CN116004696B - 可与IRES组合的3ˊUTR加茎环结构基因及其应用、mRNA表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因及其应用、mRNA表达系统。本发明提供的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，通过在mRNA的3′UTR序列的末端插入茎环序列构建得到；所述3′UTR序列选自β珠蛋白3′UTR、α珠蛋白3′UTR、非帽依赖性组蛋白3′UTR、肌红蛋白3′UTR、钙网蛋白3′UTR中的一种；所述茎环序列为不需要加poly A尾的天然或人工茎环结构序列。本发明通过试验筛选了可与IRES组合的3′UTR和茎环结构，其能够与IRES可形成稳定结构，实现真核细胞内高效翻译，翻译后其稳定性及表达效率接近于加帽加尾mRNA的表达水平。

Description

可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因及其应用、mRNA表达 系统

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因及其应用、mRNA表达系统。

背景技术

随着新冠病毒的爆发与蔓延，研发周期短、生物安全性高的mRNA疫苗受到了各大研究机构和制药公司的青睐。mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体，直接进行翻译以生成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防免疫的作用。mRNA疫苗的生产过程主要包括质粒原液的制备、mRNA原液的制备与纯化、mRNA疫苗制剂的生产等步骤。其中，mRNA原液制备过程直接影响mRNA疫苗的质量和生产成本，因此优化mRNA原液的生产工艺十分重要。mRNA原液的生产过程始于大量生产扩增质粒DNA(pDNA)，以线性化质粒或者质粒的PCR产物为模板，利用T7、T3或Sp6噬菌体聚合酶等RNA聚合酶转录mRNA，在DNase I酶降解模板及纯化后，通过在5′端加上帽子结构以及在3′端加上ployA结构以加强mRNA的稳定性。

迄今为止，大规模的加帽方式主要有两种，分别为两步法酶法加帽和一步法共转录加帽。酶法加帽是最为传统的加帽方式，通过dsDNA作为底物，经过转录形成RNA，再经过鸟苷酰转移酶或二氧甲基转移酶分别产生cap 0(N7MeGpppN)和cap 1(N7MeGpppN2′-OMe)结构。这种加帽方式几乎可以达到100％的加帽率，但是加帽酶比较昂贵，需要的酶促成本高，批量生产成本高。另外，引入了额外的蛋白和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，需进行多次纯化，工艺流程繁琐。而采用一步法共转录加帽，其工艺简便，但加帽效率较低。

mRNA 3′端的poly A尾，最佳长度为120-150个核苷酸，过长或过短都会影响mRNA的稳定性和翻译效率。mRNA加尾方式有两种：一是通过使用重组poly A聚合酶进行修饰，但制备出的poly A尾长度不同，容易存在批次差异，从而出现不均一性。且酶促反应价格昂贵，后续需要进行纯化，生产流程繁琐。二是通过在模板中添加多聚A序列，在体外直接转录生成。此方法操作简单，可以明确poly A尾的长度，但是编码这些长的polyA序列在基因合成或者PCR过程中会出现截断的情况，破坏用于转录的DNA的稳定性。

mRNA的体外转录过程相较其他大部分的疫苗生产方法更为安全快捷，但它所依赖的原材料却相对昂贵，另外因为修饰效率的影响，容易出现批次差异，影响mRNA在体内的翻译效率。因此，我们必须改进现有的IVT mRNA生产方案，降低mRNA的生产成本，实现mRNA生产工艺的稳定性，达到工业化产出。

