CN109528653B - 具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途，膜性囊泡包括生物相容性外壳和由生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触，内部基质包含gRNA和Cas蛋白，gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且gRNA能够与Cas蛋白形成功能性复合体。

Description

具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和 用途
技术领域
本发明涉及药物递送，具体涉及具有基因编辑功能的膜性囊泡、其制备方法和用途。
背景技术
CRISPR/Cas系统是应用较广的基因编辑技术。该技术源于细菌和古生菌中的一种对付噬菌体等外来DNA的防御系统。在某些细菌和古生菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats，CRISPR)。经序列比对发现，这些重复序列的间隔序列与许多噬菌体DNA序列相同。此外，这些序列转录的RNA能够与细菌和古生菌产生的一类称为Cas(CRISPR associated)的蛋白质形成复合体，当复合体检测到入侵的DNA和RNA序列一致时，这段RNA通过碱基互补的方式与DNA序列结合，引导Cas蛋白识别原型间隔序列毗邻基序(Protospacer Associated Motif,PAM)，Cas蛋白由此到达PAM识别序列的特定位点，实现其对外来DNA的基因编辑，因此这段RNA被称为导向RNA(guide RNA，gRNA)。严格来说，gRNA由两部分组成：一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA(CRISPR RNA,crRNA),另一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)。
目前已发现三种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白和gRNA为核心组成。在实际应用中，将gRNA序列以及编码Cas9蛋白的基因序列装入一个表达载体中。转入宿主细胞后，表达产生的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞的特定基因序列，从而高效发挥其基因编辑作用。随着金黄色葡萄球菌Cas9的发现，使得CRISPR/Cas9系统可以装入腺相关病毒载体中，致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。然而，由于部分人群对腺相关病毒具有潜在的抵抗性，及其潜在致瘤性等安全隐患，仍需开发更加高效、安全的递送系统。最近，有学者发现通过电穿孔方法将CRISPR/Cas9表达质粒注入外泌体中，可有效递送CRISPR/Cas9系统，进而实现对靶细胞的基因编辑。这一发现揭示了外泌体在递送CRIPSR/Cas9系统中的潜在价值。然而，通过外泌体传递CRISPR/Cas9表达质粒，一方面由于质粒表达的大量gRNA和Cas9蛋白使得发生脱靶效应的风险较大；另一方面由于质粒DNA有可能整合至靶细胞基因组，使其具有潜在致癌性的安全问题。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明进行了深入研究，发现细胞内源产生的膜性囊泡可直接包裹CRISPR/Cas9系统中的gRNA和Cas9蛋白，并可将gRNA和Cas9蛋白传递至其它细胞行使其基因编辑功能。由于gRNA和Cas9蛋白在细胞内会很快降解，所以直接传递gRNA和Cas9蛋白可以大大降低二者持续表达所带来的脱靶效应的发生风险。至少部分地基于上述研究完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种具有基因编辑功能的膜性囊泡，其包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中：
所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入靶细胞内；
所述内部基质包含gRNA和Cas蛋白，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas蛋白形成功能性复合体。
在某些实施方案中，所述内部基质不包含用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因。
在某些实施方案中，所述膜性囊泡的直径为30-1000nm，密度为1.13-1.28g/m1。
在某些实施方案中，所述膜性囊泡通过细胞外泌获得。
在某些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白或其突变体，优选地，所述突变体包括SaCas9、SpCas9-HF1、eSpCas9(1.1)和HypaCas9。
本发明的第二方面，提供一种具有基因编辑功能的膜性囊泡的制备方法，其包括：
(1)在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞的步骤；
