CN117899238A - Pglyrp2基因的用途及其相关药物 - Google Patents
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Abstract
PGLYRP2基因的用途及其相关药物，涉及生物医药领域，具体涉及PGLYRP2基因的用途及其相关药物。要解决现有药物仅能抑制乙型肝炎病毒复制，无法清除病毒cccDNA的问题。PGLYRP2基因用于制备治疗乙型肝炎病毒感染的药物。PGLYRP2基因用于制备清除乙型肝炎病毒cccDNA的药物。本发明还提供一种用于清除乙型肝炎病毒的基因治疗载体，该基因治疗载体包括启动子、内含子、增强子和PGLYRP2基因编码区。本发明明确了PGLYRP2蛋白的HBV病毒抑制功能和cccDNA清除作用，能够显著地促进肝细胞和小鼠肝脏HBV的清除。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及PGLYRP2基因的用途及其相关药物。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B，HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，其属于嗜肝DNA病毒属。HBV主要感染人的肝细胞，其感染可显著提高肝硬化和肝癌的发病率。针对HBV感染者，临床上主要有干扰素α和核苷类似物，或针对其表面抗原的多克隆抗体。专利CN101906417A中公开了一种重组腺相关病毒基因治疗载体，其采用基因重组技术将对乙型肝炎病毒有抑制作用的shRNA克隆入腺相关病毒载体的骨架质粒中，与辅助质粒共转染包装细胞得到重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒虽然能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制和表达，但是仅能够减缓疾病的进程，易反复治疗效果不佳。
乙肝病毒慢性感染后，会在肝细胞核中产生共价闭环的HBV cccDNA，cccDNA十分稳定、半衰期较长，核苷(酸)类似物和干扰素α难以清除cccDNA，停药后病情易反弹。因此，临床慢乙肝的治愈需要清除肝内病毒的cccDNA。现有的药物虽然能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制和表达，但是其无法清除病毒cccDNA，仅能够减缓疾病的进程，导致停药后易于复发。
发明内容
本发明是要解决现有药物仅能抑制乙型肝炎病毒复制，无法清除病毒cccDNA的问题，提供PGLYRP2基因的用途及其相关药物。
本发明提供PGLYRP2基因在制备治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
本发明进一步提供PGLYRP2基因在制备清除乙型肝炎病毒cccDNA的药物中的应用。
本发明提供一种用于清除乙型肝炎病毒的基因治疗载体，包括启动子、内含子、增强子和PGLYRP2基因编码区。
所述载体骨架为病毒载体或非病毒载体。
所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体或博卡病毒载体。所述腺相关病毒载体为AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAV-DJ型腺相关病毒载体。
所述非病毒载体为脂质体纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、外泌体、多肽复合物、mRNA载体、iTOP或Feldan shuttle。
所述启动子为PGLYRP2基因启动子截短体M，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
所述增强子为CMV增强子和HBV EnII元件，CMV增强子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，HBV EnII元件的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
所述PGLYRP2基因编码区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
本发明提供一种用于清除乙型肝炎病毒的药物组合物，含有上述的基因治疗载体。
本发明的有益效果：
本发明明确了PGLYRP2蛋白的HBV病毒抑制功能和cccDNA清除作用，能够显著地促进肝细胞和小鼠肝脏HBV的清除，本发明的腺相关病毒基因治疗载体能够在9天内显著清除体外肝细胞的病毒cccDNA，在6周内显著清除小鼠血清中病毒表面抗原。
本发明进一步制备了用于清除乙型肝炎病毒的基因治疗载体，其中腺相关病毒基因治疗载体中包含基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M，本发明构建的基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M在小鼠体内具有长效表达与肝脏组织特异性表达的特点，具有自反馈机制，赋予基因治疗产品更好的安全性。