mRNA发挥作用的基本原则为成功翻译功能性蛋白质，而蛋白质的数量则会受到mRNA翻译、合成和衰减速率的影响。通过顺式作用的结构元件与反式作用的调控因子相互作用，可以改变蛋白的表达水平和持续时间，以保证蛋白在细胞中的正常表达。因此了解mRNA翻译的细胞机制是成功改进mRNA IVT方案，优化mRNA结构的先决条件。mRNA的翻译过程包括起始，延伸和终止三个阶段，其中起始阶段在基因的表达调控中尤为重要。在原核生物中，起始阶段涉及到核糖体RNA与mRNA的直接相互作用。真核生物中则进化出一种更为复杂的机制，主要依赖于蛋白质-RNA和蛋白质-蛋白质的相互作用，这种复杂的翻译机制主要通过核糖体扫描和内部核糖体进入两种方式进行。细胞在生理或病理的胁迫条件下会调整自身蛋白质的表达水平，当帽依赖性翻译起始所依赖的蛋白质大量减少时，细胞会启动非帽依赖性翻译起始，以应对应激反应，启动细胞蛋白的正常表达。非帽依赖性翻译机制可以依赖内部核糖体进入位点(IRES)或非帽依赖性翻译增强子(CITE)来介导翻译起始过程。IRES是一种存在于5′UTR(5′翻译区)处的特殊结构元件，能在帽子结构缺失的情况下招募核糖体进行正常的翻译过程。IRES序列存在于多种病毒基因中，如脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和口蹄疫病毒等，以上IRES结构类似，可与mRNA 3’末端结合，进而与核糖体结合，开启蛋白翻译。

在真核生物的细胞核中，绝大多数转录出的mRNA会在其3′末端修饰由70-200个单一腺苷酸残基构成的多聚腺苷酸尾。poly A尾不仅对mRNA的加工、运输、转运产生影响，还与mRNA的翻译效率直接相关。复制依赖型组蛋白mRNA是真核生物中唯一已知的非多聚腺苷酸化mRNA，其3′末端含有一个高度保守的茎环结构，该茎环结构代替了真核生物poly A尾的功能。茎环结合蛋白(SLBP)与茎环结构相互作用形成的SLBP-茎环复合物，参与了组蛋白mRNA代谢的所有步骤，即组蛋白mRNA的加工、核输出、翻译和降解。与多聚腺苷酸化mRNA的翻译机制类似，复制依赖性组蛋白的翻译依赖一种特殊的环化机制。SLBP-茎环复合物的形成是其翻译所必需的，而SLBP类似于PABP，SLBP利用SLIP1与eIF4G相互作用，使5′cap和茎环通过eIF4E-eIF4G-SLIP1-SLBP形成环化结构，从而促进mRNA的高效翻译。

因此，为了简化mRNA的生产流程，降低mRNA的生产成本，急需开发一种无需加帽和加尾修饰，并且可转录出可稳定表达的mRNA的序列结构和表达系统。

发明内容

基于以上目的，本发明的目的之一在于提供一种可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，其筛选了一种可与IRES组合的3′UTR加茎环序列，替代mRNA的poly A结构，因此使得mRNA的翻译不需要加帽加尾，可实现细胞内高效翻译。

本发明的目的之二在于提供一种重组表达载体，采用该载体体外转录出的mRNA不需要加帽加尾修饰即可获得可高效翻译的mRNA。

本发明的目的之三在于提供一种可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因的应用，在体外转录获得该mRNA序列之后，无需加帽加尾修饰，注入真核细胞后，即可在细胞内开启翻译，产生相应蛋白质。

本发明的目的之四在于提供一种mRNA表达系统，其包含内部核糖体进入位点(IRES)、目的蛋白编码区、3′UTR序列、茎环序列，可实现无需加帽和加尾修饰，即可转录出可稳定表达的mRNA，简化mRNA的生产流程，降低mRNA的生产成本。

为了实现上述目的，本发明的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，采用如下技术方案实现：

一种可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，通过在mRNA的3′UTR序列的末端插入茎环序列构建得到；所述3′UTR序列选自β珠蛋白3′UTR、α珠蛋白3′UTR、非帽依赖性组蛋白3′UTR、肌红蛋白3′UTR、钙网蛋白3′UTR中的一种；所述3′UTR序列的拷贝数为1～6个拷贝重复；所述茎环序列为不需要加poly A尾的天然或人工茎环结构序列。

本发明提供的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，可实现真核细胞内无帽无尾mRNA的高效翻译。本发明通过试验筛选了可与IRES组合的3′UTR和茎环结构。试验证明，本发明提供的3′UTR加茎环结构能够与IRES形成稳定结构，可实现真核细胞内高效翻译，此结构翻译效率类似于3′UTR加PolyA与5′cap-UTR结构组合。当mRNA含有IRES、蛋白编码序列、3′UTR序列和茎环结构时，能够实现细胞内高效蛋白翻译，其稳定性及表达效率接近于加帽加尾mRNA的表达水平。

