MX2012005910A - Metodo para producir butanol mediante el uso de fermentacion extractiva con adicion osmolitica. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para producir butanol mediante fermentación microbiana, en el cual se retira el producto butanol durante la fermentación mediante extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua en presencia de al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. El osmolito puede comprender un monosacárido, un disacárido, glicerol, jugo de caña de azúcar, melazas, polietilenglicol, dextrano, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos. Además, se proporciona un método y una composición para recuperar butanol a partir de un medio de fermentación.

Description

METODO PARA PRODUCIR BUTANOL MEDIANTE EL USO DE FERMENTACION EXTRACTIVA CON ADICION OSMOLITICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de los biocombustibles . Más específicamente, la invención se relaciona con un método para producir butanol mediante fermentación microbiana, en el cual al menos un osmolito se encuentra presente en el medio de fermentación a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, y el producto de butanol se elimina por extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El butanol es una sustancia química industrial importante que tiene una variedad de aplicaciones, tales como el uso como aditivo para combustibles, como componente de una mezcla para el combustible diesel, como sustancia química usada como materia prima en la industria de los plásticos y como agente extractante de grado alimenticio en la industria de los alimentos y saborizantes . Cada año, se producen de de 10 a 12 miles de millones de libras (4.54 a 5.44 miles de Ref . :230182 millones de . kilogramos) de butanol mediante medios petroquímicos . A medida que aumenta la necesidad de obtener butanol, se expande el interés en producir esta sustancia química a partir de recursos renovables tales como maíz, caña de azúcar o alimentación celulósica mediante fermentación.

En un proceso fermentativo para producir butanol, la eliminación de producto en el lugar reduce ventajosamente la inhibición de butanol del microorganismo y mejora la velocidad de fermentación mediante el control de las concentraciones de butanol en el caldo de fermentación. Las tecnologías para la eliminación de producto en el lugar incluyen estabilización, adsorción, pervaporación, extracción por disolvente de membrana y extracción líquido-líquido. En la extracción líquido- líquido se pone en contacto un agente extractante con el caldo de fermentación para dividir el butanol entre el caldo de fermentación y la fase del agente extractante. El butanol y el agente extractante se recuperan mediante un proceso de separación, por ejemplo, mediante destilación.

La solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2009/0171129 Al describe métodos para recuperar alcoholes de C3-C6 de soluciones acuosas diluidas, tales como caldos de fermentación. El método incluye aumentar la actividad del alcohol C3-C6 en una porción de la solución acuosa hasta alcanzar al menos la de la saturación del alcohol de C3-C6 en la porción. De acuerdo con una modalidad de la invención, el aumento de la actividad del alcohol de C3-C6 puede comprender agregar un soluto hidrófilo a la solución acuosa. Se agrega suficiente soluto hidrófilo para permitir la formación de una segunda fase líquida, ya sea solo mediante la adición del soluto hidrófilo o en combinación con otras etapas del proceso. El soluto hidrófilo que se agrega puede ser una sal, un aminoácido, un solvente hidrosoluble , un azúcar o una combinación de estos.

La solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389 presentada el 4 de junio de 2009 describe métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación; los métodos comprenden la etapa de contactar el caldo de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol.

Las solicitudes de patente de los Estados Unidos núm. 61/168,640; 61/168,642; y 61/168,645, presentadas en conjunto el 13 de abril de 2009; y 61/231,697; 61/231,698; y 61/231,699; presentadas en conjunto el 6 de agosto de 2009; describen métodos para producir y recuperar butanol a partir a partir de un medio de fermentación; los métodos comprenden la etapa de contactar el medio de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua que comprende un primer solvente y segundo solvente; el primer solvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22> aldehidos grasos de C12 a C22, Y mezclas de estos, y el segundo solvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes de C7 a Cu, ácidos carboxílicos de C7 a Cu, ésteres de ácidos carboxílicos de C7 a Cu, aldehidos de C7 a Cu y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol.

Se buscan continuamente métodos para producir y recuperar butanol a partir de un medio de fermentación. Se desea encontrar un proceso para la eliminación del producto butanol en el lugar, en el cual la adición osmolítica a un medio de fermentación proporciona una mejor eficacia de extracción de butanol y biocompatibilidad aceptable con el microorganismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para recuperar butanol a partir de un medio de fermentación; el método comprende butanol, agua, al menos un osmolito y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir a partir de al menos una fuente de carbono fermentable . El osmolito está presente en el medio de fermentación a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. La presente invención también proporciona métodos para la producción de butanol mediante el uso del microorganismo y un osmolito que se agrega. Los métodos incluyen poner en contacto el medio de fermentación con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua; opcionalmente, separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase orgánica y recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol. En una modalidad de la invención, se proporciona un método para recuperar butanol a partir a partir de un medio de fermentación; el método comprende: a) proporcionar un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fermentable ; b) poner en contacto el medio de fermentación con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ásteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos grasos de C7 a C22, ésteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; c) opcionalmente, separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado .

En algunas modalidades, una porción del butanol se extrae en forma conjunta del medio de fermentación mediante un proceso que comprende las etapas de: a) estabilizar el butanol del medio de fermentación con un gas para formar una fase gaseosa que contiene butanol; y b) recuperar el butanol de la fase gaseosa que contiene butanol .

De acuerdo con los métodos de la invención, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos. En algunas modalidades, el osmolito comprende un monosacárido, un disacárido, glicerol, jugo de caña de azúcar, melazas, polietilenglicol , dextrano, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el osmolito comprende un monosacárido seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, fructosa, glucosa y combinaciones de estas. En algunas modalidades, el osmolito se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, dextrano, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos.

De acuerdo con los métodos de la invención, en algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste en bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levadura. En algunas modalidades, las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, ArthroJacter, Corynejbacterium y Brevibacterium. En algunas modalidades, la levadura se selecciona del grupo que consiste en Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia y Saccharomyces .

De acuerdo con los métodos de la invención, el primer agente extractante se selecciona del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mistírico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-dodecanol y una combinación de estos. En algunas modalidades, el primer agente extractante comprende alcohol oleílico. En algunas modalidades, el segundo agente extractante se selecciona del grupo que consiste en 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal y una combinación de estos.

En algunas modalidades, el butanol es 1-butanol. En algunas modalidades, el butanol es 2 -butanol. En algunas modalidades, el butanol es isobutanol. En algunas modalidades, el medio de fermentación también comprende etanol, y la fase orgánica que contiene butanol contiene etanol.

En una modalidad de la invención se proporciona un método para la producción de butanol; el método comprende: a) proporcionar un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación bifásico que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a 22 , esteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Cí2 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22, esteres de ácidos carboxílieos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico también comprende al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, durante un tiempo suficiente para permitir la extracción del butanol en el agente extractante orgánico para formar una fase orgánica que contiene butanol; ) separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y ) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

En una modalidad de la invención se proporciona un método para la producción de butanol; el método comprende: a) proporcionar un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación, en donde el microorganismo produce el butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que contiene butanol; c) agregar al menos un osmolito al medio de fermentación para proporcionar el osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional; d) poner en contacto al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22/ amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22/ ácidos carboxílicos de C7 a C22, esteres de ácidos carboxílicos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; e) separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; f) opcionalmente, recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol; y g) opcionalmente, regresar al menos una porción de la fase acuosa al medio de fermentación.

En algunas modalidades, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación en la etapa (c) cuando la fase de crecimiento del microorganismo se vuelve más lenta. En algunas modalidades, se puede agregar el osmoli'to al medio de fermentación en la etapa (c) cuando se completa la fase de producción del butanol.

En algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente comprende una modificación que desactiva una ruta competidora para el flujo de carbono. En algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente no produce acetona.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante se combina con el segundo agente extractante en un recipiente, antes de entrar en contacto con el medio de fermentación en un recipiente de fermentación.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a un recipiente de fermentación, en el cual el medio de fermentación se pone en contacto con los agentes extractantes .

La Figura 3 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a distintos recipientes de fermentación.

La Figura 4 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede corriente abajo del termentador, y el primer agente extractante y el segundo agente extractante se combinan en un recipiente antes de que el medio de fermentación entre en contacto con los agentes extractantes en un recipiente distinto.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención en la que la extracción del producto se produce corriente abajo del fermentador y el primer agente extractante inmiscible en agua y el segundo agente extractante opcional inmiscible en agua se agregan por separado a un recipiente en el que el medio de fermentación entra en contacto con los agentes extractantes.

La Figura 6 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede corriente abajo del fermentador, y el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a distintos recipientes para que entren en contacto con el medio de fermentación.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede en al menos un fermentador por lotes a través de un flujo de corrientes paralelas de un agente extractante orgánico inmiscible en agua en o cerca del fondo de una masa de fermentación para llenar el fermentador con agente extractante que fluye fuera del fermentador en un punto en la parte superior, o cerca de éste, del fermentador.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del C.F.R., 1.821 1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - reglas de las secuencias") según la norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual ( IPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas) .

Tabla la. Sec . con números de ident . de secuencias codificantes y proteínas Tabla Ib. Sec. con números de ident. de secuencias que se usan en la construcción, cebadores y vectores DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para recuperar butanol a partir a partir de un medio de fermentación microbiano que comprende al menos un osmolito mediante la extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. El osmolito está presente en el medio de fermentación a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. La fase orgánica que contiene butanol se separa de la fase acuosa, y se puede recuperar el butanol. También se proporcionan métodos para producir butanol. Definiciones En esta descripción se usan las siguientes definiciones.

El término "osmolito" se refiere a un compuesto orgánico que afecta la osmosis. Un osmolito es soluble en la solución en una célula y/o en el fluido circundante (por ejemplo, caldo de fermentación) y cumple una función en el mantenimiento del volumen, equilibrio de fluidos y potencial de agua de la célula.

El término "butanol" se refiere a 1-butanol, 2-butanol y/o isobutanol, individualmente o como mezclas de estos.

El término "inmiscible en agua" se refiere a un componente químico, tal como un agente extractante o un solvente, el cual es incapaz de mezclarse con una solución acuosa, tal como un caldo de fermentación, de manera tal que forme una fase líquida.

El término "agente extractante" , como se usa en la presente invención, se refiere a uno o más solventes orgánicos que se usan para extraer butanol de un caldo de fermentación.

El término "medio de fermentación bifásico" se refiere a un medio de crecimiento bifásico que comprende un medio de fermentación (es decir, una fase acuosa) y una cantidad adecuada de un agente extractante orgánico inmiscible en agua.

El término "fase orgánica", como se usa en la presente invención, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner en contacto un caldo de fermentación con un agente extractante inmiscible en agua.

El término "fase acuosa", como se usa en la presente invención, se refiere a la fase de una mezcla bifásica, obtenida al poner en contacto un medio de fermentación acuoso con un agente extractante orgánico, el cual comprende agua.

El término "eliminación de producto en el lugar" , como se usa en la presente invención, significa la eliminación selectiva de un producto de fermentación específico a partir de un proceso biológico tal como fermentación, para controlar la concentración de producto en el proceso biológico.

El término "caldo de fermentación" , como se usa en la presente, significa la mezcla de agua, azúcares, sólidos disueltos, sólidos suspendidos, microorganismos que producen butanol, butanol producto y todos los otros constituyentes del material que se conserva en el recipiente de fermentación en el cual se produce el butanol producto mediante la reacción de azúcares en butanol, agua y dióxido de carbono (C02) por los microorganismos presentes. El caldo de fermentación puede comprender una o más fuentes de carbono fermentable, tales como los azúcares descritos en la presente invención. El caldo de fermentación es la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica. Oportunamente, como se usa en la presente descripción, el término "medio de fermentación" se puede usar como sinónimo de "caldo de fermentación" .

Como se usa en la presente invención, el término "recipiente de fermentación" significa el recipiente en el cual se realiza la reacción de fermentación mediante la que se obtiene el butanol producto de los azúcares. El término "fermentador" se puede usar como sinónimo de "recipiente de fermentación" en la presente descripción.

El término "fuente de carbono fermentable" se refiere a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por los microorganismos descritos en la presente invención. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos ; polisacáridos , tales como almidón o celulosa; sustratos de un carbono; y una combinación de estos, que se pueden encontrar en el medio de fermentación. Las fuentes de carbono fermentable incluyen carbono renovable, es decir, carbono que no se basa en petróleo, que incluyen carbono de materias primas agrícolas, algas, celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa o cualquier combinación de estas.

El término "ácido graso", como se usa en la presente invención, se refiere a un ácido carboxílico con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22 , el cual es saturado o insaturado.

El término "alcohol graso" , como se usa en la presente invención, se refiere a un alcohol con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22 el cual es saturado o insaturado .

El término "aldehido graso" , como se usa en la presente invención, se refiere a un aldehido con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22 , el cual es saturado o insaturado .

El término "amida grasa" , como se usa en la presente invención, se refiere a una amida con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C12 a C22, la cual es saturada o insaturada.

El término "coeficiente de partición", abreviado en la presente invención como Kp, significa la relación de la concentración de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos solventes inmiscibles en equilibrio. Un coeficiente de partición es una medida de la solubilidad diferencial de un compuesto entre dos solventes inmiscibles. Como se usa en la presente invención, el término "coeficiente de partición de butanol" se refiere a la relación de concentraciones de butanol entre la fase orgánica que comprende el agente extractante y la fase acuosa que comprende el medio de fermentación. Como se usa en la presente invención, el coeficiente de partición es sinónimo del término "coeficiente de distribución" .

El término "separación" , como se usa en la presente invención, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a remover un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto con una mayor pureza o a una concentración más alta que la pureza o la concentración del compuesto en la mezcla inicial.

El término "ruta biosintética del butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol, 2 -butanol o isobutanol.

El término "ruta biosintética del 1-butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetil coenzima A (acetil CoA) .

El término "ruta biosintética del 2-butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 2-butanol a partir de piruvato.

El término "ruta biosintética del isobutanol" , como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato.

Como se usa en la presente descripción el término "título efectivo" se refiere a la cantidad total de butanol producida por fermentación por cada litro del medio de fermentación. La cantidad total de butanol incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del agente extractante orgánico; y (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase gaseosa si se usó estabilización con gas.

El término "índice eficaz" , como se usa en la presente invención, se refiere a la cantidad total de butanol producida por fermentación por título de medio de fermentación por hora de fermentación.

Como se usa en la presente descripción, el término "rendimiento eficaz" se refiere a la cantidad de butanol que se produce por unidad de sustrato de carbono fermentable consumida por el catalizador biológico durante la fermentación.

El término "condiciones aerobias" , como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento en presencia de oxígeno.

El término "condiciones microaerobias" , como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento con niveles bajos de oxígeno (es decir, por debajo de los niveles normales de oxígeno atmosférico) .

El término "condiciones anaerobias" , como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento en ausencia de oxígeno.

El término "medios mínimos" , como se usa en la presente invención, se refiere a los medios de crecimiento que contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento, generalmente, sin la presencia de aminoácidos. Un medio mínimo contiene, típicamente, una fuente de carbono fermentable y varias sales, que podrían variar entre los microorganismos y las condiciones de crecimiento; estas sales proporcionan, generalmente, elementos esenciales, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre para permitir que el microorganismo sintetice proteínas y ácidos nucleicos.

