CN116350803B - 一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法 - Google Patents
一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及生物医药技术领域,具体公开了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法。利用乳头瘤病毒样颗粒中主要衣壳蛋白L1蛋白的自组装特性,向使用DTT和EDTA解离的乳头瘤病毒样颗粒中加入mRNA,然后加入终止缓冲液后使L1蛋白重新组装聚合成内部包括有mRNA的乳头瘤病毒样颗粒,该mRNA递药系统可在体内稳定运输,使得mRNA完整进入细胞内表达相应蛋白质,不仅具有良好的生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性,而且可通过口服方式作用,目的蛋白的表达量高。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域,具体是一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法。
背景技术
mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸,大小为300~5000kDa,长度为1~15kb。与DNA相比,mRNA不进入细胞核,在细胞质中即可完成蛋白质的合成并发挥功能活性,而DNA需要先进入细胞核,然后转录成mRNA,使DNA的效率低于mRNA。另外mRNA不会插入基因组,而只是瞬时表达编码蛋白,从而降低了插入基因组引起突变的风险,因此安全性较好,且mRNA很容易通过体外转录过程合成,过程简单,工业化生产成本相对低,可以快速应用于各种疗法,应用潜力极其广泛。
mRNA在理论上能够表达任何蛋白,通过体内表达功能蛋白,发挥多种疾病的治疗作用,但mRNA的单链结构致使其极为不稳定,易被降解,而且自身携带负电荷,穿过表面同为负电荷的细胞膜递送亦是难题。因此,mRNA递送到细胞内部共有两道屏障:一是递送途中的酶降解;二是静电排斥致使的膜屏障,因此在实际应用过程中,需要对mRNA进行特殊修饰并与递送系统配合才能实现mRNA的胞内表达。脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)是目前最热门的递送技术,承载mRNA的LNP载体除了含有带负电荷的mRNA外,另有四种成分为可电离的阳离子磷脂(ionizable lipids)、中性辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂(PEGylated lipid),可以保护mRNA分子胞外降解,或者促进mRNA分子与细胞膜融合提高转染。目前最常用的mRNA疫苗递送手段除了脂质纳米粒(Lipidnanoparticle,LNP),还有阳离子脂质复合物(lipoplex,LPX)、脂质多聚复合物(lipopolyplex,LPP)、聚合物纳米颗粒(Polymer nanoparticles,PNP)、无机纳米颗粒(Inorganic nanoparticles,INP)和阳离子纳米乳(Cationic nanoemulsion,CNE)等。
但是上述现有的mRNA递送系统存在以下问题:一是这些纳米颗粒部分由外源性成分组成,LNPs激活不同的炎症途径,这将导致炎症细胞因子的产生,如IL-1和IL-6,可以启动和维持局部和全身炎症和副作用,目前mRNA疫苗的副作用多数来自于LNP的成分,比如PEG、电离脂质等,会导致发生针对递送系统的天然免疫或适应性免疫;二是制备工艺复杂,mRNA/LNP传统的制备方法是两相混合再经均质技术(高压均质机、高压微射流)或者挤出技术(聚碳酸酯膜过滤器)控制粒径,工艺要求高使得制备难度高;三是这类制剂都需要肌肉注射,使用不方便;四是脂质纳米颗粒需要低温保存,因此非常不稳定。
综上,亟需一种生物相容性好、易制备、可口服、易保存的mRNA递药系统。
发明内容
为了解决上述问题,提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统及制备方法,该装载mRNA的乳头瘤病毒样纳米颗粒稳定性好,可以确保载入mRNA的乳头瘤病毒样颗粒完整地在体内运输,且具有良好的生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性,相较于现有技术,目的蛋白的表达量更高。
