CN110591934B - 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110591934B
CN110591934B CN201910888612.1A CN201910888612A CN110591934B CN 110591934 B CN110591934 B CN 110591934B CN 201910888612 A CN201910888612 A CN 201910888612A CN 110591934 B CN110591934 B CN 110591934B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ergosterol
yeast
saccharomyces cerevisiae
erg20
content
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910888612.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110591934A (zh
Inventor
李珍珠
蒋春美
陈贤情
王筱
宋宇婧
郭丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd filed Critical Jiaxing Synbiolab Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910888612.1A priority Critical patent/CN110591934B/zh
Publication of CN110591934A publication Critical patent/CN110591934A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110591934B publication Critical patent/CN110591934B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产麦角甾醇酵母工程菌。本发明提供的高产麦角甾醇的酵母工程菌为酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM‑trp‑190902‑WB757，具有细胞麦角甾醇含量高的优点，细胞中麦角甾醇含量相对于现有技术和天然野生菌种均大幅提高，达到细胞湿重的1.75wt％，比目前国内外所用酵母菌种的生产产量提高了1‑4倍。本发明提供的工程菌还具有高细胞生物量的优点，可以通过相对简单的方法条件发酵培养，易于实现并控制，成本低。本发明还提供了一种优化的含量测定的方法。本发明麦角甾醇产量高，操作简便，实用性强，可普遍推广，一般发酵厂的设备和条件均可生产，生产投资较少，具有广阔的实际应用价值及前景。