El término "medios definidos", como se usa en la presente invención, se refiere a los medios de crecimiento que tienen cantidades conocidas de todos los ingredientes presentes, por ejemplo, una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno definidas, y elementos traza y vitaminas requeridos por el microorganismo.

El término "biocompatibilidad" , como se usa en la presente invención, se refiere a la medida de la capacidad de un microorganismo para usar glucosa en presencia de un agente extractante. Un agente extractante biocompatible permite que el microorganismo use glucosa. Un agente extractante no biocompatible (es decir, biotóxico) no permite que el microorganismo use glucosa, por ejemplo, a un índice mayor que aproximadamente 25 % del índice cuando el agente extractante no está presente.

El término "°C" significa grados Celsius.

El término "OD" significa densidad óptica, por sus siglas en inglés.

El término "OD60o" se refiere a la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm.

El término ATCC se refiere a la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) , Manassas, VA.

El término "s" significa segundo(s).

El término "min" significa minuto(s).

El término "h" significa hora(s).

El término "mi" significa mililitro (s) .

El término "1" significa litro.

El término "g" significa gramo(s).

El término "mmol" significa milimol (es) .

El término "M" significa molar.

El término "µ?" significa microlitro (s) .

El término "yg" significa microgramo (s) .

El término " g/ml" significa microgramo por mililitro.

El término "ml/min" significa mililitros por minuto.

El término "g/1" significa gramos por litro.

El término "g/l/h" significa gramos por litro por hora.

El término "mmol/min/mg" significa milimol por minuto por miligramo.

El término "temp." significa temperatura.

El término "rpm" significa revoluciones por minuto.

El término "HPLC" significa cromatografía de gas de alta presión, por sus siglas en inglés.

El término "CG" significa cromatografía de gas, por sus siglas en inglés.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes y otras referencias que se mencionan en la presente se incorporan expresamente como referencia en su totalidad para todas las finalidades. Además, cuando se proporciona una cantidad, concentración u otro valor o parámetro, ya sea como un intervalo, un intervalo preferido o una lista de valores superiores preferibles y valores inferiores preferibles, se entenderá que se describe específicamente todos los intervalos formados de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, sin considerar si los intervalos se describen por separado. En los casos en que en la presente se menciona un intervalo de valores numéricos, a menos que se establezca de cualquier otra forma, el intervalo pretende incluir los límites de este y todos los números enteros y fracciones comprendidos dentro del intervalo. No está previsto que el alcance de la invención esté limitado a los valores específicos mencionados al definir un intervalo. Microorganismos genéticamente modificados Los huéspedes microbianos para la producción de butanol pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. El huésped microbiano empleado debe ser tolerante al producto butanol producido para que el rendimiento no esté limitado por la toxicidad del producto para el huésped. La selección de un huésped microbiano para la producción de butanol se describe detalladamente a continuación.

Los microbios que son metabólicamente activos a concentraciones de butanol de título alto no son muy conocidos en la técnica. Aunque se han aislado mutantes tolerantes al butanol de Clostridia solventogénica , se dispone de poca información con respecto a la tolerancia al butanol de otras cepas bacterianas potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de tolerancia al alcohol en bacterias sugieren que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbiol . Lett . 220:223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) describen que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede verse limitado por la toxicidad del butanol. El efecto principal del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la alteración de las funciones de la membrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol . 50:1238-1243 (1985)).

Los huéspedes microbianos seleccionados para la producción de butanol deben ser tolerantes al butanol y deben poder convertir carbohidratos en butanol al usar la ruta biosintética introducida que se describe más adelante. Los criterios para seleccionar huéspedes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al butanol, alta velocidad de uso de carbohidratos, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación génica y capacidad de generar alteraciones cromosómicas estables.

Las cepas de huéspedes adecuadas con tolerancia al butanol pueden identificarse por selección basándose en la tolerancia intrínseca de la cepa. Puede medirse la tolerancia intrínseca de microbios al butanol al determinar la concentración de butanol que es responsable de inhibir el 50 % de la velocidad de crecimiento (IC50) cuando se cultiva en un medio mínimo. Los valores IC50 pueden determinarse con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microbios de interés pueden cultivarse en presencia de diversas cantidades de butanol y se controla la velocidad de crecimiento al determinar la densidad óptica a 600 nanómetros . El tiempo de duplicación puede calcularse a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y usarse como una medida de la velocidad de crecimiento. La concentración de butanol que produce 50 % de inhibición del crecimiento puede determinarse a partir de una gráfica del porcentaje de inhibición de crecimiento contra la concentración de butanol . Preferentemente, la cepa huésped debe tener un IC50 de butanol mayor que aproximadamente 0.5 %. Más apropiada es una cepa huésped que tiene un IC50 de butanol mayor que aproximadamente 1.5 %. Es de particular preferencia una cepa huésped que tiene un IC50 de butanol mayor que aproximadamente 2.5 %.

El huésped microbiano para la producción de butanol también debe tener un índice alto de uso de glucosa y/u otros carbohidratos. La mayoría de los microbios tienen la capacidad de usar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden usar los carbohidratos eficazmente y, por consiguiente, no serían huéspedes adecuados.

La capacidad de modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante . Los modos de tecnología de transferencia de genes que pueden usarse incluyen la electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Existe una amplia variedad de plásmidos conjugativos del huésped y marcadores de resistencia a fármacos. Los vectores de clonación usados con un organismo se adaptan al organismo huésped en función de la naturaleza de los marcadores de resistencia a antibióticos que pueden actuar en ese huésped.

El huésped microbiano también puede manipularse con el fin de inactivar rutas competitivas para el flujo de carbonos mediante la inactivación de varios genes. Esto requiere la disponibilidad de transposones o vectores de integración cromosómica para dirigir la inactivación. Además, los huéspedes de producción que son sensibles a la mutagénesis química pueden experimentar mejoras en la tolerancia intrínseca al butanol a través de la mutagénesis química y la selección de mutantes.

Como ejemplo de la inactivación de las rutas competitivas para el flujo de carbono, se puede reducir o eliminar la piruvato descarboxilasa (véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 20090305363.) En algunas modalidades, el butanol es el principal producto del microorganismo. En algunas modalidades, el microorganismo no produce acetona.

Sobre la base de los criterios descritos anteriormente, los huéspedes microbianos adecuados para la producción de butanol incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia y Saccharomyces. Los huéspedes preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae .

Los microorganismos mencionados anteriormente pueden modificarse genéticamente para convertir fuentes de carbono fermentables en butanol, específicamente, 1-butanol, 2-butanol o isobutanol, mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Los microorganismos adecuados incluyen Escherichia, Lactobacillus y Saccharomyces. Los microorganismos adecuados incluyen E. coli, L. plantarum y S. cerevisiae . Además, el microorganismo puede ser una cepa tolerante al butanol de uno de los microorganismos enumerados anteriormente que se aisla con el método descrito por Bramucci et al. (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 11/761497; y patente núm. WO 2007/146377) . Un ejemplo de una cepa así es la cepa de Lactobacillus plantarum PN0512 (ATCC: PTA-7727, depósito biológico hecho el 12 de julio de 2006 para la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 11/761497) .

Las rutas biosintéticas adecuadas para la producción de butanol se conocen en la técnica y en la presente descripción se describen ciertas rutas adecuadas. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende al menos un gen que es heterólogo de la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende más de un gen que es heterólogo de la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética del butanol comprende genes heterólogos que codifican polipéptidos correspondientes a cada etapa de una ruta biosintética.

Del mismo modo, ciertas proteínas adecuadas que tienen la capacidad de catalizar las conversiones de sustrato en producto indicadas se describen en la presente invención, y otras proteínas adecuadas se proporcionan en la técnica. Por ejemplo, las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms . US20080261230 , US20090163376 y US20100197519 describen acetohidroxi ácido isomerorreductasas como lo hace la solicitud de los Estados Unidos núm. de serie: 12/893,077, presentada el 29 de septiembre de 2010; la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100081154 describe dihidroxi ácido deshidratasas ; las alcohol deshidrogenasas se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20090269823 y en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/290636.

Los microorganismos se pueden modificar genéticamente para contener una ruta biosintética de 1-butanol para producir 1-butanol. Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al. en la patente núm. 2007/041269, que se incorpora en la presente descripción como referencia. Por ejemplo, el microorganismo puede modificarse genéticamente para expresar una ruta biosintética de 1-butanol que comprende el siguiente sustrato catalizado enzimáticamente para conversiones de productos: a) acetil CoA en acetoacetil -CoA; b) acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA; c) 3-hidroxibutiril-CoA en crotonil -CoA; d) crotonil-CoA en butiril-CoA; e) butiril-CoA en buliraldehído; y f) buliraldehído en a-butanol.

Los microorganismos se pueden modificar, además, genéticamente para expresar una ruta biosintética de 2-butanol para producir 2-butanol. Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al. en las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms . 2007/0259410 y 2007/0292927, y en las publicaciones de solicitudes del PCT núms. WO 2007/130518 y WO/2007 130521. Por ejemplo, en una modalidad el microorganismo puede modificarse genéticamente para expresar una ruta biosintética de 2-butanol que comprende el siguiente sustrato catalizado enzimáticamente para conversiones de productos : a) piruvato en alfa acetolactato; b) alfa acetolactato en acetoína; c) acetoína en 2 , 3-butanodiol ; d) 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona; y e) 2-butanona en 2-butanol.

Los microorganismos se pueden modificar, además, genéticamente para expresar una ruta biosintética del isobutanol para producir isobutanol . Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al. en las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms. 2007/0092957 y WO 2007/050671. Por ejemplo, el microorganismo puede modificarse genéticamente para contener una ruta biosintética del isobutanol que comprende el siguiente sustrato catalizado enzimáticamente para conversiones de productos: a) piruvato en acetolactato; b) acetolactato en 2 , 3-dihidroxiisovalerato; c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato ; d) a-cetoisovalerato en isobutiraldehído; y e) isobutiraldehído en isobutanol.

La cepa de Escherichia coli puede comprender: (a) una ruta biosintética del isobutanol codificada por los siguientes genes: budB (sec. con núm. de ident . : 1) de Klebsiella pneu oniae que codifica acetolactato sintasa (indicada como sec. con núm. de ident.: 2), ilvC (indicada como sec. con núm. de ident.: 3) de E. coli que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa (indicada como sec. con núm. de ident . : 4), ilvD (indicada como sec. con núm. de ident . : 5) de E. coli que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa (indicada como sec. con núm. de ident.: 6), kivD (indicada como sec. con núm. de ident.: 7) de Lactococcus lactis que codifica la cetoácido decarboxilasa de cadena ramificada (indicada como sec. con núm. de ident. : 8) y sadB (indicada como sec. con núm. de ident.: 9) de Achromobacter xylosoxidans que codifica una butanol deshidrogenasa (indicada como sec. con núm. de ident.: 10). Las enzimas codificadas por los genes de la ruta biosintética del isobutanol catalizan el sustrato para producir las conversiones que convierten piruvato en isobutanol, tal como se describió anteriormente. Específicamente, la acetolactato sintasa cataliza la conversión de piruvato en acetolactato, la acetohidroxiácido reductoisomerasa cataliza la conversión de acetolactato en 2 , 3-dihidroxiisovalerato, la acetohidroxiácido deshidratasa cataliza la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato, la cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada cataliza la conversión de a-cetoisovalerato en isobutiraldehído, y la butanol deshidrogenasa cataliza la conversión de isobutiraldehído en isobutanol. Esta cepa recombinante de Escherichia coli se puede construir mediante métodos conocidos en la técnica (véanse las solicitudes de patentes copendientes de los Estados Unidos núms . 12/478,389 y 12/477,946) y/o descritas en la presente más adelante. Se contempla la construcción de cepas adecuadas que comprenden una secuencia que tiene al menos aproximadamente 70-75 % de identidad, al menos aproximadamente 75-80 %, al menos aproximadamente 80-85 % de identidad o al menos aproximadamente 85-90 % de identidad con las secuencias de proteínas descritas en la presente.

La cepa de Escherichia coli podría comprender deleciones de los siguientes genes para eliminar las rutas competidoras que limitan la producción de isobutanol : pflB, indicado como sec. con núm. de ident . : 71, (que codifica para piruvato formato liasa) IdhA, indicado como sec. con núm. de ident núm.: 73, (que codifica para lactato deshidrogenasa) , adhE, indicado como sec. con núm. de ident.: 77, (que codifica para alcohol deshidrogenasa) , y al menos un gen que comprende el opérón frdABCD (que codifica para fumarato reductasa) , específicamente, frdA, indicado como sec. con núm. de ident.: 75, frdB, indicado como sec. con núm. de ident.: 90, frdC, indicado como sec. con núm. de ident.: 92, y frdD, indicado como sec. con núm. de ident.: 94.

La cepa de Saccharomyces cerevisiae puede comprender: una ruta biosintética del isobutanol codificada por los siguientes genes: región codificante de alsS de Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident.: 11) que codifica acetolactato sintasa (sec. con núm. de ident.: 12), ILV5 de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident.: 13) que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa (KA I; sec. con núm. de ident.: 14) y/o una KARI mutante, tal como la codificada por Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 15; proteína con sec. con núm. de ident.: 16), ilvD de Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident.: 17) que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa (sec. con núm. de ident.: 18), kivD de Bacillus subtilis (secuencia codificada por codones indicada como sec. con núm. de ident.: 19) que codifica la cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada (sec. con núm. de ident.: 20) y sadB de Achromobacter xylosoxidans (sec. con núm. de ident.: 9) que codifica una butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident.: 10). Las enzimas codificadas por los genes de la ruta biosintética del isobutanol catalizan el sustrato para producir conversiones que convierten piruvato en isobutanol, tal como se describe en la presente. Se contempla la construcción de cepas adecuadas que comprenden una secuencia que tiene al menos aproximadamente 70-75 % de identidad, al menos aproximadamente 75-80 %, al menos aproximadamente 80-85 % de identidad o al menos aproximadamente 85-90 % de identidad con las secuencias de aminoácidos descritas en la presente.

Una cepa de levadura que expresa una ruta del isobutanol con actividad de acetolactato sintasa (ALS) en el citosol y que tiene deleciones de los genes de piruvato descarboxilasa (PDC) endógenos se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/477,942. Se comprobó que esta combinación de ALS citosólico y expresión reducida de PDC aumenta considerablemente el flujo de piruvato a acetolactato, que luego fluye a la ruta para la producción de isobutanol . La cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae se puede construir mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente descripción. Otras cepas de levadura adecuadas se conocen en la técnica. Se proporcionan ejemplos adicionales en las solicitudes provisionales de los Estados Unidos núms. de serie 61/379546, 61/380563 y en la solicitud de los Estados Unidos núm. de serie 12/893089.