根据本申请的一个方面,提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下过程:将mRNA装载于乳头瘤病毒样颗粒的内部,获得所述mRNA递药系统。
可选地,所述过程具体包括以下步骤:
1)将所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液混合后解离,获得溶液A;
2)将mRNA加入所述溶液A中混合后,获得溶液B;
3)将所述溶液B与终止缓冲液混合后进行重组装,获得含有所述mRNA递药系统的溶液C。
可选地,所述解离缓冲液包含乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇(DTT)、氯化钠(NaCl)和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl);优选地,所述解离缓冲液中,所述乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)浓度为20±1mM,所述二硫苏糖醇(DTT)浓度为40±2mM、所述氯化钠(NaCl)浓度为300±10mM,所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)浓度为100±5mM;优选地,所述乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)浓度为20mM,所述二硫苏糖醇(DTT)浓度为40mM、所述氯化钠(NaCl)浓度为300mM,所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)浓度为100mM。
优选地,所述解离时间为50~70min,优选地,为60min。
优选地,所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液的体积比为1:0.9~1.1,优选地,为1:1。
可选地,所述终止缓冲液包含氯化钙(CaCl2)和二甲基亚砜(DMSO);优选地,所述终止缓冲液中,所述氯化钙(CaCl2)浓度为25±1mM,所述二甲基亚砜(DMSO)的浓度为20±1vol%;优选地,所述终止缓冲液中,所述氯化钙(CaCl2)浓度为25mM,所述二甲基亚砜(DMSO)的浓度为20vol%。
优选地,所述重组装温度为2~6℃,优选地,为4℃。
可选地,所述步骤3)之后还包括步骤4)用于提纯所述mRNA递药系统:
4)首先向蔗糖/PBS层上加入所述溶液C,一次离心后收集一次沉淀,然后加入PBS重悬后,将获得重悬液加入至CsCl溶液中,二次离心收集二次沉淀,最后用滤膜过滤嵌合,获得所述提纯后的mRNA递药系统;
优选地,所述一次离心条件为27000r/min 4℃离心3h;优选地,所述二次离心条件为35000r/min 4℃离心20h。
可选地,所述乳头瘤病毒样颗粒由乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1组成。
可选地,所述mRNA为经过修饰的mRNA,所述经过修饰的mRNA具有5’帽子、5’和3’-非翻译区和3’-polyA尾。
优选地,所述修饰还包括使用化学修饰的核苷酸代替常规核苷酸,用5-甲基胞苷(m5C)代替胞苷,和/或用5-甲基尿苷(m5U)代替尿苷,和/或用N1-甲基腺苷(m1A)、N6-甲基腺苷(m6A)、2-硫尿苷(s2U)、5-甲氧基尿苷(5moU)、假尿苷(ψ)或N1-甲基假尿苷(m1ψ)代替腺苷。
可选地,所述mRNA可以编码抗体蛋白、肿瘤抗原和病原体蛋白中的一种或多种。
根据本申请的另一个方面,提供了一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统,其特征在于,所述mRNA递药系统根据上述任一种制备方法制备获得。
可选地,所述mRNA递药系统注射或口服使用;优选地,所述mRNA递药系统口服使用。
本申请的有益效果包括但不限于:
1. 本申请提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统的制备方法,制备获得了以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统,为mRNA的递送提供了一种新的思路和方法,并且相较于脂质纳米颗粒(LNP)和多聚体方式,本申请提供的制备方法工艺简单,且该口服mRNA递药系统具有非免疫原性,不易引起过敏反应等潜在不良事件。