Description

一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及酵母工程菌及其构建方法，具体地是涉及一株高产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下四种选育方法获得：自然筛选、诱变育种、细胞杂交、原生质体融合。上述四种育种技术均存在明显的不足之处。从不同酵母菌种中进行筛选，尽管能筛选到细胞麦角甾醇含量在0.8wt％-2.4wt％(细胞干重)左右的菌种，但在野生型酵母菌株中普遍存在一个问题，细胞的生长和麦角甾醇的形成之间存在着一定的矛盾，即麦角甾醇含量较高的菌株，细胞的生物量较低；而生长良好的菌株麦角甾醇含量又很低。因此降低了这些菌株的实际应用价值。采用诱变育种很难得到细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都能提高的菌株。采用杂交和原生质体融合技术可以将不同菌株的优良特性结合起来，能获得细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的菌株。但研究发现，在这些酵母细胞中还含有2wt％左右的麦角甾醇前提物24(28)-脱氢麦角甾醇存在。若24(28)-脱氢麦角甾醇不能进一步转化为麦角甾醇，则酵母细胞内的麦角甾醇含量将不能被有效提高。上述育种技术均不能解决这一难题。
因此，本领域迫切需要开发一种有效提升细胞内麦角甾醇的含量的菌种、制备和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供有效提升细胞内麦角甾醇的含量的菌种、制备和检测方法。
本发明的第一方面，提供了一种麦角甾醇工程菌，其特征在于，所述工程菌为酵母，并且所述酵母的基因组中整合有外源的ERG20表达盒，所述ERG20表达盒用于表达ERG20蛋白。
在另一优选例中，所述的ERG20蛋白选自酿酒酵母S288C。
在另一优选例中，所述的ERG20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:6所示。
在另一优选例中，所述的工程菌选自下组：酿酒酵母、甲醇酵母、毕赤酵母、或其组合。
在另一优选例中，所述的工程菌选自酿酒酵母W303-1B。
在另一优选例中，所述的工程菌为酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757，其保藏号为CCTCC M 2019688。
在另一优选例中，在所述工程菌的基因组中整合一个或多个拷贝的所述ERG20表达盒。
在另一优选例中，所述的工程菌的基因组中，还整合有选自下组的额外表达盒：ERG6表达盒、ERG4表达盒、或其组合。
在另一优选例中，所述的外源的ERG20表达盒具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中，
Z1为启动子或含启动子的5'-UTR元件；
Z2为无或任选的增强子；
Z3为编码ERG20蛋白的核苷酸序列；和
Z4为无或3'－UTR元件。
在另一优选例中，所述的ERG20带有或不带有标签序列。
在另一优选例中，所述工程菌菌株能高效产出麦角甾醇，每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量为野生菌种的8倍以上。
在另一优选例中，所述酿酒酵母菌株能高效产出麦角甾醇，每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量为超过10mg。
本发明的第二方面，提供了一种高产麦角甾醇的酵母工程菌株的构建方法,包括如下步骤：
1)以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ERG20基因；
2)将PCR扩增得到的ERG20基因连接到载体质粒上，构建含有ERG20基因的重组质粒；
3)用重组质粒转化酵母菌株，在选择培养基上筛选转化子。
在另一优选例中，所述载体质粒是含筛选标签的质粒。
在另一优选例中，所述载体质粒是含筛选标签trp。
在另一优选例中，所述载体质粒是含筛选标签的质粒PGK1-CYC1。
在另一优选例中，所述载体质粒是含筛选标签trp的质粒PGK1-CYC1。
在另一优选例中，所述的转化方法均采用醋酸锂转染法。
本发明的第三方面，提供了一种生产麦角甾醇的方法，对产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757进行发酵，获得麦角甾醇。
在另一优选例中，所述发酵过程步骤为：
(i)斜面菌种培养,
(ii)液体菌种培养,和
(iii)摇瓶发酵培养。
在另一优选例中，所述发酵过程的培养基由下组物质组成：氮源、碳源、核苷酸和氨基酸。
在另一优选例中，所述发酵过程的培养基还含有脱落粉末。
在另一优选例中，所述氮源为酵母氮源。
在另一优选例中，所述碳源为葡萄糖。
在另一优选例中，所述核苷酸为腺嘌呤、尿嘧啶、和/或其组合。
在另一优选例中，所述氨基酸为组氨酸、亮氨酸、和/或其组合。
在另一优选例中，所述培养基的终pH为6.2-6.8，优选地为6.5。
在另一优选例中，所述摇瓶发酵的接种量为1wt％-60wt％；较佳地，接种量为5wt％-50wt％；最佳地，接种量为10-30wt％。
在另一优选例中，所述摇瓶发酵的温度条件为25-45℃；较佳地，温度条件为28-40℃；最佳地，温度条件为30-35℃。
本发明的第四方面，提供了一种对产麦角甾醇酿酒酵母SaccharomycesCerevisiae CM-trp-190902-WB757进行细胞内麦角甾醇含量测定的方法，包括如下步骤：
1)收集到的酵母菌体回流皂化；
2)使用有机溶剂萃取1次或多次(如，重复1、2、或3次)，合并有机溶剂层，无机溶剂(如水)洗至中性；
3)蒸干有机溶剂层，复溶(如用无水乙醇)已提取物质；
4)使用紫外分光光度计分别测量230nm和281.5nm处的吸光度；
5)计算细胞内麦角甾醇含量。
在另一优选例中，所述回流皂化在甲醇-氢氧化钾溶液中进行。
在另一优选例中，所述回流皂化温度为85-98℃，优选地温度为90℃。
在另一优选例中，所述有机溶剂选自：石油醚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和/或三乙醇胺，等。
在另一优选例中，所述有机溶剂为石油醚。
在另一优选例中，所述复溶过程优选使用超声辅助溶解。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为生产工艺流程图。
