CN109536397B

CN109536397B - 一种基因工程酿酒酵母及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109536397B
Application number: CN201811465766.1A
Authority: CN
Inventors: 许建韧; 刘晨光; 赵心清; 白凤武
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109536397A

Abstract

本发明公开了一种基因工程酿酒酵母，其中YCR049C基因被失活或YCR049C基因缺失。本发明还公开了基因工程酿酒酵母的制备方法及在乙醇发酵生产中的应用。本发明的基因工程酿酒酵母显著提高了酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性，并且能够在超高浓度乙醇发酵条件下，增强菌株乙醇发酵性能。

Description

一种基因工程酿酒酵母及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种乙醇胁迫耐受性提高的基因工程酿酒酵母及其制备方法和应用。

背景技术

燃料乙醇是环境友好的可再生能源之一，基于生物质通过微生物发酵生产，可以单独使用或与汽油混配制成乙醇汽油作为汽车燃料。酿酒酵母是乙醇发酵生产菌株，已经得到广泛研究和应用。由于高浓度乙醇对酵母细胞有生理毒性，发酵终点乙醇浓度低的问题突出，不仅导致从发酵醪中分离乙醇的能耗高，而且产生大量废糟液。

通过多组学分析或基因功能验证等多种手段，数百个基因被证实可能与酿酒酵母乙醇胁迫响应有关，这些基因涉及蛋白合成、氨基酸代谢、核苷酸代谢、糖的转运、细胞生长、脂类代谢、细胞周期及细胞膜(壁)合成等多个功能，具有一定的复合性。由于酵母细胞代谢网络的复杂性，不同层次的胁迫响应，多基因调控等综合因素，特别是能否通过乙醇耐性机制调控胁迫响应基因提高菌株乙醇耐受性，仍没有被系统揭示和证实，这些研究工作的进展将为酵母遗传育种和工业化应用奠定理论基础。

发明内容

选育乙醇耐受性好的酿酒酵母菌株，对提高发酵终点乙醇浓度，节省乙醇分离能耗，减少废糟液排量，具有十分重要的意义。为了一定程度上解决上述问题，本发明的目的提供一种基因工程酿酒酵母，及其制备方法和应用。

本发明的第一个方面提供了一种基因工程酿酒酵母，其中YCR049C基因被失活或YCR049C基因缺失。

进一步地，YCR049C基因的序列如SEQ ID NO:1所示或YCR049C基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，改造出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c。

在一个实施方式中，该基因工程酿酒酵母为酿酒酵母M8-KO049，保藏号为 CGMCCNO.16628，于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的第二个方面提供了一种提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，将酿酒酵母中的YCR049C基因失活，或将YCR049C基因缺失；其中，YCR049C基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示或YCR049C基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个方面提供了一种上述基因工程酿酒酵母的制备方法，通过同源重组的方法敲除YCR049C基因。

进一步地，该制备方法包括步骤1)构建YCR049C敲除组件；步骤2)将 YCR049C敲除组件电击转化酿酒酵母；步骤3)筛选阳性克隆及鉴定。

进一步地，YCR049C敲除组件的构建方法为：利用PCR方法，在KanMX4融合性筛选标记的5’和3’两端分别连接模式酵母S288c的YCR049C的5’和3’两端部分同源序列；PCR上游引物序列如SEQ ID No:3所示，PCR下游引物序列如SEQ ID No:4所示。

本发明的第四个方面提供了一种如上所述的基因工程酿酒酵母在乙醇发酵生产中的应用。

进一步地，发酵生产为高浓度葡萄糖批次发酵。发酵培养基中，初始葡萄糖浓度为>250g/L。

本发明通过连续稳态乙醇发酵工艺条件下进行转录组分析，筛选出潜在乙醇耐性基因YCR049C。通过同源重组方法在模式酿酒酵母中敲除YCR049C，显著提高了酿酒酵母的乙醇胁迫耐受性，并且能够在超高浓度(Very high gravity,VHG)乙醇发酵条件下，增强菌株乙醇发酵性能，首次实验证明此基因与酿酒酵母的乙醇耐性有关，进而影响其乙醇发酵生产性能。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的敲除组件的构建策略。

