋｅおよびＳｔｒａｔｈｅｒｎ、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹに記載されている。

ＨＰＬＣ
発酵副生物組成物の分析は当業者に周知である。例えば、１つの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラムをＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇガードカラム（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）から入手可能）と共に利用し、屈折率（ＲＩ）で検出した。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を移動相として、流量０．５ｍＬ／分およびカラム温度５０ ℃で使用して実現される。イソブタノール保持時間は４７．６分である。

略語の意味は以下の通りである：「ｓ」は秒を意味し、「分」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチ当たりポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬはマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ_６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、、「ｇ」は引力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロベース対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量％を意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量％を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。

「モル選択性」という用語は、消費された糖基質１モル当たり生成された生成物のモル数であり、％で報告される。

実施例１
出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＬＥＵ１欠損株におけるＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）由来のＤＨＡＤの発現
酵母ＬＥＵ１遺伝子は、機能するためにＦｅ−Ｓクラスターを必要とする酵素であるイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼをコードする。この実施例では、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＤＨＡＤコード領域に由来して発現されるＤＨＡＤ活性にＬＥＵ１の欠損が与える影響を検討した。酵母における遺伝子発現では、ｐＲＳ４２３に由来するシャトルベクターｐＮＹ１３（配列番号：２９）を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における維持のためのＦ１複製開始点（１４２３から１８７９）および酵母における複製のための２ミクロン開始点（ｎｔ ７５３７から８８８１）を含むものであった。ベクターは、ＦＢＡプロモーター（ｎｔ ２１１１から３１１０）およびＦＢＡターミネーター（ｎｔ ４３１６から５３１５）を有する。さらに、酵母における選択のためのＨＩＳ３マーカー（ｎｔ ５０４から１１６３）および大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン耐性マーカー（ｎｔ ６５４７から７４０４）を有する。ｐＮＹ９は、ＨＩＳ３マーカーに取って代わるＵＲＡ３マーカーを含む同じベクターである。

クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するＤＨＡＤのＩＬＶ３コード領域は、ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）によって、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現にコドン最適化して合成した。クローン化した合成配列をＰＣＲ増幅した。増幅時に、ｉｌｖ３（Ｋ）（０）−Ｆ（ｄｅｌｅｔ）を順方向プライマーとして、ｉｌｖ３（Ｋ）（ｏ）−Ｒを逆方向プライマーとして使用することによって、Ｎ末端におけるＤＨＡＤのミトコンドリアシグナルペプチドの一部分を欠損させ、細胞質発現のためのコード領域（配列番号：１７３）を生じさせた。さらに、ＳｐｈＩ部位を順方向プライマーに組み込み、ＮｏｔＩ部位を逆方向プライマーに含ませた。ＰＣＲ産物をシャトルベクターｐＮＹ９およびｐＮＹ１３にクローン化し、したがってＩＬＶ３コード領域をＦＢＡプロモーターの制御下においた。ＰＣＲ産物と各ベクター（ｐＮＹ９、ｐＮＹ１３）とをＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化させた。消化後に、成分を連結し、連結混合物をＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ寒天板で、形質転換体を選別した。上述した順方向および逆方向プライマーを用いたＰＣＲによって、陽性クローンをスクリーニングした。得られたプラスミドをそれぞれ、プラスミドｐＮＹ１３およびｐＮＹ９に由来するｐＲＳ４２３：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）およびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）と称した。

出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）由来のＤＨＡＤの発現を検討するため、発現ベクターｐＲＳ４２３：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）を空のベクターｐＲＳ４２６と共に株ＢＹ４７４３およびＢＹ４７４３ ｌｅｕ１：：ｋａｎＭＸ４ （ＡＴＣＣ ４０３４３７７）に形質転換した。コンピテント細胞の調製および形質転換は、Ｚｙｍｏ ＲｅｓｅａｒｃｈのＦｒｏｚｅｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎキットに基づいて行った。ヒスチジンおよびウラシルを含まない酵母合成培地を含む寒天板（Ｔｅｋｎｏｖａ）で、形質転換体を選別した。酵素アッセイでは、まず発現構築物を有する株および空のベクターｐＲＳ４２６を、ヒスチジンおよびウラシルを含まない合成完全酵母培地５ｍｌ中で終夜増殖させた。終夜培養物５ｍｌを、２５０ｍｌのフラスコ中の培地１００ｍｌに移した。培養物は、６００ｎｍにおいて１から２Ｏ．Ｄに到達すると回収した。２０ｍＭトリス（ｐＨ ７．５）１０ｍｌで試料を洗浄し、次いで同じトリス緩衝液１ｍｌに再懸濁した。０．１ｍｍのシリカ（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ、ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）が入っている２．０ｍｌの試験管に、試料を移した。次いで、細胞をビードビーター（ＢＩＯ１０１）中で破壊した。微量遠心管に入れ、１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心することによって、上澄液を得た。典型的には、０．０６から０．１ｍｇの粗抽出物のタンパク質をＤＨＡＤアッセイで使用した。粗抽出物中のタンパク質は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定した。

ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素アッセイ
インビトロＤＨＡＤ酵素アッセイは、フリントら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９３年） ２６８巻：１４７３２〜１４７４２頁）に記載されるアッセイの変形である。アッセイは、全容量１．６ｍｌで行い、８００μｌ ２Ｘ 緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ ８．０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、１６０μｌ １０Ｘ基質（１５．６ｍｇ／ｍｌジヒドロキシイソバレレート）、粗抽出物（典型的には、５０〜２００μｇのタンパク質）、および水からなるものであった。反応は、３７℃でインキュベートした。０、３０、６０、および９０分の間隔で、反応を３５０μｌずつ分取し、１Ｎ ＨＣｌ中０．０５％ジニトロフェニルヒドラジン３５０μｌを加えて２５℃で３０分間インキュベートした。反応をクエンチするために、４Ｎ水酸化ナトリウム３５０μｌを反応混合物に添加し、反応を１５，０００ｘｇで２分間遠心した。上澄液をプラスチックの使い捨てキュベットに移し、５４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。α−ケトイソバレレート（ＫＩＶ）の生成量は、α−ケトイソバレレートの標準曲線から得られた線形回帰方程式に吸光度を挿入することによって決定した。各時点でのＫＩＶの生成量をプロットして、生成速度を決定した。次いで、線形回帰の勾配を使用して、比活性を次式で算出した：

比活性算出＝（ＫＩＶ生成の勾配／１０００）／１．６ｍＬ反応当たりタンパク質（ｍｇ）＝ｍｍｏｌ／分＊ｍｇ

Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）由来のデヒドラターゼは、酵母株ＢＹ４７４３において発現されたとき０．２から０．３５μｍｏｌ分^−１ｍｇ^−１の範囲の比活性を有した（Δｌｅｕ１）。一方、この酵素は、親酵母株ＢＹ４７４３において発現されたとき０．１４μｍｏｌ分^−１ｍｇ^−１の範囲の比活性しか示さなかった。空のベクターｐＲＳ４２３またはｐＲＳ４２６を含む株ＢＹ４７４３（Δｌｅｕ１）および野生型ＢＹ４７４３は、０．０３から０．１μｍｏｌ分^−１ｍｇ^−１の範囲の活性のバックグラウンドを有した。

実施例２
出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＬＥＵ１欠損株におけるジオールデヒドラターゼの発現
補酵素Ｂ１２非依存性プロパンジオールデヒドラターゼは、共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００９０１５５８７０号明細書に開示される。細菌ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）におけるこの補酵素Ｂ１２非依存性（Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）−依存性）プロパンジオールデヒドラターゼ（配列番号：１５）およびその推定関連レアクティバーゼ（配列番号：１６）をコードする配列［Ｓｃｏｔｔら、（２００６年） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８８巻：４３４０〜９頁］（以降、それぞれｒｄｈｔＡおよびｒｄｈｔＢと呼ばれる）を１ＤＮＡ断片（配列番号：１７）として標準方法で合成し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターにクローン化した（ＤＮＡ２．０、Ｉｎｃ．、（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ））。このクローンをＰＣＲ型として使用して、別々のＲｄｈｔＡおよびＲｄｈｔＢコード領域断片を調製した。プライマーＮ６９５およびＮ６９６（配列番号：１８および１９）を使用して、ジオールデヒドラターゼのＲｄｈｔＡコード領域をＰＣＲ増幅した。プライマーＮ６９７およびＮ６９８（配列番号：２０および２１）を使用して、ジオールデヒドラターゼアクチベースのＲｄｈｔＢコード領域をＰＣＲ増幅した。ＳＯＥ ＰＣＲを使用して、２本のＤＮＡ断片を、対抗する方向で互いに隣接したＡＤＨターミネーター（配列番号：２３）とＣＹＣ１ターミネーター（配列番号：２４）とを有する二重ターミネーターＤＮＡ断片（配列番号：２２）と組み合わせた（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９年） Ｇｅｎｅ ７７巻：６１〜６８頁）。二重ターミネーター断片を、ｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤのＰａｃＩ消化の後に０．６ｋｂ断片として単離した（共有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書、実施例１７に記載）。得られた４ｋｂＤＮＡ断片は、ＲｄｈｔＡおよびＲｄｈｔＢコード領域を二重ターミネーターの両側に対応する方向で有し、各コード領域の３’末端は、二重ターミネーター配列に隣接している。次いで、このＤＮＡ断片を、ギャップ修復方法（Ｍａら、（１９８７年） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８巻：２０１〜２１６頁）で出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シャトルベクターｐＲＳ４２６：：ＦＢＡ−ＩＬＶ５＋ＧＰＭ−ｋｉｖＤにクローン化した。このシャトルベクターは、ＢｂｖＣＩを用いて消化して、ＩＬＶ５およびｋｉｖＤコード領域ならびに３′末端間の二重ターミネーター配列を除去することによって調製されたものである。得られたプラスミドｐＲＳ４２６：：ＲｄｈｔＡＢ （下記）は、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＦＢＡプロモーター（配列番号：２５）の制御下にＲｄｈｔＡ遺伝子を含み、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭプロモーター（配列番号：２６）の制御下にＲｄｈｔＢ遺伝子を含むものであった。