图2为重组质粒PGK1-ERG20-CYC1的构建示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现一株产麦角甾醇酵母工程菌。目前，在酿酒酵母中进行甾醇类物质含量提升的研究大多集中在对酿酒酵母内的甲羟戊酸(MEV)途径进行改造上，本发明通过过表达酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757中ERG20基因，直接促进FPP的合成，为麦角甾醇的合成提供更多前体，并且可有效促进酵母细胞中的24(28)-脱氢麦角甾醇进一步转化为麦角甾醇，大大提高酵母细胞的麦角甾醇含量。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
麦角甾醇
麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种28碳甾族化合物，存在酵母和某些植物中，为无色晶体，是真菌细胞膜的重要组分,它在确保膜结构的完整性，与膜结合酶的活性，膜的流动性，细胞活力及物质运输等方面起着重要作用，其也是脂溶性维生素D2的前体，具有明显的抑菌、抗肿瘤功效。在紫外线照射下，麦角甾醇分子中4个碳环的一个发生断裂，转化成维生素D2，是生产维生素D的原料。从酵母细胞中提取麦角甾醇，然后用紫外线照射是生产维生素D2的主要方法。维生素D2是哺乳动物生长发育所必需的脂溶性维生素，其主要生理功能是调节体内钙磷代谢。在医药工业上，维生素D2是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。维生素D2也可以作为饲料添加剂添加在饲料中，增加畜禽的产蛋率和孵化率。此外，麦角甾醇还是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松”、“激素黄体酮”等甾醇类药物的生产。
ERG基因家族
本文所述“ERG20”编码的蛋白产物“法尼基焦磷酸合酶”，其氨基酸序列为SEQ IDNO.:6所示，参与催化麦角甾醇前体物质——法尼基焦磷酸(FPP)的合成。
ERG4编码的蛋白产物为C-24固醇还原酶，是麦角甾醇生物合成过程中最后一个酶,催化最终合成麦角甾醇。ERG4包含单一开阅框，编码473氨基酸的蛋白质，位于第Ⅶ染色体上。
ERG6编码的产物为C-24甲基化酶,存在于植物和真菌中,催化酵母甾醇C-24位甲基化形成28碳的甾醇结构,C-24位甲基化对形成正常细胞膜是必需的。ERG6具单一开阅框,编码383氨基酸的蛋白质,ERG6定位在第ⅩⅢ染色体上。
本发明经过大量的创造性实验发现在工程化酵母菌株中提高ERG家族中多个基因如ERG4\ERG6\ERG20。出乎意料的，发明人发现过表达ERG20基因直接促进FPP的合成，为麦角甾醇的合成提供更多前体，并且可有效促进酵母细胞中的24(28)-脱氢麦角甾醇进一步转化为麦角甾醇，大大提高酵母细胞的麦角甾醇含量。上述育种技术均不能从源头上提升细胞内麦角甾醇的含量。而过表达ERG4后细胞内麦角甾醇的含量几乎不见升高，单独过表达ERG6后细胞内麦角甾醇的含量的升高并不如过表达ERG20基因更高。因此，本发明发现在酵母菌中过表达ERG20基因的方案是效果最明显的。
而且，意外地也发现，按照本发明所述的技术方案在酿酒酵母中过表达ERG20后，改造后的工程化酿酒酵母不仅表现出了麦角甾醇含量大幅提高，极高的细胞生物量，而且发酵培养条件易于实现并控制，成本低。本方案提供的改造后的工程化酿酒酵母具有广阔的实际应用价值及前景。
菌种保藏
本发明的菌种酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757(与保藏名称相同)已于2019年9月6日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市洪山区八一路，保藏号：CCTCC M 2019688。
本发明的技术方案，具有如下主要优点：
1.本发明提供了一种了细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的酿酒酵母工程菌Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757。
2.本发明提供的酿酒酵母工程菌具有细胞麦角甾醇含量高的优点，细胞中麦角甾醇含量相对于现有技术和天然野生菌种均大幅提高，达到细胞湿重的1.75wt％，比目前国内外所用酵母菌种的生产产量提高了1-4倍。
3.本发明提供的酿酒酵母工程菌具有高细胞生物量的优点，可以通过相对简单的方法条件发酵培养，易于实现并控制，成本低。
4.本发明麦角甾醇产量高，操作简便，实用性强，可普遍推广，一般发酵厂的设备和条件均可生产，生产投资较少，具有广阔的实际应用价值及前景。
5.本发明提供了一种细胞内麦角甾醇含量测定的方法，与传统的液相法测量相比，使用分光光度计进行测量，操作简单，可重复性强，成本低，节省样品检测时间。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1高产麦角甾醇酵母工程菌的构建
1.1 PCR扩增得到ERG20基因
如下引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
Figure BDA0002208051420000071
1.1.1配置PCR反应混合物：(Fusion酶体系100μL)含有：20μL 5×GC Buffer，8μLdNTPS，5μL MgCl2，8μL引物对，3μL DMSO，1μL模板DNA，1μL FUSION酶，用去离子水补体积至100μL。
1.1.2用PCR仪Proflex设置工作程序：98℃预热3分钟，循环一次；98℃高温解旋15秒，58℃退火30秒，72℃延伸70秒，循环34次；72℃再延伸10分钟，12℃保存，循环一次。
1.1.3回收并纯化PCR产物：
1.1.3.1胶回收，根据凝胶回收试剂盒说明书操作：
A.在胶块中加入600μL PN溶液，50℃水浴，并不断翻转，充分溶解。
B.柱平衡，在吸附柱CA2(插到收集管中)内加入500μL平衡液BL，12000rpm，1min，倒掉废液。
C.将溶解的凝胶液加入到吸附柱内，室温放置2min，12000rpm，离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
D.在吸附柱内加入600μL漂洗液PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，倒掉废液。
E.重复步骤D
H.将吸附柱放入收集管中，12000rpm，离心2min，并在室温下放置数分钟晾干。
I.将吸附柱放入新的1.5ml离心管，在吸附柱中央加入30ul以上的水，12000rpm，离心2min收集DNA溶液。