2. 本申请提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统,具有良好的稳定性和生物相容性,可以确保该递药系统可以完整地在体内运输,并且具有可生物降解的特性,是理想的易降解药物的运载体。
3. 本申请提供的以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统,通过口服的途径进入肠道,免疫细胞通过与乳头瘤病毒受体结合,以胞饮方式mRNA可完整进入细胞内并表达相应蛋白质,表达的蛋白质为各类抗体和免疫调节因子等起到防病治病的作用,相比于现有的质粒递送技术方案,该mRNA递药系统的目的蛋白表达量更高。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1:重组表达质粒pRP[Exp]-Puro-EF1A>{Igk leader/EGFP*}的结构示意图;
图2:体外转录载体pUC19K-T7pA110-UTRM-Igκ-sig/EGFP的结构示意图;
图3:透射电镜下颗粒示意图:A,牛乳头瘤病毒样颗粒BPV1颗粒;B,人乳头瘤病毒HPV16颗粒(33000X);
图4:提取mRNA的琼脂凝胶电泳(1-10为10个不同样本);
图5:检测EGFP浓度的标准曲线;
图6:装载mRNA的VLPs感染CaCo-2细胞株表达EGFP的水平;
图7:小鼠灌服装载mRNA的VLPs后体内EGFP水平。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请,但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明,本申请的实施例中的原料和试剂均通过商业途径购买。
在mRNA递送过程中,由于裸露的mRNA通过清道夫受体介导的内吞途径被细胞摄入并积累在内体中,使得裸露的mRNA在体内运输并穿过细胞膜进入细胞质的效率极其低下,体内正常细胞摄取mRNA效率很低,仅未成熟的树突状细胞可以通过巨胞饮途径摄取并有效积累mRNA,因此治疗性mRNA的广泛应用需要更高效的递送方式。
近十年来,mRNA制剂技术取得很大进展,例如脂质纳米颗粒和多聚体等,能有效地将mRNA递送进入大多数类型的细胞内,包裹mRNA的纳米颗粒是通过内吞作用摄入,然后从内体释放mRNA,核酶体将启动翻译并产生各种蛋白质,包括分泌、跨膜、胞内和线粒体内蛋白等。然而,这类制剂技术需要大量使用化学品,如可电离阳离子磷脂、中性辅助磷脂、胆固醇、PEG修饰磷脂等,不仅工艺复杂,而且容易引起过敏反应等不良事件。
mRNA作为一种非常有潜力的候选药物,但将裸mRNA作为药物存在稳定问题,体外易降解、体内半衰期短、成药性较差。为了提高mRNA稳定性,需要对mRNA结构进行各种化学修饰,如5'-加帽,多聚腺苷酸(A)尾部,5'-和3'-UTR(非翻译区)以及编码区域的密码子优化等,可以解决mRNA不稳定的问题。5'帽子的甲基化修饰(如m7G等)、三磷酸桥含有一个单硫代磷酸酯替换等,可以促使mRNA和核糖体的结合,能有效地封闭RNA 5'末端,以保护mRNA的5'核酸外切酶降解,增强mRNA的稳定性;mRNA的3'末端多聚腺苷酸(polyA)在调节mRNA稳定性和翻译效率方面发挥关键的作用,同时也可降低尿苷暴露以降低免疫原性;mRNA中的5'-和3'-UTR包含特定的调控序列元件,可调节mRNA的翻译和稳定性;mRNA的半衰期可以通过在UTR中引入稳定性元件来进行优化。
密码子的优化也可以起到进一步调控作用,例如同义密码子替换可能会对蛋白表达、折叠和细胞功能产生显著影响,如mRNA二级结构可以通过改变mRNA翻译的半衰期来调节蛋白的表达,并且采用化学修饰的核苷酸可以稳定mRNA空间结构提高蛋白的表达水平;同时可以选择优化富含GC的密码子并使U含量最小化,或几种核苷酸化学修饰策略以降低免疫原性而不影响其翻译特性,如将天然尿苷替换为5-甲基尿苷(m5U)和假尿苷(ψ)可降低mRNA的免疫原性,增强转录本稳定性,并且还提高了翻译效率。
在提高mRNA的稳定性之后,仍存在裸露的mRNA在体内运输并穿过细胞膜进入细胞质的效率低下问题。研究证明,裸露的mRNA通过清道夫受体介导的内吞途径被细胞摄入并积累在内体(endosome)中,体内正常细胞摄取mRNA的效率低,仅未成熟的树突状细胞可以通过巨胞饮途径摄取并有效积累mRNA,因此治疗性mRNA的广泛应用需要更高效的递送方式,从而才能够将注射的mRNA完整地从注射部位运输到相应的靶部分。