本发明中，3′UTR即3′非翻译区，为mRNA分子3′端不编码蛋白质区域对应的DNA序列。进一步地，为了提高mRNA的翻译效率以及延长mRNA的半衰期，本发明在3′UTR的选择上采用了半衰期较长的人源β珠蛋白的3′UTR序列，并且经试验发现采用三个重复拷贝的3′UTR序列，具有最优的表达稳定性和表达效果。因此，为了提高稳定性及表达效率，优选地，所述3′UTR序列为β珠蛋白3′UTR；所述3′UTR序列的拷贝数为3个拷贝重复；所述茎环序列为组蛋白茎环序列。

优选地，所述可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长为442bp。该序列中含有三个拷贝重复的β珠蛋白3′UTR序列以及组蛋白3′末端茎环序列。其中，第1～134、141～274、283～416位点为三个重复的β珠蛋白3′UTR序列，417～442位点为组蛋白3′末端的茎环序列。此外，第135-140、275-282位点为基因克隆过程中使用的限制性内切酶的酶切位点。

本发明还提供一种重组表达载体，其包含IRES元件以及如上所述的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因。

采用本发明的重组表达载体，体外转录出的mRNA不需要加帽加尾修饰即可获得可高效翻译的mRNA。

本发明的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因的应用，具体是在细胞、组织、生物体或不含细胞的表达系统中的应用。

本发明的mRNA表达系统，采用的技术方案是：

一种mRNA表达系统，其构建过程包括以下步骤：

(1)获取携带IRES的载体，然后在IRES载体中插入如上所述的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因构建IRES-3′UTR-stem质粒；

(2)将目的蛋白的DNA序列通过分子克隆插入在IRES-3′UTR-stem质粒的IRES与3′UTR序列之间，获得重组质粒；

(3)根据IRES序列以及茎环序列设计引物，以重组质粒为模板，利用引物进行PCR扩增，实现mRNA的表达。

优选地，所述携带IRES的载体的获取过程为：获取IRES元件的序列，将IRES元件的序列克隆到质粒的多克隆位点之间，并转化到感受态细胞，获得携带IRES的载体。

进一步地，所述目的蛋白为蛋白编码序列，蛋白例如可以是抗原、抗体、酶等序列。

本发明的mRNA表达系统，在5′UTR位置选择了IRES元件，以代替mRNA的5′cap-UTR结构。为了实现不用加尾修饰的目的，并保证与IRES组合后的高效翻译，本发明在茎环序列前加入特定的3′UTR(3′非翻译区)序列，解决了IRES元件与茎环序列结合的不稳定问题，从而使之能够有效代替mRNA的poly A结构。

因此，本发明的表达系统中，包含内部核糖体进入位点(IRES)、目的蛋白编码区、3′UTR序列、茎环序列。本方法制备的用于真核系统表达的mRNA，无需额外加冒加尾处理。因此，可简化mRNA的生产流程，降低生产成本，使mRNA的生产工艺更加稳定，可促进mRNA原液生产的连续化与自动化。

附图说明

图1为实施例2中的体外转录模板结构示意图；

图2为实施例2中在激光共聚焦显微镜下观察IRES-EGFP-1/2β-stem、IRES-EGFP-β-stem、IRES-EGFP-2β-stem PCR产物、IRES-EGFP-3β-stem与IRES-EGFP-4β-stem mRNA转染24h后的293T细胞的荧光结果图；

图3为实施例2中酶标仪检测IRES-EGFP-1/2β-stem、IRES-EGFP-β-stem、IRES-EGFP-2β-stem PCR产物、IRES-EGFP-3β-stem与IRES-EGFP-4β-stem mRNA转染24h后的293T细胞的荧光强度结果；

图4为实施例2中在不同的转染时间条件下，含有不同拷贝数的3′UTR mRNA在细胞中的含量；

图5为实施例2中在具体的转染时间条件下，含有不同拷贝数的3′UTR mRNA在细胞中的含量；

图6为实施例2中在激光共聚焦显微镜下观察IRES-EGFP-3β-stem、cap-EGFP-3β-polyA与EGFP-3βmRNA转染24h后的293T细胞的荧光结果图；

图7为实施例2中酶标仪检测IRES-EGFP-3β-stem、cap-EGFP-3β-polyA与EGFP-3βmRNA转染24h后的293T细胞的荧光强度结果；