Otras modificaciones adecuadas para los microorganismos, que se usan junto con los procesos provistos en la presente invención incluyen modificaciones para reducir la actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20090305363, modificaciones de una célula huésped que proporcionan mayor flujo de carbono mediante una ruta de Entner-Doudoroff o la reducción del equilibro de los equivalentes como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100120105. Las cepas de levadura con mayor actividad de proteínas heterólogas que requieren la fijación de un grupo Fe-S para su actividad se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100081179. Otras modificaciones incluyen modificaciones en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa de función doble, que se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639, y la integración de al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que usa piruvato, que se describe en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/380563.

Adicionalmente, las células huésped que comprenden al menos una deleción, una mutación y/o una sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis del agrupamiento de Fe-S se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/305333, y las células huéspedes que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de fosfocetolasa y células huésped que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransacetilasa se describen en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/356379.

Construcción de una cepa de levadura adecuada NGI-049 es un ejemplo de una cepa adecuada de Saccharomyces cerevisiae. NGI-049 es una cepa con inserción-inactivación de los genes PDC1, PDC5 y PDC6 endógenos que contiene los vectores de expresión pLH475-Z4B8 y pLH468. Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres isoenzimas principales de la piruvato descarboxilasa . La cepa expresa genes que codifican enzimas para una ruta biosintética del isobutanol que están integrados o en plásmidos . La construcción de la cepa NGI-049 se proporciona en la presente invención.

La actividad de la piruvato descarboxilasa endógena en la levadura convierte el piruvato en acetaldehído, que luego se convierte en etanol o en acetil-CoA mediante acetato. Por lo tanto, la actividad de piruvato descarboxilasa endógena es un objetivo para la reducción o eliminación de la formación de subproductos.

Se han informado ejemplos de otras cepas de levadura con menor actividad de piruvato descarboxilasa debido a la interrupción de los genes que codifican piruvato descarboxilasa, tales como Saccharomyces en Flikweert et al.

(Yeast (1996) 12:247-257), Kluyveromyces en Bianchi et al.

(Mol. Microbiol. (1996) 19 (1) : 27-36) , y a la interrupción del gen regulador en Hohmann, (Mol Gen Genet . (1993) 241:657-666). Las cepas de Saccharomyces que no tienen actividad de piruvato descarboxilasa pueden obtenerse de ATCC (núms. de acceso 200027 y 200028) .

Construcción del cásete de integración pdc6 : : GPMpl - sadB y supresión de PDC6 : Se preparó un cásete de integración pdc6 : :GPMlp-sadB- ADH11-URA3r al unir el segmento GPM-sadB-ADHt (sec. con núm. de ident.: 21) de pRS425 : : GPM-sadB (sec. con núm. de ident . : 63) al gen URA3r de pUC19-URA3r. pUC19-URA3r (sec. con núm. de ident. : 22) contiene el marcador XJRA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 75 bp para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador URA3. Se unieron los dos segmentos de ADN mediante empalme por superposición de extensión (SOE, por sus siglas en inglés) y reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) (como se describe en Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) usando como plantilla los ADN plasmídicos pRS425:: GPM-sadB y pUC19-URA3r, con ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; catálogo núm. F-540S) , y los cebadores 114117-11A a 114117-11D (sec. con núms. de ident . : 23, 24, 25 y 26) , y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident. : 27 y 28) .

Los cebadores externos para la SOE PCR (114117-13A y 114117-13B) contenían regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones corriente arriba y corriente abajo del promotor y terminador de PDC6, respectivamente. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 (núm. de la ATCC 200866) , y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se seleccionaron por PCR mediante el uso de los cebadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núms. de ident.: 30 y 31) , y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núms. de ident . : 29 y 32) para verificar la integración en el locus de PDC6 con la deleción de la región codificante de PDC6. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : :PGPm- sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl : : PDCl-ilvD y supresión de PDCl: Un cásete de integración pdcl : : PDClp- ilvD-FBAlt-URA3r se elaboró al unir el segmento ilvD-FBAlt (sec. con núm. de ident. :33) de pLH468 al gen URA3r de pUC19-URA3r por SOE PCR (como lo describió Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) mediante el uso como plantilla de los ADN de pLH468 y el plásmido pUC19-URA3r con Phusion ADN-polimerasa . (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; núm. de catálogo F-540S) y los cebadores 114117-27A a 114117-27D (sec. con núms . de ident.: 34, 35, 36 y 37).

Los cebadores externos para la SOE PCR (114117-27A y 114117-27D) contenían las regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones corriente abajo del promotor de PDCl y corriente abajo de la secuencia codificante de PDCl. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 pdcG : :PGPM1-sadB-ADHlt, y los transformantes se mantuvieron en medios sintéticos completos sin uracilo y suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se seleccionaron por PCR mediante el uso de los cebadores 114117-36D y 135 (sec. con núms . de ident . : 38 y 39), y los cebadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident.: 32 y 40) para verificar la integración en el locus de PDCl con deleción de la secuencia codificante de PDCl. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : :GPMlp-sadB-ADHlt pdcl : : PDClp- ilvD-FBAlt . Supresión de HIS3 Para suprimir la región codificante HIS3 endógena, un cásete his3::URA3r2 se amplificó por PCR de la plantilla de ADN URA3r2 (sec. con núm. de ident.: 41). URA3r2 contiene el marcador de URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 500 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador de URA3. La PCR se realizó con la ADN polimerasa Phusion y los cebadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms . de ident . : 42 y 43) , que generaron un producto de PCR de -2.3 kb. La porción HIS3 de de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del HIS3 promotor de y la región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador URA3r2 produzca el reemplazo de la región codificante de HIS3. El producto de PCR se transformó en NYLA67 mediante técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202), y se seleccionaron transformantes en un medio completo sintético sin uracilo y enriquecido con glucosa al 2 % a 30 °C. Se seleccionaron transformantes para verificar la correcta integración mediante la réplica en placas de transformantes en un medio completo sintético sin histidina y enriquecido con glucosa al 2 % a 30 °C. El marcador URA3r se recicló mediante la colocación en placas en un medio completo sintético enriquecido con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 °C de acuerdo con los protocoles estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante "NYLA73" tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : GPMlp- sadB-ADHlt pdcl : : PDClp-ilvD-FBA1 t ñhis3.

Construcción del cásete de integración pdc5 : : kanMX y supresión de PDC5 : Se amplificó por PCR un cásete pdc5::kanMX4 del adn cromosómico de la cepa YLR134W (núm. de la ATCC 4034091) con la ADN polimerasa Phusion y los cebadores PDC5::KanMXF y PDC5::KanMXR (sec. con núms . de ident . : 44 y 45), lo cual generó un producto de PCR de -2.2 kb. La porción de PDC5 de cada cebador se derivó de la región 5' corriente arriba del promotor de PDC5 y la región 3' corriente abajo de la región codificante para que la integración del marcador de kanMX4 produzca el reemplazo de la región codificante de PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA73 mediante técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) , y se seleccionaron transformantes en un medio YP enriquecido con etanol al 1 % y geneticina (200 mg/ml) a 30 °C. Los transformantes se seleccionaron mediante PCR para verificar la integración correcta en el locus de PDC con el reemplazo de la región codificante de PDC5 mediante el uso de los cebadores PDC5kofor y N175 (sec. con núms. de ident.: 46 y 47) . Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6 : : GPMlp-sadB-ADHlt pdcl : : PDClp- ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5 : :kanMX4.

Construcción de pLH475-Z4B8 El plásmido pLH475-Z4B8 (sec. con núm. de ident. :48) se construyó para la expresión de ALS y KARI en levadura. El pLH475-Z4B8 es un vector pHR81 (ATCC núm. 87541) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) El promotor CUP1 (sec. con núm. de ident . : 49) , región codificante de acetolactato sintasa de Bacillus subtilis (AlsS; sec. con núm. de ident.: 11; proteína sec. con núm. de ident.: 12) y terminador CYC1 (CYC1-2; sec. con núm. de ident . : 50) ; 2) un promotor ILV5 (sec. con núm. de ident. :51), región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 15; proteína sec. con núm. de ident.: 16) y terminador ILV5 (sec. con núm. de ident. :52); y 3) el promotor FBA1 (sec. con núm. de ident. :53), región codificante de KARI de S. cerevisiae {ILV5; sec. con núm. de ident.: 13; proteína sec. con núm. de ident.: 14) y terminador CYC1 (sec. con núm. de ident. : 54) .

La región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 es una secuencia que codifica KARI derivada de Pseudomonas fluorescens, pero que contiene mutaciones, que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20090163376 , que se incorpora en la presente como referencia. La KARI codificada por Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 16) tiene los siguientes cambios de aminoácidos en comparación con la KARI natural de Pseudomonas fluorescens : C33L: la cisteína en la posición 33 cambió a leucina, R47Y: la arginina en la posición 47 cambió a tirosina, S50A: la serina en la posición 50 cambió a alanina, T52D: la treonina en la posición 52 cambió a asparagina, V53A: la valina en la posición 53 cambió a alanina, L61F: la leucina en la posición 61 cambió a fenilalanina, T80I: la treonina en la posición 80 cambió a isoleucina, A156V: la alanina en la posición 156 cambió a treonina, y G170A: la glicina en la posición 170 cambió a alanina. La región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 se sintetizó mediante DNA 2.0 (Palo Alto, CA; sec . con núm. de ident.:15) sobre la base de codones que se optimizaron para la expresión en Saccharomyces cerevisiae .

Vector de expresión pLH468 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident . : 55) se construyó para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura.

Las regiones que codifican cetoisovalerato descarboxilasa (KivD, por sus siglas en inglés) de B . subtilis y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH, por sus siglas en inglés) se sintetizaron mediante DNA2.0 sobre la base de codones que se optimizaron para la expresión en Saccharomyces cerevisiae (sec. con núms . de ident.: 19 y 56, respectivamente) y se proporcionaron en los plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son sec. con núms. de ident. 20 y 57, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para el ensamble de pLH467 (pRS426 : : PGPDi-.kivDy-GPDlt) , el vector pNY8 (sec. con núm. de ident . : 58; también denominado pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20080182308 , Ejemplo 17, que se incorpora en la presente descripción como referencia) se digirió con las enzimas AscI y Sfil, para así cortar el promotor GPD1 (sec. con núm. de ident.: 59) y la región codificante ald. Un fragmento del promotor de GPD1 (GPD1-2; sec. con núm. de ident.: 60) de pNY8 se amplificó por PCR para agregar un sitio AscI en el extremo 5' y un sitio Spel en el extremo 3', mediante el uso del cebador 5' OT1068 y el cebador 3' OT1067 (sec. con núms . de ident.: 61 y 62) . El fragmento del vector pNY8 digerido con Ascl/Sfil se unió con el producto de PCR del promotor de GPD1 digerido con AscI y Spel, y el fragmento Spel-Sfil que contiene la región codificante kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. La triple ligadura generó el vector pLH467 (pRS426 : : PGPD1-kivDy-GPDlt.) . Se verificó pLH467 mediante mapeo de restricción y secuenciación.

Se derivó pLH435 (pRS425: : PGPMI-Had y-ADHl ) del vector pRS425 : :GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 63) que se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/477942, Ejemplo 3, que se incorpora en la presente descripción como referencia. pRS425 : :GPM-sadB es el vector pRS425 (núm. de la ATCC 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor de GPM1 (sec. con núm. de ident.: 64), la región codificante de una butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans (sadB; sec . con núm. de ident . : 9; proteína con sec. con núm. de ident.: 10: descrita en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20090269823) y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 65). pRS425 : :GPMp-sadB contiene los sitios Bbvl y Pací en los extremos 5' y 3' de la región codificante sadB, respectivamente. Un sitio Nhel se adicionó en el extremo 5' de la región codificante sadB por mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de los cebadores OT1074 y OT1075 (sec. con núms . de ident. :66 y 67) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI , el cual se amplificó por secuenciación. El pRS425 : : PGmi-sadB-Nhel se digirió con Miel y Pací para desprender la región codificante sadB y se ligó con el fragmento Nhel-Pací que contiene la región codificante HADH optimizada por codones del vector pHadhy-DNA2.0 para crear pLH435.

Para combinar los casetes de expresión de KivD y HADH en un solo vector, el vector de levaduras pRS411 (núm. de la ATCC 87474) se digirió con SacI y Notl y se unió con el fragmento Sacl-Sall de pLH467 que contiene el cásete PGPDI-kivDy-GPDlt junto con el fragmento Sall-Notl de pLH435 que contiene el cásete PGPM1-Kadhy-ADHlt en una reacción de unión triple. Esto produjo el vector pRS411 : : PGPD1-kivDy-PGPM1-Hadhy (pLH441) , que se verificó con mapeo de restricción.

Para generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta de isobutanol inferior: ilvD, kivDy y Kadhy, se usó pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident . : 68), que se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569636 como fuente del gen IlvD. Este vector lanzadera contiene un origen de replicación Fl (de nt 1423 a 1879) para el mantenimiento en E. coli y un origen de 2 miera (de nt 8082 a 9426) para la replicación en levadura. El vector tiene un promotor de FBA (de nt 2111 a 3108; sec. con núm. de ident.: 53) y un terminador de FBA (de nt 4861 a 5860; sec. con núm. de ident.: 69) . Además, tiene el marcador His (de nt 504 a 1163) para la selección en levadura y el marcador de resistencia a la ampicilina (de nt 7092 a 7949) para la selección en E. coli. La región codificante de ilvD (de nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident. 17; proteína con sec. con núm. de ident.: 18) de Streptococcus mutans UA159 (núm. de la ATCC 700610) se encuentra entre el promotor de FBA y el terminador de FBA, y forma un gen quimérico para la expresión. Además, una etiqueta Lumio está fusionada a la región codificante de ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealiz r pRS423 FBA ilvD(Strep) (también denominado pRS423 -FBA (Spel ) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con una longitud total de 9,482 pb . La segunda etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pLH441 con SacI y Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN poldmerasa) , que da un fragmento de 6,063 pb . Este fragmento se unió con el fragmento del vector de 9,482 bp de pRS423-FBA(SpeI) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio . Este vector generado pLH468 (pRS423 : : PFBAI-ilvD (Strep) Lumio-FBAlt-PGPD1-kivDy-GPDlt-PGPM1-hadhy-ADHlt) se confirmó por mapas de restricción y secuenciación .

Los vectores plasmidicos pLH468 y pLH475-Z4B8 se transformaron simultáneamente en la cepa BY4700 pdc6::GPMlp-sadB-ADHlt pdcl : : PDClp- ilvD-FBAlt Úhis3 pdc5::kanMX4 mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y la cepa resultante se mantuvo en medio completo sintético sin histidina ni uracilo, y complementado con 1 % de etanol a 30 °C. La cepa resultante se denominó NGI-049.

Construcción de una cepa de E. coli adecuada NGCI-031 es un ejemplo de una cepa de E. coli adecuada. NGCI-031 es una cepa que contiene una ruta biosintética del isobutanol y deleciones de los genes pflB, frdB, IdhA y adhE. La construcción de la cepa NGCI-031 se proporciona en la presente invención.

