CN101045905A - 驯化选育的自絮凝酵母变异株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和微生物技术领域，公开了一种自絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae flo)，CGMCC No.1602。本发明还公开了所述的自絮凝酿酒酵母在乙醇及燃料乙醇生产等方面的用途。本发明还公开了采用所述的自絮凝酿酒酵母生产乙醇的方法。本发明的自絮凝酿酒酵母絮凝性能稳定，糖醇收率高，满足工业化生产要求。

Description

驯化选育的自絮凝酵母变异株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和微生物技术领域，特别涉及一种新的、具有自絮凝特征酿酒酵母变异株的选育方法、选育得到的菌株及其应用。

背景技术

发酵是乙醇、特别是燃料乙醇生产的关键技术，决定其原辅材料消耗和综合能耗。发酵技术的核心是菌株，目前国内外乙醇发酵均使用常规的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株呈单细胞游离状态，发酵过程中悬浮在发酵醪中，连续发酵条件下随发酵醪不断离开发酵系统，致使发酵罐中的细胞密度低，每毫升发酵醪中的酵母细胞密度仅为1-2亿个，导致乙醇发酵平均发酵时间长，例如在发酵终点乙醇浓度达到10-12％(v/v)条件下，连续发酵所需平均发酵时间为50-60h，发酵罐设备生产强度低，而且从发酵液中分离酵母必须使用碟片离心机，离心机设备投资大，运行能耗高。

为了解决游离酵母乙醇发酵技术的缺点，人们提出了固定化酵母的概念，并开发了相应的技术，使用各种载体材料，以包埋、交联、吸附等物理或化学方法来固定化酵母细胞，使其在发酵过程中能够被截留在发酵罐内，提高发酵罐内酵母细胞密度，缩短发酵时间，提高发酵罐设备生产强度。然而，各种固定化酵母都具有如下几方面的缺点：1、消耗载体材料；2、发酵过程一旦发生杂菌污染，很难控制；3、固定化酵母内部发酵产生CO₂对其涨裂破坏作用及发酵罐内大量CO₂扰动导致的磨损，严重影响固定化酵母的使用寿命；4、乙醇发酵过程副产的酵母难以回收，得到纯品酵母。

与游离酵母相比，絮凝酵母因其能够自絮凝形成毫米尺度的颗粒，可以被有效截留在发酵罐内，达到固定化的效果，而且发酵后酵母分离可以采用自沉降，节省离心机的设备投资与运行能耗。与各种载体材料固定化酵母相比，絮凝酵母在固定化过程中不消耗任何载体材料，发酵过程抗杂菌污染能力强，而且由于发酵过程酵母颗粒的解离和絮凝是一个可逆过程，始终维持动态平衡，因此不存在载体固定化酵母的寿命问题，同时乙醇发酵过程副产的酵母易于分离，得到纯品。

本发明人采用原生质体融合技术，以具有自絮凝能力但乙醇发酵性能较差的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和乙醇发酵性能优良但没有絮凝能力的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为双亲株，选育得到了一株具有自絮凝特征的融合株SPSC01，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO.0587(中国专利申请CN01138778.5和CN02110807.2)。然而，融合株SPSC01作为选育的第一代菌株，其絮凝稳定性和发酵性能，都不能满足工业化生产的要求，发酵装置运行过程中随运行时间的延长，SPSC01的絮凝能力显著降低，发酵液中游离酵母细胞数量相应增加。更为严重的是，由于其亲株之一S.pombe是从非洲土人酿制的pombe酒中分离得到的，发酵过程副产物有机酸含量较高，导致融合株SPSC01发酵过程糖醇收率低，仅为以葡萄糖为基准理论收率0.511的83％左右。

因此，目前迫切需要选育出自絮凝性能稳定，能够满足工业化生产要求且糖醇收率高的新乙醇发酵菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有自絮凝特征且絮凝性能稳定，可满足工业化生产要求，糖醇收率高的新乙醇发酵菌株。

