CN117925714B - 一种高效稳定的mRNA转录载体构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效稳定的mRNA转录载体构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。具体公开了一种转录骨架元件，具有结构：S1‑S2‑S3‑S4‑S5‑S6；所述结构中包含酶切位点、启动子元件、5’‑UTR元件、可变目的蛋白基因序列、3’‑UTR元件、PolyA尾元件；本发明通过对传统PolyA尾的改造，同时对3’‑UTR和5’‑UTR序列的进行重新设计组装，显著提高了PolyA尾稳定性，提高了转录质粒转录的mRNA的稳定性，进而提高了蛋白翻译效率和维持时间。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种高效稳定的mRNA转录载体构建方法及其应用。
背景技术
mRNA转录载体设计是基因工程技术中的重要环节，它涉及到将目的基因插入到质粒中，并利用特定启动子和终止子进行转录，以实现对特定蛋白质的体外合成。在过去的数十年中，随着生物技术的不断发展，mRNA转录载体设计的技术也在不断进步和完善。
mRNA转录载体设计的技术背景可以追溯到上个世纪末，当时科学家们开始尝试将目的基因插入到质粒中，并利用特定启动子和终止子进行转录。在当时，这种方法被认为是一种非常有前途的基因表达方法，因为它可以在体外合成出具有特定功能的蛋白质，而且这种蛋白质可以更加纯净、安全和高效。
在mRNA转录载体设计的技术发展中，科学家们不断尝试不同的方法和技术，以优化转录效率和产物的稳定性。其中，选择含有强启动子和终止子的质粒作为基础载体是其中一种重要的方法。强启动子可以促进转录的起始，而强终止子可以确保转录的终止，从而提高了转录的效率和产物的稳定性。
除了选择合适的启动子和终止子外，科学家们还尝试了添加诱导剂等方法，以促进质粒的转录和翻译过程。这些诱导剂包括各种化学物质和调节因子等，可以与质粒上的特定基因序列结合，促进基因的表达和蛋白质的合成。
随着生物技术的不断发展和进步，mRNA转录载体设计的技术也在不断改进和完善。目前，已经有多种不同的mRNA转录载体被开发出来，每种载体都具有不同的特点和应用范围。同时，随着测序技术和生物信息学的不断发展，人们也可以更加深入地了解基因表达的调控机制和蛋白质的功能，从而为mRNA转录载体设计提供了更多的思路和方向。
总之，mRNA转录载体设计是基因工程技术中的重要环节，它涉及到将目的基因插入到质粒中，并利用特定启动子和终止子进行转录，以实现对特定蛋白质的体外合成。在过去的数十年中，随着生物技术的不断发展，mRNA转录载体设计的技术也在不断进步和完善。
目前被广泛应用的mRNA转录质粒是早期传统的转录质粒模型。选用人β-球蛋白的3’-UTR和5’-UTR序列为mRNA转录的主要功能元件加载在工程质粒上，利用T7启动子序列对质粒的转录进行启动。随着人们对mRNA疫苗的研发领域的重视，对mRNA转录质粒的要求也越来越高，传统的mRNA转录质粒已经不能满足更前沿的使用要求。一步法加尾是mRNA生产中比较前沿且经济有效的方法。但是连续的PolyA尾结构为质粒本身引入了更大的不稳定性，mRNA转录质粒在工程菌中扩增传代时，经常出现PolyA碱基缺失的情况，极大影响了转录质粒转录的mRNA的稳定性，进而影响了蛋白翻译水平。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种高效稳定的mRNA转录骨架元件、含有该转录骨架元件的转录载体及其构建方法、应用；通过对传统PolyA尾的改造，同时对3’-UTR和5’-UTR序列的进行重新设计组装，提高了PolyA尾稳定性，提高了转录质粒转录的mRNA的稳定性，进而提高了蛋白翻译水平。
为实现上述目的，本发明公开了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种转录骨架元件，具有结构：S1-S2-S3-S4-S5-S6；
所述S1为启动子元件；
所述S2为5’-UTR元件；
所述S3为酶切位点或可变目的蛋白基因序列；
所述S4为3’-UTR元件；
所述S5为PolyA尾元件；
所述S6为酶切位点；
所述5’-UTR元件为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述PolyA尾元件由120个A碱基和1个G碱基组成，其中G碱基将120个A碱基分成两个60个A碱基的等长区域。
进一步地，所述3’-UTR元件为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述S3的酶切位点为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述启动子为T7启动子，T7启动子序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的转录骨架元件在构建高效稳定的mRNA转录载体的应用。
第三方面，本发明提供了一种mRNA转录载体，所述mRNA转录载体含有第一方面所述的转录骨架元件。
进一步地，所述mRNA转录载体还包含有表达质粒骨架；
所述表达质粒骨架为pUC57原核表达质粒骨架，所述pUC57原核表达质粒骨架为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的mRNA转录载体，或其基因组中整合有如第一方面所述的转录骨架元件。
第四方面，本发明提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞含有：如第三方面所述的mRNA转录载体，或其基因组中整合有如第一方面所述的转录骨架元。
