KR20140123106A - 암호화된 종양 항원의 발현을 증가시키기 위한 히스톤 스템-루프 및 폴리(ａ) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산 - Google Patents

암호화된 종양 항원의 발현을 증가시키기 위한 히스톤 스템-루프 및 폴리(ａ) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역, 하나 이상의 히스톤 스템-루프 및 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위한 상기 핵산의 용도도 제공한다. 본 발명에는 또한 약학 조성물, 예를 들어 암 또는 종양 질환의 치료법에 사용될 약학 조성물, 특히 백신을 제조함에 있어서 상기 핵산의 용도가 개시되어 있다. 본 발명에는 또한 히스톤 스템-루프 및 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산을 사용하여 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키는 방법에 관하여도 개시되어 있다.

Description

암호화된 종양 항원의 발현을 증가시키기 위한 히스톤 스템-루프 및 폴리(Ａ) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산{NUCLEIC ACID COMPRISING OR CODING FOR A HISTONE STEM-LOOP AND POLY(A) SEQUENCE OR A POLYADENYLATION SIGNAL FOR INCREASING THE EXPRESSION OF AN ENCODED TUMOR ANTIGEN}
본 발명은 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역, 하나 이상의 히스톤 스템-루프 및 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 뿐만 아니라 본 발명은 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키는데 있어서 상기 핵산의 용도도 제공한다. 또한 본 발명에는, 예를 들어 암 또는 종양 질환을 치료하는데 사용되는 약학 조성물, 특히 백신의 제조시 상기 핵산 서열의 용도에 관하여도 기술되어 있다. 본 발명에는 또한 히스톤 스템-루프 및 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산을 사용하여, 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위한 방법에 관하여도 기술되어 있다.
심혈관 질환과 감염성 질환은 별도로 하고, 종양 및 암 질환은 현대 사회에서 가장 흔히 발생하는 사망 원인 중 하나로서, 대부분 경우, 치료 및 치료 후 회복을 위한 조치의 관점에서 비용이 많이 들어가는 질환이다. 종양 및 암 질환의 치료는, 예를 들어 발생한 종양의 유형, 연령, 치료 대상인 환자의 체내 암 세포 분포 등에 매우 의존적이다. 오늘날 암 치료법은 통상적으로 침습적 수술 이외에도 방사선 요법이나 화학 요법을 이용함으로써 수행된다. 그러나 이러한 통상의 치료법들은 보통 면역계에 보통 이상의 부담을 줄 뿐만 아니라 몇몇 경우에는 오로지 제한된 범위로만 이용될 수 있을 뿐이다. 뿐만 아니라 이와 같은 통상의 치료법들 대부분은 면역계가 재생될 수 있도록 개별 치료들 간 간격이 길어야 한다.
이에 따라서, 상기와 같은 "통상의 치료법들" 이외에도 최근 들어서는 이와 같은 치료법들이 면역계에 미치는 영향을 없애거나 적어도 줄이는 보완 기술들이 연구되고 있다. 이러한 보완 치료법의 하나는, 특히 유전자 치료 접근법 또는 유전자 백신화 방법을 포함하는데, 이러한 방법들은 이미 기존의 치료법이나 통상의 치료법들을 지원함에 있어서 매우 전도 유망한 것으로 확인된 바 있다.
유전자 치료법과 유전자 백신화는 질병의 치료법과 예방에 있어서 이미 그 효과가 입증되었으며, 일반적으로 통상의 의료 실무, 특히 상기 예시된 질환들을 치료함에 있어서 상당한 효과를 보이는 분자 의료 분야의 한 방법이다. 유전자 치료법과 유전자 백신화 둘 다의 방법은 환자의 세포나 조직에 핵산을 도입한 후, 이처럼 세포나 조직에 도입된 핵산에 의해 암호화된 정보를 가공하는 것(즉 원하는 폴리펩티드의 (단백질)을 발현시키는 것)을 바탕으로 한다.
유전자 치료에 관한 접근법에 있어서는, 심지어 RNA가 최근 개발중에 있는 것으로 알려져 있음에도 불구 통상적으로 DNA가 사용되고 있다. 중요한 점은, 이와 같은 모든 유전자 치료에 관한 접근법에 있어서 mRNA는, DNA, 바이러스 RNA 또는 mRNA가 사용되는지 여부에 상관없이, 암호화된 단백질의 서열 정보에 대한 메신저로서의 역할을 한다는 점이다.
일반적으로 RNA는 불안정한 분자인 것으로 간주되는데: RNase는 도처에 존재하는 것으로서 불활성화되기 어려운 것으로 악명 높다. 뿐만 아니라, RNA는 또한 DNA보다 화학적으로 더욱 불안정하다. 그러므로 진핵 생물 세포 내 mRNA의 "디폴트 상태(default state)"가 상대적 안정성에 의해 특징 지워지고, 각각의 mRNA의 파괴를 가속화하는데 특이적 신호들이 필요하다는 사실은 아마도 놀라울 수 있을 것이다. 이와 같은 발견의 주된 이유는 세포내 mRNA 파괴가 엑소뉴클레아제에 의해 거의 배타적으로 촉진되기 때문인 것으로 보인다. 그러나 진핵 생물 mRNA의 말단부들은, 특이적 말단 구조들 및 이 구조들과 연관된 단백질들[5' 말단의 m7GpppN CAP, 그리고 통상적으로는 3' 말단의 폴리(A) 서열]에 의해 상기와 같은 효소들로부터 보호되고 있다. 그러므로 이와 같은 2개의 말단 변형부의 제거는 mRNA 파괴 속도를 제한하는 것으로 간주된다. 알파-글로빈 mRNA의 3' UTR 내에서 안정화 요소(stabilizing element)가 특성 규명된 바 있지만, 통상적으로 진핵 생물 mRNA들의 전도(turnover)에 영향을 주는 RNA 서열들은 보통 탈아데닐화를 가속화함으로써 파괴 촉진 인자로서의 역할을 한다[문헌(Meyer, S., C. Temme, et al .(2004), Crit Rev Biochem Mol Biol 39(4): 197-216) 참조].
전술된 바와 같이, 진핵 생물 mRNA의 5' 말단은 통상적으로 전사 후 변형되어, 메틸화된 CAP 구조, 예를 들어 m7GpppN을 운반하게 된다. RNA 스플라이싱, 안정화 및 운반에 관한 원리들은 별도로 하고, CAP 구조는 번역이 개시될 때 40S 리보좀 서브유닛이 mRNA의 5' 말단에 보충되는 것을 유의적으로 증강시킨다. 상기 기능들 중 후자의 기능은 진핵 생물 개시 인자 복합체인 eIF4F에 의하여 CAP 구조가 인지되는 과정을 필요로 한다. 폴리(A) 서열은 추가로 mRNA에 40S 서브유닛이 보충되는 것[즉 폴리(A) 결합 단백질(PABP)의 개입을 필요로 하는 효과]을 증가시킴으로써 번역을 가속화한다. 또한 PABP는 CAP-결합 eIF4F 복합체의 일부인 eIF4G와 물리적으로 상호 작용을 한다는 사실이 최근에 입증되었다. 그러므로 캡핑 및 폴리아데닐화된 mRNA에 대한 번역 개시의 폐쇄형 루프 모델이 가설로 세워졌다[Michel, Y. M., D. Poncet, et al .(2000), J Biol Chem 275(41): 32268-76.].
거의 모든 진핵 생물 mRNA는 도처에 존재하는 절단/폴리아데닐화 기구에 의해 자체의 3' 말단에 부가되는 폴리(A) 서열로 종결된다. 3' 말단에 폴리(A) 서열이 존재하는 것은 진핵 생물 mRNA의 가장 눈에 띄는 특징들 중 하나이다. 절단후 대부분의 전구 mRNA는 (복제 의존성 히스톤 전사체의 경우는 제외하고) 폴리아데닐화 미부(polyadenylation tail)를 필요로 한다. 이와 같은 내용에 있어서 3' 말단 가공은 핵으로부터 세포질로의 mRNA 운반을 촉진하고 mRNA의 안정성과 번역에 영향을 주는 핵내 공동 전사 과정이다. 이와 같은 3' 말단은 절단/폴리아데닐화 기구에 의해 유도되는 2단계 반응에서 형성되고, 이와 같은 3' 말단의 형성은 mRNA 전구체(전구 mRNA) 내 2개의 서열 요소들[고도로 보존된 헥사뉴클레오티드 AAUAAA(폴리아데닐화 신호) 및 하류 G/U-풍부 서열]의 존재에 의존적이다. 제1 단계에서, 전구 mRNA는 이와 같은 2개의 요소들 사이에서 절단된다. 제1 단계와 밀접하게 연관된 제2 단계에서, 새로이 형성된 3' 말단은 200~250개의 아데닐레이트로 이루어진 폴리(A) 서열[추후 mRNA 대사의 모든 양태들, 예를 들어 mRNA의 외부 방출, 안정성 및 번역에 영향을 주는 서열]이 부가됨으로 인해 연장된다[Dominski, Z. and W. F. Marzluff(2007), Gene 396(2): 373-90].
이러한 원리에 있어서 유일하게 알려져 있는 예외로서는, 폴리(A) 서열 대신 히스톤 스템-루프로 종결되는 복제 의존성 히스톤 mRNA가 있다. 예시적인 히스톤 스템-루프 서열에 대해서는 문헌[Lopez et al .(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T.(2008), RNA(New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308]에 기술되어 있다.
히스톤 전구 mRNA 내 스템-루프들은 통상적으로 퓨린 풍부 서열(히스톤 하류 요소(Histone Downstream Element; HDE)라고 알려져 있는 서열)이 뒤따른다. 상기 전구 mRNA는 단일 엔도뉴클레오리틱 절단 과정[스템-루프의 하류 약 5 뉴클레오티드를 절단하는 과정으로서, U7 snRNA와 HDE의 염기쌍 형성을 통해 U7 snRNP에 의해 촉진됨]에 의해 핵 내에서 가공된다. 히스톤 스템-루프 구조와 히스톤 하류 요소(HDE)(U7 snRNP의 결합 위치)를 포함하는 3'-UTR 서열은 일반적으로 히스톤 3'-가공 신호라고 칭하여졌다[예를 들어 문헌(Chodchoy, N., N. B. Pandey, et al.(1991). Mol Cell Biol 11(1): 497-509) 참조].
새로 합성된 DNA는 염색질로 포장(package)되어야 하기 때문에, 히스톤 합성은 세포 주기와 조화를 이루어 나가며 조절된다. 히스톤 유전자들의 전사가 활성화되고 히스톤 mRNA 수준이 전사후 조절됨에 따라 S기에 히스톤 단백질들의 합성은 증가된다. 히스톤 스템-루프는 히스톤 발현 조절의 모든 전사후 단계들에 필수적인 것으로 보인다. 상기 히스톤 스템-루프는 mRNA의 효율적인 가공, mRNA의 세포질로의 방출, mRNA의 폴리리보좀 상으로의 부하, 그리고 mRNA 안정성 조절에 필요하다.
상기 내용중 32kDa 단백질은 핵과 세포질 둘 다에 있어서 히스톤 메시지의 3' 말단에서 히스톤 스템-루프와 결합되는 단백질인 것으로 확인되었다. 이러한 스템-루프 결합 단백질(SLBP)의 발현 수준은 세포 주기에 의해 조절되고, 히스톤 mRNA 수준이 증가하는 S기에 가장 높다. SLBP는 U7 snRNP에 의한 히스톤 전구 mRNA의 효율적인 3' 말단 가공에 필요하다. 가공을 마친 후 SLBP는 성숙한 히스톤 mRNA의 말단에서 스템-루프와 결합된 상태로 유지되다가, 이 결합된 복합체가 세포질 내에서 히스톤 단백질로 번역되는 것을 촉진한다[Dominski, Z. and W. F. Marzluff(2007), Gene 396(2): 373-90]. 흥미롭게도 SLBP의 RNA 결합 도메인은 후생 동물과 원생 동물에서 전반적으로 보존되며[Davila Lopez, M., & Samuelsson, T.(2008), RNA(New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308], 상기 도메인이 히스톤 스템-루프 서열과 결합되는 것은 스템-루프 구조에 의존적이고, 최소 결합 위치는 스템-루프 5' 말단의 3개 이상의 뉴클레오티드와 스템-루프 3' 말단의 2개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다는 것을 알 수 있었다[Pandey, N. B., et al.(1994), Molecular and Cellular Biology, 14(3), 1709-1720 and Williams, A. S., & Marzluff, W. F.,(1995), Nucleic Acids Research, 23(4), 654-662].
비록 히스톤 유전자들이 일반적으로 "복제 의존성"인 것(즉 히스톤 스템-루프로 종결되는 mRNA를 생성하는 것)으로나 아니면 "대체형"인 것(즉 히스톤 스템-루프 대신에 폴리(A) 미부를 보유하는 mRNA를 생성하는 것)으로 분류되긴 하지만, 이 mRNA의 히스톤 스템-루프와 폴리(A) 또는 올리고(A) 3' 말단 둘 다를 포함하는 천연 발생 mRNA도 매우 희귀한 경우로서 확인된 바 있다. 산체스(Sanchez)외 다수는, 리포터 단백질로서 루시퍼라제를 사용하여 손톱 개구리속(Xenopus)의 난자 형성시 히스톤 mRNA의 히스톤 스템-루프 3' 말단에 부가되어 있는 천연 발생 올리고(A) 미부들의 영향력에 대해 관찰하였는데, 이로부터, 올리고(A) 미부는 난자 형성시 히스톤 mRNA를 침묵시키는 번역 억제 기구의 활성 부이고, 이 미부의 제거 과정은 히스톤 mRNA의 번역을 활성화하는 기구의 일환임을 발견하였다[Sanchez, R. and W. F. Marzluff(2004), Mol Cell Biol 24(6): 2513-25].
뿐만 아니라, 마커 단백질인 알파 글로빈을 암호화하는 인위 구조체들을 이용하여[즉 글로빈 유전자는, 인트론이 없는 히스톤 유전자들과는 대조적으로 인트론들을 함유한다는 사실을 이용하여] 전구 mRNA 가공 및 mRNA 안정성 수준에서의 복제 의존성 히스톤 조절에 대한 요구 조건이 연구된 바 있다. 이러한 목적으로 알파 글로빈 암호화 서열 뒤에 히스톤 스템-루프 신호(이 히스톤 스템-루프 뒤에는 히스톤 하류 요소가 따름)와 폴리아데닐화 신호가 따르는 구조체들이 제조되었다[Whitelaw, E., et al .(1986). Nucleic Acids Research, 14(17), 7059-7070.; Pandey, N. B., & Marzluff, W. F.(1987). Molecular and Cellular Biology, 7(12), 4557-4559.; Pandey, N. B., et al .(1990). Nucleic Acids Research, 18(11), 3161-3170].
또 다른 접근법에서 뤼셔(Luscher)외 다수는, 재조합 히스톤 H4 유전자의 세포 주기 의존적 조절을 연구하였다. H4 암호화 서열 뒤에 히스톤 스템-루프 신호와 폴리아데닐화 신호가 따르고, 갈락토키나제 암호화 서열에 의해 2개의 가공 신호가 부수적으로 분리되어 있는 구조체들이 제조되었다[Luscher, B. et al.,(1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(13), 4389-4393].
뿐만 아니라 스타우버(Stauber)외 다수는, 히스톤 H4 mRNA 수준을 세포 주기에 따라서 조절하는데 필요한 최소 서열을 확인하였다. 이와 같은 연구를 위하여, 선별 마커인 잔틴:구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(GPT)에 대한 암호화 서열→히스톤 스템-루프 신호→폴리아데닐화 신호를 이러한 순서로 포함하는 구조체가 사용되었다[Stauber, C. et al.,(1986). EMBO J, 5(12), 3297-3303].
히스톤 전구 mRNA 가공 과정을 관찰함에 있어서 와그너(Wagner)외 다수는, 히스톤 스템-루프 신호와 폴리아데닐화 신호 사이에 EGFP가 배치되어 있는 리포터 구조체를 사용하여, 이 EGFP가, 히스톤 전구 mRNA 가공 과정이 저해되는 경우에만 발현되도록 함으로써, 히스톤 전구 mRNA 절단에 필요한 인자들을 확인하였다[Wagner, E. J. et al .,(2007). Mol Cell 28(4), 692-9].
주목할 점은, 폴리아데닐화된 mRNA의 번역은 일반적으로 5' CAP과 인접하게 될 3' 폴리(A) 서열을 필요로 한다는 점이다. 이는 폴리(A) 결합 단백질과 진핵 생물 개시 인자인 eIF4G 간 단백질-단백질 상호 작용을 매개로 하여 이루어진다. 복제 의존성 히스톤 mRNA에 관하여 유사한 기구가 밝혀졌다. 이와 같은 내용에 있어서 게일리(Gallie)외 다수는, 히스톤 스템-루프가 번역 효율을 높이고 번역의 유효 수준을 확립할 때 5'-CAP에 종속적이라는 점에서, 상기 히스톤 스템-루프는 폴리(A) 서열과 기능면에서 유사함을 규명하였다. 이들은, 형질 감염된 중국 햄스터 난소 세포 내 리포터 mRNA의 번역을 증진시키는데 히스톤 스템-루프가 충분하며 또한 필수적이긴 하지만, 이의 기능을 최적으로 발휘하도록 만들기 위해서는 3' 말단에 위치하여야 한다는 것을 보여주었다. 그러므로 다른 mRNA상에 존재하는 폴리(A) 미부와 유사하게, 이와 같은 히스톤 mRNA의 3' 말단은 생체 내 번역에 필수이며, 또한 폴리(A) 미부와 기능면에서도 유사한 것으로 파악된다[Gallie, D. R., Lewis, N. J., & Marzluff, W. F.(1996), Nucleic Acids Research, 24(10), 1954-1962].
뿐만 아니라, SLBP는 세포질 히스톤 mRNA에 결합되어 있으며 이 mRNA의 번역에 필요하다는 것도 알 수 있었다. 심지어 SLBP가 eIF4G와 직접 상호 작용하지 않더라도 히스톤 mRNA의 번역에 필요한 도메인은 최근 확인된 단백질 SLIP1과 상호 작용한다. 추가의 단계에서 SLIP1은 eIF4G와 상호 작용하여 히스톤 mRNA를 환형으로 만들 수 있을 뿐 아니라, 폴리아데닐화된 mRNA의 번역과 유사한 기구에 의해 히스톤 mRNA의 번역을 효율적으로 지속시킬 수 있다.