Construcción de una cepa de E. coli que tiene deleciones de los genes pflB, frdB, IdhA y adhE En la presente invención se proporciona un método adecuado para eliminar los genes pflB, frdB, ldhA y adhE de E. coli. La recolección Keio de cepas de E. coli (Baba et al., Mol. Syst. Biol . , 2:1-11, 2006) se usó para la producción de ocho de los knockouts. La recolección Keio (disponible en NBRP en el National Institute of Genetics, Japón) es una genoteca de knockouts única creada en la cepa BW25113 de E. coli mediante el método de Datsenko y anner (Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. , Proc Nati Acad Sci., U S A, 97: 6640-6645, 2000). En la colección, cada gen suprimido se reemplazó con un marcador para canamicina flanqueado por FRT removible por recombinasa Flp . La cepa de E. coli que tiene múltiples inactivaciones génicas se construyó al mover el marcador de canamicina de la inactivación génica desde la cepa donante de Keio, mediante transducción del bacteriófago Pl, hasta una cepa receptora. Después de cada transducción de Pl para producir una inactivación génica, el marcador para canamicina se removió con la recombinasa Flp. Esta cepa sin marcador actuó como la nueva cepa receptora para la siguiente transducción de Pl . Una de las inactivaciones génicas descritas se construyó directamente en la cepa mediante el método de Datsenko y Wanner (más arriba) , en lugar de hacerlo mediante la transducción de Pl .

La cepa 4KO de E. coli se construyó en la cepa JW0886 de Keio mediante transducciones de PlVir con lisados del fago Pl preparados de tres cepas de Keio. A continuación se enumeran las cepas de Keio que se usaron: JW0886: el marcador para canamicina se inserta en el gen pflB J 4114: el marcador para canamicina se inserta en el gen frdB J 1375: el marcador para canamicina se inserta en el gen IdhA J 1228: el marcador para canamicina se inserta en el adhE [Las secuencias que corresponden a los genes desactivados son: pflB (sec. con núm. de ident. : 71) , frdB (sec. con núm. de ident. : 73), ldhA (sec. con núm. de ident. : 77) , adhE (sec. con núm. de ident. : 75) .] La eliminación del marcador de canamicina flanqueado por FRT del cromosoma se llevó a cabo al transformar la cepa resistente a la canamicina con pCP20, un plásmido resistente a la ampicilina (Cherepanov y Wackernagel, más arrijba) ) . Los transformantes se esparcieron sobre placas con LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina. El plásmido pCP20 tiene la FLP recombinasa de levadura bajo el control del promotor XpR, y la expresión de este promotor es controlada por el represor sensible a la temperatura cI857 que se encuentra en el plásmido. El origen de replicación de pCP20 también es sensible a la temperatura.

La eliminación del marcador para canamicina flanqueado por loxP del cromosoma se llevó a cabo al transformar la cepa resistente a la canamicina con pJW168, un plásmido resistente a la ampicilina (Wild et al., Gene. 223:55-66, 1998) que alberga la recombinasa Cre del bacteriófago Pl . La recombinasa Cre (Hoess, R.H. & Abremski, K. , más arriba) media la escisión del gen resistente a la canamicina mediante la recombinación en los sitios loxP. El origen de replicación de pJW168 es el pSClOl sensible a la temperatura. Los transformantes se distribuyeron en placas con LB que contenían 100 g/ml de ampicilina.

La cepa JW0886 (ApflB::kan) se transformó con el plásmido pCP20 y se esparció sobre las placas con LB que contenían 100 µg/ml de ampicilina a 30 °C. Después, los transformantes resistentes a la ampicilina se seleccionaron, se sembraron en estrías sobre las placas con LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se secaron sobre las placas con LB y sobre las placas con medio selectivo de ampicilina y canamicina. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se seleccionaron mediante PCR de colonias con los cebadores pflB CkUp (sec. con núm. de ident . : 78) y pflB CkDn (sec. con núm. de ident . : 79) . Una alícuota de 10 L de la mezcla de reacción de la PCR se analizó por electroforesis en gel . Se observó el producto esperado de la PCR de aproximadamente 0.4 kb para confirmar la eliminación del marcador y crear la cepa "JW0886 sin marcador". Esta cepa tenía una deleción del gen pflB.

La cepa "JW0886 sin marcador" se transdujo con un lisado de Plv r de JW4114 (frdB::kan) y se sembró en estrías sobre las placas con LB que contenían 25 mg/ml de canamicina. Los transductantes resistentes a la canamicina se seleccionaron mediante PCR de colonias con los cebadores frdB CkUp (sec. con núm. de ident . : 80) y frdB CkDn (sec. con núm. de ident.: 81) . Las colonias que produjeron el producto de PCR previsto de aproximadamente 1.6 kb se volvieron electrocompetentes y se transformaron con pCP20 para la eliminación del marcador, como se describió anteriormente. Primero, los transformantes se esparcieron sobre las placas con LB que contenían 100 µ9/p?1 de ampicilina a 30 °C y, después, los transformantes resistentes a la ampicilina se seleccionaron, se sembraron en estrías sobre las placas con LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se secaron sobre las placas con LB y sobre las placas con medio selectivo de ampicilina y canamicina. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se seleccionaron mediante PCR con los cebadores frdB CkUp (sec. con núm. de ident.: 80) y frdB CkDn (sec. con núm. de ident.: 81) . Se observó el producto de PCR previsto de aproximadamente 0.4 kb, mediante lo cual se confirmó la eliminación del marcador y se creó la cepa de doble inactivación génica "ApflB frdB" .

La cepa de doble inactivación génica se transdujo con un lisado de Plvir de JW1375 (AldhA::kan) y se esparció sobre las placas con LB que contenían 25 yg/ml de canamicina. Los transductantes resistentes a la canamicina se seleccionaron mediante PCR de colonias con los cebadores ldhA CkUp (sec. con núm. de ident . : 82) e ldhA CkDn (sec. con núm. de ident.: 83) . Los clones que produjeron el producto de PCR previsto de 1.5 kb se volvieron electrocompetentes y se transformaron con pCP20 para la eliminación del marcador, como se describió anteriormente . Los transformantes se esparcieron sobre las placas con LB que contenían 100 ug/ml de ampicilina a 30 °C, y los transformantes resistentes a la ampicilina se sembraron en estrías sobre las placas con LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se secaron sobre las placas con LB y sobre las placas con medio selectivo de ampicilina y canamicina. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se seleccionaron mediante PCR con los cebadores ldhA CkUp (sec. con núm. de ident.: 82) e ldhA CkDn (sec. con núm. de ident.: 83) para un producto de 0.3 kb . Los clones que produjeron el producto de PCR previsto de aproximadamente 0.3 kb confirmaron la eliminación del marcador y crearon la cepa de triple inactivación génica denominada "3KO" (ApflB frdB ldhA) .

La cepa de "3K0" se transdujo con un lisado de PlVir de JW1228 (AadhE::kan) y se esparció sobre las placas con LB que contenían 25 µ9/??1 de canamicina. Los transductantes resistentes a la canamicina se seleccionaron mediante PCR de colonias con los cebadores adhE CkUp (sec. con núm. de ident. : 84) y adhE CkDn (sec. con núm. de ident . : 85) . Los clones que produjeron el producto de PRC previsto de 1.6 kb se denominaron 3K0 adhE::kan. La cepa 3K0 adhE::kan se volvió electrocompetente y se transformó con pCP20 para la eliminación del marcador. Los transformantes se esparcieron sobre las placas con LB que contenían 100 yg/ml de ampicilina a 30 °C. Los transformantes resistentes a la ampicilina se sembraron en estrías sobre las placas con LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se secaron sobre las placas con LB y sobre las placas con medio selectivo de ampicilina y canamicina. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se seleccionaron mediante PCR con los cebadores adhE CkUp (sec. con núm. de ident.: 84) y adhE CkDn (sec. con núm. de ident. : 85) . Los clones que produjeron el producto de PCR previsto de aproximadamente 0.4 kb se denominaron "4KO" (DpflB frdB ldhA adhE) .

Construcción de un huésped de producción de E. colí (Cepa NGCI-031) que contiene una ruta biosintética de isobutanol y deleciones de los genes pflB, frdB, ldhA y adhE Un fragmento de ADN que codifica sadB, una butanol deshidrogenasa, (ADN con sec. con núm. de ident.: 9; proteína con sec. con núm. de ident.: 10) de Achromobacter xylosoxidans se amplificó de ADN genómico de A. xylosoxidans en condiciones estándar. El ADN se preparó con el kit de Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis , MN; catálogo núm. D-5500A) de acuerdo con el protocolo recomendado para los organismos gram negativos. La amplificación por PCR se realizó mediante el uso de los cebadores directos e inversos N473 y N469 (sec. con núms . de ident . : 86 y 87, respectivamente) con la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, Beverly, MA) . El producto de PCR fue TOPO-Blunt clonado en pCR4 BLU T (Invitrogen) para producir pCR4Blunt : : sadB , que se transformó en las células Mach- 1 de E. coli. Posteriormente, el plásmido se aisló de cuatro clones, y se verificó la secuencia.

La región codificante de sadB se clonó luego en el vector pTrc99a (Amann et al., Gene 69: 301- 315, 1988). Después se realizó la digestión de pCR4Blunt : : sadB con EcoRI , liberando el fragmento de sadB, que se unió con el pTrc99a digerido con EcoRI para generar pTrc99a : : sadB . Este plásmido se transformó en las células Mach 1 de E. coli, y el transformante resultante se denominó Machl/pTrc99a : : sadB . Se determinó que la actividad enzimática expresada del gen sadB en estas células fue de 3.5 mmol/min/mg de proteína en extractos libres de células cuando se analizó mediante el uso de isobutiraldehído como estándar.

Después, el gen sadB se subclonó en pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD, como se describe más adelante. El pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD es el vector de expresión pTrc-99a que tiene un operón para la expresión de isobutanol (se describe en los Ejemplos 9-14 de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957, que se incorpora en la presente descripción como referencia) . El primer gen en el operón de isobutanol pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD es budB que codifica acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955, seguido del gen ilvC que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa de E. coli. Después, sigue ilvD que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa de E. coli y, finalmente, el gen kivD que codifica el cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada de L. lactis.

La región codificante de sadB se amplificó de pTrc99a : : sadB con los cebadores N695A (sec. con núm. de ident.: 88) y N696A (sec. con núm. de ident . : 89) mediante el uso de la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, Beverly, MA) . La amplificación se realizó con una desnaturalización inicial a 98 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 s, hibridación a 62 °C durante 30 s, elongación a 72 °C durante 20 s, y un ciclo de elongación final a 72 °C durante 5 min, seguido de una retención a 4 °C. El cebador N695A contenía un sitio de restricción Avrll para clonación y un RBS corriente arriba del codón de inicio ATG de la región codificante de sadB . El cebador N696A incluía un sitio Xbal para clonación. El producto de PC de 1.1 kb se digirió con Avrll y Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA) y se purificó en gel mediante el uso de un estuche de extracción en gel Qiaquick (Qiagen Inc., Valencia, CA) . El fragmento purificado se unió con pTrc99A : : budB- ilvC-ilvD-kivD, que se había cortado con las mismas enzimas de restricción, al usar T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) . La mezcla de ligadura se incubó a 16 °C durante la noche y, después, se transformó en las células competentes Mach 1™ de E. coli (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los transformantes se obtuvieron después del cultivo en el medio agar con LB y 100 yg/ml de ampicilina. El ADN plasmídico de los transformantes se preparó con el estuche QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Inc., Valencia, CA) de conformidad con los protocolos del fabricante. El plásmido resultante se denominó pTrc99A: : budB- ilvC- i lvD-kivD-sadB .

Las células electrocompetentes de las cepas 4KO se prepararon como se describió y se transformaron con pTrc99A: : budB- ilvC- ilvD-kivD-sadB ( "pBCDDB" ) . Los transformantes se sembraron en estrías en placas de agar con LB que contenían 100 ug/ml de ampicilina. La cepa resultante que tenía el plásmido pTrc99A: : budB- ilvC- ilvD-kivD- sadB con 4K0 se denominó NGCI-031.

Agentes extractantes orgánicos El agente extractante es un solvente o una mezcla de solventes orgánicos inmiscibles en agua que tienen características que lo hacen útil para la extracción de butanol de un caldo de fermentación. Un agente extractante orgánico adecuado debe cumplir los criterios de un solvente ideal para una fermentación extractiva bifásica comercial para la producción o la recuperación de butanol. Específicamente, el agente extractante debe (i) ser biocompatible con los microorganismos, por ejemplo, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae, (ii) ser prácticamente inmiscible con el medio de fermentación, (iii) tener un alto coeficiente de partición (KP) para la extracción de butanol, (iv) tener un bajo coeficiente de partición para la extracción de nutrientes, (v) tener una baja tendencia a formar emulsiones con el medio de fermentación, y (vi) ser económico y no peligroso. Además, para mejorar la operabilidad del proceso y el aspecto económico, el agente extractante debe tener (vii) baja viscosidad (m) , (viii) baja densidad (r) con respecto al medio de fermentación acuoso, y (ix) un punto de ebullición adecuado para la separación corriente abajo del agente extractante y del butanol .

En una modalidad, el agente extractante puede ser biocompatible con el microorganismo, es decir, no tóxico para el microorganismo o tóxico solo en la medida en que el microorganismo se deteriore hasta un nivel aceptable, de manera que el microorganismo continúe la producción del producto butanol en el medio de fermentación. El grado de biocompatibilidad de un agente extractante se puede determinar por la velocidad de uso de glucosa del microorganismo en presencia del agente extractante y del producto butanol, que se mide en las condiciones de fermentación definidas. Véase, por ejemplo, los ejemplos en las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos núms. 61/168,640; 61/168,642; y 61/168,645. Mientras que un agente extractante biocompatible permite que el microorganismo use glucosa, un agente extractante no biocompatible no permite que el microorganismo use glucosa a una velocidad mayor que, por ejemplo, aproximadamente 25 % de la velocidad cuando el agente extractante no está presente. Debido a que la presencia del producto de fermentación butanol puede afectar la sensibilidad del microorganismo con el agente extractante, el producto de fermentación debe estar presente durante la prueba de biocompatibilidad del agente extractante. La presencia de productos de fermentación adicionales, por ejemplo, etanol, puede afectar de manera similar la biocompatibilidad del agente extractante. Se prefiere el uso de un agente extractante biocompatible para procesos en los que se desea la producción continua de butanol después de poner en contacto el caldo de fermentación que comprende el microorganismo con un agente extractante orgánico.

En una modalidad, el agente extractante se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22f ácidos grasos de C7 a C22, ésteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos. Los ejemplo de agentes extractantes adecuados incluyen un agente extractante que comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal, 2-butiloctanol, ácido 2-butil-octanoico y mezclas de estos. En algunas modalidades, el agente extractante comprende alcohol oleílico. En algunas modalidades, el agente extractante comprende un alcohol saturado de cadena ramificada, por ejemplo, 2 -butiloctanol , comercialmente disponible como ISOFAL® 12 (Sasol, Houston, TX) o ¦ Jarcol 1-12 (Jarchem Industries, Inc., Newark, NJ) . En algunas modalidades, el agente extractante comprende un ácido carboxílico de cadena ramificada, por ejemplo, ácido 2-butil-octanoico, ácido 2-hexil-decanoico o ácido 2 -decil-tetradecanoico, comercialmente disponibles como ISOCARB® 12, ISOCARB® 16 e ISOCARB® 24, respectivamente (Sasol, Houston, TX) .