近十年来,mRNA制剂技术取得很大进展,例如采用脂质纳米颗粒(LNP)和多聚体等,能有效地将mRNA递送进入大多数类型的细胞内,包裹mRNA的纳米颗粒是通过内吞作用摄入,然后从内体释放mRNA,核酶体将启动翻译并产生各种蛋白质,包括分泌、跨膜、胞内和线粒体内蛋白等。然而,这类制剂技术存在大量使用化学品,如可电离阳离子磷脂、中性辅助磷脂、胆固醇、PEG修饰磷脂等,工艺复杂,易引起过敏反应等不良事件。
在寻找mRNA递药系统的过程中,发明人意料地发现人乳头瘤病毒样颗粒可将非复制型、经修饰的mRNA包裹在里面,具有运输稳定性,运输的mRNA在细胞内表达mRNA编码的蛋白质,在体内表达目的基因编码的蛋白质,且较递送DNA(如表达质粒)具有明显优势。发明人通过研究发现,利用mRNA修饰的技术优势,加上具有较好的可降解性病毒样颗粒,能够使mRNA在体内表达更持久、生物学效应更显著。在本申请中,发明人以乳头瘤病毒样颗粒为载体的信使核糖核酸药物口服递药系统,不仅为mRNA递送提供了一种新的思路和方式,而且相较于现有技术采用脂质纳米颗粒(LNP)和多聚体的方式具有稳定性和生物相容性高的优点,且具有非免疫原性和可生物降解的特性,使其使用的安全性较高,可以解决mRNA递送的难题,而且利用本发明技术制备的乳头瘤病毒样颗粒可通过基因工程表达,该mRNA递药系统的制备方法简单高效。
除此之外,该mRNA递药系统还可以通过口服的方式发挥作用。目前世界上没有一种可以口服的核酸药物或核酸疫苗,主要是因为肠道系统含有复杂和大量的酶系统,可迅速降解核酸,同时肠道壁细胞也难以摄取核酸并表达功能蛋白。本发明人出其意料的发现,乳头瘤病毒L1蛋白可以很好包裹mRNA,可借助乳头瘤L1蛋白形成的致密的假病毒颗粒的耐消化酶与亲肠壁上皮细胞的双重特性,将携带的mRNA穿过肠道,结合肠道上皮细胞,递送至细胞内,在肠壁上细胞表达分泌型或膜结合型功能蛋白(依mRNA设计),发挥功能蛋白的治疗或疫苗的作用。
乳头瘤病毒L1蛋白,或形成的病毒样颗粒(VLPs)或假病毒颗粒,与肠上皮细胞的结合并被摄取通过特定空间构象的硫酸肝素多糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan)介导(文献:Knappe, M. et al. Surface-exposed amino acid residues of HPV16 L1protein mediating interaction with cell surface heparan sulfate. J. Biol.Chem. 2007,282,27913–27922)。乳头瘤L1蛋白形成的假病毒进入细胞的机制一般认为是通过网格蛋白(clathrin)和微囊(caveolar)介导的胞饮方式(endocytosis)(Bousarghin,L.AT, et al. Human papillomavirus types 16, 31, and 58 use differentendocytosis pathways to enter cells. J Virol. 2003, 77:3846-50; Laniosz VKA.et al. Bovine papillomavirus type 1: from clathrin to caveolin. JVirol..2008)。细胞内的mRNA通过核糖体翻译成相应功能蛋白质,再释放进入周围组织或进入血液循环发挥作用。
人乳头瘤病毒(human Papilloma virus,HPV),属于一组小DNA非溶细胞性病毒(nonlytic virus),无包膜,直径为52~55nm。乳头瘤病毒晚期编码区L1和L2基因分别编码HPV的主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)。L1蛋白在体外具有自组装功能,5个L1蛋白聚合成一个五聚体,然后72个五聚体自动装配成一个病毒样颗粒(VLPs),因此一个VLP包含360个L1蛋白。主要壳蛋白L1分子量为56kDa,由505个氨基酸组成,大约占病毒结构蛋白总量的80%。HPV具嗜上皮特性(tropic),L1蛋白可与皮肤和粘膜等的上皮细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖((heparan sulfate proteoglycans,HSPG)等受体结合并通过内吞摄取。本文所指乳头瘤病毒,不仅为人乳头瘤病毒,还包括牛乳头瘤病毒(BPV),两者具有相似的结构、特点和安全性。
