CN116355858A - 一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于递送CRISPR‑Cas9的工程化细胞外囊泡及其制备方法和用途。本发明利用蓝光诱导隐花色素2及其配体蛋白CIBN的可控结合与解离，通过脂酰化修饰提高Cas9蛋白在细胞外囊泡中的水平，并利用病毒糖蛋白包装细胞外囊泡，促进其摄取后受体细胞中Cas9蛋白的入核过程，进而提高细胞外囊泡递送的基因编辑效率，并在细胞及动物水平靶向清除HBV。

Description

一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡及其制备方 法和用途
技术领域
图一本发明涉及药物递送领域，具体地涉及一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡及其制备方法和用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范围内主要的公共卫生问题。2019年全球约有2.96亿慢性HBV感染者，我国目前约有7000万慢性HBV感染者，其中2000-3000万为慢性乙型肝炎患者，进展为肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌等终末期肝病的风险较高。共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是病毒复制模板，也是慢性HBV感染难以清除的原因。HBV复制过程中的随机整合可能会增加肝细胞癌发生风险，且整合片段表达的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)会抑制免疫细胞功能。
目前，临床上用于治疗HBV感染的药物主要有核苷(酸)类似物(nucleos(t)ideanalogues，NAs)及干扰素-α(interferon α，IFN-α)两类，可高效抑制病毒复制，但无法精确靶向感染肝细胞核内的cccDNA及整合病毒DNA片段，因此CHB(Chronic Hepatitis B)患者的临床治愈率普遍较低，亟需开发新型抗病毒疗法。
规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)是存在于细菌和古细菌基因组中高度保守的DNA重复序列，其附近存在编码CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)的基因，可介导针对噬菌体等外源DNA的适应性免疫反应。目前最常用的CRISPR/Cas9基因编辑系统由向导RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9蛋白组成，gRNA与目标基因组序列互补，可引导Cas9蛋白识别原型间隔序列毗邻基序(protospace adjacent motif，PAM)并实现特异性编辑。CRISPR/Cas9系统可靶向破坏cccDNA及整合病毒DNA片段，是极具前景的新型抗病毒疗法，但缺乏安全且高效的递送载体，临床应用受限。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明进行了深入研究，通过细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)在细胞间递送具有基因编辑活性的Cas9蛋白和gRNA，并通过优化大大提高负载和递送效率。此外，本发明通过病毒包装蛋白加速Cas9蛋白入核过程，进而提高EVs递送的基因编辑效率，并在细胞及动物水平靶向清除HBV。至少部分地基于上述研究完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其包括脂质双分子层和CRISPR-Cas9基因编辑元件，其中所述CRISPR-Cas9基因编辑元件通过蓝光诱导的二聚化系统与所述脂质双分子层连接。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，所述CRISPR-Cas9基因编辑元件包括sgRNA和Cas蛋白，其中所述sgRNA靶向病毒的基因片段。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，蓝光诱导的二聚化系统包括隐花色素2及其配体蛋白。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，所述Cas蛋白与隐花色素2连接，所述配体蛋白通过锚定肽与所述脂质双分子层连接。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，所述锚定肽具有脂酰化修饰，优选具有肉豆蔻酰化及棕榈酰化位点。
