CN117653714A - AAV9-HGF联合TGF-β-Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用 - Google Patents

AAV9-HGF联合TGF-β-Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了AAV9‑HGF联合TGF‑β/Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用。两者联合应用可以有效促进HGF表达，抑制TGF‑β；减弱肺损伤，抑制纤维化重塑。两者联用后具有较好的协同效果，对于矽肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。

Description

AAV9-HGF联合TGF-β-Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤 维化中的应用
技术领域
本发明属于医疗技术领域，具体涉及AAV9-HGF联合TGF-β-Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用。
背景技术
矽肺是以肺组织弥漫性纤维化为主的疾病，目前临床上仍缺乏有效治疗手段。因此，寻找有效治疗肺纤维化的药物是尘肺治疗的迫切需要。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)可以促进正常组织再生，防止肺、心、肾和肝的纤维化重塑。研究表明，HGF在纤维化的发展和/或进展过程中的表达呈负相关。转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)是一组多功能的多肽类细胞因子，对细胞的生长、分化和免疫功能具有重要的调节作用。TGF-β信号通路在上皮-间充质转化(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)过程中发挥重要作用，同时还能激活MAPK、PI3K/AKT、Rho通路诱导EMT过程发生，促进肺纤维化。因此，在肺纤维化疾病的发生发展过程中，HGF与TGF-β发挥了重要作用，并且可作为矽肺的潜在治疗靶点。
目前矽肺的发病机制尚不明确且临床上缺乏有效的治疗措施来逆转尘肺纤维化病变或减缓病变的进展。相较于传统治疗方法，基因治疗可通过导入正常基因或者编辑修复缺陷基因，实现对疾病的根源性治疗。腺相关病毒(rAAV)由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点被视为是最有前途的基因治疗手段，在世界范围内得到广泛应用。有研究表明，AAV9在全身用药后在病毒基因组分布和蛋白表达方面更具优势。因此，在本项研究中，我们将利用AAV9腺相关病毒优势与TGF-β/Smad信号通路抑制剂SB431542联合治疗小鼠矽肺纤维化，对于肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于，利用AAV9腺相关病毒靶向内皮细胞的优势，过表达关键抗纤维化分子HGF并使用TGF-β/Smad信号通路抑制剂SB431542对小鼠矽肺纤维化进行治疗。
本发明的技术方案为：
AAV9-HGF联合TGF-β/Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用，包括：
1、在治疗和/或预防和/或缓解和/或改善矽肺纤维化中的应用。
2、在制备治疗和/或预防和/或缓解和/或改善矽肺纤维化药物中的应用。
应用的方法为：构建AAV9-HGF腺相关病毒载体，包装后与TGF-β/Smad通路抑制剂SB431542联用。
作为改进，所述AAV9-HGF腺相关病毒载体的构建方法包括如下步骤：
NCBI查找野生型小鼠HGF基因序列(HGF,NM_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物；目的基因两端设计有XhoⅠ连接位点；将扩增得到的野生型小鼠HGF基因片段使用DNALigase连接至pAAV-ITR-CMV质粒上获得pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因；将pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒与解冻后的DH5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的LB培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的LB培养基上37℃培养12h；筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，XhoⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序。
作为改进，所述腺相关病毒包装的方法包括如下步骤：
病毒包装前将3-5×106个293FT细胞传代接种，培养16h-24h；按照CPT高效转染试剂盒说明书，将含有pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF的转染体系均匀加入接种293FT细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞；收集的细胞用PBS重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清；细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，PBS超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液。
本发明的技术优势在于：
AAV9-HGF与TGF-β/Smad通路抑制剂SB431542联合应用可以有效促进HGF表达，抑制TGF-β；使促进肺部正常组织再生，抑制纤维化重塑。两者联用后具有较好的协同效果，对矽肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。
附图说明
