CN116286838A - 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途 - Google Patents

一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116286838A
CN116286838A CN202211404872.5A CN202211404872A CN116286838A CN 116286838 A CN116286838 A CN 116286838A CN 202211404872 A CN202211404872 A CN 202211404872A CN 116286838 A CN116286838 A CN 116286838A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
lipid
acid molecule
mrna
prostate cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211404872.5A
Other languages
English (en)
Inventor
查高峰
徐远东
夏恒
张士强
庞俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Hongxin Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen filed Critical Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen
Priority to CN202211404872.5A priority Critical patent/CN116286838A/zh
Publication of CN116286838A publication Critical patent/CN116286838A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/884—Vaccine for a specifically defined cancer prostate

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途。本发明的核酸疫苗包括表达PSMA、PSA、PAP、ERG中的一种或几种抗原的非自复制核酸分子，或上述核酸分子与脂质纳米颗粒的脂质体复合物。本发明的核酸疫苗可以通过脂质纳米颗粒递送系统将上述肿瘤相关抗原中的一种或几种mRNA递送至机体，进而瞬时表达肿瘤相关抗原，激活机体的免疫反应，促进CD8阳性T细胞浸润以及肿瘤微环境中IFN‑γ的分泌，起到预防或杀伤肿瘤的效果，且无明显毒副作用。此外，本发明的核酸疫苗载体递送效率高效，只需低剂量即可有效预防前列腺癌的发生，或杀伤前列腺癌细胞，具有良好的应用前景。

Description

一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途。
背景技术
前列腺癌是男性最常见的泌尿系恶性肿瘤，肿瘤相关死亡人数排在所有肿瘤中的第二位。前列腺癌的治疗方式主要包括手术、放疗、化疗和雄激素剥夺治疗，但疾病最终会进展为去势抵抗型前列腺癌，此时患者的预期生存时间不足2年。因此，需要新的治疗方法来控制疾病进展，改善患者的预后。
免疫疗法可作为前列腺癌患者的另一选择。尽管前列腺癌低肿瘤突变负荷及复杂的肿瘤微环境导致其成为免疫学上的“冷肿瘤”，但获批用于治疗前列腺癌的疫苗Sipuleucel-T可以延长患者四个月左右的中位生存时间，这提示免疫疗法在前列腺癌治疗中具有巨大的潜力。此外，还有anti-PD1、DNA疫苗、痘病毒疫苗、细菌疫苗等多种免疫疗法用于治疗前列腺癌的研究，但总体疗效不满意，且存在费用昂贵或制作过程繁琐等缺点，其中DNA疫苗还存在导致机体突变的风险。可见，找到更有效刺激机体免疫且安全性良好、制作工艺简单的免疫疗法对前列腺癌患者具有重大意义。
以mRNA为基础的核酸疫苗通过载体运输到宿主细胞，在核糖体内产生蛋白以激活免疫实现治疗疾病的目的。mRNA不整合到宿主细胞基因组中，因此不存在突变的风险；只需目的基因的mRNA序列即可在体外合成mRNA，制作过程较简单、安全，容易实现批量生产；而且在宿主细胞表达的蛋白可同时激活细胞免疫和体液免疫。因此，mRNA疫苗是治疗肿瘤的一个理想选择。然而，mRNA极不稳定，分子较大，具有亲水性以及带有负电荷，因此裸露的mRNA无法通过亲脂的细胞膜，需要稳定的载体将mRNA运输至宿主细胞。目前，常见的递送载体主要包括脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)、聚合物基纳米颗粒、脂质-聚合物杂化体，其中LNP具备生物相容性等特点，可以保护mRNA不被降解，被广泛作为mRNA的载体。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)是在前列腺癌中特异表达的蛋白，可作为机体免疫系统攻击的特定目标。CV9103是包含PSMA、PSCA、PSA、STEAP1四个靶点的mRNA疫苗，并包含自我增强的佐剂，I期的临床试验结果表明该疫苗激活了机体的免疫，超过90％患者出现了PSA水平的下降；但是CV9103仍存在使用剂量大，患者耐受性差，免疫原性差，安全性差，疗效差等问题。其中，缺乏安全有效的递送系统是CV9103疫苗疗效欠佳的主要原因之一。因此，需要研究免疫原性更强、安全性良好的前列腺癌mRNA疫苗。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明基于阳离子脂质体递送系统，以经典的前列腺癌相关抗原PSMA、PSA、PAP为靶点，并增加了前列腺癌中高表达的相关抗原ERG，制备用于前列腺癌的核酸疫苗，使用低剂量的疫苗即可激活机体免疫，安全性好，制作工艺简单，容易实现产业化。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面提供了一种非天然存在的核酸分子，所述核酸分子包括以下至少一种非自复制的核苷酸：