本发明的第二方面，提供一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其由转染了重组表达载体的工程化细胞经表达和分离得到，所述重组表达载体至少包括第一重组质粒和第二重组质粒，其中所述第一重组质粒包括靶向病毒基因片段的sgRNA以及表达Cas蛋白和隐花色素2的核酸序列，所述第二重组质粒包括表达配体蛋白和锚定肽的核酸序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白或其突变体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其中，所述宿主细胞包括Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞。
本发明的第三方面，提供一种用于递送CRISPR-Cas9的系统，其包括本发明所述的工程化细胞外囊泡和病毒类包装载体。
本发明的第四方面，提供一种工程化细胞外囊泡的制备方法，其包括以下步骤：
(1) 构建重组表达载体：将CRISPR-Cas9基因编辑元件与隐花色素2的核酸序列连接，以及将用于与所述隐花色素2结合的配体蛋白与锚定肽的核酸序列连接分别构建重组质粒；
(2) 转染至宿主细胞并进行培养，其中使用蓝光进行诱导；
(3) 分离工程化细胞外囊泡。
在某些实施方案中，根据本发明所述的工程化细胞外囊泡的制备方法，其中，所述方法进一步包括使用病毒类包装载体的步骤。
本发明的第五方面，提供一种用于在细胞内进行基因编辑的方法，其包括使用根据本发明的工程化细胞外囊泡向靶细胞内递送CRISPR-Cas系统的步骤。
本发明的第六方面，提供试剂在制备用于改善或治疗病毒相关疾病的药物中的用途，其中，所述试剂包括本发明所述的工程化细胞外囊泡。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述gRNA和Cas9蛋白能够特异性作用于靶DNA序列并发挥基因编辑功能。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述靶DNA序列为HBV基因组。
本研究利用蓝光诱导隐花色素2(cryptochrome 2，CRY2)及其配体蛋白CIBN的可控结合与解离，通过脂酰化修饰提高Cas9蛋白在EVs中的水平，并利用水疱性口炎病毒糖蛋白(vesicular stomatitis virus-glycoprotein，VSV-G)包装EVs，促进其摄取后受体细胞中Cas9蛋白的入核过程，进而提高EVs递送的基因编辑效率，并在细胞及动物水平靶向清除HBV。
附图说明
图1 蓝光二聚化系统构建及功能验证(A)蓝光诱导二聚化系统质粒构建及相互作用示意图。(B)在HEK293T细胞中瞬时共转染PX458-Cas9-CRY2-eGFP质粒及pcDNA3.1-MyrPalm-CIBN质粒，蓝光或黑暗环境培养48小时。4%多聚甲醛固定细胞，Hoechst-33342标记细胞核，共聚焦显微镜观察。(C)在Huh7细胞中同时转染1.2×HBV、Cas9-CRY2-gHBV1及Cas9-CRY2-gHBV2表达质粒，阳性对照共转染1.2×HBV、Cas9-gHBV1和Cas9-gHBV2表达质粒，48小时后提取细胞总DNA，利用HBV-251-F及HBV-2137C-R进行PCR反应，琼脂糖凝胶检测扩增产物。(D)回收纯化双gRNA切割产生的小片段(如箭头所示)，进行克隆测序。
图2 蓝光诱导二聚化系统对EVs装载Cas9蛋白的影响(A)JEM-1400透射电镜观察纯化后EVs-Ctrl-Cas9的形态结构。Nanosight NS300测定纯化后EVs-Ctrl-Cas9的粒径分布及浓度。(B)JEM-1400透射电镜观察纯化后EVs-Cas9-CRY2的形态结构。Nanosight NS300测定纯化后EVs-Cas9-CRY2的粒径分布及浓度。(C)在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-CRY2-gHBV1和MyrPalm-CIBN表达质粒，蓝光照射下培养。48小时后收集细胞沉淀，提取上清中的EVs，Western blot检测Cas9-CRY2蛋白和MyrPalm-CIBN蛋白水平。β-actin作为细胞内参蛋白，CD81作为EVs内参蛋白。(D)从上述纯化后的EVs中提取RNA，qRT-PCR检测gRNA相对水平，GAPDH作为内参。回收纯化扩增的gHBV1片段，进行测序分析。采用非配对t检验进行统计学分析，***表示p<0.001。