(2)从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；
(3)可选地，进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤；
其中，步骤(1)中的所述工程细胞包含产生gRNA和编码具有活性的Cas蛋白的基因。
在某些实施方案中，所述工程细胞包括Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的膜性囊泡，和可选的药物学可接受载体。
本发明的第四方面，一种用于在细胞内进行基因编辑的方法，其包括使用本发明所述的膜性囊泡向靶细胞内递送CRISPR/Cas系统的步骤。
本发明的第五方面，提供膜性囊泡作为药物递送系统的用途，其中，所述gRNA和Cas9蛋白能够特异性作用于靶DNA序列并发挥基因编辑功能。
附图说明
图1检测不同细胞内源产生的外泌体中gRNA和Cas9蛋白的水平。其中：图1A和图1B为分别通过粒径分析(A)和电镜观察(B)从HeLa细胞培养上清中分离纯化的外泌体。图1C为通过半定量PCR和western blot检测HeLa细胞内源产生的外泌体中gRNA-HPV和cas9蛋白的水平。转染PX458质粒的细胞作为检测gRNA-HPV时的对照细胞，GAPDH作为HeLa细胞产生的外泌体中RNA的内参；而只加lipofectamine 2000的细胞作为检测Cas9蛋白时的对照细胞，CD81作为外泌体蛋白内参。图1D和图1E分别为通过粒径分析(D)和电镜观察(E)HuH7细胞培养上清中分离纯化的外泌体。图1F为通过半定量PCR和western blot检测HuH7细胞内源产生的外泌体中gRNA-HBV1和cas9蛋白的水平，GAPDH作为HuH7细胞产生的外泌体中RNA的内参，CD63作为外泌体蛋白内参。图1G为通过半定量PCR和western blot检测HEK293细胞内源产生的外泌体中gRNA-HBV1和cas9蛋白的水平，GAPDH作为HEK293细胞产生的外泌体中RNA的内参，CD81作为外泌体蛋白内参。图1H为通过半定量PCR和western blot检测巨噬细胞内源产生的外泌体中gRNA-HBV1和cas9蛋白的水平，GAPDH作为巨噬细胞产生的外泌体中RNA的内参，CD81作为外泌体蛋白内参。Exo：exosomes。
图2通过tCLN生物芯片和TIRF显微镜检测HuH7细胞内源产生的外泌体中gRNA和Cas9蛋白的水平。其中：图2A将PX458质粒和PX458-gHBV1-T2A del表达质粒分别转染至HuH7细胞中，转染6小时后，更换新鲜培养基，其中一皿转染PX458-gHBV1-T2A del表达质粒的细胞培养基中加入终浓度为2.5μM的外泌体分泌抑制剂GW4869，另外两皿分别转染PX458质粒和PX458-gHBV1-T2A del表达质粒的细胞培养基中加入对照试剂DMSO，48小时后，收集细胞的培养上清，经外泌体提取试剂盒(LifeTechnology,USA)提取细胞培养上清中的外泌体。然后，采用带有CY5荧光基团标记的gRNA-HBV1特异性探针的tCLN生物芯片在TIRF显微镜下检测外泌体中gHBV1(红光)。图2B在TIRF显微镜下检测外泌体中融合GFP蛋白的Cas9蛋白(绿光)。图2C连续观察20个视野，统计所有视野中的荧光信号强度。并采用21.0版SPSS(SPSS,Chicago,IL)软件进行Mann-Whitney U test统计分析，双侧检验，P<0.05表示具有统计学意义，***表示P<0.001。
图3检测外泌体中gRNA和Cas9蛋白的基因编辑功能。其中：图3A将从HuH7细胞培养上清中浓缩和纯化的含有gHBV1和gHBV2的外泌体加入到转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞中，48小时后，提取细胞DNA。然后，通过位于两条gRNA切点之外的引物进行PCR扩增，并PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。图3B将PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒共同转染至一皿HuH7细胞中，并将pBB4.5-1.2×HBV表达质粒转染至另一皿HuH7细胞，转染48小时后，将两皿细胞消化，并将转染PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒的HuH7细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞铺至一新皿中共培养。48小时后，提取细胞DNA。然后，通过位于两条gRNA切点之外的引物进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。图3C将小片段PCR产物切胶纯化回收，并进行测序分析。图3D将稳定表达PX458-gHPV1和PX458-gHPV2的HeLa细胞分别消化后铺至一新皿中共培养。48小时后，提取细胞DNA。然后，通过位于两条gRNA切点之外的引物进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