En una modalidad, un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, esteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos. Los primeros agentes extractantes adecuados también se pueden seleccionar del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, también denominado 1-dodecanol, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico y mezclas de estos. En una modalidad, el agente extractante puede comprender alcohol oleílico.

En una modalidad, un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua opcional se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22/ ácidos carboxílicos grasos de C7 a C22, esteres de ácidos carboxílieos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos. Los segundos agentes extractantes adecuados también se pueden seleccionar del grupo que consiste en 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal y mezclas de estos. En una modalidad, el segundo agente extractante comprende 1-decanol.

En una modalidad, el primer agente extractante comprende alcohol oleílico, y el segundo agente extractante comprende 1-decanol.

Cuando se usan un primer y segundo agente extractante, las cantidades relativas de cada uno puede variar dentro de un intervalo adecuado. Por ejemplo, el primer agente extractante se puede usar en una cantidad que es de aproximadamente 30 por ciento a aproximadamente 90 por ciento, de aproximadamente 40 por ciento a aproximadamente 80 por . ciento, de aproximadamente 45 por ciento a aproximadamente 75 por ciento o de aproximadamente 50 por ciento a aproximadamente 70 por ciento del volumen combinado del primer y segundo agente extractante. El intervalo óptimo refleja la maximización de las características del agente extractante, por ejemplo, equilibrar un coeficiente de partición relativamente alto de butanol con un nivel de biocompatibilidad aceptable. En una fermentación extractiva bifásica para la producción o recuperación de butanol, la temperatura, el tiempo de contacto, la concentración de butanol en el medio de fermentación, la cantidad relativa de agente extractante y medio de fermentación, el primer y segundo agente extractante específico que se usan, la cantidad relativa del primer y segundo agente extractante, la presencia de otros solutos orgánicos, que incluyen el tipo y la concentración de osmolitos, y la cantidad y el tipo de microorganismo están relacionados; por lo tanto, estas variables se pueden ajustar, según sea necesario, dentro de límites adecuados para optimizar el proceso de extracción, como se describe en la presente descripción.

Los agentes extractantes orgánicos adecuados pueden estar disponibles comercialmente mediante diversos proveedores, por ejemplo, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) , en diversos grados, muchos de los cuales pueden ser adecuados para usarse en una fermentación extractiva para producir o recuperar butanol . Los grados técnicos de un solvente pueden contener una mezcla de compuestos, que incluye el componente deseado y componentes de mayor y menor peso molecular. Por ejemplo, un alcohol oleílico de grado técnico comercialmente disponible contiene aproximadamente 65 % de alcohol oleílico y una mezcla de alcoholes grasos de cadena más larga y más corta.

Osmolito De acuerdo con el presente método, el medio de fermentación contiene al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. El osmolito puede comprender uno o más de los componentes del medio de fermentación basal, por ejemplo glucosa, en cuyo caso el osmolito está presente a una concentración superior a la de la concentración osmolítica (por ejemplo, glucosa) en el medio de fermentación basal. El osmolito puede comprender una fuente de carbono fermentable opcional presente en el medio de fermentación, además de cualquier fuente de carbono fermentable que se encuentre en el medio de fermentación basal, por ejemplo xilosa, en cuyo caso el osmolito está presente a una concentración superior a la de la fuente de carbono fermentable opcional en el medio de fermentación. Como se definió en la sección Definiciones, el osmolito puede comprender una o más sustancias orgánicas que no están presentes en el medio de fermentación basal o que, generalmente, no se consideran una fuente de carbono fermentable, tal como polietilenglicol . El medio de fermentación basal puede contener una fuente de carbono fermentable, tal como un monosacárido y, generalmente, se adapta a un microorganismo específico. Se pueden encontrar sugerencias de composiciones de medios de fermentación basal en el manual de Difco™ & BBL™ (Becton Dickinson and Company, Sparks, MD 21152, USA).

El osmolito puede comprender un monosacárido, un disacárido, glicerol, jugo de caña de azúcar, melazas, polietilenglicol, dextrano, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos. Por ejemplo, el osmolito puede comprender un monosacárido seleccionado del grupo que consiste en gliceraldehído, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, mañosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, dihidroxiacetona, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa y combinaciones de estos. Por ejemplo, el osmolito puede comprender un disacárido seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, lactulosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, kojibiosa, nigerosa, isomaltosa, soforosa, laminaribiosa, gentiobiosa, turanosa, maltulosa, palatinosa, gentiobiulosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, rutinosa, rutinulosa, xilobiosa y combinaciones de estas. El osmolito se puede seleccionar del grupo que consiste en polietilenglicol , dextrano, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos. Los osmolitos seleccionados de este grupo deben tener un peso molecular suficientemente alto que no les permita ser permeables en la célula microbiana. Se desea un peso molecular, por ejemplo, de al menos 8000 dalton para los osmolitos seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, dextrano, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos.

El osmolito puede estar comercialmente disponible de varias fuentes en diversos grados, muchos de los cuales pueden ser adecuados para usar en la fermentación extractiva, a fin de producir o recuperar butanol mediante los métodos descritos en la presente descripción. El osmolito se puede recuperar mediante métodos conocidos en la técnica a partir de un medio de fermentación o de una fase acuosa que se forma al poner en contacto el medio de fermentación con un agente extractante, o mediante otros métodos físicos o químicos, tales como precipitación, cristalización y/o evaporación. El osmolito recuperado se puede usar en una fermentación posterior. En una modalidad, el osmolito se puede obtener de un sustrato de carbohidrato de la fermentación, por ejemplo, glucosa de templa de maíz hidrolizada.

La cantidad de osmolito necesaria para lograr una concentración en el medio de fermentación al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional se puede determinar como se describe, por ejemplo, en los procedimientos de los ejemplos que se indican más adelante. El intervalo de concentración osmolítica que tiene un efecto positivo en el coeficiente de partición se determina, por ejemplo, mediante experimentación. También se determina el intervalo de concentración osmolítica que demuestra una biocompatibilidad aceptable con el microorganismo de interés. El intervalo de concentración osmolítica adecuada se selecciona de la superposición de estos dos intervalos, de manera que la cantidad de osmolito necesaria para lograr un efecto positivo en el coeficiente de partición del butanol se equilibra con el intervalo de concentración que proporciona un nivel de biocompatibilidad aceptable con el microorganismo. Las consideraciones económicas también pueden ser un factor al momento de seleccionar la cantidad de osmolito que se usará.

En una modalidad, el osmolito puede estar presente en el medio de fermentación a una concentración que es biocompatible con el microorganismo, es decir, no tóxico para el microorganismo o tóxico solo en la medida en que el microorganismo se deteriore hasta un nivel aceptable, de manera que el microorganismo continúe la producción del producto butanol en el medio de fermentación en presencia del osmolito. El grado de biocompatibilidad de un osmolito se puede determinar por la velocidad de crecimiento del microorganismo en presencia de varias concentraciones osmolíticas. Mientras que una concentración osmolítica biocompatible permite que el microorganismo use glucosa u otra fuente de carbono, o que crezca, una concentración osmolítica no biocompatible no permite que el microorganismo use glucosa u otra fuente de carbono ni que crezca a una velocidad mayor que, por ejemplo, aproximadamente 25 % de la velocidad de crecimiento cuando la cantidad excesiva de osmolito no está presente. La presencia de productos de fermentación, por ejemplo butanol, también puede afectar los intervalos de concentración osmolítica que tienen biocompatibilidad con el microorganismo. Se desea el uso de un osmolito en intervalos de concentración biocompatibles para los procesos en los que la producción continua de butanol es necesaria después de poner en contacto el medio de fermentación que comprende el microorganismo con el osmolito. En aquellos procesos en los que no se requiere la producción continua de butanol después de poner en contacto el medio de fermentación que comprende el microorganismo con el osmolito, se puede usar un osmolito en intervalos de concentración que tienen poca biocompatibilidad, si la hubiera, con el microorganismo.

Para lograr una concentración osmolítica en el medio de fermentación que sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación o a la fase acuosa a partir de un medio de fermentación bifásico durante la fase de crecimiento del microorganismo, durante la fase de producción de butanol, cuando la concentración de butanol es inhibidora, o a combinaciones de estos. Se puede agregar el osmolito al primer agente extractante, al segundo agente extractante o a combinaciones de estos. El osmolito se puede agregar como un sólido, como una suspensión o como una solución acuosa. Opcionalmente , se puede agregar el osmolito tanto al medio de fermentación como a los agentes extractantes. El osmolito se puede agregar de manera continua, semicontinua o en lote. El osmolito se puede agregar a la corriente completa en la que se introduce, por ejemplo, al medio de fermentación completo en un fermentador, o a una corriente parcial que se toma de uno o más recipientes, por ejemplo, a una corriente parcial que se toma de un fermentador.

En algunas modalidades, la concentración total de osmolito en el medio de fermentación es, al menos, aproximadamente 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 , 0.9 M, 1 M o 2 M. En algunas modalidades, la concentración total de osmolito en la fermentación es menor que, aproximadamente, 5 M.

Fermentación El microorganismo puede cultivarse en un medio de fermentación adecuado en un fermentador adecuado para producir butanol . Puede usarse cualquier fermentador adecuado, que incluye un fermentador de tanque agitado, un fermentador de elevación por aire, un fermentador de columna de burbujas, o cualquier combinación de éstos. Los materiales y métodos para el mantenimiento y crecimiento de cultivos microbianos son muy conocidos para los experimentados en la técnica de la ciencia de la fermentación o de la microbiología (véase, por ejemplo, Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentáis, segunda edición, McGraw Hill, Nueva York, 1986) . Se debe tener en cuenta el medio de fermentación apropiado, el pH, la temperatura y los requisitos para las condiciones aerobias, microaerobias o anaerobias en función de los requisitos específicos del microorganismo, la fermentación y el proceso.

El medio de fermentación que se use no es crítico, pero debe ser compatible con el crecimiento del microorganismo empleado y promover la ruta biosintética necesaria para producir el producto butanol deseado. Puede usarse un medio de fermentación convencional que incluye, pero no se limita a, medios complejos que contienen fuentes de nitrógeno orgánico, tales como extracto de levadura o peptona, y al menos una fuente de carbono fermentable, medios mínimos y medios definidos. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, tales como glucosa o fructosa, disacáridos, tales como lactosa o sacarosa, oligosacáridos , polisacáridos , tales como almidón o celulosa, sustratos de un carbono y mezclas de estos. Además de la fuente de carbono adecuada, el medio de fermentación puede contener una fuente de nitrógeno adecuada, tal como una sal de amonio, extracto de levadura o peptona, minerales, sales, cof ctores, soluciones tampón y otros componentes conocidos por las personas con conocimiento en la técnica (Bailey et al., más arriba). Las condiciones adecuadas para la fermentación extractiva dependen del microorganismo específico empleado y podrán ser determinadas fácilmente por una persona experimentada en la técnica a través de experimentación de rutina.

Métodos para recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva con adición osmolítica Se puede recuperar butanol a partir de un medio fermentación que contiene butanol, agua, al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, opcionalmente, al menos una fuente de carbono fermentable, y un microorganismo que se modificó genéticamente (es decir, se desarrolló mediante ingeniería genética) para producir butanol mediante una ruta biosintética a partir de al menos una fuente de carbono. Los microorganismos modificados genéticamente se pueden seleccionar de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levadura, e incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae . Una etapa del proceso es poner en contacto el medio de fermentación con un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente, un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. "Poner en contacto" significa que el medio de fermentación y el agente extractante orgánico o sus componentes solventes entran en contacto físico en cualquier momento durante el proceso de fermentación. Se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos. En una modalidad, el medio de fermentación también comprende etanol, y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol.

Cuando se usan un primer y segundo agente extractante, el contacto se puede realizar cuando el primer y segundo agente extractante se combinaron previamente. Por ejemplo, el primer y segundo agente extractante se pueden combinar en un recipiente, tal como un tanque de mezclado y, después, se pueden agregar los agentes extractantes combinados a un recipiente que contiene el medio de fermentación. En forma alternativa, el contacto se puede realizar cuando el primer y segundo agente extractante se combinan durante el contacto. Por ejemplo, el primer y segundo agente extractante se pueden agregar por separado a un recipiente que contiene el medio de fermentación. En una modalidad, el contacto del medio de fermentación con el agente extractante orgánico también comprende poner en contacto el medio de fermentación con el primer agente extractante antes de poner en contacto el medio de fermentación y el primer agente extractante con el segundo agente extractante . En una modalidad, el contacto con el segundo agente extractante puede ocurrir en el mismo recipiente que el contacto con el primer agente extractante. En una modalidad, el contacto con el segundo agente extractante puede ocurrir en un recipiente diferente de aquel en el que se produce el contacto con el primer agente extractante. Por ejemplo, se puede poner en contacto el primer agente extractante con el medio de fermentación en un recipiente y transferir el contenido a otro recipiente en donde se produce el contacto con el segundo agente extractante. En estas modalidades, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos .

El agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al comienzo de la fermentación para formar un medio de fermentación bifásico. Alternativamente, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado la cantidad deseada de crecimiento, que puede determinarse al medir la densidad óptica del cultivo. En una modalidad, el primer agente extractante puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un recipiente, y el segundo agente extractante puede entrar en contacto con el medio de fermentación y el primer agente extractante en el mismo recipiente. En otra modalidad, el segundo agente extractante puede entrar en contacto con el medio de fermentación y el primer agente extractante en un recipiente diferente de aquel en el que se produce el contacto del primer agente extractante con el medio de fermentación. En estas modalidades, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos.

Además, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación cuando el nivel de butanol en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado, por ejemplo, antes de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico o inhibidor. Se puede supervisar la concentración de butanol durante la fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como cromatografía de gases o cromatografía líquida de alto rendimiento. Se puede agregar el osmolito al medio de fermentación antes o después de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico o inhibidor. En algunas modalidades, el agente extractante orgánico comprende ácidos grasos. En algunas modalidades, los procesos descritos en la presente descripción se pueden usar junto con los procesos descritos en las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos núms . 61/368429 y 61/379546, en donde se esterifica butanol con un ácido orgánico, tal como un ácido graso, mediante el uso de un catalizador, tal como una lipasa, para formar ásteres de butanol.