图8为实施例2中在不同的转染时间条件下，293T细胞中的EGFP mRNA含量；

图9为实施例2中在具体的转染时间条件下，293T细胞中的EGFP mRNA含量；

图10为实施例3中的体外转录模板结构示意图；

图11为实施例3中酶标仪检测293T细胞的荧光强度结果；

图12为实施例3中在不同的转染时间条件下，293T细胞中的luciferase mRNA含量；

图13为实施例3中在具体的转染时间条件下，293T细胞中的luciferase mRNA含量；

图14为实施例4中的体外转录模板结构示意图；

图15为实施例4中293T细胞内介导的RBD蛋白表达水平测试结果图；

图16为实施例4中在不同的转染时间条件下，293T细胞中的RBD mRNA含量；

图17为实施例4中在具体的转染时间条件下，293T细胞中的RBD mRNA含量。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

以下实施例中，为了方便描述，以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES元件为例。除了实施例中源于EMCV的IRES元件，任意适宜的IRES元件均可采用，本发明不对其进行特殊限制。

实施例1

本实施例提供的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，为mRNA的3′UTR序列的末端插入茎环序列构建得到；所述3′UTR序列为β珠蛋白3′UTR；所述3′UTR序列的拷贝数为3个拷贝重复；所述茎环序列为组蛋白茎环序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在其他的实施方式中，3′UTR序列还可选自α珠蛋白3′UTR、非帽依赖性组蛋白3′UTR、肌红蛋白3′UTR、钙网蛋白3′UTR中的一种。

在其他的实施方式中，3′UTR序列的拷贝数还可为1～6个拷贝重复中的其他拷贝数。

在其他的实施方式中，茎环序列还可采用其他的不需要加poly A尾的天然或人工茎环结构序列。

进一步地，本实施例还提供一种重组表达载体，其采用上述可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，与IRES组合构建IRES-3β-stem载体，具体构建方法如下：

(1)在GenBank数据库中检索到EMCV病毒的全基因组序列(KF836387.1)，选取IRES元件的碱基部位为第129-727位，共599个碱基。将该序列克隆到质粒的多克隆位点EcoR I和Nco I之间，并转化到DH5α感受态细胞，获得携带IRES载体。

(2)在获得的携带IRES载体中插入人源的β珠蛋白3′UTR序列加组蛋白茎环序列(茎环序列采用stem表示)，以提取的人的口腔上皮DNA为模板，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)获得含有限制性核酸内切酶BamH I和Sma I位点的β珠蛋白3′UTR序列加茎环序列(stem)，茎环在PCR扩增引物上携带。随后，克隆到IRES载体中，获得含有一个3′UTR加茎环的IRES-β-stem载体。

(3)以提取的口腔上皮DNA为模板通过PCR，获得含有限制性内切酶Sma I和XbaI位点的β珠蛋白3′UTR序列，并克隆到IRES-β-stem载体中，获得有两个3′UTR加茎环的IRES-2β-stem载体。

(4)以提取的口腔上皮DNA为模板通过PCR，获得含有限制性内切酶Xba I和Not I位点的β珠蛋白3′UTR序列，并克隆到IRES-2β-stem载体中，获得含有三个3′UTR加茎环的IRES-3β-stem载体。

本实施例构建的IRES-3β-stem表达载体，该载体含有IRES元件、3′UTR以及茎环序列，可将目的基因插入IRES与3′UTR之间的酶切位点之间。通过在上游引物的5′末端添加T7启动子序列，PCR扩增出含有T7启动子、IRES、目的基因、3′UTR、stem序列的DNA片段。以该DNA为模板，体外转录出的mRNA不需要加帽加尾修饰即可获得可高效翻译的mRNA。

实施例2

本实施例提供mRNA表达系统的实施例，具体是一种编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的IRES-EGFP-3β-stem表达系统。利用该系统得到的体外转录模板的示意图如图1所示，具体步骤如下：

(一)IRES-EGFP-3β-stem载体的构建

合成引物扩增绿色荧光蛋白EGFP编码区序列，通过分子克隆技术将该序列构建到IRES-β-stem、IRES-2β-stem、IRES-3β-stem、IRES-4β-stem载体中，用于检测EGFP的表达。IRES-β-stem、IRES-2β-stem、IRES-3β-stem、IRES-4β-stem载体的制备过程参照实施例1进行。