1.1.3.2PCR产物纯化，根据TIANGEN普通DNA产物纯化试剂盒：
A.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm(～13400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)
B.估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。
C.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm(～13400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
D.向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
E.重复操作步骤D
F.将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm(～13400g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。
G.将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL水，室温放置2min。12000rpm(～13400g)离心2min收集DNA溶液。
1.1.4PCR所得ERG20基因片段的鉴定：(经上海生工生物工程技术服务有限公司)测序可知ERG20基因片段的核苷酸序列，与酵母基因组数据库(https://www.yeastgenome.org/)中已报道的ERG20基因的核苷酸序列同源性达99％，表明已通过PCR得到了ERG20基因片段(1059bp)。
获得ERG20片段的核苷酸序列如下：
Figure BDA0002208051420000081
Figure BDA0002208051420000091
(SEQ ID No.:1)
1.2构建重组质粒PGK1-ERG20-CYC1
以含有trp筛选标记的质粒PGK1-CYC1(购自GENEWIZ)为基础，构建含有ERG20基因的重组表达质粒PGK1-ERG20-CYC1，构建过程如图2所示。
1.2.1提质粒备用：
根据TIANGEN质粒小提试剂盒：
A.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm(～13400g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)
B.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm(～13400g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
C.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
D.向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
E.向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm(～13400g)离心10min。
F.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm(～13400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
G.向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
H.重复操作步骤G。
I.将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm(～13400g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
J.将吸附柱CP3至于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL无菌水，室温放置2min，12000rpm(～13400g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
1.2.2 PCR扩增获得载体骨架：
以下引物，以载体PGK1-CYC1(购自GENEWIZ公司)为模板，进行PCR扩增获得载体骨架。PCR反应混合物：(Fusion酶体系100μL)含有：20μL 5×GC Buffer，8μL dNTPS，5μLMgCl2，8μL引物对，3μL DMSO，1μL模板DNA，1μL FUSION，用去离子水补体积至100μL。用PCR仪Proflex设置工作程序：98℃预热3分钟，循环一次；98℃高温解旋15秒，58℃退火30秒，72℃延伸3分40秒，循环34次；72℃再延伸10分钟，12℃保存，循环一次。经琼脂糖凝胶电泳，比对分子量大小，回收5885bp的DNA片段。
Figure BDA0002208051420000101
1.2.3建立连接反应
在本实施例中，使用的插入片段为从酵母基因组上扩增获得的ERG20片段(SEQ IDNo.:1)。
根据Vazyme One Step Cloning Kit：
于冰上配置以下反应体系：最适克隆载体使用量为(0.02×克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol)，最适插入片段使用量为(0.04×插入片段碱基对数)ng(0.06pmol)，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，用去离子水补体积至20μL。使用移液器轻轻吸打混匀(勿震荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。将50μL大肠杆菌DH5α感受态在冰上加入连接反应体系中，冰浴30min，42℃热击45s；冰敷1-2min；加入200μL LB培养基；37℃，220r，45min；涂相应Amp抗性平板。测序验证正确后，提质粒备用，即得重组表达质粒PGK1-ERG20-CYC1。
1.3用重组表达质粒PGK1-ERG20-CYC1转化酿酒酵母W303-1B，筛选酵母工程菌
1.3.1配置转化溶液和筛选培养基：
每管转化体系：50％PEG 62.4μL，1M LiAc 8.22μL，DMSO 9.58μL，10mg/ml ssDNA5μL。
1.3.2酿酒酵母感受态的制备及采用醋酸锂转染法进行转化，具体操作如下：