本发明具有极大的潜力实现乙型肝炎的彻底治愈。
附图说明
图1为PGLYRP2蛋白抑制细胞内HBV DNA水平的结果；
图2为PGLYRP2蛋白抑制细胞内HBV pgRNA水平的结果；
图3为PGLYRP2蛋白抑制细胞外HBV DNA水平的结果；
图4为PGLYRP2蛋白抑制细胞外HBsAg水平的结果；
图5为PGLYRP2蛋白抑制细胞内cccDNA水平的结果；
图6为在HBV阳性肝组织中PGLYRP2蛋白与HBV感染程度的相关性结果；
图7为图6中的放大图；
图8为在HBV阳性肝组织中PGLYRP2蛋白与HBV感染程度的相关曲线；
图9为HBV promoter-Luciferase模式图及其荧光素酶活性比较人源hPGLYRP2与鼠源mPGLYRP2对乙型肝炎病毒复制抑制作用的结果；
图10为基因治疗载体pAAV-EnII-EnCMV-M-PGLYRP2重组体的模式图；
图11为PGLYRP2蛋白对骨架载体pAAV-EnCMV-M的正调控作用；
图12为PGLYRP2蛋白对基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M的自反馈调控作用；
图13为C57/BL6野生型与PGLYRP2-/-小鼠的AAV/hPGLYRP2注射与HBV感染造模的模式图，以及小鼠实验6周后血清HBV DNA含量的检测结果；
图14为小鼠HBV感染模型实验6周后小鼠血清HBs水平的检测结果；
图15为小鼠HBV感染模型实验6周后小鼠体内病毒cccDNA的检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明先将PGLYRP2基因构建至慢病毒载体pLVSIN，包装慢病毒后感染肝细胞HepAD38细胞，形成HepAD38/PGLYRP2稳转株，在培养基中撤除四环素(tet-)后，分析PGLYRP2蛋白对HBV病毒的体外抑制作用。
在小鼠体内实验中，将人源hPGLYRP2基因构建至高噬肝性腺相关病毒载体pAAV2/8，包装病毒后小鼠尾静脉注射，实现PGLYRP2-/-小鼠的肝细胞外源表达人源hPGLYRP2蛋白，分析人源PGLYRP2蛋白对HBV病毒的体内抑制作用。
PGLYRP2基因在正常人肝细胞中组成型高水平表达，而在乙型肝炎病毒指数高的肝细胞中PGLYRP2基因表达偏低，本发明应用携带有PGLYRP2基因的病毒表达载体，靶向肝细胞表达PGLYRP2蛋白，以恢复病毒感染肝细胞中PGLYRP2蛋白的适度高水平状态，实现外源表达PGLYRP2蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的效果。
实施例1：PGLYRP2蛋白对HBV病毒的抑制作用分析
为检测PGLYRP2蛋白对HBV病毒的抑制作用，首先构建PGLYRP2稳转细胞株所需的慢病毒表达重组体。以人源cDNA为模板扩增得到PGLYRP2基因，上游引物hPGLYRP2 XhoI_F：5’-CTCGAGATGGCCCAGGGCGTGCTC-3’，下游引物hPGLYRP2NotI_R：5’-GCGGCCGCCTGCAGGTCGGTGGCGGGCA-3’。再使用限制性内切酶XhoI、NotI将慢病毒空载体pLVSIN(购买自TAKARA公司)进行双酶切，并连接PGLYRP2基因，即得到慢病毒表达重组体pLVSIN/PGLYRP2。
将慢病毒包装质粒与重组载体以GAG:VSVA:pLVSIN/PGLYRP2＝9:1:10的比例转染HEK293T细胞，转染72小时后收病毒液，用以感染肝细胞HepAD38，选用1.5μg/ml嘌呤霉素筛选HepAD38/PGLYRP2阳性细胞的稳转细胞株。在稳转细胞株的培养基中撤除四环素(tet-)后继续培养9天，采用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304-03)提取细胞内外的基因组DNA，采用Trizol法提取细胞的RNA，采用ELISA法(Sangon Biotech,D711407)检测培养基中HBsAg的水平，分析PGLYRP2蛋白对HBV病毒的抑制作用。
结果：相比对照细胞HepAD38/Con，PGLYRP2过表达的稳转细胞株HepAD38/PGLYRP2的细胞内HBV DNA水平(如图1)、细胞内pgRNA水平(如图2)、细胞外HBV DNA水平(如图3)和细胞外HBsAg水平(如图4)均显著降低，提示PGLYRP2蛋白对HBV病毒具有明确的抑制作用。PGLYRP2蛋白抑制细胞内cccDNA水平的结果如图5所示，相比对照细胞HepAD38/Con，PGLYRP2过表达的稳转细胞株HepAD38/PGLYRP2细胞内cccDNA水平显著下调，表明PGLYRP2蛋白明确地抑制细胞内cccDNA水平。
实施例2：在HBV阳性患者的肝组织中PGLYRP2蛋白水平与HBV感染程度的相关性分析
本实施例采用免疫组化方法检测了17个HBV阳性患者的肝组织中PGLYRP2蛋白与乙肝病毒核心抗原HBc的表达水平，其中兔抗人PGLYRP2蛋白抗体(#NBP2-32042,Novus)选用1:100浓度，鼠抗HBc(#orb99015，Biorbyt)选用1:50浓度孵育免疫组化片。