图1为pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF过表达质粒图谱。
图2为pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF过表达质粒酶切鉴定图。
图3为pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF过表达质粒测序图。
图4为pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒转染293FT细胞图。
图5为各组小鼠肺组织中HGF蛋白相对表达含量(n＝6)。
图6为AAV9-HGF治疗矽肺后小鼠肺组织病理学染色图像(HE染色、MASSON染色、SiriusRed染色)。
图7为AAV9-HGF治疗矽肺后小鼠肺组织纤维化指标标情况。
图8为AAV9-HGF治疗矽肺后小鼠肺组织HGF和TGF-β表达情况。
图9为SB431542治疗矽肺后小鼠肺组织病理学染色图像(HE染色、MASSON染色、SiriusRed染色)。
图10为SB431542治疗矽肺后小鼠肺组织纤维化指标标情况。
图11为AAV9-HGF治疗矽肺后小鼠肺组织HGF和TGF-β表达情况。
图12为AAV9-HGF和SB431542联合治疗矽肺后小鼠肺组织病理学染色图像(HE染色、MASSON染色、SiriusRed染色)。
图13为AAV9-HGF和SB431542联合治疗矽肺后小鼠肺组织纤维化指标表达情况。
图14为小鼠联合治疗后肺血管内皮细胞免疫荧光图。
其中：
图14中，A为转染72h后白光图；B为转染72h后荧光图；比例尺：100μm；
图5-6以及图9-10中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限定本发明的保护范围。
1.实验动物分组
SPF级6-8周龄C57BL/6小鼠36只，体重为20-24g，采用随机数字表法按体重将小鼠分为6组，分别为：Saline组、SiO2组、SiO2+AAV-HGF组、SiO2+AAV-Control组、SiO2+SB431542组以及SiO2+AAV-HGF+SB431542组，每组6只。
2.腺相关病毒载体构建
NCBI查找野生型小鼠HGF基因序列(HGF,NM_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物(过表达基因序列见表1)。
表1过表达基因序列
目的基因两端设计有XhoⅠ连接位点。将扩增得到的野生型小鼠HGF基因片段使用DNALigase连接至pAAV-ITR-CMV质粒上获得pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因(图1)。将pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒与解冻后的DH5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的LB培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的LB培养基上37℃培养12h。筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，XhoⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序引物见表2。
表2RT-qPCR扩增引物序列
3.pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒包装
病毒包装前将3-5×106个293FT细胞传代接种，培养16h-24h。按照CPT高效转染试剂盒说明书，将含有pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF的转染体系均匀加入接种293FT细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基。转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞。收集的细胞用PBS重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清。细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，PBS超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液。
4.小鼠动物模型制备
在通风橱中使用异氟烷麻醉机将小鼠麻醉，外接麻醉呼吸机。暴露小鼠气管后，Saline组气管注射0.1mL的生理盐水，SiO2组气管注射100mg/mL的二氧化硅悬浊液0.1mL，按摩小鼠胸部，使液体能够肺部均匀分布，缝合皮肤后密切观察小鼠生存状况。
SiO2+AAV-HGF组与SiO2+AAV-Control组在小鼠矽肺模型手术后通过颈静脉分别注射AAV-HGF与AAV-EGFP病毒，每只小鼠注射病毒为3.21×1011vg；
SiO2+SB431542组于小鼠矽肺模型手术后第3、4、5天按5mg/kg通过腹腔注射SB431542工作液进行干预；
SiO2+AAV-HGF+SB431542组在小鼠矽肺模型手术后通过颈静脉注射AAV-HGF病毒，每只小鼠注射病毒为3.21×1011vg，并于手术后第3、4、5天按5mg/kg通过腹腔注射SB431542工作液进行干预。
各干预组小鼠术后28天，0.3mL10％水合氯醛腹腔注射麻醉处死小鼠，右肺下叶进行OCT包埋，右中叶用4％多聚甲醛固定，其余肺组织保存于-80℃冰箱，用于后续实验。
5.H&E染色
①脱蜡：将石蜡切片浸于二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ5min；
②水化：100％酒精3min×2次，95％、85％、75％梯度酒精3min×1次，蒸馏水摇床洗3min×2次；
③苏木素染色：苏木素染液滴于切片上染色5min，蒸馏水冲洗30s；
④1％盐酸乙醇分化5s；
⑤伊红染色：伊红染液8min，蒸馏水冲洗5s；
⑥脱水：依次浸入75％、85％、95％梯度酒精，每种浓度酒精3s×1次，100％酒精30s×2次；
⑦透明：二甲苯溶液3min×2次；
⑧封片：中性树脂封片后于光镜下观察；