La fermentación puede realizarse en condiciones aerobias durante un tiempo suficiente para que el cultivo alcance un nivel de crecimiento preseleccionado, según lo determinado por medición de la densidad óptica. Se puede agregar el osmolito al caldo de fermentación antes o después de alcanzar el nivel de crecimiento preseleccionado. Después, se puede agregar un inductor para inducir la expresión de la ruta biosintética del butanol en el microorganismo modificado y cambiar las condiciones de fermentación por condiciones microaerobias o anaerobias para estimular la producción de butanol, según se describe en detalle en el Ejemplo 6 de la solicitud de patente copendiente de los Estados Unidos núm. 12/478,389. El agente extractante se puede agregar después de cambiar las condiciones por condiciones microaerobias o anaerobias. El osmolito se puede agregar antes o después de cambiar a condiciones microaerobias o anerobias . En una modalidad, el primer agente extractante puede entrar en contacto con el medio de fermentación antes de que el medio de fermentación y el primer agente extractante entren en contacto con el segundo agente extractante. Por ejemplo, en un proceso de fermentación en lotes, puede ser necesario dejar transcurrir un tiempo adecuado entre el contacto del medio de fermentación con el primer y el segundo agente extractante. En un proceso de fermentación continuo, el contacto del medio de fermentación con el primer agente extractante puede ocurrir en un recipiente, y el contacto del contenido de ese recipiente con el segundo agente extractante puede ocurrir en un segundo recipiente. En estas modalidades se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos.

Después de poner en contacto el medio de fermentación con el agente extractante orgánico en presencia del osmolito, el producto butanol se divide en el agente extractante orgánico y disminuye la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo, lo que limita la exposición del microorganismo de producción al producto butanol inhibidor. El volumen del agente extractante orgánico que se usará depende de varios factores que incluyen el volumen del medio de fermentación, el tamaño del fermentador, el coeficiente de partición del agente extractante para el producto butanol, la concentración osmolítica y el modo de fermentación seleccionado, según se describe más adelante. El volumen del agente extractante orgánico puede ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del fermentador. La relación entre el agente extractante y el medio de fermentación es de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1 sobre una base de volumen : volumen, por ejemplo, de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 1:12 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1 o de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1.

La cantidad de osmolito que se agregará depende de varios factores, que incluyen el efecto de la adición osmolítica en las propiedades de crecimiento del microorganismo que produce butanol y el efecto de la adición osmolítica en el Kp del butanol en una fermentación bifásica. La cantidad óptima de osmolito que se agregará puede depender, además, de la composición del medio de fermentación basal inicial y de la concentración de las fuentes de carbono fermentable en el medio de fermentación. Si bien es posible que una concentración osmolítica demasiado alta aumente el Kp del butanol y mitigue los efectos de la toxicidad del butanol en el microorganismo, también puede ser inhibidora para el microorganismo. Por otra parte, es posible que una concentración osmolítica demasiado baja no aumente suficientemente el Kp del butanol para mitigar el efecto inhibidor del butanol en el microorganismo. Por lo tanto, es necesario encontrar un equilibro mediante la experimentación para garantizar que el efecto neto de agregar una cantidad excesiva de osmolito al medio de fermentación de como resultado un aumento total de la velocidad y del título de la producción de butanol.

En algunas modalidades, el Kp aumenta en aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 150 % o aproximadamente 200 % en comparación con el Kp sin la adición osmolítica. En algunas modalidades, el Kp aumenta al menos aproximadamente 2 veces, al menos, aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 6 veces . En algunas modalidades, la concentración total de osmolito se selecciona para aumentar el Kp en una determinada cantidad, a la vez que se mantiene la velocidad de crecimiento del microorganismo en un nivel que es al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 90 % de la velocidad de crecimiento en ausencia de la adición osmolítica. En algunas modalidades, la concentración total de osmolito en el medio de fermentación es suficiente para aumentar la velocidad eficaz de producción de butanol en al menos aproximadamente, 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 100 % en comparación con la velocidad sin la adición osmolítica. En algunas modalidades, la concentración total de osmolito en el medio de fermentación es suficiente para aumentar el rendimiento eficaz de butanol en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 100 % en comparación con el rendimiento eficaz sin la adición osmolítica. En algunas modalidades, la concentración total de osmolito en el medio de fermentación es suficiente para aumentar el título eficaz de butanol en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 100 % en comparación con el título eficaz sin la adición osmolítica.

En algunas modalidades, la cantidad de adición osmolítica es suficiente para provocar un título eficaz de al menos aproximadamente 7 g/1, al menos aproximadamente 10 g/1, al menos aproximadamente 15 g/1, al menos aproximadamente 20 g/1, al menos aproximadamente 25 g/1, al menos aproximadamente 30 g/1 o al menos aproximadamente 40 g/1. En algunas modalidades, la cantidad de adición osmolítica es suficiente para provocar un rendimiento eficaz de al menos aproximadamente 0.12, al menos aproximadamente 0.15, al menos aproximadamente 0.2, al menos aproximadamente 0.25 o al menos aproximadamente 0.3. En algunas modalidades, la cantidad de adición osmolítica es suficiente para provocar una velocidad eficaz de al menos aproximadamente 0.1 g/l/h, al menos aproximadamente 0.15 g/l/h, al menos aproximadamente 0.2 g/l/h, al menos aproximadamente 0.3 g/l/h, al menos aproximadamente 0.4 g/l/h, al menos aproximadamente 0.6 g/l/h, al menos aproximadamente 0.8 g/l/h, al menos aproximadamente 1 g/l/h o al menos aproximadamente 1.2 g/l/h. En algunas modalidades, la velocidad es aproximadamente 1.3 g/l/h.

La siguiente etapa es separar, opcionalmente , la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, sifoneo, decantación, centrifugación, uso de un sedimentador que decanta por acción de la gravedad y división de fases asistida por membrana. La recuperación del butanol de la fase orgánica que contiene butanol se puede realizar con métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, destilación, adsorción con resinas, separación con tamices moleculares y pervaporación. Específicamente, puede usarse la destilación para recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol. El osmolito se puede reciclar para la producción y/o el proceso de recuperación del butanol.

El osmolito se puede recuperar del medio de fermentación o de la fase acuosa de una mezcla bifásica mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la fase acuosa o el medio de fermentación se pueden concentrar mediante destilación, estabilización, pervaporación u otros métodos para obtener una mezcla acuosa concentrada que comprenda el osmolito. Opcionalmente, se puede regresar el osmolito a un medio de fermentación y, de este modo, reciclarlo en el proceso de fermentación. Opcionalmente, el osmolito que se obtiene de un sustrato de carbohidrato de la fermentación se puede agregar a un medio de fermentación para proporcionar una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

La estabilización del gas se puede usar junto con el agente extractante orgánico y la adición osmolítica para eliminar el producto butanol del medio de fermentación. La estabilización con gas puede realizarse al hacer pasar un gas, tal como aire, nitrógeno o dióxido de carbono, a través del medio de fermentación para formar una fase gaseosa que contiene butanol. El producto butanol puede recuperarse de la fase gaseosa que contiene butanol mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como el uso de una trampa de agua enfriada para condensar el butanol, o la depuración de la fase de gas con un solvente.

Cualquier resto de butanol en el medio de fermentación después de haber completado la fermentación puede recuperarse por extracción continuada mediante el uso de un agente extractante orgánico nuevo o reciclado. Alternativamente, el butanol puede recuperarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, estabilización con gas, evaporación por membrana, pervaporación, y similares. En el caso en que el medio de fermentación no se recicla para el proceso, se puede agregar una cantidad adicional de osmolito para aumentar aún más el coeficiente de partición del butanol y mejorar la eficacia de la recuperación del butanol.

Los métodos de fermentación extractiva de dos fases pueden llevarse a cabo en un modo continuo en un fermentador de tanque agitado. En este modo, la mezcla del medio de fermentación y el agente extractante orgánico que contiene butanol se elimina del fermentador. Las dos fases se separan con métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, sifoneo, decantación, centrifugación, mediante el uso de un sedimentador que decanta por acción de la gravedad, división de fases asistida por membrana, y similares, tal como se describió anteriormente. Después de la separación, el medio de fermentación y el osmolito que allí se encuentra se pueden reciclar hasta el fermentador o se pueden reemplazar por un medio nuevo, al que se agrega una cantidad adicional de osmolito. Luego se trata el agente extractante para recuperar el producto butanol, tal como se describió anteriormente. El agente extractante puede volver a reciclarse en el fermentador para extraer aún más el producto. Alternativamente, puede agregarse continuamente al fermentador un agente extractante fresco para reemplazar el agente extractante que se eliminó.

Este modo de operación continuo ofrece varias ventajas. Dado que el producto se elimina continuamente del reactor, se requiere un menor volumen de agente extractante orgánico, lo que posibilita un mayor volumen del medio de fermentación que se usará. Esto da como resultado rendimientos de producción más altos. El volumen del agente extractante orgánico puede ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 50 % del volumen de trabajo del fermentador; de 3 % a aproximadamente 20 % del volumen de trabajo del termentador; o de 3 % a aproximadamente 10 % del volumen de trabajo del termentador. Es conveniente usar la menor cantidad posible de agente extractante en el termentador para maximizar el volumen de la fase acuosa y, por consiguiente, la cantidad de células en el termentador. El proceso puede realizarse en un modo totalmente continuo, en el que el agente extractante se recicla continuamente entre el termentador y un aparato de separación, y el medio de fermentación se elimina continuamente del termentador y se repone con medio fresco. En este modo totalmente continuo, no se permite que el producto butanol alcance la concentración tóxica crítica y se suministran nutrientes frescos continuamente para que la fermentación pueda llevarse a cabo durante períodos prolongados . Los aparatos que pueden usarse para llevar a cabo estos modos de fermentaciones extractivas de dos fases son muy conocidos en la técnica. Se describen ejemplos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 4,865,973 de ollerup et al.

También puede usarse el modo de fermentación discontinua o por lotes. La fermentación por lotes, que es muy conocida en la técnica, es un sistema cerrado en el que la composición del medio de fermentación se fija al comienzo de la fermentación y no está sometida a alteraciones artificiales durante el proceso. En este modo, la cantidad osmolítica deseada y un volumen del agente extractante orgánico se agregan al termentador, y no se elimina el agente extractante durante el proceso. El agente extractante orgánico se puede formar en el termentador mediante la adición por separado del primer agente extractante y del segundo agente extractante opcional, o el primer y segundo agente extractante se pueden combinar para formar el agente extractante antes de la adición de cualquiera agente extractante al termentador. Se puede agregar el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos. Aunque este modo de fermentación es más simple que los modos continuo o completamente continuo descritos anteriormente, se requiere un volumen mayor de agente extractante orgánico para minimizar la concentración del producto butanol inhibidor en el medio de fermentación. Por consiguiente, el volumen del medio de fermentación es menor y la cantidad de producto producida es menor que la obtenida al usar el modo continuo. El volumen del agente extractante orgánico en el modo discontinuo puede ser de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del termentador; o de 30 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del termentador. Es conveniente usar el menor volumen posible de agente extractante en el termentador por la razón descrita anteriormente.

También puede usarse el modo de fermentación semicontinua o por lote alimentado. La fermentación por lote alimentado es una variante del sistema por lotes estándar, en el que los nutrientes, por ejemplo, la glucosa, se agregan en incrementos durante la fermentación. La cantidad y la velocidad de adición del nutriente pueden determinarse por experimentación de rutina. Por ejemplo, puede supervisarse la concentración de nutrientes críticos en el medio de fermentación durante la fermentación. Alternativamente, se pueden controlar los factores que se miden más fácilmente, por ejemplo, el pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales, tales como el dióxido de carbono. A partir de estos parámetros medidos, puede determinarse la velocidad de la adición de nutrientes. La cantidad de agente extractante orgánico que se usa y los métodos of adición en este modo son los mismos que se usan en el modo discontinuo, descrito anteriormente. La cantidad de adición osmolítica puede ser la misma que se usa en otros modos de fermentación.

La extracción del producto puede hacerse en dirección 3' del fermentador en lugar de hacerlo en el lugar. En este modo externo, la extracción del producto butanol en el agente extractante orgánico se lleva a cabo en el medio de fermentación que se eliminó del fermentador. Se puede agregar el osmolito al medio de fermentación que se retiró del fermentador. La cantidad de agente extractante que se usa es de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del fermentador; o de 30 % a aproximadamente 60 % del volumen de trabajo del fermentador. El medio de fermentación puede eliminarse del fermentador de manera continua o periódica, y la extracción del producto butanol por el agente extractante orgánico puede hacerse con o sin la eliminación de las células del medio de fermentación. Las células pueden eliminarse del medio de fermentación con métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, filtración o centrifugación. Se puede agregar el osmolito al medio de fermentación antes o después de retirar las células. Después de la separación del medio de fermentación del agente extractante por los métodos descritos anteriormente, el medio de fermentación puede reciclarse en el fermentador, desecharse o tratarse para la eliminación de cualquier producto butanol restante. De manera similar, las células aisladas también pueden reciclarse en el fermentador. Después del tratamiento para recuperar el producto butanol, el agente extractante puede reciclarse para usarse en el proceso de extracción.

Alternativamente, puede usarse un agente extractante nuevo. En este modo, el agente extractante no está presente en el fermentador; por lo tanto, la toxicidad del agente extractante es un problema menor. Si las células se separan del medio de fermentación antes de entrar en contacto con el agente extractante, el problema de la toxicidad del agente extractante se puede reducir aún más. Además, al usar este modo externo, la posibilidad de que se forme una emulsión es menor, y se minimiza la evaporación del agente extractante, lo cual mitiga las preocupaciones ambientales.

Métodos para producir butanol mediante el uso de fermentación extractiva con adición osmolítica Se proporciona un método mejorado para la producción de butanol, en donde un microorganismo que se modificó genéticamente para producir butanol mediante una ruta biosintética a partir de al menos una fuente de carbono fermentable se cultiva en un medio de fermentación bifásico que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua, y el medio de fermentación bifásico comprende, además, al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. Los microorganismos modificados genéticamente se pueden seleccionar de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levadura, e incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae. El primer agente extractante orgánico inmiscible en agua se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22l ácidos grasos de C12 a C22, esteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos, y el segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua opcional se puede seleccionar del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22, ésteres de ácidos carboxílicos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico comprende de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % en volumen del agente extractante orgánico. En forma alternativa, el medio de fermentación bifásico puede comprender de aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % en volumen del agente extractante orgánico o de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %. El microorganismo se puede cultivar en el medio de fermentación bifásico por un tiempo suficiente para extraer butanol en el agente extractante y formar una fase orgánica que contenga butanol. Una concentración osmolítica al menos suficiente en el medio de fermentación se puede lograr mediante la adición de osmolito a la fase acuosa durante la fase de crecimiento del microorganismo, a la fase acuosa durante la fase de producción de butanol, a la fase acuosa cuando la concentración de butanol en la fase acuosa es inhibidora, al primer agente extractante, al segundo agente extractante o a combinaciones de estos .

En una modalidad, el medio de fermentación también comprende etanol, y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol. Después, la fase orgánica que contiene butanol se separa de la fase acuosa, tal como se describió anteriormente. Posteriormente, el butanol se recupera de la · fase orgánica que contiene butanol, tal como se describió anteriormente.