전술된 바와 같이, 유전자 치료 접근법은 보통 암호화 정보를 세포에 운반하기 위해 DNA를 사용하는데, 이 경우, 이 DNA는 mRNA의 천연 발생 요소들, 특히 5'-CAP 구조 및 3' 폴리(A) 서열을 운반하는 mRNA로 전사되고, 이에 따라서 암호화된 치료 또는 항원 단백질의 발현이 보장된다.
그러나 다수의 경우, 이러한 핵산들을 환자의 세포나 조직에 도입한 다음, 원하는 폴리펩티드들, 즉 이 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드들을 발현하는 것에 바탕을 둔 발현계는, DNA가 사용되었는지 아니면 RNA가 사용되었는지에 상관없이, 발현 수준을 원하는 정도 또는 심지어 필요한 정도, 즉 효율적인 치료를 가능하게 할 수 있는 정도로 나타내지 않는다.
지금까지 선행 기술에서는, 특히 시험관 내 및/또는 생체 내에서 개량된 발현계를 사용하여 암호화된 단백질의 발현 수율을 높이기 위한 상이한 시도들이 행하여졌다. 발현 수율을 높이기 위한 방법으로서 선행 기술에 일반적으로 알려진 방법은 통상 특이 프로모터들과 이에 상응하는 조절 요소들을 포함하는 발현 벡터 또는 카세트를 사용하는 것을 바탕으로 한다. 이러한 발현 벡터 또는 카세트는 통상적으로 특정 세포계에서만 제한적으로 사용되므로, 이와 같은 발현계는 상이한 세포계 내에서 사용될 수 있도록 적응되어야 한다. 이후 이와 같이 적응된 발현 벡터 또는 카세트는 일반적으로 세포에 형질 감염되고, 통상적으로 특이 세포주가 처리됨에 따라서 함께 처리된다. 그러므로 특정 세포 유형에 특이적인 프로모터 및 조절 요소와는 독립적인, 세포 고유의 계에 의해 대상 세포 내에서 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 핵산 분자들이 주로 선호된다. 이와 같은 내용에 있어서 mRNA 안정화 요소들과 mRNA의 번역 효율을 높이는 요소들이 구별될 수 있다.
자체의 암호화 서열 내에서 최적화되는 것으로서, 일반적으로는 이러한 용도로 적당한 mRNA는 국제 특허 출원 공보 WO 제02/098443호(CureVac GmbH)에 기술되어 있다. 예를 들어 WO 제02/098443호에는, 일반적인 형태로 안정화되었으며 자체의 암호화 영역 내에서 번역에 대해 최적화된 mRNA가 기술되어 있다. WO 제02/098443호에는 또한, 서열 변형을 확인하는 방법에 관하여도 개시되어 있다. 뿐만 아니라 WO 제02/098443호에는, 서열의 구아닌/시토신(G/C) 함량을 증가시키기 위한, mRNA 서열 내 아데닌 및 우라실 뉴클레오티드들의 치환 가능성이 기술되어 있다. WO 제02/098443호에 따르면, 이와 같이 G/C 함량을 증가시키기 위한 치환 및 적응은 암 또는 감염성 질환 치료에 있어서 유전자 치료 방법에서 사용될 수 있을 뿐만 아니라 유전자 백신에도 적용될 수 있다고 한다. 이와 같은 내용에 있어서 WO 제02/098443호에는 일반적으로 이와 같은 변형에 사용될 염기 서열인 서열이 예시되어 있는데, 이 경우 변형 mRNA는 하나 이상의 생물학적 활성 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하고, 이 mRNA는 치료될 환자의 체내에서, 예를 들어 전혀 번역되지 않거나, 부적당하게 번역되거나 또는 오류를 동반하며 번역된다고 한다. 대안적으로 WO 제02/098443호는, 이와 같은 변형에 사용되는 염기 서열로서 항원, 예를 들어 종양 항원 또는 바이러스 항원을 암호화하는 mRNA를 제안하고 있다.
암호화된 단백질의 발현을 증가시키기 위한 추가의 접근법에서, 국제 특허 출원 공보 WO 제2007/036366호에는, 길이가 긴(특히 길이가 120bp 이상인) 폴리(A) 서열과, 베타 글로빈 유전자의 3' 비번역 영역 2개 이상을 조합한 서열의, mRNA 안정성과 번역 활성에 대한 긍정적인 영향력이 기술되어 있다.
그러나, 이와 같이 후반부에 언급된 모든 선행 기술(문헌)들은 이미 유전자 치료 접근법의 상당히 효율적인 도구를 제공하고자 노력하였고, 또한 mRNA 안정성과 번역 활성을 개선하고자 노력하였음에도 불구, RNA 기반 방법의 일반적으로 낮은 안정성 대 DNA 백신 및 DNA 기반 유전자 치료 접근법에 관한 문제는 여전히 남아있다. 그러므로, 당 업계에는, 전술된 바와 같은 통상의 치료법에 대해 보완 수단으로 이용되는 치료법 또는 유전자 치료 접근법과 유전자 백신화에 관한 개선된 도구로서, 예를 들어, 바람직하게는 유전자 치료법과 유전자 백신화에 있어서의 mRNA 안정성 및/또는 번역 활성을 더욱 개선함으로써 암호화된 단백질을 생체 내에서 더욱 효과적으로 제공할 수 있는 도구가 제공될 필요성이 여전히 존재한다.
뿐만 아니라, 당 업계에서 달성된 모든 발전에도 불구, 무세포계, 세포 또는 유기체 내 암호화된 펩티드 또는 단백질의 효율적인 발현(재조합 발현)은 여전히 해결해야할 숙제로 남아있다.
그러므로 본 발명에 내재된 목적은, 암 또는 종양 질환을 치료 또는 예방 차원에서 처치함에 있어서, 선행 기술로부터 유전자 백신화에 사용되는 것으로 알려져 있는 핵산들과 관련하여, 바람직하게 mRNA를 추가로 안정화하고/안정화하거나 이러한 mRNA의 번역 효율을 높임으로써, 암호화된 단백질의 발현을 증가시키는 부가적 및/또는 대안적 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적은 첨부된 특허 청구 범위의 청구항들의 발명 주제에 의해 달성된다. 특히 본 발명에 내재된 목적은 제1 양태에 따라서, 바람직하게는 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위하여
a) 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 그리고
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 본 발명의 핵산 서열에 의해 달성된다.
대안적으로, 히스톤 스템-루프 서열[히스톤 유전자, 특히 H1, H2A, H2B, H3 및 H4 군의 히스톤 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 서열] 이외의 임의의 적당한 스템-루프 서열은 본 발명의 양태 및 구체예 전부에 있어서 본 발명에 의해 사용될 수 있다.
이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 제1 양태에 의한 본 발명의 핵산은, 바람직하게 본원에 기술된 바와 같이 DNA 또는 RNA 합성에 의해 적어도 부분적으로 생산되거나 또는 분리된 핵산인 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 본 발명의 발명자들이 발견한 놀라운 사실, 즉 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호와 히스톤 스템-루프 둘 다가 본질적으로 대안적 기구들을 나타냄에도 불구, 상기 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호, 그리고 하나 이상의 히스톤 스템-루프의 조합이 단백질 발현 수준을, 상기 각각의 요소들 중 어느 하나가 존재할 때 관찰되는 수준 이상까지 복합적으로 증가시키는 것으로 보아, 상기 조합은 상승적으로 작용을 한다는 사실을 바탕으로 한다. 폴리(A) 및 하나 이상의 히스톤 스템-루프의 조합의 상승 효과는 폴리(A) 서열 및 히스톤 스템-루프의 순서와는 상관없을 뿐만 아니라, 폴리(A) 서열의 길이와도 상관없는 것으로 보인다.
그러므로 본 발명의 핵산 서열은, 바람직하게 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해서 a) 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역; b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프, 그리고 c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 서열을 포함하거나 암호화하는 것이 특히 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 만일 암호화된 단백질은 히스톤 단백질, 특히 H4, H3, H2A 및/또는 H2B 히스톤 군에 속하는 히스톤 단백질, 히스톤(유사) 기능을 보유하는(즉 뉴클레오좀을 형성하는) 이의 단편, 유도체 또는 변이체가 아닌 것이 바람직할 수 있다. 또한 암호화된 단백질은 통상적으로 H1 히스톤 군의 히스톤 링커 단백질에 상응하지 않는다. 본 발명의 핵산 분자는 통상적으로 마우스 히스톤 유전자의 (5' 및/또는 특히 3'에 존재하는) 임의의 조절 신호, 특히 마우스 히스톤 유전자 H2A의 것이 아닌 조절 신호를 포함하지 않으며, 또한 가장 바람직하게 마우스 히스톤 유전자 H2A614의 것이 아닌 조절 신호도 포함하지 않는다. 특히 본 발명의 핵산 분자는 마우스 히스톤 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 및/또는 히스톤 스템-루프 가공 신호, 특히 마우스 히스톤 유전자 H2A의 것이 아닌 히스톤 스템-루프 및/또는 히스톤 스템-루프 가공 신호와, 가장 바람직하게는 마우스 히스톤 유전자 H2A614의 것이 아닌 히스톤 스템-루프 및/또는 히스톤 스템-루프 가공 신호도 포함하지 않는다.
뿐만 아니라, 본 발명의 핵산은 통상적으로 리포터 단백질(예를 들어 루시퍼라제, GFP, EGFP, β-갈락토시다제, 특히 EGFP), 갈락토키나제(galK) 및/또는 마커 또는 선별 단백질(예를 들어 알파-글로빈, 갈락토키나제 및 잔틴:구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(GPT)) 또는 박테리아 리포터 단백질, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 또는 기타 박테리아 항생제 내성 단백질, 예를 들어 박테리아 자체의 요소(a) 내부 박테리아 neo 유전자 유래 단백질을 제공하지 않는다.
리포터, 마커 또는 선별 단백질은 통상적으로 본 발명에 의한 종양 항원이 아닌 것으로 이해된다. 리포터, 마커 또는 선별 단백질 또는 이 단백질 자체의 원천 유전자는 일반적으로 박테리아, 세포 배양액, 동물 또는 식물에 있어서 연구용 도구로서 사용된다. 상기와 같은 리포터, 마커 또는 선별 단백질 또는 이 단백질 자체의 원천 유전자는 측정될 수 있거나 선별시 이용될 수 있는, 용이하게 식별 가능한 특성을 유기체들이 (바람직하게는 이종) 발현할 수 있도록 만든다. 특히 마커나 선별 단백질은 선별 가능한 기능을 보인다. 통상적으로 이러한 선별 마커 또는 리포터 단백질은 사람이나 다른 포유동물에서는 천연 발생되지 않고, 다른 유기체, 특히 박테리아나 식물로부터 유래된다. 그러므로 포유동물 이외의 종들, 특히 사람 이외의 종들로부터 기원하는 선별 마커 또는 리포터의 기능을 가지는 단백질은 본 발명에 의한 "종양 항원"으로서 작용을 하는 특성을 가지는 단백질로서 이해되지 않는 것이 바람직하다. 특히 선별 마커 또는 리포터 단백질은, 예를 들어 형광도 또는 기타 분광 기술 및 항생제 내성을 기반으로 하는 시험관 내 분석법에 의해, 형질 전환된 세포들이 확인될 수 있도록 만들어준다. 그러므로 형질 전환된 세포에 이와 같은 특성들을 부여하는 선별 리포터 또는 마커 유전자는 통상적으로 생체 내에서 본 발명에 의한 종양 항원으로서 작용을 하는 단백질인 것으로 이해되지 않는다.
임의의 경우, 리포터, 마커 또는 선별 단백질은 보통 어떠한 종양 항원 특성도 발휘하지 않으므로, 종양 질환을 치료상 처치할 수 있는 면역 효과 또한 발휘하지 않는다. 설령, 만일 임의의 단일 리포터, 마커 또는 선별 단백질이 (이것들 자체의 리포터, 선별 또는 마커로서의 기능 이외에) 면역 효과를 나타내더라도, 이러한 리포터, 마커 또는 선별 단백질은 본 발명의 "종양 항원"의 의미에 포함되는 것으로 이해되지 않는 것이 바람직하다.
이와는 대조적으로, 본 발명에 의한 종양 항원(특히 H1, H2A, H2B, H3 및 H4 군의 히스톤 유전자 제외)으로서 작용하는 단백질 또는 펩티드는 통상적으로 선별 마커 또는 리포터로서의 기능을 발휘하지 않는다. 그럼에도 불구, 만일 임의의 단일 "종양 항원"이 (이것 자체의 종양 항원으로서의 기능 이외에) 선별 마커 또는 리포터로서의 기능을 나타낸다면, 이러한 치료 단백질은 본 발명의 "선별 마커 또는 리포터 단백질"의 의미에 포함되는 것으로 이해되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 종양 항원으로서 작용하는 단백질은 포유동물, 특히 사람, 특히 포유동물 종양으로부터 유래되며, 선별 마커 또는 리포터 단백질로서의 역할은 하지 않는 것으로 이해되는 것이 가장 바람직하다. 특히 이와 같은 종양 항원들은 포유동물의 종양, 특히 사람의 종양으로부터 유래한다. 이러한 종양 항원 단백질들은 개체의 면역 반응을 촉발하여 개체의 면역계가 TH1 및/또는 TH2 면역 반응에 의해 자신의 체내에 있는 종양 세포들을 공격할 수 있도록 만듦으로써 개체를 치료할 것이므로, 이 종양 항원 단백질은 항원성인 것으로 이해되고 있다. 그러므로 이와 같은 항원 종양 단백질들은 통상 개체에 발병한 암의 유형을 특징짓는 포유동물 단백질, 특히 사람 단백질이다.
그러므로 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역(a)이 적어도 하나 이상의 히스톤-스템 루프(b), 더욱 넓게는 임의의 적당한 스템-루프에 이종인 것이 바람직하다. 다시 말해서, 본 발명의 내용중 "이종"이란, 하나 이상의 스템-루프 서열이 천연 상태에서는 특정 유전자[본 발명의 핵산의 요소의 (종양 항원) 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자(a)]의 (조절) 서열로서 (예를 들어 3' UTR에) 발생하지 않는 경우를 의미한다. 그러므로 본 발명의 핵산의 (히스톤) 스템-루프는, 바람직하게 본 발명의 핵산의 요소의 암호화 영역(a)을 포함하는 유전자 이외의 유전자의 3' UTR로부터 유래한다. 예를 들어 요소 즉 암호화 영역(a)은, 만일 본 발명의 핵산이 이종이면 히스톤 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체(히스톤 단백질의 기능을 보유하는 것)를 암호화하지 않을 것이지만, 히스톤(유사) 기능 이외의 생물학적 기능, 바람직하게는 종양 항원성 기능을 발휘하는 (동일하거나 상이한 종의) 임의의 기타 펩티드 또는 서열을 암호화할 것이다[예를 들어 (예를 들어 포유동물, 특히 사람의 종양에 대한 백신화의 관점에서 종양 항원성 기능을 발휘하여, 바람직하게는 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 종양 항원을 발현하는 개체의 종양 세포에 대한 면역 반응을 촉발하는) 단백질을 암호화할 것이다].
이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 핵산은
a) 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역;
b) 임의로는 히스톤 스템-루프에 대해 3' 말단 쪽으로 히스톤 하류 요소(HDE)를 포함하지 않는 히스톤 스템-루프 하나 이상; 그리고
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 5'→3' 방향으로 포함하거나 암호화한다.
"히스톤 하류 요소(HDE)"란 용어는, 천연 발생 히스톤 스템-루프의 3' 말단 쪽에 존재하는 퓨린 풍부 폴리뉴클레오티드 구획(약 15~20 뉴클레오티드)으로서, 히스톤 전구 mRNA가 성숙한 히스톤 mRNA로 가공되는데 관여하는 U7 snRNA의 결합 위치를 나타내는 구획을 말한다. 예를 들어 성게의 경우 HDE는 CAAGAAAGA(Dominski, Z. and W. F. Marzluff(2007), Gene 396(2): 373-90)이다.
게다가 본 발명의 제1 양태에 의한 본 발명의 핵산은 인트론을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 또 다른 구체예에서, 본 발명의 제1 양태에 의한 본 발명의 핵산 서열은
a) 암호화 영역, 바람직하게는 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역;
b) 폴리(A) 서열; 그리고
c) 하나 이상의 히스톤 스템-루프
를 5'→3' 방향으로 포함하거나 암호화한다.
본 발명의 제1 구체예에 의한 본 발명의 핵산 서열은, 예를 들어 임의의 (단일 사슬 또는 이중 사슬) DNA, 바람직하게는, 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 단일 사슬 DNA 분자, 이중 사슬 DNA 분자(이에 한정되는 것은 아님)로부터 선택되는 임의의 적당한 핵산을 포함하거나, 아니면, 예를 들어 임의의 PNA(펩티드 핵산)로부터 선택될 수 있거나, 아니면, 예를 들어 임의의(단일 사슬 또는 이중 사슬) RNA, 바람직하게는 메신저 RNA(mRNA) 등으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 바이러스 RNA(vRNA)를 포함할 수도 있다. 그러나 본 발명의 핵산 서열은 바이러스 RNA일 수 없거나 바이러스 RNA를 포함할 수 없다. 더욱 구체적으로 본 발명의 핵산 서열은 바이러스 서열 요소, 예를 들어 바이러스 인핸서 또는 바이러스 프로모터(예를 들어 불활성화되지 않은 바이러스 프로모터 또는 서열 요소, 더욱 구체적으로는 치환 기법에 의해 불활성화되지 않은 바이러스 프로모터 또는 서열 요소), 또는 기타 바이러스 서열 요소, 또는 바이러스나 레트로바이러스 핵산 서열을 포함할 수 없다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 핵산 서열은 레트로바이러스 또는 바이러스 벡터, 또는 변형된 레트로바이러스 또는 바이러스 벡터일 수 없다.
임의의 경우, 본 발명의 핵산 서열은 변형될 수 있거나 또는 변형될 수 없거나, 또는 활성화될 수 있거나 또는 활성화될 수 없는 인핸서 및/또는 프로모터 서열을 포함할 수 있거나 포함할 수 없다. 인핸서 및/또는 프로모터는 식물에서 발현될 수 있거나 발현될 수 없으며/없거나, 진핵 생물에서 발현될 수 있거나 발현될 수 없으며/없거나, 원핵 생물에서 발현될 수 있거나 발현될 수 없다. 본 발명의 핵산 서열은 (자가-스플라이싱) 리보자임을 암호화하는 서열을 포함할 수 있거나 포함할 수 없다.
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 자가-복제성 RNA(레플리콘)일 수 있거나 이 자가-복제성 RNA를 포함할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 핵산 서열은 플라스미드 DNA 또는 RNA, 특히 mRNA이다.