图2是本发明的一个实施例的目的基因敲除组件检测电泳图；

图3是本发明的一个实施例的敲除转化子菌落PCR鉴定电泳图；

图4是本发明的一个实施例的乙醇添加平板生长比较图，其中：S288c HO为转入空载体的对照菌株；S288cΔ049C为M8-KO049菌株。

图5是本发明的一个较佳实施例的M8-KO049与对照菌株在VHG条件下批次发酵结果，其中：葡萄糖消耗(●and○)，乙醇生成(■and□)，生物量(▲and △)；实心：敲除菌株M8-KO049，空心：对照菌株S288c。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2018年10月24日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101

保藏编号：CGMCC No.16628；

分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的构思、具体步骤及产生的具体效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

本发明的一个具体实施方式的发明思路如下：

(1)筛选潜在乙醇耐性基因：通过乙醇发酵与长期乙醇胁迫偶联的发酵工艺，选取表型显著的菌株，在转录水平鉴定乙醇相关基因库，通过变化幅度明显的靶点基因，特别是功能基因；反过来，通过外源不同浓度乙醇添加摇瓶实验，从RT-qPCR 技术手段实证潜在耐性基因转录水平，以筛选乙醇耐性表型明显的靶基因 YCR049C。

具体地，通过对发明人的专利菌株絮凝酵母SPSC01及敲除絮凝基因FLO1后解絮凝菌株SPSC01ΔFLO1，在连续稳态乙醇发酵工艺条件下进行转录组分析，筛选出潜在乙醇耐性基因YCR049C。

该基因位于酵母染色体III NC_001135(211863-212309)，其编码蛋白使用Philius Transmembrane Prediction和TMHMM预测可能的跨膜结构；

(2)设计敲除引物，用经典的同源重组和KANMX4抗性筛选标记，通过PCR 扩增得到YCR049C敲除组件；

具体地，通过PCR，以酵母pHO整合载体(NCBI：#AF324728，美国Utah 大学DavidJ.Stillman惠赠)为基础，借助载体中的KANMX4抗性标记基因为模板，使用YCR049C敲除引物，PCR扩增获得含抗性标记基因的线性敲除组件；

(3)电击转化模式酵母酿酒酵母S288c，进行同源重组，替换S288c胞内染色体原YCR049C基因，达到基因敲除目的。用G418抗性(酵母)进行抗生素筛选，得到酿酒酵母敲除转化子，接着通过菌落PCR方法验证正确的敲除菌株。 M8-KO049。

YCR049C基因序列的NCBI登录号Gene ID:850416。KANMX4抗性标记基因模块来源于pFA6a-KanMX4质粒，最初是由大肠杆菌E.coli转座子Tn903的kan抗性的已知阅读框与丝状真菌Ashbya gossypii的TEF基因的转录和翻译的调控序列融合而成。KANMX4抗性标记基因的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示。

实施例1：潜在乙醇耐受基因筛选方法

步骤1转录水平鉴定乙醇胁迫与乙醇发酵相关基因

絮凝状态与细胞乙醇耐性紧密相关。因酵母受到不同浓度的乙醇抑制条件下，细胞内基因表达调控情况各异。为此，将乙醇胁迫与发酵系统偶联作为一个综合的乙醇因素进行考察，故选择两周以上的连续补料发酵方式调研工业絮凝酿酒酵母 (絮凝酵母菌株SPSC01，保藏号CGMCC NO.0587)与非絮凝酵母SPSC01ΔFLO1 转录水平，获得与乙醇发酵和胁迫相关的潜在耐性基因库。其中非絮凝酵母 SPSC01ΔFLO1是在絮凝酵母菌株SPSC01基础上，敲除主要絮凝基因FLO1构建而成(参见He L Y,Zhao X Q,Bai F W.Engineeringindustrial Saccharomyces cerevisiae strain with the FLO1-derivative geneisolated from the flocculating yeast SPSC01for constitutive flocculation andfuel ethanol production[J].Applied Energy, 2012,100(4):33-40)。