Además, se proporciona un método para la producción de butanol, en donde un microorganismo que modificó genéticamente para producir butanol mediante una ruta biosintética a partir de al menos una fuente de carbono se cultiva en un medio de fermentación, en el cual el microorganismo produce butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que contiene butanol. Los microorganismo modificados genéticamente se pueden seleccionar de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levadura, e incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae . Se agrega al menos un osmolito al medio de fermentación para proporcionar el osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. En una modalidad, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación cuando la fase de crecimiento del microorganismo se hace más lenta. En una modalidad, se puede agregar el osmolito al medio de fermentación cuando se completa la fase de producción de butanol . Se pone en contacto al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol con un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, esteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22/ ácidos carboxílicos de C7 a C22, esteres de ácidos carboxílicos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Después, la fase orgánica que contiene butanol se separa de la fase acuosa, como se describió anteriormente Posteriormente, el butanol se recupera de la fase orgánica que contiene butanol, tal como se describió anteriormente. Se regresa al menos una porción de la fase acuosa al medio de fermentación. En una modalidad, el medio de fermentación también comprende etanol , y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol.

Se puede producir isobutanol mediante fermentación extractiva con el uso de una cepa modificada de Escherichia coli en combinación con un alcohol oleílico como agente extractante orgánico, como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389. El método produce un título eficaz más alto para el isobutanol (es decir, 37 g/1) en comparación con el uso de técnicas de fermentación convencionales (véase el Ejemplo 6 de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389). Por ejemplo, Atsumi et al. {Nature 451 (3) : 86-90 , 2008) describen que el isobutanol alcanza un título de hasta 22 g/1 al usar una fermentación con Escherichia coli que se modificó genéticamente para contener una ruta biosintética del isobutanol. El título más alto del butanol que se obtiene con el método de fermentación extractiva descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389 se debe, al menos en parte, a la eliminación del producto tóxico de butanol del medio de fermentación, lo cual mantiene el nivel por debajo del nivel tóxico para el microorganismo. Es razonable suponer que el método de fermentación extractiva de la presente que usa al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, como se define en la presente descripción, se usaría de manera similar y proporcionaría resultados similares.

El butanol que se produce con los métodos descritos en la presente puede tener un título eficaz mayor de 22 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol que se produce con los métodos descritos puede tener un título eficaz de al menos 25 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol que se produce con los métodos descritos en la presente invención puede tener un título eficaz de al menos 30 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol que se produce con los métodos descritos en la presente invención puede tener un título eficaz de al menos 37 g por litro del medio de fermentación.

Los presentes métodos se describen generalmente abajo con referencia a la Figura 1 a la Figura 7.

Con referencia ahora a la Figura 1, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol al usar fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente, osmolito se introduce en un termentador 20, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable . Opcionalmente, se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 12 y una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introducen en un recipiente 16 , en el que el primer y segundo agente extractante se combinan para formar el agente extractante combinado 18. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 18, al recipiente 16, a la corriente del primer agente extractante 12, a la corriente del segundo agente extractante 14 o a una combinación de estos. Una corriente del agente extractante 18 se introduce en el fermentador 20, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol . Una corriente 26 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 38, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42. Opcionalmente, se regresa al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene osmolito (no se muestra) al fermentador 20 o a otro fermentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

Con referencia ahora a la Figura 2, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol al usar fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente, osmolito se introduce en un termentador 20, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 12 y una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introducen por separado en el fermentador 20, en donde se produce el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 12, a la corriente 14 o a una combinación de estas. Una corriente 26 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 38, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42. Opcionalmente, se regresa al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene osmolito (no se muestra) al fermentador 20 o a otro fermentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

Con referencia ahora a la Figura 3, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente , osmolito se introduce en un primer fermentador 20, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 12 se introduce en el fermentador 20, y una corriente 22 que comprende una mezcla del primer agente extractante y los contenidos del fermentador 20 se introduce en un segundo fermentador 24. Una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introduce en el segundo recipiente 24, en donde se produce el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol . Opcionalmente , se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 12, a la corriente 22, a la corriente 14, al recipiente 24 o a una combinación de estos. Una corriente 26 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 38, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42. Opcionalmente, se regresa al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene osmolito (no se muestra) al termentador 20 o a otro termentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

Con referencia ahora a la Figura 4, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol en la que la extracción del producto se realiza corriente abajo del termentador en lugar de realizarse en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente, osmolito se introduce en un termentador 120, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente , se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al termentador. Una corriente del primer agente extractante 112 y una corriente del segundo agente extractante opcional 114 se introducen en un recipiente 116, en el que el primer y segundo agente extractante se combinan para formar el agente extractante combinado 118. Por lo menos una porción, que se muestra como corriente 122, del medio de fermentación en el termentador 120 se introduce en el recipiente 124. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 112, a la corriente 114, al recipiente 116, a la corriente 118, al recipiente 124 o a una combinación de estos. Una corriente del agente extractante 118 se introduce, además, en el recipiente 124, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Una corriente 126 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 138, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Se regresa al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene osmolito al fermentador 120 u, opcionalmente , a otro fermentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional .

Con referencia ahora a la Figura 5, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol en la que la extracción del producto se realiza corriente abajo del fermentador en lugar de realizarse en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente, osmolito se introduce en un fermentador 120, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 112 y una corriente del segundo agente extractante 114 se introducen por separado en un recipiente 124, en el que el primer y segundo agente extractante se combinan para formar el agente extractante combinado. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 112, a la corrientell4 , a la corriente 122, al recipiente 124 o a una combinación de estos. Por lo menos una porción, que se muestra como corriente 122, del medio de fermentación en el termentador 120 también se introduce en el recipiente 124, en donde se produce el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol . Una corriente 126 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 138, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Se regresa al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene osmolito al termentador 120 u, opcionalmente, a otro termentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

Con referencia ahora a la Figura 6, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol en la que la extracción del producto se realiza corriente abajo del termentador en lugar de realizarse en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable que contiene, opcionalmente , osmolito se introduce en un termentador 120, que contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no se muestra) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, se puede agregar osmolito como una corriente separada (no se muestra) al termentador. Una corriente del primer agente extractante 112 se introduce en un recipiente 128, y al menos una porción, que se muestra como corriente 122, del medio de fermentación en el termentador 120 también se introduce en el recipiente 128. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 122, a la corriente 112, al recipiente 128 o a una combinación de estos. Una corriente 130 que comprende una mezcla del primer agente extractante y el contenido del termentador 120 se introduce en un segundo recipiente 132. Opcionalmente, se puede agregar osmolito (no se muestra) a la corriente 130, a la corriente 114, al recipiente 132 o a una combinación de estos. Una corriente del segundo agente extractante opcional 114 se introduce en el segundo recipiente 132, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Una corriente 134 que comprende ambas fases, la fase acuosa y la fase orgánica, se introduce en un recipiente 138, en el que se realiza la separación de la fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Se regresa al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene osmolito al termentador 120 u, opcionalmente, a otro termentador (no se muestra) . Los puntos de adición del osmolito al proceso se seleccionan de manera que concentración osmolítica en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional.

Los procesos extractivos descritos en la presente pueden ejecutarse como procesos por lotes o ejecutarse en un modo continuo, en donde se agrega agente extractante fresco y se elimina por bombeo el agente extractante usado para que la cantidad de agente extractante en el termentador permanezca constante durante todo el proceso de fermentación. La extracción continua de productos y subproductos de la fermentación puede aumentar la velocidad, el título y el rendimiento efectivos.

En todavía otra modalidad, es posible, además, realizar la extracción líquido- líquido en un modo flexible de corrientes paralelas o, alternativamente, en contracorriente que justifica la diferencia en los perfiles de operación por lotes cuando se usa una serie de termentadores por lotes . En este escenario, los termentadores se llenan con una masa fermentable que proporciona al menos una fuente de carbono fermentable y un microorganismo de manera continua, uno después del otro, durante el tiempo que la planta esté en funcionamiento. Con referencia a la Figura 7, cuando el Fermentador F100 se llena con la templa y el microorganismo, estos se alimentan en el Fermentador F101 y, luego, en el Fermentador F102 para después volver al Fermentador F100 en un circuito continuo. Se puede agregar osmolito (no se muestra) a uno o más termentadores, a la corriente que ingresa al fermentador, a la corriente que sale del fermentador o a una combinación de estos. En cualquiera de los termentadores, la fermentación comienza con la presentación conjunta de la masa de fermentación y el microorganismo y continúa hasta que se completa la fermentación. El tiempo de llenado de la masa de fermentación y el microorganismo equivale a la cantidad de termentadores dividida por el tiempo total del ciclo (llenado, fermento, vaciado y limpieza) . Si el tiempo total del ciclo es de 60 horas y hay 3 termentadores, entonces el tiempo de llenado es de 20 horas. Si el tiempo total del ciclo es de 60 horas y hay cuatro termentadores, entonces el tiempo de llenado es de 15 horas.

La extracción adaptable a corrientes paralelas sigue el perfil de fermentación en el supuesto de que el termentador que funciona con el título más alto de la fase del caldo puede usar la corriente de solvente extractor más rica en concentración de butanol, y el fermentador que funciona con el título más bajo de la fase del caldo se beneficiará con la corriente de solvente extractor más pobre en concentración de butanol. Por ejemplo, con referencia nuevamente a la Figura 7, considérese el caso en que el Fermentador F100 se encuentra al inicio de una fermentación y funciona con un título relativamente bajo de butanol en la fase del caldo (B) , el Fermentador F101 se encuentra en el medio de una fermentación que funciona con un título relativamente moderado de butanol en la fase del caldo, y el Fermentador F102 se encuentra casi al final de una fermentación que funciona con un título relativamente alto de butanol en la fase del caldo. En este caso, el solvente extractor de menor contenido (S) , con una cantidad mínima o nula de butanol extraído, puede alimentarse en el Fermentador F100, la corriente de "salida de solvente" (S') del Fermentador F100 que tiene un componente de butanol extraído puede alimentarse en el Fermentador F101 como su corriente de "entrada de solvente", y la corriente de "salida de solvente" del F101 puede alimentarse en el Fermentador F102 como su corriente de entrada de solvente . La corriente de salida de solvente del F102 podrá entonces enviarse para procesarse y recuperar el butanol presente en la corriente. La corriente de solvente procesada de la cual se elimina la mayor parte de butanol puede regresarse al sistema como solvente extractor pobre en butanol y sería el solvente que se alimenta en el Fermentador F100 anteriormente.

Como las fermentaciones continúan de manera ordenada, pueden reubicarse las válvulas del distribuidor del solvente extractor para alimentar el solvente extractor de menor contenido en el fermentador que funciona con el título más bajo de butanol en la fase del caldo. Por ejemplo, en el supuesto de que (a) el Fermentador F102 completa su fermentación, se ha recargado y la fermentación comienza nuevamente, (b) el Fermentador F100 está en la mitad de su fermentación y funciona con un título moderado de butanol en la fase del caldo, y e) el Fermentador F101 está casi al final de su fermentación y funciona con un título relativamente más alto de butanol en la fase del caldo. En este escenario, el solvente extractor más pobre alimentaría el F102, el solvente extractor que sale del F102 alimentaría el Fermentador F100 y el solvente extractor que sale del Fermentador F100 alimentaría el Fermentador F101.

La ventaja de funcionar de esta manera sería mantener el título de butanol de la fase del caldo tan bajo como sea posible durante el mayor tiempo posible para realizar mejoras en la productividad. Además, puede ser posible hacer caer la temperatura en los otros termentadores que han avanzado más en la fermentación y que están funcionando con títulos más altos de butanol en la fase del caldo. La caída de la temperatura puede posibilitar una tolerancia mejorada para títulos más altos de butanol en la fase del caldo.

Ventajas de los presentes métodos Los métodos de fermentación extractiva de la presente proporcionan butanol que se conoce tiene un contenido energético similar al de la gasolina y puede combinarse con cualquier combustible fósil. Se prefiere el butanol como combustible o aditivo para combustibles, ya que produce sólo C02 y una cantidad pequeña o nula de SOx o NOx cuando se quema en un motor de combustión interna estándar. Además, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo para combustibles de máxima preferencia hasta la fecha.

Además de su utilidad como biocombustible o aditivo para combustibles, el butanol que se produce de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene el potencial de impactar los problemas de distribución de hidrógeno en la industria emergente de células de combustible. Hoy en día, las células de combustible suscitan preocupaciones sobre seguridad asociadas con el transporte y la distribución de hidrógeno. El butanol puede reformarse fácilmente para su contenido de hidrógeno y puede distribuirse a través de gasolineras existentes en la pureza requerida para células de combustible o vehículos. Además, los métodos de la presente invención producen butanol de fuentes de carbono derivadas de plantas, lo cual evita un impacto ambiental negativo asociado a los procesos petroquímicos estándar para la producción de butanol .

Las ventajas de los métodos de la presente invención incluyen la viabilidad de producir butanol con velocidad, título y rendimiento netos eficaces que son significativamente más altos y más económicos que los niveles umbral del butanol obtenido mediante un proceso de fermentación extractiva bifásica sin la adición de al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional. El método de la presente invención también puede reducir la cantidad neta de agente extractante nuevo o reciclado que se requiere para lograr un nivel deseado de producción de butanol de una fermentación en lotes.

EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades preferidas de la invención, se aportan a manera de ejemplo únicamente. De la descripción precedente y de estos ejemplos, aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrán introducir diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.

Materiales Se usaron los siguientes materiales en los ejemplos.

Todos los reactivos comerciales se usaron como se recibieron .

Todos los solventes se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se usaron sin purificación adicional. El alcohol oleílico empleado fue de grado técnico y contenía una mezcla de alcohol oleílico (65 %) y alcoholes grasos de cadena más larga y cadena más corta. El isobutanol (99.5 % de pureza) se obtuvo de Sigma-Aldrich y se usó sin purificación adicional.

Métodos generales Las concentraciones de isobutanol y de glucosa en la fase acuosa se midieron mediante HPLC (modelo aters Alliance, Milford, MA o serie Agilent 1200, Santa Clara, CA) con una columna BioRad Aminex HPX-87H, de 7.8 mm x 300 mm, (laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA) con columnas de guarda adecuadas, mediante el uso de ácido sulfúrico acuoso 0.01 N, isocrático, como eluyente. La muestra se hizo pasar a través de un filtro centrífugo de 0.2 ]im (nailon modificado de melamina-formaldehído (MF, por sus siglas en inglés) de Nanosep) hacia el interior de un frasco de HPLC. Las condiciones de ejecución de la HPLC fueron las siguientes: Volumen de inyección: 10 µ? Velocidad de flujo: 0.60 ml/minuto Tiempo de ejecución: 40 minutos Temperatura de columna: 40 °C Detector: índice de refracción Temperatura del detector: 35 °C Detección UV: ancho de banda 210 nm, 8 nm Después de la ejecución, las concentraciones en la muestra se determinaron a partir de curvas estándar para cada uno de los compuestos. Los tiempos de retención fueron 32.6 y 9.1 minutos para isobutanol y glucosa, respectivamente.