본 발명의 제1 양태에 관한 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산은 시험관 내 전사에 적당한 핵산, 특히 적당한 시험관 내 전사 벡터(예를 들어 시험관 내 전사에 사용되는 특정 프로모터, 예를 들어 T3, T7 또는 Sp6 프로모터를 포함하는 플라스미드 또는 선형 핵산 서열) 내에 포함된 핵산 서열이다.
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 발현계(예를 들어 발현 벡터 또는 플라스미드), 특히 원핵 생물(예를 들어 이.콜라이(E. coli)와 같은 박테리아) 또는 진핵 생물(예를 들어 CHO 세포와 같은 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물이나 동물과 같은 전 유기체(whole organism))의 발현계 내에서의 전사 및/또는 번역에 적당한 핵산에 포함되어 있다.
"발현계"란 용어는, 펩티드, 단백질 또는 RNA, 특히 mRNA의 생산(재조합 발현)에 적당한 계(세포 배양액 또는 전 유기체)를 의미한다.
본 발명의 제1 양태에 의한 본 발명의 핵산 서열은 하나 이상의 히스톤 스템-루프를 포함하거나 암호화한다. 이와 같은 본 발명의 내용에 있어서, 이러한 히스톤 스템-루프는 일반적으로 (그것이 히스톤 스템-루프인지 아닌지에 상관없이) 통상 히스톤 유전자로부터 유래하며, 인접하는 2개의 전체 또는 부분 역전 상보성 서열들의 분자 내 염기쌍을 포함함으로써 스템-루프를 형성한다. 스템-루프는 일반적으로 단일 사슬 DNA, 더욱 일반적으로는 RNA에서 발생할 수 있다. 상기 구조는 또한 헤어핀(hairpin) 또는 헤어핀 루프라고도 알려져 있으며, 보통은 연속 서열 내 스템과 (말단) 루프로 이루어져 있는데, 이 경우, 상기 스템은, 일종의 스페이서(spacer)라고 할 수 있는 짧은 서열(스템-루프 구조의 루프를 구축함)에 의해 분리된 2개의 인접 전체 또는 부분 역전 상보성 서열들에 의해 형성된다. 상기 2개의 전체 또는 부분 역전 인접 상보성 서열들은, 예를 들어 스템-루프 요소, 즉 스템 1과 스템 2로 정의될 수 있다. 이러한 스템-루프는 상기 2개의 전체 또는 부분 역전 인접 상보성 서열들, 예를 들어 스템-루프 요소들, 즉 스템 1과 스템 2가 서로 염기쌍을 형성하며, 그 결과 이중 사슬 핵산 서열 구획(연속 서열상 스템-루프 요소들, 즉 스템 1과 스템 2 사이에 위치하는 짧은 서열에 의해 형성되는, 쌍을 형성하지 않은 루프를 포함하는 구획)이 자체의 말단에 형성될 때 형성된다. 이로써 쌍을 형성하지 않은 루프는 통상적으로 이러한 스템-루프 요소들 중 어느 하나와 염기쌍을 형성할 수 없는 핵산의 한 영역을 나타낸다. 이때 생성된 롤리팝 형상 구조(lollipop-shaped structure)는 다수의 RNA 2차 구조의 중요한 구축 블록이다. 그러므로 스템-루프 구조의 형성은 생성된 스템 및 루프 영역들의 안정성에 의존적이며, 이 경우, 제1 전제 조건은 통상적으로 그 자체가 폴드백(fold back)되어 염기쌍이 형성된 이중 사슬을 형성할 수 있는 서열이 존재해야 한다는 것이다. 염기쌍이 형성된 스템-루프 요소들의 안정성은 자체의 길이, 이 요소에 포함된 미스매치부(mismatch) 또는 돌출부(bulge)의 수[소수의 미스매치부는 특히 길이가 긴 이중 사슬 구획에 통상적으로 관용적임], 그리고 염기쌍이 형성된 영역의 염기 조성에 의해 결정된다. 본 발명의 내용에 있어서, 길이가 3~15개 염기인 루프가 상상될 수 있는데, 이때 더욱 바람직한 루프의 길이는 3~10개 염기이고, 더욱 바람직하게는 3~8개, 3~7개, 3~6개 염기이며, 더더욱 바람직하게는 4~5개 염기이고, 가장 바람직하게는 4개 염기이다. 이중 사슬 구조를 형성하는 스템 서열의 길이는 통상적으로 5~10개 염기이고, 더욱 바람직하게는 5~8개 염기이다.
본 발명의 내용에 있어서, 히스톤 스템-루프는 통상적으로 히스톤 유전자(예를 들어 히스톤 군 H1, H2A, H2B, H3, H4으로부터 유래하는 유전자)로부터 유래하며, 인접하는 2개의 전체 또는 부분 역전 상보성 서열들의 분자 내 염기쌍을 포함함으로써 스템-루프를 형성한다. 통상적으로 히스톤의 3' UTR 스템-루프는 히스톤 mRNA의 핵세포질 운반과, 세포질 내 안정성 및 번역 효율 조절에 관여하는 RNA 요소이다. 후생 동물 히스톤 유전자의 mRNA는 폴리아데닐화 미부 및 폴리-A 미부를 가지지 않는 대신, 고도로 보존된 스템-루프와 퓨린 풍부 영역(약 20 뉴클레오티드 하류)(히스톤 하류 요소 또는 HDE) 간 어느 위치에서 3' 말단 가공이 일어난다. 히스톤 스템-루프는 31kDa의 스템-루프 결합 단백질(SLBP - 히스톤 헤어핀 결합 단백질 또는 HBP라고도 칭하여짐)에 의해 결합된다. 이와 같은 히스톤 스템-루프 구조는 바람직하게 다른 서열 요소들 및 구조들[즉 히스톤 유전자 내 천연 상태에서는("형질 전환되지 않은 생 유기체/세포 내에서는"을 의미함) 생성되지 않지만, (본 발명에 따라서) 조합되었을 때 인위적인 이종 핵산을 제공하는 요소들 및 구조들]과 함께 본 발명에 의해 이용된다. 그러므로 본 발명은, 특히 히스톤 스템-루프 구조와 다른 이종 서열 요소들[히스톤 유전자 또는 후생 동물 히스톤 유전자 내에서 발생하지 않으며, 히스톤 이외의 단백질을 암호화하는 유전자의 (전사 및/또는 번역에 영향을 미치는) 작동 서열 영역 및/또는 조절 서열 영역으로부터 분리된 요소들]의 인위적(비천연) 조합이 유리한 효과를 제공한다는 발견을 바탕으로 한다. 그러므로 본 발명의 하나의 양태는, 후생 동물 히스톤 유전자에서는 발생하지 않는 서열(폴리아데닐화 신호(암호화 영역의 3'-말단)를 나타내는 서열) 또는 폴리(A) 서열과 히스톤 스템-루프 구조의 조합을 제공한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 의하면, 바람직하게 후생 동물의 히스톤 유전자 내에서 발생하지 않는, 종양 항원 단백질을 암호화하는 암호화 영역과 히스톤 스템-루프의 조합이 이러한 양태와 함께 제공된다[이 경우, 암호화 영역과 히스톤 스템-루프 서열은 이종임]. 만일 이와 같은 종양 항원이 포유동물, 바람직하게는 (종양 질환을 앓고 있는) 사람의 체내에서 발생한다면 바람직할 것이다. 또 다른 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산의 모든 요소들 (a), (b) 및 (c)는 서로 이종이며, 3개의 상이한 공급원, 예를 들어 (a) 사람의 유전자로부터 유래하는 종양 항원 단백질 암호화 영역, (b) 후생 동물, 예를 들어 포유동물, 사람 이외의 동물 또는 사람의 히스톤 유전자의 비번역 영역으로부터 유래하는 히스톤 스템-루프, 그리고 (c) 히스톤 유전자 이외의 유전자와, 본 발명의 핵산의 요소 (a)에 의한 종양 항원 암호화 영역의 비번역 영역 이외의 유전자의, 예를 들어 비번역 영역으로부터 유래하는 폴리아데닐화 신호 또는 폴리(A) 서열로부터 유래하는 모든 요소들은 인위적으로 조합된다.
그러므로 히스톤 스템-루프는 본원에 기술된 바와 같은 스템-루프 구조로서, 바람직하게 기능에 따라서 정의된다면 자체의 천연 결합 파트너, 즉 스템-루프 결합 단백질(SLBP; 히스톤 헤어핀 결합 단백질 또는 HBP라고도 칭하여짐)과 결합하는 특성을 나타내는/보유하는 스템-루프 구조이다.
본 발명에 의하면, 청구항 1의 구성 요소 (b)에 의한 히스톤 스템-루프 서열은 마우스 히스톤 단백질로부터 유래할 수 없다. 더욱 구체적으로 히스톤 스템-루프 서열은 마우스 히스톤 유전자 H2A614로부터 유래할 수 없다. 또한, 본 발명의 핵산은 마우스 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 없을 뿐만 아니라 마우스 히스톤 유전자 H2A614도 포함할 수 없다. 뿐만 아니라, 본 발명의 핵산 서열은 스템-루프 가공 신호, 더욱 구체적으로 마우스 히스톤 가공 신호를 포함할 수 없으며, 가장 구체적으로 본 발명의 핵산 서열은, 심지어 만일 본 발명의 핵산 서열이 하나 이상의 포유동물 히스톤 유전자를 포함할 수 있을지라도, 마우스 스템-루프 가공 신호 H2kA614를 포함할 수 없다. 그러나 하나 이상의 포유동물 히스톤 유전자는 WO 제01/12824호의 서열 번호 7의 서열일 수 없다.
본 발명의 제1 양태에 관한 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 하나 이상의 히스톤 스템-루프 서열, 바람직하게는 하기 화학식 I 또는 II 중 하나 이상에 따른 하나 이상의 히스톤 스템-루프 서열을 포함하거나 암호화한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
[화학식 II]
Figure pct00002
상기 식 중,
스템 1 또는 스템 2 경계 요소(bordering element)인 N1 -6 은 1~6개, 바람직하게는 2~6개, 더욱 바람직하게는 2~5개, 더더욱 바람직하게는 3~5개, 가장 바람직하게는 4~5개 또는 5개의 N으로 이루어진 연속 서열이되, N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고;
스템 1 [N0 -2GN3 -5]는 요소, 즉 스템 2와 역행 상보성 또는 부분 역행 상보성으로서, 5~7개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
N0 -2는 0~2개, 바람직하게는 0~1개, 더욱 바람직하게는 1개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
N3 -5는 3~5개, 바람직하게는 4~5개, 더욱 바람직하게는 4개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고,
G는 구아노신 또는 이의 유사체로서, 시티딘 또는 이의 유사체에 의해 임의로 치환될 수 있되, 다만 스템 2 내 이의 상보성 뉴클레오티드인 시티딘은 구아노신에 의해 치환되며;
루프 서열 [N0 -4(U/T)N0-4]은 요소들, 즉 스템 1과 스템 2 사이에 위치하는 서열로서, 3~5개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
N0 -4는 각각 독립적으로 0~4개, 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 1~2개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고,
U/T는 우리딘 또는 임의로는 티미딘을 나타내며;
스템 2 [N3 -5CN0 -2]는 요소, 즉 스템 1과 역행 상보성 또는 부분 역행 상보성으로서, 5~7개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
N3 -5는 3~5개, 바람직하게는 4~5개, 더욱 바람직하게는 4개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
N0 -2는 0~2개, 바람직하게는 0~1개, 더욱 바람직하게는 1개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 또는 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
C는 시티딘 또는 이의 유사체로서, 구아노신 또는 이의 유사체에 의해 임의로 치환될 수 있되, 다만 스템 1 내 이의 상보성 뉴클레오티드인 구아노신은 시티딘에 의해 치환되며;
상기 스템 1 및 스템 2는 서로 염기쌍을 형성하여 역행 상보성 서열을 형성할 수 있는데, 이 경우, 염기쌍 형성은, 예를 들어 뉴클레오티드 A 및 U/T 또는 G및 C 간 왓슨-크릭 염기쌍 형성 법칙, 또는 비 왓슨-크릭 염기쌍 형성 법칙, 예를 들어 워블 염기쌍 형성 법칙, 역 왓슨-크릭 염기쌍 형성 법칙, 훅스틴 염기쌍 형성 법칙, 역 훅스틴 염기쌍 형성 법칙에 의해 스템 1과 스템 2 사이에서 이루어질 수 있거나, 또는 상기 스템 1 및 스템 2는 서로 염기쌍을 형성하여 부분 역행 상보성 서열을 형성할 수 있는데, 이 경우, 하나의 스템 내에 존재하는 하나 이상의 염기들은 다른 스템의 역행 상보성 서열 내 상보성 염기를 가지지 않는다는 원리에 입각하여, 스템 1과 스템 2 사이에는 불완전 염기쌍 형성이 이루어질 수 있다.
전술된 내용에 있어서, 워블 염기쌍 형성 법칙은 통상적으로 2개의 뉴클레오티드 간 비 왓슨-크릭 염기쌍 형성 법칙이다. 본 발명의 내용중 사용될 수 있는 4개의 주요 워블 염기쌍들은 구아노신-우리딘, 이노신-우리딘, 이노신-아데노신, 이노신-시티딘(G-U/T, I-U/T, I-A 및 I-C), 그리고 아데노신-시티딘(A-C)이다.
따라서 본 발명의 내용에 있어서, 워블 염기는 전술된 바와 같은 추가의 염기와 워블 염기쌍을 형성하는 염기이다. 그러므로 비 왓슨-크릭 염기쌍 형성, 예를 들어 워블 염기쌍 형성은 본 발명에 의한 히스톤 스템-루프 구조의 스템 내에서 일어날 수 있다.
전술된 내용중, 부분 역행 상보성 서열은 스템 1과 스템 2의 염기쌍 형성에 의해 형성된 스템-루프 서열의 스템 구조 내에 최대 2개, 바람직하게는 오로지 하나의 미스매치부를 포함한다. 다시 말해서, 스템 1과 스템 2는, 바람직하게 스템 1과 스템 2의 서열 전체에 걸쳐[올바른 왓슨-크릭 또는 비 왓슨-크릭 염기쌍 형성이 100% 일어날 수 있는 범위에서] 서로 (전체적으로) 염기쌍을 형성하여, 역행 상보성 서열을 형성할 수 있다는 것인데, 이때, 각각의 염기는 상보성 결합 파트너로서 자체의 올바른 왓슨-크릭 또는 비 왓슨-크릭 염기 현수체(base pendant)를 가진다. 대안적으로 스템 1 및 스템 2는 스템 1 및 스템 2 전체 서열에 걸쳐서 서로 부분적으로 염기쌍을 형성할 수 있는 것이 바람직한데, 이 경우, 일어날 수 있는 올바른 왓슨-크릭 또는 비 왓슨-크릭 염기쌍 형성 범위 100% 중 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상에는 올바른 왓슨-크릭 또는 비 왓슨-크릭 염기쌍들이 차지하게 되고, 나머지 염기들 중 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하는 쌍을 형성하지 않게 된다.
본 발명의 제1 양태에 관한 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 (스템 경계 요소들을 가지는) 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상의 길이는 약 15~약 45 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15~약 40 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15~약 35 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15~약 30 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 20~약 30 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 약 24~약 28 뉴클레오티드이다.
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 (스템 경계 요소들을 가지지 않는) 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상의 길이는 약 10~약 30 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10~약 20 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 12~약 20 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14~약 20 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 16~약 17 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 약 16 뉴클레오티드이다.
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에 의하면, 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 아미노산 서열은 하기 구체적 화학식 Ia 또는 IIa 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상을 포함할 수 있거나 암호화할 수 있다:
[화학식 Ia]
Figure pct00003
[화학식 IIa]
Figure pct00004
상기 식 중,
N, C, G, T 및 U는 상기 정의된 바와 같다.
제1 양태에 관한 추가의 더욱 특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 하기 구체적 화학식 Ib 또는 IIb 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상을 포함할 수 있거나 암호화할 수 있다:
[화학식 Ib]
Figure pct00005
[화학식 IIb]
Figure pct00006
상기 식 중,
N, C, G, T 및 U는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 제1 양태에 관한 더더욱 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 서열은, 대안적으로 자체의 스템-루프 구조와, 실시예 1에 따라서 제조된 히스톤-루프 서열들을 나타내는 선형 서열로서 보인, 하기 구체적 화학식 Ic~Ih 또는 IIc~IIh 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상을 포함할 수 있거나 암호화할 수 있다:
[화학식 Ic]
Figure pct00007
[화학식 IIc]
Figure pct00008
[화학식 Id]
Figure pct00009
[화학식 IId]
Figure pct00010
[화학식 Ie]
Figure pct00011
[화학식 IIe]
Figure pct00012
[화학식 If]
Figure pct00013
[화학식 IIf]
Figure pct00014
[화학식 Ig]
Figure pct00015
[화학식 IIg]
Figure pct00016
[화학식 Ih]
Figure pct00017
[화학식 IIh]
Figure pct00018
상기 화학식 Ic~Ih 또는 IIc~IIh 각각에 있어서,
N, C, G, A, T 및 U는 상기 정의된 바와 같고;
각각의 U는 T에 의해 치환될 수 있으며;
스템 요소 1 및 2 중 (고도로) 보존된 G 또는 C는 각각 자체의 상보성 뉴클레오티드 염기 C 또는 G에 의해 치환될 수 있되, 다만, 상응하는 스템 내 자체의 상보성 뉴클레오티드는, 나란히 존재하는 자체의 상보성 뉴클레오티드에 의해 치환되고/치환되거나;
G, A, T, U, C, R, Y, M, K, S, W, H, B, V, D 및 N은 이하 표에 정의된 뉴클레오티드 염기들과 같다:
축약어 뉴클레오티드 염기 비고
G G 구아닌
A A 아데닌
T T 티민
U U 우라실
C C 시토신
R G 또는 A 퓨린
Y T/U 또는 C 피리미딘
M A 또는 C 아미노
K G 또는 T/U 케토
S G 또는 C 강(H 결합 3개)
W A 또는 T/U 약(H 결합 2개)
H A 또는 C 또는 T/U G는 아님
B G 또는 T/U 또는 C A는 아님
V G 또는 C 또는 A T/U는 아님
D G 또는 A 또는 T/U C는 아님
N G 또는 C 또는 T/U 또는 A 임의의 염기
* 존재하거나
존재하지 않음		 염기는 존재할 수 있거나 존재할 수 없음
상기 내용중, 본 발명의 화학식 I 또는 Ia ~ Ih, 또는 II 또는 IIa ~ IIh 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열은 천연 발생 히스톤 스템-루프 서열로부터 선택되고, 더욱 특히 바람직하게는 원생 동물 또는 후생 동물 히스톤 스템-루프 서열로부터 선택되며, 더더욱 특히 바람직하게는 척추 동물 히스톤 스템-루프 서열로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 포유동물 히스톤 스템-루프 서열, 특히 사람 히스톤 스템-루프 서열로부터 선택된다.