结果：分别用anti-PGLYRP2和anti-HBc抗体检测组织中的PGLYRP2和HBc蛋白含量，免疫组化图片如图6和图7所示。在HBV阳性肝组织中PGLYRP2蛋白与HBV感染程度的相关曲线如图8所示。发现在HBV阳性患者的肝组织中，PGLYRP2蛋白与乙肝病毒核心抗原HBc的表达水平呈显著的负相关性；相比HBc高表达的肝组织，HBc低表达的肝组织中PGLYRP2蛋白水平显著更高(n＝17,p<0.001,R＝-0.773,95％ CI:-0.917to-0.449)，提示在HBV感染程度高的肝组织中PGLYRP2蛋白表达水平明显降低。
实施例3：比较人源hPGLYRP2与鼠源mPGLYRP2对乙型肝炎病毒复制的抑制作用
采用HBV promoter-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统，分析人源hPGLYRP2与鼠源mPGLYRP2对乙肝病毒复制的抑制作用。在HEK293细胞中共转染HBVpromoter-luciferase 100ng，pLVSIN Con vector、pLVSIN/hPGLYRP2或pLVSIN/mPGLYRP2400ng，海肾荧光素酶报告质粒50ng，转染16小时后裂解细胞，采用酶标仪CytoFluorplate4000Luminescence Microplate Reader(ABI,CA)检测荧光素酶活性。
结果：相比pLVSIN Con vector组，人源hPGLYRP2极显著地抑制了HBV promoter-Luciferase的荧光素酶活性(p<0.001)，鼠源hPGLYRP2显著地抑制了HBV promoter-Luciferase的荧光素酶活性(p<0.05)；人源hPGLYRP2比鼠源hPGLYRP2对HBV promoter-Luciferase的荧光素酶活性抑制效果显著更强(p<0.05)。该结果表明，人源hPGLYRP2与鼠源mPGLYRP2对乙肝病毒复制都有显著的抑制作用，其中人源hPGLYRP2比鼠源mPGLYRP2对乙肝病毒复制的抑制效果更好(图9)。
实施例4：基因治疗载体pAAV-EnII-EnCMV-M/PGLYRP2重组体的构建
本发明采用基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M作为骨架载体；以人源cDNA为模板扩增得到PGLYRP2基因，PGLYRP2基因序列如列表中SEQ ID NO：4所示。再使用限制性内切酶ClaI和BamHI对载体pAAV-EnII-EnCMV-M进行双酶切并连接PGLYRP2基因编码片段，转化得到pAAV-EnII-EnCMV-M-PGLYRP2重组体，该重组体的模式图如图10所示。
扩增PGLYRP2基因的引物如下：
上游引物PGLYRP2 ClaI_F：5’-ATCGATATGGCCCAGGGCGTGCTC-3’，下游引物hPGLYRP2 BamHI_R：5’-GGATCCCTGCAGGTCGGTGGCGGGCA-3’。
所述基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M的构建方法如下：
一、以MluI-M F和NcoI-M R为引物，以质粒PGL4-PGLYRP2(1--2005)为模板扩增得到PGLYRP2基因启动子截短体M。
上游引物MluI-M F：5’-CGACGCGTCGGTGGCGCATGCCTGTAACCTGA-3’，下游引物NcoI-M R：5’-CATGCCATGGCATGGATTTCAAGCCACCAGCAGTAGCTG-3’。PGLYRP2基因启动子截短体M的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
所述质粒PGL4-PGLYRP2(1--2005)，已在文章Hepatology.2020May；71(5):1626-1642.中公开。
二、以MluI-HBV-EnII F和SacI-HBV-EnII R为引物，以质粒pBB4.5-HBV1.2,genotype C为模板扩增得到HBV EnII元件。HBV EnII元件的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示。
上游引物MluI-HBV-EnII F：5’-CGACGCGTCGTCCTGCCCAAGGTCTTACATAA-3’，下游引物SacI-HBV-EnII R：5’-CGAGCTCGCAGCTCCTCCCAGTCCTTAAAC-3’。
所述质粒pBB4.5-HBV1.2,genotype C为他人赠送，已在文章Emerg MicrobesInfect.2022Dec；11(1):1356-1370中公开。AAV-MCS空载体购自淼灵质粒平台(P0244，含CMV启动子)。
三、使用限制性内切酶MluI、NcoI将AAV-MCS空载体进行双酶切，将CMV promoter切除，保留CMV增强子，并连接PGLYRP2基因启动子截短体M，即得到pAAV-EnCMV-M，CMV增强子EnCMV的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；再使用限制性内切酶MluI、SacI将pAAV-EnCMV-M进行双酶切，并连接HBV EnII元件，最终构建出pAAV-EnII-EnCMV-M载体。