编码PSMA的核苷酸、编码PSA的核苷酸、编码PAP的核苷酸、编码ERG的核苷酸。
所述核酸分子(DNA或mRNA)包含编码PSMA、PSA、PAP、ERG中的至少一种抗原的编码区，所述编码区包含一个或多个开放阅读框(ORF)，并且其中至少一个ORF编码蛋白质。同时，所述核酸分子还包含5’-帽结构、5’-UTR、3’-聚核苷酸序列以及3’-UTR中的至少一种。其中，5’-UTR为10-200个核苷酸，优选的50-100个核苷酸；3’-UTR优选的50-120个核苷酸；3’-聚核苷酸序列优选地100-120个A，进一步优选为110-120个A。
优选地，编码PSMA的核酸分子具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，编码PSA的核酸分子具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，编码PAP的核酸分子具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，编码ERG的核酸分子具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供了一种非自复制核酸的脂质体复合物，所述脂质体复合物包括第一方面所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂。
优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的质量比为1：1-50：1。
优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒为可质子化的阳离子脂质纳米颗粒；按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包含15-49％可质子化的阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和2-5％表面活性剂。
优选地，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPG、DOPS，所述表面活性剂包括PEG-DMG、PEG-DSPE。更优选地，所述结构脂质为胆固醇，所述辅助脂质为DSPC，所述表面活性剂选自PEG2000-DMG、PEG2000-DSPE、C18-PEG2000，具体选自PEG2000-DMG。
本发明第三方面提供了第二方面所述的非自复制核酸的脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质、表面活性剂溶于有机溶剂中，得到有机相；
S2、将核酸分子溶于缓冲液中，得到水相；
S3、将有机相和水相充分混匀后得到混合液，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂后制得非自复制核酸的脂质体复合物。
优选地，所述可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂在有机溶剂中的总浓度为1-30mg/mL，所述核酸分子在水相中的浓度为0.5-1.5mg/mL。更优选地，所述可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂在有机溶剂中的总浓度为12-15mg/mL。
本发明第四方面提供了第一方面所述的核酸分子，和/或第二方面所述的非自复制核酸的脂质体复合物在制备防治前列腺癌的药物中的应用。
优选地，防治前列腺癌的药物包括预防前列腺癌的疫苗。
经研究发现，本发明设计的核酸疫苗(PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA)可有效激活机体的免疫系统，特别是促进CD8阳性T细胞浸润，以及肿瘤微环境中IFN-γ的分泌，起到预防或杀伤肿瘤的效果，且无明显毒副作用。更优选地，所述疫苗的给药方式包括雾化给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、眼部给药。
优选地，所述有机溶剂包括但不限于乙醇，所述缓冲液包括但不限于柠檬酸盐缓冲液、醋酸钠溶液。更优选地，所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠酸性溶液或柠檬酸-柠檬酸钠酸性溶液。
优选地，所述有机相和水相的体积比为1：2-6。更优选地，所述有机相和水相的体积比为1：3。
优选地，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂，具体方法为：采用PSB缓冲液将混合液稀释10-50倍(更优选10-20倍)，再浓缩。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种预防和治疗前列腺癌的核酸疫苗，该疫苗包括表达PSMA、PSA、PAP、ERG中的一种或几种抗原的非自复制核酸分子，或上述核酸分子与阳离子脂质纳米颗粒的脂质体复合物(mRNA-LNP)。本发明设计的核酸疫苗可以通过脂质纳米颗粒递送系统将上述肿瘤相关抗原中的一种或几种mRNA递送至机体，进而瞬时表达肿瘤相关抗原，激活机体的免疫反应，促进CD8阳性T细胞浸润以及肿瘤微环境中IFN-γ的分泌，起到预防或杀伤肿瘤的效果，且无明显毒副作用。此外，本发明的核酸疫苗载体递送效率高效，只需低剂量即可有效预防前列腺癌的发生，或杀伤前列腺癌细胞，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为PSMA(FOLH1)、PSA(KLK3)、PAP(ACP3)、ERG的质粒图谱；