(二)mRNA的体外转录

以IRES-EGFP-β-stem、IRES-EGFP-2β-stem、IRES-EGFP-3β-stem和IRES-EGFP-4β-stem质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增引物如下：

IRES-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCCCCCCTCTCCCTC-3′(如SEQ ID NO.2所示)；

stem-R：5′-TGGGTGGCTCTGAAAAGAGCCTT-3′(如SEQ ID NO.3所示)。

扩增完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，将条带正确且明亮的PCR产物进行回收纯化，并以回收的DNA产物为模板进行体外转录、DNaseI消化以及磁珠回收纯化，取少量纯化后的mRNA，进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带的大小及亮度分析扩增结果是否正确。

(三)分析不同拷贝数的3′UTR长度对IRES-stem载体系统翻译效率的影响

为了观察不同拷贝数的3′UTR对IRES-stem载体系统翻译效率的影响，本发明将体外转录得到含有不同拷贝β珠蛋3′UTR的IRES-EGFP-1/2β-stem、IRES-EGFP-β-stem、IRES-EGFP-2β-stem、IRES-EGFP-3β-stem mRNA以及IRES-EGFP-4β-stem mRNA以等浓度转染293T细胞。在转染24h后，利用激光共聚焦荧光显微镜与酶标仪分析293T细胞的荧光强度，实验结果如图2与图3所示。

由图2和图3可以看出，与单拷贝3′UTR相比，双拷贝3′UTR、三拷贝3′UTR以及四拷贝3′UTR介导的mRNA绿色荧光蛋白表达量显著增强，其中添加三拷贝3′UTR的mRNA绿色荧光蛋白表达量显著高于其他拷贝数。

为了进一步研究不同拷贝数的3′UTR对IRES-stem系统的影响，本发明通过实时荧光定量PCR对mRNA在胞内的表达量进行分析，以评估不同拷贝数的3′UTR对于mRNA稳定性的影响。实验结果如图4与图5所示。

由图4和图5可以看出，在转染后的不同时间点，添加三拷贝3′UTR与四拷贝3′UTR的mRNA在293T细胞中的表达水平得到了显著性提高(p<0.001)。其中，以添加单拷贝3′UTR的mRNA为对照，添加双拷贝3′UTR的mRNA在不同时间点表达水平也有不同程度的提高；添加1/2β珠蛋白3′UTR的mRNA表达水平有所降低。

综上可知，三拷贝β珠蛋白3′UTR介导的基因表达具有最为稳定高效的作用效果。

(四)对比试验

为了评价该载体的表达效率与稳定性，本发明制备了需要加帽加尾的对照载体，该载体用人的β珠蛋白的5′UTR序列代替了IRES结构，并且删除了组蛋白茎环序列，该载体命名为β-EGFP-3β。将该载体进行PCR扩增、PCR产物回收、体外转录、DNaseI消化、加帽加尾修饰以及回收纯化之后，得到具有5′cap-UTR和3′ploy A结构的cap-EGFP-3β-ploy A的mRNA以及不含帽子结构与polyA结构的对照组EGFP-3β-mRNA。

1)表达效率实验

利用lipofectamine2000转染试剂，将体外转录得到的IRES-EGFP-3β-stem、cap-EGFP-3β-poly A以及没有进行加帽加尾修饰的对照EGFP-3βmRNA以等浓度转染293T细胞。转染24h后，利用激光共聚焦荧光显微镜与酶标仪分析293T细胞的荧光强度，实验结果如图6与图7所示。

由图6和图7可以看出，利用本发明得到的IRES-EGFP-3β-stem载体，mRNA能够高效的表达EGFP目的基因，其翻译效率接近于加帽加尾修饰的cap-EGFP-3β-polyA mRNA，二者相比于不加帽加尾的对照mRNA，表达能力均得到了显著提高。

2)稳定性试验

将体外转录得到IRES-EGFP-3β-stem、cap-EGFP-3β-poly A以及没有进行加帽加尾修饰的对照EGFP-3βmRNA等浓度转染293T细胞，分别在转染的第6h、24h、48h、72h、96h提取细胞的RNA，通过RT-qPCR数据分析细胞中mRNA的降解情况。实验结果如图8与图9所示。

