CN108396033A - 增加编码的肿瘤抗原表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸 - Google Patents

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托马斯·施拉克
约亨·普罗布斯特
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Abstract

本发明涉及一种核酸序列，所述核酸序列包含或编码：编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白，至少一个组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号。此外，本发明提供所述核酸用于增加所编码的肽或蛋白的表达的应用。还公开了其用于制备药物组合物、特别是疫苗(例如，用于治疗癌症或肿瘤疾病)的应用。本发明还描述了利用包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸增加包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白的表达的方法。

Description

增加编码的肿瘤抗原表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷 酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸
本申请是国际申请号PCT/EP2013/000459，国际申请日2013年2月 15日，中国申请号201380008957.4，发明名称为“用于增加编码的肿瘤抗原表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸”的专利申请的分案申请。
本发明涉及一种核酸序列，所述核酸序列包含或编码：编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白，至少一个组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号。此外，本发明提供所述核酸用于增加所编码的肽或蛋白的表达的应用。还公开了其用于制备药物组合物、特别是疫苗(例如，用于治疗癌症或肿瘤疾病)的应用。本发明还描述了利用包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸增加包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白的表达的方法。
除了心血管疾病和传染病之外，肿瘤和癌症疾病的发生是现代社会中最常见的死亡原因，并且，在大部分情形中，关于治疗和随后的恢复措施其涉及大量的花费。例如，肿瘤和癌症疾病的治疗很大程度上取决于发生的肿瘤的类型、待治疗的患者的年龄、癌细胞的分布等等。现在，除侵入性手术之外，常规上利用放射疗法或化学疗法进行癌症治疗。然而，这样的常规疗法典型地给免疫系统带来极大的压力，并且在一些情形中仅能以有限的程度使用。另外，这些常规疗法中的大部分在单次治疗之间需要长的时间间隔，以允许免疫系统的再生。
因此，除了所述“常规治疗”之外，近年来已经研究了补充策略，以避免或至少减少所述治疗对免疫系统的影响。一种这样的补充治疗具体包括基因治疗方法或基因接种，已经发现其对于治疗或支持所述常规疗法是高度有希望的。
基因治疗和基因接种是已经在疾病的治疗和预防中得到证明的分子医学方法，并且所述方法通常表现出对日常医学实践、特别是对上文提及的疾病的治疗的相当大的作用。这两种方法，即基因治疗和基因接种，都是基于将核酸引入到患者细胞或组织中然后处理由已经引入到细胞或组织中的核酸编码的信息，也就是说，处理所需要的多肽的(蛋白)表达。
在基因治疗方法中，典型地是使用DNA，尽管在最近的开发过程中 RNA也是已知的。重要的是，在所有这些基因治疗方法中，不管是使用 DNA、病毒RNA还是mRNA，mRNA作用为所编码的蛋白的序列信息的信使。
通常，认为RNA是不稳定分子：RNA酶是普遍存在的，并且众所周知其是难于灭活的。此外，与DNA相比，RNA还是更化学不稳定的。因此，可能令人惊讶的是，真核细胞中mRNA的“默认状态”特征在于相对的稳定性，并且需要特定的信号来加速个体mRNAs的分解。关于这一发现的主要原因似乎是细胞内mRNA分解几乎专门由核酸外切酶催化。然而，真核mRNAs的末端是通过下述特定的末端结构及其相缔合的蛋白针对这些酶进行保护的：在5’端的m7GpppN CAP和典型地在3’端的聚腺苷酸序列。由此认为这两种末端修饰的去除是mRNA分解的速度限制。尽管稳定元件已经表征为α-珠蛋白mRNA的3’UTR，但是影响真核mRNAs的更新的RNA序列典型地通过加速脱腺苷作用而作用为分解的启动剂(在Meyer，S.，C.Temme，等人.(2004)，Crit Rev Biochem Mol Biol(生物化学分子生物学重要综述)39(4)：197-216.中综述)。
如上文提及的，真核mRNAs的5’端典型地在转录后修饰，以携带甲基化的CAP结构，例如，m7GpppN。除了在RNA剪接、稳定和转运中的作用，在翻译起始过程中，CAP结构显著增强40S核糖体亚基向mRNA 的5’端的募集。后一种功能需要由真核起始因子复合物eIF4F来识别该 CAP结构。聚腺苷酸序列另外通过增加40S亚基到mRNAs的募集而刺激翻译，这是一种需要聚腺苷酸结合蛋白(PABP)的干预的作用。PABP，最近又证明与eIF4G物理相互作用，eIF4G是CAP-结合的eIF4F复合物的一部分。因此，假设了对加帽的、聚腺苷化的mRNAs的翻译起始的闭环模型(Michel，Y.M.，D.Poncet，等人.(2000)，J Biol Chem(生物化学杂志)275(41)：32268-76.)。
几乎所有的真核mRNAs的末端都是通过遍在切割/聚腺苷化机制添加在其3＇末端的聚腺苷酸序列。在3＇末端存在聚腺苷酸序列是真核 mRNAs的最显著的特征之一。在切割后，除了复制依赖性组蛋白转录物之外，大部分前mRNAs都获得聚腺苷化的尾部。在这种情形中，3’末端加工是促进mRNAs从细胞核转运到细胞质并且影响mRNAs的稳定性和翻译的核共转录过程。该3’末端的信息以由切割/聚腺苷化机制引导的两步反应发生，并且取决于在mRNA前体(前mRNAs)中存在两种序列元件：高度保守的核苷酸六聚体AAUAAA(聚腺苷酸化信号)和下游的富含 G/U的序列。在第一步中，前mRNAs在这两个元件之间被切割开。在与第一步紧密偶联的第二步中，刚形成的3′端通过添加由200-250个腺苷酸组成的聚腺苷酸序列而延伸，所述聚腺苷酸序列基本上影响mRNA代谢的所有方面，包括mRNA输出、稳定性和翻译(Dominski，Z.和W.F. Marzluff(2007)，Gene(基因)396(2)：373-90.)。
这一法则唯一已知的例外是复制依赖性组蛋白mRNAs，其末端是组蛋白茎环而不是聚腺苷酸序列。示例性的组蛋白茎环序列记述在Lopez 等人.(Dávila López，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约，N.Y.)， 14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308.)中。
组蛋白前mRNAs中的茎环典型地接着富含嘌呤的序列，其称为组蛋白下游元件(HDE)。这些前mRNAs在细胞核中在该茎环下游的大约5个核苷酸处由单次内切核酸水解切割而进行加工，该单次内切核酸水解切割由U7snRNP通过U7snRNA与HDE的碱基配对进行催化。包含组蛋白茎环结构和组蛋白下游元件(HDE)(U7snRNP的结合位点)的3’-UTR序列通常称为组蛋白3’-加工信号(例如，参见Chodchoy，N.，N.B.Pandey，等人.(1991).Mol CellBiol(分子细胞生物学)11(1)：497-509.)。
由于需要将刚合成的DNA包装成染色质，组蛋白合成与细胞周期相适应地进行调节。在S期过程中增加的组蛋白类蛋白合成通过组蛋白基因的转录激活以及组蛋白mRNA水平的转录后调控而实现。这可能表明，组蛋白茎环对于组蛋白表达调节的所有转录后步骤都是重要的。其是有效加工、mRNA输出到细胞质中、负载到多核糖体上和对mRNA稳定性的调节所必需的。
在上述情形中，鉴定一种32kDa的蛋白，其在细胞核和细胞质中在组蛋白信使的3’端与组蛋白茎环相缔合。该茎环结合蛋白(SLBP)的表达水平是细胞周期调节的，并且在S期最高，此时组蛋白mRNA水平增加。 SLBP是U7snRNP对组蛋白前mRNA的有效的3’端加工所必需的。在加工完成后，SLBP保持与成熟的组蛋白mRNAs的末端的茎环缔合，并且在刺激其细胞质中翻译成组蛋白类蛋白。(Dominski，Z.和W.F.Marzluff (2007)，Gene(基因)396(2)：373-90)。有趣的是，SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中都是保守的(Dávila López，M.，& Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约，N.Y.)，14(1)，1-10. doi：10.1261/rna.782308)，并且其能够表明，其与组蛋白茎环序列的结合取决于茎环结构，并且最小的结合位点包含所述茎环的至少3个5’核苷酸和2个3’核苷酸(Pandey，N.B.，等人.(1994)，Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)，14(3)，1709-1720和Williams，A.S.，& Marzluff，W.F.，(1995)，Nucleic Acids Research(核酸研究)，23(4)， 654-662.)。
尽管组蛋白基因通常分类为“复制依赖性的”，其产生末端是组蛋白茎环的mRNA，或是“置换型的”，其相反产生携带聚腺苷酸-尾的mRNA，但是，在一些非常少见的情形中已经鉴定了其天然存在的包含组蛋白茎环和聚腺苷酸或寡(A)3’的mRNAs。Sanchez等人使用荧光素酶作为报道蛋白在爪蟾(Xenopus)卵子发生过程中检验了附着在组蛋白mRNA的组蛋白茎环的3’的天然存在的寡(A)尾的作用，并且发现寡(A)尾是在卵子发生过程中使组蛋白mRNA沉默的翻译抑制机制的活性部分，并且去除其是激活组蛋白mRNAs翻译的机制的一部分(Sanchez，R.和W.F.Marzluff (2004)，Mol Cell Biol(分子细胞生物学)24(6)：2513-25)。
此外，已经使用编码标记蛋白α珠蛋白的人工构建体研究了在前 mRNA加工和mRNA稳定性水平上对复制依赖性组蛋白的调节的需要，这是利用与内含子较少的组蛋白基因相比珠蛋白基因含有内含子的事实。对于这一目的，产生这样的构建体，其中α珠蛋白编码序列之后接着组蛋白茎环信号(组蛋白茎环之后接着组蛋白下游元件)和聚腺苷酸化信号(Whitelaw，E.，等人.(1986).Nucleic Acids Research(核酸研究)，14(17)，7059-7070.；Pandey，N.B.，&Marzluff，W.F.(1987).Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)，7(12)，4557-4559.；Pandey，N.B.，等人. (1990).Nucleic Acids Research(核酸研究)，18(11)，3161-3170)。
Lüscher等人以另一种方法研究了重组组蛋白H4基因的细胞周期依赖性调节。产生这样的构建体，其中H4编码序列之后接着组蛋白茎环信号和聚腺苷酸化信号，这两种加工信号临时由半乳糖激酶编码序列隔开 (Lüscher，B.等人.，(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82(13)，4389-4393)。
另外，Stauber等人鉴定了在组蛋白H4mRNA水平上赋予细胞周期调节所需要的最小序列。对于这些研究，使用这样的构建体，其包含在组蛋白茎环信号(其后接着聚腺苷酸化信号)之前的选择标记黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)的编码序列(Stauber，C.等人.，(1986).EMBO J， 5(12)，3297-3303)。
检验组蛋白前mRNA加工，Wagner等人使用在组蛋白茎环信号与聚腺苷酸化信号之间放置EGFP的报道子构建体(以使EGFP仅在组蛋白前 mRNA加工被破坏的情形中表达)鉴定了组蛋白前mRNAs切割所需要的因子(Wagner，E.J.等人.，(2007).Mol Cell(分子细胞)28(4)，692-9)。
应该注意，聚腺苷化的mRNA的翻译通常需要使得3′聚腺苷酸序列接近5′CAP。这通过聚腺苷酸结合蛋白与真核起始因子eIF4G之间的蛋白-蛋白相互作用而调控。关于复制依赖性的组蛋白mRNAs，已经揭示了类似的机制。在这种情形中，Gallie等人表明组蛋白茎环在功能上与聚腺苷酸序列类似，原因在于其提高翻译效率并且共同依赖于5’-CAP，从而建立有效的翻译水平。他们表明组蛋白茎环足以增加报道mRNA在转染的中国仓鼠卵巢细胞中的翻译并且是必需的，但是为了最理想地行使功能，必须位于3’-端。因此，与其他mRNAs上的聚腺苷酸尾相似，这些组蛋白mRNAs的3′端似乎是在体内翻译所必需的，并且在功能上与聚腺苷酸尾相似(Gallie，D.R.，Lewis，N.J.，&Marzluff，W.F.(1996)，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)，24(10)，1954-1962)。
另外，可以显示，SLBP结合在细胞质组蛋白mRNA上，并且是其翻译所需要的。即使SLBP不直接与eIF4G相互作用，但是组蛋白mRNA 翻译所需要的结构域与最近鉴定的蛋白SLIP1相互作用。在另一个步骤中，SLIP1与eIF4G相互作用，并且允许组蛋白mRNA循环并通过与聚腺苷化mRNAs翻译相似的机制支持组蛋白mRNA的有效的翻译。
如上文提及，基因治疗方法通常使用DNA将编码信息转运到细胞中，然后其转录成mRNA，所述mRNA携带天然存在的mRNA元件，特别是 5’-CAP结构和3’聚腺苷酸序列以确保所编码的治疗性蛋白或抗原性蛋白的表达。
然而，在多种情形中，不管是使用DNA还是RNA，基于将所述核酸引入到患者细胞或组织中并且随后通过表达由这些核酸编码的需要的多肽的表达系统没有表现出合乎需要的、或者甚至是必需的可能允许有效的治疗的表达水平。
在现有技术中，迄今已经进行了不同的尝试在体外和/或体内增加编码的蛋白的表达产率，特别是使用改善的表达系统。现有技术中通常所述的增加表达的方法常规上是基于使用包含特定启动子和相应的调节元件的表达载体或盒。由于这些表达载体或盒典型地局限于特定的细胞系统，因此这些表达系统必须进行修改才能用于不同的细胞系统。然后通常将所述修改的表达载体或盒转染到细胞中并且典型地依赖于特定的细胞系进行处理。因此，优选主要产生对不依赖于对特定细胞类型特异性的启动子和调节元件、能够通过细胞中固有的系统在靶细胞中表达编码的蛋白的那些核酸分子。在这种情形中，在mRNA稳定元件和增加mRNA翻译效率的元件之间可以区分。
在其编码序列进行优化并且通常适用于这样的目的的mRNAs记述在申请WO 02/098443(CureVac GmbH)中。例如，WO 02/098443描述了以通用形式稳定并且在其编码区翻译优化的mRNAs。WO 02/098443还公开了确定序列修饰的方法。WO 02/098443另外描述了为增加序列中的鸟嘌呤/胞嘧啶(G/C)含量而取代mRNA序列中的腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的可能性。依据WO 02/098443，所述为增加G/C含量的取代和修改可以用于基因治疗应用，而且还可以用作基因疫苗用于癌症或传染病的治疗。在这一情形中，WO 02/098443通常提及作为用于所述修饰的基础序列的序列，其中修饰的mRNA编码至少一种生物活性肽或多肽，所述肽或肽在待治疗的患者中例如全然不翻译或不充分翻译的或具有错误的翻译。备选地，WO 02/098443提议编码抗原(例如，肿瘤抗原或病毒抗原)的mRNAs 作为所述修饰的基础序列。
在另一种增加所编码的蛋白的表达的方法中，申请WO 2007/036366 记述了长的聚腺苷酸序列(特别是长于120bp)以及β珠蛋白基因的至少两个3’非翻译区的组合对mRNA稳定性和翻译活性的阳性作用。
然而，即使所有这些近来的现有技术文献已经尝试提供非常有效的用于基因治疗方法以及另外改善的mRNA稳定性和翻译活性的工具，但是，相对于DNA疫苗和基于DNA的基因治疗方法，仍然存在基于RNA的应用稳定性通常较低的问题。因此，在本领域中仍然存在提供用于基因治疗方法和基因接种或作为上文讨论的常规治疗的补充治疗法的改善的工具，其允许在体内更好地提供所编码的蛋白，例如，通过进一步改善的mRNA 稳定性和/或翻译活性，优选用于基因治疗和基因接种。
此外，尽管本领域中的所有进展，在不含细胞的系统、细胞或生物体中有效表达所编码的肽或蛋白(重组表达)仍然是具有挑战性的问题。
因此，本发明的基本目的是提供另外的和/或备选的增加所编码的蛋白的表达的方法，优选地，通过相对于现有技术中已知用于癌症或肿瘤疾病的治疗性或预防性治疗中的基因接种的所述核酸进一步稳定mRNA和/ 或增加所述mRNA的翻译效率而进行。
该目的通过后附权利要求的主题来解决。具体地，按照第一方面，本发明基本目的通过本发明的核酸序列而解决，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白；
b)至少一个组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号，
优选地用于增加所编码的肽或蛋白的表达。
备选地，除组蛋白茎环序列之外的任意适宜的茎环序列(来源于组蛋白基因，特别是H1，H2A，H2B，H3和H4家族的组蛋白基因)都可以由本发明用于其所有的方面和实施方案中。
在这一情形中，特别优选的是本发明第一方面所述的本发明的核酸至少部分通过DNA或RNA合成产生，优选如本文所述，或是分离的核酸。
本发明是基于本发明人的令人惊讶的发现：聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号与至少一种组蛋白茎环的组合(尽管二者均代表自然中的择一机制)协同作用，原因在于该组合增加蛋白的表达，高于使用任一种单独的元件所观察到的水平数倍(manifold)。观察到聚腺苷酸与至少一种组蛋白茎环的组合的协同作用与聚腺苷酸和组蛋白茎环的顺序无关，并且与聚腺苷酸序列的长度无关。
因此，特别优选的是，本发明的核酸序列包含或编码：a)编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白；b)至少一个组蛋白茎环，和c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化序列；优选地用于增加所编码的肽或蛋白的表达。在一些实施方案中，可能优选的是，所编码的蛋白优选不是组蛋白类蛋白，特别不是H4，H3，H2A和/ 或H2B组蛋白家族的组蛋白类蛋白或其保留组蛋白(-样)功能(即，形成核小体)的片段、衍生物或变体。此外，所编码的蛋白典型地不对应于 H1组蛋白家族的组蛋白接头蛋白。本发明的核酸分子典型地不包含任何调节信号(小鼠组蛋白基因的5’和/或，特别是3’，特别不是小鼠组蛋白基因H2A的5’和/或，特别是3’，并且进一步最优选不是小鼠组蛋白基因 H2A614的5’和/或，特别是3’)。特别地，其不包含来自小鼠组蛋白基因的组蛋白茎环和/或组蛋白茎环加工信号，特别地不是小鼠组蛋白基因 H2A的组蛋白茎环和/或组蛋白茎环加工信号，最优选不是小鼠组蛋白基因H2A614的组蛋白茎环和/或组蛋白茎环加工信号。
此外，本发明的核酸在其元件(a)中典型地不提供报道蛋白(例如，荧光素酶，GFP，EGFP，β-半乳糖苷酶，特别是EGFP)，半乳糖激酶(galK) 和/或标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白，半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))或细菌报道蛋白，例如氯霉素乙酰转移酶(CAT) 或其他细菌抗生素抗性蛋白，例如，来源于细菌neo基因的细菌抗生素抗性蛋白。
报道、标记或选择蛋白典型地理解为不是本发明所述的肿瘤抗原。报道、标记或选择蛋白或其基础基因(underlying gene)通常用作细菌、细胞培养物、动物或植物中的研究工具。它们赋予表达其的生物体(优选是异源表达)容易鉴别的特性，所述特性可以测量或允许进行选择。具体地，标记或选择蛋白表现出可选择的功能。典型地，所述选择、标记或报道蛋白在人或其他动物中不是天然存在的，而是来源于其他生物体，特别是来源于细菌或植物。因此，来源于除哺乳动物之外(特别是除人之外)的物种的具有选择、标记或报道功能的蛋白优选排除被理解为具有作用为本发明所述的“肿瘤抗原”的蛋白。特别地，选择、标记或报道蛋白允许通过例如基于荧光或其他分光光度计技术以及针对抗生素的抗性的体外测定来鉴定转化的细胞。因此，赋予转化的细胞所述特性的选择、报道或标记基因典型地不被理解为作为用本发明所述的肿瘤抗原的蛋白。
在任何情形中，报道、标记或选择蛋白通常不发挥任何肿瘤抗原特性，并且因此，不发挥允许治疗性处理肿瘤疾病的免疫学作用。如果任一种单独的报道、标记或选择蛋白仍然发挥免疫学作用(除了其报道、选择或标记功能之外)，则所述报道、标记或选择蛋白优选不被理解为本发明意义内的“肿瘤抗原”。
相比之下，本发明所述的作用为肿瘤抗原的的蛋白或肽(特别排除 H1、H2A、H2B、H3和H4家族的组蛋白基因)典型地不表现出选择、标记或报道功能。如果任一单个“肿瘤抗原”仍然应该表现出选择、标记或报道功能(除了其肿瘤抗原功能之外)，则所述肿瘤抗原优选不被理解为本发明意义内的“选择、标记或报道蛋白”。
最优选地理解是，作用为本发明所述的肿瘤抗原的蛋白来源于哺乳动物，特别是人，特别是来源于哺乳动物肿瘤，并且不适合作为选择、标记或报道蛋白。特别地，所述肿瘤抗原来源于哺乳动物，特别是来源于人肿瘤。这些肿瘤抗原蛋白应该理解为是有抗原性的，原因在于它们旨在通过引发受试者的免疫应答以使受试者的免疫系统能够通过TH1和/或TH2 免疫应答而搏击该受试者的肿瘤细胞从而治疗该受试者。因此，所述抗原性肿瘤蛋白典型地是表征受试者癌症类型的哺乳动物蛋白，特别是人蛋白。
因此，优选的是，编码至少一种肽或蛋白的编码区(a)与至少一种组蛋白茎环的至少(b)，或更广泛地，与任意适当的茎环是异源的。换言之，在本发明的情形中，“异源”意指至少一种茎环序列不是天然存在为编码本发明核酸的元件(a)的(肿瘤抗原性)蛋白或肽的特定基因的(调节) 序列(例如，在3’UTR)。因此，本发明核酸的(组蛋白)茎环优选来源于不同于包含本发明核酸的元件(a)的编码区的基因的基因的3’UTR。例如，如果本发明核酸是异源的，则元件(a)的编码区不编码组蛋白类蛋白或其(保留组蛋白类蛋白的功能的)片段、变体或衍生物，而是编码发挥生物学功能、优选不同于组蛋白(-样)功能的肿瘤抗原功能的任意其他的(相同物种或另一种物种的)肽或序列，例如，编码蛋白(发挥肿瘤抗原功能，例如，针对哺乳动物、特别是人肿瘤接种，由此引发针对受试者肿瘤细胞的免疫反应)，其优选地表达由本发明的核酸编码的肿瘤抗原。
在这一情形中，特别优选的是本发明的核酸在5’-至3’-方向上包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白；
b)至少一个组蛋白茎环，任选地没有所述组蛋白茎环3’的组蛋白下游元件(HDE)，
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号。
术语“组蛋白下游元件(HDE)”是指在天然存在的组蛋白茎环3’的约 15-20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸片段，其表示参与将组蛋白前 mRNA加工为成熟的组蛋白mRNA的U7 snRNA的结合位点。例如，在海胆(sea urchins)中，所述HDE为CAAGAAAGA(Dominski，Z.和W.F. Marzluff(2007)，Gene(基因)396(2)：373-90)。
此外，优选地，本发明第一方面所述的本发明的核酸不包含内含子。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明第一方面所述的本发明的核酸序列从5’到3’包含或编码：
a)编码区，优选地所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白；
c)聚腺苷酸序列；和
b)至少一个组蛋白茎环。
本发明第一实施方案所述的本发明的核酸序列包含任意适当的核酸，例如，选自任意(单链或双链)DNA，优选地，但不限于此，例如，基因组DNA，质粒DNA，单链DNA分子，双链DNA分子，或可以选自例如任意PNA(肽核酸)或可以选自例如任意(单链或双链)RNA，优选信使RNA(mRNA)；等等。本发明的核酸序列还可以包含病毒RNA (vRNA)。然而，本发明的核酸序列可以不是病毒RNA或者可以不包含病毒RNA。更具体地，本发明的核酸序列可以不包含病毒序列元件，例如，病原增强子或病毒启动子(例如，没有灭活的病毒启动子或序列元件，更具体地不是通过更换策略灭活)，或其他病毒序列元件，或病毒或反转录病毒核酸序列。更具体地，本发明的核酸序列可以不是反转录病毒或病毒载体或修饰的反转录病毒或病毒载体。
在任意情形中，本发明的核酸序列可以或可以不包含增强子和/或启动子序列，其可以被修饰或不被修饰或者其可以是激活的或不被激活。所述增强子或启动子可以是植物可表达的或不可表达的，和/或在真核生物中可表达或不可表达和/或在原核生物中可表达或不可表达。本发明的核酸序列可以包含或不包含编码(自我剪接)核酶的序列。
在具体的实施方案中，本发明的核酸序列可以是或可以包含自我复制的RNA(复制子)。
优选地，本发明的核酸序列是质粒DNA或RNA，特别是mRNA。
在本发明第一方面的具体的实施方案中，本发明的核酸是包含在适于体外转录的核酸中的核酸序列，特别是包含在适当的体外转录载体中的核酸序列(例如，包含用于体外转录的特定启动子(诸如T3、T7或Sp6启动子)的质粒或线性核酸序列)。
在本发明第一方面的其他特别优选的实施方案中，本发明的核酸包含在适于在表达系统中(例如，在表达载体或质粒中)、特别是在原核(例如，细菌，如大肠杆菌(E.coli)，或真核(例如，哺乳动物细胞，如CHO 细胞，酵母细胞或昆虫细胞或完整生物体，如植物或动物)表达系统中) 转录和/或翻译的核酸。
术语“表达系统”意指适于产生肽、蛋白或RNA，特别是mRNA(重组表达)的系统(细胞培养物或完整生物体)。
本发明第一方面所述的本发明的核酸序列包含或编码至少一个组蛋白茎环。在本发明的情形中，所述组蛋白茎环通常(不管其是组蛋白茎环还是不是组蛋白茎环)典型地来源于组蛋白基因，并且包含两个相邻的完全或部分反向互补序列的分子内碱基配对，由此形成茎环。茎环可以存在于单链DNA中，或者更常见地存在于RNA中。该结构还称为发夹或发夹环，并且通常由连续序列内的茎和(末端)环组成，其中所述茎由两条由在一定程度上作为间隔体的短序列隔开的相邻的完全或部分反向互补的序列形成，所述作为间隔体的短序列成为所述茎环结构的环。这两条相邻的完全或部分反向互补的序列可以定义为，例如，茎环元件茎1和茎2。当这两条相邻的完全或部分反向互补的序列，例如，茎环元件茎1和茎2，彼此形成碱基配对时，形成双链的核酸序列片段，其在其末端包含由位于连续序列上的茎环元件茎1和茎2之间的短序列形成的不配对的环，从而形成茎环。不配对的环由此典型地表示核酸不能与这些茎环元件中的任一个碱基配对的区域。形成的棒棒糖-形状的结构是多种RNA二级结构的主要结构单元。因此，茎环结构的形成依赖于产生的茎和环区域的稳定性，其中第一前提条件典型地是存在可以自身向后折叠形成配对双链的序列。配对的茎环元件的稳定性由长度、其包含的错配或凸起的数量(少量错配典型地是可耐受的，尤其是在长的双链片段中)以及配对区的碱基组成决定。在本发明的情形中，3-15个碱基的环长度是可能的，但是更优选的环长度是3-10个碱基，更优选3-8个，3-7个，3-6个或甚至更优选4-5个碱基，并且最优选4个碱基。形成双链结构的茎序列典型地具有5-10 个碱基的长度，更优选5-8个碱基的长度。
在本发明的情形中，组蛋白茎环典型地来源于组蛋白基因(例如，来源于组蛋白家族H1，H2A，H2B，H3，H4的基因)，并且包含两条相邻的完全或部分反向互补的序列的分子内碱基配对，由此形成茎环。典型地，组蛋白3＇UTR茎环是参与组蛋白mRNAs的核质转运以及在细胞质中的稳定性和翻译效率的调节的RNA元件。后生动物组蛋白基因的mRNAs 缺少聚腺苷化和聚-A尾，相比之下，3＇端加工在该高度保守的茎环与下游约20个核苷酸处的富含嘌呤的区域(组蛋白下游元件，或HDE)之间的位点发生。组蛋白茎环被31kDa茎环结合蛋白(SLBP-也称为组蛋白发夹结合蛋白或HBP)结合。所述组蛋白茎环结构优选由本发明与其他序列元件和结构组合使用，所述其他序列元件和结构不天然存在于(意指在未转化的或生物体/细胞中)组蛋白基因中，而是按照本发明组合以提供人造的异源核酸。因此，本发明特别是基于这样的发现：组蛋白茎环结构与其他异源序列元件的人工(非天然的)组合提供有利的作用，所述其他异源序列元件不存在于组蛋白基因中或后生动物组蛋白基因中，并且分离自编码不同于组蛋白的蛋白的基因的可操作和/或调节序列区域(影响转录和/或翻译)。因此，本发明的一个方面提供组蛋白茎环结构与不存在于后生动物组蛋白基因中的聚腺苷酸序列或表示聚腺苷酸化信号的序列 (编码区的3’-端)的组合。按照本发明的另一个优选的方面，提供组蛋白茎环结构与编码优选不存在于后生动物组蛋白基因中的肿瘤抗原性蛋白(其优选地不存在于后生动物组蛋白基因中)的编码区的组合(编码区和组蛋白茎环序列是异源的)。如果所述肿瘤抗原性蛋白存在于患有肿瘤疾病的哺乳动物、优选人中，则其是优选的。在一个更优选的实施方案中，本发明核酸的所有元件(a)、(b)和(c)彼此是异源的，并且由三种不同的来源人工组合，例如，(a)肿瘤抗原性蛋白编码区来源于人基因，(b)组蛋白茎环来源于后生动物(例如，哺乳动物，非人或人)组蛋白基因的非翻译区，(c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号来源于例如不同于组蛋白基因的基因的非翻译区，并且所述非翻译区不同于所述本发明核酸的元件(a)所述的肿瘤抗原编码区的非翻译区。