图2为PSMA、PSA、PAP、ERG的电泳图；
图3为PSMA mRNA的完整性检测结果；
图4为人源性及鼠源性PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs的粒径、PDI及电位数据；
图5为脂质纳米颗粒对mRNA的包封率数据；
图6为PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs转染HeLa细胞后相关蛋白的翻译情况；
图7为mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs转染HeLa细胞后相关蛋白的翻译情况；
图8为单用mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs疫苗的治疗结果；
图9为mPSMA、mPSA、mPAP、mERG联用mRNA-LNPs疫苗治疗结果；
图10为疫苗增加肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润(红色信号)及IFN-γ的分泌(紫色信号)；
图11为单用mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs疫苗的预防性实验结果；
图12为联用mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs疫苗的预防性实验结果；
图13为PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs单用或联用促进T细胞杀伤作用的体外杀伤实验结果；
图14为mRNA-LNPs疫苗的安全性评价结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1 mRNA的制备
(1)构建PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA模板质粒:
将含有启动子，5’/3’-UTR(来自modorna新冠疫苗)与polyA结构的序列连接至pUC57载体质粒的HindIII和EcoRI之间，此步骤委托通用生物(安徽)股份有限公司完成，得到能高效翻译表达mRNA的通用型框架载体质粒，命名为pIVT。
T7启动子(SEQ ID NO：1)：TAATACGACTCACTATA；
5’UTR(SEQ ID NO：2)：
Figure BDA0003936578620000051
3’UTR(SEQ ID NO：3)：
Figure BDA0003936578620000052
plyA(120)(SEQ ID NO：4)：
Figure BDA0003936578620000053
(2)在步骤(1)构建的pIVT空载体的基础上，对候选人源抗原PSMA(NM_004476.3)、PSA(NM_001648.2)、PAP(NM_001134194.2)、ERG(NM_001136154.1)基因序列进行优化合成，即通过无缝克隆技术(具体操作方法，见碧云天无缝克隆试剂盒)，将这四个基因分别克隆到步骤(1)构建的pIVT通用型框架载体质粒(图1)，此步骤委托通用生物(安徽)股份有限公司完成。优化后的序列如下：
PSMA优化后的序列(SEQ ID NO：5)：
Figure BDA0003936578620000054
Figure BDA0003936578620000061
PSA优化后的序列(SEQ ID NO：6)：
Figure BDA0003936578620000071
PAP优化后的序列(SEQ ID NO：7)：
Figure BDA0003936578620000072
Figure BDA0003936578620000081
ERG优化后的序列(SEQ ID NO：8)：
Figure BDA0003936578620000082
Figure BDA0003936578620000091
(3)以(2)中的质粒为模板，采用天根生物的质粒大提试剂盒(DP117，步骤参见说明书)，通过EcoRI限制性内切酶(近岸蛋白)过夜酶切，最后通过DNA纯化磁珠(诺唯赞，RNase Free)进行线性化质粒的分离纯化，最后溶解于无酶水中备用。
(4)体外转录：1mL体外转录体系：
Figure BDA0003936578620000092
混匀后置于37℃反应1小时，加入75uL的Dnase I在37℃消除DNA半小时，过程中取出混匀一次，最后加入1.8倍体积的RNA纯化磁珠(诺唯赞)将合成好的RNA纯化。
(5)RNA加帽反应：10mL加帽反应体系：
Figure BDA0003936578620000093
轻弹混匀后置于37℃反应30分钟，中间取出混匀一次，最后加入0.5倍体积的RNA纯化磁珠(诺唯赞)将加帽后的RNA纯化。
(6)Oligo(dT)25亲和填料(Thermo)纯化去除转录中断和降解的RNA产物，具体纯化的步骤如下：
1)使用5倍柱体积的缓冲液(10mm Tris-HCl，0.5M NaCl,1mm EDTA,pH 7.4)平衡色谱柱。
2)将通过RNA亲和磁珠(诺维赞)纯化的RNA样品溶解于缓冲液(10mM Tris-HCl,0.5M NaCl,1mM EDTA,pH 7.4)中。
3)将样品以50-150cm/h的速度加载到色谱柱上，色谱柱温控制在65℃。