图3 VSV-G对受体细胞摄取EVs后Cas9蛋白分布的影响(A)在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-Nluc-CRY2及MyrPalm-CIBN表达质粒，蓝光照射48小时后分离纯化EVs，滴加到Huh7细胞培养基中，孵育6小时后收集Huh7细胞沉淀。(B)检测HEK293T细胞来源EVs及受体细胞Huh7胞内的荧光素酶活性。RLU：相对荧光素酶活性单位。(C)在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-CRY2-eGFP和MyrPalm-CIBN表达质粒，对照组转染Cas9-CRY2-eGFP表达质粒和pcDNA3.1空载质粒，蓝光照射48小时，分离纯化EVs并滴加到Huh7细胞培养基中。24小时后4%多聚甲醛固定细胞，Hoechst-33342标记细胞核，共聚焦显微镜观察。(D)收集HEK293T细胞来源且含Cas9-CRY2-gHBV1的VSV-G包装的EVs，JEM-1400透射电镜观察其形态结构，Nanosight NS300测定其粒径分布及浓度。(E)收集HEK293T细胞来源且收集含Cas9-CRY2-eGFP的VSV-G包装的EVs，滴加到Huh7细胞培养基中，分别在6小时、12小时及24小时固定细胞，Hoechst-33342标记细胞核，共聚焦显微镜观察。采用非配对t检验对各组结果进行统计学分析，*表示p<0.05，***表示p<0.001。
图4 VSV-G包装的EVs在体外HBV复制细胞模型中的抗病毒作用(A)在Huh7细胞中转染1.2×HBV表达质粒构建病毒复制模型。在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-CRY2-gHBV1、Cas9-CRY2-gHBV2、MyrPalm-CIBN和VSV-G表达质粒，蓝光照射48小时后分离纯化EVs，滴加到转染后24小时的Huh7细胞中。(B-D)48小时后收集细胞培养上清及细胞沉淀，全自动化学发光法检测上清HBeAg、HBsAg水平。DNase I消化培养上清中的游离DNA，提取病毒核酸，检测上清HBV DNA水平。(E)提取Huh7细胞总DNA，利用HBV-251-F及HBV-2137C-R进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。(F)回收纯化双gRNA切割产生的小片段(如箭头所示)，进行克隆测序。采用非配对t检验对各组结果进行统计学分析，其中ns表示p>0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
图5 工程化EVs在体外HBV感染细胞模型中的抗病毒作用(A-C)收集EVs滴加后的HepG2-NTCP细胞培养上清，全自动化学发光法检测HBeAg及HBsAg水平，qPCR检测HBV DNA水平。(D)收集HepG2-NTCP细胞沉淀，提取细胞总DNA，qPCR检测胞内cccDNA相对水平。(E)提取HepG2-NTCP细胞总蛋白，Western blot检测胞内HBcAg水平，β-actin作为内参蛋白。(F)利用HBV-251-F及HBV-2043D-R扩增HepG2-NTCP细胞的总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。(G)回收纯化双gRNA切割产生的小片段(如箭头所示)，进行克隆测序。采用非配对t检验对各组结果进行统计学分析，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
图6 携带Cas9蛋白的EVs经小鼠尾静脉注射后的分布情况(A)在HEK293T细胞中进行瞬时共转染，蓝光照射后纯化含Cas9-Nluc-CRY2蛋白的VSV-G包装的EVs，经尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，对照组注射等体积PBS溶液。(B)1小时后经尾静脉注射底物呋马嗪，异氟烷麻醉小鼠后在腹侧位置成像。(C)分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠及脑组织，裂解后检测荧光素酶活性，计算EVs在各组织的分布比例。RLU：相对荧光素酶活性单位。
图7 工程化EVs在HBV复制小鼠模型中的抗病毒作用(A-B)尾静脉注射EVs后第3天和第7天分别对小鼠进行取血，全自动化学发光法检测血清HBeAg及HBsAg水平。(C)分离小鼠肝脏，进行HBcAg免疫组织化学染色。(D)提取肝脏总DNA，利用HBV-251-F及HBV-2043D-R进行PCR反应，检测肝脏中游离型病毒基因组编辑情况，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。(E)回收纯化双gRNA切割后产生的小片段(如箭头所示)，进行克隆测序。HDI：水压动力注射。采用非配对t检验对各组结果进行统计学分析，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图8 工程化EVs在HBV转基因小鼠模型中的抗病毒作用(A-C)尾静脉注射EVs后第3天对小鼠进行取血。提取病毒核酸，qPCR检测HBV DNA水平。全自动化学发光法检测血清中的HBeAg及HBsAg水平。(D)牺牲小鼠后分离肝脏，进行HBcAg的免疫组织化学染色。Zone1：肝脏汇管区；Zone3：肝脏中央静脉区。(E)提取肝组织总DNA，利用1.28×HBV-F及1.28×HBV-R进行PCR反应，检测肝脏中整合病毒片段的编辑情况，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。(F)回收纯化双gRNA切割后产生的小片段(如箭头所示)，进行克隆测序。采用非配对t检验对各组结果进行统计学分析，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。