因此，组蛋白茎环是本文所述的茎环结构，如果优选是官能化限定的，则其表现出/保留与其天然结合配偶体茎环结合蛋白(SLBP-也称作组蛋白发夹结合蛋白或HBP)结合的特性。
按照本发明，权利要求1的组件(b)所述的组蛋白茎环序列可以不是来源于小鼠组蛋白类蛋白。更特别地，所述组蛋白茎环序列可以不是来源于小鼠组蛋白基因H2A614。此外，本发明的核酸可以不包含小鼠组蛋白茎环序列也不包含小鼠组蛋白基因H2A614。此外，即使本发明的核酸序列可以包含至少一种哺乳动物组蛋白基因，但是本发明的核酸序列可以不包含茎环加工信号，更具体地，小鼠组蛋白加工信号，并且最具体地，可以不包含小鼠茎环加工信号H2kA614。然而，所述至少一种哺乳动物组蛋白基因可以不是WO 01/12824的Seq.ID No.7。
按照本发明第一方面的一个优选的实施方案，本发明的核酸序列包含或编码至少一种组蛋白茎环序列，优选按照下式(I)或(II)中的至少一种所述。
式(I)(不具有茎边界元件的茎环序列)：
式(II)(具有茎边界元件的茎环序列)：
其中：
茎1或茎2边界元件N1-6 是1-6个、优选2-6个、更优选2-5个、甚至更优选3-5个、最优选4-5个或5个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和 C，或其核苷酸类似物；
茎1[N0-2GN3-5] 与元件茎2反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；
其中N0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1 个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自 A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；
其中N3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4 个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物，并且
其中G是鸟苷或其类似物，并且可以任选地被胞苷或其类似物替代，条件是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷替代；
环序列[N0-4(U/T)N0-4] 位于元件茎1和茎2之间，并且是3-5个核苷酸、更优选4个核苷酸的连续序列；
其中每个N0-4彼此独立地是0-4个、优选 1-3个、更优选1-2个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；并且其中U/T表示尿苷或任选地胸苷；
茎2[N3-5CN0-2] 与元件茎1反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；
其中N3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4 个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自 A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；
其中N0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1 个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；并且
其中C是胞苷或其类似物，并且可以任选地被鸟苷或其类似物替代，条件是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷替代；
其中
茎1和茎2能够彼此碱基配对形成反向互补序列，其中碱基配对可以发生在茎1与茎2之间，例如，通过核苷酸A与U/T或G与C的沃森-克里克碱基配对或通过非沃森-克里克碱基配对，例如摆动碱基配对，反向沃森-克里克碱基配对，Hoogsteen碱基配对，反向Hoogsteen碱基配对，或者能够彼此碱基配对形成部分反向互补的序列，其中，基于一个茎中的一个或多个碱基在另一个茎的反向互补序列中不具有互补碱基，不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间。
在上述情形中，摆动碱基配对典型地是两个核苷酸之间的非沃森-克里克碱基配对。在本发明的情形中，可以使用的四个主要的摆动碱基对是鸟苷-尿苷，肌苷-尿苷，肌苷-腺苷，肌苷-胞苷(G-U/T，I-U/T，I-A和I-C) 和腺苷-胞苷(A-C)。
因此，在本发明的情形中，摆动碱基是这样的碱基，其与上述另一个碱基形成摆动碱基对。因此，非沃森-克里克碱基配对，例如，摆动碱基配对，可以发生在本发明所述的蛋白茎环结构的茎中。
在上述情形中，部分反向互补序列在由茎1与茎2的碱基配对形成的茎环序列的茎结构中包含最多2个、优选仅一个错配。换言之，茎1和茎2优选能够在茎1和茎2的整个序列上彼此(完全)碱基配对(100％可能正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对)，由此形成反向互补序列，其中每个碱基具有其正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基悬垂物作为互补结合配偶体。备选地，茎1和茎2优选能够在茎1和茎2的整个序列上彼此部分碱基配对，其中100％可能正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对中的至少约70％，75％，80％，85％，90％或95％被正确的沃森-克里克或非沃森-克里克碱基配对占据，并且其余碱基的至多约30％，25％， 20％，15％，10％或5％是不配对的。
按照本发明第一方面的优选的实施方案，本文定义的本发明的核酸序列的所述至少一个组蛋白茎环序列(具有茎边界元件)包含约15-约45个核苷酸的长度，优选约15至约40个核苷酸的长度，优选约15至约35个核苷酸的长度，优选约15至约30个核苷酸的长度，并且甚至更优选约20至约30 个核苷酸的长度，并且最优选约24至约28个核苷酸的长度。
按照本发明第一方面的进一步优选的实施方案，本文定义的本发明的核酸序列的所述至少一个组蛋白茎环序列(不具有茎边界元件)包含约10 至约30个核苷酸的长度，优选约10至约20个核苷酸的长度，优选约12至约 20个核苷酸的长度，优选约14至约20个核苷酸的长度，并且甚至更优选约 16至约17个核苷酸的长度，并且最优选约16个核苷酸的长度。
按照本发明第一方面的进一步优选的实施方案，按照本发明第一方面所述的本发明的核酸序列可以包含或编码至少一种按照下列具体的式(Ia) 或(IIa)中的至少一个所述的组蛋白茎环序列：
式(Ia)(不具有茎边界元件的茎环序列)：
式(IIa)(具有茎边界元件的茎环序列)：
其中：
N，C，G，T和U如上文定义。
按照第一方面的另一个更特别优选的实施方案，本发明的核酸序列可以包含或编码至少一种按照下述具体的式(Ib)或(IIb)中的至少一个所述的组蛋白茎环序列：
式(Ib)(不具有茎边界元件的茎环序列)：
式(IIb)(具有茎边界元件的茎环序列)：
其中：N，C，G，T和U如上文定义。
按照本发明第一方面的甚至更优选的实施方案，本发明第一方面所述的本发明的核酸序列可以包含或编码至少一种按照下述具体的式 (Ic)-(Ih)或(IIc)-(IIh)中的至少一个所述的组蛋白茎环序列，备选地以其茎环结构并且作为表示按照实施例1产生的组蛋白茎环序列的线性序列显示：
式(Ic)：(不具有茎边界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎环共有序列)：
式(IIc)：(具有茎边界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎环共有序列)：
式(Id)：(不具有茎边界元件)
式(IId)：(具有茎边界元件)
式(Ie)：(不具有茎边界元件的原生动物组蛋白茎环共有序列)
式(IIe)：(具有茎边界元件的原生动物组蛋白茎环共有序列)
式(If)：(不具有茎边界元件的后生动物组蛋白茎环共有序列)
式(IIf)：(具有茎边界元件的后生动物组蛋白茎环共有序列)
式(Ig)：(不具有茎边界元件的脊椎动物组蛋白茎环共有序列)
式(IIg)：(具有茎边界元件的脊椎动物组蛋白茎环共有序列)
式(Ih)：(不具有茎边界元件的人组蛋白茎环共有序列(智人(Homo sapiens)))
式(IIh)：(具有茎边界元件的人组蛋白茎环共有序列(智人))
其中在上述式(Ic)-(Ih)或(IIc)-(IIh)中的每一个式中：
N，C，G，A，T和U如上文定义；
每个U可以被T替代；
茎元件1和2中的每个(高度)保守的G或C可以被其互补核苷酸碱基 C或G替代，条件是其在对应的茎中的互补核苷酸平行地被其互补核苷酸替代；和/或
G，A，T，U，C，R，Y，M，K，S，W，H，B，V，D和N是如下表中定义的核苷酸：
缩写 核苷酸碱基 备注
G G 鸟嘌呤
A A 腺嘌呤
T T 胸腺嘧啶
U U 尿嘧啶
C C 胞嘧啶
R G或A 嘌呤
Y T/U或C 嘧啶
M A或C 氨基
K G或T/U 酮
S G或C 强(3个氢键)
W A或T/U 弱(2个氢键)
H A或C或T/U 不是G
B G或T/U或C 不是A
V G或C或A 不是T/U
D G或A或T/U 不是C
N G或C或T/U或A 任意碱基
* 存在或不存在 碱基可以存在或不存在
在这一情形中，特别优选的是，按照本发明的式(I)或(Ia)-(Ih)或(II)或(IIa)-(IIh)中的至少一个式所述的组蛋白茎环序列选自天然存在的组蛋白茎环序列，更特别优选地选自原生动物或后生动物组蛋白茎环序列，并且甚至更特别优选地选自脊椎动物，最优选的选自哺乳动物组蛋白茎环序列，尤其是选自人组蛋白茎环序列。
按照第一方面的特别优选的实施方案，按照本发明的式(I)或(Ia)-(Ih) 或(II)或(IIa)-(IIh)中的至少一个式所述的组蛋白茎环序列是这样的组蛋白茎环序列，所述组蛋白茎环序列在每个核苷酸位置包含图1-5所示的后生动物和原始动物(图1)、原生动物(图2)、后生动物(图3)、脊椎动物 (图4)和人(图5)中天然存在的组蛋白茎环序列的最常见的核苷酸，或最常见的或第二最常见的核苷酸。在这一情形中，特别优选的是，所有核苷酸中至少80％、优选至少85％或最优选至少90％对应于天然存在的组蛋白茎环序列的最常见的核苷酸。
在第一方面的另一个具体的实施方案中，按照本发明的具体的式(I) 或(Ia)-(Ih)中的至少一个式所述的组蛋白茎环序列选自下述表示按照实施例1产生的组蛋白茎环序列的组蛋白茎环序列(不具有茎边界元件)：
VGYYYYHHTHRVVRCB(按照式(Ic)的SEQ ID NO：13)
SGYYYTTYTMARRRCS(按照式(Ic)的SEQ ID NO：14)
SGYYCTTTTMAGRRCS(按照式(Ic)的SEQ ID NO：15)
DGNNNBNNTHVNNNCH(按照式(Ie)的SEQ ID NO：16)
RGNNNYHBTHRDNNCY(按照式(Ie)的SEQ ID NO：17)
RGNDBYHYTHRDHNCY(按照式(Ie)的SEQ ID NO：18)
VGYYYTYHTHRVRRCB(按照式(If)的SEQ ID NO：19)
SGYYCTTYTMAGRRCS(按照式(If)的SEQ ID NO：20)
SGYYCTTTTMAGRRCS(按照式(If)的SEQ ID NO：21)
GGYYC不YTHAGRRCC(按照式(Ig)的SEQ ID NO：22)
GGCYCTTYTMAGRGCC(按照式(Ig)的SEQ ID NO：23)
GGCTCTTTTMAGRGCC(按照式(Ig)的SEQ ID NO：24)
DGHYCTDYTHASRRCC(按照式(Ih)的SEQ ID NO：25)
GGCYCTTTTHAGRGCC(按照式(Ih)的SEQ ID NO：26)
GGCYCTTTTMAGRGCC(按照式(Ih)的SEQ ID NO：27)
此外，在这一情形中，下述按照具体的式(II)或(IIa)-(IIh)中的一个式所述的按照实施例1产生的组蛋白茎环序列(具有茎边界元件)是特别优选的：
H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N*(按照式(IIc)的SEQ ID NO：28)
M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H*(按照式(IIc)的SEQ ID NO：29)
M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(按照式(IIc)的SEQ ID NO：30)
N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N*(按照式(IIe)的SEQ ID NO：31)
N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N*(按照式(IIe)的SEQ ID NO：32)
N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H*(按照式(IIe)的SEQ ID NO：33)
H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N*(按照式(IIf)的SEQ ID NO：34)
M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H*(按照式(IIf)的SEQ ID NO：35)
M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(按照式(IIf)的SEQ ID NO：36)
H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M*(按照式(IIg)的SEQ ID NO：37)
H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M*(按照式(IIg)的SEQ ID NO：38)
M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M*(按照式(IIg)的SEQ ID NO：39)
N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB*N*H*(按照式(IIh)的SEQ ID NO：40)
H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M*(按照式(IIh)的SEQ ID NO：41)
H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M*(按照式(IIh)的SEQ ID NO：42)
按照本发明第一方面进一步优选的实施方案，本发明的核酸序列包含或编码至少一种与按照具体的式(I)或(Ia)-(Ih)或(II)或(IIa)-(IIh)中至少一个式所述的组蛋白茎环序列中不到100％保守的核苷酸或与天然存在的组蛋白茎环序列显示出至少约80％、优选至少约85％、更优选至少约90％、或甚至更优选至少约95％的序列同一性的组蛋白茎环序列。
在一个优选的实施方案中，所述组蛋白茎环序列不包含环序列 5’-UUUC-3’。更具体地，所述组蛋白茎环序列分别不包含茎1序列 5’-GGCUCU-3’和/或茎2序列5’-AGAGCC-3’。在另一个优选的实施方案中，所述茎环序列不包含环序列5’-CCUGCCC-3’或环序列5’-UGAAU-3’。更具体地，所述茎环不包含茎1序列5’-CCUGAGC-3’或分别不包含茎1 序列5’-ACCUUUCUCCA-3’和/或茎2序列5’-GCUCAGG-3’或 5’-UGGAGAAAGGU-3’。此外，只要本发明不具体限制为组蛋白茎环序列，则茎环序列优选不是来源于哺乳动物胰岛素受体3’-非翻译区。此外，优选地，本发明的核酸可以不包含组蛋白茎环加工信号，特别是不包含来源于小鼠组蛋白基因H2A614基因(H2kA614)的那些。
按照本发明第一方面所述的本发明的核酸序列可以任选地包含或编码聚腺苷酸序列。当存在时，所述聚腺苷酸序列包含约25至约400个腺苷核苷酸的序列，优选约30个或更优选地约50至约400个腺苷核苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷核苷酸的序列，甚至更优选约50至约 250个腺苷核苷酸的序列，最优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。在这一情形中，术语“约”是指其后数值的±10％的偏差。因此，所述聚腺苷酸序列包含至少25个或多于25个，更优选地至少30个，更优选地至少50个腺苷核苷酸。因此，所述聚腺苷酸序列典型地不包含少于20 个腺苷核苷酸。更具体地，其不包含10个和/或少于10个腺苷核苷酸。
优选地，本发明所述的核酸不包含由下述组成的组的组件中的一个或两个或至少一个或几乎一个或全部：编码核酶(优选自我剪接核酶)的序列，病毒核酸序列，组蛋白茎环加工信号，特别是来源于小鼠组蛋白 H2A614基因的组蛋白茎环加工序列，Neo基因，灭活的启动子序列和灭活的增强子序列。甚至更优选地，本发明所述的核酸不包含核酶，优选不包含自我剪接的核酶，并且不包含由下述组成的组中的一种：Neo基因，灭活的启动子序列，灭活的增强子序列，组蛋白茎环加工信号，特别是来源于小鼠组蛋白H2A614基因的组蛋白茎环加工序列。因此，所述核酸可以是既不包含核酶(优选自我剪接核酶)也不包含Neo或者备选地既不包含核酶(优选自我剪接核酶)也不包含任何抗性基因(例如，通常用于选择)的优选模式。在另一种优选的模式中，本发明的核酸可以既不包含核酶(优选自我剪接核酶)也不包含组蛋白茎环加工信号，特别是来源于小鼠组蛋白H2A614基因的组蛋白茎环加工序列。
备选地，按照本发明的第一方面，本发明的核酸序列任选地包含聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号在本文中定义为通过特定的蛋白因子 (例如，切割和聚腺苷酸化特异性因子(CPSF)，切割刺激因子(CstF)，切割因子I和II(CF I和CF II)，聚腺苷酸聚合酶(PAP))向(转录的)mRNA 传送多腺苷酸化的信号。在这一情形中，优选包含NN(U/T)ANA共有序列的共有聚腺苷酸化信号。在特别优选的方面中，所述聚腺苷酸化信号包含下述序列中的一种：AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中，并且胸苷通常存在于DNA中)。在一些实施方案中，用于本发明的核酸的聚腺苷酸化信号不对应于U3snRNA，U5，来自人基因 G-CSF的聚腺苷化加工信号，或SV40聚腺苷酸化信号序列。特别地，上述聚腺苷酸化信号不与任意抗生素抗性基因(或任意其他报道、标记或选择基因)组合，特别是不与抗性neo基因(新霉素磷酸转移酶)(在本发明所述的核酸中作为本发明核酸的元件(a)所述的编码区的基因)组合。并且，上述聚腺苷酸化信号中的任一种优选不与本发明核酸中的组蛋白茎环或来自小鼠组蛋白基因H2A614的组蛋白茎环加工序列组合。
按照本发明第一方面所述的本发明的核酸序列可以另外编码这样的蛋白或肽，所述蛋白或肽包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物。
肿瘤抗原优选地位于表征哺乳动物、特别是人肿瘤(例如，在系统或实体瘤疾病中)的(肿瘤)细胞的表面。肿瘤抗原还可以选自与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的蛋白。此外，肿瘤抗原还包括在细胞中表达的这样的抗原，所述抗原本身(或原始本身)不降解但是与假定的肿瘤相关。与肿瘤供应血管或其(重)形成相联系的抗原，特别是与新血管形成相关的那些抗原，例如，生长因子，诸如VEGF，bFGF等，也包括在本发明中。与肿瘤相联系的抗原还包括来自典型地包埋所述肿瘤的细胞或组织的抗原。此外，一些物质(通常是蛋白或肽)在(已知或未知)患有癌症疾病的患者中表达，并且其在所述患者的体液中以增加的浓度存在。这些物质也称为“肿瘤抗原”，然而，其不是在免疫应答诱导物质这种严格意义上的抗原。肿瘤抗原的种类可以进一步分成肿瘤特异性抗原(TSAs) 和肿瘤相关的抗原(TAAs)。TSAs可以仅由肿瘤细胞呈递而从来不由正常的“健康”细胞呈递。其典型地由肿瘤特异性突变导致。TAAs是更常见的，通常由肿瘤和健康细胞两种细胞呈递。这些抗原被细胞毒性T细胞识别并且抗原呈递细胞可以被细胞毒性T细胞破坏。另外，肿瘤抗原还可以以例如突变的受体的形式存在于肿瘤表面。在这种情形中，其可以被抗体识别。
此外，肿瘤相关的抗原可以分类为组织特异性抗原(其也称作黑色素细胞特异性抗原)，癌-睾丸(cancer-testis)抗原和肿瘤特异性抗原。癌 -睾丸抗原典型地理解为种系相关基因的肽或蛋白，其可以在宽泛种类的肿瘤中活化。人癌-睾丸抗原可以进一步细分为在X染色体上编码的抗原，即所谓的CT-X抗原，和不在X染色体上编码的抗原，即所谓的(非XCT 抗原)。在X染色体上编码的癌-睾丸抗原包括，例如，黑素瘤抗原基因家族，即所谓的MAGE-家族。MAGE-家族的基因可以特征在于共有的 MAGE同源性结构域(MHD)。这些抗原中的每一种，即，黑色素细胞特异性抗原，癌-睾丸抗原和肿瘤特异性抗原，可以引发自体同源性细胞和体液免疫应答。因此，由本发明的核酸序列编码的肿瘤抗原优选是黑色素细胞特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选地，其可以是CT-X 抗原，非X CT抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非X CT抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原，非XCT抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原。
特别优选的肿瘤抗原选自由下述组成的列表：5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIPHPG1，α-5-β-1-整联蛋白，α-5-β-6-整联蛋白，α-辅肌动蛋白-4/m，α-甲基酰基-辅酶A消旋酶，ART-4，ARTC1/m，B7H4，BAGE-1， BCL-2，bcr/abl，β-连环蛋白/m，BING-4，BRCA1/m，BRCA2/m，CA 15-3/CA 27-29，CA 19-9，CA72-4，CA125，肌钙网蛋白，CAMEL，CASP-8/m，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L，CD19，CD20，CD22，CD25，CDE30， CD33，CD4，CD52，CD55，CD56，CD80，CDC27/m，CDK4/m，CDKN2A/m， CEA，CLCA2，CML28，CML66，COA-1/m，类共激活蛋白(coactosin-like protein)，胶原XXIII，COX-2，CT-9/BRD6，Cten，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，cYP-B，CYPB1，DAM-10，DAM-6，DEK-CAN， EFTUD2/m，EGFR，ELF2/m，EMMPRIN，EpCam，EphA2，EphA3， ErbB3，ETV6-AML1，EZH2，FGF-5，FN，Frau-1，G250，GAGE-1， GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE7b，GAGE-8， GDEP，GnT-V，gP100，GPC3，GPNMB/m，HAGE，HAST-2，hepsin， Her2/neu，HERV-K-MEL，HLA-A*0201-R17I，HLA-A11/m，HLA-A2/m，HNE，同源异型框NKX3.1，HOM-TES-14/SCP-1，HOM-TES-85，HPV-E6， HPV-E7，HSP70-2M，HST-2，hTERT，iCE，IGF-1R，IL-13Ra2，IL-2R， IL-5，不成熟的层粘连蛋白受体，激肽释放酶-2，激肽释放酶-4，Ki67， KIAA0205，KIAA0205/m，KK-LC-1，K-Ras/m，LAGE-A1，LDLR-FUT，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A9， MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B 1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4， MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D1，MAGE-D2，MAGE-D4，MAGE-E1， MAGE-E2，MAGE-F1，MAGE-H1，MAGEL2，乳腺珠蛋白(mammaglobin) A，MART-1/melan-A，MART-2，MART-2/m，基质蛋白22，MC1R，M-CSF， ME1/m，间皮素(mesothelin)，MG50/PXDN，MMP11，MN/CA IX-抗原， MRP-3，MUC-1，MUC-2，MUM-1/m，MUM-2/m，MUM-3/m，I/m类肌球蛋白，NA88-A，N-乙酰葡糖胺转移酶-V，Neo-PAP，Neo-PAP/m， NFYC/m，NGEP，NMP22，NPM/ALK，N-Ras/m，NSE，Ny-ESO-B， NY-ESO-1，OA1，OFA-iLRP，OGT，OGT/m，OS-9，OS-9/m，骨钙素，骨桥蛋白，p15，p190m型bcr-abl(p190minor bcr-abl)，p53，p53/m，PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PAP，PART-1，PATE，PDEF，Pim-1-激酶，Pin-1， Pml/PARα，POTE，PRAME，PRDX5/m，prostein，蛋白酶-3，PSA，PSCA， PSGR，PSM，PSMA，PTPRK/m，RAGE-1，RBAF600/m，RHAMM/CD168， RU1，RU2，S-100，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SCC，SIRT2/m， Sp17，SSX-1，SSX-2/HOM-MEL-40，SSX-4，STAMP-1，STEAP-1，存活蛋白(survivin)，存活蛋白-2B，SYT-SSX-1，SYT-SSX-2，TA-90，TAG-72， TARP，TEL-AML 1，TGFβ，TGFβRII，TGM-4，TPI/m，TRAG-3，TRG， TRP-1，TRP-2/6b，TRP/INT2，TRP-p8，酪氨酸酶，UPA，VEGFR1， VEGFR-2/FLK-1，和WT1。所述肿瘤抗原优选地可以选自由下述组成的组：p53，CA125，EGFR，Her2/neu，hTERT，PAP，MAGE-A1，MAGE-A3，间皮素，MUC-1，GP100，MART-1，酪氨酸酶，PSA，PSCA，PSMA， STEAP-1，VEGF，VEGFR1，VEGFR2，Ras，CEA或WT1，并且更优选地选自PAP，MAGE-A3，WT1和MUC-1。所述肿瘤抗原优选地可以选自由下述组成的组：MAGE-A1(例如，登记号M77481所述的 MAGE-A1)，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A6(例如，登记号NM_005363 所述的MAGE-A6)，MAGE-C1，MAGE-C2，melan-A(例如，登记号 NM_005511所述的melan-A)，GP100(例如，登记号M77348所述的 GP100)，酪氨酸酶(例如，登记号NM_000372所述的酪氨酸酶)，surviving (例如，登记号AF077350所述的存活蛋白)，CEA(例如，登记号NM_004363 所述的CEA)，Her-2/neu(例如，登记号M11730所述的Her-2/neu)，WTl (例如，登记号NM_000378所述的WT1)，PRAME(例如，登记号 NM_006115所述的PRAME)，EGFRI(表皮生长因子受体1)(例如，登记号AF288738所述的EGFRI(例如，登记号1))，MUC1，黏蛋白-1(例如，登记号NM_002456所述的黏蛋白-1)，SEC61G(例如，登记号NM_014302 所述的SEC61G)，hTERT(例如，登记号NM_198253所述的hTERT)，5T4 (例如，登记号NM_006670所述的5T4)，TRP-2(例如，登记号NM_001922 所述的TRP-2)，STEAP1，PCA，PSA，PSMA，等等。
此外，肿瘤抗原还可以包括与癌症或肿瘤疾病(特别是淋巴瘤或淋巴瘤相关的疾病)相关的独特型抗原，其中所述独特型抗原是淋巴样血细胞的免疫球蛋白独特型或淋巴样血细胞的T细胞受体独特型。
用于治疗癌症或肿瘤疾病的肿瘤抗原性蛋白典型地是哺乳动物来源、优选人来源的蛋白。其对于受试者治疗的选择取决于待治疗的肿瘤类型和个体肿瘤的表达模式。例如，患有前列腺癌的人优选地用典型地在前列腺癌中表达(或过表达)或在待治疗的受试者中特异性过表达的肿瘤抗原，例如，PSMA，PSCA，和/或PSA中的任一种进行治疗。