第五方面，本发明提供了一种mRNA疫苗组合物，所述疫苗组合物含有用于表达免疫原的mRNA，所述mRNA包含第一方面所述的转录骨架元件。
第六方面，本发明提供了一种第三方面所述的mRNA转录载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)选取PolyA尾，为120个A碱基，将120个A碱基进行截段，利用单个碱基G将120个A碱基分为两个60个A的等长区域；
(2)在设计转录质粒的UTR时，在翻译起始密码子(AUG)直接上游设计Kozak序列(GCCACC)，利用软件对符合多肽序列进行优化设计，得优化后的5’-UTR元件；
所述5’-UTR元件序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
(3)选取小鼠的Rps27a基因的3’-UTR序列，同时引入了辛德毕斯病毒sgRNA的3’-UTR部分功能序列作为辅助元件，组装得3’-UTR元件；
所述3’-UTR元件序列如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(4)在5’-UTR元件与3’-UTR元件之间引入酶切位点序列，以便于目的蛋白基因序列的引入；
所述酶切位点序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(5)PolyA尾序列连接在3’-UTR元件之后，在PolyA尾序列后引入酶切位点，便于载体线性化；
所述酶切位点序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
(6)在5’-UTR元件前添加T7启动子，以便于T7 RNA聚合酶识别转录起始位点；
所述T7启动子序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
(7)将上述得到的[T7启动子～5’-UTR元件～酶切位点～3’-UTR元件～PolyA尾～酶切位点]转录骨架元件连接在表达质粒骨架上，得mRNA转录载体；
所述表达质粒骨架为pUC57原核表达质粒骨架。
本发明的有益效果：
本发明通过对传统PolyA尾的改造，同时对3’-UTR和5’-UTR序列的进行重新设计组装，显著提高了PolyA尾稳定性，提高了转录质粒转录的mRNA的稳定性，进而提高了蛋白翻译效率和维持时间。
附图说明
图1为mRNA转录质粒NEW1和T1的构建流程图；其中A为将改造后的转录质粒(NEW1)的各个结构元件进行组合后，加载在pUC57质粒上；B为将传统转录质粒(T1)的各个结构元件进行组合后，加载在pUC57质粒上；
图2为NEW1-EGFP和T1-EGFP转录质粒的构建流程图；其中A为EGFP基因连接到NEW1转录质粒的基因加载区域，B为EGFP基因连接到T1转录质粒的基因加载区域；
图3为连续传代后发生PolyA尾碱基缺失的菌株数量图；
图4为T1-EGFP、T3-EGFP和NEW1-EGFP转录出的绿色荧光蛋白mRNA在293T细胞中翻译效率及维持时间图；
图5为T1-EGFP、T3-EGFP和NEW1-EGFP转录出的绿色荧光蛋白mRNA在小鼠DC细胞中翻译效率及维持时间图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
步骤(1)，选取PolyA尾最稳定且有效的长度，为120个A。将120个A碱基进行截段，利用单个碱基G将120个A碱基分为两个60个A的等长区域。
步骤(2)，首先，可以在翻译起始密码子(AUG)直接上游设计Kozak序列(GCCACC)，因为这是许多哺乳动物mRNA中的保守序列，用于可靠地识别起始密码子；其次，排除5’-UTR中的上游AUG，以避免选择性翻译起始和可能导致氨基酸序列错移突变；第三，可以将次级结构最小化，以减少翻译起始复合物沿着5’-UTR顺利扫描的能量障碍。同时利用软件对符合多肽序列进行优化设计。
本发明优化得到的5’-UTR序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
对于3’-UTR的优化设计，本发明选取小鼠的Rps27a基因(transcript IDs:ENSMUST00000102845.10)的3’端UTR序列，同时引入了辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)sgRNA的3’-UTR部分功能序列作为辅助元件。本发明将此天然结构组装入转录质粒的3’-UTR部分。从而设计得到本发明的特殊3’-UTR序列。
特殊3’-UTR序列如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
步骤(3)，在将步骤(2)得到的5’-UTR与3’-UTR之间引入一段酶切位点(MSC)序列，以便于目的蛋白基因序列的引入。
酶切位点(MSC)序列如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
步骤(4)，将步骤a得到的PolyA尾序列后引入酶切位点，便于载体线性化。
酶切位点序列如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
步骤(5)，将步骤(2)得到的5’-UTR序列前添加T7启动子序列，以便于T7 RNA聚合酶识别转录起始位点。
T7启动子序列如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
步骤(6)，将上述结构元件连接在pUC57原核表达质粒骨架上，得改造后的转录质粒(NEW1)，如图1A所示；
所述pUC57原核表达质粒骨架序列如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