图9 HBV转基因小鼠注射EVs后的肝脏炎症损伤情况(A)EVs注射后第3天小鼠血清ALT及AST水平。(B)EVs注射后第3天小鼠肝组织苏木素-伊红染色情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
工程化细胞外囊泡
本发明的第一方面，提供一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其包括脂质双分子层和CRISPR-Cas9基因编辑元件，其中所述CRISPR-Cas9基因编辑元件通过蓝光诱导的二聚化系统与所述脂质双分子层连接。本发明的工程化细胞外囊泡的直径一般为30-1000nm。在某些实施方案中，直径为50-140nm，优选80-140nm之间，更优选100-120nm。
本发明中，蓝光是指具有波长400-480nm的光线。在一个优选的实施方案中，本发明采用波长450-480nm的蓝光进行诱导。
本发明的工程化细胞外囊泡具有脂质双层结构。其中脂质双分子层结构中包括磷脂和胆固醇。脂质双分子层内包含能够提供基因编辑功能的CRISPR-Cas9基因编辑元件，其至少包括sgRNA和Cas蛋白。其中，sgRNA也称为导向RNA(guide RNA)。sgRNA的至少部分序列能够与靶DNA互补，且sgRNA能够与Cas蛋白形成功能性复合体。sgRNA的序列不特别限定，根据待编辑的靶DNA的序列而变化，并且sgRNA可以是一种，也可以是多种不同类型的组合。优选地，gRNA包括识别靶DNA的crRNA和活化Cas蛋白所需的tracrRNA (trans-activatingcrRNA, tracrRNA)。
本发明中，靶DNA为病毒基因组DNA，优选为HBV基因组DNA，还优选为HBV cccDNA。HBV的状态不特别限定，其可以是已经整合到人类基因组的病毒DNA，也可以是未整合的病毒DNA。
在一个优选的实施方案中，本发明使用的gRNA为靶向病毒基因组DNA的两种不同的gRNA，从而产生截断的病毒基因组DNA片段，由此避免仅单一gRNA所导致的病毒基因组重新环化后的继续转录、表达的问题。
本发明中，靶向病毒基因组DNA的gRNA序列不特别限定，本领域技术人员根据已报道的病毒基因组序列或公开的基因组数据进行设计并合成，也可以使用本领域已知的靶向病毒基因组DNA的gRNA序列，例如中国专利申请CN104711257A、CN109528653A中公开的gRNA序列，其通过引用整体并入本文。
本发明的Cas蛋白是指CRISPR系统中具有核酸酶活性的一类蛋白，其为CRISPR关联(CRISPR associated)蛋白。本发明可使用目前已经发现的SpCas9、SaCas9、Cas13a、Cas13b、Cpf1等多种类型的Cas蛋白。本发明中的Cas蛋白包括天然存在的蛋白或重组蛋白。另外，Cas蛋白不仅包含本申请日之前已鉴定的任何蛋白，还包含基于目前已知的知识能够确定可能具有该蛋白活性，并在本申请日之后鉴定其活性的蛋白。还优选地，本发明使用对天然Cas蛋白进行改造，以达到所需功能或目的的突变体。
在示例性实施方案中，本发明的gRNA和Cas蛋白由基因表达产生，并通过细胞外泌作用而直接进入本发明的工程化细胞外囊泡。在另外的示例性实施方式中，本发明可使用例如人工制备的Cas蛋白，并通过人工方式将其导入工程化细胞外囊泡内。
在优选的实施方案中，本发明的工程化细胞外囊泡包含gRNA和Cas蛋白，但是不包含用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因。例如，本发明的工程化细胞外囊泡不包含用于产生gRNA和/或Cas蛋白的任何表达载体或质粒。即，优选地，本发明的工程化细胞外囊泡具有确定量的gRNA和/或Cas蛋白，不能通过转录或翻译而产生新的gRNA或Cas蛋白。
在示例性实施方案中，本发明的工程化细胞外囊泡为细胞内源性外泌体，其通过细胞外泌的方式获得。因此，除了上述gRNA和Cas蛋白外，可选的含有蛋白及mRNA、miRNA、lncRNA等。
除了上述gRNA和Cas蛋白以外，本发明的工程化细胞外囊泡还可包括其他成分，例如，用于引导工程化细胞外囊泡靶向特定位置或细胞的分子。这些分子可采用本领域已知的任何分子。
本领域技术人员可以理解的是，本发明的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡还可以包括用于基因表达的其他元件，例如但不限于启动子、连接子(柔性连接臂)等，还可以包括用于蛋白标记及示踪的报告基团，对此不特别限定。