プラスミドｐＲＳ４２６およびｐＲＳ４２６：：ＲｄｈｔＡＢを、標準技法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、２０１〜２０２頁）で出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４３（ＡＴＣＣ ２０１３９０）およびＢＹ４７４３ ｌｅｕ１：：ｋａｎＭＸ４ （ＡＴＣＣ ４０３４３７７）に導入した。ウラシルを含まない合成完全培地に、細胞を蒔いて、形質転換体を選別した。形質転換体について、インビボアッセイを使用してジオールデヒドラターゼ活性を以下の通り試験した。固形培地上で増殖させたパッチ状の細胞を使用して、ペトリ板の液体培地（２０ｍｌ）を接種した。使用された培地は、５ｇ／Ｌの１，２−プロパンジオール添加および非添加のウラシル不含合成完全培地であった（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３９８０３９）。ペトリ板をＡｎａｅｒｏｐａｃｋ（商標） Ｓｙｓｔｅｍジャー（三菱瓦斯化学（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）カタログ番号５０−７０）に移した。Ｐａｃｋ−Ａｎａｅｒｏサッシェ（三菱瓦斯化学（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）カタログ番号１０−０１）を使用して、嫌気性環境（＜０．１％酸素）を生成した。４８時間後、一般方法に記載のように、培養上清をサンプリングし、濾過し、ＨＰＬＣで分析した。１，２−プロパンジオールが培地に用いられたとき、ｐＲＳ４２６：：ＲｄｈｔＡＢを有する株の培養上清において、保持時間３８．８分間のプロパノールが観察された。表５に示す結果から、ＬＥＵ１欠損も有する株の上澄液において、ＬＥＵ１欠損のない株の場合より多くのプロパノールが生成されたことがわかる。統計分析のＰスコアは、０．０００５未満であった。

実施例３
ミトコンドリアＩＬＶ３の破壊による出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるサイトゾルジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）活性の改善
ベクター／宿主構築物
出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ＩＬＶ３は、分枝鎖アミノ酸生合成に関与するミトコンドリアジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする。出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるインビトロ酵素アッセイのために内因性ＩＬＶ３発現からバックグラウンドを低下させるために、配列番号：３０および３１で示されたプライマー「ＩＬＶ３：：ＵＲＡ３ Ｆ」および「ＩＬＶ３：：ＵＲＡ３ Ｒ」を用いて、ｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーをＰＣＲ増幅することにより、ｉｌｖ３：：ＵＲＡ３破壊カセットを構築した。これらのプライマーは、相同組換えのためのＩＬＶ３染色体座の上流および下流の配列と同一である７０塩基対５′および３′伸張を含む１．４ｋｂＵＲＡ３ ＰＣＲ産物を生成した。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、ＰＣＲ産物をＢＹ４７４１細胞（ＡＴＣＣ ２０１３８８）に形質転換し、得られた形質転換体を、ウラシルを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上で３０℃において維持した。配列番号：３２および３３で示したプライマー「ＩＬＶ３ Ｆ Ｃｈｅｃｋ」および「ＵＲＡ３ ＲＥＶ Ｃｈｅｃｋ」を使用したＰＣＲで、形質転換体をスクリーニングして、正しい部位における組込みおよび内因性ＩＬＶ３座の破壊を検証した。正しい形質転換体の遺伝子型は、ＢＹ４７４１ ｉｌｖ３：：ＵＲＡ３であった。