제1 양태에 관한 특히 바람직한 구체예에 의하면, 본 발명의 구체적 화학식 I 또는 Ia ~ Ih, 또는 II 또는 IIa ~ IIh 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열은 각각의 뉴클레오티드 위치에, 도 1~5에 보인 바와 같이, 후생 동물 및 원생 동물(도 1), 원생 동물(도 2), 후생 동물(도 3), 척추 동물(도 4) 및 사람(도 5)의 천연 발생 히스톤 스템-루프 서열들 중 가장 빈번히 발생하는 뉴클레오티드, 또는 가장 빈번히 발생하거나 두 번째로 가장 빈번히 발생하는 뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 히스톤 스템-루프 서열이다. 이와 같은 내용에 있어서, 모든 뉴클레오티드 중 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상은 천연 발생 히스톤 스템-루프 서열들 중 가장 빈번히 발생하는 뉴클레오티드에 상응하는 것이 특히 바람직하다.
제1 양태에 관한 추가의 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 구체적 화학식 I 또는 Ia ~ Ih 중 하나 이상에 의한 히스톤 스템-루프 서열은, 실시예 1에 따라서 제조된 히스톤 스템-루프 서열들을 나타내는 (스템 경계 요소들을 가지지 않는) 하기 히스톤 스템-루프 서열들로부터 선택된다:
VGYYYYHHTHRVVRCB(화학식 Ic에 따른 서열 번호 13의 서열)
SGYYYTTYTMARRRCS(화학식 Ic에 따른 서열 번호 14의 서열)
SGYYCTTTTMAGRRCS(화학식 Ic에 따른 서열 번호 15의 서열)
DGNNNBNNTHVNNNCH(화학식 Ie에 따른 서열 번호 16의 서열)
RGNNNYHBTHRDNNCY(화학식 Ie에 따른 서열 번호 17의 서열)
RGNDBYHYTHRDHNCY(화학식 Ie에 따른 서열 번호 18의 서열)
VGYYYTYHTHRVRRCB(화학식 If에 따른 서열 번호 19의 서열)
SGYYCTTYTMAGRRCS(화학식 If에 따른 서열 번호 20의 서열)
SGYYCTTTTMAGRRCS(화학식 If에 따른 서열 번호 21의 서열)
GGYYCTTYTHAGRRCC(화학식 Ig에 따른 서열 번호 22의 서열)
GGCYCTTYTMAGRGCC(화학식 Ig에 따른 서열 번호 23의 서열)
GGCTCTTTTMAGRGCC(화학식 Ig에 따른 서열 번호 24의 서열)
DGHYCTDYTHASRRCC(화학식 Ih에 따른 서열 번호 25의 서열)
GGCYCTTTTHAGRGCC(화학식 Ih에 따른 서열 번호 26의 서열)
GGCYCTTTTMAGRGCC(화학식 Ih에 다른 서열 번호 27의 서열)
뿐만 아니라, 이러한 내용에 있어서, 구체적 화학식 II 또는 IIa ~ IIh 중 하나에 따른 서열로서, 실시예 1에 따라서 제조된, (스템 경계 요소들을 가지는) 이하 히스톤 스템-루프 서열들이 특히 바람직하다:
H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N*(화학식 IIc에 따른 서열 번호 28의 서열)
M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H*(화학식 IIc에 따른 서열 번호 29의 서열)
M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(화학식 IIc에 따른 서열 번호 30의 서열)
N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N*(화학식 IIe에 따른 서열 번호 31의 서열)
N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N*(화학식 IIe에 따른 서열 번호 32의 서열)
N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H*(화학식 IIe에 따른 서열 번호 33의 서열)
H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N*(화학식 IIf에 따른 서열 번호 34의 서열)
M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H*(화학식 IIf에 따른 서열 번호 35의 서열)
M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H*(화학식 IIf에 따른 서열 번호 36의 서열)
H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M*(화학식 IIg에 따른 서열 번호 37의 서열)
H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M*(화학식 IIg에 따른 서열 번호 38의 서열)
M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M*(화학식 IIg에 따른 서열 번호 39의 서열)
N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB*N*H*(화학식 IIh에 따른 서열 번호 40의 서열)
H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M*(화학식 IIh에 따른 서열 번호 41의 서열)
H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M*(화학식 IIh에 따른 서열 번호 42의 서열)
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 구체적 화학식 I 또는 Ia ~ Ih, 또는 II 또는 IIa ~ IIh 중 하나 이상에 따른 히스톤 스템-루프 서열 내 100% 미만만큼 보존된 뉴클레오티드, 또는 천연 발생 히스톤 스템-루프 서열과 서열 동일성을 약 80% 이상, 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 또는 더더욱 바람직하게는 약 95% 이상 보이는 히스톤 스템-루프 서열 하나 이상을 포함하거나 암호화한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 히스톤 스템-루프 서열은 루프 서열 5'-UUUC-3'을 포함하지 않는다. 더욱 구체적으로 히스톤 스템-루프는 스템 1 서열 5'-GGCUCU-3' 및/또는 스템 2 서열 5'-AGAGCC-3'을 각각 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 스템-루프 서열은 루프 서열 5'-CCUGCCC-3' 또는 루프 서열 5'-UGAAU-3'를 포함하지 않는다. 더욱 구체적으로 스템-루프는 스템 1 서열 5'-CCUGAGC-3'을 포함하지 않거나, 또는 스템 1 서열 5'-ACCUUUCUCCA-3' 및/또는 스템 2 서열 5'-GCUCAGG-3' 또는 5'-UGGAGAAAGGU-3'을 각각 포함하지 않는다. 또한 본 발명이 특히 히스톤 스템-루프 서열들에 한정되지 않는 한, 스템-루프 서열들은 포유동물 인슐린 수용체의 3' 비번역 영역으로부터 유래하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게 본 발명의 핵산은 히스톤 스템-루프 가공 신호를 포함할 수 없으며, 특히 마우스 히스톤 유전자 H2A614 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 가공 신호(H2kA614)를 포함할 수 없다.
본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 서열은 임의로 폴리(A) 서열을 포함하거나 암호화할 수 있다. 이러한 폴리(A) 서열이 존재할 때, 이 폴리(A) 서열은 약 25~약 400개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 바람직하게는 약 30개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 더욱 바람직하게는 약 50~약 400개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 더욱 바람직하게는 약 50~약 300개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 더더욱 바람직하게는 약 50~약 250개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 가장 바람직하게는 약 60~약 250개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함한다. 이와 같은 내용에 있어서, "약"이란 용어는, 상기 "약" 다음에 오는 수치(들)가 이 수치의 ±10% 편차 범위 내에 있음을 말한다. 그러므로 폴리(A) 서열은 25개 이상 또는 25개보다 많은 아데노신 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 30개 이상의 아데노신 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로, 이와 같은 폴리(A) 서열은 통상 20개 미만의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 더욱 구체적으로 폴리(A) 서열은 10개 및/또는 10개 미만의 아데노신 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
바람직하게 본 발명에 따른 핵산은 다음과 같은 구성 성분들로 이루어진 군의 구성 성분들 중 하나 또는 2개 또는 하나 이상 또는 하나를 제외한 전부 또는 전부를 포함하지 않는다: 리보자임(바람직하게는 자가-스플라이싱 리보자임)을 암호화하는 서열, 바이러스 핵산 서열, 히스톤 스템-루프 가공 신호, 특히 마우스 히스톤 H2A614 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 가공 서열, Neo 유전자, 불활성화된 프로모터 서열 및 불활성화된 인핸서 서열. 더욱 바람직하게 본 발명에 의한 핵산은 리보자임, 바람직하게는 자가-스플라이싱 리보자임과, 다음과 같은 구성 성분들로 이루어진 군의 일원을 포함하지 않는다: Neo 유전자, 불활성화된 프로모터 서열, 불활성화된 인핸서 서열, 히스톤 스템-루프 가공 신호, 특히 마우스 히스톤 H2A614 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 가공 서열. 그러므로 상기 핵산은 바람직한 형태로 리보자임, 바람직하게는 자가-스플라이싱 리보자임을 포함할 수 없을뿐더러, Neo 유전자도 포함할 수 없으며, 대안적으로는 리보자임, 바람직하게는 자가-스플라이싱 리보자임을 포함할 수 없을뿐더러, (예를 들어 일반적으로 선별에 사용되는) 임의의 내성 유전자도 포함할 수 없다. 다른 바람직한 형태로, 본 발명의 핵산은 리보자임, 바람직하게는 자가-스플라이싱 리보자임을 포함할 수 없을뿐더러, 히스톤 스템-루프 가공 신호, 특히 마우스 히스톤 H2A614 유전자로부터 유래하는 히스톤 스템-루프 가공 서열도 포함할 수 없다.
대안적으로, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 임의로 폴리아데닐화 신호[즉 본원에 특이 단백질 인자들(예를 들어 절단 및 폴리아데닐화 특이성 인자(CPSF), 절단 자극 인자(CstF), 절단 인자 I 및 II(CF I 및 CF II), 폴리(A) 중합 효소(PAP)에 의해 (전사된) mRNA를 폴리아데닐화시키는 신호로서 정의된 신호]를 포함하기도 한다. 이와 같은 내용에 있어서, 공통 폴리아데닐화 신호는 NN(U/T)ANA 공통 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 폴리아데닐화 신호는 다음과 같은 서열들 중 하나를 포함한다: AA(U/T)AAA 또는 A(U/T)(U/T)AAA [여기서, 우리딘은 보통 RNA에 존재하고, 티미딘은 보통 DNA에 존재함]. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 핵산에 사용된 폴리아데닐화 신호는 U3 snRNA, U5, 사람 유전자 G-CSF 유래 폴리아데닐화 가공 신호, 또는 SV40 폴리아데닐화 신호 서열에 상응하지 않는다. 특히 상기 폴리아데닐화 신호들은 임의의 항생제 내성 유전자(또는 기타 임의의 리포터, 마커 또는 선별 유전자)와 결합하지 않으며, 특히 내성 neo 유전자(네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자)와 (본 발명의 핵산의 요소 (a)에 따른 암호화 영역의 유전자로서) 본 발명의 핵산 내에서 결합하지 않는다. 또한 상기 폴리아데닐화 신호들 중 임의의 것은 바람직하게 본 발명의 핵산 내에서 히스톤 스템-루프 또는 히스톤 스템-루프 가공 신호(마우스 히스톤 유전자 H2A614 유래)와 결합하지 않는다.
본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 서열은 또한 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 암호화할 수 있다.
종양 항원들은 바람직하게 (예를 들어 전신 또는 고형 종양 질환에 있어서) 포유동물, 특히 사람 종양을 특징짓는 (종양) 세포의 표면상에 존재한다. 종양 항원은 또한 정상 세포보다는 종양 세포에서 과발현되는 단백질들로부터 선택될 수도 있다. 뿐만 아니라, 종양 항원은, 그 자체가 변형이 일어난 것은 아니지만(또는 원래부터 그 자체가 변형되어 있던 것은 아니지만) 추측되는 종양과 연관된, 세포 내에서 발현되는 항원들도 포함한다. 종양 지원 혈관 또는 이 혈관의 (재)형성과 관련된 항원들, 특히 혈관 신생과 연관된 항원들, 예를 들어 성장 인자, 예를 들어 VEGF, bFGF 등도 본 발명에 포함된다. 뿐만 아니라 종양과 연관된 항원들은 통상 종양을 내포하는 세포나 조직으로부터 유래하는 항원을 포함한다. 또한 일부 물질들(보통은 단백질 또는 펩티드)은 (알려져 있거나 알려져 있지 않은) 암 질환을 앓고 있는 환자 내에서 발현되고, 상기 환자의 체액 중에 높은 농도로 발생한다. 이러한 물질들은 또한 "종양 항원"이라고도 칭하여지지만, 항원은 면역 반응을 유도하는 물질이라는 점에서 엄격한 의미로는 항원이 아니다. 종양 항원 군은 추가로 종양 특이 항원(Tumor Specific Antigen; TSA)과 종양 연관 항원(Tumor Associated Antigen; TAA)으로 분류될 수 있다. TSA는 오로지 종양 세포에 의해서만 제시될 수 있는 것이지, 정상의 "건강한" 세포에 의해서는 제시될 수 없는 것이다. TSA는 통상 종양 특이 돌연 변이로부터 유도된다. 더욱 일반적으로 발생하는 TAA는 일반적으로 종양과 건강한 세포 둘 다에 의해 제시된다. 이 항원들은 인지되고, 이 항원의 항원 제시 세포는 이와 같은 세포 독성 T 세포에 의해 파괴될 수 있다. 더욱이 종양 항원은 또한 종양의 표면상에, 예를 들어 돌연 변이된 수용체의 형태로 발생할 수도 있다. 이와 같은 경우, 종양 항원은 항체에 의해 인지될 수 있다.
뿐만 아니라 종양 연관 항원은 조직 특이 항원(멜라닌 세포 특이 항원이라고도 칭하여짐), 암-고환 항원 및 종양 특이 항원으로 분류될 수도 있다. 암-고환 항원은 통상 다양한 종양 내에서 활성화될 수 있는 생식 계열 연관 유전자의 펩티드 또는 단백질인 것으로 이해된다. 사람의 암-고환 항원은 추가로 X 염색체상에서 암호화되는 항원(소위 CT-X 항원이라 칭하여짐)과, X 염색체상에서 암호화되지 않는 항원(소위 비 X CT 항원이라 칭하여짐)으로 분류될 수 있다. X 염색체상에서 암호화되는 암-고환 항원은, 예를 들어 흑색종 항원 유전자군(소위 MAGE군)을 포함한다. 상기 MAGE군의 유전자는 공유되는 MAGE 상동성 도메인(MHD)에 의해 특징지워질 수 있다. 이러한 항원들, 즉 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 및 종양 특이 항원은 각각 자가 세포 면역 반응 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러므로 본 발명의 핵산에 의해 암호화되는 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원인 것이 바람직하며, 또한 상기와 같은 항원은 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원일 수 있다.
특히 바람직한 종양 항원들은, 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-조효소 A 라세마제, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA15-3/CA27-29, CA19-9, CA72-4, CA125, 칼레티큘린, CAMEL, CASP-8/m, 카텝신 B, 카텝신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신 유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, C텐, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, F라우-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미성숙 라미닌 수용체, 칼리크레인-2, 칼리크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈 A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 매트릭스 단백질 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 군 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-B, NY-ESO-1, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로티나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1 및 WT1으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 이와 같은 종양 항원들은 p53, CA125, EGFR, Her2/neu, hTERT, PAP, MAGE-A1, MAGE-A3, 메소텔린, MUC-1, GP100, MART-1, 티로시나제, PSA, PSCA, PSMA, STEAP-1, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Ras, CEA 또는 WT1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것이 바람직하며, PAP, MAGE-A3, WT1 및 MUC-1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 종양 항원들은 MAGE-A1(예를 들어 기탁 번호 M77481에 의한 MAGE-A1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6(예를 들어 기탁 번호 NM_005363에 의한 MAGE-A6), MAGE-C1, MAGE-C2, 멜란-A(예를 들어 기탁 번호 NM_005511에 의한 멜란-A), GP100(예를 들어 기탁 번호 M77348에 의한 GP100), 티로시나제(예를 들어 기탁 번호 NM_000372에 의한 티로시나제), 서바이빈(예를 들어 기탁 번호 AF077350에 의한 서바이빈), CEA(예를 들어 기탁 번호 NM_004363에 의한 CEA), Her-2/neu(예를 들어 기탁 번호 M11730에 의한 Her-2/neu), WT1(예를 들어 기탁 번호 NM_000378에 의한 WT1), PRAME(예를 들어 기탁 번호 NM_006115에 의한 PRAME), EGFRI(상피 성장 인자 수용체 1)(예를 들어 기탁 번호 AF288738에 의한 EGFRI(상피 성장 인자 수용체 1)), MUC1, 뮤신-1(예를 들어 기탁 번호 NM_002456에 의한 뮤신-1), SEC61G(예를 들어 기탁 번호 NM_014302에 의한 SEC61G), hTERT(예를 들어 기탁 번호 NM_198253에 의한 hTERT), 5T4(예를 들어 기탁 번호 NM_006670에 의한 5T4), TRP-2(예를 들어 기탁 번호 NM_001922에 의한 TRP-2), STEAP1, PCA, PSA, PSMA 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것이 바람직하다.
또한 종양 항원은 암 또는 종양 질환, 특히 림프종 또는 림프종 관련 질환과 연관된 이디오타입 항원(idiotypic antigen)을 포함할 수도 있는데, 여기서, 상기 이디오타입 항원은 림프양 혈액 세포의 면역글로불린 이디오타입 또는 림프양 혈액 세포의 T 세포 수용체 이디오타입이다.
암 또는 종양 질환의 치료용인 종양 항원 단백질은 통상 포유동물 기원, 바람직하게는 사람 기원 단백질이다. 이 단백질의 개체 치료를 위한 선별은 치료될 종양의 유형과 각각의 종양의 발현 프로필에 의존적이다. 전립선암을 앓고 있는 사람은, 예를 들어 통상 전립선 암종 내에서 발현되거나(또는 과발현되거나) 치료될 개체 내에서 특히 과발현되는 종양 항원, 예를 들어 PSMA, PSCA 및/또는 PSA 중 임의의 것에 의해 치료되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산의 암호화 영역은 1 시스트론, 2 시스트론 또는 심지어 다중 시스트론 핵산, 즉 1개, 2개 또는 그 이상의 단백질 또는 펩티드의 암호화 서열을 운반하는 핵산으로서 발생할 수 있다. 이와 같이 2 시스트론 또는 심지어 다중 시스트론 핵산 내 암호화 서열들은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 내부 리보좀 도입 위치(IRES) 서열 하나 이상, 또는 수 개의 단백질들 또는 펩티드들을 포함하는 폴리펩티드의 절단을 유도하는 신호 펩티드에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 암호화 영역을 포함한다. 바람직하게 암호화된 종양 항원은 히스톤 단백질이 아니다. 본 발명의 내용에 있어서, 이와 같은 히스톤 단백질은 통상 DNA가 뉴클레오좀이라 불리는 구조 단위로 포장되도록 명령받는 장소인 진핵 생물 세포의 핵에서 발견되는 강 알칼리성 단백질이다. 히스톤 단백질은 크로마틴의 주요 단백질 구성 성분으로서, 그 주위를 DNA가 감싸는 일종의 실패(spool)로서의 역할을 하고, 유전자 조절에 관여한다. 히스톤이 없으면 염색체 내 DNA는 풀릴 것이며, 그 길이는 매우 길 것이다[사람 DNA의 경우 길이 대 폭의 비율은 107 이상 대 1임]. 예를 들어 각각의 사람 세포의 DNA는 그 길이가 약 1.8 미터이지만, 이 사람 세포 DNA가 히스톤에 감기면 크로마틴의 형태로서 그 길이가 약 90 밀리미터가 되며, 유사 분열시 복제 및 응축됨으로 인하여 그 길이는 염색체의 형태로서 약 120 마이크로미터가 된다. 더욱 바람직하게 본 발명의 내용에 있어서 이와 같은 히스톤 단백질은 통상 다음과 같은 5개의 히스톤 주요 군들, 즉 H1/H5, H2A, H2B, H3 및 H4" 중 하나로부터 선택되거나, 바람직하게는 포유동물 히스톤으로부터 선택되거나, 더욱 바람직하게는 사람 히스톤 또는 히스톤 단백질로부터 선택되는, 고도로 보존된 단백질로서 정의된다. 이와 같은 히스톤 또는 히스톤 단백질은 통상 2개의 상위 군, 즉 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 포함하는 코어 히스톤(core histone)과, 히스톤 H1 및 H5를 포함하는 링커 히스톤(linker histone)으로 조직된다.