1.1连续补料发酵

(1)接一环斜面保藏酵母菌，过夜活化，然后1％(v/v)转接于装有100mL YPD培养基的250mL三角瓶中制备种子。30℃、150rpm，培养18h。

(2)取100mL种子加入1.5L连续补料发酵培养基中进行发酵，当发酵罐 (KBT-2.5L，韩国)中发酵液残糖浓度低于1g/L时，开启蠕动泵以0.025h^-1的稀释速率从培养基储罐中向发酵罐中流加发酵培养基，同时打开发酵罐的溢流口，通过溢流口控制发酵罐有效发酵体积为1.5L，发酵条件为30℃，150rpm，pH＝4.5，通气量0.03vvm。

其中，连续补料发酵培养基的成分为每升含酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖 150g。

(3)每天定时取3管4mL发酵液，10000rpm，离心5min，收集菌体。离心后沉淀用灭菌去离子水清洗两次，在80℃烘箱中过夜烘干至恒重，称重计算细胞干重。离心后上清用高效液相色谱检测残糖与乙醇含量。

1.2RNA提取

监测发酵指标，当连续补料发酵过程中，发酵装置中生物量维持在稳定值，可进行RNA样品的采集。

(1)取12ml发酵液，平行样3个，4℃，6000rpm，离心5min，收集菌体，

(2)用冰浴的0.9％(w/v)生理盐水快速洗涤，6000rpm，离心5min，弃上清，留菌体，快速置于液氮中冻存，5min后转移至-80℃冰箱保存。

(3)提取纯化严格按照

RNA提取试剂盒步骤，样品用琼脂糖凝胶电泳验证其RNA的完整性，送公司进行Illumina_HiSeq_2000测序，获得差异表达基因及差异表达量。

步骤2不同浓度乙醇添加下实证潜在耐性基因转录水平

2.1乙醇添加实验

(1)絮凝与非絮凝菌株先在YPD固体培养基上划线，30℃，过夜培养。

(2)挑单克隆，接种到100mL YPD液体培养基，30℃，150rpm，过夜活化。

(3)5％转接至YPD液体培养基中预培养种子20h左右。

(4)4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，留菌体，用0.1mol/L的柠檬酸钠解絮缓冲液(pH 5.0)重悬，离心洗涤，然后调节OD₆₂₀＝1.0。其中，柠檬酸钠解絮缓冲液的成分为0.1mol/L柠檬酸钠，pH5。

(5)5％(v/v)接种至100mL添加有5％，8％，10％(v/v)乙醇的YPD培养基(10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，100g/L葡萄糖)中，30℃，150rpm培养。 5％和8％乙醇条件下培养12小时，10％乙醇条件下培养24小时，随后提取RNA (

RNA提取试剂盒)，进行测序，并对转录结果进行分析。

2.2RT-qPCR验证

(1)将提取的总RNA反转录成cDNA，使用宝生物工程(大连)有限公司

反转试剂盒，先进行gDNA去除，再进行RT-PCR，具体操作和反应体系按说明书。反转后的cDNA溶液需10倍稀释待下一步用于cDNA模板。

(2)Real Time qPCR实验使用BIO-RAD iQ^TM

Green supermix试剂盒。采用两步法PCR反应程序。具体操作和反应体系按说明书。使用编码肌动蛋白的 ACT1基因(GI:296144393)作为内参。

由表1结果可知，在连续补料发酵中，由于存在连续的生物乙醇底物转化过程，同时存在长期胁迫影响，在诸多差异表达基因中，YCR049C转录水平在5.78，可见YCR049C转录本的上调是受乙醇显著影响的，通过5％，8％，10％(v/v)乙醇添加摇瓶实验，可见与乙醇胁迫浓度条件相关，并且我们参照同样5.78水平的 ORF_YGR107W(随机挑选)，可能推测改造YCR049C在菌株育种上见效显著。(相比于非絮凝酵母SPSC01ΔFLO1，菌株SPSC01的YCR049C基因上调。)

表1为转录组差异表达的数值，是Log2ratio(SPSC01ΔFLO1/SPSC01)，即以对照菌株(非絮凝)为分母、测试菌株SPSC01为分子的比值。

表1 SPSC01与SPSC01ΔFLO1菌株在不同乙醇浓度下转录水平比较(log₂ratio)