由图8与图9可知，利用本发明得到的IRES-EGFP-βstem mRNA与加帽加尾修饰mRNA相比，表达水平在不同时间点并无显著性差异(NS＝non-significant)，二者与不加帽加尾修饰的mRNA相比，在不同时间段的表达水平均得到了显著提高(p<0.001)。

实施例3

本实施例提供mRNA表达系统的实施例，具体是一种编码荧光素酶(luciferase)的IRES-stem表达系统。利用该系统得到体外转录模板示意图参考图10，具体实施方式如下。

(一)IRES-luciferase-3β-stem载体的构建

利用VIT 10.0Vector软件设计引物扩增luciferase序列，通过分子克隆技术将该序列构建到IRES-3β-stem载体中，得到的载体命名为IRES-LUC-3β-stem。

(二)mRNA的体外转录

以IRES-LUC-3β-stem质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增引物如下：

IRES-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCCCCCCTCTCCCTC-3′(如SEQ ID NO.2所示)；

stem-R：5′-TGGGTGGCTCTGAAAAGAGCCTT-3′(如SEQ ID NO.3所示)。

扩增完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将条带正确且明亮的产物进行回收纯化，并以回收的DNA产物为模板进行体外转录、DNaseI消化以及磁珠回收纯化，并取少量纯化后的mRNA，进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带的大小及亮度分析扩增结果是否正确。

(三)对比试验

为了评价该载体的表达效率与稳定性，本发明提供了需要加帽加尾的对照载体，该载体用人的β珠蛋白的5′UTR序列代替了IRES结构，并且删除了组蛋白茎环序列，该载体命名为β-LUC-3β。将该载体进行PCR扩增、PCR产物回收、体外转录、DNaseI消化、加帽加尾修饰以及回收纯化之后，得到具有5′cap和3′ploy A结构的cap-LUC-3β-ploy A mRNA以及不含帽子结构与polyA结构的LUC-3βmRNA。

1)表达效率实验

利用lipofectamine2000转染试剂，将体外转录得到的IRES-LUC-3β-stem、cap-LUC-3β-poly A以及没有进行加帽加尾修饰的对照LUC-βmRNA等浓度转染293T细胞。转染24h后，利用酶标仪分析293T细胞的荧光强度，实验结果如图11所示。

由图11可以看出，利用本发明得到的IRES-LUC-3β-stem mRNA能够高效的表达luciferase报告基因，其翻译效率接近于加帽加尾修饰的cap-LUC-3β-polyA mRNA，二者相比于不加帽加尾的对照mRNA，表达能力均得到了显著提高(p<0.001)。

2)稳定性试验

将体外转录得到IRES-LUC-3β-stem、cap-LUC-3β-poly A以及没有进行加帽加尾修饰的对照LUC-3βmRNA等浓度转染293T细胞，分别在转染的第6h、24h、48h、72h、96h提取细胞的RNA，通过RT-qPCR数据分析细胞中mRNA的降解情况。实验结果如图12和图13所示。

由图12和图13可知，利用本发明得到的IRES-LUC-3βstem mRNA与加帽加尾修饰mRNA相比，表达水平在不同时间点并无显著性差异(NS＝non-significant)，二者与不加帽加尾修饰的mRNA相比，在不同时间段的表达水平均得到了显著提高(p<0.001)。

实施例4

本实施例提供mRNA表达系统的实施例，具体是一种编码SARS-CoV-2抗原的IRES-stem表达系统。利用该系统得到体外转录模板示意图参考图14，具体实施方式如下。

(一)IRES-RBD-3β-stem载体的构建

将合成的SARS-CoV-2RBD序列通过分子克隆技术将该序列构建到IRES-3β-stem载体中，得到的载体命名为IRES-RBD-3β-stem。

(二)mRNA的体外转录

以IRES-LUC-3β-stem质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增引物如下：

IRES-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCCCCCCTCTCCCTC-3′(如SEQ ID NO.2所示)；

stem-R：5′-TGGGTGGCTCTGAAAAGAGCCTT-3′(如SEQ ID NO.3所示)。

扩增完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，将条带正确且明亮的PCR产物进行回收纯化，并以回收的DNA产物为模板进行体外转录、DNaseI消化以及磁珠回收纯化，并取少量纯化后的mRNA，进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带的大小及亮度分析扩增结果是否正确。