本发明的具有基因编辑功能的工程化细胞外囊泡可通过本领域的任何方法制备。例如，人工合成的方法或者基于细胞培养的方法。鉴于RNA的稳定性相对差，人工合成的效率较低，优选基于细胞培养的方法。基于细胞培养的方法的具体说明参见下文。
基于本发明的工程化细胞外囊泡，本发明还提供一种用于递送CRISPR-Cas9的系统，其包括所述的工程化细胞外囊泡和病毒类包装载体。病毒类包装载体是本领域已知的，其包括但不限于水疱性口炎病毒体系、慢病毒载体包装体系、鼠类白血病病毒包装体系和反向遗传学自组装假病毒体系等。在一个优选的实施方案中，本发明采用水疱性口炎病毒糖蛋白作为病毒类包装载体。
工程化细胞外囊泡的制备方法
本发明的第二方面，提供一种工程化细胞外囊泡的制备方法。本发明的制备方法包括以下步骤：
(1) 构建重组表达载体：将CRISPR-Cas9基因编辑元件与隐花色素2的核酸序列连接，以及用于与所述隐花色素2结合的配体蛋白与锚定肽的核酸序列连接分别构建重组质粒，其中，CRISPR-Cas9基因编辑元件至少包含能够靶向病毒基因片段的第一sgRNA和第二sgRNA；
(2) 转染至宿主细胞并进行培养，其中使用蓝光进行诱导；
(3) 分离工程化细胞外囊泡。
本发明中，步骤(1)中使用的载体可以是任何类型的质粒，例如包括但不限于PX458、pcDNA3.1等。
本发明中，步骤(2)中进行培养的条件为本领域已知的条件，包括适当的培养基、温度和二氧化碳浓度等。宿主细胞需要具有分泌外泌体的功能。细胞类型不特别限定，可以是动物细胞(例如猴细胞、鼠细胞等)或人细胞，其实例包括但不限于HEK293T细胞、Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞等。本发明可使用上述细胞中的一种或多种，但不局限上述情形。
本发明中，步骤(3)分离工程化细胞外囊泡可通过工程化细胞的培养液进行，工程化细胞的培养液优选为培养上清。本发明的培养上清中包含从工程细胞分泌的工程化细胞外囊泡和培养基成分。步骤(3)的目的主要是从培养基成分等中分离出所需的工程化细胞外囊泡。步骤(3)中的分离有时也称作抽提或富集，其实例包括但不限于差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法等。步骤(3)的分离还可通过使用已知的试剂盒进行。
药物组合物
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其包括本发明所述的工程化细胞外囊泡或用于递送CRISPR-Cas9的系统，和可选的药学上可接受的载体。
本发明中，药物学可接受载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。
本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
细胞内基因编辑的方法
本发明的第四方面，提供一种用于在细胞内进行基因编辑的方法，本文有时简称为“本发明的基因编辑方法”，其包括使用本发明第一方面所述的工程化细胞外囊泡向靶细胞内递送CRISPR-Cas9系统的步骤。本发明的靶细胞是指需要进行基因编辑的细胞，例如，需要基因敲除的细胞。本发明的CRISPR-Cas系统是指主要由Cas蛋白和gRNA组成的能够发挥基因编辑功能的体系。
工程化细胞外囊泡在制备药物中的用途
本发明的第五方面，提供工程化细胞外囊泡在制备药物中的用途。本发明的药物中gRNA和Cas9蛋白能够特异性作用于靶DNA序列并发挥基因编辑功能。通过本发明的药物可用于针对感染性疾病病原体，例如HBV、HPV和HIV等。
实施例
1. 蓝光诱导二聚化系统构建及功能验证
以PX458质粒为载体，在Cas9的羧基端插入CRY2构建Cas9-CRY2融合表达质粒。以pcDNA3.1载体为骨架，在CIBN的氨基端插入具有肉豆蔻酰化及棕榈酰化位点的短肽MGCCNSKRKD-(MyrPalm)，用于靶向质膜。在细胞中进行共转染并给予460nm蓝光刺激后，Cas9-CRY2蛋白会与MyrPalm-CIBN蛋白结合，共同被锚定到质膜上，促进Cas9蛋白分选进入EVs中(图1A)。选择gHBV1和gHBV2作为抑制HBV复制的特异性gRNA。
表1 示例性的gRNA序列
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为探究蓝光诱导二聚化系统对Cas9蛋白在细胞内分布的影响，以PX458为载体，通过突变T2A构建Cas9-CRY2-eGFP融合表达质粒。在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-CRY2-eGFP及MyrPalm-CIBN表达质粒，置于黑暗或蓝光照射环境下培养，共聚焦显微镜观察胞内Cas9蛋白分布。结果显示，蓝光照射下HEK293T细胞表达的Cas9-CRY2-eGFP蛋白集中分布在胞浆，细胞核定位与黑暗环境相比明显减少(图1B)，表明蓝光诱导二聚化系统可促进Cas9蛋白从胞核易位至胞浆。