6.天狼星红染色
①脱蜡、水化同上；
②天狼星红染液滴染1h，蒸馏水摇床洗5次，2min/次；
③脱水、透明、封片同上。
7.Masson染色
①脱蜡水化同上；
②将配制好的weigert染色液滴于石蜡切片上染色5min；
③盐酸乙醇分化液滴染10s，使用自来水流水冲洗1min；
④使用Masson蓝化液滴染5min，蒸馏水摇床清洗2次，3min/次；
⑤使用丽春红染液滴染3min，蒸馏水摇床清洗3次，2min/次；
⑥使用磷钼酸溶液滴染7min，蒸馏水摇床清洗2min；
⑦使用苯胺蓝溶液滴染15min，蒸馏水摇床清洗2min；
⑧使用弱酸工作液滴染1min，自来水流水冲洗1min；
⑨脱水、透明、封片同上。
8.羟脯氨酸含量测定
①称取小鼠肺组织30mg放入离心管中使用组织匀浆仪破碎，加入水解液1mL，混匀，放入95℃水浴锅中20min；
②将各离心管流水冷却后加入PH指示剂并将PH调整至6.0-6.8左右；
③离心管中加蒸馏水至10mL并混匀；
④取3-4mL稀释的水解液加适量活性炭混匀，3500转/min离心10min，取上清1mL后续检测；
⑤依照说明书依次加入试剂，混匀后60℃水浴15min，冷却后3500转/min离心10min；
⑥离心后取上清液于波长550nm处测定各管吸光度，依照说明书计算羟脯氨酸含量。
9.免疫荧光
①冰冻切片从-80℃取出置于暗盒中，待其恢复至室温；
②使用4％多聚甲醛溶液固定15min，PBS溶液摇床清洗5min；
③免疫组化笔于组织周围画圈；
④0.3％Triton-X100孵育打孔20min，PBS溶液摇床清洗3次，3min/次；
⑤5％牛血清白蛋白封闭30min；
⑥一抗按1：100比例稀释后滴于组织上，4℃过夜孵育；
⑦冰箱取出切片，待其回温后PBS溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑧二抗按照1：200比例稀释后滴于组织上，37℃温箱孵育2h，PBS溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑨滴加DAPI溶液孵育5min，PBS溶液摇床清洗5次，3min/次；
⑩擦干切片上残留液体，滴加抗荧光猝灭剂后封片，于激光共聚焦显微镜下观察。
10.WesternBlot
①将提取的蛋白与5×loadingbuffer按照4:1比例混合，95℃金属浴5min使蛋白变性；
②电泳与电转：用SDS-PAGE凝胶电泳，每孔准确加入30μg总蛋白，浓缩胶电压条件恒压80V，蛋白跑至分离胶后转恒压120V，恒流0.3A湿式转入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜中；
③封闭：PVDF膜放入5％脱脂牛奶中封闭2h；
④一抗孵育：按照1:1000比例稀释一抗，将PVDF膜放入一抗中4℃过夜；使用PBST摇床漂洗5min×3次；
⑤二抗孵育：按照1:3000比例稀释二抗，根据一抗种属加入相应二抗，室温孵育2h，使用PBST漂洗10min×3次；
⑥显影：PVDF膜浸入ECL试剂中4-5s后全自动化学发光检测仪拍照。使用Imagelab软件进行蛋白分析。
11.实时荧光定量PCR
采用小鼠肺组织,提取总RNA,测定浓度后进行反转录,加入扩增反应体系运用qRT-PCR法扩增,扩增引物序列见表3,反应结束后可得样品ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。
表3所用引物序列
12.统计学方法
数据分析采用用SPSS25.0软件，作图使用Graphpad8.0软件。实验数据以x±s表示，多组间的数据比较采用单因素方差(One-wayANOVA)分析，进一步进行组间两两比较时，采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
1.pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒酶切鉴定
利用PCR获取HGF的目的基因，与pAAV-ITR-CMV质粒XhoⅠ单酶切产物相连接构建形成重组质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示分别在2.5kb和5.0kb附近有单一的目的条带，产物片段大小与预期大小一致。测序结果与设计序列一致，证明病毒载体构建成功。
2.pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF病毒包装纯化及滴度检测
pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF转染体系与293FT细胞共培养后，倒置显微镜下观察显示细胞生长状态良好，胞浆透亮，胞核隐约可见。荧光倒置显微镜下观察到293FT细胞发绿色荧光，表明腺相关病毒包装成功。纯化后使用PCR法测定AAV9-HGF病毒滴度为5.22×1012vg/mL，可以满足接下来的体内外实验需求。
3.小鼠肺组织中HGF蛋白的表达
通过颈静脉注射给予小鼠pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF过表达病毒后，通过westernblot检测发现小鼠肺组织中过表达组HGF蛋白相对表达水平(1.60±0.21)较生理盐水组(0.45±0.13)或阴性对照组(0.69±0.24)显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。表明我们构建的病毒载体在动物肺组织中高表达HGF。
4.HE染色结果
SiO2+AAV-HGF组小鼠矽肺纤维化程度减轻，而SiO2+AAV-Control组小鼠细胞外基质增多，肺泡破坏程度与SiO2组相似；Masson染色与天狼猩红染色结果显示：SiO2+AAV-HGF组小鼠肺组织胶原纤维含量明显减少，病理改变轻于SiO2组，而SiO2+AAV-Control组仍存在矽结节；羟脯氨酸含量检测结果表明：SiO2+AAV-HGF组小鼠羟脯氨酸含量较SiO2组与SiO2+AAV-Control组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
5.WesternBlot实验结果