4)用额外的5倍柱体积的缓冲液(10mM Tris-HCl,0.5M NaCl,1mm EDTA,pH 7.4)洗涤色谱柱，然后用不同盐离子缓冲液(含10mM Tris-HCl,100-300mm NaCl,1mm EDTA,pH7.4)洗脱与填料结合不稳的杂质，直到导电率稳定。
5)使用无酶无菌水洗脱步骤(4)的洗脱液，UV 260nm主峰即为带有polyA结构序列的mRNA，对收集的mRNA样品通过使用RNA亲和磁珠进行纯化，也可以等效放大后采用切向流等浓缩纯化。
(7)mRNA质量检测：首先，通过琼脂糖凝胶电泳对合成的PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA进行初步的质量检测，具体过程为：将0.5ug各mRNA加入2×RNA loading buffer混匀，85℃加热变性2分钟后，立刻置于冰上2分钟，然后在浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中通过100V电泳30min，使用RNA marker(Thermo，SM1821)来指示样品RNA大小，结果见图2；提示体外转录的mRNA质量良好。同时，还使用毛细管电泳仪(安捷伦5200)对制备的mRNA(以PSMA为例)进行完整性检测，结果见图3，提示合成的mRNA完整性良好。同理制备PSMA、PSA、PAP、ERG对应的鼠源性mPSMA:(NM_016770.3)、mPSA(NM_008455.3)、mPAP:(NM_207668.2)、mERG(NM_133659.3)的mRNA序列，用于后续的动物实验。
mPSMA优化后的序列(SEQ ID NO：9)：
Figure BDA0003936578620000101
Figure BDA0003936578620000111
mPSA优化后的序列(SEQ ID NO：10)：
Figure BDA0003936578620000112
/>
Figure BDA0003936578620000121
Figure BDA0003936578620000131
mPAP优化后的序列(SEQ ID NO：11)：
Figure BDA0003936578620000132
mERG优化后的序列(SEQ ID NO：12)：
Figure BDA0003936578620000133
/>
Figure BDA0003936578620000141
实施例2 mRNA-LNPs脂质纳米颗粒的制备及表征
(1)将可质子化的阳离子脂质(E7C71A9，具体见专利公开号“CN114105799A”)与结构脂质(胆固醇)、辅助脂质(DSPC)、表面活性剂(PEG2000-DMG)分别以47.5：41：10：1.5的摩尔质量比溶解在无水乙醇中，四组分均匀混合后，添加无水乙醇使阳离子脂质浓度在0.01M-0.5M范围内。以称取10mg阳离子脂质、4mg胆固醇、4mg辅助脂质、2.5mg表面活性剂制备为例，四组分加入无水乙醇的量分别为200uL、200uL、400uL、100uL；再抽取84.25uL阳离子脂质、126.70uL胆固醇、126.49uL辅助脂质、24.1uL表面活性剂加入到318.46uL的无水乙醇中制得680uL体积的乙醇相溶液。然后使用微流控制备系统(迈安纳，INano E)使所得的乙醇相溶液和溶解有mRNA的醋酸-醋酸钠酸性溶液(pH＝5.0,25mM)或柠檬酸-柠檬酸钠酸性溶液(pH＝5.0,25mM)以1:3的体积比在微流控芯片中以12mL/h的流速混合，制得脂质纳米颗粒的粗溶液，再将所得溶液用PBS溶液稀释10倍，用15mL或50mL超滤离心管(Millipore，100K)在4℃下以1.5krcf的转速超滤15min，共超滤三次，最终使可离子化脂质与疫苗mRNA的摩尔比约为6:1，制得mRNA-LNPs脂质纳米颗粒。
(2)粒径、PDI及电位的表征：所制备的脂质纳米颗粒的粒径和PDI通过Nano-ZSZEN3600(Malvern)测定。取mRNA-LNPs脂质纳米颗粒溶液20uL(RNA浓度为100μg/mL)进行粒径或电位测量，稳定时间为120s，循环三次，每次循环10次。结果如图4所示，提示所制备的mRNA-LNPs脂质纳米颗粒粒径在75nm左右，PDI小于0.2，电位为-1.58至-0.9192mV。
(3)包封率测定：参照Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒标准规程进行测定，分别检测x-100破乳前后的mRNA浓度，计算可得LNP的包封率，大致过程为：分别取2uL超滤后的mRNA-LNPs脂质纳米颗粒样品加入到498uL 1×TE和498uL 2％浓度Triton-100溶液，加入发光液后用酶标仪分析吸光度，根据标准曲线计算mRNA浓度。结果提示样品包封率大于90％，R2大于0.99(图5)，核酸浓度在0.15mg/mL左右。
(4)Western blot检测PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA在细胞中的表达：采用含10％FBS的DMEM培养基将购于武汉普诺赛公司的HeLa细胞培养于T25培养瓶，培养条件为37℃，CO2浓度为5％。细胞密度达到80％后，胰酶消化细胞3min，含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，完全培养基重悬、计数，以2×105/孔的量接种于12孔板，按照每孔1ug mRNA的比例进行细胞转染，24小时后收集细胞裂解液上清，加入5×SDSloading在100℃变性5分钟后，进行Western-blot实验，结果见图6。同理验证mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs的翻译效率。测试结果表明上述mRNA均能有效翻译成蛋白(图7)。