本发明第一方面所述的本发明的核酸的编码区可以作为单顺反子、双顺反子或甚至多顺反子核酸而存在，即为携带一种、两种或更多种蛋白或肽的编码序列的核酸。在双顺反子或甚至多顺反子核酸中的所述编码序列可以被至少一个内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如，如本文所述)或被信号肽隔开，所述信号肽诱导所产生的包含数个蛋白或肽的多肽的切割。
按照本发明的第一方面，本发明的核酸序列包含编码区，所述编码区编码包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白。优选地，所编码的肿瘤抗原不是组蛋白类蛋白。在本发明的情形中，所述组蛋白类蛋白典型地是在真核细胞核中发现的强碱性蛋白，其包装并且使DNA按秩序成为称为核小体的结构单位。组蛋白类蛋白是染色质的组要蛋白成分，作为DNA围绕其缠绕的轴，并且在基因调节中起作用。如果没有组蛋白，染色体中未缠绕的DNA将非常长(在人DNA中，长度与宽度的比率大于10,000,000)。例如，每个人体细胞具有约1.8米长的DNA，但是缠绕在组蛋白上，其具有约90毫米长的染色质，当在有丝分裂过程中复制并压缩时，其产生约120微米的染色体。更优选地，在本发明的情形中，所述组蛋白类蛋白典型地定义为选自下述五种主要种类的组蛋白中的一种的高度保守的蛋白：H1/H5，H2A，H2B，H3和H4″，优选选自哺乳动物组蛋白，更优选选自人组蛋白或组蛋白类蛋白。所述组蛋白或组蛋白类蛋白典型地分成两个超级种类：定义为核心组蛋白，包括组蛋白H2A，H2B， H3和H4；和定义为接头组蛋白，包括组蛋白H1和H5。
在这一情形中，接头组蛋白，优选地排除在待审的发明的保护范围之外，优选哺乳动物接头组蛋白，更优选人接头组蛋白，典型地选自H1，包括H1F，特别包括H1F0，H1FNT，H1FOO，H1FX和H1H1，特别包括HIST1H1A，HIST1H1B，HIST1H1C，HIST1H1D，HIST1H1E，HIST1H1T；并且
此外，核心组蛋白，优选地排除在待审的发明的保护范围之外，优选哺乳动物核心组蛋白，更优选人核心组蛋白，典型地选自H2A，包括 H2AF，特别包括H2AFB1，H2AFB2，H2AFB3，H2AFJ，H2AFV，H2AFX， H2AFY，H2AFY2，H2AFZ，和H2A1，特别包括HIST1H2AA，HIST1H2AB， HIST1H2AC，HIST1H2AD，HIST1H2AE，HIST1H2AG，HIST1H2AI， HIST1H2AJ，HIST1H2AK，HIST1H2AL，HIST1H2AM，和H2A2，特别包括HIST2H2AA3，HIST2H2AC；H2B，包括H2BF，特别包括H2BFM， H2BFO，H2BFS，H2BFWT H281，特别包括HIST1H2BA，HIST1H2BB，HIST1H2BC，HIST1H2BD，HIST1H2BE，HIST1H2BF，HIST1H2BG， HIST1H2BH，HIST1H2BI，HIST1H2BJ，HIST1H2BK，HIST1H2BL， HIST1H2BM，HISTlH2BN，HIST1H2BO，和H2B2，特别包括HIST2H2BE；H3，包括H3A1，特别包括HIST1H3A，HIST1H3B， HIST1H3C，HIST1H3D，HIST1H3E，HIST1H3F，HIST1H3G，HIST1H3H， HIST1H3I，HIST1H3J，和H3A2，特别包括HIST2H3C，和H3A3，特别包括HIST3H3；H4，包括H41，特别包括HIST1H4A，HIST1H4B， HIST1H4C，HIST1H4D，HIST1H4E，HIST1H4F，HIST1H4G，HIST1H4H， HIST1H4I，HISTlH4J，HIST1H4K，HIST1H4L，和H44，特别包括 HIST4H4，和H5。
按照本发明的第一方面，本发明的核酸包含编码区，所述编码区编码包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白。优选地，所编码的肿瘤抗原不是报道蛋白(例如，荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)，增强的绿色荧光蛋白(EGFP)，β-半乳糖苷酶)，并且不是标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白，半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。优选地，本发明的核酸序列不包含(细菌)抗生素抗性基因，特别不是neo 基因序列(新霉素抗性基因)或CAT基因序列(氯霉素乙酰转移酶，氯霉素抗性基因)。
上文定义的本发明的核酸包含或编码：a)编码区，所述编码区编码包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白；b)至少一个组蛋白茎环，和c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化序列；优选地用于增加所编码的肽或蛋白的表达，其中所编码的肽或蛋白优选不是组蛋白类蛋白，不是报道蛋白和/或不是标记或选择蛋白，如上文定义。本发明的核酸的元件b) 至c)可以以任意顺序存在于本发明的核酸中，即，元件a)，b)和c)可以从 5’至3’方向以a)，b)和c)或a)，c)和b)的顺序存在于本发明的核酸序列中，其中也可以包含本文所述的其他元件，诸如5’-CAP结构，聚(C)序列，稳定序列，IRES序列等。本发明的核酸的元件a)至c)中的每一个，特别是在双顺反子或多顺反子构建体中的a)和/或元件b)和c)中的每一个，更优选元件b)在本发明的核酸中也可以重复至少一次，优选两次或更多次。例如，本发明的核酸可以例如以下述顺序显示其序列元件a)，b)和任选的 c)：
5’-编码区-组蛋白茎环-聚腺苷酸序列-3’；或
5’-编码区-组蛋白茎环-聚腺苷酸化信号-3’；或
5’-编码区-聚腺苷酸序列-组蛋白茎环-3’；或
5’-编码区-聚腺苷酸化信号-组蛋白茎环-3’；或
5’-编码区-编码区-组蛋白茎环-聚腺苷酸化信号-3’；或
5’-编码区-组蛋白茎环-组蛋白茎环-聚腺苷酸序列-3’；或
5’-编码区-组蛋白茎环-组蛋白茎环-聚腺苷酸化信号-3’；等等。
在这一情形中，特别优选的是本发明的核酸序列包含或编码：a)编码区，所述编码区编码包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白； b)至少一个组蛋白茎环，和c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化序列；优选地用于增加所编码的肽或蛋白的表达，其中所编码的蛋白优选不是组蛋白类蛋白，不是报道蛋白(例如，荧光素酶，GFP，EGFP，β-半乳糖苷酶，特别是EGFP)和/或不是标记或选择蛋白(例如，α-珠蛋白，半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在第一方面的进一步优选的实施方案中，本文定义的本发明的核酸序列还可以以修饰的核酸的形式存在。
在这一情形中，本文定义的本发明的核酸序列可以被修饰，以提供“稳定的核酸”，优选稳定的RNA，更优选基本上耐受体内降解(例如，通过核酸外切酶或核酸内切酶降解)的RNA。例如，稳定的核酸可以通过改变本发明的核酸序列的编码区的G/C含量，通过引入核苷酸类似物 (例如，具有主链修饰、糖修饰或碱基修饰的核苷酸)或通过在本发明核酸序列的3’-和/或5’-非翻译区引入稳定序列而获得。
如上文提及，本文定义的本发明的核酸序列可以包含核苷酸类似物/ 修饰，例如，主链修饰，糖修饰或碱基修饰。与本发明相联系的主链修饰是这样的修饰，即，本文定义的本发明的核酸序列中所包含的核苷酸的主链的磷酸被化学修饰。与本发明相联系的糖修饰是本文定义的本发明的核酸序列的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明相联系的碱基修饰是本发明的核酸序列的核酸分子的核苷酸的碱基结构部分的化学修饰。在这一情形中，核苷酸类似物或修饰优选选自适于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
在本发明第一方面的特别优选的实施方案中，本文定义的核苷酸类似物/修饰选自下述碱基修饰：所述碱基修饰另外增加所编码的蛋白的表达，并且优选地选自：2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸，2-氨基腺苷-5′-三磷酸，2-硫代胞苷-5′-三磷酸，2-硫代尿苷-5′-三磷酸，4-硫代尿苷-5′-三磷酸，5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸，5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸，5-溴胞苷-5′-三磷酸，5-溴尿苷-5′-三磷酸，5-碘胞苷-5′-三磷酸，5-碘尿苷-5′-三磷酸，5-甲基胞苷-5′-三磷酸，5-甲基尿苷-5′-三磷酸，6-氮胞苷-5′-三磷酸， 6-氮尿苷-5′-三磷酸，6-氯嘌呤核苷-5′-三磷酸，7-脱氮腺苷-5′-三磷酸，7- 脱氮鸟苷-5′-三磷酸，8-氮杂腺苷-5′-三磷酸，8-叠氮腺苷-5′-三磷酸，苯并咪唑-核苷-5′-三磷酸，N1-甲基腺苷-5′-三磷酸，N1-甲基鸟苷-5′-三磷酸， N6-甲基腺苷-5′-三磷酸，O6-甲基鸟苷-5′-三磷酸，假尿苷-5′-三磷酸，或嘌呤霉素-5′-三磷酸，黄苷-5′-三磷酸。对于核苷酸，特别优选的是选自由下述组成的碱基修饰的核苷酸的组的碱基修饰：5-甲基胞苷-5＇-三磷酸， 7-脱氮鸟苷-5′-三磷酸，5-溴胞苷-5′-三磷酸和假尿苷-5′-三磷酸。
按照另一个实施方案，本文定义的本发明的核酸序列可以包含脂质修饰。所述脂质-修饰的核酸典型地包含本文定义的核酸。本文定义的本发明的核酸序列的所述脂质-修饰的核酸分子典型地进一步包含与所述核酸分子共价连接的至少一个接头，和与各个接头共价连接的至少一个脂质。备选地，所述脂质-修饰的核酸分子包含如本文定义的至少一种核酸分子和与所述核酸分子共价连接(不用接头)的至少一个(双功能)脂质。根据第三备选方案，所述脂质-修饰的核酸分子包含如本文定义的核酸分子，与所述核酸分子共价连接的至少一个接头和与各个接头共价连接的至少一个脂质，以及还有与所述核酸分子共价连接(不用接头)的至少一个 (双功能)脂质。在这一情形中，特别优选的是，脂质修饰存在于线性的本发明的核酸序列的末端。
按照本发明第一方面另一个优选的实施方案，本文定义的本发明的核酸序列，特别是如果提供为(m)RNA，由此可以通过添加所谓的“5′CAP”结构而针对RNA酶的降解而稳定。
按照本发明第一方面进一步优选的实施方案，本文定义的本发明的核酸序列可以由至少10个胞苷的序列、优选至少20个胞苷、更优选至少 30个胞苷的序列(所谓的“聚(C)序列”)修饰。特别地，本发明的核酸序列可以包含或编码典型地约10-200个胞苷核苷酸、优选约10-100个胞苷核苷酸、更优选约10-70个胞苷核苷酸或甚至更优选约20-50个或甚至20-30个胞苷核苷酸的聚(C)序列。该聚(C)序列优选位于包含在本发明第一方面所述的本发明的核酸中的编码区的3’。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，与其特定的野生型编码区 (即，未修饰的编码区)的G/C含量相比，本文定义的本发明的核酸序列的编码区(编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白)的G/C含量被改变，特别地被增加。与特定野生型编码区编码的氨基酸序列相比，该编码区所编码的氨基酸序列优选没有改变。
本文定义的本发明的核酸序列编码区的G/C-含量的改变是基于这样的事实，即，要被翻译的任意mRNA区的序列对于该mRNA的有效翻译是重要的。因此，各种核苷酸的组成和序列是重要的。特别地，与具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的mRNA序列相比，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的mRNA序列更稳定。因此，按照本发明，与其野生型编码序列相比，所述编码区的密码子是改变的，但是保留翻译的氨基酸序列，以使其包含增加量的G/C核苷酸。关于几种密码子编码同一种氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。
与其野生型编码区相比，取决于本文定义的本发明的核酸序列的编码区所编码的氨基酸，对于所述核酸序列，例如编码区的修饰存在多种可能性。在由仅含有G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的情形中，不需要对该密码子的修饰。因此，由于不存在A或U，关于Pro(CCC或CCG)， Arg(CGC或CGG)，Ala(GCC或GCG)和Gly(GGC或GGG)的密码子不需要修饰。
相比之下，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过编码相同的氨基酸但是不含有A和/或U的其他密码子的替代而进行修饰。这些的实例如下：
Pro的密码子可以由CCU或CCA修饰为CCC或CCG；
Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG；
Ala的密码子可以由GCU或GCA修饰为GCC或GCG；
Gly的密码子可以由GGU或GGA修饰为GGC或GGG。
在其他情形中，尽管不能从密码子中消除A或U核苷酸，但是其可以通过使用含有较低A和/或U核苷酸含量的密码子来减少A和U的含量。这些的实例如下：
Phe的密码子可以由UUU修饰为UUC；
Leu的密码子可以由UUA，UUG，CUU或CUA修饰为CUC或CUG；
Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU修饰为UCC，UCG或AGC；
Tyr的密码子可以由UAU修饰为UAC；
Cys的密码子可以由UGU修饰为UGC；
His的密码子可以由CAU修饰为CAC；
Gln的密码子可以由CAA修饰为CAG；
Ile的密码子可以由AUU或AUA修饰为AUC；
Thr的密码子可以由ACU或ACA修饰为ACC或ACG；
Asn的密码子可以由AAU修饰为AAC；
Lys的密码子可以由AAA修饰为AAG；
Val的密码子可以由GUU或GUA修饰为GUC或GUG；
Asp的密码子可以由GAU修饰为GAC；
Glu的密码子可以由GAA修饰为GAG；
终止密码子UAA可以修饰为UAG或UGA。
另一方面，在Met(AUG)和Trp(UGG)密码子的情形中，没有序列修饰的可能性。
上文列出的置换可以单独或以所有可能的组合使用，从而与其特定的野生型编码区(即，原始序列)相比，增加本文定义的本发明的核酸序列的编码区的G/C含量。因此，例如，关于野生型序列中存在的Thr的所有的密码子都可以修饰为ACC(或ACG)。
在上述情形中，显示了mRNA密码子。因此，在相应的编码特定 mRNA的DNA中，mRNA中存在的尿苷也可以存在为胸苷。
优选地，与野生型编码区的G/C含量相比，本文定义的本发明的核酸序列的编码区的G/C含量增加至少7％，更优选增加至少15％，特别优选地增加至少20％。根据具体的实施方案，在编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白的编码区中至少5％，10％，20％， 30％，40％，50％，60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％且最优选至少90％，95％或甚至100％的可取代的密码子被取代，由此增加所述编码区的G/C含量。
在这一情形中，特别优选的是，与野生型编码区相比，将本文定义的本发明的核酸序列的编码区的G/C含量增加至最大(即，100％可取代的密码子)。
按照本发明，本文定义的本发明的核酸序列的编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白的编码区的进一步优选的修饰是基于这样的发现，即，翻译效率还取决于tRNAs在细胞中存在的不同频率。因此，如果在本文定义的本发明的核酸序列的编码区中存在增加程度的所谓的“稀少密码子”，与其中存在编码相对“常见的”tRNAs的密码子的情形相比，相应的修饰的核酸序列以显著更少的程度翻译。
在这一情形中，与相对应的野生型编码区相比，本发明的核酸序列的编码区优选被修饰，以使编码在细胞中相对稀少的tRNA的野生型序列的至少一个密码子交换为编码在细胞中相对常见且与所述相对稀少的 tRNA携带相同的氨基酸的tRNA的密码子。通过这种修饰，本文定义的本发明的核酸序列的编码区被修饰，以插入关于常见的tRNAs是可用的密码子。换言之，按照本发明，通过这种修饰，编码在细胞中相对稀少的 tRNA的野生型编码区的所有密码子可以交换为编码在细胞中相对常见且在每种情形中与所述相对稀少的tRNA携带相同的氨基酸的tRNA的密码子。
哪些tRNAs在细胞中相对常见，相比之下，哪些tRNAs相对稀少，对于本领域技术人员是已知的；例如，参考Akashi，Curr.Opin.Genet.Dev. (现代遗传发育观点)2001，11(6)：660-666。特别优选为特定氨基酸使用最常见的tRNA的密码子，例如，Gly密码子，其利用在(人)细胞中最常见的tRNA。
在这种情形中，特别优选的是，在不改变由核酸序列的编码区所编码的肽或蛋白的氨基酸序列的前提下，将本文定义的本发明的核酸序列的编码区中增加的(特别是最大化的)序列G/C含量与“常见”密码子联系起来。这种优选的实施方案允许提供特别有效翻译的和稳定的(修饰的) 本文定义的本发明的核酸序列。
按照本发明第一方面的另一个优选的实施方案，本文定义的本发明的核酸序列优选另外具有至少一个5′和/或3′稳定序列。这些在5’和/或3’非翻译区的稳定序列具有增加核酸、特别是胞质中的mRNA的半衰期的作用。这些稳定序列可以与在病毒、细菌和真核生物中存在的天然存在的序列具有100％的序列同一性，但是也可以是部分或完全合成的。可以提及(α-)珠蛋白基因(例如，来自智人(Homo sapiens)或光滑爪蟾(Xenopus laevis))的非翻译序列(UTR)作为可以在本发明中用于稳定的核酸的稳定序列的实例。稳定序列的另一个实例具有通式： (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO：55)，其包含在编码(α-)珠蛋白、(I)型-胶原蛋白、15-脂氧合酶或编码酪氨酸羟化酶的非常稳定的 RNAs的3’-UTRs中(参见Holcik等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)1997，94：2410-2414)。所述稳定序列当然能够单独使用或与另一种组合使用并且还与本领域技术人员已知的其他稳定序列组合使用。在这一情形中，特别优选的是，α珠蛋白基因的3’UTR序列位于包含在本发明第一方面所述的本发明的核酸序列的编码至少一种包含肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白的编码区的3’。
碱基的置换、添加或消除优选地用本文定义的本发明的核酸序列使用用于制备所述核酸序列的DNA基质通过公知的定点诱变技术或使用寡核苷酸连接策略进行(参见，例如，Maniatis等人.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第3版，Cold Spring Harbor，NY，2001)。
上述任一种修饰可以适用于本文定义的本发明的核酸序列，并且适用于用在本发明的情形中的任一种核酸，并且，如果适当的或必要的，可以彼此以任意组合来组合，条件是，这些修饰的组合在各个核酸中彼此不干扰。因此，本领域技术人员能够作出选择。
按照本发明使用的本文定义的核酸序列可以使用本领域已知的任意方法制备，包括合成法，诸如例如，固相合成，以及体外方法，诸如体外转录反应或体内反应，诸如DNA质粒在细菌中的体内繁殖。
在这样的方法中，为了制备本文定义的本发明的核酸序列，特别是当所述核酸是mRNA的形式时，可以在体外转录相对应的DNA分子。该DNA基质优选地包含合适的启动子，例如T7或SP6启动子，以用于体外转录，其后跟随着关于待制备的核酸分子(例如mRNA)的需要的核苷酸序列和体外转录的终止信号。形成至少一种目的RNA基质的DNA 分子可以通过发酵增殖和随后分离为可以在细菌内复制的质粒的一部分来制备。可以作为适合于本发明提及的质粒是例如质粒pT7Ts(GenBank 编号U26404；Lai等人，Development(发育)1995，121：2349-2360)，系列，例如-1(GenBank编号X65300；来自Promega)和 pSP64(GenBank编号X65327)；还参考：Mezei和Storts，Purification of PCR Products(PCR产物的纯化)，在：Griffin和Griffin(编)，PCR Technology： Current Innovation(PCR技术：当前改革)，CRC Press(CRC出版社)， Boca Raton，FL，2001中。
本文定义的本发明的核酸序列以及由该核酸序列编码的蛋白或肽可以包含这些序列的片段或变体。所述片段或变体可以典型地包含这样的序列，所述序列在核酸水平或氨基酸水平上与上文提及的核酸中的一种，或与由本发明的核酸序列编码的蛋白或肽或序列中的一种具有至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，优选至少70％，更优选至少80％，同等地更优选至少85％，甚至更优选至少90％和最优选至少95％或甚至 97％，98％或99％的序列同一性，至完整的野生型序列。
在本发明的情形中，蛋白或肽的“片段”(例如，由本文定义的本发明的核酸序列编码)可以包含本文定义的蛋白或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码核酸分子)，与原始(天然)蛋白(或其编码核酸分子) 的氨基酸序列相比，其是N端、C端和/或序列内部截短/变短的。因此，所述截短可以在氨基酸水平或相应地在核酸水平上发生。因此，关于本文定义的所述片段的序列同一性可以优选地指本文定义的完整的蛋白或肽或所述蛋白或肽的完整的(编码)核酸。同样地，在本发明的情形中核酸的“片段”可以包含本文定义的核酸的序列，关于其核酸分子，与原始(天然)核酸分子相比，其是5’-，3’-和/或序列内部截短/变短的。因此，关于本文定义的所述片段的序列同一性可以优选指本文定义的完整的核酸，并且优选的序列同一性水平典型地如本文所示。与全长天然肽或蛋白相比，片段具有相同的生物学功能或特异性的活性或者至少保留所述天然全长蛋白至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的活性(如在适当的功能测定中测量，例如，通过适当的测定系统评估抗原性特性的测定，例如，其测量免疫学反应，例如，测量适当的细胞因子(作为免疫反应的指示剂)的表达和/或分泌)，例如其特异性抗原性或治疗性特性。因此，在优选的实施方案中，所述“片段”是全长(天然存在的)肿瘤抗原性蛋白的一部分，其对免疫系统发挥如本文所述的肿瘤抗原性特性。
在本发明的情形中，蛋白或肽的片段(例如，由本文定义的本发明的核酸序列编码)还可以包含本文定义的蛋白或肽的序列，该序列具有约 6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，由I类MHC分子加工并呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如，8，9或10 个氨基酸的长度，(或者甚至6，7，11或12个氨基酸)，或由II类MHC 分子加工并呈递的片段，优选具有约13个以上的氨基酸的长度，例如， 13，14，15，16，17，18，19，20或甚至更多个氨基酸的长度，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任一部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以其天然形式被识别。本文定义的蛋白或肽的片段可以包含那些蛋白或肽的至少一个表位。此外，蛋白的结构域，如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白的缩短或截短版本，也可以理解为包含蛋白的片段。
本文定义的蛋白或肽的片段(例如，由本文定义的本发明的核酸序列编码)还可以包含这些蛋白或肽的表位。在本发明的情形中，蛋白的T 细胞表位或部分可以包括优选具有约6至约20个或甚至更多个氨基酸的长度的片段，例如，由I类MHC分子加工和呈递的片段，优选具有约8- 约10个氨基酸的长度，例如，8，9，或10个氨基酸(或甚至11或12个氨基酸)，或通过II类MHC分子加工和呈递的片段，优选具有约13个以上氨基酸的长度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其中这些片段可以选自氨基酸序列的任一部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以其天然形式被识别。
B细胞表位典型地是位于本文定义的(天然)蛋白或肽抗原外表面上的片段，优选地具有5至15个氨基酸，更优选地具有5至12个氨基酸，甚至更优选地具有6至9个氨基酸，其可以被抗体识别，即，以其天然形式被抗体识别。
蛋白或肽的此类表位还可以选自本文提及的所述蛋白或肽的变体中的任一种。在这一情形中，抗原决定簇可以是构象或不连续的表位，其由本文定义的蛋白或肽的片段组成，所述片段在本文定义的蛋白或肽的氨基酸序列上是不连续的，但是在三维结构上聚在一起；或者是由单一多肽链组成的连续或线性的表位。
在本发明的情形中定义的蛋白或肽的“变体”可以由本文定义的本发明的核酸序列编码。由此，可以产生具有与原始序列在一个或多个(2， 3，4，5，6，7个以上)突变，诸如一个或多个置换的、插入的和/或缺失的氨基酸处不同的氨基酸序列的蛋白或肽。“变体”关于全长天然蛋白序列的优选的序列同一性水平典型地如本文所示。优选地，与全长天然肽或蛋白相比，变体具有相同的生物学功能或特异性的活性或者至少保留所述天然全长蛋白至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的活性(如在适当的功能测定中测量，例如，通过由一种或多种细胞因子的分泌和/或表达来评估针对肿瘤抗原的免疫学反应的测定)，例如其特异性抗原特性。因此，在优选的实施方案中，“变体”是肿瘤抗原性蛋白的变体，其发挥本文所示的程度的抗原特性。
在本发明的情形中定义的蛋白或肽的“变体”(例如，由本文定义的核酸编码)与其天然的(即，未突变的)生理学序列相比可以包含保守氨基酸取代。这些氨基酸序列及其编码核苷酸序列特别都在本文定义的术语变体的涵盖下。其中来源于同一类的氨基酸彼此交换的取代称为保守取代。具体地，这些是具有脂族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、在侧链中有芳香基团的氨基酸，或是这样的氨基酸，即所述氨基酸的侧链可以参与氢键，例如，具有羟基官能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被具有相似极性侧链的另一种氨基酸替代，或者例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被另一种具有类似的疏水侧链的氨基酸取代(例如，丝氨酸 (苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。特别地，插入和取代可能在不引起三维结构改变或不影响结合区的那些序列位置。例如，使用CD光谱(圆二色谱)可以容易地确定插入或缺失对三维结构的改变(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides(多肽的吸光度、圆二色性和ORD)，在：Modern Physical Methods in Biochemistry(生物化学中的现代物理方法)，Neuberger等人，(编)，Elsevier，Amsterdam)中。
此外，本文定义的可以由本文定义的本发明的核酸序列编码的蛋白或肽的变体还可以包含那些序列，其中所述核酸的核苷酸按照遗传密码的简并性交换而不导致蛋白或肽相应的氨基酸序列改变，即，所述氨基酸序列或其至少部分在上述意义内的一个或多个突变处与原始序列没有区别。
为了确定两个序列相同的百分数，所述序列例如，本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的本发明的核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身，可以比对所述序列，以随后彼此比较。因此，例如，第一序列的位置可以与第二序列的相应位置进行比较。如果第一序列中的位置被与第二序列中某位置相同的成分占据，则这两个序列在该位置是相同的。如果这不是这样的情形，则所述序列在该位置是不同的。如果与第一序列相比，在第二序列中存在插入，则可以在第一序列中插入缺口以允许进一步的比对。如果与第一序列相比，在第二序列中存在缺失，则可以在第二序列中插入缺口以允许进一步的比对。然后，两个序列相同的百分数是相同位置的数目除以位置总数(包括仅在一个序列中占据的那些位置)的函数。两个序列相同的百分数可以使用数学算法确定。可以使用的一种优选的但非限制性的数学算法的实例是Karlin等人，(1993)，PNAS USA，90：5873-5877或Altschul等人，(1997)，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，25：3389-3402的算法。这样的算法整合在BLAST程序中。通过该程序能够鉴定与本发明的序列在某种程度上相同的序列。