在本发明的第一方面，提供一种自絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeflo)，所述的自絮凝酿酒酵母在培养液中培养时会形成颗粒，并且在转动或振荡停止后2-3分钟内所述颗粒会发生自沉降。

在本发明的一个优选例中，所述的自絮凝酿酒酵母在接种到培养液中，培养数小时(如1-4小时)会形成毫米级(如0.5-10毫米，更佳地1-5毫米)的颗粒，并且在转动或振荡停止后2-3分钟所述颗粒基本上全部自沉降(即90％以上，更佳地95％以上的颗粒发生自沉降)。

在本发明的另一优选例中，所述自絮凝酿酒酵母乙醇发酵时的糖醇收率大于88％。

更佳地，所述自絮凝酿酒酵母乙醇发酵的糖醇收率大于90％。

在本发明的另一优选例中，所述的自絮凝酿酒酵母的保藏号为CGMCCNo.1602。

在本发明的第二方面，提供一种所述的自絮凝酿酒酵母的用途，用于生产乙醇。

在本发明的另一优选例中，所述的乙醇为食用乙醇或燃料乙醇。

更佳地，所述的燃料乙醇按照有关国家标准，与汽油或柴油配混后，可用于机动车、船等的燃料。

在本发明的第三方面，提供一种生产乙醇的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将所述的自絮凝酿酒酵母接种于糖液中，进行发酵，得到发酵液；和

(2)从发酵液中分离出乙醇。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括步骤：从发酵液中分离出酵母。

在本发明的另一优选例中，所述的糖液是将淀粉质原料进行预处理而得到的糖液。

在本发明的另一优选例中，所述的预处理包括步骤：对淀粉质原料进行液化处理和进行糖化处理。

在本发明的另一优选例中，在液化处理后进行过滤，然后对滤液进行糖化处理。

在本发明的另一优选例中，所述的预处理还包括步骤：淀粉质原料的粉碎。

在本发明的另一优选例中，在粉碎前，还包括步骤：脱胚处理或脱皮处理。

在本发明的另一优选例中，采用淀粉酶对淀粉质原料粉浆进行液化。

在本发明的另一优选例中，采用糖化酶对淀粉质原料粉浆进行糖化。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(2)中还包括步骤：从发酵液中回收自絮凝酵母。

在本发明的另一优选例中，所述的回收方式为自沉降方式回收。

在本发明的另一优选例中，所述的淀粉质原料选自：粮食类淀粉质原料(如玉米、小麦、早籼稻)，或非粮食类淀粉质原料(如薯类)。

在本发明的另一优选例中，所述的发酵条件包括：发酵的温度为32±3℃，发酵的pH值在4.0±0.5。

在本发明的另一优选例中，发酵的温度为32±2℃。

在本发明的另一优选例中，发酵的pH值在4.0±0.2。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了自絮凝酵母菌株选育及性能评价流程图。

图2显示了用于驯化选育自絮凝酵母菌株的小型四级串联连续发酵装置工艺及设备流程图。其中，各设备、阀及控制系统编号及规格为：1、WM-2A型无油空压机；2、空气转子流量计(0～150mL/min)；3、针型阀；4、LP-3000pH指示及控制系统；5、温度指示及控制系统；6、φ8mm电磁阀；7、250mL氨水贮罐；8、恒温水槽；9、恒温水进口；10、恒温水出口；11培养基贮罐(2000mL三角瓶)；12、HL-2S型培养基流加蠕动泵；13、总容积约1500mL(内径φ110×高度H150mm)，工作容积约1000mL(在底部向上110mm处有φ6mm，向下倾斜30°的溢流口)，带有保温夹套的自制玻璃罐体；14、90-1型磁力搅拌器，配φ8×30mm搅拌子；15、发酵液贮罐(2000mL三角瓶)；16、HL-2S型样品采出蠕动泵；17、用于分离自絮凝酵母的样品。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和实验，最终驯化选育出一株具有良好的自絮凝特征且絮凝性能稳定的、发酵过程副产物少、糖醇收率高的新的乙醇发酵酵母菌株(保藏号为：CGMCC No.1602)，本发明人将该菌株命名为“自絮凝酿酒酵母变异株(Saccharomyces cerevisiae flo)”。多种试验表明，所述的自絮凝酿酒酵母变异株可以满足高效地生产乙醇的需求。本发明人在此基础上完成了本发明。