プラスミドｐＲＳ４２３：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）およびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）の構築物は、実施例１に記載した。ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３の構築は、共通および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書、実施例１７に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ＩＬＶ３は、ｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１ｐ−ａｌｓＳ−ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３と同じプラスミドである。この構築物は、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＣＵＰ１プロモーター（配列番号：３４）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号：２７）由来のａｌｓＳコード領域、およびＣＹＣ１ターミネーター（配列番号：２４）を含むキメラ遺伝子；および出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＦＢＡプロモーター（配列番号：２５）、ミトコンドリア標的シグナルコード配列を含まない出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＩＬＶ３コード領域（配列番号：１１１）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号：２３）を含むキメラ遺伝子も含む。

試料の調製
標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を使用して、プラスミドベクターｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１ｐ−ａｌｓＳ−ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３およびｐＲＳ４２３：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）を株ＢＹ４７４１ ｉｌｖ３：：ＵＲＡ３に形質転換し、ヒスチジンを含まない合成完全培地上に維持した。プラスミドベクターｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１ｐ−ａｌｓＳ−ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３およびｐＲＳ４２６：：ＦＢＡｐ−ＩＬＶ３（ＫＬ）も株ＢＹ４７４１に形質転換した。ヒスチジンを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地２００ｍｌが入っている１０００ｍｌのフラスコ中で、好気性培養物を、Ｉｎｎｏｖａ４０００インキュベータ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、（Ｅｄｉｓｏｎ， ＮＪ））を用いて３０℃、２２５ｒｐｍで増殖させた。培養物をＯＤ６００測定値１．０〜２．０で回収し、６０００ｘｇで１０分間遠心することによってペレット化した。細胞ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０で洗浄し、活性をアッセイするまでペレットを−８０℃で保存した。０．５ｍｍのビーズ１ｍｌおよび酵母細胞懸濁液１．５ｍｌを使用して、標準ビードビーティング方法で、無細胞抽出物を調製した。抽出物中のタンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定した。実施例１に記載するように、ＤＨＡＤ酵素アッセイおよび比活性算出を行った。表６に示す結果から、ＩＬＶ３欠損細胞におけるＤＨＡＤ活性は、ＩＬＶ３欠損のない細胞の場合より高かったことがわかる。

α−ケトイソバレレート生成のＨＰＬＣによる検証
ＨＰＬＣおよびセミカルビジド誘導体化を使用して、インビトロＤＨＡＤ酵素アッセイからα−ケトイソバレレートの生成を行った。ＤＨＡＤ酵素アッセイは、全容量１．６ｍｌで行い、８００μｌ ２Ｘ 緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ ８．０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、１６０μｌ １０Ｘ基質（１５．６ｍｇ／ｍｌジヒドロキシイソバレレート）、粗抽出物 （典型的には、５０〜２００μｇのタンパク質）、および水からなるものであった。反応を３７℃でインキュベートした。０分および９０分の間隔で、反応を３５０μｌずつ分取し、氷に移し、１３，０００ｘｇ、４℃で２分間遠心して、沈殿したタンパク質を除去した。上澄液を氷冷したＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（Ｓｉｇｍａ）スピンカラムに移し、１３，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心して、酵素および可溶なタンパク質を除去した。フロースルー画分を誘導体化試薬１００μｌ（１％セミカルビジド塩酸塩および１．５％酢酸ナトリウム三水和物）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。反応をＣｏＳｔａｒスピンフィルター（ＣｏＳｔａｒ、０．２２μｍフィルター）に１３，０００ｘｇ、４℃で５分間かけて、いずれの沈殿物も除去した。フロースルー画分を分析用ＨＰＬＣバイアルに移した。

誘導体化されたα−ケトイソバレレートの分析は、Ｓｕｐｅｒｇｕａｒｄ ＬＣ−１８−ＤＢガードカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ；２５ｃｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＳｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−１８カラムを用いて逆相クロマトグラフィーで実施した。注入量は１０μｌであった。移動相はメタノール（Ａ）および５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ７．２であった。利用されたグラジエントプログラムを表７に示す。検出は２５０ｎｍで行われた。

表８に示す結果から、上記の比活性の間接的アッセイで検出されたように、ＫＩＶが細胞において生成されたことが確認された。ＤＨＡＤアッセイの欄に記載のＫＩＶの量は、比活性を決定する際に上述した活性アッセイについて９０分の試料で間接的に決定された量である。このＫＩＶの量は、ＨＰＬＣアッセイで検出された量とよく相関する。