注：i:5％(v/v)乙醇添加；

ii:8％(v/v)乙醇添加；

iii:10％(v/v)乙醇添加；

iv:转录组测定值，发酵罐培养基乙醇浓度约为8.75％(v/v)

实施例2：敲除基因YCR049C酿酒酵母的制备

步骤1YCR049C敲除组件构建

1.1pHO整合质粒载体DNA提取

(1)将冻存的含有质粒的大肠杆菌DH5α接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm的条件下过夜培养。

(2)取4mL菌液，12000rpm，离心5min，收集菌体，加入100μL的溶液 I(25mmol/LTris-盐酸,pH 8.0；10mmol/L乙二胺四乙酸；50mmol/L葡萄糖)，剧烈振荡使菌体充分悬浮。

(3)加入200μL的溶液II(200mmol/L氢氧化钠；1％十二烷基硫酸钠)，上下颠倒，裂解菌体。

(4)加入150μL预冷的溶液III(3mol/L乙酸钾；5mmol/L乙酸)，上下颠倒，混均匀，冰上静置10min。

(5)4℃，12000rpm，离心10min，将上清移至干净的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀。

(6)4℃，12000rpm，离心10min，将上清移至干净的离心管中。

(7)加入2倍体积预冷的无水乙醇，混均匀，在-20℃放置20min，沉淀DNA。

(8)在4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，用70％的乙醇漂洗沉淀2次。

(9)室温放置5min，用50μL TE缓冲液溶解质粒。

(10)加入1μL 10mg/mL RNA酶，在37℃温育30min，-20℃保存。

1.2PCR扩增YCR049C敲除组件

以整合载体pHO为模板可扩增出KANMX4，YCR049C敲除组件的同源臂设计在引物中，分别加在KANMX4的5’端和3’端，敲除组件左端和右端同源臂分别来自YCR049C基因的5’端和3’端，中间为KANMX4，即G418抗性筛选标记。敲除组件的构建策略参见图1。

(1)引物序列如下：

YCR049CΔ-上游引物5’-CCAGGAGCGTGGGGCGAGGATCAAAACTCACGT

(SEQ ID No:3):CCCCAAAAAACGGACATGGAGGCCCAGAATAC-3’

YCR049CΔ-下游引物5’-GGTGGTTGTTCAGCACGGCTTGCAGCAAGAGCG

(SEQ ID No:4):CCAAAACAGATTCAGTATAGCGACCAGCATTC-3’

带有下划线的引物序列为同源臂。

(2)以pHO整合载体为模板扩增抗性基因KANMX4

聚合酶链式反应体系如下：

聚合酶链式反应条件如下：

将PCR产物用PCR纯化试剂盒按说明进行纯化，凝胶电泳检测，检测结果见图2。

步骤2 YCR049C敲除菌株构建

2.1酵母感受态细胞制备：

(1)取斜面保藏的酵母菌种S228c(购自ATCC 204508)一环，接种于YPD 培养基中，在30℃，150rpm，振荡过夜培养。

(2)取活化后的酵母菌5mL，接入装有100mL YPD培养基的500mL摇瓶中，在30℃，250rpm，振荡培养，使得细胞密度OD₆₂₀为1.0-1.2左右。

(3)将酵母菌液置于冰上冷却。

(4)4℃，5000rpm，离心5min，收集80mL细胞，弃上清，置于冰上。

(5)用冰预冷的40mL超纯水重悬菌体，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。

(6)重复(5)

(7)加入20mL冰预冷的1M山梨醇，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。

(8)重复(7)

(9)加入700μL冰冷的1M山梨醇，用移液枪温柔混匀，置冰上，迅速转化。

2.2酵母电击转化：

(1)将BIO-RAD电转杯超声洗净，加无水乙醇浸泡，最后用紫外照射并风干。

(2)取酵母感受态细胞80μL，加入事先制备好的待转化DNA 10μL用移液枪温柔混匀，冰上放置。

(3)加入到预冷的0.4cm电转杯中，选择真菌转化程序进行电击操作。

(4)立刻加入1mL冰预冷山梨醇(1M)，将细胞悬液转移到1.5mL的离心管中，在30℃静置温育2-4h。

(5)离心浓缩，将细胞涂布于YPD平板上(300μg/mL G418)，30℃培养箱倒置培养48小时，可见转化菌落生长。

2.3酵母阳性转化子验证

挑选平板上的菌落进行菌落PCR反应：

验证引物如下：

验证-YCR049CΔ-上游引物(SEQ ID No:5):