将酿酒酵母W303-1B(购自ATCC)接种于CM斜面培养基进行活化；从活化后的斜面上取一环菌体接种于5ml CM液体培养基中，30℃震荡培养至对数期；使用分光光度计测量菌液OD600的值，使转接菌OD600＝0.1，转接5ml，直至菌液生长至0.6-0.8，一般为4-5h。3600rpm，10min，去上清，用500μL 0.1M LiAc洗涤菌体，7000rpm，2min，去尽上清；加入100μL 0.1M LiAc重悬细胞；每管转化体系包括：80μL转化溶液+20μL 0.1M LiAc重悬的细胞+质粒(>500ng)，充分混匀每管转化体系，30℃静置35min，42℃热击15min，离心去上清，100μL无菌水重悬细胞；涂相应的色氨酸缺陷型平板(CM-TRP)，挑选转化子，接种于CM-TRP斜面，30℃培养1-2天后，放4℃冰箱保存备用。
结果：在CM-TRP斜面上生长的单菌落，将其活化并培养发酵，经麦焦甾醇含量测量，其中一株高产麦角甾醇的酿酒酵母被命名为Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757。
实施例2高产麦角甾醇酵母工程菌的发酵
高产麦角甾醇酵母的生产工艺包括：
斜面菌种→液体菌种→摇瓶培养→离心收集沉淀→获得高产麦角甾醇的酵母细胞
发酵培养基为：(CM-TRP液体1L)6.7g YNB，20g葡萄糖，0.84g脱落粉末，0.05g腺嘌呤，0.1g组氨酸，0.1g亮氨酸，0.05g尿嘧啶，pH调至5.6；等量的固体培养基需再加入15g琼脂，pH调至6.5。
(1)斜面菌种：将产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757接种于色氨酸缺陷型培养基CM-TRP固体斜面上，在30-35℃培养48h，放入4℃冰箱保存；
(2)液体菌种：将保存的产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757活化后，接一环细胞于装有100ml色氨酸缺陷型CM-TRP液体培养基的三角瓶中，于30-35℃振荡培养15-24h即为液体菌种；
(3)摇瓶培养：将液体菌种按30wt％的接种量接入装有1000ml色氨酸缺陷型CM-TRP液体培养基的三角瓶中，于30-35℃振荡培养220rpm，15-24h即为摇瓶培养；
(4)离心收集菌体：离心收集高产麦角甾醇的酵母湿菌体。
实施例3酿酒酵母细胞内麦角甾醇含量的测定方法
本实施例采用的测定方法包括以下步骤：
(1)定量称取2g收集到的酵母湿菌体(实施例2制备)，用25ml甲醇复溶已称取的酵母湿菌体，85-92℃，回流5min；
(2)加入5ml 50％氢氧化钾溶液，92℃皂化回流30min；
(3)待溶液冷却至室温，加入30ml石油醚萃取2-3次，合并石油醚层，且水洗至中性；
(4)通过滤纸及无水硫酸钠5-10g除去水分；
(5)在通风橱内，沸水浴蒸干已水洗至中性且已除去水分的石油醚层；
(6)加入10ml无水乙醇复溶提取到的干物质，超声混匀溶解；
(7)使用紫外分光光度计分别测量230nm和281.5nm处的吸光度；使用公式计算：每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量(mg/g湿菌体)＝(OD281.5/290﹣OD230/518)×稀释倍数×5
结果：测定结果表明，在实施例2的培养条件下，每升培养液的细胞湿重为19.2g，每克湿细胞的麦角甾醇含量为10.3mg/g。
实施例4多种转基因酿酒酵母细胞内麦角甾醇含量的对比
与实施例1相同的方法制备3种ERG基因亚型的过表达菌株，并利用上述方法对每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量水平进行评估和比较。
菌种编码 菌种描述 每g湿菌体百分比含量(wt％) 倍数
W303 野生菌 0.12
CM-trp-190902-WB757 过表达ERG20基因 1.03 8.58
W637 过表达ERG6基因 0.38 3.2
W573 过表达ERG4基因 0.11 0.92
结果：如上表所示，与野生菌W303相比，本发明提供的过表达ERG20基因菌株Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757，每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量提高了不止8倍，而其他ERG基因亚型提高倍数有限，其中过表达ERG4基因每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量与野生菌水平相当，而过表达ERG6基因每克酵母湿菌体中麦角甾醇的含量提高3倍，即提高甾醇C-24甲基转移酶活性增强了细胞合成麦焦甾醇的能力，但其贡献还是少于过表达ERG20基因。
讨论
一是自然筛选。从现有各类不同微生物之间筛选麦角甾醇含量较高的高产菌株用于生产是优良菌株选育的基本方法，但普遍存在的问题是不同种、属间麦角甾醇含量差异较大，其大部分干重麦角甾醇含量在0.8wt％-2wt％左右，细胞生物量较低。进一步提高酵母菌麦角甾醇含量是一个亟待解决的问题。
二是采用诱变育种技术进行选育，诱变选育是利用能提高诱发基因突变频率的诱变剂对菌株进行处理，诱变剂的种类一般可分为3类：物理诱变、化学诱变和生物诱变。由于常规的物理、化学等方法诱变随机性太大，麦角甾醇高产菌的筛选又无快速简便的初筛手段，且麦角甾醇含量测定非常费时，整个过程耗费时间长，所以诱变育种的菌种选育工作量非常大，结果具有不确定性。
三是采用细胞杂交选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行杂交，从杂交子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的杂交子代菌株。其细胞干重麦角甾醇含量可达2.5wt％左右。
四是采用原生质体融合选育技术，将细胞麦角甾醇含量较高的酵母细胞与细胞生物量高的酵母细胞进行原生质体融合，从融合子代中筛选细胞生物量和细胞麦角甾醇含量都较高的融合子代菌株。其细胞干重麦角甾醇含量也可达2.5wt％左右。