Claims (24)

1. 組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質を含み、前記酵母宿主は、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の発現を低下させる組換え酵母宿主細胞。
2. 前記少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質をコードする遺伝子における破壊を含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
3. 前記内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ、亜硫酸還元酵素、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビオチン合成酵素、アコニターゼ、ホモアコニターゼ、リポ酸合成酵素、フェレドキシン成熟化、ＮＡＤＨユビキノン酸化還元酵素、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ユビキノール−シトクロム−ｃ還元酵素、ＡＢＣタンパク質Ｒｌｉ１、ＮＴＰアーゼＮｂｐ３５、およびヒドロゲナーゼ様タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
4. 前記酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラＨａｎｓｅｎｕｌａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
5. 前記内因性Ｆｅ−Ｓタンパク質が、ミトコンドリアにおいて発現される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
6. 前記内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質が、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼおよびイソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ活性からなる群から選択される活性を有する、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
7. 前記宿主細胞が、配列番号１１４に記載の前記アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を発現するサッカロミセスである、請求項６に記載の組換え酵母宿主細胞。
8. 前記少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質が、真菌２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼおよび植物２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼからなる群から選択される、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
9. 前記異種性真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼがサイトゾルにおいて発現される、請求項８に記載の組換え酵母宿主細胞。
10. 前記異種性真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼが、Ｅ値＜１０^−５の表９の前記プロファイルＨＭＭに一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、配列番号１７９に対応する前記ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤ酵素の前記アミノ酸配列の５６位、１２９位、および２０１位に対応する保存されたシステイン３種類すべてをさらに含む、請求項８に記載の組換え酵母宿主細胞。
11. 前記異種性真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼが、配列番号：４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、および１５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項８に記載の組換え酵母宿主細胞。
12. 前記異種性真菌または植物の２Ｆｅ−２Ｓクラスタージヒドロキシ酸デヒドラターゼが、前記Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、および前記タンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズという前記デフォルトパラメーターを用いて、配列番号：１１４と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項８に記載の組換え酵母宿主細胞。
13. 前記細胞がイソブタノール生合成経路を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
14. 前記細胞がイソブタノールを生成する、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
15. 前記イソブタノールの生成方法であって、請求項１４に記載の組換え酵母宿主細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップを含む方法。
16. 前記少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質が、Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性を有する、請求項１に記載の組換え酵母宿主細胞。
17. Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼ活性を有する前記少なくとも１種の異種性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質が、前記Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法で、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、および前記タンパク質配列の完全長にわたるタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いて、配列番号４４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を有するプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼである、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
18. 前記細胞が２−ブタノールを生成する、請求項１６または１７に記載の組換え宿主細胞。
19. 前記細胞が２−ブタノンを生成する、請求項１６または１７に記載の組換え宿主細胞。
20. 前記細胞が２−ブタノール生合成経路を含む、請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
21. 前記細胞が２−ブタノン生合成経路を含む、請求項１９に記載の組換え宿主細胞。
22. ２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換方法であって、
    ａ）（１）２Ｆｅ−２Ｓジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする少なくとも１種の異種性遺伝子を含む組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性を低下させる組換え酵母宿主細胞；および（２）２，３−ジヒドロキシイソバレレートの供給源を準備するステップと、
    ｂ）（ａ）の組換え宿主細胞を前記２，３−ジヒドロキシイソバレレートの供給源と共に、前記２，３−ジヒドロキシイソバレレートが前記宿主細胞によってα−ケトイソバレレートに変換される条件下で増殖させるステップと
    を含む方法。
23. 請求項２１に記載の組換え酵母宿主細胞を、２−ブタノンが生成される条件下で増殖させるステップを含む、２−ブタノンの生成方法。
24. 前記２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換方法であって、
    ａ）（１）Ｆｅ−Ｓプロパンジオールデヒドラターゼレアクティバーゼをコードする少なくとも１種の異種性遺伝子を含む組換え酵母宿主細胞であって、少なくとも１種の内因性Ｆｅ−Ｓクラスタータンパク質の活性を低下させる組換え酵母宿主細胞；および（２）２，３−ブタンジオールの供給源を準備するステップと、
    ｂ）（ａ）の前記組換え宿主細胞を前記２，３−ブタンジオールの供給源と共に、前記２，３−ブタンジオールが前記宿主細胞によって２−ブタノンに変換される条件下で増殖させるステップと
    を含む方法。

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