VLPs可以通过基因工程制备获得,以HPV16病毒样颗粒(VLPs)制备为例说明过程:将HPV16L1基因构建到pBacPAK8上,通过与线性化的杆状病毒在sf9昆虫细胞中同源重组得到含有L1基因的重组病毒;利用重组病毒感染sf9昆虫细胞,可以在昆虫细胞的细胞核中组装HPV16病毒样颗粒(VLPs),通过30%CsCl超速离心可以将VLPs纯化;VLPs还可以通过商业方式购买获得。
VLPs在DTT和EDTA存在的条件下可以解离成L1蛋白,向解离的L1中加入已经体外转录合成的mRNA,除去DTT和EDTA后,提高钙离子的浓度,使得解离的L1蛋白会重新聚合成VLPs,其中一部分包裹了mRNA的VLPs称之为病毒样颗粒或假病毒颗粒,这部分包裹有mRNA的VLPs即是所需要的mRNA递药系统。发明人发现,使用DTT和含EGTA的缓冲液将病毒样颗粒解聚,然后与mRNA混合,当混合后作用时间为60min时效果较好,然后再用逐渐增加浓度的CaCl2在4℃下放置12h即可组装成完整的假病毒颗粒,即mRNA递药系统。
本发明的目的之一就是开发一种能够装载mRNA的乳头瘤病毒样颗粒,自行制备或市售的乳头瘤病毒L1蛋白在还原后解离,装载mRNA后可逐步自组装成外观上与天然的乳头瘤病毒相似的颗粒。本发明的另一目的是制备一种不同于人工LNP的稳定、生物相容型的纳米颗粒。经过发明人研究发现,装载mRNA的乳头瘤病毒样纳米颗粒具有一定稳定性,从而确保载入mRNA的乳头瘤病毒样颗粒可以完整地在体内运输,其生物相容性、非免疫原性和可生物降解特性,使其成为理想的易降解药物的运载体。
该乳头瘤病毒样颗粒可稳定装载具有编码治疗疾病作用的多种蛋白质的非复制型、经修饰的mRNA,通过注射口服的途径将乳头瘤病毒样纳米颗粒送入肠道内,通过与乳头瘤病毒受体结合,以胞饮方式,将乳头瘤病毒样颗粒中修饰后的mRNA完整地进入细胞内并表达相应蛋白质,表达的蛋白质为各类抗体和免疫调节因子等起到防病治病的作用。胃肠道容纳了人体免疫系统70%-80%的免疫细胞,肠相关的淋巴组织(gut-associatedlymphoid tissue,GALT)是组成肠道免疫的主要部分,主要包括位于小肠壁的派尔集合淋巴结(Peyer's patches PP)、独立淋巴滤泡、肠系膜淋巴结以及黏膜固有层内的淋巴细胞等。因此,通过口服递送表达免疫相关蛋白的mRNA,该mRNA递药系统可以更高效地进入细胞,从而实现目的mRNA的表达,能够取得更好的治疗效果。
为了完成本发明之目的,本发明采取如下实施例的技术方案。为便于检测mRNA是否成功表达,采用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为工具,考察本发明的可行性和效果。
实施例1 mRNA递药系统的制备
采用体外转录系统(IVT-mRNA)制备mRNA
(1)重组表达质粒构建及制备
委托云舟生物科技(广州)有限公司构建表达质粒pRP[Exp]-Puro-EF1A>{Igkleader/EGFP*}(如图1所示),以增强绿色荧光蛋白EGFP为工具蛋白用于对照研究。采用Gateway技术构建载体,包含两步反应:第一步BP反应构建含有目的序列的入门克隆载体;第二步LR反应构建含有目的序列的重组表达载体,在Gateway技术中,起重要作用的重组位点是:attB、attP、attL和attR。具体步骤如下:先扩增目的基因,根据BP反应原理,设计引物序列:attB site+特异性引物序列(下划线)。
pD-PF1,如SEQ ID NO.1所示:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGC;
pD-PR1,如SEQ ID NO.2所示:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。
目的片段切胶回收,BP反应构建中间载体pDown-{Igk leader/EGFP*},中间载体测序鉴定,再进行LR反应,将携带启动子的载体pUp-EF1A、pDown-{Igk leader/EGFP*}以及pRP[Exp]-Puro重组,转化及终载体阳性克隆鉴定,最终构建获得pRP[Exp]-Puro-EF1A>{Igk leader/EGFP*}载体.