为探究Cas9-CRY2融合蛋白是否具有基因编辑功能，构建PX458-Cas9-CRY2-gHBV1和PX458-Cas9-CRY2-gHBV2质粒，并在Huh7细胞中与1.2×HBV质粒进行瞬时共转染，PCR扩增和测序分析检测基因编辑情况。结果显示，Cas9-CRY2-gHBV1和Cas9-CRY2-gHBV2表达质粒在转染后可切割HBV基因组形成小片段(图1C)。测序分析显示小片段为扩增得到的HBVDNA片段，且gHBV1和gHBV2切割位点间的病毒序列发生了缺失，表明Cas9-CRY2融合蛋白具有基因编辑活性(图1D)。
2. 蓝光诱导二聚化系统可促进Cas9蛋白装载到EVs中
为明确从细胞培养上清中分离纯化的EVs形态结构及粒径分布，在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-CRY2-gHBV1和MyrPalm-CIBN表达质粒，给予细胞蓝光照射；对照组转染未经修饰的Cas9-gHBV1表达质粒。48小时后收集细胞培养上清，差速离心法纯化EVs。透射电镜观察可见EVs-Ctrl-Cas9(图2A)和EVs-Cas9-CRY2(图2B)均呈茶托样的脂质双层结构。纳米颗粒跟踪分析结果显示，EVs-Ctrl-Cas9的平均粒径约为102.8 nm，囊泡浓度约为4.39×108particles/mL(图2A)；EVs-Cas9-CRY2的平均粒径约为110.6 nm，囊泡浓度约9.80×108particles/mL(图2B)。上述结果表明，差速离心法可成功分离HEK293T细胞来源的EVs，且蓝光诱导二聚化不影响EVs形态。
为探究蓝光诱导二聚化系统能否促进Cas9蛋白装载到EVs中，在HEK293T细胞中瞬时共转染PX458-Cas9-CRY2-gHBV1和pcDNA3.1-MyrPalm-CIBN质粒，对照组共转染PX458-Cas9-CRY2-gHBV1和pcDNA3.1空载质粒，置于黑暗或蓝光照射环境中培养。48小时后，Western blot检测EVs中的Cas9蛋白水平。结果显示，转染MyrPalm-CIBN表达质粒且蓝光照射下产生的EVs中Cas9-CRY2融合蛋白水平最高(图2C)，表明蓝光诱导二聚化及脂酰化修饰共同作用可提高EVs中Cas9蛋白水平。此外，在上述蓝光诱导二聚化系统调控产生的EVs中可检测到gRNA的存在(图2D)，表明其具备递送基因编辑功能的潜力。
3. VSV-G可增强EVs被受体细胞摄取后Cas9蛋白的入核
新型的小荧光素酶NanoLuc(Nluc)可用于蛋白标记及示踪，在Cas9的羧基端插入Nluc，构建Cas9-Nluc-CRY2融合表达质粒。在HEK293T细胞中瞬时共转染Cas9-Nluc-CRY2及MyrPalm-CIBN表达质粒，蓝光照射48小时后纯化EVs并滴加到Huh7细胞培养基中(图3A)。6小时后收集Huh7细胞沉淀，检测荧光素酶活性。与上清荧光素酶活性检测结果一致，同时表达MyrPalm-CIBN且蓝光照射下产生的EVs进行滴加孵育后，Huh7细胞中荧光素酶活性最高(图3B)，表明蓝光诱导二聚化系统可提高Cas9蛋白在EVs中的水平，且携带Cas9蛋白的EVs可被受体细胞Huh7有效摄取。
为明确EVs摄取后Cas9蛋白在受体细胞中的分布情况，分离纯化HEK293T来源且含Cas9-CRY2-eGFP蛋白的EVs，滴加到Huh7细胞培养基中。孵育24小时后，Cas9蛋白主要分布在Huh7细胞的胞浆，细胞核内未见明显分布(图3C)。VSV-G在内体的酸性环境中活化后可诱导膜融合。为增加Cas9蛋白的入核水平，利用VSV-G包装EVs，促进其摄取后与受体细胞的早期内体发生膜融合，避免Cas9蛋白进入MVB或溶酶体降解途径。在HEK293T细胞中进行共转染及蓝光照射，纯化VSV-G包装且携带Cas9-CRY2-gHBV1的EVs，透射电镜观察可见其呈茶托样脂质双层结构，纳米颗粒跟踪分析结果显示其平均粒径约为116.9 nm，囊泡浓度约为2.15×109particles/mL(图3D)，表明VSV-G包装不影响EVs的形态结构和粒径分布。为探究VSV-G对EVs摄取后受体细胞中Cas9蛋白分布的影响，分离纯化HEK293T来源且含Cas9-CRY2-eGFP蛋白的VSV-G包装的EVs，滴加到Huh7细胞的培养基中。共聚焦显微镜观察EVs孵育后6小时、12小时和24小时胞内Cas9蛋白的分布。结果显示，EVs滴加后12小时细胞核中可观察到绿色荧光，24小时后细胞核中Cas9蛋白水平有所增加，表明VSV-G可促进EVs摄取后受体细胞中Cas9蛋白的入核(图3E)。
4. 工程化EVs在体外HBV复制及感染细胞模型中靶向编辑病毒基因组
