CN117511947B - 一种优化的5`utr序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够提高蛋白编码区翻译效率的5`UTR序列及其应用。本发明的5`UTR序列能够提高蛋白编码区的翻译效率，进而降低mRNA药物剂量、降低递送系统带来的潜在副作用，用于mRNA药物的制备。

Description

一种优化的5`UTR序列及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和核酸药物领域，具体地，涉及一种优化的5'UTR序列及其应用。
背景技术
基于mRNA的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用于个体化治疗，因此是现代医学发展的新方向。与哺乳动物细胞系中表达的重组蛋白相比，mRNA的生产更快、更灵活。在过去十年中，mRNA修饰和递送系统领域的技术发展迅速推进了mRNA疫苗的基础和临床研究。然而，mRNA疗法面临的技术问题也很明显，比如mRNA在体内表达效率低等问题，mRNA疫苗的保护效力并不乐观，这些也是临床应用亟需优化的关键问题。
基于稳定性和蛋白翻译效率而优化开发的mRNA，可以最大限度地提高mRNA生产及避免递送中的损失问题。5'UTR在mRNA翻译过程中至关重要，包括核糖体募集，扫描和起始密码子选择。5'UTR序列长度一般在100-200核苷酸。Carsten Rudolph等在一项研究中比较了5个不同的UTR序列对于mRNA稳定性和翻译效率的影响，结果显示人细胞CYBA UTR序列可以在不影响RNA半衰期的情况下增强翻译效率。有研究发现双拷贝beta globin 3'UTR序列在树突细胞中支持蛋白的高效表达。在过往研究中使用到的UTR序列包括：来自CMV（Cytomegalovirus，人类巨噬细胞病毒)的增强子序列，人α-珠蛋白（alpha-globin）5'UTR、人生长激素UTR序列、非洲爪蟾蜍β-珠蛋白（beta-globin）UTR等。UTR对于mRNA翻译效率的影响不仅与细胞类型有关，而且高度依赖二级结构。相对较短的设计UTR能更好的完成预设目的，设计出最短的UTR序列是非常有必要的，既可以免受细胞类型差异的影响，又能够在插入修饰核苷酸时使其对翻译效率的影响降至最弱。
发明内容
本发明的目的在于提供能够提高蛋白编码区翻译效率的5`-UTR序列及其在制备mRNA药物中的应用。
本发明的第一方面,提供了一种5`UTR元件，所述5`UTR元件用于构建mRNA转录模板，提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率，所述5`-UTR元件的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
在另一优选例中，所述5`UTR元件的核苷酸序列还包括：
与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性≥70%(较佳地≥80%，更佳地≥90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%)，且具有提高mRNA中编码区翻译效率活性的核苷酸序列；或
如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mRNA中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述5`UTR元件的长度为40-120nt，较佳地50-100nt。
本发明的第二方面,提供了一种mRNA转录模板构建体，所述构建体具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (I)
式中，
Z1、Z7为无或酶切位点；
Z2为无或启动子元件或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
Z3为本发明第一方面所述的5`UTR元件；
Z4为可替换的编码区；
Z5为3`UTR元件；
Z6为无或polyA尾部元件。
在另一优选例中，所述Z1、Z7为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。
在另一优选例中，所述mRNA转录模板构建体包括酶切位点、启动子元件、5`UTR元件、可替换的编码区和3`UTR。
在另一优选例中，所述Z2为启动子元件，所述启动子选自下组：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、CAG启动子、UBC启动子、CMV启动子、U6启动子、EF1a启动子、PGK1启动子、TRE启动子、Ac5启动子、UAS启动子、SV40启动子、ADH1启动子、CaMV35S启动子、Ubi启动子、Lac启动子、Ptac启动子、pL启动子，或其组合。
在另一优选例中，所述Z3具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述Z4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。
在另一优选例中，所述Z4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子（包括沉默和活跃转座子）、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。
在另一优选例中，所述Z5与Z3来源于同一转录本。
在另一优选例中，所述Z5与Z3来源于不同转录本。