自絮凝酿酒酵母变异株

如本文所用，“自絮凝酵母变异株”、“自絮凝酵母flo”可互换使用，均是指保藏号为CGMCC No.1602的乙醇发酵菌株。

本发明提供了一种经选育获得的自絮凝酿酒酵母变异株，所述的自絮凝酿酒酵母变异株按照常规乙醇发酵酿酒酵母培养方法，从斜面保藏的试管中接种到摇瓶液体培养基中，数小时之内形成肉眼可见的毫米级自絮凝酵母颗粒，摇瓶转动或震荡停止后，2-3分钟内，该自絮凝颗粒酵母可以自沉降，使上部培养液变得澄清透明，取样显微镜下观察，基本上没有游离酵母细胞。

本发明所述的自絮凝酿酒酵母变异株的生理特性与乙醇发酵行业使用的酿酒酵母，如K2，相同。

絮凝性：良好絮凝性，摇瓶培养数小时，可以观察到毫米级大小自絮凝颗粒酵母，静置2～3分钟后，自絮凝颗粒酵母全部沉降，与SPSC01相比，该菌株絮凝性能稳定，在装置上连续使用三个月，絮凝性能不降低。

耐乙醇度：连续发酵条件下发酵终点乙醇浓度可以达到15％(v)以上，间歇发酵则可以达到20％(v)。

最适温度：菌体生长和乙醇发酵的最适温度分别为30-32℃和30-34℃，并可耐受38-40℃的高温。

糖醇转化率：对工业生产所用的淀粉质原料糖化液，其糖醇转化率可以达到88％以上。

利用所述菌株能够自絮凝形成毫米级颗粒的特征，在发酵罐中可实现细胞固定化，无需使用其它载体材料。

选育自絮凝酿酒酵母变异株

本发明人以目前乙醇发酵行业普遍使用的、发酵性能优良的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)K2或自絮凝酵母SPSC01(CGMCC 0587)为出发菌株，基于“絮凝是酵母细胞自身对环境胁迫因素的抗逆应激反应”原理，在小型多级串联发酵罐组成的连续发酵系统中，以低稀释率向一级发酵罐流加高糖底物，在末级发酵罐中建立高乙醇浓度和营养贫乏两方面的环境胁迫选择压力，进行驯化培养，使酵母细胞自絮凝，并根据絮凝性能，进行分离纯化，从而获得絮凝性能稳定且乙醇发酵性能满足工业化生产要求的自絮凝酿酒酵母变异株。

乙醇的生产方法

本发明的自絮凝酿酒酵母能够将可发酵性糖转化成乙醇和二氧化碳，因而可用于生产乙醇。并且，酵母能够在发酵罐中以自絮凝的方式实现固定化，因而显著提高了发酵罐中的酵母细胞密度，相应提高了发酵罐的乙醇产率。

因此，本发明提供了一种乙醇的生产方法，所述方法包括：

(1)在接种有本发明所述的自絮凝酿酒酵母的糖液(即糖化液)中，进行发酵，得到发酵液；和

(2)从发酵液中分离出乙醇。

本发明对使用的淀粉质原料没有限制，可以是乙醇生产中常用的原料。在本发明的优选方式中，所述的淀粉质原料选自粮食类淀粉质原料，如玉米、小麦、早籼稻等，这些原料副产品附加值较高，综合经济效益较好，也可以选用非粮食类淀粉质原料，如各种薯类，特别是木薯和红薯。