为探究VSV-G包装的EVs能否在转染HBV表达质粒的细胞复制模型中递送Cas9蛋白及gRNA的基因编辑活性，在Huh7细胞中瞬时转染1.2×HBV表达质粒构建病毒复制细胞模型。在HEK293T细胞中进行瞬时共转染并给予蓝光照射，分离纯化含有Cas9蛋白和gHBV的VSV-G包装的EVs，滴加到转染后的Huh7细胞培养基中，置于黑暗环境继续培养(图4A)。48小时后收集Huh7细胞培养上清及细胞沉淀，全自动化学发光法检测上清HBeAg及HBsAg水平，实时荧光定量PCR(qPCR)检测上清HBV DNA水平，PCR及测序分析检测基因编辑情况。结果显示，与对照组相比，携带Cas9蛋白和gHBV的VSV-G包装的EVs对细胞上清HBeAg、HBsAg和HBVDNA的抑制作用最强(图4B-D)，表明VSV-G包装的EVs可在转染1.2×HBV质粒的Huh7细胞中显著抑制病毒抗原及HBV DNA水平，且对病毒复制水平的抑制作用优于无VSV-G包装的EVs。此外，VSV-G包装的EVs还可在Huh7细胞中切割HBV基因组形成小片段(图4E)。测序分析显示，小片段为扩增得到的HBV DNA片段，且gHBV1和gHBV2切割位点中间的病毒序列发生了缺失(图4F)。上述结果表明，VSV-G包装的EVs可将Cas9蛋白和gRNA递送到瞬时转染1.2×HBV表达质粒的Huh7细胞中，靶向编辑HBV基因组，并显著抑制病毒复制。
为探究工程化EVs能否在体外感染细胞模型中编辑HBV基因组并抑制病毒复制，在HepG2-NTCP细胞中建立HBV感染并进行EVs滴加孵育实验。浓缩HBV病毒颗粒，以感染复数为500的剂量感染HepG2-NTCP细胞。在HEK293T细胞中进行瞬时共转染并给予蓝光照射，收集纯化含有Cas9蛋白和gHBV的VSV-G包装的EVs，滴加到HBV感染后第5天的HepG2-NTCP细胞培养基中，置于黑暗环境继续培养。48小时后，收集细胞培养上清及细胞沉淀，全自动化学发光法检测上清HBeAg及HBsAg水平，qPCR检测上清HBV DNA水平；Western blot检测胞内HBcAg水平，qPCR检测胞内HBV cccDNA相对水平；PCR及测序分析检测基因编辑情况。结果显示，工程化EVs可显著降低HepG2-NTCP细胞上清中病毒抗原及DNA水平(图5A-C)，同时有效降低胞内cccDNA及HBcAg水平(图5D-E)。此外，工程化EVs还可在HepG2-NTCP细胞中切割HBV基因组形成小片段(图5F)。测序分析显示小片段为扩增得到的HBV DNA片段，且gHBV1和gHBV2切割位点中间的病毒序列发生了缺失(图5G)。上述结果表明，工程化EVs可在体外HBV感染细胞模型中靶向编辑病毒基因组，并显著抑制病毒复制。
5. 工程化EVs在小鼠HBV复制模型中靶向编辑游离型及整合病毒基因组
为探究含有Cas9蛋白的EVs注射后在小鼠体内的分布情况，在HEK293T细胞中进行瞬时共转染并给予蓝光照射，收集纯化含Cas9-Nluc-CRY2蛋白的VSV-G包装的EVs，经尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，1小时后进行活体成像或分离组织后体外检测荧光素酶活性(图6A)。结果显示，尾静脉注射EVs后小鼠肝脏区域存在明显的阳性信号(图6B)，EVs在肝脏的分布比例远高于其他组织(图6C)，表明携带Cas9-Nluc-CRY2蛋白的EVs经小鼠尾静脉注射后主要在肝脏分布。
为探究工程化EVs能否在小鼠体内靶向编辑游离型病毒基因组，在C57BL/6雄鼠中通过尾静脉水压动力注射1.2×HBV表达质粒构建小鼠HBV复制模型。在HEK293T细胞中进行瞬时共转染，蓝光照射后收集纯化含有Cas9蛋白和gHBV的VSV-G包装EVs。在尾静脉水压动力注射后第3天对小鼠进行取血，检测血清病毒抗原水平，经尾静脉分别注射等体积PBS溶液、EVs-Ctrl和EVs-Cas9/gHBV，将注射当天规定为Day0。分别在EVs注射后第3天和第7天进行取血，检测小鼠血清病毒抗原水平；牺牲小鼠后分离肝脏，进行HBcAg的免疫组化染色，PCR反应和测序分析检测基因编辑情况。结果显示，工程化EVs不仅显著抑制小鼠血清HBeAg和HBsAg水平(图7A-B)，还可有效降低肝脏HBcAg水平(图7C)。此外，工程化EVs可在小鼠肝脏中切割游离型HBV基因组形成小片段(图7D)，测序分析显示小片段为扩增得到的HBV DNA片段，且gHBV1和gHBV2切割位点中间的病毒序列发生了缺失(图7E)。上述结果表明，工程化EVs可在尾静脉水压动力注射1.2×HBV表达质粒构建的小鼠HBV复制模型中靶向编辑游离型HBV基因组，显著抑制病毒复制水平。
为探究工程化EVs能否在小鼠体内靶向编辑整合病毒DNA片段，在1.28×HBV转基因小鼠中经尾静脉注射递送含Cas9蛋白和gHBV的VSV-G包装的EVs，将注射当天规定为Day0。尾静脉注射EVs后第3天对小鼠进行取血，检测血清HBeAg、HBsAg和HBV DNA水平；牺牲小鼠，分离肝脏后进行HBcAg的免疫组化染色，PCR及测序分析检测基因编辑情况。结果显示，工程化EVs不仅可有效降低小鼠血清病毒DNA及抗原水平(图8A-C)，还可显著抑制肝脏不同区域的HBcAg水平(图8D)。此外，工程化EVs还可在小鼠肝脏中切割整合的HBV基因组形成小片段(图8E)，测序分析显示小片段为扩增得到的HBV DNA片段，且gHBV1和gHBV2切割位点中间的病毒序列发生了缺失(图8F)。