近年来，利用合成生物学技术在微生物中提升甾醇类物质含量及异源生产其它天然化合物的研究备受关注，这种方法克服了植物提取及化学全合成的环境不友好、产率低和过程复杂等不足。本发明通过对前体物质积累这一因素进行优化以提升目标物质产量。目前，在酿酒酵母中进行甾醇类物质含量提升的研究大多集中在对酿酒酵母内的甲羟戊酸(MEV)途径进行改造上，如过表达MEV途径中截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGR)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20)和转录因子(upc2-1)以提高法尼基焦磷酸(FPP)的积累；敲除或者抑制角鲨烯合酶基因(ERG9)的表达以抑制竞争路径鲨烯的合成等。本发明拟通过过表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1B中ERG20基因直接促进FPP的合成，为麦角甾醇的合成提供更多前体，并且可有效促进酵母细胞中的24(28)-脱氢麦角甾醇进一步转化为麦角甾醇，大大提高酵母细胞的麦角甾醇含量。上述四种育种技术均不能从源头上提升细胞内麦角甾醇的含量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
<120> 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法
<130> P2019-1175
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120
gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240
aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300
gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420
aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480
accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540
gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600
tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660
gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720
gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780
gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840
aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900
attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960
gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
gaagcaaata gaccttctag agggccgcat c 31
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 3
ctttttctga agccatgtcg acgttttttt gtttttatat ttgttgtaaa aagtaga 57
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
aaatataaaa acaaaaaaac gtcgacatgg cttcagaaaa agaaattagg agagagaga 59
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
ccctctagaa ggtctatttg cttctcttgt aaactttgtt caagaacg 48
<210> 6
<211> 352
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe
1 5 10 15
Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met
20 25 30
Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr
35 40 45
Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala
50 55 60
Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe
85 90 95
Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp
115 120 125
Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe
130 135 140
Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val
145 150 155 160
Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro
165 170 175
Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe
180 185 190
Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala
195 200 205
Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln
210 215 220
Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp
225 230 235 240
Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly
245 250 255
Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu
260 265 270
Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly
275 280 285
Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys
305 310 315 320
Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys
325 330 335
Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys
340 345 350

