CN100336900C - 一株产麦角甾醇的酵母工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产麦角甾醇的酵母工程菌及其应用。本发明提供的高产麦角甾醇的酵母工程菌为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117。本发明还提供了一种生产麦角甾醇的方法，是对产麦角甾醇的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117进行发酵，获得麦角甾醇。本发明发酵培养条件简单，成本低廉，麦角甾醇产量高，具有实用性强、操作简便等优点，易于普遍推广，具有广阔的实际应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及酵母工程菌及其应用，特别是涉及一株高产麦角甾醇的酵母工程菌及其应用。
背景技术
维生素D2是哺乳动物生长发育所必需的脂溶性维生素，其主要生理功能是调节体内钙磷代谢。在医药工业上，维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。麦角甾醇存在于酵母和一些植物中，是脂溶性维生素D2的前体，在紫外线照射下，转化为维生素D2。从酵母细胞中提取麦角甾醇，然后用紫外线照射是生产维生素D2的主要方法。此外，麦角甾醇还是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松”、“黄体酮”等的生产。
目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下选育方法获得：
一是对不同酵母菌种进行筛选，从中选出细胞麦角甾醇含量相对较高的菌种用于生产，其细胞麦角甾醇含量在0.8-2.0％左右，这些酵母菌种普遍存在的问题是细胞生物量较低。进一步提高酵母菌麦角甾醇含量是一个亟待解决的问题。
二是采用诱变育种技术进行选育，尽管有不少这方面的研究，但还没有有关通过诱变筛选从而提高酵母细胞麦角甾醇含量的报道。
三是采用细胞杂交选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行杂交，从杂交子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的杂交子代菌株。其细胞麦角甾醇含量可达2.5％左右。
四是采用原生质体融合选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行原生质体融合，从融合子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的融合子代菌株。其细胞麦角甾醇含量也可达2.5％左右。
上述四种育种技术均存在明显的不足之处。从不同酵母菌种中进行筛选，尽管能筛选到细胞麦角甾醇含量在0.8-2.4％左右的菌种，但普遍存在的一个问题就是在野生型酵母菌株中，细胞的生长和麦角甾醇的形成之间存在着一定的矛盾，即麦角甾醇含量较高的菌株，细胞的生物量较低；而生长良好的菌株麦角甾醇含量又比较低。因此降低了这些菌株的实际应用价值。采用诱变育种技术几乎不能得到细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都能提高的菌株。采用杂交和原生质体融合技术可以将不同菌株的优良特性结合起来，能获得细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的菌株。但在研究中发现，在这些酵母细胞中还含有2％左右的麦角甾醇前体物24(28)-脱氢麦角甾醇存在。若能将酵母细胞中的24(28)-脱氢麦角甾醇进一步转化为麦角甾醇，将大大提高酵母细胞的麦角甾醇含量。上述几种育种技术均不能解决这一难题。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产麦角甾醇的酵母工程菌。
本发明所提供的高产麦角甾醇工程菌是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88，该菌株已于2004年03月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1117。
高产麦角甾醇的酵母工程菌株(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88(CGMCC №1117)的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。最适生长温度30℃，pH为5.5。
本发明的第二个目的是提供一种高产麦角甾醇的酵母工程菌株的选育方法。
本发明所提供的高产麦角甾醇的酵母工程菌株的选育方法，包括如下步骤：
1)以啤酒酵母染色体DNA为模版，进行PCR扩增，得到编码甾醇C-24(28)还原酶的ERG4基因；
2)将PCR扩增得到的ERG4基因连接到载体上，构建含有ERG4基因的重组质粒；
3)用重组质粒转化酵母菌株，在选择培养基上筛选转化子。