在另一优选例中，所述Z5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
本发明的第三方面,提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的mRNA转录模板构建体。
在另一优选例中，所述载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合；优选地，所述载体为质粒。
本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
本发明的第五方面,提供了一种产生用于制备mRNA药物的优化mRNA的方法，所述方法包括步骤：
(i) 在适合的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含有mRNA转录模板构建体的载体的培养物；
(ii) 从所述培养物中分离和/或回收(i)中所述载体，并酶切线性化为mRNA转录模板；和
(iii) 将(ii)中所述mRNA转录模板进行转录，从而获得所述优化mRNA。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)：对步骤(iii)获得的优化mRNA进行纯化和/或修饰。
本发明的第六方面,提供了一种优化mRNA，所述优化mRNA是用如本发明第五方面所述的方法制备得到的，并且所述优化mRNA具有式II所示结构：
M1-M2-M3-M4-M5-M6 (II)
式中，
M1为5`端帽子元件；
M2为无或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
M3为本发明第一方面所述的5`UTR元件；
M4为可替换的编码区；
M5为3`UTR元件；
M6为polyA尾部元件。
在另一优选例中，所述M3具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述M4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。
在另一优选例中，所述M4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子（包括沉默和活跃转座子）、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。
在另一优选例中，所述M5与M3来源于同一转录本。
在另一优选例中，所述M5与M3来源于不同转录本。
在另一优选例中，所述M5具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述M6的长度较佳地为100 nt-150 nt，更佳地为110 nt-130nt，最佳地为120 nt。
在另一优选例中，所述M6的序列如SEQ ID NO: 6所示。
本发明的第七方面,提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(c1) 如本发明第二方面所述的mRNA转录模板构建体，或如本发明第六方面所述的优化mRNA作为活性成分；和
(c2) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂、雾化吸入剂、涂抹式药剂。
在另一优选例中，所述药物组合物通过注射施用，即静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内或腹膜内注射。
在另一优选例中，所述药物组合物通过吸入施用，例如鼻内施用。
在另一优选例中，所述药物组合物经皮施用，例如经皮涂抹施用或电极导入给药。
在另一优选例中，所述药物组合物是将所述mRNA用阳离子脂进行包裹所形成的脂质纳米颗粒，即LNP-mRNA。
在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99%的如本发明第六方面所述的优化mRNA和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗包括（但不限于）传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的药物。
本发明的第八方面,提供了一种mRNA药物组合物的制备方法，所述方法包括：将如本发明第六方面所述的优化mRNA与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mRNA药物组合物。
在另一优选例中，所述mRNA药物组合物为mRNA疫苗组合物。
本发明的第九方面,提供了一种如本发明第一方面所述的5`UTR元件的用途，用于构建mRNA转录模板，从而提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率。
本发明的第十方面,提供了一种如本发明第六方面所述的优化mRNA或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了5`UTR-GFP细胞筛选试验流程。
图2显示了5`UTR-GFP细胞筛选试验结果。
图3显示了5`UTR-EPO小鼠体内筛选的流程示意图。
图4显示了5`UTR-EPO小鼠体内筛选结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过体内外筛选和序列优化，获得了一条5`UTR序列。实验证明，本发明所述的5`UTR序列（如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列）能够提高蛋白编码区的翻译效率，进而降低mRNA药物剂量、降低递送系统带来的潜在副作用。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