图4利用Vero和CHO细胞产生带有gRNA和Cas9蛋白的外泌体。将PX458-gHBV1表达质粒经lipofectamine 2000转染至Vero细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体。其中：图4A和图4B分别为通过粒径分析(A)和电镜观察(B)从Vero细胞培养上清中分离纯化的外泌体。图4C为通过半定量PCR和western blot检测Vero细胞内源产生的外泌体中gRNA-HBV1和cas9蛋白的水平，转染PX458质粒的细胞作为检测gRNA-HBV1时的对照细胞，GAPDH作为HeLa细胞产生的外泌体中RNA的内参；而只加lipofectamine2000的细胞作为检测Cas9蛋白时的对照细胞，CD81作为外泌体蛋白内参。图4D将PX458-gHBV1表达质粒转染至CHO细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体。分别通过半定量PCR和western blot检测CHO细胞内源产生的外泌体中gRNA-HBV1和cas9蛋白的水平，GAPDH作为CHO细胞产生的外泌体中RNA的内参，CD63作为外泌体蛋白内参。Exo：exosomes。
图5本发明的外泌体用于其它靶细胞内的基因编辑。其中：图5A纯化浓缩Vero细胞产生的外泌体，并将外泌体用PKH26进行染色，30分钟后加入1％BSA终止反应，终止10分钟，随后加入适量PBS 100,000x g离心2小时，弃去上清，用100μl PBS重悬外泌体，加入HuH7细胞中孵育3小时。受体细胞在孵育前30分钟利用Hoechst33342进行细胞核染色。孵育3小时后用预冷的PBS洗2遍，并用4％多聚甲醛固定。随后用TCS-SP8STED 3X仪器进行共聚焦成像。图5B将PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒共同转染至一皿Vero细胞中，并将pBB4.5-1.2×HBV表达质粒转染至一皿HuH7细胞，转染48小时后，将两孔细胞消化，并将转染PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒的Vero细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞进行共同铺至一新皿中。48小时后，提取细胞DNA。然后，通过位于两条gRNA切点之外的引物进行PCR扩增，并PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。图5C将PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒共同转染至一皿CHO细胞中，并将pBB4.5-1.2×HBV表达质粒转染至一皿HuH7细胞，转染48小时后，将两孔细胞消化，并将转染PX458或PX458-gHBV1和PX458-gHBV2表达质粒的CHO细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞进行共同铺至一新皿中。48小时后，提取细胞DNA。然后，通过位于两条gRNA切点之外的引物进行PCR扩增，并PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
[具有基因编辑功能的膜性囊泡]
本发明的第一方面，提供具有基因编辑功能的膜性囊泡，其包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质。本发明的膜性囊泡的直径一般为30-1000nm。在某些实施方案中，直径为50-140nm，优选80-140nm之间，更优选105-140nm。在某些实施方案中，直径为200-500nm，优选250-300nm。另外，膜性囊泡的密度一般为1.13-1.28g/m1，优选1.13-1.19g/ml。
本发明的生物相容性外壳构成膜性囊泡的外部结构，其具有脂质双层结构。其中脂质双层结构中包括磷脂和胆固醇。优选地，进一步包括蛋白类物质，例如，主要组织相容性复合物MHC I、MHC II、四跨膜蛋白超家族如CD9、CD81、CD63等。
在某些实施方案中，生物相容性外壳能够与靶细胞表面接触，并使至少内部基质进入靶细胞内，优选使膜性囊泡进入靶细胞内，由此将内部基质中的物质递送至靶细胞。在某些实施方案中，脂质双层结构中包含引发靶细胞发生胞吞功能的蛋白，由此将膜性囊泡胞吞至靶细胞内。
本发明的内部基质为由生物相容性外壳包裹的水性基质，其包含能够提供基因编辑功能的成分，至少包括gRNA和Cas蛋白。其中，gRNA也称为导向RNA(guide RNA)。gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且gRNA能够与Cas蛋白形成功能性复合体。gRNA的序列不特别限定，根据待编辑的靶DNA的序列而变化，并且gRNA可以是一种，也可以是多种不同类型的组合。优选地，gRNA包括识别靶DNA的crRNA和活化Cas蛋白所需的tracrRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)。