步骤2)所述载体质粒是含有铜抗性筛选标记CUP1p-MT1的质粒pCM2。
步骤3)所述菌株按如下方法选育：
1)在YEPD培养基中筛选出细胞生物量较高的酵母菌株和细胞麦角甾醇含量较高的酵母菌株；
2)对生物量高的酵母菌种和细胞麦角甾醇含量高的酵母菌种进行生孢培养、单倍体分离、诱变，筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；
3)将生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与细胞麦角甾醇含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；
4)在选择培养基上筛选得到高生物量和细胞麦角甾醇含量高的杂交二倍体菌株。
本发明的第三个目的是提供一种生产麦角甾醇的方法。
本发明所提供的生产麦角甾醇的方法是对产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117进行发酵，获得麦角甾醇。
所述发酵过程具体包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养。所述液体种子培养为多级种子培养，一般以三级-六级种子培养为好；所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括20％-40％总还原糖量的有机物，0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，pH为4.5-7.0。发酵培养条件为：接种量为10-30％，在28～35℃条件下搅拌培养15-30小时。所用到的有机物种类很多，可以是玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液、糖蜜或他们的任意组合。
本发明的生产工艺流程示意图如图1所示。本发明通过杂交和基因工程育种技术，构建了高产麦角甾醇的啤酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88(CGMCC№1117)，该工程菌具有高细胞生物量的优点，而且能使催化24(28)-脱氢麦角甾醇转化为麦角甾醇的C-24(28)还原酶得到高效表达，使酵母中24(28)-脱氢麦角甾醇含量明显减少，细胞中麦角甾醇含量大幅提高，达到细胞干重的4％，比目前国内外所用酵母菌种的生产产量提高了1-3倍。发酵培养条件简单，成本低廉，所用培养基为普通的麦芽汁、淀粉糖化液或糖蜜，只需调节其总还原糖含量，并适当添加硫酸铵和磷酸。本发明实用性强，操作简便，易于普遍推广，一般发酵厂的设备和条件均可生产，生产投资较少，具有广阔的实际应用前景。
附图说明
图1为生产工艺流程示意图
图2为重组质粒pERG4-1(7)的构建示意图
图3为重组质粒pHX4的构建图谱
具体实施方式
实施例1、高产麦角甾醇酵母工程菌的选育
自然界中不存在细胞生物量和细胞麦角甾醇含量同时都高的酵母菌种，加之在酵母细胞中还含有2％左右的麦角甾醇前体物24(28)-脱氢麦角甾醇存在。若采用单一的育种技术，不能得到细胞生物量和细胞麦角甾醇含量同时都高、细胞内的24(28)-脱氢麦角甾醇明显减少、麦角甾醇显著增加的优良菌种。通过杂交和基因克隆育种的技术获得高产麦角甾醇的酵母工程菌。
一、筛选杂交二倍体菌株
1、分别测定250株不同种属的酵母菌株在YEPD液体培养基(4％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母粉、自来水配制，自然pH)中培养后的细胞生物量和细胞麦角固醇含量，从中筛选出5株细胞生物量较高的菌株(每升培养液的细胞干重在15克以上)和5株细胞麦角甾醇含量较高的菌株(每克干细胞的麦角甾醇含量在0.04克以上，但每升培养液的细胞干重在3克以下)。
2、通过生孢实验，从上述菌株中挑选出一株生物量较高、生孢好的二倍体YE244，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)(中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCC 2.1884)和一株细胞麦角甾醇含量较高、生孢好的二倍体YE39，啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCC2.602)，按常规方法对其进行生孢培养和单倍体分离。分别测定单倍体菌株的细胞生物量和细胞麦角甾醇含量，从中选出生物量较高的单倍体YE244-28(MATa)和细胞麦角甾醇含量较高的单倍体YE39-16(MATα)。
3、用硫酸二乙酯和亚硝基胍分别对所得两种单倍体进行诱变，获得营养缺陷突变株，从突变株中选出具有不同交配型、不同的营养缺陷标记、而且它们的细胞生物量及细胞麦角固醇含量略有提高的突变株YE244-28(MATa leu)和YE39-16(MATα trp)作为杂交亲株。
4、用群体杂交法将所得两种突变株YE244-28(MATa leu)和YE39-16(MATα trp)细胞进行杂交，在基本培养基(YNB培养基)上筛选杂交子。