5`UTR元件
在本发明的一个方面，提供了一种5`UTR元件，所述5`UTR元件用于构建mRNA转录模板，提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率，所述5`UTR元件的核苷酸序列选自下组：
(a) 如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
(b) 与SEQ ID NO: 1所示序列的同源性≥70%(较佳地≥80%，更佳地≥90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%)，且具有提高mRNA中编码区翻译效率活性的核苷酸序列；或
(c) 如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mRNA中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。
mRNA转录模板构建体
如本文所用，术语“mRNA转录模板”、“mRNA转录本”可以互换使用。
在本发明的另一个方面，提供了一种mRNA转录模板构建体，所述构建体具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (I)
式中，
Z1、Z7为无或酶切位点；
Z2为无或启动子元件或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
Z3为本发明第一方面所述的5`UTR元件；
Z4为可替换的编码区；
Z5为3`UTR元件；
Z6为无或polyA尾部元件。
如本文所用，术语“5`-UTR”和“5`UTR”可以互换使用；“3`-UTR”和“3`UTR”可以互换使用。
如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为RNAs，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5`端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。所述的外源基因(也称为目的基因)没有特别的限制，代表性例子包括(但不限于)：筛选标记基因、抗性基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因等。
在本发明的一个实施方式中，所述mRNA转录模板构建体具有式I结构，式中，Z1、Z7为酶切位点，Z2为启动子元件或内部核糖体进入位点序列（IRES），Z3为如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的5`UTR序列，Z4为可替换的编码区（例如实施例中筛选所用的GFP或hEPO编码序列），Z5为3`UTR元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
优化mRNA
mRNA的序列优化是帮助mRNA提高翻译效率的方法之一。mRNA的5`-UTR和3`-UTR的序列优化能够增加mRNA的半衰期和翻译活性。Cap结构采用不同的类似物能够增加mRNA的稳定性，利用酶使mRNA的5`端加上Cap结构能够比不同形式的Cap类似物有更好的效能。mRNA的polyA尾的稳定mRNA效果也是非常重要的，有研究去除了mRNA的polyA使得mRNA极度不稳定，同时也降低了mRNA的多聚核糖体数目、延伸速度和翻译轮数。因而polyA对mRNA的稳定和有效翻译至关重要。另外，核苷酸的修饰和密码子的同义替换也能影响mRNA的稳定性和翻译活性。同时序列的优化可能影响mRNA的二级结构和翻译后修饰。此外，增加mRNA的GC含量也能增加mRNA稳定性。综上所述，5`-UTR、3`-UTR、5`Cap、polyA尾、密码子优化和GC含量是影响mRNA稳定性的所有可调节位点。
目前FDA已经批准上市的辉瑞(Pfizer/BioNTech)的BNT162b2疫苗的5`-UTR采用了人α珠蛋白的5`-UTR并优化了序列和5`端序列，调整了5`-UTR的二级结构，而莫得那(Moderna)的mRNA-1273疫苗的5`-UTR则采用了其通过计算机设计并优化的序列。对于3`-UTR，莫得那的mRNA-1273疫苗采用了人α珠蛋白(HBA1)的3`-UTR中的110 nt碱基，而辉瑞的BNT162b2疫苗采用了基于自然基因进行SELEX的方法，挑选出了人12S rRNA(mtRNR1)和AES/TLE5基因的3`-UTR。辉瑞疫苗在此基础上选用了AES 3`-UTR的136 nt序列并进行了两个C→Ψ的改变，随后接续139nt的mtRNR1序列。目前真正有效的UTR设计方法还是借鉴自然基因并基于经验进行优化。
本发明利用筛选和序列优化的5`-UTR元件，构建了如本发明第二方面所述的mRNA转录模板，所述mRNA转录模板经转录后获得了优化的mRNA。
本发明的优化mRNA具有式II所示结构：
M1-M2-M3-M4-M5-M6 (II)
式中，
M1为5`端帽子元件；
M2为无或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
M3为本发明第一方面所述的5`UTR元件；
M4为可替换的编码区；
M5为3`UTR元件；
M5为polyA尾部元件。