이러한 내용에 있어서, 바람직하게는 계류중인 발명의 보호 범위로부터 제외되는 링커 히스톤, 바람직하게는 포유동물 링커 히스톤, 더욱 바람직하게는 사람 링커 히스톤은 통상 H1, 예를 들어 H1F, 특히 예를 들어 H1F0, H1FNT, H1FOO, H1FX 및 H1H1, 특히 예를 들어 HIST1H1A, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H1T로부터 선택된다.
뿐만 아니라, 바람직하게는 계류중인 발명의 보호 범위로부터 제외되는 코어 히스톤, 바람직하게는 포유동물 코어 히스톤, 더욱 바람직하게는 사람 코어 히스톤은 통상 H2A, 예를 들어 H2AF, 특히 예를 들어 H2AFB1, H2AFB2, H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2, H2AFZ 및 H2A1, 특히 예를 들어 HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL, HIST1H2AM 및 H2A2, 특히 예를 들어 HIST2H2AA3, HIST2H2AC; H2B, 예를 들어 H2BF, 특히 예를 들어 H2BFM, H2BFO, H2BFS, H2BFWT H2B1, 특히 예를 들어 HIST1H2BA, HIST1H2BB, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BE, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI, HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BM, HIST1H2BN, HIST1H2BO 및 H2B2, 특히 예를 들어 HIST2H2BE; H3, 예를 들어 H3A1, 특히 예를 들어 HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J 및 H3A2, 특히 예를 들어 HIST2H3C 및 H3A3, 특히 예를 들어 HIST3H3; H4, 예를 들어 H41, 특히 예를 들어 HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4J, HIST1H4K, HIST1H4L 및 H44, 특히 예를 들어 HIST4H4 및 H5로부터 선택된다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 암호화 영역을 포함한다. 바람직하게 암호화된 종양 항원은 리포터 단백질(예를 들어 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), β-갈락토시다제)이 아니고, 마커 또는 선별 단백질(예를 들어 알파-글로빈, 갈락토키나제 및 잔틴:구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(GPT))이 아니다. 바람직하게 본 발명의 핵산 서열은 (박테리아) 항생제 내성 유전자를 포함하지 않으며, 특히 neo 유전자 서열(네오마이신 내성 유전자) 또는 CAT 유전자 서열(클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 클로람페니콜 내성 유전자)을 포함하지 않는다.
상기 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산, 바람직하게는 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위한 핵산은 a) 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 암호화 영역; b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 그리고 c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는데, 여기서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 바람직하게 상기 정의된 바와 같은 히스톤 단백질, 리포터 단백질 및/또는 마커나 선별 단백질이 아니다. 본 발명의 핵산의 요소들 b) 및 c)는 본 발명의 핵산 내에 임의의 순서로 배열될 수 있는데, 다시 말해서 요소들 a), b) 및 c)는 본 발명의 핵산 서열 내 5'에서 3' 방향으로 a), b) 및 c)의 순서로, 또는 a), c) 및 b)의 순서로 배열될 수 있으며, 이때, 본원에 기술된 또 다른 요소들, 예를 들어 5'-CAP 구조, 폴리(C) 서열, 안정화 서열, IRES 서열 등도 포함될 수 있다. 2 시스트론 또는 다중 시스트론 구조체 내 본 발명의 핵산의 요소들, 즉 a) ~ c) 각각, 특히 a) 및/또는 요소들, 즉 b) 및 c) 각각, 더욱 바람직하게는 요소 b)는 또한 본 발명의 핵산 내에 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 핵산은 자체의 서열 요소들인 a)와 b), 그리고 임의로는 c)를, 예를 들어 다음과 같은 순서로 보일 수 있다:
5'━암호화 영역━히스톤 스템-루프━폴리(A) 서열━3'; 또는
5'━암호화 영역━히스톤 스템-루프━폴리아데닐화 신호━3'; 또는
5'━암호화 영역━폴리(A) 서열━히스톤 스템-루프━3'; 또는
5'━암호화 영역━폴리아데닐화 신호━히스톤 스템-루프━3'; 또는
5'━암호화 영역━암호화 영역━히스톤 스템-루프━폴리아데닐화 신호━3'; 또는
5'━암호화 영역━히스톤 스템-루프━히스톤 스템-루프━폴리(A) 서열━3'; 또는
5'━암호화 영역━히스톤 스템-루프━히스톤 스템-루프━폴리아데닐화 신호━3' 등.
이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 핵산 서열, 바람직하게는 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위한 핵산 서열은 a) 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 암호화 영역; b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 그리고 c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 서열을 포함하거나 암호화하는데, 여기서, 암호화된 단백질은 히스톤 단백질, 리포터 단백질(예를 들어 루시퍼라제, GFP, EGFP, β-갈락토시다제, 특히 EGFP) 및/또는 마커나 선별 단백질(예를 들어 알파-글로빈, 갈락토키나제 및 잔틴:구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(GPT))이 아니다.
제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 또한 변형 핵산의 형태로서도 발생할 수 있다.
이와 같은 내용에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 "안정화된 핵산", 바람직하게는 안정화된 RNA, 더욱 바람직하게는 본질적으로 (예를 들어 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의한) 생체 내 분해에 내성인 RNA를 제공하도록 변형될 수 있다. 안정화된 핵산은, 예를 들어 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역의 G/C 함량을 변경하거나, 뉴클레오티드 유사체(예를 들어 주쇄 변형, 당 변형 또는 염기 변형이 일어난 뉴클레오티드)를 도입하거나, 아니면 본 발명의 핵산 서열의 3'- 및/또는 5'-비번역 영역에 안정화 서열을 도입함으로써 제조될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 뉴클레오티드 유사체/변형체, 예를 들어 주쇄 변형체, 당 변형체 또는 염기 변형체를 포함할 수 있다. 본 발명과 관련된 주쇄 변형체는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 내에 포함된 뉴클레오티드 주쇄 중 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형체이다. 본 발명과 관련된 당 변형체는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 뉴클레오티드 중 당의 화학 변형체이다. 뿐만 아니라, 본 발명과 관련된 염기 변형체는 본 발명의 핵산 서열의 핵산 분자 뉴클레오티드 중 염기 부의 화학 변형체이다. 이와 같은 내용에 있어서 뉴클레오티드 유사체 또는 변형체는 바람직하게 전사 및/또는 번역에 사용될 수 있는 뉴클레오티드 유사체들로부터 선택된다.
본 발명의 제1 양태에 관한 특히 바람직한 구체예에서, 본원에 정의된 뉴클레오티드 유사체/변형체는, 암호화된 단백질의 발현을 부가적으로 증가시키는 것으로서, 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤지미다졸-리보시드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 잔토신-5'-트리포스페이트로부터 선택되는 것인 염기 변형체들로부터 선택된다. 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 염기 변형 뉴클레오티드들의 군으로부터 선택되는 염기 변형용 뉴클레오티드가 특히 바람직하다.
추가의 구체예에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 지질 변형체를 포함할 수 있다. 이와 같은 지질 변형된 핵산은 통상 본원에 정의된 핵산을 포함한다. 이와 같이 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 지질 변형 핵산 분자는 통상 핵산 분자와 공유 결합한 링커 하나 이상과, 각각의 링커와 공유 결합한 지질 하나 이상을 추가로 포함한다. 대안적으로 지질 변형 핵산 분자는 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자 하나 이상과, (링커의 매개 없이) 이 핵산 분자와 공유 결합한 (2 기능성) 지질 하나 이상을 포함한다. 제3 대안에 따르면, 지질 변형 핵산 분자는 본원에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 이 핵산 분자와 공유 결합한 링커 하나 이상, 그리고 각각의 링커와 공유 결합한 지질 하나 이상뿐만 아니라, (링커의 매개 없이) 이 핵산 분자와 공유 결합한 (2 기능성) 지질 하나 이상도 포함한다. 이와 같은 내용에 있어서 지질 변형체는 본 발명의 선형 핵산 서열의 말단부에 존재한다.
본 발명의 제1 양태에 관한 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은, 특히 (만일 이 핵산이 (m)RNA로서 제공되면) 소위 "5'-CAP" 구조가 부가됨으로써 RNase에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은, 10개 이상의 시티딘, 바람직하게는 20개 이상의 시티딘, 더욱 바람직하게는 30개 이상의 시티딘으로 이루어진 서열(소위 "폴리(C) 서열")에 의해 변형될 수 있다. 특히 본 발명의 핵산 서열은 통상 약 10~200개의 시티딘 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 10~100개의 시티딘 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 10~70개의 시티딘 뉴클레오티드, 또는 더더욱 바람직하게 약 20~50개 또는 20~30개의 시티딘 뉴클레오티드로 이루어진 폴리(C) 서열을 포함할 수 있거나 암호화할 수 있다. 이러한 폴리(C) 서열은 바람직하게 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 내에 포함된 암호화 영역의 3' 말단에 위치한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열로 이루어진 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역 중 G/C 함량은 변하는데, 특히 특정 야생형 암호화 영역(즉 비변형 암호화 영역)의 G/C 함량과 비교하였을 때 증가한다. 암호화 영역의 암호화된 아미노산 서열은 특정 야생형 암호화 영역의 암호화된 아미노산 서열과 비교하였을 때 변형되지 않는 것이 바람직하다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역의 G/C 함량 변화는, 번역될 임의의 mRNA 영역을 이루는 서열이 이 mRNA의 효율적인 번역에 중요하다는 사실을 바탕으로 한다. 그러므로 다양한 뉴클레오티드들의 조성과 이러한 뉴클레오티드들로 이루어진 서열은 중요하다. 특히 G(구아노신)/C(시토신) 함량이 증가한 mRNA 서열은, A(아데노신)/U(우라실) 함량이 증가한 mRNA 서열보다 더욱 안정하다. 본 발명에 의하면, 지속적으로 아미노산 서열로 번역되고 있는 암호화 영역의 코돈들은, 이 코돈들 중 G/C 뉴클레오티드들의 양이 증가되었다는 점에서 야생형 암호화 영역의 코돈들과는 상이하다. 몇몇 코돈들은 하나의 동일한 아미노산을 암호화한다는 사실(소위 유전 암호의 축퇴성)에 비추어, 안정성에 가장 유리한 코돈이 결정될 수 있다(소위 대안적 코돈 선호도(alternative codon usage)).
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역에 의해 암호화될 아미노산에 따라서, 야생형 암호화 영역과 비교되었을 때 핵산 서열(예를 들어 암호화 영역)의 변형에 대한 여러 가지 가능성이 존재한다. 배타적으로 G 또는 C 뉴클레오티드만을 포함하는 코돈에 의해 암호화된 아미노산의 경우, 코돈의 변형은 불필요하다. 그러므로 Pro(CCC 또는 CCG), Arg(CGC 또는 CGG), Ala(GCC 또는 GCG) Gly(GGC 또는 GGG)에 대한 코돈들에는 A 또는 U가 존재하지 않기 때문에, 이 코돈들에서는 변형이 필요하지 않은 것이다.
이와는 대조적으로, A 및/또는 U 뉴클레오티드를 포함하는 코돈들은, 동일한 아미노산들을 암호화하되, A 및/또는 U를 포함하지는 않는 기타 코돈들로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 이에 관한 예로서는 다음과 같은 경우들이 있다:
Pro에 대한 코돈들은 CCC 또는 CCA로부터 CCC 또는 CCG로 변형될 수 있고;
Arg에 대한 코돈들은 CGU 또는 CGA 또는 AGA 또는 AGG로부터 CGC 또는 CGG로 변형될 수 있으며;
Ala에 대한 코돈들은 GCU 또는 GCA로부터 GCC 또는 GCG로 변형될 수 있고;
Gly에 대한 코돈들은 GGU 또는 GGA로부터 GGC 또는 GGG로 변형될 수 있다.
다른 경우에 있어서, 비록 A 또는 U 뉴클레오티드가 코돈들로부터 제거될 수 없다고 하더라도, A 및/또는 U 뉴클레오티드들의 함량이 더욱 적은 코돈들을 사용함으로써 A 및 U 함량이 감소될 수 있다. 이에 관한 예로서는 다음과 같은 경우들이 있다:
Phe에 대한 코돈들은 UUU에서 UUC로 변형될 수 있고;
Leu에 대한 코돈들은 UUA, UUG, CUU 또는 CUA에서 CUC 또는 CUG로 변형될 수 있으며;
Ser에 대한 코돈들은 UCU 또는 UCA 또는 AGU에서 UCC, UCG 또는 AGC로 변형될 수 있고;
Tyr에 대한 코돈은 UAU에서 UAC로 변형될 수 있으며;
Cys에 대한 코돈은 UGU에서 UGC로 변형될 수 있고;
His에 대한 코돈은 CAU에서 CAC로 변형될 수 있으며;
Gln에 대한 코돈은 CAA에서 CAG로 변형될 수 있고;
Ile에 대한 코돈들은 AUU 또는 AUA에서 AUC로 변형될 수 있으며;
Thr에 대한 코돈들은 ACU 또는 ACA에서 ACC 또는 ACG로 변형될 수 있고;
Asn에 대한 코돈은 AAU에서 AAC로 변형될 수 있으며;
Lys에 대한 코돈은 AAA에서 AAG로 변형될 수 있고;
Val에 대한 코돈들은 GUU 또는 GUA에서 GUC 또는 GUG로 변형될 수 있으며;
Asp에 대한 코돈은 GAU에서 GAC로 변형될 수 있고;
Glu에 대한 코돈은 GAA에서 GAG로 변형될 수 있으며;
종결 코돈 UAA는 UAG 또는 UGA로 변형될 수 있다.
한편, Met 및 Trp에 대한 코돈들(각각 AUG 및 UGG)의 경우, 서열 변형 가능성은 없다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 중 암호화 영역의 G/C 함량을, 특정 야생형 암호화 영역(즉 원래 서열)의 G/C 함량에 비해 증가시키기 위해서는, 상기 나열된 치환들은 개별적으로 적용될 수 있거나, 아니면 가능한 모든 조합으로 적용될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 야생형 서열에서 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈들은 ACC(또는 ACG)로 변형될 수 있다.
상기 내용에서 mRNA 내에 존재하는 코돈들이 보인다. 그러므로 mRNA 내에 존재하는 우리딘은 또한 특정 mRNA를 암호화하는 각각의 DNA 내에서는 티미딘으로서 존재할 수도 있다.
바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역의 G/C 함량은, 야생형 암호화 영역의 G/C 함량에 비하여 7% 이상, 더욱 바람직하게 15% 이상, 특히 바람직하게 20% 이상 증가한다. 특정 구체예에 의하면, 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역 내 치환 가능한 코돈들 중 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더더욱 바람직하게는 80% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상 또는 심지어 100%가 치환되며, 이로써 상기 암호화 영역의 G/C 함량이 증가하게 된다.
이와 같은 내용에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 중 암호화 영역의 G/C 함량은, 야생형 암호화 영역의 G/C 함량에 비하여 최대 값(즉 치환 가능한 코돈들 100%)만큼 증가할 수 있다.
본 발명에 의하면, 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역의 바람직한 추가 변형은, 번역 효율 또한 세포 내 tRNA 발생에 관한 상이한 출현 빈도에 의해 결정된다는 발견을 바탕으로 한다. 그러므로 만일 소위 "희귀 코돈(rare codon)"이 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역 내에 증가된 정도로 존재하면, 상응하는 변형 핵산 서열은 "빈번히 출현하는(frequent)" tRNA를 암호화하는 코돈이 존재하는 경우보다 유의적으로 낮은 정도로 번역된다.
이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역은, 바람직하게 이와 상응하는 야생형 암호화 영역과 비교되게 변형되는 결과, 세포 내에서 비교적 희귀한 tRNA를 암호화하는 야생형 서열의 코돈 하나 이상이, 세포 내에서 비교적 빈번히 출현하고, 비교적 희귀한 tRNA가 운반하는 아미노산과 동일한 아미노산을 운반하는 tRNA를 암호화하는 코돈으로 치환된다. 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역은 이와 같은 변형에 의해서 변형되며, 그 결과 빈번히 발생하는 tRNA가 운반할 수 있는 코돈들이 삽입된다. 다시 말해서, 본 발명에 의하면 이와 같은 변형에 의해 세포 내에서 비교적 희귀한 tRNA를 암호화하는 야생형 암호화 영역의 코돈들 모두는 각각의 경우, 세포 내에서 비교적 빈번히 출현하고, 각각의 경우에 비교적 희귀한 tRNA가 운반하는 아미노산과 동일한 아미노산을 운반하는 tRNA를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있는 것이다.