Claims (16)

1.一种麦角甾醇工程菌，其特征在于，所述工程菌为酵母，并且所述酵母的基因组中整合有外源的ERG20表达盒，所述ERG20表达盒用于表达ERG20蛋白；其中，所述的ERG20蛋白选自酿酒酵母S288C；并且，所述的工程菌为酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757，其保藏号为CCTCC M 2019688。
2.如权利要求1所述的工程菌，所述的ERG20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.:6所示。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌的基因组中，还整合有选自下组的额外表达盒：ERG6表达盒、ERG4表达盒、或其组合。
4.如权利要求1所述的工程菌，所述的外源的ERG20表达盒具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
式中，
Z1为启动子或含启动子的5'-UTR元件；
Z2为无或任选的增强子；
Z3为编码ERG20蛋白的核苷酸序列；和
Z4为无或3'－UTR元件。
5.一种生产麦角甾醇的方法，对产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757进行发酵，获得麦角甾醇；
其中，所述产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757的保藏号为CCTCC M 2019688。
6.如权利要求5所述的方法，所述发酵过程的培养基由下组物质组成：氮源、碳源、核苷酸和氨基酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵过程的培养基还含有脱落粉末。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氮源为酵母氮源。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核苷酸为腺嘌呤、尿嘧啶、和/或其组合。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为组氨酸、亮氨酸、和/或其组合。
12.一种对产麦角甾醇酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae CM-trp-190902-WB757进行细胞内麦角甾醇含量测定的方法，其中，所述产麦角甾醇酿酒酵母SaccharomycesCerevisiae CM-trp-190902-WB757的保藏号为CCTCC M 2019688，所述的方法包括如下步骤：
1)收集到的酵母菌体回流皂化；
2)使用有机溶剂萃取1次或多次，合并有机溶剂层，无机溶剂洗至中性；
3)蒸干有机溶剂层，复溶已提取物质；
4)使用紫外分光光度计分别测量230nm和281.5nm处的吸光度；
5)计算细胞内麦角甾醇含量。
13.如权利要求12所述的方法，所述回流皂化在甲醇-氢氧化钾溶液中进行。
14.如权利要求12所述的方法，所述复溶过程使用超声辅助溶解。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为石油醚。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述的多次包括重复1、2或3次。
CN201910888612.1A 2019-09-19 2019-09-19 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法 Active CN110591934B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910888612.1A CN110591934B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910888612.1A CN110591934B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110591934A CN110591934A (zh) 2019-12-20
CN110591934B true CN110591934B (zh) 2021-09-14