在本发明的一个实施方式中，所述优化mRNA具有式II结构，式中，M1为5`端帽子元件，M2为无或内部核糖体进入位点序列（IRES），M3为如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的5`UTR序列，M4为可替换的编码区（例如实施例中筛选所用的GFP编码序列或hEPO编码序列），M5为3`UTR元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示；M6为polyA尾部元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
本发明的药物组合物及其应用
在本发明的一个方面，还提供了一种药物组合物。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物为mRNA疫苗组合物。
mRNA疫苗分为自我扩增RNA(self-amplifying RNA, saRNA)和非扩增RNA(non-replicating mRNA)。经典的非扩增RNA疫苗，包括cap帽子、5`-UTR、开放阅读框(openreading frame, ORF)（即编码区）、3`-UTR和多聚A尾(polyA tail)。ORF区负责编码抗原表达，但以上5个区域共同决定mRNA的稳定性、表达活性和免疫原性。
而saRNA的结构来源于α病毒基因组。saRNA疫苗利用α病毒的基因组能够自我复制的特性使进入体细胞的DNA或RNA先自我扩增，再转录出抗原编码mRNA。saRNA疫苗目前有以DNA质粒为基础的saRNA和病毒样颗粒递送的saRNA两种。基于saRNA，Beissert等人还发展了转基因扩增RNA(trans-amplifying RNA，taRNA)，其将编码抗原的基因放在α病毒基因组中，增加了疫苗的安全性。与自我扩增RNA相比，非扩增RNA具有更小，表达抗原更特异不引起非特异性免疫的特点。
mRNA疫苗的一大挑战是减少外源mRNA本身的免疫原性。自然情况下，外源mRNA进入细胞后，能够被维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)识别，激活固有免疫反应，进而被降解。体外转录(in vitro transcription, IVT)mRNA能够激活免疫细胞和Toll样受体(Toll-like receptor)介导的炎症反应。mRNA的U富集(U-rich)序列是激活Toll样受体的关键因素。通过核苷酸化学修饰、添加polyA尾和优化mRNA GC含量等均能够减少mRNA的免疫原性。
化学修饰的核苷酸包括5-甲基胞苷(5-methylcytidine, m5C)、5-甲基尿苷(5-methyluridine, m5U)、N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)、2-硫尿核苷(2-thiouridine, s2U)、5-氧甲基尿苷(5-methoxyuridine, 5moU)、假尿苷(pseudouridine, ψ)和N1-甲基假尿苷(N1-methylpseudouridine, m1ψ)。
此外，添加polyA尾也能减少U含量进而减小mRNA的免疫原性。CureVac和AcuitaTherapeutics公司尝试通过脂质纳米颗粒运输红细胞生成素编码mRNA进入猪体内，该mRNA具有较高GC含量，结果能够引起红细胞生成素相关反应而没有免疫原性。然而，过高的GC含量会抑制mRNA的翻译活性，这也是疫苗研发过程中需要注意的。
mRNA的纯化方式在减少mRNA自身的免疫原性中也相当重要。目前常用的纯化方法包括高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)、阴离子交换色谱法、亲和色谱法和粒子大小分离法。纯化的目的主要是去除截短的转录本。一个好的例子是Pardi等人设计的通过HPLC纯化m1ψ修饰的编码抗HIV-1抗体的mRNA通过脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNP)帮助小鼠避免了HIV-1的感染。
mRNA目前的递送方法有很多，科学家们建立了脂质体运输、聚合物运输、肽链运输、病毒样复制子颗粒运输和阳离子纳米乳化剂运输等方法，此外裸mRNA也能够被直接注射进细胞。在研的mRNA疫苗最常用的递送方法是脂质纳米颗粒运输。该方法具有毒性小、递送效率高等优势。
本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的mRNA转录模板构建体或优化mRNA。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤等疾病或病症。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
药物组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地为可注射液体。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温®)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