实施例3 mRNA疫苗作用效果的动物实验
1、mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs免疫雄性C57BL/6小鼠，评价疫苗治疗肿瘤的效果
4-5周龄雄性C57BL/6小鼠购自广东省实验动物中心，种瘤记为第0天，种瘤部位位于小鼠背部右后皮下；分别于第4、9、13天采用mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs及联用mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs(比例为1:1:1:1)进行免疫，用量为0.15mg/kg；并以PBS组作为对照，免疫注射部位为小鼠右后肢，注射方式为肌注，注射体积为100uL。随后观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，计算方式为：体积V＝1/2长×宽×宽。结果提示本发明的疫苗均能有效抑制肿瘤的生长。具体步骤如下：
(1)将鼠源性前列腺癌细胞株RM1细胞(购于武汉普诺赛公司)，培养于T25培养瓶，细胞密度达80％左右时，用胰酶消化细胞2min，含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，完全培养基重悬细胞并计数，种瘤细胞数为2×105/只，约第4天皮下瘤大小约50mm3，然后将小鼠随机分成6组，PBS组、mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs组以及mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA联用组，每组6只小鼠。
(2)第4、9、13天免疫小鼠，隔天观察、测量肿瘤体积
结果提示mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs组及联用组肿瘤体积明显小于PBS组，其中mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA联用组效果最佳(图8、图9)。免疫荧光实验发现mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs组肿瘤组织中的CD8阳性T细胞浸润，以疫苗组最为显著，提示本发明制备的mRNA疫苗可有效改善肿瘤微环境，增加杀伤性T细胞的浸润。此外，本发明制备的mRNA疫苗还可以促进肿瘤微环境中IFN-γ的分泌(图10)。
2、mPSMA、mPSA、mPAP、mERG mRNA-LNPs疫苗免疫雄性C57BL/6小鼠，评价疫苗预防肿瘤发生的效果。
小鼠接种第一针疫苗记为day1，分别于day1、day7接种2次疫苗，用量为0.15g/kg；注射部位为小鼠右后肢，注射方式为肌注，注射体积为100uL。于day14天种瘤(鼠源性前列腺癌细胞株RM1细胞)，种瘤部位位于小鼠背部右后皮下；随后观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，计算方式为：体积V＝1/2长×宽×宽。结果提示单用或联用mPSMA、mPSA、mPAP、mERGmRNA-LNPs疫苗均可有效预防肿瘤生长(图11、12)。
3、体外杀伤实验评估PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs激活效应T细胞的能力。
(1)收集前列腺癌患者外周血及其前列腺癌组织标本(样本来自中山大学附属第七医院，获得相关伦理委员会审批同意)，获取人外周血单核细胞及前列腺癌原代细胞。提取外周血单核细胞备用，大致如下：
1)在短中管中加入适量淋巴细胞分离液(白鲨易(biosharp)，BL590)。2)取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，然后水平离心2000rpm×20分钟。3)离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。4)用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。5)末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞，取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。6)细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率。
(2)制备前列腺癌原代细胞：在前列腺癌碎组织块中加入0.25％胰蛋白酶或2000U/mL胶原酶，在37℃水浴中消化30min以上，离心取上清，用4℃预冷的HBSS缓冲液(赛业生物(Cyagen)，HBSS-10001)洗3次，DMEM完全培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数，得到浓度为(5-10)×108个/L的细胞悬液，最后将细胞接种在含有10％小牛血清的RPMI-1640或DMEM中，在37℃、5％CO2下分瓶培养。
(3)制备人源性树突状细胞、T细胞及原代前列腺癌细胞，评估PSMA、PSA、PAP、ERGmRNA-LNPs对机体免疫系统的激活作用。