5、由于杂交亲株YE244-28(MATa leu)为亮氨酸缺陷型，YE39-16(MATα trp)为色氨酸缺陷型，它们在基本培养基(YNB培养基)均不能生长，只有杂交子能生长，将在基本培养基(YNB培养基)能生长的杂交子选出，测定细胞生物量和细胞麦角甾醇含量，从中选育出细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都高的杂交二倍体菌株YEH-56。
二、构建高产麦角甾醇酵母工程菌
1、PCR扩增得到ERG4基因
以P1，5’-TA
AAGCTTGGTTGGTTTGTAGAGATGTCAAAG-3’和P2，5’-C
GGATCCTTCAAGCCCTTTTGTCGCGT-3’为引物(引物P1和P2的下划线处为HindIII和BamHI酶切位点)，以啤酒酵母染色体DNA为模板，进行PCR扩增。
1)配制PCR反应混合物：50μL反应体系中含有0.6μg模板DNA、0.5μmol/L引物对、200μmol/L dNTP、5μL反应缓冲液、2单位Pfu DNA polymerase，用去离子水补体积至50μL。
2)用国产PCR仪TC-96AE设置工作程序：94℃/5分钟，循环一次；94℃/40秒，72℃/3分钟，54℃/2分钟，循环29次；94℃/40秒，72℃/15分钟，54℃/2分钟，循环一次。
3)回收并纯化PCR产物：PCR反应产物弃去石蜡油后，加TE缓冲液至300μL，分别用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)和氯仿-异戊醇(1∶1)抽提一次，取上层水相，加入0.2倍体积的10M醋酸铵和2倍体积的无水乙醇，-20℃条件下沉淀2-3小时，12000rpm离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗已次，真空抽干后，溶于50μLTE缓冲液中，-20℃保存备用，编码甾醇C-24(28)还原酶的ERG4基因。
4)PCR产物经HindIII和BamHI酶切，与经HincII酶切的穿梭载体YEp352连接，在T4 DNA连接酶作用下16℃水浴中温育16-24h，得到重组质粒pERG4-1(7)，构建过程如图2所示。
5)PCR所得ERG4基因的鉴定：限制性内切酶酶切分析结果表明PCR所得ERG4基因与GenBank中已报道的该基因的酶切图谱相同；采用双脱氧终止法测定了ERG4基因的核苷酸序列，与已报道的ERG4基因的核苷酸序列的同源性达99％，表明通过PCR得到了ERG4基因。
2、构建重组质粒pHX4
以含有铜抗性筛选标记(CUP1p-MT1)的质粒pCM2和质粒pDBLeu为基础，构建含有ERG4基因的重组表达质粒pHX4，构建过程如图3所示。
1)配制反应物溶液
质粒提取溶剂I：25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)和50mM葡萄
糖，8磅，30分钟湿热灭菌，4℃保存。
质粒提取溶剂II：0.2M NaOH，1％(w/v)SDS(使用前现配)。
质粒提取溶剂III：3M乙酸钾，5M冰乙酸，pH5.2。
TE缓冲液：10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。
STE缓冲液：100mM NaCl溶于TE缓冲液中。
2)所用限制性内切酶：HindIII，SalI，BamHI。
3)用限制性内切酶HindIII和SalI酶切重组质粒pERG4-1(7)，回收2.5kb的ERG4DNA；用限制性内切酶SalI和BamHI酶切质粒pDBLeu，回收0.56kb的ADHI终止子DNA片段；用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切pCM2，使其线型化。上述DNA片断分别用用酚/氯仿抽提DNA并用乙醇沉淀，4℃条件下以12000rpm离心60min，沉淀以25μL pH8.0的TE缓冲液溶解。
3)建立连接反应：
2μL ERG4 DNA，2μLADHI终止子DNA片段，2μL线型化的pCM2 DNA。
1μL 10×buffer
1μL 10mmol/L ATP
0.5U的T4 DNA连接酶
将连接反应液混匀后，16℃水浴中温育16-24h，得到重组表达质粒pHX4。
3、用重组表达质粒pHX4转化所得杂交二倍体菌株，筛选酵母工程菌
1)配制转化溶液和筛选培养基：
LiAc-TE：0.1M LiAc溶于TE(pH8.0)
40％PEG：40％PEG4000溶于LiAc-TE(pH8.0)
小牛胸腺DNA：4mg小牛胸腺DNA溶于1mL TE(pH8.0)，4℃冰箱过夜后，反复抽吸混匀，并于100℃沸水中煮沸10分钟，迅速冰浴，冷却后分装，-20℃保存备用。
2)采用酵母菌完整细胞转化法进行转化，具体操作如下：
将受体菌YEH-56接种于YEPD斜面培养基进行活化；从活化后的斜面上取一环菌体接种于5mLYEPD液体培养基中，28℃振荡培养至对数期；取1mL菌液，5000rpm离心1分钟，用TE洗一次；将细胞悬浮在100μL LiAc-TE溶液中，加入10μg小牛胸腺DNA，0.01-1μg重组表达质粒pHX4 DNA，700μLPEG4000溶液，充分混匀后于28℃保温1小时。42℃热击处理25分钟；3000rpm离心2分钟，用无菌水洗一次，将细胞悬浮在500μL无菌水中；