通常地，所述的预处理包括：淀粉质原料液化、糖化，还包括液化或糖化后的固液分离。当淀粉质原料为非粉状时，还需要进行淀粉质原料的粉碎。

本发明对于淀粉质原料的粉碎、液化、糖化等工艺没有特别的限制，可以采用本领域常用的方法。在本发明的一种优选方式中，预处理步骤包括：

粉碎：根据生产工艺的要求，将淀粉质原料(如玉米)首先粉碎成一定细度(如1.0-1.2mm)的粉料。在本发明的优选方式中，视生产规模，淀粉质原料粉碎之前可以进行脱胚脱皮等处理。

液化：将淀粉质原料粉按照一定比例与水混合(比如1∶1.5-2.5(如1∶2))，然后加入适量的淀粉酶，进行液化处理。淀粉酶的加入量按照现有技术中常规粉浆液化所需用的量。在本发明的优选方式中，采用每克淀粉质原料15u淀粉酶量进行液化处理。在本发明的优选方式中，在液化后进行过滤，去除原料残渣，以利于后续驯化选育自絮凝酵母菌株。

糖化：在液化后过滤得到的液化液中加入适量糖化酶，采用常规的糖化技术进行糖化。在本发明的优选方式中，将液化液温度调节到62-65℃，并用浓H₂SO₄酸化到pH值4.2-4.5，然后按每克淀粉质原料粉(如玉米粉)150U加入糖化酶，保温糖化约8-10小时，DE值(葡萄糖值)达到80以上即可。

在采用本发明的自絮凝酿酒酵母进行发酵时，选择各种适合的发酵条件，通常发酵温度在32±3℃，优选32±2℃；发酵的pH值在4.0±0.5，优选4.2±0.2；通风量和糖液流加稀释率根据发酵条件进行调整。

在发酵终止后，需要将酵母和乙醇从混合液中分离出来。酵母分离，可以采用自沉降，乙醇一般采用蒸馏步骤来实现分离，可采用常规的蒸馏方法来进行。通常，采用的乙醇分离和纯化设备为蒸馏设备，包括粗馏塔、精馏塔、及各类换热器等。

乙醇的生产设备

本发明对乙醇的生产设备没有特别的限制，当采用本发明的自絮凝酿酒酵母发酵生产乙醇时，可以采用各种合适的发酵设备。优选的，可采用多级串联形式的发酵设备。在本发明的一种优选方式中，采用了四级串联形式的发酵设备，如图2。

本发明的自絮凝酿酒酵母对于发酵设备的规模没有限制，根据所要求的乙醇生产规模而定，比如发酵设备的规模可以是100ml、500ml、1l、10L、50L、100L、1M³、100M³乃至更大。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的具有自絮凝能力的酿酒酵母变异株，其絮凝性能稳定，连续发酵装置运行三个月，其在发酵罐中沉降截留效果不降低，同时从发酵罐中采出酵母乳中自絮凝颗粒酵母的自沉降分离性能良好，工业化生产装置运行可靠。

(2)本发明的具有自絮凝能力的酿酒酵母变异株，其乙醇发酵性能满足工业化生产要求，基于培养基初始总糖的糖醇收率达到其理论收率0.511的90％以上。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1选育自絮凝酵母菌株的装置

用于选育本发明的自絮凝酵母菌株的装置如图2所示，所述装置为四级串联发酵罐系统，连续运行。

图2中，所述的装置具有：1、WM-2A型无油空压机；2、空气转子流量计(0～150mL/分钟)；3、针型阀；4、LP-3000pH指示及控制系统；5、温度指示及控制系统5；6、电磁阀，其规格为φ8mm；7、氨水贮槽，其规格为250mL；8、恒温水槽；9、恒温水进口；10、恒温水出口；11、培养基贮罐，其为2000mL三角瓶；12、HL-2S型培养基流加蠕动泵；13、总容积约1500mL(内径φ110×高度H150mm)，工作容积约1000mL(在底部向上110mm处有φ6mm，向下倾斜30°的溢流口)，带有保温夹套的自制玻璃罐体，其共有4个，为四级串联形式；14、90-1型磁力搅拌器，配φ8×30mm搅拌子；15、发酵液贮罐(2000mL三角瓶)；以及16、HL-2S型样品采出蠕动泵。