Ejemplo 1 Efecto de la concentración de sacarosa en el coeficiente de partición (Kp) El objetivo de este ejemplo es evaluar el efecto que tienen las concentraciones de sacarosa del medio de fermentación en el coeficiente de partición (Kp) del isobutanol cuando se usa alcohol oleílico como agente extractante. El medio de fermentación basal (BF , por sus siglas en inglés) que se usa generalmente en las fermentaciones de E. coli se usó como medio de fermentación en este Ejemplo. La composición del BFM se indica en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de BFM La solución de oligoelementos que se usó en el medio anterior se preparó de la siguiente manera. Los ingredientes enumerados a continuación se agregaron en el orden que consta en la lista, y la solución se calentó a 50 °C-60 °C hasta que se disolvieron por completo todos los componentes . Se agregó lentamente citrato férrico una vez que los otros ingredientes estuvieron en solución. La solución se esterilizó mediante filtros de 0.2 mieras.

EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0.84 g/1 Hexahidrato de dicloruro de cobalto (6- 0.25 g/1 hidrato de cloruro de cobalto) Tetrahidrato de dicloruro de manganeso (4- 1.5 g/1 hidrato de cloruro de manganeso) Dihidrato de cloruro cúprico 0.15 g/1 Ácido bórico (H3B03) 0.30 g/1 Dihidrato de molibdato sódico 0.25 g/1 Dihidrato de acetato de zinc 1.30 g/1 Citrato férrico 10.0 g/1 Se calcula que el nivel inicial de las sales totales (suma de fosfato potásico monobásico, fosfato amónico dibásico, monohidrato de ácido cítrico y heptahidrato de sulfato magnésico) en el BFM, como se muestra en la Tabla 2, era de aproximadamente 144.2 mM. Se agregaron 2 mmol/1 de clorhidrato de betaína al medio basal ya que se informa en la literatura (Cosquer A, et al; 1999; Appl Environ Microbiol 65:3304-3311) que mejora la tolerancia osmótica de E. coli.

Se usó el siguiente procedimiento experimental para generar los datos de la Tabla 3. En estos experimentos de medición de Kp, se agregó una cantidad específica de sacarosa como osmolito, al medio de fermentación basal . A 30 mi de BFM complementado con sacarosa, se agregó 10 mi de agente extractante de alcohol oleílico (OA, por sus siglas en inglés) rico en isobutanol que contenía 168 g/1 de isobutanol, y se mezclaron vigorosamente durante 4 y 8 horas a 30 °C con agitación a 250 rpm en un agitador de mesa (Innova 4230, New Brunswick scientific, Edison, NJ) para lograr el equilibrio entre las dos fases. La fase acuosa y la fase orgánica en cada matraz se separaron por decantación. La fase acuosa se centrifugó (2 minutos a 13,000 rpm con un modelo de centrífuga 5415R de Eppendorf) para eliminar la fase de agente extractante residual, y el sobrenadante se analizó para determinar la glucosa y el isobutanol mediante HPLC. El análisis de los niveles de isobutanol en la fase acuosa después de 4 horas de agitación fue similar al que se obtuvo después de 8 horas de mezclado; esto sugiere que el equilibrio entre las dos fases se logró dentro de las 4 horas. El objetivo era probar que el mezclado adicional después de las 4 horas no cambiaba el Kp.

El coeficiente de partición (Kp) de la distribución de isobutanol entre la fase orgánica y la fase acuosa se calculó de la cantidad conocida de isobutanol que se agregó al matraz y de los datos de la concentración de isobutanol que se midieron en la fase acuosa. La concentración de isobutanol en la fase de agente extractante se determinó mediante el equilibrio de la masa. El coeficiente de partición se determinó como la relación de la concentración de isobutanol entre la fase orgánica y la fase acuosa, es decir, Kp = [isobutanol] fase orgánica / [isobutanol] fase acuosa- Cada punto de datos correspondiente a un nivel específico de sacarosa que se muestra en la Tabla 3 se repitió dos veces, y los valores de Kp se informaron como el promedio de los dos matraces.

Tabla 3. Efecto de la concentración de sacarosa en el Kp del isobutanol Los resultados de la Tabla 3 demuestran que la complementación del medio de fermentación acuoso con un osmolito en forma de sacarosa dio como resultado un Kp de isobutanol más alto en un sistema bifásico con alcohol oleílico como fase extractante.

Ejemplo 2 (esperado) Aumento de la producción de isobutanol mediante la adición de una cantidad excesiva de glucosa o sacarosa, como osmolito, en el medio de fermentación Una bacteria o una levadura modificadas genéticamente capaces de producir isobutanol se cultivan en un medio de fermentación típico que consiste en algunos niveles bajos de sales como fuente de nitrógeno y fosfato, vitaminas, oligoelementos , peptona de extracto de levadura y una fuente de carbono, tal como glucosa o sacarosa. La concentración de la fuente de carbono varía, típicamente, de 2 g/1 a 30 g/1. Para fomentar la producción de biomasa, la etapa de fermentación inicial es aerobia, en la cual el aire se depura en el medio a 0.2-1.0 volumen/volumen por minuto (wm) . La temperatura se mantiene a 30 °C, y el pH se mantiene entre 5.0 y 6.5. Una vez que se desarrolla una cantidad suficiente de biomasa, se desencadena la producción de isobutanol por medio de cambiar las condiciones de fermentación por condiciones anerobias o microaerobias . Las condiciones anerobias se crean al cortar por completo el suministro de aire, mientras que las condiciones microaerobias se logran al hacer más lento el suministro de aire y/o reducir la velocidad de agitación. Durante esta etapa de producción de la fermentación, se acumula isobutanol en el medio, y la concentración continúa en aumento hasta que se vuelve inhibidora para el microorganismo; esto provoca que la velocidad de fermentación sea más lenta. El efecto neto es una velocidad y un titulo totales más bajos para la producción de isobutanol .

La adición de agentes extractantes orgánicos, como el alcohol oleílico, en el termentador durante la etapa de producción extrae butanol de la fase acuosa; esto mitiga el efecto inhibidor en el microorganismo y da como resultado una velocidad y un título más altos de la fermentación del isobutanol. La velocidad de fermentación en este sistema bifásico también se vuelve más lenta una vez que la concentración de la fase acuosa del isobutanol alcanza un nivel umbral inhibidor. En presencia del agente extractante (alcohol oleílico) en el termentador, el coeficiente de partición (Kp) del isobutanol entre las dos fases establece la concentración acuosa del isobutanol. En el caso de un sistema de alcohol oleílico/agua, el Kp se encuentra dentro del orden de 3.5-4.5. Es posible lograr un aumento considerable de la velocidad y del título del isobutanol si se puede aumentar el Kp del isobutanol durante la fermentación, de manera que la concentración acuosa del isobutanol caiga por debajo del nivel umbral inhibidor.

Los resultados del Ejemplo 1 demostraron que la adición de altos niveles de sacarosa puede aumentar dramáticamente el Kp; por lo tanto, una vez que la concentración acuosa de isobutanol en el Ejemplo 2 alcanza niveles inhibidores durante la fermentación, se agrega al menos un osmolito, tal como glucosa, sacarosa, templa de maíz o combinaciones de estos, a niveles excepcionalmente altos (50- 250 g/1) para mitigar el efecto inhibidor del isobutanol en el microorganismo. El efecto neto será una velocidad y un título totales más altos de fermentación del isobutanol. Además, el aumento del Kp debido a la adición de ese osmolito provocará un proceso de extracción mejorado y eficaz durante la eliminación del producto en el lugar (ISPR, por sus siglas en inglés) en comparación con el caso en el que no se agrega una cantidad excesiva de azúcares, como osmolitos, al medio de fermentación.

En una modalidad, la concentración osmolítica en forma de glucosa se puede modular y variar durante la fermentación controlando la velocidad de hidrólisis del almidón en la templa de maíz que se convierte en glucosa. A menudo, la templa de maíz que comprende, predominantemente, almidón (polímero de glucosa) , se usa como fuente de carbono en la industria del etanol que se obtiene del maíz para producir etanol. En este proceso, la templa de maíz primero se licúa a alta temperatura (85 °C- 100 °C) durante 90 - 120 min mediante la adición de una enzima alfa-amilasa termoestable (por ejemplo, SPEZYME® FRED-L; Genencor International, San Francisco, USA) y, después, se agrega la templa de maíz licuada a un fermentador que contiene un microorganismo adecuado (biocatalizador) para producir etanol o butanol, como se describe en la presente invención. La glucosa en la templa de maíz licuada se libera lentamente durante la fermentación y se pone a disposición del microorganismo mediante la adición de una segunda enzima al fermentador, por ejemplo, glucoamilasa (Distillase® L-400; Genencor International, San Francisco, Estados Unidos). Generalmente, la velocidad de hidrólisis del almidón que controla la velocidad de la disponibilidad de la glucosa en el fermentador se manipula mediante la cantidad de enzima glucoamilasa que se agrega durante la fermentación. En este ejemplo predictivo de producción de butanol, se sugiere que una vez que el butanol alcanza un nivel inhibidor en la fase acuosa del fermentador bifásico, se puede aumentar el nivel de la glucosa, como osmolito, a niveles muy altos para maximizar el Kp del butanol mediante la adición de glucoamilasa en exceso. Este método para modular el nivel de glucosa durante la fermentación del butanol permite suministrar de manera óptima el osmolito tanto a la fase de crecimiento como a la fase de producción de la fermentación.

A continuación se describen métodos analíticos que se podrían usar en el Ejemplo 2 predictivo.

La concentración de glucosa en el caldo de cultivo se puede medir rápidamente con un analizador bioquímico Select 2700 (YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH) . Las muestras del caldo de cultivo se centrifugan a temperatura ambiente durante 2 minutos a 13,200 rpm en tubos Eppendorf de 1.8 mi, y el sobrenadante acuoso se analiza para determinar la concentración de glucosa. El analizador puede realizar una autocalibración con un estándar de glucosa conocido antes de evaluar cada conjunto de muestras del termentador,· también se puede evaluar periódicamente un estándar externo para asegurar la integridad de los ensayos del caldo de cultivo. Las especificaciones del analizador para el análisis pueden ser las siguientes: Tamaño de la muestra: 15 µ? Química de sonda negra : dextrosa Química de sonda blanca: dextrosa El isobutanol y el etanol en la fase de agente extractante orgánico se miden mediante cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés), como se describe más adelante.

Se puede usar el siguiente método de GC para determinar la cantidad de isobutanol y etanol en la fase orgánica. El método de GC usa una columna J&W Scientific DB-WAXETR (50 m x 0.32 mm ID, película de 1 µp?) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) . El gas portador es helio a una velocidad de flujo de 4 ml/min con una presión de cabezal constante; la separación del inyector es 1:5 a 250 °C; la temperatura del horno es 40 °C durante 5 min, de 40 °C a 230 °C a 10 °C/min, y 230 °C durante 5 min. La detección de la ionización de las llamas se realiza a 250 °C con 40 ml/min de gas helio de reposición. Las muestras del caldo de cultivo se centrifugan antes de la inyección. El volumen de inyección es 1.0 yL. Se generan curvas estándar calibradas para el etanol y el isobutanol . En estas condiciones, el tiempo de retención del isobutanol es 9.9 minutos, y el tiempo de retención del etanol es 8.7 minutos.

Si bien se describieron modalidades particulares de la presente invención en la descripción anterior, las personas con conocimiento en la técnica entenderán que la invención puede someterse a distintas modificaciones, sustituciones y arreglos sin alejarse del espíritu o de los atributos esenciales de la invención. Deberá hacerse referencia a las reivindicaciones adjuntas, en lugar de a la memoria descriptiva anterior, que indican el alcance de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para recuperar butanol a partir de un medio de fermentación caracterizado porque comprende: a) proporcionar un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fermentable ; b) poner en contacto el medio de fermentación con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a 22 , ácidos grasos de C12 a C22/ ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos grasos de C7 a C22/ ésteres de ácidos grasos de C7 a C22 , aldehidos grasos de C7 a C22 , amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; y c) opcionalmente , recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una porción del butanol se elimina en forma conjunta del medio de fermentación mediante un proceso que comprende las siguientes etapas: a) estabilizar butanol del medio de fermentación con un gas para formar una fase gaseosa que contiene butanol; y b) recuperar butanol de la fase gaseosa que contiene butanol.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se agrega el osmolito al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el osmolito comprende un monosacárido, un disacárido, glicerol, jugo de caña de azúcar, melazas, polietilenglicol , dextrano, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el osmolito comprende un monosacárido seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, fructosa, glucosa y combinaciones de estas.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el osmolito se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol , dextrano, templa de maíz, almidón, celulosa y combinaciones de estos.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste en bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levadura.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium y Brevibacterium.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la levadura se selecciona del grupo que consiste en Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia y Saccharomyces.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer agente extractante se selecciona del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mistírico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-dodecanol y una combinación de estos.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer agente extractante comprende alcohol oleílico.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo agente extractante se selecciona de 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal y una combinación de estos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es 1-butanol.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es 2 -butanol.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es isobutanol.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol contiene etanol.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente comprende una modificación que inactiva una ruta competidora para flujo de carbono.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente no produce acetona.

19. Un método para la producción de butanol, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable ; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación bifásico que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22z esteres de ácidos carboxílieos de C7 a C aldehidos de C7 a C22/ amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico también comprende al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, durante un tiempo suficiente para permitir la extracción del butanol en el agente extractante orgánico para formar una fase orgánica que contiene butanol; c) separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y opcionalmente , d) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque se agrega el osmolito a la fase acuosa durante la fase de crecimiento del microorganismo, a la fase acuosa durante la fase de producción de butanol, a la fase acuosa cuando la concentración de butanol en la fase acuosa es inhibidora, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el osmolito se obtiene de un sustrato de carbohidrato de la fermentación.

22. Un método para la producción de butanol, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación, en donde el microorganismo produce el butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que contiene butanol; c) agregar al menos un osmolito al medio de fermentación para proporcionar el osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional; d) poner en contacto al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22/ esteres de ácidos grasos de C12 a C22/ aldehidos grasos de C12 a C22 , amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22 esteres de ácidos carboxílieos de C7 a C22 aldehidos de C7 a C22, amidas de C7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; e) separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; f) opcionalmente, recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol; y g) opcionalmente, regresar al menos una porción de la fase acuosa al medio de fermentación.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque se agrega el osmolito al medio de fermentación en la etapa (c) , cuando la fase de crecimiento del microorganismo se hace más lenta.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque se agrega el osmolito al medio de fermentación en la etapa (c) , cuando se completa la fase de producción de butanol .

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 19 o 22, caracterizado porque al menos una fuente de carbono fermentable se encuentra presente en el medio de fermentación y comprende carbono renovable de materias primas agrícolas, algas, celulosa, hemicelulosa , lignocelulosa, o cualquier combinación de estas.

26. Una composición caracterizada porque comprende: (a) un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un osmolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración osmolítica del medio de fermentación basal y de una fuente de carbono fermentable opcional, y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fe mentable ; b) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de CX2 a C22 , ácidos grasos de Ci2 a C22, esteres de ácidos grasos de C12 a C22 aldehidos grasos de Ci2 a C22( amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos; y opcionalmente , un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C7 a C22, ésteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22, y mezclas de estos; caracterizada porque se puede formar una mezcla bifásica que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol , mediante la cual se puede separar butanol del medio de fermentación de (a) .