本发明的Cas蛋白是指CRISPR系统中具有核酸酶活性的一类蛋白，其为CRISPR关联(CRISPR associated)蛋白。本发明可使用目前已经发现的SpCas9、SaCas9、Cas13a、Cas13b、Cpf1等多种类型的Cas蛋白。本发明中的Cas蛋白包括天然存在的蛋白或重组蛋白。另外，Cas蛋白不仅包含本申请日之前已鉴定的任何蛋白，还包含基于目前已知的知识能够确定可能具有该蛋白活性，并在本申请日之后鉴定其活性的蛋白。还优选地，本发明使用对天然Cas蛋白进行改造，以达到所需功能或目的的突变体。在示例性实施方式中，本发明的Cas蛋白是Cas9蛋白家族或其突变体，例如高精确(High-fidelity，SpCas9-HF1)、高特异(enhanced specificity，eSpCas9(1.1))和超精确(hyper-accurate Cas9，HypaCas9)Cas9蛋白。由于这些蛋白均为源自Cas9的突变体，可大大降低脱靶效应，安全性大为提高，因此优选这些蛋白。
在示例性实施方案中，本发明的gRNA和Cas蛋白由基因表达产生，并通过细胞外泌作用而直接进入本发明的膜性囊泡。在另外的示例性实施方式中，本发明可使用例如人工制备的Cas蛋白，并通过人工方式将其导入膜性囊泡内。
在优选的实施方案中，本发明的膜性囊泡包含gRNA和Cas蛋白，但是不包含用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因。例如，本发明的膜性囊泡不包含用于产生gRNA和/或Cas蛋白的任何表达载体或质粒。即，优选地，本发明的膜性囊泡具有确定量的gRNA和/或Cas蛋白，不能通过转录或翻译而产生新的gRNA或Cas蛋白。
在示例性实施方案中，本发明的具有基因编辑功能的膜性囊泡为细胞内源性外泌体，其通过细胞外泌的方式获得。因此，除了上述gRNA和Cas蛋白外，本发明的内部基质还可包含其他成分，例如，外泌体内通常含有的蛋白及mRNA、miRNA、lncRNA等。
除了上述gRNA和Cas蛋白以外，本发明的膜性囊泡还可包括其他成分，例如，用于引导膜性囊泡靶向特定位置或细胞的分子。这些分子可采用本领域已知的任何分子。
本发明的膜性囊泡具有较强的稳定性。例如，可在4℃条件下保存至少一周，优选2周。在-80℃条件下可保存更长时间。但尽量避免反复冻融。
本发明的具有基因编辑功能的膜性囊泡可通过本领域的任何方法制备。例如，人工合成的方法或者基于细胞培养的方法。鉴于RNA的稳定性相对差，人工合成的效率较低，优选基于细胞培养的方法。基于细胞培养的方法的具体说明参见下文。
[具有基因编辑功能的膜性囊泡的制备方法]
本发明的第二方面，提供具有基因编辑功能的膜性囊泡的制备方法。本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞的步骤；
(2)从所述工程细胞的培养液中分离得到外泌体的步骤；
其中，所述工程细胞包含产生gRNA和编码Cas蛋白的基因。
本发明中，步骤(1)中适于细胞生长的条件为本领域已知的条件，包括适当的培养基、温度和二氧化碳浓度等。例如在含10％FBS的培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。当收集外泌体时，则换用含10％无外泌体FBS的培养基进行培养，也包括其它无血清培养基。步骤(1)中的细胞需要具有分泌外泌体的功能。工程细胞是指通过基因工程手段操作而使细胞能够产生gRNA和/或Cas蛋白的改造过的细胞。细胞类型不特别限定，可以是动物细胞(例如猴细胞、鼠细胞等)或人细胞，其实例包括但不限于Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞等。本发明可使用上述细胞中的一种或多种，但不局限上述情形。
本发明中，步骤(2)所述的工程细胞的培养液是指细胞外部的液体，优选为培养上清。本发明的培养上清中包含从工程细胞分泌的膜性囊泡和培养基成分。步骤(2)的目的主要是从培养基成分等中分离出所需的膜性囊泡。步骤(2)中的分离有时也称作抽提或富集，其实例包括但不限于差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法等。步骤(2)的分离还可通过使用已知的试剂盒进行。优选地，使用差速离心法进行外泌体的抽提。在采用差速离心时，优选以低速离心和高速离心交替的方式进行，从而提高纯度。在示例性方法中，分离的具体实施步骤包括：收取细胞培养上清，在4℃下，依次800g离心5min，2000g离心10min；收取上清液，然后将收取的上清100,000g离心2h；弃去上清，加入适量的PBS重悬外泌体，再次100,000g离心2h；弃去上清，用适量的PBS重悬待用。
除了上述步骤(1)和(2)之外，本发明的制备方法还可包括其他步骤。例如，制备工程细胞的步骤，如将用于表达gRNA和/或Cas蛋白的基因表达载体导入细胞得到工程细胞的步骤。优选地，用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因位于同一载体中。例如，可用于针对不同靶基因的CRIPSR/Cas9表达质粒。
[药物组合物]
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包含本发明第一方面所述的膜性囊泡和可选地药物学可接受载体。膜性囊泡在上文进行了详细说明，在此不再赘述。下面详细说明药物学可接受载体。