药物组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明的药物组合物可以制备成例如注射剂、冻干剂、雾化吸入剂、涂抹式药剂等剂型。本发明的药物组合物可通过任何合适的方式递送（施用），包括口服、肠胃外和局部方法。本发明的药物组合物也可以通过注射施用，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内、鞘内、或腹膜内注射。此外，本发明所述的药物组合物可通过吸入施用，例如鼻内施用。另外，本发明的药物组合物可经皮施用。通过局部途径的透皮施用方法可配制成涂药棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶、乳膏剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、油漆、散剂和气雾剂。此外，本发明的药物组合物可通过电极/电场/电势差主动给药到皮内、皮下、肌肉、肿瘤、组织器官、中枢神经等部位。
本发明的药物组合物可与另一种活性剂共同施用。共同施用包括在彼此的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内施用本发明的化合物和活性剂。共同施用还包括同时、大致同时（例如，在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内）或以任何顺序依次施用本发明的化合物和活性剂。在一些实施方式中，共同施用可通过共同配制完成，即制备包含本发明的活性成分（本发明所述的mRNA转录模板构建体或优化mRNA）和活性剂两者的单一药物组合物。在其他实施方式中，本发明的活性成分和活性剂可分开配制。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于预防和/或治疗疾病，所述疾病包括（但不限于）传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤。
其中，所述传染性疾病包括（但不限于）以下疾病或由以下病原体引起的疾病：肉毒杆菌毒素、水蛭素、巨细胞病毒(CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、呼吸道合胞病毒(RSV)、基孔肯雅病(Chikungunya)、狂犬病(Rabies)、艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌(streptococci)、疟疾(malaria)、跳跃病病毒(Louping illvirus)、岗地弓形虫(Toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、轮状病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、手足口病病毒、风疹病毒、麻疹病毒、博纳病病毒、逆转录病毒（T淋巴细胞病毒）、尼帕病毒、多瘤病毒、绿脓杆菌、SARS-CoV-2、SARS、MERS、HBV、EBV、猴痘、天花、念珠菌、李斯特菌、甲病毒属下所有病毒（奥拉病毒(Aura virus)，巴马森林病毒(Barmah Forest virus)，比巴鲁病毒(Bebaru virus)，Caaingua virus，卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)，东部马脑炎病毒(Easternequine encephalitis virus)，艾拉特病毒(Eilat virus)，沼泽地病毒(Evergladesvirus)，摩根堡病毒(Fort Morgan virus)，盖塔病毒(Getah virus)，高地J病毒(Highlands J virus)，马达里亚加病毒(Madariaga virus)，玛雅罗病毒(Mayaro virus)，米德尔堡病毒(Middelburg virus)，莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)，穆坎布病毒(Mucambo virus)，恩杜穆病毒(Ndumu virus)，阿尼昂尼昂病毒(O`nyong`nyong virus)，皮克孙纳病毒(Pixuna virus)，里约热内卢病毒(Rio Negro virus)，罗斯河病毒(Ross River virus)，鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)，西门里克森林病毒(Semliki Forest virus)，辛德毕斯病毒(Sindbis virus)，南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)，图纳特病毒(Tonate virus)，特洛卡拉病毒(Trocaravirus)，乌纳病毒(Una virus)，委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus)，西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)，瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)、丙肝、甲肝。
所述罕见遗传病包括（但不限于）选自下组的罕见遗传病：肌萎缩侧索硬化，Angelman氏症候群（天使综合征），精氨酸酶缺乏症，生物素酶缺乏症，先天性肌无力综合征，法布雷病，戈谢病，血友病，亨廷顿舞蹈病，Leber遗传性视神经病变，多发性硬化，帕金森病，肺囊性纤维化，镰刀型细胞贫血病，脊髓性肌萎缩症。
在另一优选例中，所述药物组合物还可以用于制备：所有过继细胞治疗药物、所有基因编辑(TALEN,CRISPR,ZFN)和基因治疗mRNA替代方案（替代物料/原料中的蛋白制品、DNA、病毒颗粒、或其他核酸蛋白制品）、畜牧动物疫苗、宠物疫苗等。
本发明的主要创新点在于：