어느 tRNA가 세포 내에서 비교적 빈번히 발생하는지, 그리고 이와는 대조적으로 어느 tRNA가 비교적 희귀하게 발생하는지는 당 업자에게 알려져 있는 바이다[예를 들어 문헌(Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666) 참조]. 예를 들어 (사람) 세포 내에서 가장 빈번히 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 코돈과 같이, 특정 아미노산을 위해 가장 빈번히 발생하는 tRNA를 사용하는 코돈들이 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 암호화 영역 내 증가한(특히 최대로 된) 서열 G/C 함량을, 핵산 서열의 암호화 영역에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열이 변형되지 않은 "빈번히 출현하는" 코돈들과 연관짓는 것이 특히 바람직하다. 이와 같은 바람직한 구체예는 본원에 정의된 바와 같은, 특히 효율적으로 번역 및 안정화된(변형된) 본 발명의 핵산 서열을 제공할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 관한 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은, 바람직하게 5' 및/또는 3' 안정화 서열 하나 이상을 추가로 가진다. 이와 같이 5' 및/또는 3' 비번역 영역들에 존재하는 안정화 서열들은 세포 기질 내 핵산, 특히 mRNA의 반감기를 증가시키는 효과를 가진다. 바이러스, 박테리아 및 진핵 생물에서 발생하되, 부분적으로나 전체적으로 합성될 수도 있는 천연 발생 서열들과 이러한 안정화 서열들의 서열 동일성은 100%일 수 있다. 예를 들어 호모 사피엔스(Homo sapiens) 또는 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)로부터 유래하는 (알파-)글로빈 유전자의 비번역 서열들(UTR)은, 핵산 안정화를 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 안정화 서열들의 예로서 예시될 수 있다. 안정화 서열의 또 다른 예는 일반 화학식 (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(서열 번호 55)를 가지는데, 이 서열은 (알파-)글로빈,(I)형 콜라겐, 15-리폭시게나제를 암호화하거나 또는 티로신 하이드록실라제를 암호화하는 매우 안정한 RNA의 3'-UTR에 포함되어 있다[Holcik et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410~2414]. 이러한 안정화 서열들은 물론 개별적으로 사용될 수 있거나, 아니면 다른 하나의 서열과 함께 사용될 수 있으며, 또한 당 업자에게 알려진 또 다른 안정화 서열들과도 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 내용에 있어서, 알파 글로빈 유전자의 3' UTR 서열은, 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 서열 내에 포함된, 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩티드 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역의 3' 말단에 위치하는 것이 특히 바람직하다.
염기들의 치환, 부가 또는 제거는, 널리 알려진 위치 배향 돌연 변이 유발 기술 또는 올리고뉴클레오티드 결찰 기법에 의해 핵산 서열 제조용 DNA 매트릭스를 사용하여 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열과 함께 수행되는 것이 바람직하다[예를 들어 문헌(Maniatis et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001) 참조].
상기 변형들 중 임의의 것은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열뿐만 아니라, 본 발명의 내용중 사용된 임의의 핵산에도 적용될 수 있으며, 만일 적당하거나 필요하다면, 임의의 조합으로 서로 조합될 수도 있되, 다만 이와 같은 변형들의 조합들은 각각의 핵산 내에서 서로 방해가 되지 않아야 한다. 당 업자는 자신의 의지에 따라서 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라서 사용된 핵산 서열로서 본원에 정의된 서열은 당 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 합성 방법, 예를 들어 고상 합성법과, 시험관 내 방법, 예를 들어 시험관 내 전사 반응 또는 생체 내 반응, 예를 들어 박테리아에서의 생체 내 DNA 플라스미드 복제를 이용하여 제조될 수 있다.
이와 같은 방법에 있어서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을 제조하기 위해서는, 특히 만일 핵산이 mRNA의 형태라면, 상응하는 DNA 분자는 시험관 내에서 전사될 수 있다. 이러한 DNA 매트릭스는 바람직하게 시험관 내 전사에 적당한 프로모터, 예를 들어 T7 또는 SP6 프로모터를 포함하는데, 이 프로모터 뒤에는 제조될 핵산 분자(예를 들어 mRNA)에 요망되는 뉴클레오티드가 존재하고, 또한 이 뉴클레오티드 뒤에는 시험관 내 전사를 위한 종결 신호가 존재한다. 관심 있는 RNA 하나 이상의 매트릭스를 형성하는 DNA 분자는, 발효에 의한 증식 후 분리에 의해 박테리아 내에서 복제될 수 있는 플라스미드의 일부로서 제조될 수 있다. 본 발명에 적당한 것으로 예시될 수 있는 플라스미드로서는, 예를 들어 플라스미드 pT7Ts(유전자 은행 기탁 번호 U26404; Lai et al ., Development 1995, 121: 2349~2360), pGEM® 시리즈, 예를 들어 pGEM®-1(유전자 은행 기탁 번호 X65300; Promega) 및 pSP64(유전자 은행 기탁 번호 X65327)(Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin(ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001)이 있다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열과, 이 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드는 이와 같은 서열의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 단편 또는 변이체는, 통상 핵산 수준 또는 아미노산 수준에서, 전체 야생형 서열에 대해, 상기 예시된 핵산들 중 하나, 또는 (만일 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된 것이라면 그와 같은) 단백질들, 펩티드들 또는 서열들 중 하나와의 서열 동일성이 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 동일한 정도로 더욱 바람직하게 85% 이상, 더더욱 바람직하게 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게 95% 이상 또는 심지어 97%, 98% 또는 99% 이상인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 내용에 있어서 (예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된) 단백질 또는 펩티드의 "단편"은, 본원에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 서열로서, 자체의 아미노산 서열(또는 이의 암호화된 핵산 분자)과 관련, 원래 (천연의) 단백질(또는 이의 암호화된 핵산 분자)의 아미노산 서열에 비하여 N-말단, C-말단 및/또는 서열 내부가 절두된(truncated)/단축된(shortened) 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 이러한 절두는 아미노산 수준 또는 핵산 수준으로 일어날 수 있다. 그러므로 이와 같이 본원에 정의된 단편에 관한 서열 동일성은, 바람직하게 본원에 정의된 전체 단백질 또는 펩티드에 대한 것일 수 있거나, 아니면 이러한 단백질이나 펩티드의 전체 (암호화) 핵산 분자에 대한 것일 수 있다. 이와 유사하게 본 발명의 내용 중 핵산의 "단편"은 본원에 정의된 핵산의 서열로서, 자체의 핵산 분자와 관련, 원래 (천연의) 핵산 분자의 핵산 서열에 비하여 5'-말단, 3'-말단 및/또는 서열 내부가 절두된/단축된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 본원에 정의된 바와 같은 단편에 관한 서열 동일성은 바람직하게 본원에 정의된 전체 핵산에 관한 것일 수 있는데, 바람직한 서열 동일성 수준은 통상 본원에 기술되어 있는 바와 같다. 단편은, 전장 천연 펩티드 또는 단백질에 비하여 (예를 들어 이의 특이 항원 특성 또는 치료 특성과) 동일한 생물학적 기능 또는 비활성을 가지거나, 아니면 적어도 천연 전장 단백질 활성의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더더욱 바람직하게는 90% 이상(이 활성은 적당한 기능 분석법, 예를 들어 (면역 반응의 지표로서) 적당한 시토킨의 면역 반응, 예를 들어 시토킨 발현 및/또는 분비를 평가하는, 적당한 분석계에 의해 항원 특성을 평가하는 분석법에서 측정됨)을 보유한다. 그러므로 바람직한 구체예에서, "단편"은 본원에 기술된 바와 같이 면역계에서 종양 항원 특성을 나타내는 전장 (천연 발생) 종양 항원의 일부이다.
본 발명의 내용에 있어서 (예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된) 단백질 또는 펩티드의 단편은, 또한 본원에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 서열[길이가 약 6~약 20개 또는 심지어 그 이상의 아미노산인 서열], 예를 들어 제I군 MHC 분자에 의해 제시 및 가공되는 단편으로서, 바람직하게는 길이가 약 8~약 10개 아미노산, 예를 들어 8, 9 또는 10개 아미노산(또는 심지어 6, 7, 11 또는 12개 아미노산)인 단편, 또는 제II군 MHC 분자에 의해 제시 및 가공되는 단편으로서, 바람직하게는 길이가 약 13개 아미노산 이상, 예를 들어 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산인 단편을 추가로 포함할 수 있는데, 여기서, 이와 같은 단편들은 아미노산 서열의 임의의 일부로부터 선택될 수 있다. 펩티드 단편과 MHC 분자로 이루어진 복합체의 형태를 가지는 이와 같은 단편들은 통상 T 세포에 의해 인지되는데, 즉 단편들은 통상 천연의 형태로서 인지되지 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 단편들은 이와 같은 단백질 또는 펩티드의 에피토프 하나 이상을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 세포 외 도메인, 세포 내 도메인 또는 경막 도메인과 같은 단백질의 도메인들, 그리고 단백질의 단축형 또는 절두형도 또한 단백질 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
(예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된) 본원에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 단편은, 또한 이와 같은 단백질 또는 펩티드의 에피토프도 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서 단백질의 일부 또는 T 세포 에피토프는, 바람직하게 길이가 약 6~약 20개 아미노산 또는 그 이상인 단편, 예를 들어 제I군 MHC 분자에 의해 제시 및 가공되는 단편으로서, 바람직하게는 길이가 약 8~약 10개 아미노산, 예를 들어 8, 9 또는 10개 아미노산(또는 심지어 6, 7, 11 또는 12개 아미노산)인 단편, 또는 제II군 MHC 분자에 의해 제시 및 가공된 단편으로서, 바람직하게는 길이가 약 13개 아미노산 이상, 예를 들어 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상 아미노산인 단편을 포함할 수 있는데, 여기서, 이와 같은 단편들은 아미노산 서열의 임의의 일부로부터 선택될 수 있다. 펩티드 단편과 MHC 분자로 이루어진 복합체의 형태를 가지는 이와 같은 단편들은 통상 T 세포에 의해 인지되는데, 즉 단편들은 통상 천연의 형태로서 인지되지 않는다.
B 세포 에피토프는 통상 본원에 정의된 바와 같은 (천연) 단백질 또는 펩티드 항원의 외 표면상에 위치하며, 바람직하게 5~15개 아미노산, 더욱 바람직하게 5~12개 아미노산, 더더욱 바람직하게 6~9개 아미노산을 가지는 단편, 즉 자체의 천연 형태로서 항체에 의해 인지될 수 있는 단편이다.
단백질 또는 펩티드의 이와 같은 에피토프는 또한 이와 같은 단백질 또는 펩티드에 관하여 본원에 예시된 변이체들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 이와 같은 내용에 있어서, 항원 결정기는, 본원에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 분절들로 이루어졌으며, 본원에 정의된 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열에서는 불연속적으로 존재하되, 단백질 또는 펩티드가 3차원 구조를 가지게 될 때에는 서로 모이는 입체 또는 불연속 에피토프이거나, 아니면 하나의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 연속적 또는 선형 에피토프일 수 있다.
본 발명의 내용에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 이로써 하나 이상의(2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의) 돌연 변이(들), 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실된 아미노산(들)이 포함됨으로 인하여 원래 서열과 상이하게 된 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 펩티드가 제조될 수 있는 것이다. 전장 천연 단백질 서열에 비추어 보았을 때 "변이체"의 서열 동일성의 바람직한 수준은 통상 본원에 기술된 바와 같다. 바람직하게 변이체는, 전장 천연 펩티드 또는 단백질에 비하여 (예를 들어 이의 특이 항원적 특성과) 동일한 생물학적 기능 또는 비활성을 가지거나, 아니면 적어도 천연 전장 단백질 활성의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더더욱 바람직하게는 90% 이상(이 활성은 적당한 기능 분석법, 예를 들어 하나 이상의 시토킨의 분비 및/또는 발현에 의해 종양 항원에 대한 면역 반응을 평가하는 분석법에서 측정됨)을 보유한다. 그러므로 바람직한 구체예에서, "변이체"는 종양의 항원적 특성들을 본원에 기술된 정도로 발휘하는 종양 항원 단백질의 변이체이다.
본 발명의 내용에서 정의된 (예를 들어 본원에 정의된 핵산에 의해 암호화된) 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는, 자체의 천연 서열(즉 돌연 변이되지 않은 생리학적 서열)에 비하여 보존적인 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 서열과 자체의 암호화 뉴클레오티드 서열은 특히 본원에 정의된 바와 같은 "변이체"라는 용어에 속한다. 동일한 군으로부터 기원하는 아미노산들이 상호 간에 교환되는 치환들은 보존적 치환이라고 칭하여진다. 특히 이와 같은 변이체로서는 지방족 측쇄, 양 하전 또는 음 하전 측쇄를 가지거나, 측쇄 또는 아미노산 내 방향족 기를 가지거나, 수소 결합으로 도입될 수 있는 측쇄, 예를 들어 하이드록실 작용기를 가지는 측쇄를 가지는 아미노산이 있다. 이는 곧, 예를 들어 극성 측쇄를 가지는 아미노산은, 유사하게 극성 측쇄를 가지는 또 다른 아미노산으로 치환된다는 것을 의미하는데, 예를 들어 소수성 측쇄를 특징으로 하는 아미노산은 유사하게 소수성 측쇄를 가지는 아미노산으로 치환된다[예를 들어 세린(트레오닌)은 트레오닌(세린)으로, 또는 루신(이소루신)은 이소루신(루신)으로 치환됨]. 삽입 및 치환은 특히 3차원 구조를 변형시키지 않거나, 결합 영역에 영향을 주지 않는 서열 위치들에서 일어날 수 있다. 삽입(들) 또는 결실(들)에 의한 3차원 구조 변형은, 예를 들어 CD 스펙트럼(원편광 2색성 스펙트럼)을 이용하여 용이하게 확인될 수 있다[Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al .(ed.), Elsevier, Amsterdam].
뿐만 아니라, 본원에 정의된 것으로서, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는 단백질들 또는 펩티드들의 변이체들은 또한 이와 같은 서열들을 포함할 수도 있는데, 이 경우, 핵산의 뉴클레오티드는 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열 각각의 변형 없이 유전자 암호의 축퇴성에 따라서 치환되는데, 다시 말해서 아미노산 서열 또는 적어도 이의 일부는 상기와 같은 의미에서 하나 이상의 돌연 변이(들)에 의해 원래 서열과 상이할 수 없다는 것이다.
2개의 서열들, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 핵산 서열들 또는 아미노산 서열들, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열들 또는 아미노산 서열들 자체가 동일한 정도(백분율)를 측정하기 위해서, 서열들은 추후 상호 간 비교를 위해 배열될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 제1 서열의 위치는, 이와 상응하는 제2 서열의 위치와 비교될 수 있다. 만일 제1 서열 내 어느 위치를 제2 서열 내 해당 위치에 있는 구성 성분과 동일한 구성 성분이 차지하고 있다면, 상기 2개의 서열들은 이 위치에서 동일한 것이다. 만일 이와 같지 않다면, 해당 서열들은 그 위치에서 상이한 것이다. 만일 제1 서열에 비하여 제2 서열 내에 삽입이 일어난다면, 갭(gap)은 제1 서열에 삽입될 수 있고, 이로써 추가의 배열이 진행될 수 있다. 만일 제1 서열에 비하여 제2 서열 내에 결실이 일어난다면, 갭은 제2 서열에 삽입될 수 있고, 이로써 추가의 배열이 진행될 수 있다. 그 다음, 2개의 서열들이 동일한 정도(백분율)는, 동일한 위치들의 갯 수를, 하나의 서열에만 존재하는 위치들을 포함하는 위치들의 총 수로 나눈 함수이다. 2개의 서열들이 동일한 정도(백분율)는 수학적 알고리즘을 사용하여 산정될 수 있다. 이때 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직하되 제한적이지 않은 예로서는 문헌[Karlin et al .(1993), PNAS USA, 90:5873-5877 or Altschul et al .(1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]에 개시되어 있는 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 BLAST 프로그램에 통합되어 있다. 본 발명의 서열들과 어느 정도 동일한 서열들이 이 프로그램에 의해 확인될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 펩티드 또는 단백질의 유도체를 암호화할 수 있다. 이와 같은 펩티드 또는 단백질의 유도체는, 다른 분자, 예를 들어 상기 펩티드 또는 단백질로부터 유래하는 분자이다. "유도체"는 통상 천연 펩티드 또는 단백질의 전장 서열과, 부가적인 서열 특징들[천연 전장 펩티드/단백질에 대한 부가적인 기능을 발휘할 수 있는 특징들]을, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 포함한다. 또한 이러한 유도체들은, 전장 천연 펩티드 또는 단백질에 비하여, (예를 들어 자체의 치료 특성과) 동일한 생물학적 기능 또는 비활성을 가지거나, 아니면 적어도 천연 전장 단백질 활성의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더더욱 바람직하게는 90% 이상(이 활성은 적당한 기능 분석법에서 측정되고(상기 참조), 예를 들어 면역 반응에서 시토킨 발현 및/또는 분비에 의해 나타남)을 보유한다. 따라서, 펩티드 또는 단백질의 "유도체"는 또한, 예를 들어 2개 이상의 생물학적 기능을 융합 펩티드/단백질에 부여하는, 별개의 펩티드/단백질에 융합된 천연 전장 단백질(또는 이의 변이체/단편) 또는 본 발명에서 사용된 펩티드 또는 단백질을 포함하는 (키메라) 융합 펩티드/단백질을 포함하기도 한다. 예를 들어 융합은 표지, 예를 들어 에피토프, 예를 들어 FLAG 에피토프 또는 V5 에피토프 또는 HA 에피토프를 포함한다. 예를 들어 에피토프는 FLAG 에피토프이다. 이러한 태그는, 예를 들어 융합 단백질을 정제하는데 유용하다.
이와 같은 내용에 있어서, 단백질 또는 펩티드의 "변이체"의, 이 단백질 또는 펩티드의 아미노산 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개로 이루어진 구획에 대한 아미노산 동일성은 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상일 수 있다. 이와 유사하게, 핵산 서열, 특히 단편의 "변이체"의, 이 핵산 서열(통상적으로는 천연 발생 전장 서열을 말함)의 뉴클레오티드 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개로 이루어진 구획에 대한 뉴클레오티드 동일성은 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상일 수 있다. 통상적으로 "단편"의 경우 서열 동일성은, 이 서열 동일성을 최고 수준으로 나타내는 전장 단백질의 일부(단편과 동일한 길이를 가지는 부분을 반영함)가 차지하는 만큼의 (단편의) 길이에 걸친 단편을 대상으로 측정된다.