本文定义的本发明的核酸序列可以编码肽或蛋白的衍生物。所述肽或蛋白的衍生物是来源于另一种分子(如所述肽或蛋白)的分子。“衍生物”典型地包含天然肽或蛋白的全长序列以及另外的序列特征，例如，在 N端或在C端，其可以对天然全长肽/蛋白表现出另外的功能。同样地，与全长天然肽或蛋白相比，所述衍生物具有相同的生物学功能或特异性的活性或者至少保留天然全长蛋白至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％的活性(如在适当的功能测定中测量，参见上文，例如，在免疫学反应中由细胞因子表达和/或分泌表示)，例如，其特异性的治疗特性。由此，肽或蛋白的“衍生物”还包括包含与独特的肽/蛋白融合的用于本发明的肽或蛋白或天然全长蛋白(或其变体/片段)的(嵌合的)融合肽/蛋白，例如，为所述融合肽/蛋白赋予两种以上的生物学功能。例如，融合体包含标记，诸如例如，表位，例如，FLAG表位或V5表位或HA 表位。例如，所述表位是FLAG表位。例如，这样的标记用于纯化所述融合蛋白。
在这一情形中，蛋白或肽的“变体”可以与所述蛋白或肽的10，20，30，50，75或100个氨基酸的片段具有至少70％，75％，80％，85％，90％， 95％，98％或99％的氨基酸同一性。类似地，核酸序列的“变体”，或具体地，片段可以与所述核酸序列的10，20，30，50，75或100个核苷酸的片段具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的核苷酸同一性；然而，典型地是与天然存在的全长序列相比。典型地，在“片段”的情形中，对于(所述片段)在全长蛋白的一部分上的长度(反映与所述片段相同的长度)确定该片段的序列同一性，所述长度表现出最高水平的序列同一性。
在本发明第一方面的另一个优选的实施方案中，本发明的核酸序列与载体、转染或复合试剂缔合，以增加本发明的核酸序列的转染效率和/ 或免疫刺激性特性。在这一情形中，适于增加转染效率的特别优选的试剂是阳离子或聚阳离子化合物，包括鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，或其它阳离子肽或蛋白质，诸如聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，细胞渗透肽(CPPs)，包括HIV结合肽，HIV-1Tat(HIV)，Tat-衍生的肽，穿膜肽，VP22衍生的或类似的肽，HSV VP22(单纯疱疹(Herpes simplex))，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs)，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，一种或多种MPG-肽，Pep-1， L-寡聚体，降钙素肽，触角足衍生肽(特别地来自果蝇触角足(Drosophilaantennapedia))，pAntp，pIsl，FGF，乳铁蛋白，Transportan，Buforin-2， Bac715-24，SynB，SynB(1)，pVEC，hCT-衍生的肽，SAP或组蛋白。另外，优选的阳离子或聚阳离子蛋白或肽可以选自具有下述总式的蛋白或肽：(Arg)1；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，其中1+m+n+o+x＝8-15，并且 l，m，n或o彼此独立地可以是选自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14或15的任意数字，条件是Arg，Lys，His和Orn的总含量占该寡肽全部氨基酸的至少50％；并且Xaa可以是选自除Arg、 Lys、His或Orn之外的天然(＝天然存在的)或非天然氨基酸中的任一种氨基酸；x是选自0，1，2，3或4的任意数字，条件是，Xaa的总含量不超过该寡肽全部氨基酸的50％。在这一情形中，特别优选的阳离子肽是，例如，Arg7，Arg8，Arg9，H3R9，R9H3，H3R9H3，YSSR9SSY，(RKH)4， Y(RKH)2R等。可以用作转染剂的特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如，壳聚糖，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)，阳离子聚合物，例如，聚乙烯亚胺(PEI)，阳离子脂质，例如，DOTMA：[1-(2，3-二油酰氧基)丙基)]-N，N，N-三甲基氯化铵， DMRIE，二-C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol，BGTC，CTAP，DOPC， DODAP，DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA，DODAB，DOIC，DMEPC， DOGS：Dioctadecylamidoglicylspermin，DIMRI：二肉豆蔻酰-氧丙基二甲基羟乙基溴化铵，DOTAP：二油基氧基-3-(三甲基铵基)丙烷，DC-6-14：O，O-双十四酰基-N-(α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIP1：外消旋-[(2，3-双十八基氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵，CLIP6：外消旋 -[2(2，3-双十六基氧基丙基-氧基甲氧基)乙基]三甲基铵，CLIP9：外消旋 -[2(2，3-双十六基氧基丙基-氧基琥珀酰基氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如，修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺(reversed polyamides)等，改性的聚乙烯，诸如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物))等，改性的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基丙烯酸甲酯))等，改性的氨基胺 (Amidoamines)，诸如pAMAM(聚(氨基胺))等，改性的聚β氨基酯 (PBAE)，诸如二胺末端修饰的1，4丁二醇双丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物(dendrimers)，诸如聚丙胺树枝状聚合物或基于 pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，诸如PEI：聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物，基于葡聚糖的聚合物，壳聚糖等，基于甲硅烷骨架的聚合物，诸如 PMOXA-PDMS共聚物等，由一个或多个阳离子嵌段(例如选自上文提及的阳离子聚合物)的组合和一个或多个亲水或疏水嵌段(例如，聚乙二醇) 的组合组成的嵌段聚合物等。
在这一情形中，特别优选的是本发明的核酸至少部分与阳离子或聚阳离子化合物、优选阳离子蛋白或肽复合。部分意指只有一部分本发明的核酸与阳离子或聚阳离子化合物复合，并且其余的本发明的核酸是未复合的形式(“游离的”)。优选地，复合的核酸：游离的核酸的比率选自约5∶1 (w/w)至约1∶10(w/w)的范围，更优选约4∶1(w/w)至约1∶8(w/w)的范围，甚至更优选约3∶1(w/w)至约1∶5(w/w)或1∶3(w/w)的范围，最优选复合的核酸：游离的核酸的比率选自约1∶1(w/w)的比率。
优选地，本发明的核酸序列以裸露形式或复合形式提供，所述复合形式例如通过不论何种化学结构的聚阳离子化合物、优选聚阳离子(多) 肽或合成的聚阳离子化合物复合。优选地，所述核酸序列不与包装细胞一起提供。
在另一个方面，本发明提供组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其包含多种或多于一种，优选2-10种，更优选2-5种，最优选2-4种本文定义的本发明的核酸序列。这些本发明的组合物包含多于一种本发明的核酸序列，优选地编码不同的肽或蛋白，所述肽或蛋白优选地包含不同的肿瘤抗原或其片段、变体或衍生物。
在优选的实施方案中，包含多种(典型地意指多于1、2、3、4、5、 6种或多于10种核酸，例如，2-10种，优选地2-5种核酸)本发明的核酸序列、特别用于治疗前列腺癌(prostatecancer，PCa)的本发明的组合物或试剂盒或部件的试剂盒至少包含：
a)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSA或其片段、变体或衍生物；和
b)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSMA或其片段、变体或衍生物；和
c)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSCA或其片段、变体或衍生物；和
d)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原STEAP-1或其片段、变体或衍生物。
在进一步优选的实施方案中，包含多种(典型地意指多于1、2、3、 4、5、6种或多于10种核酸，例如，2-10种，优选地2-5种核酸)本发明的核酸序列、特别用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的本发明的组合物或试剂盒或部件的试剂盒至少包含：
a)包含或编码下述的核酸序列：
i.编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原NY-ESO-1或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白，
ii至少一个组蛋白茎环，和
iii.聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
b)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原5T4或其片段、变体或衍生物；和
c)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原存活蛋白或其片段、变体或衍生物。
此外，在备选方案中，包含多种(典型地意指多于1、2、3、4、5、 6种或多于10种核酸，例如，2-10种，优选地2-5种核酸)本发明的核酸序列、特别用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的本发明的组合物或试剂盒或部件的试剂盒至少包含：
a)包含或编码下述的核酸序列：
i.编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原NY-ESO-1或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白，
ii至少一个组蛋白茎环，和
iii.聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
b)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原5T4或其片段、变体或衍生物；和
c)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原存活蛋白(Survivin)或其片段、变体或衍生物；和
d)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原MAGE-C1或其片段、变体或衍生物；和
e)编码至少一种肽或蛋白的本发明的核酸，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原MAGE-C2或其片段、变体或衍生物。
按照另一个方面，本发明还提供用于增加所编码的肽或蛋白的表达的方法，所述方法包括下述步骤：例如，a)提供本文定义的本发明的核酸序列或包含多种(典型地意指多于1、2、3、4、5、6种或多于10种核酸，例如，2-10种，优选地2-5种核酸)本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物，b)将本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物用于或施用于表达系统，例如，不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述方法可以用于实验室、用于研究、用于诊断、用于肽或蛋白的商业生产和/或用于治疗目的。在这一情形中，典型地在制备本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物后，典型地以例如裸露或复合形式或作为本文所述的药物组合物或疫苗，优选通过转染或通过使用本文所述的任一种施用模式应用于或施用于不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述方法可以在体外、体内或离体进行。所述方法可以进一步在治疗特定疾病的情形中进行，特别在治疗癌症或肿瘤疾病(优选如本文所定义)的情形中进行。
在这一情形中，体外在本文中定义为将本文定义的本发明的核酸或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物转染或转导到在生物体外的培养物中的细胞中；体内在本文中定义为通过将本发明的核酸或本发明的组合物应用到完整生物体或个体上而将本发明的核酸或包含多种本发明的核酸序列的本发明的组合物转染或转导到细胞中，离体在本文中定义为将本发明的核酸或包含多种本发明的核酸序列(典型地意指多于1、2、3、4、5、6种或多于10种核酸，例如，2-10种，优选地2-5 种核酸)的本发明的组合物转染或转导到生物体或个体之外的细胞中并且随后将所转染的细胞应用到所述生物体或个体。
同样地，按照另一个方面，本发明还提供本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物用于增加所编码的肽或蛋白的表达的应用，优选用于诊断或治疗目的的应用，例如，通过将本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物应用或施用到例如不含细胞的表达系统、细胞 (例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体中。所述应用可以用于实验室、用于研究、用于诊断、用于肽或蛋白的商业生产和或用于治疗目的。在这一情形中，典型地在制备本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物之后，典型地，优选以裸露形式或复合形式或作为本文所述的药物组合物或疫苗，优选通过转染或通过使用本文所述的任一种施用模式应用于或施用于不含细胞的表达系统、细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体。所述应用可以在体外、体内或离体进行。所述应用可以进一步在治疗特定疾病的情形中进行，特别在治疗癌症或肿瘤疾病(优选如本文所定义)的情形中进行。
在另一个方面，本发明还涉及本发明的表达系统，所述表达系统包含本发明第一方面所述的本发明的核酸序列或表达载体或质粒。在这一情形中，所述表达系统可以是不含细胞的表达系统(例如，体外转录/翻译系统)、细胞表达系统(例如，哺乳动物细胞，如CHO细胞，昆虫细胞，酵母细胞，细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli))或用于表达肽或蛋白的生物体(例如植物或动物，如母牛)。
另外，按照另一个方面，本发明还涉及本文定义的本发明的核酸或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物用于制备增加编码的肽或蛋白的表达(例如，用于治疗优选如本文定义的癌症或肿瘤疾病)的药物组合物的应用，例如，将本文定义的本发明的核酸或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物应用于或施用于细胞(例如，表达宿主细胞或体细胞)、组织或生物体，优选以裸露形式或复合形式或作为本文所述的药物组合物或疫苗应用或施用，更优选使用本文所述的任一种施用模式应用或施用。
因此，在一个特别优选的方面，本发明还提供药物组合物，其包含本文定义的本发明的核酸或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物以及任选地药用载体和/或赋形剂(vehicle)。
本发明的药物组合物包含至少一种本文定义的本发明的核酸作为第一成分。
本发明的药物组合物可以任选地包含至少一种另外的药物活性组分作为第二成分。在这种联系下，药物活性组分是具有治愈、减轻或预防本文提及的特定的适应证或疾病(优选癌症或肿瘤疾病)的治疗作用的化合物。所述化合物包括，不暗示任何限制，肽或蛋白，优选如本文定义，核酸，优选如本文定义，(治疗活性的)低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000，优选小于1000)，糖，抗原或抗体，优选如本文定义，现有技术已知的治疗剂，抗原性细胞，抗原性细胞片段，细胞级分；细胞壁成分(例如，多糖)，修饰的、减毒的或去活性的(例如，化学去活性或通过辐照)病原体(病毒、细菌等)，佐剂，优选如本文定义，等等。
此外，本发明的药物组合物可以包含药用载体和/或赋形剂。在本发明的情形中，药用载体典型地包括本发明的药物组合物的液体或非液体基础。如果本发明的药物组合物以液体形式提供，则所述载体典型地是不含致热原的水；等渗的盐水或缓冲的(水性)溶液，例如，磷酸、柠檬酸等缓冲的溶液。参考特定的参比介质，注射缓冲液可以是高渗的、等渗的或低渗的，即，参考特定的参比介质，缓冲液可以具有更高、相等的或更低的盐含量，其中，优选可以使用前述盐的所述浓度，其不引起由于渗透性或其他浓度作用导致的细胞损害。参比介质是，例如，在“体内”方法中存在的液体，诸如血液、淋巴、细胞质液体，或其他体液，或例如可以在“体外”方法中用作参比介质的液体，诸如常规的缓冲液或液体。所述常规的缓冲液或液体是技术人员已知的。Ringer-乳酸盐溶液是特别优选的液体基础。
然而，一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物也可以用于本发明的药物组合物，其适于施用给待治疗的患者。术语“相容的”用作本文中意指本发明的药物组合物的这些组成成分能够与本文定义的本发明的核酸以这样的方式混合，所述方式是指不发生将基本上减少本发明的药物组合物在典型应用条件下的药物有效性的相互作用。
按照一个具体的实施方案，本发明的药物组合物可以包含佐剂。在该情形中，佐剂可以理解为适于起始或增加先天性免疫系统的免疫应答(即，非特异性免疫应答)的任意化合物。换言之，当施用时，本发明的药物组合物优选地引发由任选地包含在其中的佐剂引起的先天性免疫应答。优选地，所述佐剂可以选自技术人员已知并且适于本情形的的任一种佐剂，即，支持在哺乳动物中诱导先天性免疫应答，例如，上文定义的佐剂蛋白或下文定义的佐剂。
对于本发明的核酸序列，适于储存和递送的特别优选的佐剂是上文定义的阳离子或聚阳离子化合物作为赋形剂、转染剂或复合剂。
本发明的药物组合物可以另外包含一种或多种辅助物质，如果需要的话，以增加其免疫原性或免疫刺激性能力。由此优选地获得本文定义的本发明的核酸序列和辅助物质(其可以任选地包含本发明的药物组合物中) 的协同作用。取决于辅助物质的不同类型，在这一方面可以考虑多种机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如，脂多糖，TNF-α或CD40 配体，形成第一类适当的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”形式影响免疫系统的任何试剂(LPS，GP96等)或允许免疫应答以靶向方式增强和/或影响的细胞因子(诸如GM-CFS)作为辅助物质。特别优选的辅助物质是进一步促进先天性免疫应答的细胞因子，诸如单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子，诸如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8， IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21，IL-22，IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-27，IL-28，IL-29， IL-30，IL-31，IL-32，IL-33，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，GM-CSF，G-CSF， M-CSF，LT-β或TNF-α，生长因子，诸如hGH。
可以包含在本发明的药物组合物中的其他添加剂是乳化剂，诸如例如，吐温；湿润剂，诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；赋味剂，药用载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
本发明的药物组合物还可以另外包含任一种其他化合物，所述化合物已知由于其与人Toll样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6， TLR7，TLR8，TLR9，TLR10的结合亲和性(作为配体)，或由于其与鼠 Toll样受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TLR11，TLR12或TLR13的结合亲和性(作为配体)而是免疫刺激性的。
本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入型储库(implanted reservoir)施用。术语肠胃外用于本文中时包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或输注技术。
优选地，本发明的药物组合物可以通过肠胃外注射，更优选通过皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或经由输注技术施用。特别优选的是皮内和肌内注射。本发明的药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油质混悬液。这些混悬液可以根据本领域中已知的技术，使用适合的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。
本文定义的本发明的药物组合物还可以以任何口服可接受的剂型，包括但不限于，胶囊剂、片剂、水性混悬液或溶液口服施用。
本发明的药物组合物还可以局部施用，特别是当治疗靶标包括容易通过局部施用接近的区域或器官，例如包括皮肤或任何其他可接近的上皮组织的疾病时。合适的局部制剂对于这些区域或器官的每一个容易地制备。为了局部施用，本发明的药物组合物可以以合适的膏剂来配制，所述膏剂包含悬浮或溶解在一种或多种载体中的本文定义的本发明的核酸。
本发明的药物组合物典型地包含“安全且有效量”的本发明的药物组合物的组分，特别是本文定义的本发明的核酸序列。用于本文中时，“安全且有效量”意指足以显著诱导如本文中定义的疾病或病症的正向改善的本文定义的本发明的核酸序列的量。然而，同时，“安全且有效量”足够小到避免严重的副作用，并且允许合理的优势和风险之间的关系。这些限制的确定典型地属于合理的医学判断范围之内。
本发明的药物组合物可以用于人，并且还用于兽医用医学目的，优选用于人医学目的，一般作为药物组合物或作为疫苗施用。
按照另一个特别优选的方面，本发明的药物组合物(或本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物)可以提供为疫苗或用作疫苗。典型地，所述疫苗如上文关于药物组合物所定义。另外，所述疫苗典型地包含：本文定义的本发明的核酸或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物。
本发明的疫苗还可以包含本文关于本发明的药物组合物定义的药用载体、佐剂和/或赋形剂。在本发明的疫苗的具体情形中，药用载体的选择原则上取决于本发明的疫苗施用的方式。例如，本发明的疫苗可以系统或局部地施用。系统施用的途径通常包括，例如，经皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。口服施用的途径通常包括，例如，局部施用途径，以及皮内、经皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内和舌下注射。更优选地，疫苗可以通过皮内、皮下或肌内途径施用。因此，本发明的疫苗优选以液体(或有时以固体)形式配制。
本发明的疫苗另外可以包含一种或多种辅助物质，如果需要的话，以增加其免疫原性或免疫刺激性能力。特别优选的是关于所述药物组合物定义的作为辅助物质或添加剂的佐剂。
本发明还提供本文定义的本发明的核酸序列、包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物、本发明的药物组合物、本发明的疫苗或包含其的试剂盒的一些应用和用途，本发明的药物组合物、本发明的疫苗都包含本文定义的本发明的核酸序列。
按照一个具体的方面，本发明涉及本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物作为药物、优选作为疫苗(特别是在癌症或肿瘤疾病的治疗中)的第一医学用途。
按照另一个方面，本发明涉及本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物用于治疗本文定义的癌症或肿瘤疾病的第二医学用途，优选涉及本文定义的本发明的核酸序列、包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物、包含其的药物组合物或疫苗、或包含其的试剂盒在制备用于预防、治疗和/或减轻本文定义的癌症或肿瘤疾病的药物中的用途。优选地，所述药物组合物或疫苗用于施用给有此需要的患者而用于这一目的。