(2)体外转录mRNA、纯化及检测
委托云舟生物科技(广州)有限公司合成mRNA。首先构建体外转录载体pUC19K-T7pA110-UTRM-Igκ-sig/EGFP(如图2所示),构建元件包括T7 promoter-5‘ UTR-ORF-3’UTR-polyA,目的基因为EGFP,前面接Igκ的信号肽序列,以利EGFP分泌出细胞;再制备上述载体,纯化后的载体用单酶切线性化,选用mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit(Invitrogen™),按说明书要求进行体外转录、加帽反应和加poly A反应,试剂盒T7 2XNTP/ARCA的15mM UTP替换为N1-Methylpseudouridine-5’-Triphosphate(N1假尿苷-5’-三磷酸盐,Trilink Biotech);再用NucAway™ Spin ColumnsMEGAclear™ Kit回收纯化合成的修饰mRNA,回收的mRNA按照1:100体积进行稀释,利用紫外分光光度计测定A260和A280值,根据合成的RNA的1 OD260=33μg定量,并计算OD260/OD280比值。
载体中Igkappa-sig/EGFP元件大小为783bp,分子量约为258 kDa,用紫外可见分光光度计获得OD260/280比值平均为2.02,表明合成的mRNA纯度高。
包裹mRNA的乳头瘤病毒样纳米颗粒的组装与纯化
首先将人或牛乳头瘤病毒的外壳(重组HPV16 L1蛋白,货号ab119880;重组BPV L1蛋白,货号CBS-V554)与解离缓冲液按1∶1体积混合,室温下培养60分钟,其中解离缓冲液为:乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸 (EGTA)20mM,二硫苏糖醇(DTT)40mM,氯化钠(NaCl)300mM,三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH8.0)100mM;然后加入1/10体积的修饰后mRNA,浓度为0.51μg/μl;再将终止缓冲液逐步加入,其中终止缓冲液为:氯化钙(CaCl2)25mM,二甲基亚砜(DMSO)20vol%,将混合好的混合液放在4℃过夜。
自组装为病毒样颗粒(VLPs)后,于30%(w/w)蔗糖/PBS层上缓慢加入自组装完毕的VLPs混合液,27000rpm、4℃离心3h,取沉淀(小黄色圆斑样物质)加1mLPBS重悬;将重悬液缓慢沿管壁加入10mL的29%CsCl溶液中,35000r/min、4℃离心20h后收集沉淀,用0.22μm滤膜过滤嵌合VLPs样品,获得所需mRNA递药系统。
通过Malvern Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪检测病毒样颗粒的粒径大小,Zetasizer Software软件分析数据:将样品滴于喷炭的铜网上,静置5min,再滴加2%磷钨酸钾染色,静置5min,自然半干后固定,设定透射电镜放大倍率为50000倍、电压80kV,观察样品颗粒形态。如图3所示,将体外组装后的VLPs进行动态光散射粒径分析和透射电镜检测,可观察到大量形态结构、直径为50~55nm的球形颗粒,且粒径均一,说明体外自组装载为VLPs。
实验例1 表达EGFP的mRNA包封率检测
依实施例1,制备装载mRNA的乳头瘤病毒样颗粒,用高浓度RNase消化去除没被包裹在内的外周RNA,用无RNase的PBS缓冲液洗涤,再用实施例1的解离缓冲液解聚人乳头瘤病毒样颗粒(解离缓冲液为:乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)20mM,二硫苏糖醇(DTT)40mM,氯化钠(NaCl)300mM,三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(PH8.0)100mM),加入低浓度的RNA酶抑制剂。
经电镜或电泳确认纳米颗粒解聚和蛋白定量后,用RNA提取试剂,在Agilent 2100Bioanalyzer或Agilent® Bioanalyzer® system或上进行mRNA定性和定量分析,证实完整mRNA被包入病毒样颗粒内。结果显示,装载了mRNA乳头瘤病毒样颗粒中可检测到mRNA,mRNA乳头瘤病毒样颗粒中,包裹mRNA的量为200-500ng mRNA/mg蛋白。其中包封率的计算方式为:包封的mRNA量/加入总mRNA量*100%,结果包封率平均能够达到72.2±8.5%。
实验例2 乳头瘤病毒样颗粒包裹mRNA耐核酸酶消化