(三)对比试验

为了评价该载体的表达效率与稳定性，本发明提供了需要加帽加尾的对照载体，该载体用人的β珠蛋白的5′UTR序列代替了IRES结构，并且删除了组蛋白茎环序列，该载体命名为β-RBD-3β。将该载体进行PCR扩增、PCR产物回收、体外转录、DNaseI消化、加帽加尾修饰以及回收纯化之后，得到具有5′cap和3′ploy A结构的cap-RBD-3β-ploy A mRNA以及不含帽子结构与polyA结构的RBD-3βmRNA。

1)表达效率实验

利用lipofectamine2000转染试剂，将获得的cap-RBD-3β-ploy A、IRES-RBD-3β-stem以及对照组RBD-3βmRNA均以2μg的量转染293T细胞，在转染24h后，离心取细胞，RIPA缓冲液裂解细胞后，用RBD抗体ELISA检测细胞内蛋白表达情况。分别设置空白样品孔、标准孔、待测孔，每组设置三个平行对照。通过酶标仪绘制标准曲线，测定样品中RBD抗原的含量。得到的结果如图15所示。

由图15可知，转染cap-RBD-3β-ploy A mRNA的细胞内RBD蛋白浓度约为174ng/mL，转染IRES-RBD-3β-stem mRNA的细胞内RBD蛋白浓度约为180ng/mL，没有进行加帽加尾修饰的RBD-3βmRNA转染的细胞内几乎没有检测到RBD蛋白，表明利用IRES-stem系统得到的mRNA能够在细胞中高效的表达RBD蛋白，其表达水平接近于加帽加尾修饰的mRNA表达水平。

2)稳定性试验

将体外转录得到IRES-RBD-3β-stem、cap-RBD-3β-poly A以及没有进行加帽加尾修饰的对照RBD-3βmRNA等浓度转染293T细胞，分别在转染的第6h、24h、48h、72h、96h提取细胞的RNA，通过RT-qPCR数据分析细胞中mRNA的降解情况。实验结果如图16和图17所示。

由图16和图17可知，利用本发明得到的IRES-RBD-3β-stem mRNA与加帽加尾修饰mRNA相比，表达水平在不同时间点并无显著性差异(NS＝non-significant)，二者与不加帽加尾修饰的mRNA相比，在不同时间段的表达水平均得到了显著提高(p<0.001)。

综上可知，本发明提供的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因，不需要加尾，可实现细胞内高效翻译。并且，本发明制备的mRNA表达系统，无需额外加冒加尾处理，可简化mRNA的生产流程，降低生产成本，使mRNA的生产工艺更加稳定，可促进mRNA原液生产的连续化与自动化，在mRNA制备领域具有良好的应用价值。

Claims (4)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含IRES元件以及可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因；

所述可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因通过在mRNA的3′UTR序列的末端插入茎环序列构建得到；

所述3′UTR序列为β珠蛋白3′UTR；

所述3′UTR序列的拷贝数为3个拷贝重复；

所述茎环序列为组蛋白茎环序列；

所述茎环序列为不需要加poly A尾的天然或人工茎环结构序列；

所述可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组表达载体在细胞、组织、生物体或不含细胞的表达系统中的应用。

3.一种mRNA表达系统，其特征在于，所述mRNA表达系统的构建过程包括以下步骤：

(1)获取携带IRES的载体，然后在IRES载体中插入权利要求1所述的可与IRES组合的3′UTR加茎环结构基因构建IRES-3′UTR-stem质粒；

(2)将目的蛋白的DNA序列通过分子克隆插入在IRES-3′UTR-stem质粒的IRES与3′UTR序列之间，获得重组质粒；

(3)根据IRES序列以及茎环序列设计引物，以重组质粒为模板，利用引物进行PCR扩增，实现mRNA的表达。

4.如权利要求3所述的mRNA表达系统，其特征在于，所述携带IRES的载体的获取过程为：获取IRES元件的序列，将IRES元件的序列克隆到质粒的多克隆位点之间，并转化到感受态细胞，获得携带IRES的载体。