优选地，本文提及的疾病选自癌症或肿瘤疾病，其优选地包括，例如，急性淋巴母细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)，急性髓细胞白血病(Acute myeloidleukemia)，肾上腺皮质的癌(Adrenocortical carcinoma)，艾滋相关的癌症(AIDS-related cancers)，艾滋相关的淋巴瘤(AIDS-related 1ymphoma)，肛门癌(Anal cancer)，阑尾癌(Appendix cancer)，星形细胞瘤(Astrocytoma)，基底细胞癌(Basal cellcarcinoma)，胆管癌(Bile duct cancer)，膀胱癌(Bladder cancer)，骨癌(Bone cancer)，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤(Osteosarcoma/Malignant fibrous histiocytoma)，脑干胶质瘤(Brainstem glioma)，脑瘤(Brain tumor)，小脑星形细胞瘤(cerebellarastrocytoma)，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(cerebral astrocytoma/malignantglioma)，室管膜瘤(ependymoma)，髓母细胞瘤(medulloblastoma)，幕上原始神经外胚瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumors)，视通路和下丘脑胶质瘤(visualpathway and hypothalamic glioma)，乳腺癌 (Breast cancer)，支气管腺癌/类癌(Bronchial adenomas/carcinoids)，伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)，儿童期类癌瘤(childhood Carcinoid tumor)，胃肠道类癌瘤(gastrointestinal Carcinoid tumor)，未知的原发性癌(Carcinoma of unknown primary)，原发性中枢神经系统淋巴瘤(primaryCentral nervous system lymphoma)，儿童期小脑星形细胞瘤(childhood Cerebellarastrocytoma)，儿童期大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(childhood Cerebral astrocytoma/Malignant glioma)，宫颈癌(Cervical cancer)，儿童期癌(Childhood cancers)，慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia)，慢性骨髓性白血病(Chronicmyelogenous leukemia)，慢性骨髓增殖性病症(Chronic myeloproliferativedisorders)，结肠癌(Colon Cancer)，皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)，结缔组织增生性小圆细胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)，子宫内膜癌(Endometrial cancer)，室管膜瘤(Ependymoma)，食管癌(Esophageal cancer)，尤因肿瘤家族的尤因肉瘤(Ewing′s sarcoma in the Ewing family of tumors)，儿童期颅外生殖细胞瘤(Childhood Extracranial germ cell tumor)，性腺外生殖细胞瘤(ExtragonadalGerm cell tumor)，肝外胆管癌 (Extrahepatic bile duct cancer)，眼内黑素瘤(Intraocular melanoma)，视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)，胆囊癌(Gallbladdercancer)，胃癌(Gastric (Stomach)cancer)，胃肠类癌瘤(Gastrointestinal CarcinoidTumor)，胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)，颅外、性腺外或卵巢生殖细胞瘤(extracranial，extragonadal，or ovarian Germ cell tumor)，妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational trophoblastic tumor)，脑干胶质瘤(Glioma ofthe brain stem)，儿童期大脑星形细胞瘤(Childhood Cerebral Astrocytoma)，儿童期视通路和下斤脑胶质瘤(Childhood Visual Pathway and Hypothalamic Glioma)，胃类癌(Gastric carcinoid)，毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)，头颈癌(Head and neck cancer)，心脏癌(Heartcancer)，肝细胞(肝)癌(Hepatocellular(liver)cancer)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)，咽下癌(Hypopharyngeal cancer)，儿童期下丘脑和视通路胶质瘤(childhoodHypothalamic and visual pathway glioma)，眼内黑素瘤 (Intraocular Melanoma)，胰岛细胞癌(Islet Cell Carcinoma，内分泌胰腺 (Endocrine Pancreas))，卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)，肾癌(Kidney cancer，肾细胞癌(renal cell cancer))，喉癌(Laryngeal Cancer)，白血病 (Leukemias)，急性淋巴母细胞白血病(acutelymphoblastic Leukemia)，急性髓细胞白血病(acute myeloid Leukemia)，慢性淋巴细胞性白血病 (chronic lymphocytic Leukemia)，慢性骨髓性白血病(chronic myelogenousLeukemia)，毛细胞白血病(hairy cell Leukemia)，唇和口腔癌(Lip and Oral CavityCancer)，脂肪肉瘤(Liposarcoma)，肝癌(Liver Cancer)，非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer)，小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)，淋巴瘤(Lymphomas)，艾滋相关的淋巴瘤(AIDS-related Lymphoma)，伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)，皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-Cell Lymphoma)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)，非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphomas)，原发性中枢神经系统淋巴瘤 (Primary Central NervousSystem Lymphoma)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症( Macroglobulinemia)，骨骼恶性纤维腺组织细胞瘤/骨肉瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone/Osteosarcoma)，儿童期髓母细胞瘤(Childhood Medulloblastoma)，黑素瘤(Melanoma)，眼内(眼)黑素瘤(Intraocular(Eve)Melanoma)，梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)，成仁恶性间皮瘤(Adult Malignant Mesothelioma)，儿童期间皮瘤(ChildhoodMesothelioma)，Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary，MouthCancer，儿童期多发性内分泌癌变综合征 (Childhood Multiple Endocrine NeoplasiaSyndrome)，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤(Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasm)，蕈样真菌病(Mycosis Fungoides)，骨髓增生异常综合症(Myelodysplastic Syndromes)，骨髓增生异常/骨髓增生性疾病(Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases)，慢性骨髓性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia)，成人急性髓细胞白血病(Adult AcuteMyeloid Leukemia)，儿童期急性髓细胞白血病(Childhood Acute Myeloid Leukemia)，多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，骨髓癌 (Cancer of the Bone-Marrow))，慢性骨髓增殖性病症(Chronic Myeloproliferative Disorders)，鼻腔和鼻旁窦癌(Nasal cavity andparanasal sinus cancer)，鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)，神经母细胞瘤(Neuroblastoma)，口癌(Oral Cancer)，口咽癌(Oropharyngeal cancer)，骨肉瘤/骨骼恶性纤维性组织细胞瘤(Osteosarcoma/malignant fibrous histiocytoma of bone)，卵巢癌(Ovarian cancer)，卵巢上皮癌(Ovarian epithelial cancer，表面上皮-间质瘤(Surface epithelial-stromal tumor))，卵巢生殖细胞瘤(Ovarian germ cell tumor)，卵巢低度恶性潜能的肿瘤 (Ovarian low malignant potential tumor)，胰腺癌(Pancreatic cancer)，胰岛细胞胰腺癌(islet cell Pancreatic cancer)，鼻旁窦和鼻腔癌(Paranasal sinus and nasal cavity cancer)，甲状旁腺癌(Parathyroid cancer)，阴茎癌(Penile cancer)，咽癌(Pharyngeal cancer)，嗜铬细胞瘤 (Pheochromocytoma)，松果体星形细胞瘤(Pineal astrocytoma)，松果体生殖细胞瘤(Pineal germinoma)，儿童期松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤(childhood Pineoblastoma and supratentorialprimitive neuroectodermal tumors)，垂体腺瘤(Pituitary adenoma)，浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤(Plasma cell neoplasia/Multiple myeloma)，胸膜肺母细胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)，原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary central nervoussystem lymphoma)，前列腺癌(Prostate cancer)，直肠癌(Rectal cancer)，肾细胞癌(Renal cell carcinoma，肾癌(kidney cancer))，肾盂输尿管肿瘤(Cancer of the Renalpelvis and ureter)，视网膜母细胞瘤 (Retinoblastoma)，儿童期横纹肌肉瘤(childhoodRhabdomyosarcoma)，唾液腺癌(Salivary gland cancer)，尤因肿瘤家族肉瘤(Sarcoma ofthe Ewing family oftumors)，卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)，软组织肉瘤(soft tissueSarcoma)，子宫肉瘤(uterine Sarcoma)，赛塞利综合征(Sézary syndrome)，皮肤癌(非黑素瘤)(Skin cancer(nonmelanoma))，皮肤癌(黑素瘤)(Skin cancer(melanoma))，梅克尔细胞皮肤癌(Merkel cell Skin carcinoma)，小肠癌(Small intestine cancer)，鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma)，隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(metastatic Squamousneck cancer with occult primary)，儿童期幕上原始神经外胚瘤(childhoodSupratentorial primitive neuroectodermal tumor)，睾丸癌(Testicular cancer)，喉癌(Throat cancer)，儿童期胸腺瘤(childhood Thymoma)，胸腺瘤和胸腺癌(Thymoma andThymic carcinoma)，甲状腺癌(Thyroid cancer)，儿童期甲状腺癌(childhood Thyroidcancer)，肾盂和输尿管移行细胞癌 (Transitional cell cancer of the renal pelvisand ureter)，妊娠滋养细胞肿瘤 (gestational Trophoblastic tumor)，尿道癌(Urethral cancer)，子宫内膜子宫癌(endometrial Uterine cancer)，子宫肉瘤(Uterinesarcoma)，阴道癌 (Vaginal cancer)，儿童期视通路和下丘脑胶质瘤(childhood Visualpathway and hypothalamic glioma)，外阴癌(Vulvar cancer)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)，和儿童期肾母细胞瘤(childhood Wilms tumor，肾癌(kidney cancer))。
在进一步优选的方面，本文定义的本发明的核酸序列或包含多种本文定义的本发明的核酸序列的本发明的组合物可以用于制备药物组合物或疫苗，特别是用于本文定义的目的。
本发明的药物组合物或疫苗可以进一步用于治疗疾病或病症，优选本文定义的癌症或肿瘤疾病。
按照最后的方面，本发明还提供试剂盒，特别是部件的试剂盒。所述试剂盒，特别是部件的试剂盒，典型地包含单独的至少一种本文定义的本发明的核酸序列、包含本发明的核酸序列的本发明的药物组合物或疫苗或与本文定义的其他组分组合作为组分。所述至少一种本文定义的本发明的核酸序列任选地与本文定义的其他组分组合，其中所述至少一种本发明的核酸与包含一种或多种其他组分的试剂盒的至少一个其他部分分开提供 (试剂盒的第一部分)。例如，本发明的药物组合物和/或本发明的疫苗可以存在于试剂盒的不同部分中。例如，一个实例，试剂盒的至少一个部分可以包含至少一种本文定义的本发明的核酸序列，并且所述试剂盒的至少一个其他部分包含至少一种本文定义的其他组分，例如，所述试剂盒的至少一个其他部分可以包含至少一种药物组合物或疫苗或其部分，例如，所述试剂盒的至少一个部分可以包含本文定义的本发明的核酸序列，所述试剂盒的至少一个其他部分包括至少一种本文定义的其他组分，所述试剂盒的至少一个其他部分包括本发明的药物组合物或疫苗中的至少一种组分或者包括作为整体的本发明的药物组合或疫苗，并且所述试剂盒的至少一个其他部分，例如，包含至少一种药物载体或赋形剂等。如果所述试剂盒或部件的试剂盒包含多种本发明的核酸序列，所述试剂盒的一个组件可以包含仅一种、几种或全部该试剂盒所包含的本发明的核酸序列。在备选的实施方案中，每一种本发明的核酸序列可以包含在试剂盒的不同/分开的组件中，以使每个组件形成所述试剂盒的一部分。此外，多于一种核酸可以包含在作为试剂盒的一部分的第一组件中，而一种或多种其他(第二、第三等)组件(提供试剂盒的一个或多个其他部分)可以包含一种或多于一种本发明的核酸，其可以与第一组件相同或部分相同或不同。所述试剂盒或部件的试剂盒还可以包含技术说明书，其具有关于本发明的核酸序列、本发明的药物组合物或本发明的疫苗的施用和剂量的信息或关于任意其组件或部分(例如，如果所述试剂盒制备为部件的试剂盒)的信息。
综上所述，本发明提供包含或编码下述的核酸序列：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种类型的核酸序列的组合物，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞-特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；并且其中每种核酸序列编码不同的肽或蛋白。
所述组合物可以进一步包含本文定义的药用载体和/或药用佐剂。所述组合物可以用作疫苗用于治疗与癌症或肿瘤相关的疾病。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供包含至少两种、优选两种以上、更优选多种核酸序列(典型地意指多于1、2、3、4、5、6种或多于10种核酸，例如2-10种，优选2-5种核酸)的组合物，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞-特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；并且其中每种核酸序列编码不同的肽或蛋白。
所述组合物可以进一步包含本文定义的药用载体和/或药用佐剂。所述组合物可以用作疫苗用于治疗与癌症或肿瘤相关的疾病。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供包含至少两种、优选两种以上、更优选多种核酸序列(典型地意指多于1、2、3、4、5、6种或多于10种核酸，例如2-10种，优选2-5种核酸)的组合物，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞-特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；并且其中每种核酸序列编码不同的肽或蛋白；并且优选地，其中每种类型的核酸序列编码不同的肽或蛋白，优选不同的肿瘤抗原。
所述组合物可以进一步包含本文定义的药用载体和/或药用佐剂。所述组合物可以用作疫苗用于治疗与癌症或肿瘤相关的疾病。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供包含至少两种、优选两种以上、更优选多种核酸序列(典型地意指多于1、2、3、4、5、6种或多于10种核酸，例如2-10种，优选2-5种核酸)的组合物，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞-特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；并且其中每种核酸序列编码不同的肽或蛋白；并且优选地，其中每种类型的核酸序列编码不同的肽或蛋白，优选不同的肿瘤抗原，更优选地，其中每种类型所包含的核酸序列编码PSA，PSMA，PSCA， STEAP-1，NY-ESO-1，5T4，存活蛋白，MAGE-C1或MAGE-C2。
所述组合物可以进一步包含本文定义的药用载体和/或药用佐剂。所述组合物可以用作疫苗用于治疗与癌症或肿瘤相关的疾病。
在一些实施方案中，可以优选的是，假定所述组合物仅包含一种类型的核酸序列，则所述核酸序列不编码NY-ESO1，条件是所述组合物仅包含一种类型的核酸序列。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供包含至少两种核酸序列的组合物，所述核酸序列包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一种组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物，优选地，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞-特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；并且其中每种核酸序列编码不同的肽或蛋白；并且其中所述核酸序列中的至少一种编码5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIP HPG1，α-5-β-1-整联蛋白，α-5-β-6-整联蛋白，α-辅肌动蛋白-4/m，α-甲基酰基-辅酶A消旋酶，ART-4，ARTC1/m，B7H4，BAGE-1，BCL-2，bcr/abl，β- 连环蛋白/m，BING-4，BRCA1/m，BRCA2/m，CA 15-3/CA 27-29，CA 19-9，CA72-4，CA125，肌钙网蛋白，CAMEL，CASP-8/m，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L，CD19，CD20，CD22，CD25，CDE30，CD33，CD4，CD52， CD55，CD56，CD80，CDC27/m，CDK4/m，CDKN2A/m，CEA，CLCA2， CML28，CML66，COA-1/m，类共激活蛋白(coactosin-like protein)，胶原XXIII，COX-2，CT-9/BRD6，Cten，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白 D1，cyP-B，CYPB1，DAM-10，DAM-6，DEK-CAN，EFTUD2/m，EGFR， ELF2/m，EMMPRIN，EpCam，EphA2，EphA3，ErbB3，ETV6-AML1，EZH2，FGF-5，FN，Frau-1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4， GAGE-5，GAGE-6，GAGE7b，GAGE-8，GDEP，GnT-V，gp100，GPC3， GPNMB/m，HAGE，HAST-2，hepsin，Her2/neu，HERV-K-MEL，HLA-A*0201-R17I，HLA-A11/m，HLA-A2/m，HNE，同源异型框NKX3.1， HOM-TES-14/SCP-1，HOM-TES-85，HPV-E6，HPV-E7，HSP70-2M，HST-2， hTERT，iCE，IGF-1R，IL-13Ra2，IL-2R，IL-5，不成熟的层粘连蛋白受体，激肽释放酶-2，激肽释放酶-4，Ki67，KIAA0205，KIAA0205/m，KK-LC-1，K-Ras/m，LAGE-A1，LDLR-FUT，MAGE-A1，MAGE-A2， MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A12， MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3， MAGE-D1，MAGE-D2，MAGE-D4，MAGE-E1，MAGE-E2，MAGE-F1， MAGE-H1，MAGEL2，乳腺珠蛋白A，MART-1/melan-A，MART-2，MART-2/m，基质蛋白22，MC1R，M-CSF，ME1/m，间皮素(mesothelin)， MG50/PXDN，MMP11，MN/CA IX-抗原，MRP-3，MUC-1，MUC-2， MUM-1/m，MUM-2/m，MUM-3/m，I/m类肌球蛋白，NA88-A，N-乙酰葡糖胺转移酶-V，Neo-PAP，Neo-PAP/m，NFYC/m，NGEP，NMP22， NPM/ALK，N-Ras/m，NSE，NY-ESO-B，OA1，OFA-iLRP，OGT，OGT/m， OS-9，OS-9/m，骨钙素，骨桥蛋白，p15，p190m型bcr-abl，p53，p53/m， PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PAP，PART-1，PATE，PDEF，Pim-1-激酶，Pin-1， Pml/PARα，POTE，PRAME，PRDX5/m，prostein，蛋白酶-3，PSA，PSCA， PSGR，PSM，PSMA，PTPRK/m，RAGE-1，RBAF600/m，RHAMM/CD168，RU1，RU2，S-100，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SCC，SIRT2/m， Sp17，SSX-1，SSX-2/HOM-MEL-40，SSX-4，STAMP-1，STEAP-1，存活蛋白，存活蛋白-2B，SYT-SSX-1，SYT-SSX-2，TA-90，TAG-72，TARP， TEL-AML1，TGFβ，TGFβRII，TGM-4，TPI/m，TRAG-3，TRG，TRP-1， TRP-2/6b，TRP/INT2，TRP-p8，酪氨酸酶，UPA，VEGFR1， VEGFR-2/FLK-1，WT1以及淋巴样血细胞的免疫球蛋白独特型或淋巴样血细胞的T细胞受体独特型，或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；优选存活蛋白或其同源物，来自MAGE-家族的抗原或其结合配偶体或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物。
所述组合物可以进一步包含本文定义的药用载体和/或药用佐剂。所述组合物可以用作疫苗用于治疗与癌症或肿瘤相关的疾病。
在本发明中，如果没有另外指明，则各备选方案和各实施方案的不同的特征可以彼此组合。此外，如果没有特别提及，术语“包含”不应该解释为意指“由……组成”。然而，在本发明的情形中，在适用时，术语“包含”可以被术语“由……组成”替代。
附图说明
下述附图意欲进一步举例说明本发明，并且不应该解释为将本发明限制于此。
图1：显示由后生动物和原生动物茎环序列产生的组蛋白茎环共有序列(由DávilaLópez，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约，N.Y.)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308报道)。比对来自后生动物和原生动物的4001条组蛋白茎环序列，并且对该茎环序列中的每个位置显示存在的核苷酸的量。使用单字母核苷酸密码给出表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的所产生的共有序列。除了共有序列之外，显示表示在所分析的序列中存在的至少99％，95％和90％的核苷酸的序列。
图2：显示由原生动物茎环序列产生的组蛋白茎环共有序列的(由 Dávila López，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约，N.Y.)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308报道)。比对来自原生动物的131条组蛋白茎环序列，并且对该茎环序列中的每个位置显示存在的核苷酸的量。使用单字母核苷酸密码给出表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的所产生的共有序列。除了共有序列之外，显示表示在所分析的序列中存在的至少99％，95％和90％的核苷酸的序列。
图3：显示由后生动物茎环序列产生的组蛋白茎环共有序列(由 Dávila López，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约， N.Y.)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308报道)。比对来自后生动物的3870条组蛋白茎环序列，并且对该茎环序列中的每个位置显示存在的核苷酸的量。使用单字母核苷酸密码给出表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的所产生的共有序列。除了共有序列之外，显示表示在所分析的序列中存在的至少99％，95％和90％的核苷酸的序列。
图4：显示由脊椎动物茎环序列产生的组蛋白茎环共有序列(由 Dávila López，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约， N.Y.)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308报道)。比对来自脊椎动物的1333条组蛋白茎环序列，并且对该茎环序列中的每个位置显示存在的核苷酸的量。使用单字母核苷酸密码给出表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的所产生的共有序列。除了共有序列之外，显示表示在所分析的序列中存在的至少99％，95％和90％的核苷酸的序列。
图5：显示由人(智人(Homo sapiens))茎环序列产生的组蛋白茎环共有序列(由Dávila López，M.，&Samuelsson，T.(2008)，RNA(纽约，N.Y)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308报道)。比对来自人的84条组蛋白茎环序列，并且对该茎环序列中的每个位置显示存在的核苷酸的量。使用单字母核苷酸密码给出表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的所产生的共有序列。除了共有序列之外，显示表示在所分析的序列中存在的至少99％，95％和90％的核苷酸的序列。
图6至21：显示来自体外转录的mRNAs。
给出通过体外转录得到的mRNAs的命名和序列。使用下述缩写：
ppLuc(GC)：编码北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶的富含GC的mRNA序列
ag：α珠蛋白基因的3’非翻译区(UTR)
A64：具有64个腺苷酸的聚腺苷酸-序列
A120：具有120个腺苷酸的聚腺苷酸-序列
组蛋白SL：组蛋白茎环
aCPSL：已经针对其αCP-2KL蛋白的特异性结合从文库中选择的茎环
PolioCL：来自脊髓灰质炎病毒(Polio virus)基因组 RNA的5’三叶草形
G30：具有30个鸟苷酸的聚(G)序列
U30：具有30个尿苷酸的聚(U)序列
SL：非特异性/人工茎环
N32：32个核苷酸的非特异性序列
NY-ESO-1(G/C)：编码人肿瘤抗原NY-ESO-1的富含GC的 mRNA序列
存活蛋白(G/C)：编码人肿瘤抗原存活蛋白的富含GC的 mRNA序列
MAGE-C1(G/C)：编码人肿瘤抗原MAGE-C1的富含GC的 mRNA序列
在所述序列中，突出显示下述元件：
编码区(ORF)(大写字母)，ag(粗体)，组蛋白SL(下划线)，所检测的其他独特的序列(斜体)。
图6：显示ppLuc(GC)-ag(SEQID NO：43)的mRNA序列。通过在紧接在α-珠蛋白3’-UTR(ag)后的限制性位点使原始载体线性化，获得缺少聚腺苷酸序列的mRNA。
图7：显示ppLuc(GC)-ag-A64(SEQ ID NO：44)的mRNA序列。通过在紧接在A64聚腺苷酸-序列后的限制性位点使原始载体线性化，获得末端具有A64聚腺苷酸序列的mRNA。
图8：显示ppLuc(GC)-ag-组蛋白SL(SEQ ID NO：45)的mRNA序列。
A64聚腺苷酸序列被组蛋白SL替代。用于该实例的组蛋白茎环序列获自Cakmakci等人.(2008).Molecular and Cellular Biologv(分子和细胞生物学)，28(3)，1182-1194。
图9：显示ppLuc(GC)-ag-A64-组蛋白SL(SEQ ID NO：46)的 mRNA序列。
组蛋白SL附加在A64聚腺苷酸的3’。
图10：显示ppLuc(GC)-ag-A120(SEQ ID NO：47)的mRNA序列。 A64聚腺苷酸序列被A120聚腺苷酸序列替代。
图11：显示ppLuc(GC)-ag-A64-ag(SEO ID NO：48)的mRNA序列。第二个α-珠蛋白3’-UTR附加在A64聚腺苷酸的3’。