传统5`UTR 筛选来自高表达基因，但是，基因在细胞内表达受多个维度调控，例如转录水平高的基因受转录因子控制，因此基因高表达是一个笼统的概念，只用它来筛选5 `UTR序列并不可靠。在核酸药物领域，成药性mRNA不经过天然转录调控，因此启动翻译的能力是我们衡量mRNA药物用5`UTR序列的唯一标准。本发明通过对分子生物学的深刻认知，重新发掘UTR资源库，经人工智能AI筛选优化后，获得了一条5`UTR序列，不同于此前行业内的通用筛选标准（仅仅依赖于基因表达量），亦非计算机产生的随机序列。本发明提供的5`-UTR序列能够大大提高蛋白编码区的翻译效率，进而降低mRNA药物剂量、降低递送系统带来的潜在副作用。
体外和体内实验证明，本发明的5`UTR与BioNTech新冠疫苗B162b2 5`UTR序列相比，能够显著提高mRNA的翻译效率，从而提高mRNA的表达量。小鼠体内实验显示，带有本发明的5`UTR的mRNA的表达量是带有B162b2 5`UTR的mRNA的2.5倍以上。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 候选5`UTR序列设计和mRNA制备
1.1 候选5`UTR序列设计
从AURA网站（http://aura.science.unitn.it/about/）收集所有人源5`UTR 序列，通过AI优化，理性设计1条候选5`UTR序列（命名为m5590）交由CRO公司合成。阳性对照（PC）使用BioNTech新冠疫苗B162b2 5`UTR序列。候选5`UTR和阳性对照序列如下所示：
>m5590 (SEQ ID NO: 1)
ACAATTCTTGGAAGAGGAGAACTGGACGTTGTGAACAGAGTTAGCTGGTAATCCTCTTAAAAGATCCAAAAA
>PC (SEQ ID NO: 2)
AGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
1.2 mRNA制备
按照以下步骤制备含有候选5`UTR序列的mRNA：
(1) 通过无缝克隆将候选5`UTR序列连接至GFP编码区（氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示）或hEPO编码区（蛋白序列如SEQ ID NO: 7所示，核苷酸序列如 SEQ ID NO: 8所示）的5`端，将3`UTR序列连接至其3`端，构建GFP openreading frame和hEPO open reading frame。；使用的3`UTR序列如SEQ ID NO: 5所示。
(2) 通过转化大肠杆菌感受态，测序并挑选含有正确序列的细菌菌株。
(3) 将细菌扩大培养，抽提其中目的基因，并将目的基因由双链闭合环状切割成双链线性，从而获得mRNA转录模板。
(4) 在缓冲体系和核苷酸原料存在下，通过T7 RNA 转录酶催化，得到完整的具有表达能力的mRNA粗产物，所述mRNA带有序列如SEQ ID NO: 6所示的poly(A)尾。
(5) 通过LiCl沉淀和75%乙醇洗涤，得到纯化的含有候选5`UTR序列的GFP mRNA和hEPOmRNA。
(6) 将制备的GFP mRNA冻存于-80℃，后续用于Lipo3000转染细胞。hEPO mRNA使用含可电离阳离子脂质SM-102的LNP递送系统进行包封、制备、纯化后，得到LNP-mRNA，粒径质控为90-150nm，PDI质控<0.2，包封率>80%。
按照上述同样的步骤制备含有阳性对照序列的GFP mRNA和hEPO mRNA。
实施例2 5`UTR-GFP细胞筛选试验
图1显示了5`UTR-GFP细胞筛选试验流程，具体步骤如下：
(1) 细胞铺板：CHO细胞消化后，细胞密度调整到2.5×105/well铺于12孔板，放入细胞培养箱中过夜。
(2) 细胞换液：将前一天铺好的12孔板细胞上清吸出，PBS洗一次，在每个培养孔中加入400 µL Opti-MEM™ I减血清培养基。
(3) 设置对照组和样品组：将BNT162b2 5`UTR设为阳性对照组，只加100 µLOpti-MEM™ I 减血清培养基作为阴性对照组，候选5`UTR作为样品组。
(4) 细胞转染：按照Lipofectamine 3000说明书进行转染，每个孔转染2 µg的mRNA。将转染试剂和mRNA混合物共100 µL均匀加入到12孔细胞板中，十字晃匀，放于培养箱中培养。每个样品设置两个复孔，分别培养6h和24h。转染6h后，上述细胞加入500 µL含20%FBS的完全培养基继续培养。
(5) 流式样品准备：将细胞上清吸出，用PBS洗一次，加入200 µL胰蛋白酶消化2min，消化完全后加入500 µL完全培养基，吹吸均匀转移到事先标好的1.5 mL离心管中。
(6) 流式检测：使用CytoFLEX S流式细胞仪对GFP荧光强度进行检测，统计10000个GFP阳性细胞的荧光信号强度，取平均值进行比较。将阳性对照表达量均一化为1。
结果：
流式细胞筛选结果表明，含有5`UTR候选序列m5590的GFP mRNA在转染后6小时的翻译水平为3.049×106，相比含有BioNTech阳性对照5`UTR的GFP mRNA（2.177×106
）提高40%；在转染后24小时，含有BioNTech阳性对照5`UTR的GFP mRNA翻译水平为2.749×106，而含有候选序列m5590的GFP mRNA翻译能力进一步达到至4.851×106，相对于阳性对照提高76.5%（图2）。
实施例3 5`UTR-EPO小鼠体内筛选试验
为了阐明候选5`UTR体内启动翻译能力，按照图3进一步设计了hEPO ELISA测试实验，在先天免疫健全的小鼠体内测定其表达量，实验步骤如下所示：