3)在选择培养基上培养转化菌株，挑选转化子。
选择培养基：含有8mM/mLCuSO4的YEPD培养基。
取100μL转化菌液于15mL保温在45-50℃的选择培养基混合后倒平皿，28℃培养3-4天。
由于受体菌YEH-56对Cu离子敏感，在含有4mM/mLCuSO4的YEPD培养基上就不生长，因此在含有8mM/mLCuSO4的YEPD培养基更不能生长。在含有8mM/mLCuSO4的YEPD培养基上生长的菌均是转化子，将在含有8mM/mLCuSO4的YEPD培养基上生长的转化子接种于YEPD斜面，28℃培养1-2天后，放4℃冰箱保存备用。
4)按常规方法测定不同转化子的甾醇C-24(28)还原酶酶活力、细胞生物量和麦角甾醇含量，获得24(28)-脱氢麦角甾醇明显减少、而麦角甾醇含量高达4％的高产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117。
4、产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88CGMCC №1117遗传稳定性分析
将产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88CGMCC №1117在YEPD固体培养基传代培养30次，取适量细胞经适当稀释后，涂布YEPD平皿，培养后，随机分别挑取100个单菌落于无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时。取饥饿后的菌液分别接种于四种YEPD培养基、YNB培养基、YNB+HIS培养基和YNB+MET培养基中，培养结果证明挑取的100个单菌落在这四种培养基都生长，没有出现分离现象。随机挑10个在YEPD培养基中培养的单菌落，培养后测定细胞生物量和细胞麦角甾醇含量，结果表明细胞生物量和细胞麦角甾醇含量无明显变化。上述结果证明产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88CGMCC №1117是一株遗传稳定的、细胞生物量高、细胞麦角甾醇含量高的优良酵母工程菌。
实施例2、高麦角甾醇含量酵母产品的生产
高麦角甾醇含量酵母的生产工艺包括：
斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵→过滤→获得麦角甾醇含量高的酵母细胞
发酵培养基为：选择20％-40％总还原糖浓度的玉米淀粉糖化液培养基，添加0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5-7.0。
发酵培养条件为：接种量为10％-30％，在28-35℃条件下搅拌培养15-30小时。
下面对各生产工艺分述如下：
(1)斜面菌种：将产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88CGMCC №1117接种于含有总还原糖含量为4％的麦芽汁固体斜面上，在28-35℃培养48小时，放入4℃冰箱保存；
(2)液体菌种：将保存的产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117活化后，接一环细胞于装有150毫升总还原糖含量为8％的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于28-35℃振荡培养14-20小时即为液体菌种；
(3)一级液体种子培养：将液体菌种按15％的接种量接入装有250毫升总还原糖含量为15％的玉米淀粉糖化液培养基的三角瓶中，于28-35℃振荡培养14-20小时即为一级液体种子培养物；
(4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按15％的接种量接入装有30升总还原糖含量为20％的玉米淀粉糖化液培养基的种子培养罐，在28-35℃搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物；
(5)三级液体种子培养：将二级种子培养液按15％的接种量接入装有300升总还原糖含量为20％的玉米淀粉糖化液培养基的种子培养罐，在28-35℃搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物；
(6)发酵罐发酵：将三级种子培养液按30％的接种量接入装有2000升总还原糖含量为30％的玉米淀粉糖化液培养基的发酵罐，在30～35℃条件下发酵15～30小时；
(7)收集酵母细胞：用板框过滤收集高麦角甾醇含量的酵母。
在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-25克，每克干细胞的麦角甾醇含量为40-46毫克。
实施例3、高麦角甾醇含量酵母产品的生产
发酵培养基为：总还原糖浓度为30％-40％的大米淀粉糖化液，添加0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5-7.0。