其它没有描述详细规格和尺寸的器件按照发酵行业相应规格的种子罐或发酵罐的通用设计配置。

实施例2酿酒酵母变异株的选育

1.出发菌株及种子培养液的制备

本实施例的出发菌株之一为乙醇发酵行业目前普遍使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)K2菌株，该菌株乙醇发酵性能优良(大连酿酒厂赠送)。

4℃冰箱保藏的斜面菌种在室温下活化4～6小时后，接种至250mL盛装100mL培养基的三角瓶中，在30℃、150rpm条件下摇瓶培养24小时后，可以向图2所示发酵系统接种。

摇瓶培养基组成为(g/L)：葡糖糖10，酵母膏5，蛋白胨3，用普通自来水配制，于121℃条件下灭菌15分钟。

本发明的出发菌株之二为SPSC01，其培养方法同K2。

自絮凝酿酒酵母选育的流程见图1。

2.发酵系统的接种及连续发酵条件下菌株驯化

发酵系统由四个单罐和带有保温夹套的小型玻璃罐体串联组成，每个单罐的总容积约1500mL(内径φ110×高度H150mm)，实际工作容积约1000mL(内径φ110×高度H110mm，在底部向上110mm处有内径φ6mm，向下倾斜30°的溢流口)，配置磁力搅拌(搅拌子尺寸为φ8×30mm，搅拌速度300～600rpm，以肉眼观察各发酵罐没有沉淀死区为准)，一级发酵罐安装温度和pH指示与控制系统，其余各发酵罐只安装温度和pH指示仪表。接种前一级发酵罐盛装750mL双酶法制备的玉米糖化液，糖浓度约12％(w/v)，添加1.5g/L的KH₂PO₄，并置于灭菌锅中于121℃灭菌30分钟，其它发酵罐空罐灭菌。

将约100mL摇瓶培养的K2酵母种子悬浮液，接种到一级发酵罐，在温度30-32℃、pH4.2±0.2(使用氨水调节)、转速300rpm、通气量0.1vvm(100mL/分钟)条件下培养，至残还原糖浓度降低到约0.2％(w/v)，开始以40mL/h的速率(相当于整个系统稀释率为0.01h^-1)流加总糖浓度为22-23％(w/v)的高浓度玉米粉糖化液，糖化液中添加0.15g/L的KH₂PO₄，同时将通风量降低到0.05vvm(50mL/分钟)。一级发酵罐液位达到溢流口后，发酵液开始溢流依次进入后续各级发酵罐，系统开始进入连续发酵状态。恒温水槽的恒温水从自末级发酵罐夹套进入，向前依次进入各发酵罐，从一级发酵罐夹套出口返回恒温槽，使发酵系统温度可以保持在32-34℃，一级发酵罐的pH控制在4.2±0.2，其余各发酵罐保持自然pH值。

3.玉米糖化液的制备

采用目前乙醇发酵行业通用的双酶法工艺制备糖化液，玉米粉液化和糖化均在一工作容积15L带有夹套的搅拌罐中进行。

玉米粉为干法脱胚玉米粉，购自黑龙江华润金玉集团公司，经测定淀粉含量约67％。

淀粉酶和糖化酶购自诺维信苏州宏达制酶有限公司，为Suhong AA淀粉酶(活力20000u/mL)和Suhong GA糖化酶(活力100,000u/mL)。

称取4kg玉米粉，与预先加热至约60℃的8L自来水以1∶2的配料比配制成粉浆，然后按每克玉米粉15U的浓度加入淀粉酶，搅拌罐夹套通入蒸汽，升温至95-98℃，维持90分钟进行粉浆液化，液化完成后进行过滤处理，去除原料残渣后，以利于后续驯化选育自絮凝酵母菌株。在搅拌罐中将滤液温度调节到62-65℃，并用浓H₂SO₄酸化到pH值4.2～4.5，然后按每克玉米粉150U的浓度加入糖化酶，保温糖化8～10小时，DE值达到80以上即可。