本发明中，药物学可接受载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。
合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。
本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
[细胞内基因编辑的方法]
本发明的第四方面，提供一种用于在细胞内进行基因编辑的方法，本文有时简称为“本发明的基因编辑方法”，其包括使用本发明第一方面所述的膜性囊泡将CRISPR/Cas系统导入靶细胞的步骤。本发明的靶细胞是指需要进行基因编辑的细胞，例如，需要基因敲除的细胞。本发明的靶细胞可以与所得膜性囊泡的工程细胞相同，也可以与所述工程细胞不同。优选地，本发明的靶细胞与工程细胞不同，更优选地，靶细胞是机体内的活性细胞。
本发明的CRISPR/Cas系统是指主要由Cas蛋白和gRNA组成的能够发挥基因编辑功能的体系。
[膜性囊泡在制备药物中的用途]
本发明的第五方面，提供膜性囊泡在制备药物中的用途。本发明的药物中gRNA和Cas9蛋白能够特异性作用于靶DNA序列并发挥基因编辑功能。本发明的药物活性成分至少包括gRNA和Cas9蛋白。通过本发明的药物可用于针对感染性疾病病原体，例如HBV、HPV和HIV等；及由基因突变引起的疾病，例如单基因疾病。
实施例
一、CRIPSR/Cas9系统中的gRNA和Cas9蛋白可进入细胞内源产生的外泌体中
本研究采用针对不同靶基因的CRIPSR/Cas9表达质粒分别在HeLa和HuH7细胞中探索CRISPR/Cas9系统中的gRNA和Cas9蛋白是否可分泌至外泌体中。
针对不同靶基因的CRIPSR/Cas9表达质粒包括：针对乳头瘤病毒(HPV)基因的gRNA和Cas9表达载体(PX458-gHPV)(Shen C,et al.Int J Cancer.2017,141:540-548.)和针对HBV基因的gRNA和Cas9表达载体(PX458-gHBV1和PX458-gHBV2)(Wang J,et al.World JGastroenterol.2015,21:9554-9565；Wang J,et al.Theranostics.2017,7:3090-3105.)。各个gRNA序列在表1中列出。
表1 gRNA序列
Figure BDA0001875275580000121
首先，将PX458(Vector)和PX458-gHPV表达质粒分别转染至HeLa细胞中，细胞培养于含10％无外泌体FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体，并通过粒径分析和电镜观察所分离纯化的外泌体。结果显示，HeLa细胞培养上清中分离纯化的外泌体平均粒径为138.4d.nm(图1A)，并通过电镜观察到了典型杯状囊膜结构的外泌体(图1B)。然后，我们通过半定量PCR和western blot检测HeLa细胞分泌的外泌体中是否存在gHPV1和cas9蛋白。结果显示，gHPV1和Cas9蛋白均可进入HeLa细胞内源产生的外泌体中(图1C)。
同样，我们将PX458(Vector)和PX458-gHBV1表达质粒分别转染至HuH7细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体。结果显示，HuH7细胞培养上清中分离纯化的外泌体平均粒径为118.4d.nm(图1D)，电镜观察到了典型杯状囊膜结构的外泌体(图1E)，并发现gHBV1和Cas9蛋白均可进入HuH7细胞内源产生的外泌体中(图1F)。
另外，我们将PX458(Vector)和PX458-gHBV1表达质粒分别转染至HEK-293细胞和巨噬细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体。发现gHBV1和Cas9蛋白均可进入HEK293细胞和巨噬细胞内源产生的外泌体中(图1G，图1H)。
进一步，我们构建了PX458-gHBV1-T2A del表达质粒，该表达质粒是将PX458-gHBV1表达质粒中Cas9和绿色荧光蛋白(GFP)蛋白编码序列之间的P2A序列去除，进而表达Cas9-GFP融合蛋白。首先，将PX458质粒和PX458-gHBV1-T2A del表达质粒分别转染至HuH7细胞中，转染6小时后，更换新鲜培养基，其中一皿转染PX458-gHBV1-T2A del表达质粒的细胞培养基中加入终浓度为2.5μM的外泌体分泌抑制剂GW4869，另外两皿分别转染PX458质粒和PX458-gHBV1-T2A del表达质粒的细胞培养基中加入对照试剂DMSO，48小时后，收集细胞的培养上清，经外泌体提取试剂盒(Life Technology,USA)提取细胞培养上清中的外泌体。然后，采用脂质体纳米颗粒负载生物芯片(Tethered Cationic Lipoplex Nanoparticles,tCLN)在全内反射荧光(TIRF)显微镜下检测外泌体中是否存在gHBV1和Cas9-GFP融合蛋白。在本实验中，由于PX458质粒可表达HBV非特异的gRNA(GGGTCTTCGAGAAGACCT)，所以转染PX458质粒的细胞培养上清可作为检测gHBV1的阴性对照。