步骤(7)，构建传统mRNA转录质粒。该质粒包含T7启动子序列，β-球蛋白的5’-UTR和3’-UTR序列120个A的连续PolyA尾。在5’-UTR和3’-UTR以及PolyA尾后包含与改造质粒一样的酶切位点(MSC)序列，得传统mRNA转录质粒(命名为T1)，如图1B所示。
所述β-球蛋白的5’-UTR序列如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
所述β-球蛋白的3’-UTR序列如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
步骤(8)，将绿色荧光基因(EGFP)分别加载在改造后的转录质粒(NEW1)以及传统转录质粒(T1)上，利用无缝克隆技术分别将EGFP基因连接到NEW1和T1质粒的基因加载区域，分别得到NEW1-EGFP质粒和T1-EGFP质粒。用于后续转录mRNA翻译效果验证，如图2所示。
EGFP基因序列如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
步骤(9)，对传统mRNA转录质粒T1的PolyA尾进行改造，使其具备和改造后的转录质粒NEW1相同的PolyA尾，利用碱基G将PolyA尾截为两段，每段包含60个A碱基，得改造传统mRNA转录质粒(命名为T2)。
步骤(10)，对T1-EGFP进行5’-UTR改造，将T1-EGFP质粒的5’-UTR序列替换为NEW1的5’-UTR序列，替换后得到T3-EGFP质粒。
步骤(11)，通过使用商品化的T7 High Yield RNATranscription kit(Cat.No.:E131，近岸蛋白)以及Cap 1Capping System(Cat.No.:M082，近岸蛋白)对NEW1-EGFP和T1-EGFP进行体外转录和加帽，实验方法参照说明书。
实施例结果
(1)将PolyA尾进行截段设计后，通过与传统mRNA转录质粒进行对比，结果显示，极大提高了质粒在扩增中PolyA尾的稳定性。取包含NEW1、T1以及T2的Stbl3感受态细胞各1μL，转移至1mL氨苄抗性的液体LB培养基中进行扩增，扩增12h为一代。每个质粒设置50个对照组。每扩增10代后，对质粒进行测序。通过测序结果发现NEW1质粒在扩增传代中，PolyA尾的稳定性显著高于T1质粒，如图3所示。
(2)利用lipo3000转染试剂分别将5pmol T1-EGFP、T3-EGFP和NEW1-EGFP质粒转录出的EGFP的mRNA转入293T细胞中，通过观察转染后EGFP蛋白翻译强度以及维持时间，可以发现T3-EGFP质粒组的EGFP蛋白翻译效率以及翻译维持时间显著强于T1-EGFP质粒，如图4所示。
这说明将传统mRNA转录质粒T1的β-球蛋白5’-UTR序列替换为改造后的转录质粒(NEW1)中的5’-UTR序列，显著提高了mRNA的翻译效率和维持时间，而NEW1-EGFP的翻译效率和维持时间显著高于T3-EGFP。结果证实了NEW1质粒中的5’-UTR和3’-UTR的优越性。
目前DC疫苗研发当中，mRNA电转是抗原信息递呈的主要手段，因此本发明通过比较T1-EGFP、T3-EGFP和NEW1-EGFP转录出的绿色荧光蛋白mRNA在小鼠DC细胞中翻译效率及维持时间进行比较。结果显示T3-EGFP质粒转录出的EGFP蛋白在小鼠DC细胞中翻译效率以及翻译维持时间显著强于T1-EGFP质粒.而NEW1-EGFP质粒的效果显著优于T3-EGFP，进一步验证了NEW1载体的优越性能。如图5所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种转录骨架元件，其特征在于，具有结构：S1-S2-S3-S4-S5-S6；
所述S1为启动子元件；
所述S2为5’-UTR元件；
所述S3为酶切位点或可变目的蛋白基因序列；
所述S4为3’-UTR元件；
所述S5为PolyA尾元件；
所述S6为酶切位点；
所述5’-UTR元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的转录骨架元件，其特征在于，所述PolyA尾元件由120个A碱基和1个G碱基组成，其中G碱基将120个A碱基分成两个60个A碱基的等长区域。
3.根据权利要求1所述的转录骨架元件，其特征在于，所述3’-UTR元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的转录骨架元件，其特征在于，所述启动子为T7启动子，T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.权利要求1-4任一所述的转录骨架元件在构建高效稳定的mRNA转录载体的应用。
6.一种mRNA转录载体，其特征在于，含有权利要求1-4任一所述的转录骨架元件。
7.根据权利要求6所述的mRNA转录载体，其特征在于，还包含有表达质粒骨架；
所述表达质粒骨架为pUC57原核表达质粒骨架，所述pUC57原核表达质粒骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
8.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞含有：如权利要求6或7所述的mRNA转录载体，或其基因组中整合有如权利要求1-4任一所述的转录骨架元件。
9.一种mRNA疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有用于表达免疫原的mRNA，所述mRNA包含权利要求1-4任一所述的转录骨架元件。
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