본 발명의 제1 양태에 관한 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 본 발명의 핵산 서열의 형질 감염 효율 및/또는 면역 자극 특성을 증가시키기 위해 비이클, 형질 감염 제제 또는 복합체 형성 제제와 결합한다. 이와 같은 내용에 있어서 형질 감염 효율을 증가시키기 적당한 제제로서 특히 바람직한 것으로는 양이온성 또는 다가 양이온성 화합물 예를 들어 프로타민, 뉴클레올린, 스퍼민 또는 스퍼미딘, 또는 기타 양이온성 펩티드 또는 단백질, 예를 들어 폴리-L-리신(PLL), 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩티드, 세포 투과성 펩티드(CPP), 예를 들어 HIV-결합 펩티드, HIV-1 Tat(HIV), Tat 유도성 펩티드, 페네트라틴, VP22 유도성 펩티드 또는 유사체 펩티드, HSV VP22(헤르페스 심플렉스(Herpes simplex)), MAP, KALA 또는 단백질 형질 도입 도메인(PTD), PpT620, 프롤린-풍부 펩티드, 아르기닌-풍부 펩티드, 리신-풍부 펩티드, MPG-펩티드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩티드(들), 안테나페디아 유래 펩티드(특히 드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 유래), pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄, 버포린-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT 유래 펩티드, SAP 또는 히스톤이 있다. 또한 바람직한 양이온성 또는 다가 양이온성 단백질 또는 펩티드는 다음과 같은 전체 화학식을 가지는 다음과 같은 단백질들 또는 펩티드들로부터 선택될 수 있다:(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x[식 중, I + m + n + o + x는 8~15이고, I, m, n 또는 o는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택되는 임의의 수일 수 있되, 다만 Arg, Lys, His 및 Orn의 전체 함량은 올리고펩티드를 이루는 모든 아미노산의 50% 이상에 해당하고; Xaa는 Arg, Lys, His 또는 Orn를 제외한 천연(=천연 발생) 또는 비천연 아미노산들로부터 선택되는 임의의 아미노산일 수 있으며; x는 0, 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 임의의 수일 수 있되, 다만 Xaa의 전체 함량은 올리고펩티드를 이루는 모든 아미노산들의 50%를 초과하지 않음]. 이와 같은 내용에 있어서 특히 바람직한 양이온성 펩티드로서는, 예를 들어 Arg7, Arg8, Arg9, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R 등이 있다. 형질 감염 제제로서 사용될 수 있는 추가의 바람직한 양이온성 또는 다가 양이온성 화합물은, 양이온성 다당체, 예를 들어 키토산, 폴리브렌, 양이온성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI), 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA: [1-(2,3-시올레일옥시)프로필)]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물, DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: 디옥타데실아미도글리실스퍼민, DIMRI: 디미리스토-옥시프로필 디메틸 하이드록시에틸 암모늄 브롬화물, DOTAP: 디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판, DC-6-14: O,O-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)디에탄올아민 염화물, CLIP1: rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-하이드록시에틸)]-디메틸암모늄 염화물, CLIP6: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모늄, CLIP9: rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시숙시닐옥시)에틸]트리메틸암모늄, 올리고펙타민, 또는 양이온성 또는 다가 양이온성 중합체, 예를 들어 변형된 폴리아미노산, 예를 들어 β-아미노산-중합체 또는 역전 폴리아미드 등, 변형된 폴리에틸렌, 예를 들어 PVP(폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브롬화물)) 등, 변형된 아크릴레이트, 예를 들어 pDMAEMA(폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트)) 등, 변형된 아미도아민, 예를 들어 pAMAM(폴리(아미도아민)) 등, 변형된 폴리베타아미노에스테르(PBAE), 예를 들어 디아민 말단 변형된 1,4-부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜탄올 중합체 등, 덴드리머, 예를 들어 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기반 덴드리머 등, 폴리이민(들), 예를 들어 PEI: 폴리(에틸렌이민), 폴리(프로필렌이민) 등, 폴리알릴아민, 당 주쇄 기반 중합체, 예를 들어 사이클로덱스트린 기반 중합체, 덱스트란 기반 중합체, 키토산 등, 실란 주쇄 기반 중합체, 예를 들어 PMOXA-PDMS 공중합체 등, 하나 이상의 양이온성 블록(예를 들어 상기 예시된 양이온성 중합체들로부터 선택된 것)과 하나 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예를 들어 폴리에틸렌글리콜)의 조합으로 이루어진 블록 중합체를 포함할 수 있다.
이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 핵산은 적어도 부분적으로 양이온성 또는 다가 양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 단백질 또는 펩티드와 복합체를 형성하는 것이 특히 바람직하다. "부분적으로 복합체를 형성한다"란, 본 발명의 핵산의 일부만이 양이온성 또는 다가 양이온성 화합물과 복합체를 형성하고, 본 발명의 핵산의 나머지 부분은 복합체를 형성하지 않은 형태("자유형(free form)")를 가지는 경우를 의미한다. 복합체를 형성한 핵산 대 자유형 핵산의 비율은 바람직하게 약 5:1(w/w)~약 1:10(w/w), 더욱 바람직하게는 약 4:1(w/w)~약 1:8(w/w), 더더욱 바람직하게는 약 3:1(w/w)~약 1:5(w/w) 또는 1:3(w/w)의 범위로부터 선택되고, 또한 복합체를 형성한 핵산 대 자유형 핵산의 비율은 가장 바람직하게 약 1:1(w/w)이다.
본 발명의 핵산 서열은, 예를 들어 화학 구조가 어떤지에 상관없는 다가 양이온성 화합물, 바람직하게는 다가 양이온성 (폴리)펩티드 또는 합성 다가 양이온성 화합물에 의해 나출된 형태(naked form) 또는 복합체를 형성한 형태 중 어느 하나의 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 핵산 서열은 포장 세포(packaging cell)와 함께 제공되지 않는 것이 바람직하다.
추가의 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개 또는 하나 이상, 바람직하게는 2~10개, 더욱 바람직하게는 2~5개, 가장 바람직하게는 2~4개를 포함하는 조성물, 키트 또는 이와 같은 핵산 서열을 상기와 같은 수로 포함하는 부분들로 이루어진 키트를 제공한다. 이와 같은 본 발명의 조성물은 본 발명의 핵산 서열, 바람직하게는 상이한 종양 항원, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 상이한 펩티드들 또는 단백질들을 암호화하는 본 발명의 핵산 서열 하나 이상을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상, 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함)를 포함하는 본 발명의 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트로서, 특히 전립선암(PCa)의 치료에 사용될 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트는 적어도 다음과 같은 a) ~ d)를 포함한다:
a) 종양 항원 PSA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산;
b) 종양 항원 PSMA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산;
c) 종양 항원 PSCA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산; 그리고
d) 종양 항원 STEAP-1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상, 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함)를 포함하는 본 발명의 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트로서, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)의 치료에 사용될 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트는 적어도 다음과 같은 a) ~ c)를 포함한다:
a) i. 종양 항원 NY-ESO-1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역,
ii. 하나 이상의 히스톤 스템-루프, 그리고
iii. 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열;
b) 종양 항원 5T4, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산; 그리고
c) 종양 항원 서바이빈, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산.
뿐만 아니라 대안적 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 서열 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상, 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함)를 포함하는 본 발명의 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트로서, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)의 치료에 사용될 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트는 적어도 다음과 같은 a) ~ e)를 포함한다:
a) i. 종양 항원 NY-ESO-1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역,
ii. 하나 이상의 히스톤 스템-루프, 그리고
iii. 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열;
b) 종양 항원 5T4, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산;
c) 종양 항원 서바이빈, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산;
d) 종양 항원 MAGE-C1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산; 그리고
e) 종양 항원 MAGE-C2, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 본 발명의 핵산.
추가의 양태에 의하면, 본 발명은 또한 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 예를 들어 a) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개의 핵산, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함)를 포함하는 본 발명의 조성물, 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을 제공하는 단계, b) 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을, 발현계, 예를 들어 무세포 발현계, 세포(예를 들어 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이 방법은 실험, 연구, 진단, 펩티드 또는 단백질의 상업적 생산 및/또는 치료 목적으로 실시될 수 있다. 이와 같은 내용에 있어서, 통상 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열이 제조된 후, 이 핵산 서열 또는 조성물은 통상 무세포 발현계, 세포(예를 들어 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에, 예를 들어 나출된 형태 또는 복합체를 형성한 형태로서, 아니면 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물 또는 백신으로서, 바람직하게는 형질 감염 또는 본원에 기술된 투여 방식들 중 임의의 방식을 이용하여 적용 또는 투여된다. 상기 방법은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 또한 특정 질환, 특히 본원에 정의된 암 또는 종양 질환의 치료시에 수행될 수도 있다.
이와 같은 내용에 있어서, "시험관 내"란, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물이, 유기체 밖으로부터 배양액 중 세포에 형질 감염 또는 형질 도입되는 것으로서 정의되고; "생체 내"란, 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 핵산이, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 조성물을 전 유기체 또는 개체에 적용함으로써 세포에 형질 감염 또는 형질 도입되는 것으로서 정의되며; "세포 외"란, 본 발명의 핵산 서열 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개의 핵산, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함)를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 핵산이, 유기체 또는 개체의 외부로부터 세포에 형질 감염 또는 형질 도입된 후, 형질 감염된 세포를 유기체나 개체에 적용하는 것으로서 정의된다.
이와 유사하게, 다른 양태에 의하면, 본 발명은 또한, 예를 들어 본원에 정의된 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을, 예를 들어 무세포 발현계, 세포(예를 들어 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여함으로써, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열들을 다수 개 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의, 바람직하게는 진단용 또는 치료용, 암호화된 펩티드 또는 단백질 발현 증가용으로서의 용도도 제공한다. 이와 같은 용도는 실험, 연구, 진단, 펩티드 또는 단백질의 상업적 생산 및/또는 치료 목적으로 구현될 수 있다. 이와 같은 내용에 있어서, 통상 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열이 제조된 후, 상기 조성물 또는 핵산 서열은 통상적으로 무세포 발현계, 세포(예를 들어 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에, 바람직하게는 나출된 형태 또는 복합체를 형성한 형태로서, 아니면 본원에 정의된 약학 조성물 또는 백신으로서, 바람직하게는 형질 감염을 통하거나, 또는 본원에 정의된 투여 방식들 중 임의의 방식을 이용하여 적용 또는 투여된다. 상기 용도는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 구현될 수 있다. 상기 용도는 또한 특정 질환, 바람직하게는 본원에 정의된 암 또는 종양 질환의 치료시 구현될 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 또한 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 핵산 서열 또는 발현 벡터 또는 플라스미드를 포함하는, 본 발명의 발현계에 관한 것이기도 하다. 이와 같은 내용에 있어서, 발현계는 무세포 발현계(예를 들어 시험관 내 전사계/번역계), 세포 발현계(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 예를 들어 이.콜라이), 또는 펩티드 또는 단백질의 발현에 사용되는 유기체(예를 들어 식물 또는 동물, 예를 들어 소)일 수 있다.
뿐만 아니라, 다른 양태에 의하면, 본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열들을 다수 개 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산의, 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현 증가용 약학 조성물 제조용으로서의 용도, 예를 들어, 바람직하게는 본원에 정의된 암 또는 종양 질환 치료 방법[예를 들어 본원에 정의된 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산을, 세포(예를 들어 발현 숙주 세포 또는 체세포), 조직 또는 유기체에, 바람직하게는 나출된 형태 또는 복합체를 형성한 형태로서, 아니면 본원에 정의된 약학 조성물 또는 백신으로서, 더욱 바람직하게는 본원에 정의된 투여 방식들 중 임의의 방식을 이용하여 적용 또는 투여함으로써 실시되는 치료 방법]에 사용되는 약학 조성물 제조용으로서의 용도에 관한 것이기도 하다.
그러므로 특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 또한 임의로는 약학적으로 허용 가능한 캐리어 및/또는 비이클과 함께, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산을 포함하는 약학 조성물이나, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물을 제공하기도 한다.
본 발명의 약학 조성물은 제1 성분으로서 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 제2 성분으로서 약학적으로 활성인 부가 성분 하나 이상을 포함할 수도 있다. 이와 관련된 약학적 활성 성분은 본원에 예시된 특정 징후 또는 질환, 바람직하게는 암 또는 종양 질환을 치유, 완화 또는 예방하는 치료 효과를 가지는 화합물이다. 이러한 화합물로서는, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 단백질, 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 핵산, (치료 활성인) 저 분자량(분자량 5000 미만, 바람직하게는 1000 미만) 유기 또는 무기 화합물, 당, 항원 또는 항체(바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 것), 이미 선행 기술에 알려져 있는 치료제, 항원 세포, 항원 세포 단편, 세포 분획; 세포벽 성분(예를 들어 다당체), 변형, 감쇄 또는 불활성화(예를 들어 화학적 불활성화 또는 조사에 의한 불활성화) 병원체(바이러스 또는 박테리아 등), 보조제(바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 것) 등을 포함하나, 이것들에 한정된다는 것을 암시하지는 않는다.
뿐만 아니라 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 캐리어 및/또는 비이클을 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 캐리어는 통상 본 발명의 약학 조성물의 형태, 즉 액체 형태인지 아니면 액체 이외의 형태인지 여부를 좌우한다. 만일 본 발명의 약학 조성물이 액체 형태로 제공되면, 캐리어는 통상 발열원이 존재하지 않는 물; 등장 염수 또는 완충된 (수)용액, 예를 들어 인산염 또는 시트르산염 등으로 완충된 용액일 것이다. 주사용 완충액은 구체적 기준 매질(reference medium)에 대해서 고장성, 등장성 또는 저장성일 수 있는데, 다시 말해서 완충액은 구체적 기준 매질과 비교하였을 때 염 함량이 높거나, 동일하거나 낮을 수 있다[이 경우, 상기 예시된 염들의 농도(삼투압 효과나 기타 농도 효과로 인해 세포를 손상시키지 않는 농도)가 적용될 수 있는 것이 바람직함]. 상기 기준 매질로서는, 예를 들어 "생체 내" 방법에 사용될 수 있는 액체, 예를 들어 혈액, 림프, 세포 기질액 또는 기타 체액이거나, 예를 들어 "시험관 내" 방법에서 기준 매질로서 사용될 수 있는 액체, 예를 들어 통상의 완충액이나 액체가 있다. 이러한 통상의 완충액 또는 액체는 당 업자에게 알려져 있다. 링거-젖산염 용액이 액체 매질로서 특히 바람직하다.
그러나 처치될 환자에 투여하기 적당한, 하나 이상의 혼화 가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 피포화 화합물도 본 발명의 약학 조성물 제조에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "혼화 가능한"이란 용어는, 본 발명의 약학 조성물을 구성하는 구성 성분들이 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산과, 이 구성 성분들이 통상적으로 사용될 때 본 발명의 약학 조성물의 약학 효능을 실질적으로 떨어뜨릴 상호 작용이 일어나지 않는 방식으로 혼합될 수 있는 경우를 의미한다.
특정 구체예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물은 보조제를 포함할 수 있다. 이와 같은 내용에서, 보조제는 선천성 면역계의 면역 반응, 즉 비특이적 면역 반응을 개시하거나 증가시키는데 적당한 임의의 화합물인 것으로 이해될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 약학 조성물이 투여될 때, 이 조성물은 조성물 자체 내에 임의로 포함된 보조제로 인해 선천성 면역 반응을 유도하는 것이 바람직하다는 말이다. 이와 같은 보조제는 당 업자에게 알려진 보조제로서, 본 발명에 적당한 것, 즉 포유동물 내에서 선천성 면역 반응의 유도를 지탱하는 것, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 보조제 단백질 또는 이하에 정의된 바와 같은 보조제로부터 선택될 수 있는 것이 바람직하다.
저장 및 운반용으로 적당한 보조제로서 특히 바람직한 것으로는 비이클, 형질 감염 제제 또는 복합체 형성 제제로서 본 발명의 핵산 서열용으로 상기 정의된 바와 같은 양이온성 또는 다가 양이온성 화합물이 있다.
본 발명의 약학 조성물은 원한다면 이 조성물의 면역원성이나 면역 자극 능을 증가시키기 위해 부가적으로 하나 이상의 보조 물질을 포함할 수도 있다. 이로써 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열과, 본 발명의 약학 조성물 중에 임의로 포함될 수 있는 보조 물질의 상승 작용이 구현되는 것이 바람직하다. 다양한 종류의 보조 물질들에 따라서, 이와 관련된 다양한 기구들이 고려될 수 있다. 예를 들어 수지상 세포(DC)를 성숙시키는 화합물, 예를 들어 리포다당체, TNF-알파 또는 CD40 리간드는 적당한 보조 물질의 제1 군을 이룬다. 일반적으로 보조 물질로서 임의의 제제[즉 표적화된 방식으로 면역 반응을 증강시키고/증강시키거나 이에 영향을 줄 수 있는 "위험 신호(danger signal)"(LPS, GP96 등) 또는 시토킨, 예를 들어 GM-CFS로서 면역계에 영향을 미치는 제제]가 사용될 수 있다. 특히 바람직한 보조 물질로서는 선천성 면역 반응을 더욱 촉진하는 시토킨, 예를 들어 모노킨, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파, 성장 인자, 예를 들어 hGH가 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 추가의 첨가제로서는 유화제, 예를 들어 트윈(Tween)®; 습윤제, 예를 들어 소듐 라우릴 황산염; 착색제; 풍미 부여제, 약학적 캐리어; 정제 형성 제제; 안정화제; 항산화제; 보존제가 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 사람 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10에 대한 (리간드로서의) 자체 결합 친화도, 또는 쥣과 동물 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 (리간드로서의) 자체 결합 친화도로 인하여 면역을 자극하는 것으로 알려진 임의의 추가 화합물을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 비 경구, 즉 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측 또는 질을 통해 투여될 수 있거나, 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "비 경구"란 용어는 피하, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내, 흉골 내, 초 내, 간 내, 병변 내, 두개골 내, 경 피, 피 내, 폐 내, 복막 내, 심장 내, 동맥 내 및 설 하 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 바람직하게 비 경구 주사, 더욱 바람직하게 피하, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액 내, 흉골 내, 초 내, 간 내, 병변 내, 두개골 내, 경 피, 피 내, 폐 내, 복막 내, 심장 내, 동맥 내 및 설 하 주사 또는 주입 기술에 의해 투여될 수 있다. 피 내 및 근육 내 주사가 특히 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물의 멸균 주사형은 수성 또는 유질 현탁액일 수 있다. 이와 같은 현탁액은 적당한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 당 업계에 알려진 기술에 따라서 제형될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물은 또한 임의의 경구 적용 가능한 투여형, 예를 들어 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액(이에 한정되는 것은 아님)으로서 경구 투여될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한, 특히 치료 대상이 국소 적용에 의해 용이하게 접근 가능한 부위나 장기일 때(예를 들어 피부 질환이나 기타 임의의 접근 가능한 상피 조직 질환일 때) 국소 투여될 수도 있다. 적당한 국소 투여형은 이와 같이 특정 부위나 장기 각각에 맞춰서 용이하게 제조된다. 국소 적용을 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산이 하나 이상의 캐리어에 현탁 또는 용해된 상태로 함유된 적당한 연고로서 제형될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상 본 발명의 약학 조성물의 구성 성분들, 특히 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열(들)을 "안전량 및 유효량"만큼 포함한다. 본원에 사용된 "안전량 및 유효량"이란, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열(들)의 양으로서, 본원에 정의된 질병 또는 질환의 긍정적 개선을 유의적으로 유도하는데 충분한 양을 의미한다. 그러나, 이와 동시에 "안전량 및 유효량"은 중증 부작용이 발생하는 것을 막고, 이점과 위험성 간 분별 가능한 관계를 허용하기에는 매우 적다. 이러한 한계들은 통상적으로 현명한 의료상 판단 범위 내에서 결정된다.