同时，由于PX458质粒中Cas9和GFP蛋白编码序列之间的P2A序列，可分别翻译表达Cas9和GFP蛋白，所以转染PX458质粒的细胞培养上清可作为检测Cas9-GFP融合蛋白的阴性对照。结果显示，用带有CY5荧光基团(红光)标记的gHBV1特异性探针的tCLN生物芯片在TIRF显微镜下可特异性检测到HuH7细胞内源产生的外泌体中存在gHBV1，并且经GW4869处理后，gHBV1的水平均随着外泌体分泌的抑制而降低(图2A)。同样，在TIRF显微镜下证实融合GFP(绿光)的Cas9蛋白可特异性存在于HuH7细胞内源产生的外泌体中，并且经GW4869处理后，Cas9-GFP蛋白的水平均随着外泌体分泌的抑制而降低(图2B)。通过统计20个视野的荧光信号强度，进一步证实CRISPR/Cas9系统的gRNA和Cas9蛋白可随着细胞内源产生的外泌体分泌至细胞外(图2C和2D)。
二、外泌体中的gRNA和Cas9蛋白可进入靶细胞发挥基因编辑功能
为探索细胞内源产生的外泌体所携带的gRNA和Cas9蛋白是否可进入细胞发挥其基因编辑功能，我们首先将从HuH7细胞培养上清中浓缩和纯化的含有gHBV1和gHBV2的外泌体加入到转染1.2×HBV表达质粒(pBB4.5-1.2×HBV)的HuH7细胞中，通过PCR和测序分析评价外泌体中gRNA和Cas9蛋白的基因编辑功能。
结果如图3A所示，将含有gHBV1和gHBV2的外泌体加入到转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞后，两条gRNA可切割HBV基因形成小片段。进一步，我们将转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的HuH7细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞进行共孵育。结果显示，转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的HuH7细胞所分泌的含有gHBV1、gHBV2和Cas9蛋白的外泌体可进入转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞，并切割HBV基因形成小片段(图3B)。随后，我们将小片段PCR产物切胶纯化回收，并进行测序分析。测序结果显示，小片段为缺失两条gRNA特异性切割位点之间的HBV基因片段所形成的截短体(图3C)。我们将稳定表达PX458-gHPV1和PX458-gHPV2的HeLa细胞进行共孵育。结果显示，稳定表达PX458-gHPV1和PX458-gHPV2的HeLa细胞所分泌的含有gHPV1、gHPV2和Cas9蛋白的外泌体可进入HeLa细胞，并切割HPV基因形成小片段(图3D)。上述结果表明，细胞内源产生的外泌体中的gRNA和Cas9蛋白可进入细胞发挥基因编辑功能。在本研究之前，有报道认为由转染细胞得到的外泌体中Cas9蛋白是无活性的。本研究的结果与之前的结论完全相反，不仅证明了外泌体中的CRISPR/Cas系统具有活性，而且还可将该CRISPR/Cas系统引入靶细胞发挥基因编辑功能。
三、具有基因编辑功能的外泌体的大量制备
非洲绿猴肾细胞(Vero)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是目前生物制品生产制备领域最重要的表达或生产系统。两种细胞的大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。本实施例采用Vero和CHO细胞作为生产细胞来大量制备具有基因编辑功能的外泌体。
采用针对乙型肝炎病毒(HBV)基因的gRNA和Cas9表达载体(PX458-gHBV1和PX458-gHBV2)(Wang J,et al.World J Gastroenterol.2015,21:9554-9565；Wang J,etal.Theranostics.2017,7:3090-3105.)。
首先，我们将PX458(Vector)和PX458-gHBV1表达质粒分别转染至Vero细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体，并通过粒径分析和电镜观察所分离纯化的外泌体。结果显示，Vero细胞培养上清中分离纯化的外泌体平均粒径为134.9d.nm(图4A)，并通过电镜观察到了典型杯状囊膜结构的外泌体(图4B)。然后，我们通过半定量PCR和western blot检测Vero细胞分泌的外泌体中是否存在gHBV1和cas9蛋白。结果显示，gHBV1和Cas9蛋白均可进入Vero细胞内源产生的外泌体中(图4C)。同样，我们将PX458(Vector)和PX458-gHBV1表达质粒分别转染至CHO细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清。经超速离心，浓缩纯化出外泌体。结果显示，gHBV1和Cas9蛋白也均可进入CHO细胞内源产生的外泌体中(图4D)。
四、具有基因编辑功能的外泌体应用于在靶细胞内进行基因编辑