图12：显示ppLuc(GC)-ag-A64-aCPSL(SEO ID NO：49)的mRNA 序列。
茎环附加在A64聚腺苷酸的3’。茎环已经针对其αCP-2KL蛋白特异性结合从文库中选择(Thisted等人.，(2001)，The Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)，276(20)， 17484-17496)。αCP-2KL是αCP-2的同种型，其是最强表达的αCP蛋白(α-珠蛋白mRNA聚(C)结合蛋白)(Makeyev等人.， (2000)，Genomics(基因组)，67(3)，301-316)，一组RNA结合蛋白，其结合α-珠蛋白3’-UTR(Chkheidze等人.，(1999)， Molecular andCellular Biology(分子和细胞生物学)，19(7)， 4572-4581)。
图13：显示ppLuc(GC)-ag-A64-PolioCL(SEQ ID NO：50)的 mRNA序列。
来自脊髓灰质炎病毒基因组RNA的5’三叶草形附加在A64聚腺苷酸的3’。
图14：显示ppLuc(GC)-ag-A64-G30(SEQ ID NO：51)的mRNA序列
30个鸟苷酸的片段附加在A64聚腺苷酸的3’。
图15：显示ppLuc(GC)-ag-A64-U30(SEQ ID NO：52)的mRNA序列
30个尿苷酸的片段附加在A64聚腺苷酸的3’。
图16：显示ppLuc(GC)-ag-A64-SL(SEQ ID NO：53)的mRNA序列茎环附加在A64聚腺苷酸的3’。茎的上部和环取自(Babendure 等人.，(2006)，RNA(纽约，N.Y)，12(5)，851-861)。该茎环由长为17个碱基对的富含CG的茎和长为6个碱基的环组成。图17：显示ppLuc (GC)-ag-A64-N32(SEQ ID NO：54)
通过在备选的限制性位点将原始载体线性化，获得在聚腺苷酸后有32个另外的核苷酸的mRNA。
图18：显示NY-ESO-1(GC)-ag-A64-C30(SEQ ID NO：55)的 mRNA序列
图19：显示NY-ESO-1(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL(SEO ID NO： 56)的mRNA序列
图20：显示存活蛋白(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO： 57)的mRNA序列
图21：显示MAGE-C1(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO：58)的mRNA序列
图22：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合以协同方式增加mRNA的蛋白表达。
检验聚腺苷酸序列、组蛋白SL以及聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对mRNA的荧光素酶表达的作用。因此，将不同的 mRNAs电穿孔至HeLa细胞中。在转染后6、24和48小时测量荧光素酶水平。不具有聚腺苷酸序列和组蛋白SL的mRNA 有很少的荧光素酶表达。聚腺苷酸序列或组蛋白SL增加荧光素酶水平。然而，引人注意的是，聚腺苷酸和组蛋白SL的组合进一步强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件所观察到的水平的数倍，因此它们是协同作用的。数据绘制为一式三份转染的平均值RLU±SD(相对光单位±标准偏差)。具体的RLU总结在实施例14.2中。
图23：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加mRNA的蛋白表达与其顺序无关。
检验聚腺苷酸序列、组蛋白SL、聚腺苷酸与组蛋白SL的组合以及它们的顺序对mRNA的荧光素酶表达的作用。因此，将不同的mRNAs脂质转染至HeLa细胞中。在转染开始后6、 24和48小时测量荧光素酶水平。A64聚腺苷酸序列或组蛋白 SL都产生可比较的荧光素酶水平。将聚腺苷酸序列的长度由A64增加至A120或增加至A300适度地增加荧光素酶水平。相比之下，与延长聚腺苷酸序列相比，聚腺苷酸与组蛋白SL 的组合增加荧光素酶水平要多得多。由于其增加荧光素酶水平高于用单独的每种元件所观察到的水平的数倍，因此，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合协同作用。使用A64-组蛋白SL或组蛋白SL-A250mRNA观察到聚腺苷酸与组蛋白SL的组合的协同作用，这与聚腺苷酸和组蛋白SL的顺序无关，并且与聚腺苷酸的长度无关。数据绘制为一式三份转染的平均值 RLU±SD。具体的RLU总结在实施例14.3中。
图24：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对蛋白表达的增加是特异性的。
检验聚腺苷酸与组蛋白SL的组合或聚腺苷酸与备选序列的组合对mRNA的荧光素酶表达的作用。因此，将不同的mRNAs 电穿孔至HeLa细胞中。在转染后6、24和48小时测量荧光素酶水平。聚腺苷酸序列或组蛋白SL都产生可比较的荧光素酶水平。聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件所观察到的水平的数倍，因此，组合是协同作用的。相比之下，与仅含有聚腺苷酸序列的mRNA 相比，聚腺苷酸与其他序列中的任一种的组合对荧光素酶水平没有影响。因此，将聚腺苷酸与组蛋白SL组合特异性并且协同地起作用。数据绘制为一式三份转染的平均值RLU±SD。具体的RLU总结在实施例14.4中。
图25：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在体内以协同方式增加 mRNA的蛋白表达。
检验聚腺苷酸序列、组蛋白SL和聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在体内对mRNA的荧光素酶表达的作用。因此，将不同的 mRNAs皮内注射到小鼠中。在注射后16小时将小鼠处死，并且测量注射部位的荧光素酶水平。荧光素酶由具有组蛋白SL或聚腺苷酸序列的mRNA表达。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件所观察到的水平的数倍，因此，组合是协同作用的。数据绘制为平均值RLU±SEM(相对光单位±平均值的标准误差)。具体的RLU总结在实施例14.5中。
图26：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加mRNA的NY-ESO-1 蛋白表达。
检验聚腺苷酸序列和聚腺苷酸与蛋白SL的组合对mRNA的 NY-ESO-1表达的作用。因此，将不同的mRNAs电穿孔至HeLa 细胞中。在转染后24小时通过流式细胞术测量NY-ESO-1水平。NY-ESO-1由仅具有聚腺苷酸序列的mRNA表达。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加 NY-ESO-1水平，高于仅用聚腺苷酸序列所观察到的水平的数倍。数据作为针对荧光强度的计数绘图。平均荧光强度(MFI) 总结在实施例14.6中。
图27：显示聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加由mRNA接种激发的抗体的水平。
检验聚腺苷酸序列和聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对由mRNA 接种激发的抗NY-ESO-1抗体的诱导的作用。因此，将 C57BL/6小鼠皮内接种与鱼精蛋白复合的不同的mRNAs。使用连续稀释的血清，通过ELISA分析接种的和对照小鼠中 NY-ESO-1-特异性抗体的水平。抗NY-ESO-1IgG2a[b]由仅具有聚腺苷酸序列的mRNA诱导。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加抗NY-ESO-1IgG2a[b]水平，高于仅用聚腺苷酸序列观察到的水平数倍。数据作为平均终点滴度绘图。平均终点滴度总结在实施例14.7中。
实施例：
下述实施例意欲进一步举例说明本发明，并且不应该解释为将本发明限制于此。
1.产生组蛋白-茎环共有序列
在实验之前，基于后生动物和原生动物组蛋白茎环序列确定组蛋白茎环共有序列。序列取自由Lopez等人.(Dávila López，M.，&Samuelsson， T.(2008)，RNA(纽约，N.Y.)，14(1)，1-10.doi：10.1261/rna.782308)提供的附录，其通过检索基因组序列和表达的序列标签而鉴定了大量的天然组蛋白茎环序列。首先，将所有来自后生动物和原生动物的序列(4001条序列)、或所有来自原生动物(131条序列)或备选地来自后生动物(3870 条序列)或来自脊椎动物(1333条序列)或来自人(84条序列)的序列分组并且比对。然后，为每个位置确定存在的核苷酸的量。基于这样得到的表，产生表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的5组不同的序列的共有序列。另外，也得到更加限制性的共有序列，其愈加强调保守的核苷酸。
2.制备DNA-模板
构建用于体外转录的载体，其包含T7启动子，之后接着富含GC的编码北美萤火虫荧光素酶的序列(ppLuc(GC))，α-珠蛋白的3’非翻译区 (UTR)的中心部分(ag)和聚腺苷酸序列。聚腺苷酸序列紧接着限制性位点，该限制性位点用于在体外转录之前将载体线性化，从而获得末端为A64 聚腺苷酸序列的mRNA。因此，通过体外转录由该载体获得的mRNA命名为“ppLuc(GC)-ag-A64”。
在体外转录之前在备选的限制性位点将该载体线性化允许获得延伸带有另外的3’A64核苷酸或缺少A64的mRNA。另外，原始载体被修饰以包含备用序列。总之，通过体外转录由这些载体获得下述mRNAs(图 6-17中给出了mRNA序列)：
此外，相应地按照上述制备编码肿瘤抗原NY-ESO-1、存活蛋白和 MAGE-C1的DNA质粒序列。
总之，通过体外转录由这些载体获得下述mRNAs(图18-21中给出了mRNA序列)：
NY-ESO-1(GC)-ag-A62-C30(SEQ ID NO：55)
NY-ESO-1(GC)-ag-A62-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO：56)
存活蛋白(GC)-ag-A62-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO：57)
MAGE-C1(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL(SEQ ID NO：58)
3.体外转录
将实施例2所述的DNA模板线性化并且使用T7聚合酶在体外转录。然后，通过DNA酶处理消化该DNA模板。通过向转录反应中加入过量的N7-甲基-鸟苷-5′-三磷酸-5′-鸟苷，使得所有的mRNA-转录物包含 5′-CAP结构。纯化这样得到的mRNA并且重悬在水中。
4.mRNA的酶促腺苷酸化
将两种mRNAs酶促腺苷酸化：
ppLuc(GC)-ag-A64和ppLuc(GC)-ag-组蛋白SL。
为了这一目的，按照供应商的使用说明，将RNA与大肠杆菌聚腺苷酸-聚合酶和ATP(聚腺苷酸聚合酶定制试剂盒(Poly(A)Polymerase Tailing Kit)，Epicentre，Madison，USA)温育。纯化具有延伸的聚腺苷酸序列的mRNA并且重悬在水中。通过琼脂糖凝胶电泳确定聚腺苷酸序列的长度。起始mRNAs延伸大约250个腺苷酸，得到的mRNAs分别命名为：
ppLuc(GC)-ag-A300和ppLuc(GC)-ag-组蛋白SL-A250。
5.通过mRNA电穿孔进行荧光素酶表达
将HeLa细胞胰蛋白酶化处理并用opti-MEM洗涤。将每份200μl opti-MEM中的1x105个细胞用0.5μg ppLuc-编码mRNA电穿孔。单独电穿孔不编码ppLuc的mRNA作为对照。将电穿孔的细胞接种在24孔平板的1ml RPMI 1640培养基中。在转染后6、24或48小时，吸出培养基，并将细胞在200μl裂解缓冲液(25mM Tris，pH 7.5(HCl)，2mM EDTA， 10％甘油，1％Triton X-100，2mM DTT，1mM PMSF)中裂解。在测量 ppLuc活性之前将裂解物保存在-20℃。
6.通过mRNA脂质转染进行荧光素酶表达
将HeLa细胞以每孔2x104个细胞的密度接种在96孔平板中。次日，将细胞在opti-MEM中洗涤，然后在150μl opti-MEM中用0.25μg Lipofectin-复合的ppLuc-编码mRNA转染。单独脂质转染不编码ppLuc 的mRNA作为对照。在一些孔中，在转染开始后6小时，吸出opti-MEM，并且在200μl裂解缓冲液中裂解细胞。在其余的孔中，此时将opti-MEM 更换为RPMI1640培养基。在这些孔中，在转染开始后24或48小时，吸出培养基，并且在200μl裂解缓冲液中裂解细胞。在测量ppLuc活性之前将裂解物保存在-20℃。
7.荧光素酶测量
使用50μl裂解物和200μl荧光素缓冲液(25mM甘氨酰甘氨酸，pH 7.8(NaOH)，15mMMgSO4，2mM ATP，75μM荧光素)在BioTek SynergyHT平板读数仪中在5秒测量时间内以相对光单位(RLU)测量 ppLuc活性。通过从总RLU中减去对照RNA的RLU而计算具体的RLU。 8.通过皮内mRNA注射进行荧光素酶表达(体内荧光素酶表达)
小鼠用甲苯噻嗪(Rompun)和Ketavet的混合物麻醉。皮内注射每种ppLuc-编码mRNA(每次注射体积为50μl的0.5μg mRNA)。单独注射不编码ppLuc的mRNA作为对照。注射后16小时，将小鼠处死，并且收集组织。将组织样品在液氮中骤然冷冻，并且在800μl裂解缓冲液(25 mM Tris，pH 7.5(HCl)，2mM EDTA，10％甘油，1％Triton X-100，2mM DTT，1mM PMSF)中在组织层(Qiagen)中裂解。随后，将样品在4℃以 13500rpm离心10分钟。在测量ppLuc活性之前将裂解物保存在-80℃(参见7.荧光素酶测量)。
9.通过mRNA电穿孔进行NY-ESO-1表达
将HeLa细胞胰蛋白酶化处理并用opti-MEM洗涤。将每份200μl opti-MEM中的2x105个细胞用10μgNY-ESO-1-编码mRNA电穿孔。合并三次电穿孔的细胞并且接种在6-孔平板的2mlRPMI 1640培养基中。转染后24小时，收集细胞并且转移到96孔V底平板(每种mRNA2个孔)中。将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并且每孔用200μl Cytofix/Cytoperm(Becton Dickinson(BD))渗透化处理。15分钟后，用 PermWash(BD)洗涤细胞。然后，将细胞用小鼠抗-NY-ESO-1 IgGl或独特型对照(20μg/ml)在室温温育1小时。再用PermWash洗涤细胞两次。接着，将细胞用Alexa-647偶联的山羊-抗-小鼠IgG的1∶500稀释液在4℃温育1小时。最后，用PermWash洗涤细胞两次。将细胞重悬在200μl 缓冲液(PBS，2％FCS，2mM EDTA，0.01％叠氮化钠)中。通过流式细胞术以平均荧光强度(MFI)定量NY-ESO-1表达。
10.通过用mRNA接种诱导抗NY-ESO-1抗体
C57BL/6小鼠皮内接种与鱼精蛋白复合的NY-ESO-1-编码mRNA(14 天内接种5次)。对照小鼠用缓冲液处理。在最后一次接种后8天通过ELISA分析接种的和对照小鼠中的NY-ESO-1-特异性抗体的水平：将96 孔ELISA平板(Nunc)每孔用100μl的10μg/ml重组NY-ESO-1蛋白在4℃包被16小时。将平板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温-20)洗涤两次。为了阻断非特异性结合，然后将平板在37℃用封闭缓冲液(PBS，0.05％吐温-20， 1％BSA)温育2小时。封闭后，每孔加入100μl连续稀释的小鼠血清，并且在室温温育4小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤平板三次。接着，允许100μl/孔在封闭缓冲液中1∶600稀释的生物素酰化的大鼠抗小鼠IgG2a[b] 检测抗体(BD Biosciences)在室温结合1小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板三次，接着在室温用100μl/孔辣根过氧化物酶-偶联的链霉抗生物素蛋白温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤四次后，每孔加入100μl 3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺(Thermo Scientific)。当产生颜色变化时，每孔加入100μl 20％硫酸。在405nm测量吸光度。
11.通过用mRNA接种诱导抗存活蛋白抗体
C57BL/6小鼠皮内接种与鱼精蛋白复合的存活蛋白-编码mRNA(14 天内接种5次)。对照小鼠用缓冲液处理。在最后一次接种后8天通过 ELISA分析接种的和对照小鼠中的存活蛋白-特异性抗体的水平：将96 孔ELISA平板(Nunc)每孔用100μl的10μg/ml重组存活蛋白在4℃包被 16小时。将平板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温-20)洗涤两次。为了阻断非特异性结合，然后将平板在37℃用封闭缓冲液(PBS，0.05％吐温-20，1％ BSA)温育2小时。封闭后，每孔加入100μl连续稀释的小鼠血清，并且在室温温育4小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤平板三次。接着，允许100 μl/孔在封闭缓冲液中1∶600稀释的生物素酰化的大鼠抗小鼠IgG2a[b]检测抗体(BD Biosciences)在室温结合1小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板三次，接着在室温用100μl/孔辣根过氧化物酶-偶联的链霉抗生物素蛋白温育30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤四次后，每孔加入100μl 3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺 (Thermo Scientific)。当产生颜色变化时，每孔加入100μl 20％硫酸。在 405nm测量吸光度。
12.通过用mRNA接种诱导抗MAGE-C1抗体
C57BL/6小鼠皮内接种与鱼精蛋白复合的MAGE-C1-编码mRNA(14 天内接种5次)。对照小鼠用缓冲液处理。在最后一次接种后8天通过 ELISA分析接种的和对照小鼠中的MAGE-C1-特异性抗体的水平：将96 孔ELISA平板(Nunc)每孔用100μl的10μg/ml重组MAGE-C1蛋白在4℃包被16小时。将平板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温-20)洗涤两次。为了阻断非特异性结合，然后将平板在37℃用封闭缓冲液(PBS，0.05％吐温-20， 1％BSA)温育2小时。封闭后，每孔加入100μl连续稀释的小鼠血清，并且在室温温育4小时。然后，用洗涤缓冲液洗涤平板三次。接着，允许 100μl/孔在封闭缓冲液中1∶600稀释的生物素酰化的大鼠抗小鼠IgG2a[b] 检测抗体(BD Biosciences)在室温结合1小时。再用洗涤缓冲液洗涤平板三次，接着在室温用100μl/孔辣根过氧化物酶-偶联的链霉抗生物素蛋白温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤四次后，每孔加入100μl 3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺(Thermo Scientific)。当产生颜色变化时，每孔加入100μl 20％硫酸。在405nm测量吸光度。
13.通过ELISPOT检测抗原-特异性细胞免疫应答(T细胞免疫应答)：
将C57BL/6小鼠皮内接种与鱼精蛋白复合的MAGE-C1编码mRNA (14天内接种5次)。对照小鼠用缓冲液处理。最后一次接种后1周将小鼠处死，取出脾脏并且分离脾细胞。在来自上述抗原(肽文库)的肽的存在下，将脾细胞再刺激7天，或者与由用编码所述抗原的mRNA电穿孔的首次用于实验的同源小鼠的骨髓细胞产生的树突细胞共同温育。为了确定抗原-特异性细胞免疫应答，在再刺激后测量INFγ分泌。为了检测INFγ，将包被多筛选平板(coat multiscreen plate，Millipore)用包含针对INFγ的抗体(BD Pharmingen，Heidelberg，德国)的包被缓冲液0.1M碳酸盐 -碳酸氢盐缓冲液pH 9.6(10.59g/l Na2CO3，8.4g/l NaHCO3)温育过夜。在平板中，刺激剂和效应细胞以1：20的比率一起温育24小时。将平板用 1×PBS洗涤，并且用生物素-偶联的二级抗体温育。在用1×PBS/0.05％吐温-20洗涤后，向平板中加入底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四唑液体底物系统，购自SigmaAldrich，Taufkirchen，德国)，并且可以视觉检测该底物的转化。
14.结果
14.1组蛋白茎环序列：
为了表征组蛋白茎环序列，将来自后生动物和原生动物(4001条序列)、或来自原生动物(131条序列)或备选地来自后生动物(3870条序列)或来自脊椎动物(1333条序列)或来自人(84条序列)的序列分组并且比对。然后，对于每个位置确定存在的核苷酸的量。基于这样得到的表，产生表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的5组不同的序列的共有序列。在组合的后生动物和原生动物的共有序列中，有3个核苷酸是保守的，即，环中的T/U和茎中的G和C(形成碱基对)。在结构上，典型地形成6个碱基对的茎和4个核苷酸的环。然而，背离的结构是常见的：在84条人组蛋白茎环中，有两条包含仅5个核苷酸的茎(包含4个碱基对和一个错配)。另一个人组蛋白茎环包含仅5个碱基对的茎。另外四条人组蛋白茎环包含6个核苷酸长的茎，但是分别在三个不同的位置包含一个错配。此外，四条人组蛋白茎环分别在两个不同位置包含一个摆动碱基对。由于已经在盘基网柄菌(D，discoideum)中鉴定了5个核苷酸的环，因此，关于所述环，不严格需要4个核苷酸的长度。
除了表示在所分析的序列中存在的所有核苷酸的共有序列之外，还获得了更加限制性的共有序列，其愈加强调保守核苷酸。总之，获得下述序列：
(Cons)：表示所有存在的核苷酸
(99％)：表示所有存在的核苷酸中的至少99％
(95％)：表示所有存在的核苷酸中的至少95％
(90％)：表示所有存在的核苷酸中的至少90％
组蛋白茎环序列分析的结构总结在下表1-5中(也参见图1-5)：
表1：后生动物和原生动物组蛋白茎环共有序列：(基于4001条后生动物和原生动物组蛋白茎环序列的比对)(还参见图1)
表2：原生动物组蛋白茎环共有序列：(基于131条原生动物组蛋白茎环序列的比对)(还参见图2)
表3：后生动物组蛋白茎环共有序列：(基于3870条(包括1333条脊椎动物序列)后生动物组蛋白茎环序列的比对)(还参见图3)
表4：脊椎动物组蛋白茎环共有序列：(基于1333条脊椎动物组蛋白茎环序列的比对)(还参见图4)
表5：智人组蛋白茎环共有序列：(基于84条人组蛋白茎环序列的比对)(还参见图5)
其中所用的缩写定义如下：
14.2聚腺苷酸与组蛋白SL的组合以协同方式增加mRNA的蛋白表达。
为了研究聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对mRNA的蛋白表达的作用，合成了在α-珠蛋白3’-UTR的3’具有不同的序列的mRNAs：仅以3’-UTR 的3’结尾的mRNAs，由此缺少聚腺苷酸序列和组蛋白SL，或者包含A64 聚腺苷酸序列或相反包含组蛋白SL，或者在3’-UTR的3’包含A64聚腺苷酸和组蛋白SL二者。将荧光素酶编码mRNAs或对照mRNA电穿孔至 HeLa细胞中。在转染后6、24和48小时测量荧光素酶水平(见下表6 和图22)。
表6：
由不具有聚腺苷酸序列和组蛋白SL的mRNA仅有少量荧光素酶表达。聚腺苷酸序列或组蛋白SL增加荧光素酶水平至相似的程度。每种 mRNA产生比缺少聚腺苷酸和组蛋白SL二者的mRNA高得多的荧光素酶水平。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合进一步强烈地增加荧光素酶水平，高于用每种单独的元件观察到的水平数倍。在相同的mRNA中由于组合聚腺苷酸与组蛋白SL引起的荧光素酶水平升高的幅度表明它们是协同作用的。
通过将来自聚腺苷酸-组蛋白SL mRNA(+/+)的信号除以来自组蛋白 SL mRNA(-/+)加聚腺苷酸mRNA(+/-)的信号的和来量化聚腺苷酸与组蛋白SL之间的协同性(见下表7)。
表7：
这样计算的因子表明来自组合聚腺苷酸与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平比如果单纯加合聚腺苷酸与组蛋白SL的作用将预测的荧光素酶水平高多少。来自组合聚腺苷酸与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平是单纯加合它们的作用的水平的多至16.6倍高。该结果证实聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在蛋白表达中实施了显著的协同性增加。
14.3聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加mRNA的蛋白表达与其顺序无关
聚腺苷酸与组蛋白SL的组合的作用可能取决于聚腺苷酸序列的长度以及聚腺苷酸与组蛋白SL的顺序。因此，合成具有增加的聚腺苷酸序列长度的mRNAs和具有相反顺序的聚腺苷酸与组蛋白SL的mRNA：两种 mRNAs在3’-UTR的3’包含Al20或A300聚腺苷酸序列。另一种mRNA 在3’-UTR的3’首先包含组蛋白SL，其后接着A250聚腺苷酸序列。将荧光素酶编码mRNAs或对照mRNA脂质转染至HeLa细胞中。在转染开始后6、24和48小时测量荧光素酶水平(见下表8和图23)。
表8：
A64聚腺苷酸序列或组蛋白SL二者都产生可比较的荧光素酶水平。与之前的实验一致，A64与组蛋白SL的组合的确强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件观察到的水平数倍。在相同的mRNA中由于组合聚腺苷酸与组蛋白SL导致的荧光素酶水平升高的幅度证明它们是协同作用的。如之前，基于A64-组蛋白SL、A64和组蛋白SL mRNA的荧光素酶水平定量A64与组蛋白SL之间的协同性(见下表9)。来自组合A64 与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平是单纯加合聚腺苷酸与组蛋白SL 的作用的多至61.7倍高。
表9：
相比之下，聚腺苷酸序列的长度由A64增加至A120或增加至A300 仅适度地增加荧光素酶水平(见表8和图19)。还将具有最长的聚腺苷酸序列(即A300)的mRNA与这样的mRNA进行比较，其中相似长度的聚腺苷酸序列与组蛋白SL组合，即，组蛋白SL-A250。除了具有长的聚腺苷酸序列之外，该mRNA中组蛋白SL与聚腺苷酸的顺序相对于A64- 组蛋白SL mRNA是相反的。A250与组蛋白SL的组合强烈增加荧光素酶水平，高于用组蛋白SL或A300观察到的水平的数倍。同样地，如之前，比较来自组蛋白SL-A250 mRNA的RLU与来自A300 mRNA加组蛋白 SL mRNA的RLU，来定量A250与组蛋白SL之间的协同性(见下表10)。来自组合A250与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平是单纯加合聚腺苷酸与组蛋白SL的作用的多至17.0倍高。
表10：
总之，对于基本上不同长度的聚腺苷酸，已经证明组蛋白SL与聚腺苷酸的组合对由mRNA的蛋白表达的高度协同作用，并且同聚腺苷酸与组蛋白SL的顺序无关。
14.4通过聚腺苷酸与组蛋白SL的组合引起蛋白表达的增加是特异性的
为了研究聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对由mRNA的蛋白表达是否是特异性的，合成具有与聚腺苷酸组合的备选序列的mRNAs：这些 mRNAs在A64的3’分别包含七种不同序列中的一种。将荧光素酶编码 mRNAs或对照mRNA电穿孔至HeLa细胞。在转染或6、24和48小时测量荧光素酶水平(见下表11和图24)。
表11：
聚腺苷酸序列或组蛋白SL二者都产生可比较的荧光素酶水平。同样地，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件观察到的水平数倍，因此，二者是协同作用的。相比之下，与仅包含聚腺苷酸序列的mRNA相比，组合聚腺苷酸与任一种备选序列对荧光素酶水平没有作用。因此，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合以协同方式增加由mRNA的蛋白表达，并且该作用是特异性的。
14.5聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在体内以协同方式增加由mRNA的蛋白表达。
为了研究聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在体内对由mRNA的蛋白表达的作用，将在α-珠蛋白3’UTR的3’具有不同序列的荧光素酶编码 mRNAs或对照mRNA皮内注射到小鼠中：在3’-UTR的3’包含A64聚腺苷酸序列或相反包含组蛋白SL、或包含A64聚腺苷酸与组蛋白SL二者的mRNAs。在注射后16小时测量荧光素酶水平(见下表12和图25)。