糖化结束后，得到总糖浓度为22～23％(w/v)的糖化液，添加适量KH₂PO₄后，可以用于酵母培养或乙醇发酵。发酵用高糖浓度培养基分装到2000mL三角瓶中，盛装量为1200mL，灭菌温度为110℃，时间15分钟，以避免糖损耗及抑制物产生。

由于糖液灭菌后被灭酶，发酵过程后糖化作用被破坏，为了发酵过程获得尽可能低的残糖浓度及较高的乙醇浓度，糖液流加前按照糖化时的加酶量，直接向糖化液中加入经0.2μm滤膜过滤除菌的糖化酶。

4.酵母样品的采集及自絮凝酵母菌株的分离

发酵系统进入发酵状态稳定运行一个月后，各发酵罐中乙醇浓度和残糖浓度如下：

(1)一级发酵罐：残还原糖8-10％(w/v)，乙醇8-9％(v/v)；

(2)二级发酵罐：残还原糖4-5％(w/v)，乙醇10-11％(v/v)；

(3)三级发酵罐：残还原糖1-2％(w/v)，乙醇11-12％(v/v)；

(4)四级发酵罐：残还原糖0.1-0.2％(w/v)，残总糖低于0.5％(w/v)乙醇高于13％(v/v)。

由于四级发酵罐内设置了沉降分离档板(外径φ90×高度H120mm的玻璃筒体，距离罐底20mm)，在高乙醇浓度和低营养组分胁迫下自絮凝形成颗粒的酵母，如果颗粒尺度达到毫米大小，就具有良好的沉降性能，可以被沉降档板有效截留在发酵罐内，而微米尺度的游离酵母细胞不能被截留，随发酵液流出发酵罐，离开系统，从而为从四级发酵罐中选育自絮凝酵母菌株创造了条件。

发酵系统稳定运行二个月后，开始从四级发酵罐中采集酵母悬浮液，用无菌水适当稀释后，置于培养皿中，肉眼观察，挑选自絮凝酵母颗粒，用无菌水冲洗2～3次后，将菌体悬浮液轻轻倒在分离纯化培养基表面，置于30℃恒温箱培养，直至形成直径约2～3mm的典型酵母菌落。分离纯化培养基组成与前述酵母种子摇瓶培养基相同，添加2％的琼脂。

结果，获得具有多个自絮凝特征的酵母菌株，其中自絮凝酵母flo的自絮凝特性最好。

实施例3菌株絮凝性能的初步检测

将实施例1选育得到的自絮凝酵母flo接种到摇瓶液体培养基中，按照前述酵母种子培养相同的操作进行培养，数小时后取出摇瓶，可以观察到毫米级大小自絮凝颗粒酵母，静置2-3分钟自絮凝颗粒酵母几乎全部沉降，培养液澄清透明，表明选育得到的酵母菌株絮凝性能优良，摇瓶培养24小时的自絮凝酵母悬浮液，可以向发酵罐接种，考察其乙醇发酵性能和絮凝稳定性。

实施例4乙醇发酵性能和絮凝稳定性检测

本实施例进一步试验上述获得的具有自絮凝性能的酵母菌株flo的发酵性能和絮凝稳定性。

建立单级连续发酵系统，其发酵罐结构与前述串联发酵系统末级发酵罐相同，即罐体内置沉降分离档板，进行自絮凝酵母乙醇发酵性能和絮凝稳定性考察。连续发酵的培养基为与前述串联发酵系统相同的糖化液，流加稀释率为0.05h^-1，发酵温度32±2℃，pH4.2±0.2，通风量0.05vvm(50mL/分钟)。发酵装置连续运行3个月，自絮凝酵母在发酵罐内自沉降分离性能良好，流出发酵罐发酵液澄清，肉眼观察没有颗粒酵母，显微镜下计数每毫升发酵液游离酵母细胞密度低于10⁶个，表明选育得到的菌株絮凝性能稳定。