为评估小鼠肝脏的炎症损伤情况，在工程化EVs注射后第3天检测小鼠血清转氨酶水平，同时对肝组织进行苏木素-伊红染色。结果显示，实验组小鼠的ALT及AST水平与对照组相比均无明显差异(图9A)，且在肝脏中未观察到肝细胞损伤和炎症细胞浸润的情况(图9B)，表明工程化EVs在HBV转基因小鼠模型中经尾静脉注射后未发生明显的肝脏炎症损伤。上述结果证明，工程化EVs可在HBV转基因小鼠模型中靶向编辑肝脏中的整合HBV DNA片段，显著抑制病毒复制水平，且安全性良好。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (10)

1.一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其特征在于，包括脂质双分子层和CRISPR-Cas9基因编辑元件，其中所述CRISPR-Cas9基因编辑元件通过蓝光诱导的二聚化系统与所述脂质双分子层连接。
2.根据权利要求1所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因编辑元件包括sgRNA和Cas蛋白，其中所述sgRNA靶向病毒的基因片段。
3.根据权利要求2所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其特征在于，蓝光诱导的二聚化系统包括隐花色素2及其配体蛋白。
4.根据权利要求3所述的用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其特征在于，所述Cas蛋白与隐花色素2连接，所述配体蛋白通过锚定肽与所述脂质双分子层连接。
5.一种用于递送CRISPR-Cas9的工程化细胞外囊泡，其特征在于，其由转染了重组表达载体的工程化细胞经表达和分离得到，所述重组表达载体至少包括第一重组质粒和第二重组质粒，其中所述第一重组质粒包括靶向病毒基因片段的sgRNA以及表达Cas蛋白和隐花色素2的核酸序列，所述第二重组质粒包括表达配体蛋白和锚定肽的核酸序列。
6.一种用于递送CRISPR-Cas9的系统，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的工程化细胞外囊泡和病毒类包装载体。
7.根据权利要求1-5任一项所述的工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 构建重组表达载体：将CRISPR-Cas9基因编辑元件与隐花色素2的核酸序列连接，以及将用于与所述隐花色素2结合的配体蛋白与锚定肽的核酸序列连接分别构建重组质粒；
(2) 转染至宿主细胞并进行培养，其中使用蓝光进行诱导；
(3) 分离工程化细胞外囊泡。
8.根据权利要求7所述的工程化细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，进一步包括使用病毒类包装载体的步骤。
9.一种用于在细胞内进行基因编辑的方法，其包括使用根据权利要求1-5任一项所述的工程化细胞外囊泡向靶细胞内递送CRISPR-Cas系统的步骤。
10.试剂在制备用于改善或治疗病毒相关疾病的药物中的用途，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-5任一项所述的工程化细胞外囊泡。
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OSTEIKOETXEA X等: "Engineered Cas9 extracellular vesicles as a novel gene editing tool", 《J EXTRACELL VESICLES》, vol. 11, no. 5, pages 2 - 11, XP093035490, DOI: 10.1002/jev2.12225 *
WANG J等: "Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 system inhibits hepatitis B virus replication", 《WORLD J GASTROENTEROL》, vol. 21, no. 32, pages 9554 - 9565, XP055607943, DOI: 10.3748/wjg.v21.i32.9554 *
谢甜等: "光控诱导重组系统的开发与应用", 《遗传》, vol. 44, no. 8, pages 655 - 671 *

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