5’-AGGAGCGTGGGGCGAGGATCAAAAC-3’

验证-YCR049CΔ-下游引物(SEQ ID No:6):

5’-CAGCATTCACATACGATTGACGCAT-3’。

菌落基因组DNA提取：

(1)用灭菌的枪头蘸取单菌落，接入YPD液体过夜培养。

(2)取20μL菌液，12000rpm，离心2min，收集细胞。

(3)弃上清，加50μL灭菌水悬浮，同上离心，进行洗涤。

(4)加入20μL灭菌水，悬浮，99℃，煮沸10min。

(5)4℃，12000rpm，离心5min，取上清4μL做菌落聚合酶链式反应。

菌落聚合酶链式反应体系如下：

菌落聚合酶链式反应条件如下：

DNA凝胶电泳检测目的片段大小，验证结果如图3所示，泳道2的敲除菌株中扩增除了正确大小的抗性基因KANMX4。

至此，获得了敲除基因YCR049C酿酒酵母M8-KO049，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.16628。

实施例3：敲除菌株M8-KO049乙醇耐性生长比较

采用常规的生长比较方法，通过梯度稀释比较菌株生长的差异，菌落中细胞浓的表示生长好。具体操作为：

(1)将YCR049C敲除菌株M8-KO049(S288cΔYCR049C)和对照菌株S288c (或含有空载的对照菌株S288c HO)接种到100mL YPD液体培养基(10g/L酵母浸粉，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨)，30℃，150rpm，过夜培养。

(2)以1％的接种量分别转接至100mL YPD培养基中，同上培养，使OD₆₂₀值达到1.2。

(3)分别取1mL菌液，用灭菌后的0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)调节OD₆₂₀值至0.5，然后5倍梯度稀释；

(4)2μL点样于YPD固体培养基(10g/L酵母浸粉，20g/L葡萄糖，20g/L 蛋白胨，20g/L琼脂粉)以及添加乙醇溶剂(8％(v/v))的YPD固体培养基平板上；

(5)30℃培养箱中倒置培养，待菌落长出后观察对比并拍照。

结果如图4所示，在正常YPD培养条件下(20-24h)，M8-KO049敲除菌株和对照菌株生长一致基础上略好，说明敲除YCR049C基因后对酵母细胞的生长没有抑制作用。当正常YPD培养基培养中添加8％(v/v)的乙醇，而其它条件不变的情况下，敲除菌株的生长显著明显好于对照，在稀释至5^-6情况下仍有细胞菌落生长，而对照菌株稀释至5^-4情况下基本不能生长，说明敲除YCR049C基因后提高了 S288c菌株的乙醇耐受性。

实施例4：M8-KO049敲除菌株VHG发酵性能

采用发酵罐批次发酵工艺，考察了VHG(超高浓度)发酵条件下敲除菌株的发酵性能。

(1)M8-KO049敲除菌株和对照菌株S288c直接在YPD固体培养基上划线， 30℃，过夜培养。

(3)1％转接至100ml YPD液体培养基中预培养种子20h左右。

(4)分别取菌液，测其OD₆₂₀，用YPD液体培养基调节OD₆₂₀＝1.0。

(5)5％(v/v)接种至1L VHG发酵罐培养基(8g/L酵母浸粉，6g/L蛋白胨，300g/L葡萄糖)，pH 4.5、150rpm、通气量0.05vvm、30℃，定时取样，测定发酵参数，比较发酵结果。