发酵培养条件：接种量为10％-30％，在28-35℃条件下搅拌培养15-30小时。
生产工艺中增加四级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养相同，其他工艺条件与实施例2相同。
在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-24克，每克干细胞的麦角甾醇含量为40-43毫克。
实施例4、高麦角甾醇含量酵母产品的生产
发酵培养基为：总还原糖浓度为30％-40％的甘薯淀粉糖化液，添加0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5-7.0。
发酵培养条件：接种量为10％-30％，在28-35℃条件下搅拌培养15-30小时。
其他工艺条件与实施例3相同。
在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-22克，每克干细胞的麦角甾醇含量为40-42毫克。
实施例5、高麦角甾醇含量酵母产品的生产
发酵培养基为：总还原糖浓度为30％-40％的蔗糖糖蜜，添加0.1-0.5％硫酸铵，1.0％的玉米水解液，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5-6.0。
发酵培养条件：接种量为10-30％，在28-35℃条件下搅拌培养15-30小时。
生产工艺中增加五级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养相同，其他工艺条件与实施例4相同。
在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-27克，每克干细胞的麦角甾醇含量为40-48毫克。
实施例6、高麦角甾醇含量酵母产品的生产
发酵培养基为：总还原糖浓度为30％-40％的甜菜糖蜜，添加0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5-6.0。
发酵培养条件：接种量为10-30％，在28-35℃条件下搅拌培养15-30小时。
其他工艺条件与实施例5相同。
在该培养条件下，每升培养液的细胞干重为20-26克，每克干细胞的麦角甾醇含量为40-45毫克。
Claims (7)
1、产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117。
2、一种生产麦角甾醇的方法，是对产麦角甾醇啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ZGFH-88 CGMCC №1117进行发酵，获得麦角甾醇。
3、根据权利要求2所述的生产麦角甾醇的方法，其特征在于：所述发酵过程具体包括斜面菌种培养、液体菌种培养、至少二级液体种子培养、发酵罐发酵培养。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述液体种子培养为三级一六级种子培养。
5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述斜面菌种培养、液体菌种培养、液体种子培养和发酵罐发酵培养的培养基包括20％-40％总还原糖量的有机物，0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，pH为4.5-7.0。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有机物选自玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液、糖蜜或他们的任意组合。
7、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵罐培养的接种量为10％-30％。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999016886A1 (de) * | 1997-09-30 | 1999-04-08 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von ergosterol und dessen zwischenprodukten mittels rekombinanter hefen |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 微生物麦菜甾醇酵母菌株选育 邓玉清等，微生物学杂志，第21卷第3期 2001 * |
| 生物合成麦角甾醇酵母菌析选育 薛冬桦等，长春工业大学学报，第24卷第3期 2003 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1683517A (zh) | 2005-10-19 |
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