SiO2+AAV-HGF组小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-β蛋白较SiO2组及SiO2+AAV-Control组小鼠均表达减少(P<0.05)；qRT-PCR结果显示：SiO2+AAV-HGF组小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-βmRNA表达水平较SiO2组及SiO2+AAV-Control组小鼠表达减少(P<0.05)。
6.免疫荧光结果
SiO2+AAV-HGF组小鼠肺血管内皮细胞中HGF蛋白较SiO2组小鼠荧光强度增加，TGF-β蛋白荧光强度降低。
7.病理切片染色结果
SB431542组小鼠矽肺纤维化程度较SiO2组小鼠程度减轻；羟脯氨酸含量检测结果表明：SB431542组小鼠羟脯氨酸含量较SiO2组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
8.WesternBlot实验结果
SB431542组小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-β蛋白较SiO2组小鼠均表达减少(P<0.05)；qRT-PCR结果显示：SB431542组小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-βmRNA较SiO2组小鼠均表达减少(P<0.05)。
9.免疫荧光结果
SB431542组小鼠肺血管内皮细胞中HGF蛋白较SiO2组小鼠荧光强度增加，TGF-β蛋白荧光强度降低。
10.病理切片染色结果显示
联合给药组(即SiO2+AAV-HGF+SB431542组)小鼠矽肺纤维化程度较SiO2组小鼠减轻；羟脯氨酸含量检测结果表明：联合给药组小鼠羟脯氨酸含量较SiO2组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
11.WesternBlot实验结果
联合给药组(即SiO2+AAV-HGF+SB431542组)小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-β蛋白较SiO2组小鼠均表达减少(P<0.05)；qRT-PCR结果显示，联合给药组小鼠α-SMA、CollagenⅠ及TGF-βmRNA表达水平较SiO2组小鼠均表达减少(P<0.05)。
12.免疫荧光结果
如图14中所示，小鼠联合治疗组(即SiO2+AAV-HGF+SB431542组)肺血管内皮细胞中HGF蛋白荧光强度较SiO2+SB431542组与SiO2+AAV-HGF组小鼠荧光强度增加且TGF-β荧光强度降低。
表明AAV9-HGF与TGF-β/Smad受体抑制剂SB431542联合应用可以有效促进HGF表达，抑制TGF-β；使促进肺部正常组织再生，抑制纤维化重塑。两者联用后具有较好的协同效果，肺纤维化疾病的治疗具有重要临床应用价值。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不等同于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，不脱离本发明的精神和范围下所做的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.AAV9-HGF联合TGF-β/Smad受体抑制剂SB431542在治疗矽肺纤维化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在治疗和/或预防和/或缓解和/或改善矽肺纤维化中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在制备治疗和/或预防和/或缓解和/或改善矽肺纤维化药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：构建AAV9-HGF腺相关病毒载体，包装后与TGF-β/Smad受体抑制剂SB431542联用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AAV9-HGF腺相关病毒载体的构建方法包括如下步骤：
NCBI查找野生型小鼠HGF基因序列(HGF,NM_001289458)，根据查找的基因序列设计并合成基因扩增引物；目的基因两端设计有XhoⅠ连接位点；将扩增得到的野生型小鼠HGF基因片段使用DNA Ligase连接至pAAV-ITR-CMV质粒上获得pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF腺相关病毒骨架质粒，质粒上带有绿色荧光标记基因；将pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF质粒与解冻后的DH5α感受态细胞混匀冰浴30min，42℃水浴60s，冰浴2min，加入不含抗生素的LB培养基37℃摇床震荡45min后于含抗生素的LB培养基上37℃培养12h；筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒，XhoⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述测序引物为：
RT-qPCR扩增引物序列
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述腺相关病毒包装的方法包括如下步骤：
病毒包装前将3-5×106个293FT细胞传代接种，培养16h-24h；按照CPT高效转染试剂盒说明书，将含有pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF的转染体系均匀加入接种293FT细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；转染72h后，观察荧光并拍照，判断转染效率并收集细胞；收集的细胞用PBS重悬，反复冻融裂解细胞，细胞裂解液中加入全能核酸酶处理半小时，随后15000rpm离心30min，取上清；细胞裂解液上清经过碘克沙醇梯度高速离心，得到初步纯化的腺相关病毒，PBS超滤除去碘克沙醇得到最终纯化的病毒液。
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