人或牛乳头瘤病毒样颗粒与核酸酶Benzonase(Sigma-Aldrich,E8263,≥250units/μL,终浓度250U/mL)作用不同时间,采用QIAGEN公司生产的病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取RNA,采用微量紫外分光光度计对mRNA进行定量;再进行EB染色的琼脂凝胶电泳,观察假病毒颗粒包裹的修饰后mRNA的完整性。结果如下图4,经过不同时程核酸酸处理后,可见mRNA未降解,保持完整。
测试例1 制备条件的优化过程
首先将人或牛乳头瘤病毒的外壳(重组HPV16 L1蛋白,货号ab119880;重组BPV L1蛋白,货号CBS-V554)与解离缓冲液按1∶1体积混合,为防止mRNA体外降解,需要在尽可能短的时间内完成包裹,还需要考虑到时间对于包封率的影响,因此对步骤3)重组装包裹过程的共同作用时间进行了考察,具体的设置为30min、40min、50min和60min。发明人发现,30min时包封率不高,而60min时mRNA可能有降解(包封率测定方法见实验例1),故选择共同作用40min。
发明人还在室温条件下,对解离缓冲液中二硫苏糖醇(DTT)的终浓度(10mM、20mM、40mM、50mM)进行了筛选考察,平均包封率分别为49.7%、76.4%、71.3%和69.4%。最终确定解离缓冲液为:乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)20mM,二硫苏糖醇(DTT)20mM,氯化钠(NaCl)300mM,三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH8.0)100mM;然后加入1/10体积的修饰后mRNA,浓度为0.51μg/μl;再将终止缓冲液逐步加入(分3次,每次三分之一体积),确定终止缓冲液终浓度为:氯化钙(CaCl2)10mM,二甲基亚砜(DMSO)20vol%。发明人还考察了过夜处理的时间,将混合好的混合液放在4℃过夜处理12h,电镜下显示,与处理2h比较,混合液处理12h时制备的假病毒颗粒更完整。
实施例2 装载mRNA乳头瘤病毒样颗粒体外转染细胞后表达目的蛋白
采用人结肠癌CaCo-2细胞株(ATCC HTB-37),接种于96孔板,1X104个细胞CaCo-2/孔过夜,细胞融合80%后,加入适量无血清培养基,再吸去,每个组3个重复孔。设以下组别:(1)试验组,每孔加10μg的装载mRNA的乳头瘤病毒颗粒,1mL培养液体系(无血清);(2)质粒对照:每孔加10μg的装载表达质粒的乳头瘤病毒颗粒(体积同上),1mL培养液体系;(3)脂质体介导转染组:每孔13μg的mRNA与10μL/孔脂质体(Lipofectamine 3000)混匀,室温下放置20min,再加入细胞培养体系中。另设未装载核酸的乳头瘤病毒样颗粒对照组和裸mRNA组。3个重复孔/组,以上组别的细胞培养4h,37℃,之后加入2mL完全培养液,再培养48h,吸上清检测,冻存后统一用ELISA检测(试剂盒为GFP ELISA Kit,ab171581)。根据图5中EGFP浓度与OD值的标准曲线,检测EGFP的浓度,结果显示装载mRNA的假病毒颗粒感染细胞后,目的蛋白表达水平最高(EGFP浓度结果见下表1与图6)。
由表1结果可知,相比于装载质粒的方式以及传统通过脂质体介导的递送系统,本申请提供的mRNA递药系统,最终目的蛋白的表达量最高。
实施例3 装载mRNA乳头瘤病毒样颗粒在动物体内表达
KM种小鼠,设3组:人乳头瘤病毒样颗粒对照组、装载mRNA的乳头瘤病毒样颗粒组和装载表达质粒的人乳头瘤病毒样颗粒治疗组。4只/组,雌雄各半,3组标记颜色(头、背、尾),且放不同笼子,经口灌服1次,体积均为200μL/只,分别于灌服假病毒颗粒(L1蛋白)后24h、72h共2个时间点取血分离血清后冻存,检测血清中mRNA编码的EGFP水平。
结果显示,装载mRNA的假病毒颗粒组别小鼠血清中可检测到较高水平的EGFP,平均达到0.624pg/mL,而装载表达质粒的假病毒颗粒组别小鼠血清中可检测到较高水平的EGFP水平只有0.193pg/mL,表明采用HPV假病毒颗粒递送mRNA的效率更高,在体内可表达更高水平的目的蛋白(结果见下表2与图7)。
由表2结果可知,本申请提供的mRNA递药系统相比于传统的递送质粒的方式,mRNA可以在体内表达更高水平的目的蛋白。