采用人源IL-4、GM-CSF(Peprotech)诱导外周血来源的单核细胞向树突状细胞分化，工作浓度为800U/mL，7天后收集悬浮及半贴壁细胞用于后续实验。通过CD3(MiltenyiBiotec)分选的方式从人单核细胞中的收集T淋巴细胞。然后将PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs转染树突状细胞2-12小时后与T细胞共培养18-24小时，T细胞与树突状细胞的比例为4：1，细胞用RPMI-1640培养液培养，培养基包含60ng/mL IL-21(Peprotech)和3000IU/mLIL-2(Peprotech)。并用0.5uMCFSE染料(APExBIO)标记前列腺癌原代细胞，与上述效应细胞共培养后(效应细胞与靶细胞的比例为50：1)，收集细胞，PI染料标记死细胞，流式分析提示CFSE及PI双阳性的细胞即为被效应细胞特异性杀伤的细胞(图13)。上述结果表明mRNA-LNPs有效激活树突状细胞并诱导有效激活T细胞免疫。
5、PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA-LNPs对机体的安全性评价。
无荷瘤小鼠(4-5周龄雄性C57BL/6小鼠)注射两针疫苗(mPSMA、mPSA、mPAP、mERGmRNA-LNPs)后第三天收集小鼠血清检测肝功能、肾功能等指标，对照组则注射PBS。结果提示疫苗对肝肾功能等指标无明显影响(图14)。
综上可见，本发明设计的核酸疫苗(PSMA、PSA、PAP、ERG mRNA)可有效激活了机体的免疫系统，特别是促进CD8阳性T细胞浸润，以及肿瘤微环境中IFN-γ的分泌，只需低剂量(0.15mg/kg)即可起到预防或杀伤肿瘤的效果(现有的疫苗浓度约为0.75mg/kg，具体见“Miao L,Li L,Huang Y,Delcassian D,Chahal J,Han J,Shi Y,Sadtler K,Gao W,Lin J,Doloff JC,Langer R,Anderson DG.Delivery of mRNA vaccines with heterocycliclipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cellactivation.”)，且无明显毒副作用，具有良好的应用前景。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种非天然存在的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括以下至少一种非自复制的核苷酸：
编码PSMA的核苷酸、编码PSA的核苷酸、编码PAP的核苷酸、编码ERG的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种非天然存在的核酸分子，其特征在于，编码PSMA的核酸分子具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，编码PSA的核酸分子具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，编码PAP的核酸分子具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，编码ERG的核酸分子具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
3.一种非自复制核酸的脂质体复合物，其特征在于，所述脂质体复合物包括权利要求1或2所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的一种非自复制核酸的脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的质量比为1：1-50：1。
5.根据权利要求3所述的一种非自复制核酸的脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒为可质子化的阳离子脂质纳米颗粒；按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包含15-49％可质子化的阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和2-5％表面活性剂。
6.根据权利要求4所述的一种非自复制核酸的脂质体复合物，其特征在于，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPG、DOPS，所述表面活性剂包括PEG-DMG、PEG-DSPE。
7.权利要求3-6任一项所述的非自复制核酸的脂质体复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质、表面活性剂溶于有机溶剂中，得到有机相；
S2、将核酸分子溶于缓冲液中，得到水相；
S3、将有机相和水相充分混匀后得到混合液，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂后制得非自复制核酸的脂质体复合物。
8.根据权利要求7所述的非自复制核酸的脂质体复合物的制备方法，其特征在于，所述可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂在有机溶剂中的总浓度为1-30mg/mL，所述核酸分子在水相中的浓度为0.5-1.5mg/mL。
9.权利要求1或2所述的核酸分子，和/或权利要求3-6任一项所述的非自复制核酸的脂质体复合物在制备防治前列腺癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，防治前列腺癌的药物包括预防前列腺癌的疫苗。