实施例5：PGLYRP2蛋白对基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M的肝细胞特异性表达与自反馈调控作用分析
将基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M使用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，然后连接Luciferase基因序列，得到pAAV-EnII-EnCMV-M-Luciferase重组体。Luciferase基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。
首先将基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M-Luciferase、pAAV-EnCMV-M-Luciferase分别过夜摇菌，并进行质粒提取(按照试剂盒说明书进行操作，Omega，D6943-02)。将得到的质粒进行纯化，纯化方法如下：在提好的质粒中加入1/10体积的醋酸钠(3M，pH5.2)和7/10体积的异丙醇，混匀后室温放置5分钟，12000rpm离心10分钟。此时可见白色DNA沉淀，再加入1mL 70％乙醇，12000rpm离心10分钟，弃上清，晾干残余乙醇后加入约500μL生理盐水溶解DNA，并测浓度做好标记。用于共转染的质粒pLVSIN-PGLYRP2已在文章Hepatology.2020May；71(5):1626-1642.中公开。将培养于12孔细胞培养板的Huh7细胞分为两组，分别命名为第一组和第二组。不同组别设3孔实验组和1孔对照组，第一组每孔转染0.5μg pAAV-EnII-EnCMV-M-Luciferase，第二组每孔转染0.5μg pAAV-EnCMV-M-Luciferase，每组的对照孔转染0.5μg pLVSIN空载质粒(购买自TAKARA公司)，每组的实验孔分别转染0.1μg、0.2μg和0.4μg的pLVSIN-PGLYRP2质粒。24小时后，使用荧光素酶报告基因试剂盒进行Luciferase强度检测。
结果：如图11所示，PGLYRP2蛋白对骨架载体pAAV-EnCMV-M-Luciferase以剂量依赖性的方式促进载体的蛋白表达活性，而且低剂量PGLYRP2蛋白即对骨架载体具有一定的表达促进作用；考虑到PGLYRP2蛋白具有肝细胞特异性表达的特征，提示该载体骨架具有肝细胞特异性表达的能力。
在骨架载体pAAV-EnCMV-M基础上，加入PGLYRP2蛋白负调控元件EnII，形成完整的基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M。在肝细胞中的表达结果显示，低表达PGLYRP2蛋白条件下，PGLYRP2蛋白对基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M的表达调控以正调控为主；而高表达PGLYRP2蛋白，因其对EnII的抑制作用，显著降低了基因治疗递送载体的蛋白表达水平，对基因治疗递送载体起负调控作用。因此，PGLYRP2蛋白对基因治疗递送载体pAAV-EnII-EnCMV-M的调控具有双向反馈调节作用。鉴于该双向调控机制来源于PGLYRP2蛋白、PGLYRP2启动子M、及PGLYRP2调控元件，因此称之为自反馈调控作用(如图12)。
实施例6：腺相关病毒基因治疗载体在小鼠中的乙肝病毒清除效果分析
制备pAAV-EnII-EnCMV-M/PGLYRP2病毒液：
向HEK293T细胞中，按照摩尔比1：1：1转染phelper(Addgene，#112867)、RC8(Addgene，#112864)、pAAV-EnII-EnCMV-M-PGLYRP2质粒，转染后将细胞至于37℃，5％CO2培养箱中培养，72小时后收集细胞和培养上清，将细胞悬浮液在-80℃和室温中反复冻融3次，再通过15％-60％碘克沙醇密度梯度超速离心(36300rpm 16℃离心3h)，超速离心后吸取40％碘克沙醇与60％碘克沙醇之间的病毒液，最后采用100KDa超滤管(Millipore)对病毒液进行浓缩。
在小鼠实验的6周前，在PGLYRP2-/-C57BL/6J小鼠尾静脉注射pAAV-EnII-EnCMV-M/PGLYRP2病毒液(1×1011拷贝数/只)，2周后采用1×1011拷贝数的AAV/1.2*HBV病毒尾静脉注射所有组别小鼠，造模4周后，筛选HBV阳性小鼠，用于后续研究。在注射病毒后的1-6周检测小鼠血液中HBV病毒滴度(HBV DNA拷贝数)。在病毒注射的6周后，取小鼠血液，采用ELISA方法(Sangon Biotech,D711407)检测各组小鼠体内HBs的血清水平。在病毒注射的6周后，取小鼠肝脏，用Hirt法提取法抽提染色体外游离DNA，再采用ExoI/ExoIII/T5核酸外切酶处理HBV cccDNA，纯化后的HBV cccDNA采用实时定量PCR检测HBV cccDNA的含量，所用引物为cccDNA primer_F和cccDNA primer_R。
cccDNA primer_F：5’-GTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3’，