结果如图5所示，高浓度葡萄糖的生物转化获得了高浓度乙醇胁迫， M8-KO049菌株提早约10h结束发酵，消耗290g/L葡萄糖，产生123.2g/L乙醇和9.9g/L生物量，而对照S288c菌株此时仍有8.8g/L葡萄糖，产生108.6g/L乙醇和9.5g/L生物量，乙醇产量提高了13.4％，说明乙醇耐性的增强对于乙醇发酵的促进作用，这在工业燃料乙醇生产可能起到节省能耗，提高单位效能作用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种基因工程酿酒酵母及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atggcgctgt ccaggagcgt ggggcgagga tcaaaactca cgtccccaaa aaacgacaca 60

tacttgctag catcctttcg gtggaacctc gaccgagact tgctcttcag gtgtgaaagg 120

tacttttgca tgtgggcgtc cacagggtac tcctcctcct gctcctgctt ccctgccaca 180

cgttccgcct cagtcgactc cactccttca gtcgactcca ctggctccac cagcgacgtg 240

gtagacgacc gtggcgaaac ctccatggac tcctgtggca ggatcacgtt atcgtacgtg 300

accgaatgcc gtttgttggc ttctgcggaa ttgagtctgc ggatcttaag aaactcttcg 360

tcttgcaaca aatccttagt ctccgtcatt cttgcaatct gttttggcgc tcttgctgca 420

agccgtgctg aacaaccacc tgcgtga 447

<210> 2

<211> 148

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

Met Ala Leu Ser Arg Ser Val Gly Arg Gly Ser Lys Leu Thr Ser Pro

1 5 10 15

Lys Asn Asp Thr Tyr Leu Leu Ala Ser Phe Arg Trp Asn Leu Asp Arg

20 25 30

Asp Leu Leu Phe Arg Cys Glu Arg Tyr Phe Cys Met Trp Ala Ser Thr

35 40 45

Gly Tyr Ser Ser Ser Cys Ser Cys Phe Pro Ala Thr Arg Ser Ala Ser

50 55 60

Val Asp Ser Thr Pro Ser Val Asp Ser Thr Gly Ser Thr Ser Asp Val

65 70 75 80

Val Asp Asp Arg Gly Glu Thr Ser Met Asp Ser Cys Gly Arg Ile Thr

85 90 95

Leu Ser Tyr Val Thr Glu Cys Arg Leu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Ser

100 105 110

Leu Arg Ile Leu Arg Asn Ser Ser Ser Cys Asn Lys Ser Leu Val Ser

115 120 125

Val Ile Leu Ala Ile Cys Phe Gly Ala Leu Ala Ala Ser Arg Ala Glu

130 135 140

Gln Pro Pro Ala

145

<210> 3

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaggagcgt ggggcgagga tcaaaactca cgtccccaaa aaacggacat ggaggcccag 60

aatac 65

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggttgtt cagcacggct tgcagcaaga gcgccaaaac agattcagta tagcgaccag 60

cattc 65

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggagcgtgg ggcgaggatc aaaac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagcattcac atacgattga cgcat 25

<210> 7

<211> 1357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 360

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 420

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 480

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 540

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 600

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 660

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 720

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 780

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 840

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 900

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 960

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ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1140

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tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 1260

tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 1320

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactg 1357

Claims

1.一种基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，YCR049C基因被失活。

2.如权利要求1所述的基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，所述YCR049C基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或所述YCR049C基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求2所述的基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，改造出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaee)S288c。

4.如权利要求1所述的基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，所述基因工程酿酒酵母为酿酒酵母M8-KO049，保藏号为CGMCC NO.16628，于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

5.一种提高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乙醇耐受性的方法，其特征在于，将酿酒酵母中的YCR049C基因失活；其中，所述YCR049C基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或所述YCR049C基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.一种如权利要求1所述的基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的制备方法，其特征在于，通过同源重组的方法敲除YCR049C基因。

7.如权利要求6所述的制备方法，包括：步骤1)构建YCR049C敲除组件；步骤2)将YCR049C敲除组件电击转化酿酒酵母；步骤3)筛选阳性克隆及鉴定。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，YCR049C敲除组件的构建方法为：利用PCR方法，在KanMX4融合性筛选标记的5’和3’两端分别连接模式酵母S288c的YCR049C的5’和3’两端部分同源序列；PCR上游引物序列如SEQ ID No:3所示，PCR下游引物序列如SEQ IDNo:4所示。

9.一种如权利要求1所述的基因工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在乙醇发酵生产中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述乙醇发酵生产为葡萄糖批次发酵，所述葡萄糖的初始浓度大于250g/L。