(1) LNP-mRNA的包封：把hEPO mRNA溶于水相buffer中混匀后做为水相； SM-102、DSPC、CHOL和DMG-PEG2000分别溶于无水乙醇中，按一定比例充分混匀后做为有机相。将水相和有机相分别转移至注射器中，使用PNI微流控纳米制备仪，设置参数，制备得到LNP-mRNA。LNP-mRNA经浓缩、纯化、除菌过滤，且质控合格后注射小鼠。
(2) 小鼠尾静脉注射：固定小鼠，选取尾静脉进行注射。LNP-mRNA注射量为5 µg。将BNT162b2 5`UTR mRNA设为阳性对照组，只注射溶剂和LNP空包的为阴性对照组。每个LNP-mRNA样品注射三只小鼠。
(3) 小鼠颌下采血：注射6h和24h后，进行颌下采血。将血液收集于灭菌离心管内，编号备用。
(4) 血清提取：取得全血后，室温静置1小时，2000 g离心10分钟，上清即为血清。分装后于-80℃保存。
(5) 利用人Erythropoietin ELISA试剂盒检测表达量：参照说明书进行操作，每个血清样本设置两个复孔。利用酶标仪检测OD值，根据标准曲线和稀释比例计算表达量。检测结果如图4所示。小鼠体内hEPO表达结果表明：在注射mRNA后6h检测hEPO，m5590 hEPO表达量（200343.3mIU/ml）是阳性对照表达量（68047.9mIU/ml）的2.94倍；在注射mRNA后24h检测hEPO，m5590的hEPO表达量（120237.2mIU/ml）是阳性对照表达量（44736.2mIU/ml）的2.68倍。
以上结果说明，通过对5`UTR序列进行筛选、改造和优化，本发明提供了一种显著优于现有5`UTR的药用级mRNA高表达序列。
讨论：
5`UTR对于线性mRNA早期阶段的翻译能力具有至关重要影响，尤其在疫苗应用方向，早期24小时以内的抗原翻译水平直接影响mRNA疫苗的免疫原性。基于此认知，本发明在筛选时使用的GFP并不是常用的eGFP，而是带有泛素化修饰标签的CDB·GFP，CDB·GFP具有快速降解的特点，其半衰期约为4-6小时，这使得GFP蛋白不会在细胞内过多累计，荧光强度反应的都是4-6小时以内的mRNA翻译水平。综上，本发明通过以上方法筛选的5`UTR相比使用其他标记基因（例如eGFP）筛选的结果更加真实，从而获得能够切实提高蛋白编码区的翻译效率的5`UTR。
在mRNA制药领域，动物组织表达水平相比细胞更有说服力，因此设计了小鼠表达人源EPO蛋白实验，m5590的hEPO ELISA结果说明，对5`UTR进行序列改造和优化，能够获得启动翻译能力增强的 5`UTR，在将序列同源性维持在70%，更佳地80%，最佳地90%以上进行的序列改造和优化，能够符合mRNA成药标准，得到性能更优的5`UTR元件，这一优化对表达量的提升至关重要。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1. 一种5`UTR元件，所述5`UTR元件用于构建mRNA转录模板，提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率，其特征在于，所述5`UTR元件的核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示。
2. 一种mRNA转录模板构建体，其特征在于，所述构建体具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (I)
式中，
Z1、Z7为无或酶切位点；
Z2为无或启动子元件或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
Z3为权利要求1所述的5`UTR元件；
Z4为可替换的编码区；
Z5为3`UTR元件；
Z6为无或polyA尾部元件。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的mRNA转录模板构建体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体。
5.一种产生用于制备mRNA药物的优化mRNA的方法，所述方法包括步骤：
(i) 在适合的条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而获得含有mRNA转录模板构建体的载体的培养物；
(ii) 从所述培养物中分离和/或回收(i)中所述载体，并酶切线性化为mRNA转录模板；和
(iii) 将(ii)中所述mRNA转录模板进行转录，从而获得所述优化mRNA。
6. 一种优化mRNA，所述优化mRNA是用如权利要求5所述的方法制备得到的，并且所述优化mRNA具有式II所示结构：
M1-M2-M3-M4-M5-M6 (II)
式中，
M1为5`端帽子元件；
M2为无或内部核糖体进入位点序列（IRES）；
M3为权利要求1所述的5`UTR元件；
M4为可替换的编码区；
M5为3`UTR元件；
M6为polyA尾部元件。
7. 一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(c1) 如权利要求2所述的mRNA转录模板构建体，或如权利要求6所述的优化mRNA作为活性成分；和
(c2) 药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是将所述mRNA用阳离子脂进行包裹所形成的脂质纳米颗粒。
9.一种如权利要求1所述的5`UTR元件的用途，用于构建mRNA转录模板，从而提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率。
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