Family

ID=68861630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910888612.1A Active CN110591934B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110591934B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980825B (zh) * 2020-07-27 2023-12-12 安琪酵母股份有限公司 富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法
CN114606149B (zh) * 2022-04-01 2023-11-28 湖南新合新生物医药有限公司 一种生产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株及其应用
CN115112792A (zh) * 2022-06-15 2022-09-27 山东新华制药股份有限公司 一种从酿酒酵母中提取麦角甾醇并用hplc检测的方法
CN117511947B (zh) * 2024-01-08 2024-03-29 艾斯拓康医药科技(北京)有限公司 一种优化的5`utr序列及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1683517A (zh) * 2004-04-16 2005-10-19 中国科学院微生物研究所 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其选育方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1683517A (zh) * 2004-04-16 2005-10-19 中国科学院微生物研究所 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其选育方法与应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Breeding of high ergosterol-producing yeast strains;X He等;《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》;20000731;第25卷;第40页右栏 *
Farnesyl diphosphate synthase activity affects ergosterol level and proliferation of yeast Saccharomyces cerevisae;Francis Karst等;《Cell Biol Int.》;20041231;第28卷(第3期);第2.1节、表2和图2 *
Francis Karst等.Farnesyl diphosphate synthase activity affects ergosterol level and proliferation of yeast Saccharomyces cerevisae.《Cell Biol Int.》.2004,第28卷(第3期),第2.1节、表2和图2. *
J05091;Anderson,M.S.等;《NCBI》;19930427;CDS部分 *
甾醇C-24甲基转移酶和甾醇C-8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成中的调控作用;张振颖 等;《微生物学报》;20090804;第49卷(第8期);第1064页左栏第1段和右栏第2段和图1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110591934A (zh) 2019-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110591934B (zh) 一株产麦角甾醇酵母工程菌及其构建方法
CN109055327B (zh) 醛酮还原酶突变体及其应用
CN110607247B (zh) 一种提高酿酒酵母合成角鲨烯能力的方法
CN101983240B (zh) 凝集性酵母及其制备方法
WO2021223770A1 (zh) 一种产类胡萝卜素的酵母突变菌株及其突变位点应用
CN111073902A (zh) 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用
CN105802943B (zh) 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株
CN102268432B (zh) 乳清酸磷酸核糖转移酶启动子及应用和构建体与载体
CN106995817B (zh) 一种编码叶绿体碳酸酐酶基因在构建耐高浓度co2且快速生长的工业工程微藻中的应用
CN110804561B (zh) 一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
CN113881584A (zh) 一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用
CN109136119B (zh) 微生物及其用途
CN1930292B (zh) 硼酸抗性给予蛋白质及其基因
CN102533574A (zh) 一种低产尿素黄酒酵母工程菌及其构建方法
CN113846111B (zh) 紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法及其应用
CN102643844B (zh) 粳稻木糖异构酶基因的功能及其应用
Brouwers et al. Maltotriose consumption by hybrid Saccharomyces pastorianus is heterotic and results from regulatory cross-talk between parental sub-genomes
CN114525215A (zh) 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用
CN106119137B (zh) 一种改善丝状真菌蛋白分泌能力的方法
CN108486176B (zh) 一种产乳酸乙酯的酿酒酵母及其构建方法与应用
CN114231429B (zh) 一种表达产甘油假丝酵母rna解旋酶的重组菌及其应用
CN109161565B (zh) 一种利用乳清生产乙醇的方法
CN114717124B (zh) 一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用
CN113151029B (zh) 一株产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用
CN114634883B (zh) 产2′-岩藻糖基乳糖的重组工程菌及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Chen Xianqing

Inventor after: Wang Xiao

Inventor after: Song Yujing

Inventor before: Li Zhenzhu

Inventor before: Jiang Chunmei

Inventor before: Chen Xianqing

Inventor before: Wang Xiao

Inventor before: Song Yujing

Inventor before: Guo Dan

CB03 Change of inventor or designer information