由于选育得到自絮凝酵母菌株的发酵条件，包括发酵底物、发酵温度、pH等均与出发菌株乙醇发酵工业生产条件相同，其乙醇发酵性能评价指标主要考察发酵过程糖醇收率，按照公式(I)进行计算：

$X=\frac{Y_{P/S}}{{Y_{P/S}}^{*}}\×100\%---\left(I\right)$

式中：Y_P/S ^*是乙醇对葡萄糖糖的理论得率系数，取0.511。

Y_P/S是乙醇对培养基初始总糖的得率系数，计算方法如公式(II)：

$Y_{P/S}=\frac{P}{S_0}---\left(\mathrm{II}\right)$

式中：P为发酵液平均乙醇浓度(w/v)。

S₀是流加糖化液培养基总糖浓度(w/v)。

乙醇和糖的检测方法按照发酵行业通用的检测方法检测或实验室各种化学或仪器分析检测方法进行检测，这里没有严格限制。

结果显示，自絮凝酵母变异株的糖醇收率可以达到90％以上。

实施例5用自絮凝酵母SPSC01(CGMCC 0587)

重复实施例4的步骤，不同点仅在于用自絮凝酵母SPSC01(CGMCC 0587)替换自絮凝酵母flo(CGMCC 1602)。

结果，使用SPSC01连续发酵生产乙醇，发酵装置运行过程中，菌株絮凝特性不稳定，发酵装置运行一个月后，其自絮凝颗粒酵母大小由初期毫米尺度，逐渐下降到100微米左右，已经难以有效从发酵液中自沉降分离，而自絮凝酵母flo运行三个月后，仍然稳定。

此外，由于SPSC01自絮凝性能降低，导致在发酵罐中固定化效果下降，发酵罐中酵母细胞密度下降，在糖液流加速度不变的条件下，最后一级发酵罐流出发酵液中残糖上升至1-2％(w/v)，超过工业生产要求0.1-0.2％(w/v)的控制指标，糖醇转化率严重降低(工业生产计算糖醇转化率或收率时，以培养基中总糖为基准，不低扣发酵液中残糖)，只有降低糖液流加速率，延长平均发酵时间，才能保证残糖指标达到要求。可见其发酵结果远不如自絮凝酿酒酵母变异株flo。

菌种保藏

选育得到的自絮凝酵母变异株，根据出发菌株来源及自絮凝特征命名为自絮凝酿酒酵母变异株(Saccharomyces cerevisiae flo)，所述菌株于2006年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.1602。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种自絮凝酿酒酵母，其特征在于，所述的自絮凝酿酒酵母在培养液中培养时会形成毫米级颗粒，并且在转动或振荡停止后2-3分钟内所述颗粒会发生自沉降。

2.如权利要求1所述的自絮凝酿酒酵母，其特征在于，所述自絮凝酿酒酵母乙醇发酵时的糖醇收率大于88％。

3.如权利要求1所述的自絮凝酿酒酵母，其特征在于，所述的自絮凝酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.1602。

4.一种权利要求1所述的自絮凝酿酒酵母的用途，其特征在于，用于生产乙醇。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的乙醇为食用乙醇或燃料乙醇。

6.一种生产乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的自絮凝酿酒酵母接种于糖液中，进行发酵，得到发酵液；和

(2)从发酵液中分离出乙醇。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的糖液是将淀粉质原料进行预处理而得到的糖液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的预处理包括步骤：对淀粉质原料进行液化处理和进行糖化处理。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中还包括步骤：从发酵液中回收自絮凝酵母。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的发酵条件包括：发酵的温度为32±3℃，发酵的pH值在4.0±0.5。

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