首先评价Vero等工程细胞分泌的外泌体可否进入其它靶细胞。我们将纯化浓缩的Vero细胞所产生的外泌体用PKH26进行染色，加入经Hoechst33342染色的靶细胞(HuH7细胞)中孵育，并用4％多聚甲醛固定，随后用TCS-SP8 STED 3X仪器进行共聚焦成像。结果显示，Vero细胞分泌的外泌体可进入HuH7细胞中(图5A)。
进一步，我们将转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的Vero细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞进行共孵育。结果显示，转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的Vero细胞所分泌的含有gHBV1、gHBV2和Cas9蛋白的外泌体可进入转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞，并切割HBV基因形成小片段(图5B)。
上述结果表明，Vero细胞产生的带有gRNA和Cas9蛋白的外泌体可进入靶细胞发挥基因编辑功能。
同样，我们将转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的CHO细胞和转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞进行共孵育。结果显示，转染PX458-gHBV1和PX458-gHBV2质粒的CHO细胞所分泌的含有gHBV1、gHBV2和Cas9蛋白的外泌体可进入转染pBB4.5-1.2×HBV表达质粒的HuH7细胞，并切割HBV基因形成小片段(图5C)。
同时，上述结果还表明，CHO细胞产生的带有gRNA和Cas9蛋白的外泌体也可进入靶细胞发挥基因编辑功能。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (7)

1.通过细胞外泌获得的膜性囊泡在制备用于递送CRISPR/Cas9系统进而实现对靶细胞基因编辑的药物递送系统中的用途，其特征在于，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含导向RNA即gRNA，和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；
所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：
(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；
(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；
其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的直径为30-1000nm，密度为1.13-1.28g/m1。
4.通过细胞外泌获得的膜性囊泡用于制备药物的用途，其特征在于，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含gRNA和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；
所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：
(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；
(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；
其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。
6.一种用于在细胞内进行基因编辑的非治疗方法，其包括使用通过细胞外泌获得的膜性囊泡递送CRISPR/Cas9系统进而实现对靶细胞基因编辑的步骤，其中，所述膜性囊泡包括生物相容性外壳和由所述生物相容性外壳包裹的内部基质，其中，所述生物相容性外壳具有脂质双层结构，其能够与靶细胞表面接触并使至少所述内部基质进入所述靶细胞内；所述内部基质包含gRNA和Cas9蛋白，但不包含用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因，所述gRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且所述gRNA能够与所述Cas9蛋白形成功能性复合体；
所述膜性囊泡通过包括下述步骤的方法制备得到：
(1) 在适于细胞生长的条件下培养具有外泌功能的工程细胞使得gRNA和Cas9蛋白进入外泌体的步骤；
(2) 从所述工程细胞的培养液中分离外泌体的步骤；
其中，步骤(1)中的所述工程细胞选自Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞中的至少一种，且包含产生gRNA和编码具有活性的Cas9蛋白的基因。
7.根据权利要求6所述的用于在细胞内进行基因编辑的非治疗方法，其特征在于，所述膜性囊泡的制备方法进一步包括将用于表达gRNA和/或编码Cas9蛋白的基因导入细胞得到所述工程细胞的步骤。
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