表12：
mRNA 16小时的RLU
ppLuc(GC)-ag-A64-组蛋白SL 38081
ppLuc(GC)-ag-组蛋白SL 137
ppLuc(GC)-ag-A64 4607
由具有组蛋白SL或聚腺苷酸序列的mRNA表达荧光素酶。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合进一步强烈增加荧光素酶水平，高于用单独的每种元件观察到的水平数倍。在相同的mRNA中由于组合聚腺苷酸与组蛋白SL导致的荧光素酶水平增加的幅度表明它们是协同作用的。
通过将来自聚腺苷酸-组蛋白SL mRNA(+/+)的信号除以来自组蛋白 SL mRNA(-/+)加聚腺苷酸mRNA(+/-)的信号的和而量化聚腺苷酸与组蛋白SL之间的协同性(见下表13)。
表13：
A64 组蛋白SL 16小时的RLU
+ + 38081
- + 137
+ - 4607
协同性 8.0
这样计算的因子表明来自组合聚腺苷酸与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平比单纯加合聚腺苷酸与组蛋白SL的作用预测的水平高多少。来自组合聚腺苷酸与组蛋白SL的mRNA的荧光素酶水平是单纯加合其作用的水平的8倍高。这一结果证实聚腺苷酸与组蛋白SL的组合在体内蛋白表达中实施显著的协同增加。
14.6聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加由mRNA的NY-ESO-1蛋白表达。
为了研究聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对由mRNA的蛋白表达的作用，合成了在α-珠蛋白3’-UTR的3’具有不同的序列的NY-ESO-1-编码 mRNAs：在3’-UTR的3’包含A64聚腺苷酸序列或包含A64聚腺苷酸与组蛋白SL二者的mRNAs。将NY-ESO-1-编码mRNAs电穿孔至HeLa细胞中。在转染后24小时通过流式细胞术测量NY-ESO-1水平(见下表14 和图26)。
表14：
NY-ESO-1由仅具有聚腺苷酸序列的mRNA表达。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加NY-ESO-1水平，高于仅用聚腺苷酸序列观察到的水平数倍。
14.7聚腺苷酸与组蛋白SL的组合增加通过接种mRNA引发的抗体的水平。
为了研究聚腺苷酸与组蛋白SL的组合对由mRNA接种引发的抗体的诱导的作用，将C57BL/6小鼠皮内接种在α-珠蛋白3’-UTR的3’具有不同序列的鱼精蛋白复合的NY-ESO-1-编码mRNAs。mRNAs在3’-UTR 的3’包含A64聚腺苷酸序列或包含A64聚腺苷酸与组蛋白SL二者。用血清的连续稀释液通过ELISA分析接种的和对照小鼠中的NY-ESO-1-特异性抗体的水平(见下表15和图27)。
表15：
mRNA 平均IgG2a[b]终点滴度
NY-ESO-1(GC)-ag-A64-组蛋白SL 763
NY-ESO-1(GC)-ag-A64 20
由仅具有聚腺苷酸序列的mRNA诱导抗NY-ESO-1 IgG2a[b]。然而，令人注意的是，聚腺苷酸与组蛋白SL的组合强烈增加抗NY-ESO-1 IgG2a[b]水平，高于仅用聚腺苷酸序列观察到的水平数倍。
序列表
<110> 库瑞瓦格股份公司
<120> 增加编码的肿瘤抗原表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸
<130> CU01P128WO1
<140> PCT/EP2012/000674
<141> 2012-02-15
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ic)的组蛋白茎环序列：不具有茎边界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎环共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(14)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 1
ngnnnnnnun nnnncn 16
<210> 2
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIc)的组蛋白茎环序列：具有茎边界元件的后生动物和原生动物组蛋白茎环共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
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或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(13)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
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<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 2
nnnnnngnnn nnnunnnnnc nnnnnn 26
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<211> 16
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Id)的组蛋白茎环序列：不具有茎边界元件
<220>
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或其核苷酸类似物
<220>
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或其核苷酸类似物
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或其核苷酸类似物
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<212> RNA
<213> 人工的
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<223> 式(IId)的组蛋白茎环序列：具有茎边界元件
<220>
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或其核苷酸类似物
<220>
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nnnnnncnnn nnnunnnnng nnnnnn 26
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<213> 人工的
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<220>
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或其核苷酸类似物
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或其核苷酸类似物
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dgnnnnnnun nnnnch 16
<210> 6
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIe)的组蛋白茎环序列：具有茎边界元件的原生动物组蛋白茎环共有序列
<220>
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<222> (1)..(5)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
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<221> misc_feature
<222> (8)..(13)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(19)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 6
nnnnndgnnn nnnunnnnnc hnnnnn 26
<210> 7
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(If)的组蛋白茎环序列：不具有茎边界元件的后生动物组蛋白茎环共有序列
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
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<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
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<222> (12)..(12)
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<220>
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或其核苷酸类似物
<220>
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<222> (16)..(16)
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或其核苷酸类似物
<400> 7
ngnbyynnun vndncn 16
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<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIf)的组蛋白茎环序列: 具有茎边界元件的后生动物组蛋白茎环共有序列
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<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
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<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 8
nnnnnngnby ynnunvndnc nnnnnn 26
<210> 9
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ig)的组蛋白茎环序列：不具有茎边界元件的脊椎动物组蛋白茎环共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 9
nghyyydnuh abrdcn 16
<210> 10
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIg)的组蛋白茎环序列：具有茎边界元件的脊椎动物组蛋白茎环共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 10
nnhnnnghyy ydnuhabrdc nnnnnh 26
<210> 11
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ih)的组蛋白茎环序列：不具有茎边界元件的人组蛋白茎环共有序列（智人(Homo sapiens)）
<400> 11
dghycudyuh asrrcc 16
<210> 12
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIh)的组蛋白茎环序列：具有茎边界元件的人组蛋白茎环共有序列（智人）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 12
nhaahdghyc udyuhasrrc cvhbnh 26
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ic)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 13
vgyyyyhhth rvvrcb 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ic)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 14
sgyyyttytm arrrcs 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ic)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 15
sgyycttttm agrrcs 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ie)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 16
dgnnnbnnth vnnnch 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ie)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 17
rgnnnyhbth rdnncy 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ie)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 18
rgndbyhyth rdhncy 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(If)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 19
vgyyytyhth rvrrcb 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(If)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 20
sgyycttytm agrrcs 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(If)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 21
sgyycttttm agrrcs 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ig)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 22
ggyycttyth agrrcc 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ig)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 23
ggcycttytm agrgcc 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ig)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 24
ggctcttttm agrgcc 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ih)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 25
dghyctdyth asrrcc 16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ih)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 26
ggcyctttth agrgcc 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(Ih)的组蛋白茎环序列（不具有茎边界元件）
<400> 27
ggcycttttm agrgcc 16
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIc)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 28
hhhhvvgyyy yhhthrvvrc bvhhnn 26
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIc)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 29
mhmhmsgyyy ttytmarrrc smchhh 26
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIc)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 30
mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIe)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 31
nnnnndgnnn bnnthvnnnc hnhnnn 26
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIe)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 32
nnhhnrgnnn yhbthrdnnc ydhhnn 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIe)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 33
nhhhvrgndb yhythrdhnc yrhhhh 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIf)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 34
hhmhmvgyyy tyhthrvrrc bvmhhn 26
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIf)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 35
mmmmmsgyyc ttytmagrrc smchhh 26
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIf)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 36
mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIg)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 37
hhmamggyyc ttythagrrc cvhnnm 26
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIg)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 38
hhaamggcyc ttytmagrgc cvchhm 26
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIg)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 39
mmaamggctc ttttmagrgc cmcymm 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIh)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 40
nhaahdghyc tdythasrrc cvhbnh 26
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIh)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A, U, T, G和C
或其核苷酸类似物
<400> 41
hhaamggcyc tttthagrgc cvmynm 26
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 式(IIh)的组蛋白茎环序列（具有茎边界元件）
<400> 42
hmaaaggcyc ttttmagrgc crmyhm 26
<210> 43
<211> 1747
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag的mRNA序列
<400> 43
gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60
cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240
ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620
ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auagauc 1747
<210> 44
<211> 1806
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64的mRNA序列
<400> 44
gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60
cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240
ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
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auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaa 1806
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<211> 1772
<212> RNA
<213> 人工的
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<211> 1835
<212> RNA
<213> 人工的
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<400> 46
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auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
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gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
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caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
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aaaaaaaaa 1869
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<223> ppLuc(GC)-ag-A64-ag的mRNA序列
<400> 48
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gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
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ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
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auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca uccugcccga ugggccuccc aacgggcccu ccuccccucc uugcaccg 1858
<210> 49
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<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64-aCPSL的mRNA序列
<400> 49
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cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
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ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
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caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
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caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
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gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
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ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca ucaauucuaa aacagcucug ggguuguacc caccccagag gcccacgugg 1860
cggcuaguac uccgguauug cgguacccuu guacgccugu uuuagaauu 1909
<210> 51
<211> 1841
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64-G30的mRNA序列
<400> 51
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ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
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ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620
ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca uggggggggg gggggggggg gggggggggg g 1841
<210> 52
<211> 1841
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64-U30的mRNA序列
<400> 52
gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60
cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240
ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620
ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 1841
<210> 53
<211> 1857
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64-SL的mRNA序列
<400> 53
gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60
cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240
ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620
ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca uuauggcggc cguguccacc acggauauca ccguggugga cgcggcc 1857
<210> 54
<211> 1838
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> ppLuc(GC)-ag-A64-N32
<400> 54
gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60
cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120
ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180
guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240
ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300
ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360
gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420
gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480
gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540
cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600
caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660
cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720
cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780
ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840
gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900
cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960
gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020
cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080
ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140
ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200
gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260
cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320
cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380
gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440
cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500
gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560
cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620
ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca ucccccucua gacaauugga auuccaua 1838
<210> 55
<211> 747
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> NY-ESO-1(GC)-ag-A64-C30的mRNA序列
<400> 55
gggagaaagc uuaccaugca ggccgagggc cgcggcaccg gcggcucgac cggcgacgcc 60
gacgggcccg gcggcccggg caucccggac ggcccgggcg ggaacgcggg cggcccgggc 120
gaggccggcg ccaccggcgg gcggggcccg cggggcgccg gcgccgcccg ggcgagcggc 180
cccggcgggg gcgccccgcg gggcccgcac ggcggcgccg ccagcggccu gaacgggugc 240
ugccggugcg gcgcccgcgg cccggagagc cggcuccugg aguucuaccu ggccaugccg 300
uucgcgaccc cgauggaggc cgagcuggcc cggcggagcc uggcccagga cgccccgccg 360
cugcccgugc cgggcgugcu ccugaaggag uucacgguga gcggcaacau ccugaccauc 420
cggcugaccg ccgcggacca ccggcagcug cagcugucga ucagcagcug ccuccagcag 480
cugagccugc ugauguggau cacccagugc uuccugccgg uguuccuggc ccagccgccc 540
agcggccagc gccggugacc acuaguuaua agacugacua gcccgauggg ccucccaacg 600
ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaauauu cccccccccc cccccccccc 720
cccccccccc ucuagacaau uggaauu 747
<210> 56
<211> 761
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> NY-ESO-1(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL的mRNA序列
<400> 56
gggagaaagc uuaccaugca ggccgagggc cgcggcaccg gcggcucgac cggcgacgcc 60
gacgggcccg gcggcccggg caucccggac ggcccgggcg ggaacgcggg cggcccgggc 120
gaggccggcg ccaccggcgg gcggggcccg cggggcgccg gcgccgcccg ggcgagcggc 180
cccggcgggg gcgccccgcg gggcccgcac ggcggcgccg ccagcggccu gaacgggugc 240
ugccggugcg gcgcccgcgg cccggagagc cggcuccugg aguucuaccu ggccaugccg 300
uucgcgaccc cgauggaggc cgagcuggcc cggcggagcc uggcccagga cgccccgccg 360
cugcccgugc cgggcgugcu ccugaaggag uucacgguga gcggcaacau ccugaccauc 420
cggcugaccg ccgcggacca ccggcagcug cagcugucga ucagcagcug ccuccagcag 480
cugagccugc ugauguggau cacccagugc uuccugccgg uguuccuggc ccagccgccc 540
agcggccagc gccggugacc acuaguuaua agacugacua gcccgauggg ccucccaacg 600
ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc 720
cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc caccaggaau u 761
<210> 57
<211> 646
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> 存活蛋白(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL的mRNA序列
<400> 57
gggagaaagc uuaccauggg cgcccccacc cugccgccgg ccuggcagcc guuccucaag 60
gaccaccgca ucucgaccuu caagaacugg ccguuccugg agggcugcgc gugcaccccg 120
gagcggaugg ccgaggccgg cuucauccac ugccccaccg agaacgagcc ggaccuggcc 180
cagugcuucu ucugcuucaa ggagcuggag ggcugggagc cggacgacga cccgaucgag 240
gagcacaaga agcacagcag cggcugcgcc uuccugagcg ugaagaagca guucgaggag 300
cugacgcucg gggaguuccu gaagcuggac cgggagcggg ccaagaacaa gaucgcgaag 360
gagaccaaca acaagaagaa ggaguucgag gagaccgcca agaaggugcg gcgggccauc 420
gagcagcugg ccgccaugga cugaccacua guuauaagac ugacuagccc gaugggccuc 480
ccaacgggcc cuccuccccu ccuugcaccg agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc 600
cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu cagagccacc agaauu 646
<210> 58
<211> 1813
<212> RNA
<213> 人工的
<220>
<223> MAGE-C1(GC)-ag-A64-C30-组蛋白SL的mRNA序列
<400> 58
gggagaaagc uuaccaugca guccccgcug cagggcgagg aguuccagag cucccugcag 60
agccccgugu ccaucugcag cuccagcacc cccuccagcc ucccgcagag cuuccccgag 120
uccagccagu ccccccccga gggcccgguc cagagccccc ugcacucccc gcagagcccc 180
ccggagggga ugcacuccca gagcccccug cagucccccg agagcgcccc cgagggcgag 240
gacucccuca gcccgcugca gaucccccag uccccgcugg agggggagga cagccucucc 300
agccugcacu ucccccaguc cccgcccgag ugggaggaca gccugagccc ccuccacuuc 360
ccccaguucc cgccccaggg cgaggacuuc caguccagcc ugcagucccc cgugagcauc 420
ugcuccagcu ccacgagccu gucccucccc cagagcuucc cggagucccc ccagagcccg 480
cccgaggggc cggcgcaguc cccccugcag cgccccguga gcuccuucuu cagcuacacc 540
cuggccuccc uccugcagag cucccacgag agcccgcaga gcccgcccga gggccccgcc 600
caguccccgc ugcagagccc cgucuccagc uuccccucca gcaccuccag cucccucagc 660
caguccagcc ccguguccag cuucccgucc agcaccucca gcucccugag caagagcucc 720
cccgagagcc cccugcaguc ccccgugauc agcuucucca gcuccacgag ccucuccccg 780
uucagcgagg aguccagcuc ccccgucgac gaguacacca gcuccagcga cacccugcug 840
gaguccgaca gccucaccga cuccgagagc cugaucgaga gcgagccccu guucaccuac 900
acgcucgacg agaaggugga cgagcuggcc cgguuccugc uccugaagua ccaggugaag 960
cagcccauca ccaaggccga gaugcugacc aacgucaucu cccgcuacac cggcuacuuc 1020
ccggugaucu uccggaaggc gcgcgaguuc aucgagaucc ucuucgggau cagccugcgg 1080
gagguggacc ccgacgacuc cuacgucuuc gugaacacgc uggaccucac cagcgagggc 1140
ugccuguccg acgagcaggg gaugagccag aaccgccugc ucauccugau ccuguccauc 1200
aucuucauca agggcaccua cgccagcgag gaggucaucu gggacgugcu cuccgggauc 1260
ggcgugcggg ccggccgcga gcacuucgcc uucggggagc cccgggagcu gcugaccaag 1320
gucugggugc aggagcacua ccucgaguac cgcgaggugc ccaacagcuc cccgccccgg 1380
uacgaguucc uguggggccc ccgcgcccac agcgagguca ucaagcggaa ggugguggag 1440
uuccuggcga ugcucaagaa cacggucccc aucaccuucc cguccagcua caaggacgcc 1500
cugaaggacg uggaggagcg ggcccaggcc aucaucgaca ccaccgacga cuccacggcc 1560
accgagagcg cguccagcuc cgugaugagc cccagcuucu ccagcgagug accacuaguu 1620
auaagacuga cuagcccgau gggccuccca acgggcccuc cuccccuccu ugcaccgaga 1680
uuaauaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaau gcaucccccc cccccccccc cccccccccc cccccaaagg cucuuuucag 1800
agccaccaga auu 1813

Claims (27)

1.核酸序列，其包含或编码：
a)编码区，所述编码区编码至少一种肽或蛋白；
b)至少一个组蛋白茎环，和
c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
其中所述肽或蛋白包含肿瘤抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述肿瘤抗原是黑色素细胞特异性抗原、癌-睾丸抗原或肿瘤特异性抗原，优选CT-X抗原，非-X CT-抗原，CT-X抗原的结合配偶体或非-XCT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原，更优选是CT-X抗原、非-X CT-抗原的结合配偶体或肿瘤特异性抗原或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核酸序列，其中所述肿瘤抗原选自下述列表：5T4，707-AP，9D7，AFP，AlbZIP HPG1，α-5-β-1-整联蛋白，α-5-β-6-整联蛋白，α-辅肌动蛋白-4/m，α-甲基酰基-辅酶A消旋酶，ART-4，ARTC1/m，B7H4，BAGE-1，BCL-2，bcr/abl，β-连环蛋白/m，BING-4，BRCA1/m，BRCA2/m，CA 15-3/CA 27-29，CA 19-9，CA72-4，CA125，肌钙网蛋白，CAMEL，CASP-8/m，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L，CD19，CD20，CD22，CD25，CDE30，CD33，CD4，CD52，CD55，CD56，CD80，CDC27/m，CDK4/m，CDKN2A/m，CEA，CLCA2，CML28，CML66，COA-1/m，类共激活蛋白，胶原XXIII，COX-2，CT-9/BRD6，Cten，细胞周期蛋白B1，细胞周期蛋白D1，cyp-B，CYPB1，DAM-10，DAM-6，DEK-CAN，EFTUD2/m，EGFR，ELF2/m，EMMPRIN，EpCam，EphA2，EphA3，ErbB3，ETV6-AML1，EZH2，FGF-5，FN，Frau-1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE7b，GAGE-8，GDEP，GnT-V，gp100，GPC3，GPNMB/m，HAGE，HAST-2，hepsin，Her2/neu，HERV-K-MEL，HLA-A*0201-R17I，HLA-A11/m，HLA-A2/m，HNE，同源异型框NKX3.1，HOM-TES-14/SCP-1，HOM-TES-85，HPV-E6，HPV-E7，HSP70-2M，HST-2，hTERT，iCE，IGF-1R，IL-13Ra2，IL-2R，IL-5，不成熟的层粘连蛋白受体，激肽释放酶-2，激肽释放酶-4，Ki67，KIAA0205，KIAA0205/m，KK-LC-1，K-Ras/m，LAGE-A1，LDLR-FUT，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D1，MAGE-D2，MAGE-D4，MAGE-E1，MAGE-E2，MAGE-F1，MAGE-H1，MAGEL2，乳腺珠蛋白A，MART-1/melan-A，MART-2，MART-2/m，基质蛋白22，MC1R，M-CSF，ME1/m，间皮素，MG50/PXDN，MMP11，MN/CA IX-抗原，MRP-3，MUC-1，MUC-2，MUM-1/m，MUM-2/m，MUM-3/m，I/m类肌球蛋白，NA88-A，N-乙酰葡糖胺转移酶-V，Neo-PAP，Neo-PAP/m，NFYC/m，NGEP，NMP22，NPM/ALK，N-Ras/m，NSE，NY-ESO-B，OA1，OFA-iLRP，OGT，OGT/m，OS-9，OS-9/m，骨钙素，骨桥蛋白，p15，p190m型bcr-abl，p53，p53/m，PAGE-4，PAI-1，PAI-2，PAP，PART-1，PATE，PDEF，Pim-1-激酶，Pin-1，Pml/PARα，POTE，PRAME，PRDX5/m，prostein，蛋白酶-3，PSA，PSCA，PSGR，PSM，PSMA，PTPRK/m，RAGE-1，RBAF600/m，RHAMM/CD168，RU1，RU2，S-100，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SCC，SIRT2/m，Sp17，SSX-1，SSX-2/HOM-MEL-40，SSX-4，STAMP-1，STEAP-1，存活蛋白，存活蛋白-2B，SYT-SSX-1，SYT-SSX-2，TA-90，TAG-72，TARP，TEL-AML1，TGFβ，TGFβRII，TGM-4，TPI/m，TRAG-3，TRG，TRP-1，TRP-2/6b，TRP/INT2，TRP-p8，酪氨酸酶，UPA，VEGFR1，VEGFR-2/FLK-1，WT1以及淋巴样血细胞的免疫球蛋白独特型或淋巴样血细胞的T细胞受体独特型，或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物；优选存活蛋白或其同源物，来自MAGE-家族的抗原或其结合配偶体或所述肿瘤抗原的片段、变体或衍生物。
4.根据权利要求1-3所述的核酸，其中所述至少一个组蛋白茎环与所述编码至少一种肽或蛋白的编码区是异源的，优选其中所述编码区不编码组蛋白或其具有组蛋白或组蛋白样功能的片段、衍生物或变体。
5.根据权利要求1或4所述的核酸，其中所述编码区编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原性蛋白或其片段、变体或衍生物，所述肿瘤抗原性蛋白的片段、变体或衍生物保留所述肿瘤抗原性蛋白的至少50％的生物学活性。
6.根据权利要求1-5中任一项的核酸，其中其编码区不编码报道蛋白或标记或选择蛋白。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸是RNA，优选是mRNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸序列，其中所述至少一个组蛋白茎环选自下式(I)或(II)：
式(I)(不具有茎边界元件的茎环序列)：
式(II)(具有茎边界元件的茎环序列)：
其中：
茎1或茎2边界元件N1-6是1-6个、优选2-6个、更优选2-5个、甚至更优选3-5个、最优选4-5个或5个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；
茎1[N0-2GN3-5]与元件茎2反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；
其中N0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；
其中N3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物，并且
其中G是鸟苷或其类似物，并且可以任选地被胞苷或其类似物替代，条件是其在茎2中的互补核苷酸胞苷被鸟苷替代；
环序列[N0-4(U/T)N0-4]位于元件茎1和茎2之间，并且是3-5个核苷酸、更优选4个核苷酸的连续序列；
其中每个N0-4彼此独立地是0-4个、优选1-3个、更优选1-2个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C或其核苷酸类似物；并且
其中U/T表示尿苷或任选地胸苷；
茎2[N3-5CN0-2]与元件茎1反向互补或部分反向互补，并且是5-7个核苷酸的连续序列；
其中N3-5是3-5个、优选4-5个、更优选4个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；
其中N0-2是0-2个、优选0-1个、更优选1个N的连续序列，其中每个N彼此独立地选自下述核苷酸：所述核苷酸选自A，U，T，G和C，或其核苷酸类似物；并且
其中C是胞苷或其类似物，并且可以任选地被鸟苷或其类似物替代，条件是其在茎1中的互补核苷酸鸟苷被胞苷替代；
其中
茎1和茎2能够彼此碱基配对
形成反向互补序列，其中碱基配对可以发生在茎1与茎2之间，或者
形成部分反向互补的序列，其中不完全的碱基配对可以发生在茎1和茎2之间。
9.根据权利要求8所述的核酸，其中所述至少一个组蛋白茎环选自下式(Ia)或(IIa)中的至少一个：
式(Ia)(不具有茎边界元件的茎环序列)
式(IIa)(具有茎边界元件的茎环序列)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸序列，其中所述聚腺苷酸序列包含约25至约400个腺苷核苷酸的序列，优选约50至约400个腺苷核苷酸的序列，更优选约50至约300个腺苷核苷酸的序列，甚至更优选约50至约250个腺苷核苷酸的序列，最优选约60至约250个腺苷核苷酸的序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸序列，其中所述聚腺苷酸化信号包含共有序列NN(U/T)ANA，优选AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列是修饰的核酸，特别是稳定的核酸。
13.根据权利要求12所述的核酸序列，其中，与野生型核酸的编码区的G/C含量相比，所述修饰的核酸的编码至少一种肽或蛋白的编码区的G/C含量增加，与野生型核酸所编码的氨基酸序列相比，所述修饰的核酸编码的氨基酸序列优选不被修饰。
14.组合物，其包含至少一种类型的权利要求1-13中任一项所述的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含至少两种类型的核酸序列，其中每种类型的核酸序列编码不同的肽或蛋白，优选编码不同的肿瘤抗原。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的组合物，其中所包含的一种类型的核酸序列编码PSA，PSMA，PSCA，STEAP-1，NY-ESO-1，5T4，存活蛋白，MAGE-C1或MAGE-C2。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述核酸序列不编码NY-ESO1，条件是所述组合物仅包含一种类型的核酸序列。
18.一种试剂盒或部件的试剂盒，其包含至少一种、优选多种或多于一种核酸序列，所述核酸序列每种为根据权利要求1-13中任一项所述的核酸序列。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其至少包含：
a)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSA，或其片段、变体或衍生物；和
b)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSMA，或其片段、变体或衍生物；和
c)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原PSCA，或其片段、变体或衍生物；和
d)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原STEAP-1，或其片段、变体或衍生物。
20.根据权利要求14-18中任一项所述的组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其至少包含：
a)核酸序列，所述核酸序列包含或编码：
i.编码区，所述编码区编码至少一种包含肿瘤抗原NY-ESO-1或其片段、变体或衍生物的肽或蛋白，
ii.至少一个组蛋白茎环，和
iii.聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号；
b)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原5T4，或其片段、变体或衍生物；和
c)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原存活蛋白，或其片段、变体或衍生物。
21.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其还至少包含：
a)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原MAGE-C1，或其片段、变体或衍生物；和
b)权利要求1-13中任一项的核酸序列，其中所述编码的肽或蛋白包含肿瘤抗原MAGE-C2，或其片段、变体或衍生物。
22.根据权利要求1-13中任一项所定义的核酸序列或根据权利要求14-21中任一项所定义的组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其用作药物。
23.根据权利要求1-13中任一项所定义的核酸序列或根据权利要求14-21中任一项所定义的组合物或试剂盒或部件的试剂盒，其用于治疗癌症或肿瘤疾病。
24.药物组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所定义的核酸序列或根据权利要求14-21中任一项所定义的组合物和任选的药用载体。
25.根据权利要求1-13中任一项所定义的核酸序列或根据权利要求14-21中任一项所定义的组合物或试剂盒或部件的试剂盒用于增加所述编码的肽或蛋白的表达的应用。
26.根据权利要求1-13中任一项所定义的核酸序列或根据权利要求14-21中任一项所定义的组合物或试剂盒或部件的试剂盒用于在癌症或肿瘤疾病的治疗中增加所述编码的肽或蛋白的表达的应用。
27.一种用于增加编码的肽或蛋白表达的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供权利要求1-13中任一项定义的核酸序列或权利要求14-21中任一项定义的组合物，
b)将所述核酸序列或所述组合物应用于或施用至不含细胞的表达系统、细胞、组织或生物体。
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