综上所述,本申请提供的mRNA递药系统,不仅表达目的蛋白的效果得到提高,而且还能够通过口服的方式发挥作用,并且该mRNA递药系统的制备方法简单,相比于现有的递送系统其安全性更高,目的蛋白的表达量更高,导致上述结果的原因可能是:对于装载表达质粒的人乳头瘤病毒样颗粒这一方案,质粒携带的为DNA序列,在发挥作用时需要进入细胞核后再转录出mRNA后才能表达出目的蛋白,因此目的蛋白的表达量不仅仅取决于质粒导入细胞胞浆内,还需要考虑到质粒入核的影响因素,而本申请方案中,mRNA片段进入胞浆之后即可以进行翻译进而表达出目的蛋白,因此表达量理应更高;对于脂质体介导的mRNA递送体系,作为载体mRNA本身带负电荷,会与作为载具的脂质体发生较强的连接作用,脂质体即便成功与细胞膜融合,但mRNA不会全部进入胞浆,而是容易部分粘附在细胞膜上,之后被细胞降解,不能参与目的蛋白的表达翻译过程,从而目的蛋白的表达量相对不高,再者,脂质体有比较肯定的细胞毒性,且单独的阳离子脂质体不能作为递送体用于人体内。
而本申请方案,采用HPV的VLPs包裹mRNA以实现mRNA递送至细胞内进行目的蛋白的表达,并且还能够通过口服的方式进行作用,并且表达量相较于现有技术有较大的提高,该方案中mRNA递药系统的制备方法不仅使得VLPs可以包裹大量的mRNA,而且还能通过口服的方式抵抗消化道的酶降解,并结合到肠道上皮后将mRNA送入细胞中进行高效表达,服用方式方便快捷,且服用难度明显降低。
以上所述,仅为本申请的实施例而已,本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制,而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种以乳头瘤病毒样颗粒为载体的mRNA递药系统在制备口服mRNA药物中的应用,其特征在于,所述mRNA递药系统的制备方法包括以下过程:将mRNA装载于乳头瘤病毒样颗粒的内部,获得所述mRNA递药系统,所述乳头瘤病毒样颗粒由乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1组成;
所述过程具体包括以下步骤:
1)将所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液混合后解离,获得溶液A;
2)将mRNA加入所述溶液A中混合后,获得溶液B;
3)将所述溶液B与终止缓冲液混合后进行重组装,获得含有所述mRNA递药系统的溶液C;
所述解离缓冲液包含乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇(DTT)、氯化钠(NaCl)和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl),所述解离缓冲液中,所述乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)浓度为20±1mM,所述二硫苏糖醇(DTT)浓度为40±2mM、所述氯化钠(NaCl)浓度为300±10mM,所述三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)浓度为100±5mM,所述解离时间为50~70min;
所述终止缓冲液包含氯化钙(CaCl2)和二甲基亚砜(DMSO),所述氯化钙(CaCl2)浓度为25±1mM,所述二甲基亚砜(DMSO)的浓度为20±1vol%,所述重组装温度为2~6℃;
所述乳头瘤病毒为HPV16。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述mRNA为经过修饰的mRNA,所述经过修饰的mRNA具有5’帽子、5’和3’-非翻译区和3’-polyA尾;所述修饰还包括使用化学修饰的核苷酸代替常规核苷酸,用5-甲基胞苷(m5C)代替胞苷,和/或用5-甲基尿苷(m5U)代替尿苷,和/或用N1-甲基腺苷(m1A)、N6-甲基腺苷(m6A)、2-硫尿苷(s2U)、5-甲氧基尿苷(5moU)、假尿苷(ψ)或N1-甲基假尿苷(m1ψ)代替腺苷。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述mRNA可以编码抗体蛋白、肿瘤抗原和病原体蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述乳头瘤病毒样颗粒与解离缓冲液的体积比为1:0.9~1.1。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述步骤3)之后还包括步骤4)用于提纯所述mRNA递药系统:
4)首先向蔗糖/PBS层上加入所述溶液C,一次离心后收集一次沉淀,然后加入PBS重悬后,将获得重悬液加入至CsCl溶液中,二次离心收集二次沉淀,最后用滤膜过滤嵌合,获得所述提纯后的mRNA递药系统。
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