cccDNA primer_R：5’-ACAAGAGATGATTAGGCAGAGG-3’。
结果：在HBV小鼠模型中发现病毒注射的1-6周后，小鼠血液中HBV病毒滴度(HBVDNA拷贝数)如图13所示，其中红色曲线■表示mPGLYRP2-/-，蓝色曲线●表示WT(mPGLYRP2)，黑色曲线▲表示hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)，相比mPGLYRP2-/-组，WT(mPGLYRP2)和hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组的小鼠血清中HBV DNA拷贝数极显著的下降，其中，hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组比WT(mPGLYRP2)组的小鼠血清中HBV DNA拷贝数下降的更为显著，说明本发明的腺相关病毒基因治疗载体能够显著抑制病毒复制，且腺相关病毒载体搭载hPGLYRP2比搭载mPGLYRP2基因更具优势。
在病毒注射的6周后，相对于mPGLYRP2-/-组，WT(mPGLYRP2)组和hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组的小鼠血液中病毒HBsAg含量显著降低，其中，hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组比WT(mPGLYRP2)组小鼠血液中病毒HBsAg含量降低更为显著，提示hPGLYRP2和mPGLYRP2蛋白对体内病毒表面抗原的清除都具有显著作用，其中hPGLYRP2蛋白的清除作为更为显著(图14)。
在病毒注射的6周后，采用实时定量PCR检测小鼠肝脏的HBV cccDNA含量，发现相对于mPGLYRP2-/-组，WT(mPGLYRP2)组和hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组的小鼠肝脏中病毒cccDNA含量显著下降，其中，hPGLYRP2(mPGLYRP2-/-/hPGLYRP2)组比WT(mPGLYRP2)组小鼠血液中病毒cccDNA含量降低更为显著，提示hPGLYRP2和mPGLYRP2蛋白对体内病毒cccDNA的清除都具有显著作用，其中hPGLYRP2蛋白的清除作为更为显著(图15)。
目前的慢性乙型肝炎治疗策略可以有效地抑制HBV复制，但是难以实现彻底治愈，因为患者肝脏内游离的cccDNA长期存在于细胞核中，药物无法对其进行清除，停药后常常带来复发。因此，被感染的肝细胞长期带有cccDNA是病毒感染持久性的关键因素，也是乙肝治愈的主要障碍，而本发明在细胞和小鼠实验中均明确了其对乙肝病毒cccDNA的清除作用，作为能够清除体内cccDNA库的潜在药物，本发明将为彻底治愈乙肝带来希望。
Claims (10)
1.PGLYRP2基因在制备治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
2.PGLYRP2基因在制备清除乙型肝炎病毒cccDNA的药物中的应用。
3.一种用于清除乙型肝炎病毒的基因治疗载体，其特征在于，该基因治疗载体包括启动子、内含子、增强子和PGLYRP2基因编码区。
4.根据权利要求3所述的基因治疗载体，其特征在于，所述载体骨架为病毒载体或非病毒载体。
5.根据权利要求4所述的基因治疗载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体或博卡病毒载体；所述腺相关病毒载体为AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAV-DJ型腺相关病毒载体。
6.根据权利要求4所述的基因治疗载体，其特征在于，所述非病毒载体为脂质体纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、外泌体、多肽复合物、mRNA载体、iTOP或Feldan shuttle。
7.根据权利要求3所述的基因治疗载体，其特征在于，所述启动子为PGLYRP2基因启动子截短体M，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
8.根据权利要求3所述的基因治疗载体，其特征在于，所述增强子为CMV增强子和HBVEnII元件，CMV增强子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，HBV EnII元件的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
9.根据权利要求3所述的基因治疗载体，其特征在于，所述PGLYRP2基因编码区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
10.一种用于清除乙型肝炎病毒的药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有如权利要求3-9任一项所述的基因治疗载体。
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