CN202211404872.5A 2022-11-10 2022-11-10 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途 Pending CN116286838A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211404872.5A CN116286838A (zh) 2022-11-10 2022-11-10 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211404872.5A CN116286838A (zh) 2022-11-10 2022-11-10 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116286838A true CN116286838A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86789333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211404872.5A Pending CN116286838A (zh) 2022-11-10 2022-11-10 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286838A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5981615B2 (ja) 工学操作された核酸の送達および製剤
AU2016264363B2 (en) Cancer vaccine comprising mRNA encoding a M-like-protein
US9844508B2 (en) Tumor vaccine and method for producing the same
CN109528653B (zh) 具有基因编辑功能的膜性囊泡及其制备方法、药物组合物和用途
CN115227674B (zh) 包封的溶瘤病毒遗传物质及其应用
WO2023051701A1 (zh) 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗
WO2023109657A1 (zh) 一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法
CN112533939B (zh) 一种基于减毒李斯特菌激活的抗原提呈细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用
CN117797250A (zh) 个体化mRNA组合物、载体、mRNA疫苗及其应用
CN105087648A (zh) 携带mage-a3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
CN115103912A (zh) 一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用
CN116286838A (zh) 一种预防及治疗前列腺癌的mRNA疫苗及其制备方法与用途
CN113577259B (zh) 组合物在制备用于抑制或治疗肿瘤的药物中的应用
WO2023137946A1 (zh) Ccl13的用途
CN117965550A (zh) 一种靶向CD73的mRNA药物及其制备方法与应用
Liu et al. Advances and prospects of mRNA vaccines in cancer immunotherapy
CN114053294A (zh) miR-150及负载miR-150模拟物的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用
CN105087649A (zh) 携带muc-1抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用
CN112522216A (zh) 重组腺相关病毒AAV-gas6及应用
WO2018204234A1 (en) Multi-indication mrna cancer immunotherapy
CN117482252A (zh) 一种药物组合物及其制备方法和应用
CN115820645B (zh) 制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途
CN116655749A (zh) 一种EBV的Rta截短mRNA相关疫苗及其制备方法与应用
CN117431201A (zh) 一种pcsk9纳米抗体光敏工程菌及在抗肿瘤中的应用
CN116355858A (zh) 一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230825

Address after: Room 301 and 401, Building C5, No. 459 Qiaokai Road, Fenghuang Community, Guangming District, Shenzhen City, Guangdong Province, 518107

Applicant after: Shenzhen Hongxin Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 518038 No. 628, Zhenyuan Road, Xinhu street, Guangming District, Shenzhen, Guangdong

Applicant before: Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat sen University (Shenzhen)

TA01 Transfer of patent application right