본 발명의 약학 조성물은 사람을 대상으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 수의학적 용도로서도 사용될 수 있으며, 바람직하게는 사람을 대상으로 하는 의료용으로서(일반적으로는 약학 조성물로서, 아니면 백신으로서) 사용될 수 있다.
특히 바람직한 또 다른 양태에 의하면, 본 발명의 약학 조성물(또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물)은 백신으로서 제공 또는 사용될 수 있다. 통상적으로 이러한 백신은 상기 약학 조성물에 대해 정의된 바와 같다. 뿐만아니라 이와 같은 백신은 통상 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물을 포함한다.
본 발명의 백신은 또한 본원에 정의된 바와 같이 본 발명의 조성물에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 보조제 및/또는 비이클을 포함할 수도 있다. 본 발명의 백신에 관한 구체적인 내용에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 캐리어의 선택은 원칙적으로 본 발명의 백신이 투여되는 방식에 따라서 결정된다. 본 발명의 백신은, 예를 들어 전신 투여 또는 국소 투여될 수 있다. 일반적으로 전신 투여 경로로서는, 예를 들어 경피, 경구, 비경구 경로, 예를 들어 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 피 내 및 복막 내 주사 및/또는 비강 내 투여 경로를 포함한다. 일반적으로 국소 투여 경로로서는, 예를 들어 국소 투여 경로를 포함하지만, 피 내, 경피, 피하 또는 근육 내 주사 또는 병변 내, 두개골 내, 폐 내, 심장 내 및 설하 주사도 포함한다. 더욱 바람직하게 백신은 피 내, 피하 또는 근육 내 경로에 의해 투여될 수 있다. 그러므로 본 발명의 백신은 액체(때때로는 고체) 형태로 제형되는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신은 원한다면 이 조성물의 면역원성이나 면역 자극 능을 증가시키기 위해 부가적으로 하나 이상의 보조 물질들을 포함할 수도 있다. 약학 조성물에 대해 정의된 바와 같은 보조 물질 또는 첨가제와 같은 보조제가 특히 바람직하다.
뿐만 아니라 본 발명은, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물, 본 발명의 약학 조성물, 본 발명의 백신[이와 같은 조성물, 약학 조성물 및 백신은 모두 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을 포함함], 또는 이것들을 포함하는 키트의 몇몇 응용 분야 및 용도를 제공하기도 한다.
하나의 특정 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열들 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물의, 특히 암 또는 종양 질환의 치료법에 있어서, 의약품, 바람직하게는 백신으로서의 제1 의료상 용도에 관한 것이다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 암 및 종양 질환들의 치료를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열들 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물의 제2 의료상 용도, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 암 또는 종양 질환들의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한 의약품 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열들 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물, 이와 같은 핵산 서열들을 포함하는 약학 조성물 또는 백신, 또는 이와 같은 핵산 서열들을 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다. 바람직하게 약학 조성물 또는 백신은 상기와 같은 목적으로 치료를 필요로 하는 환자에게 사용되거나 투여될 것이다.
바람직하게 본원에 예시된 질환들은, 바람직하게, 예를 들어 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문 암, 맹장 암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 소뇌 성상세포종, 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상 하부 신경교종, 유방암, 기관지 선종/유암종, 버킷 림프종, 소아 유암 종양, 위장관 유암 종양, 미지의 원발성 암종, 원발성 중추 신경계 림프종, 소아 소뇌 성상세포종, 소아 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁 경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 결장암, 피부 T 세포 림프종, 결합조직성 소원형세포종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 종양의 유잉군에 속하는 유잉 육종, 소아 두개골 외 생식 세포 종양, 생식선 외 생식 세포 종양, 간 외 담관암, 안 내 흑색종, 망막 모세포종, 담낭암, 위장(위) 암, 위장관 유암 종양, 위장관 기질 종양(GIST), 두개골 외, 생식선 외 또는 난소 생식 세포 종양, 융모상피성 종양, 외간의 신경교종, 소아 뇌 성상세포종, 소아 시각 경로 및 시상 하부 신경교종, 위 암종, 모양 세포 백혈병, 두부 및 경부 암, 심장 암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 소아 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 안 내 흑색종, 섬 세포 암종(내분비 판크라제), 카포시 육종, 신장 암(신 세포 암), 후두암, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 구순(lips) 및 구강(mouth) 암, 지방 육종, 간암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 림프종, AIDS-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증, 골의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 소아 수모세포종, 흑색종, 안 내(눈) 흑색종, 메르켈 세포 암종, 성인 악성 중피세포종, 소아 중피세포종, 전이성 편평 경부 암(원발성 잠재 구강암 동반), 소아 다발성 내분비 신생물 형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 만성 골수성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 소아 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종(골수 암), 만성 골수증식성 질환, 비강 및 코곁굴 암, 비인두암, 신경아세포종, 구강암(oral cancer), 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암(표면 상피-기질 종양), 난소 생식 세포 종양, 난소 저 악성 잠재 종양(ovarian low malignant potential tumor), 췌장암, 섬세포 췌장암, 코곁굴 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과체 성상세포종, 송과체 배아세포종, 소아 송과체아세포종 및 천막상 원시 신경외배엽종양, 뇌하수체 선종, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막-폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종(신장 암), 신우 및 요관 암, 망막모세포종, 소아 횡문근육종, 침샘암, 종양 유잉군 육종, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁육종, 시자리병, 피부암(비흑색종), 피부암(흑색종), 메르켈 세포 피부 암종, 소장암, 편평 세포 암종, 전이성 편평 경부 암(원발 잠재성), 소아 천막상 원시 신경외배엽성 종양, 고환암, 인후암, 소아 흉선종, 흉선종 및 흉선암, 갑상선암, 소아 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포 암, 융모상피성 종양, 요도암, 자궁내막암, 자궁 육종, 질암, 소아 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 고분자 글로불린혈증 및 소아 빌름 종양(신장암)을 포함하는 암 또는 종양 질환들로부터 선택된다.
추가의 바람직한 양태에 있어서, 본원에 정의된 본 발명의 핵산 또는 본원에 정의된 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하는 본 발명의 조성물은, 약학 조성물 또는 백신 제조시, 특히 본원에 정의된 목적으로 사용될 수 있다.
더욱이 본 발명의 약학 조성물 또는 백신은 질환 또는 질병, 바람직하게는 본원에 정의된 암 또는 종양 질환의 치료에 사용될 수도 있다.
마지막 양태에 따르면, 본 발명은 또한 키트, 특히 여러 부분들로 이루어진 키트를 제공하기도 한다. 이와 같은 키트, 특히 여러 부분들로 이루어진 키트는 통상 단독 구성 성분으로서, 또는 본원에 정의된 추가의 구성 성분들과 합하여진 형태로서 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 하나 이상, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 약학 조성물 또는 백신을 포함한다. 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 하나 이상은 임의로 본원에 정의된 추가의 구성 성분들과 합하여지는데, 이 경우 본 발명의 핵산 하나 이상은 기타 구성 성분 하나 이상을 포함하는 키트의 또 다른 부분 하나 이상과 분리되어 제공된다(키트의 제1 부분). 본 발명의 약학 조성물 및/또는 백신은, 예를 들어 키트의 한 부분 또는 상이한 부분들에 존재할 수 있다. 일례로서, 예를 들어 키트의 부분 하나 이상은 본원에 정의된 본 발명의 핵산 서열 하나 이상을 포함할 수 있고, 키트의 또 다른 부분 하나 이상은 본원에 정의된 바와 같은 기타 구성 성분 하나 이상을 포함할 수 있는데, 예를 들어 상기 키트의 기타 부분 하나 이상은 약학 조성물 또는 백신 하나 이상을 포함할 수 있거나, 또는 키트의 부분, 예를 들어 키트 부분 하나 이상은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 키트의 추가 부분 하나 이상은 본원에 정의된 바와 같은 기타 구성 성분 하나 이상을 포함할 수 있으며, 키트의 추가 부분 하나 이상은 본 발명의 약학 조성물 또는 백신의 구성 성분 하나 이상 또는 본 발명의 약학 조성물 또는 백신 전체를 포함할 수 있고, 키트의 추가 부분 하나 이상은, 예를 들어 약학적 캐리어 또는 비이클 하나 이상을 포함할 수 있는 식이다. 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트는 본 발명의 핵산 서열 다수 개를 포함하고, 키트 구성 성분 하나는 그 내부에 본 발명의 핵산 서열 단 하나, 수 개 또는 전부를 포함할 수 있다. 대안적 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열 전부/각각은 키트의 상이한/별도의 구성 성분 내에 포함되어, 각각의 구성 성분이 키트의 일부를 이룰 수 있다. 또한 하나 이상의 핵산은 키트의 일부로서 제1 구성 성분 내에 포함될 수 있는 반면에, (키트의 기타 부분 하나 이상을 제공하는) 기타 구성 성분들(제2 또는 제3 구성 성분 등) 하나 이상은, 제1 구성 성분과 동일하거나 부분적으로 동일하거나 상이할 수 있는 본 발명의 핵산 하나 또는 하나 이상을 포함할 수 있다. (예를 들어 만일 키트가 여러 부분들로 이루어진 키트로서 제조되면) 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트는 또한 본 발명의 핵산 서열, 본 발명의 약학 조성물 또는 백신 또는 키트의 구성 성분 또는 부분 중 임의의 것을 투여하는 방법 및 투여량에 대한 정보를 담고 있는 기술 지침서를 포함할 수도 있다.
이러한 사실들을 종합하였을 때, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 제공하는데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 한 가지 유형 이상 포함하는 조성물에 관한 것인데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 특이 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이며; 핵산 서열들 각각은 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화한다.
본 발명의 조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 암 또는 종양과 연관된 질환의 치료를 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 2개 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함) 포함하는 조성물을 제공하는데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이며; 핵산 서열들 각각은 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화한다.
본 발명의 조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 암 또는 종양과 연관된 질환의 치료를 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 2개 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함) 포함하는 조성물을 제공하는데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이며; 핵산 서열들 각각은 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화하며; 바람직하게 핵산 서열의 각각의 유형은 상이한 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 상이한 종양 항원을 암호화한다.
본 발명의 조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 암 또는 종양과 연관된 질환의 치료를 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 2개 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 다수 개(이는 통상 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 10개 이상의 핵산, 예를 들어 2~10개, 바람직하게는 2~5개의 핵산을 의미함) 포함하는 조성물을 제공하는데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이며; 핵산 서열들 각각은 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화하고; 바람직하게 핵산 서열의 각각의 유형은 상이한 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 상이한 종양 항원을 암호화하며; 더욱 바람직하게 이에 포함된 핵산 서열의 한가지 유형은 PSA, PSMA, PSCA, STEAP-1, NY-ESO-1, 5T4, 서바이빈, MAGE-C1 또는 MAGE-C2를 암호화한다.
본 발명의 조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 암 또는 종양과 연관된 질환의 치료를 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 만일 핵산 서열이 NY-ESO1을 암호화하지 않는다면 오로지 한 가지 유형의 핵산 서열만을 포함하되, 다만, 이 조성물은 오로지 한 가지 유형의 핵산 서열만을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은
a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 및
c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열을 2개 이상 포함하는 조성물을 제공하는데,
여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하고, 바람직하게 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체이며; 핵산 서열들 각각은 상이한 펩티드 또는 단백질을 암호화하고; 핵산 서열들 중 하나 이상은 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-조효소 A 라세마제, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA15-3/CA27-29, CA19-9, CA72-4, CA125, 칼레티큘린, CAMEL, CASP-8/m, 카텝신 B, 카텝신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신 유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, C텐, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, F라우-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미성숙 라미닌 수용체, 칼리크레인-2, 칼리크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈 A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 매트릭스 단백질 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 군 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-B, NY-ESO-1, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로티나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1, 림프양 혈액 세포의 면역글로불린 이디오타입 또는 림프양 혈액 세포의 T 세포 수용체 이디오타입, 또는 상기 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체; 바람직하게 서바이빈 또는 이의 상동체, MAGE-군 유래 항원 또는 이의 결합 파트너, 또는 상기 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 암호화한다.
본 발명의 조성물은 또한 본원에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 암 또는 종양과 연관된 질환의 치료를 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 달리 특정되지 않은 한 대안들과 구체예들의 상이한 특징들은 서로 합하여질 수 있다. 뿐만 아니라 "~를 포함하는"이란 용어는, 구체적으로 언급되지 않은 한 "~로 이루어진"이라는 의미로 해석되어서는 안 될 것이다. 그러나 본 발명의 내용에 있어서, "~를 포함하는"이란 용어는 허용 가능한 경우 "~로 이루어진"이라는 용어로 대체될 수 있다.
본 발명은 암 또는 종양 질환을 치료 또는 예방 차원에서 처치함에 있어서, 선행 기술로부터 유전자 백신화에 사용되는 것으로 알려져 있는 핵산들과 관련하여, 바람직하게 mRNA를 추가로 안정화하고/안정화하거나 이러한 mRNA의 번역 효율을 높임으로써, 암호화된 단백질의 발현을 증가시키는 부가적 및/또는 대안적 방법을 제공할 수 있다.
도면:
이하 도면들은 본 발명을 좀더 자세히 기술하고자 제공되는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
도 1은 후생 동물 및 원생 동물 스템-루프로부터 얻어진 히스톤 스템-루프 공통 서열을 보여주는 것이다[문헌(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) 참조]. 후생 동물 및 원생 동물로부터 유래하는 4001개의 히스톤 스템-루프 서열들이 배열되었는데, 이 경우 발생한 뉴클레오티드들의 양(갯 수)이 스템-루프 서열 내 모든 위치에 대해 표시되어 있다. 얻어진 공통 서열, 즉 분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드를 나타내는 서열은 1문자 뉴클레오티드 암호를 사용하여 제시되어 있다. 공통 서열 이외에도, 분석된 서열들 내에 존재하는 뉴클레오티드들의 99% 이상, 95% 이상 및 90% 이상을 나타내는 서열들도 보인다.
도 2는 원생 동물 스템-루프 서열들로부터 얻어진 히스톤 스템-루프 공통 서열을 보여주는 것이다[문헌(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) 참조]. 원생 동물로부터 유래하는 131개의 히스톤 스템-루프 서열들이 배열되었는데, 이 경우, 발생한 뉴클레오티드들의 양(갯 수)이 스템-루프 서열 내 모든 위치에 대해 표시되어 있다. 얻어진 공통 서열, 즉 분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드를 나타내는 서열은 1문자 뉴클레오티드 암호를 사용하여 제시되어 있다. 공통 서열 이외에도, 분석된 서열들 내에 존재하는 뉴클레오티드들의 99% 이상, 95% 이상 및 90% 이상을 나타내는 서열들도 보인다.
도 3은 후생 동물 스템-루프 서열들로부터 얻어진 히스톤 스템-루프 공통 서열을 보여주는 것이다[문헌(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) 참조]. 후생 동물로부터 유래하는 3870개의 히스톤 스템-루프 서열들이 배열되었는데, 이 경우, 발생한 뉴클레오티드들의 양(갯 수)이 스템-루프 서열 내 모든 위치에 대해 표시되어 있다. 얻어진 공통 서열, 즉 분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드를 나타내는 서열은 1문자 뉴클레오티드 암호를 사용하여 제시되어 있다. 공통 서열 이외에도, 분석된 서열들 내에 존재하는 뉴클레오티드들의 99% 이상, 95% 이상 및 90% 이상을 나타내는 서열들도 보인다.
도 4는 척추 동물 스템-루프 서열들로부터 얻어진 히스톤 스템-루프 공통 서열을 보여주는 것이다[문헌(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) 참조]. 척추 동물로부터 유래하는 1333개의 히스톤 스템-루프 서열들이 배열되었는데, 이 경우, 발생한 뉴클레오티드들의 양(갯 수)이 스템-루프 서열 내 모든 위치에 대해 표시되어 있다. 얻어진 공통 서열, 즉 분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드를 나타내는 서열은 1문자 뉴클레오티드 암호를 사용하여 제시되어 있다. 공통 서열 이외에도, 분석된 서열들 내에 존재하는 뉴클레오티드들의 99% 이상, 95% 이상 및 90% 이상을 나타내는 서열들도 보인다.
도 5는 사람(호모 사피엔스) 스템-루프 서열들로부터 얻어진 히스톤 스템-루프 공통 서열을 보여주는 것이다[문헌(Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308) 참조]. 사람으로부터 유래하는 84개의 히스톤 스템-루프 서열들이 배열되었는데, 이 경우, 발생한 뉴클레오티드들의 양(갯 수)이 스템-루프 서열 내 모든 위치에 대해 표시되어 있다. 얻어진 공통 서열, 즉 분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드를 나타내는 서열은 1문자 뉴클레오티드 암호를 사용하여 제시되어 있다. 공통 서열 이외에도, 분석된 서열들 내에 존재하는 뉴클레오티드들의 99% 이상, 95% 이상 및 90% 이상을 나타내는 서열들도 보인다.
도 6~도 21은 시험관 내 전사로 생성된 mRNA들을 보여주는 것이다.
시험관 내 전사에 의해 얻어진 mRNA들의 명칭과 서열이 제시되어 있다. 다음과 같은 축약어들이 사용된다:
ppLuc(GC): 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제를 암호화하는 GC-풍부 mRNA 서열
ag: 알파 글로빈 유전자의 3' 비번역 영역(UTR)
A64: 아데닐레이트 64개를 포함하는 폴리(A)-서열
A120: 아데닐레이트 120개를 포함하는 폴리(A)-서열
히스톤SL: 히스톤 스템-루프
aCPSL: αCP-2KL 단백질의 자체 특이 결합을 위해 라이브러리로부터 선별된 스템-루프
폴리오CL: 폴리오 바이러스 게놈 RNA로부터 유래하는 5' 클로버잎형 서열부
G30: 30개의 구아닐레이트를 포함하는 폴리(G) 서열
U30: 30개의 우리딜레이트를 포함하는 폴리(U) 서열
SL: 비특이/인공 스템-루프
N32: 32개의 뉴클레오티드로 이루어진 비특이 서열
NY-ESO-1(G/C): 사람 종양 항원 NY-ESO-1을 암호화하는 GC 풍부 mRNA 서열
서바이빈(G/C): 사람 종양 항원 서바이빈을 암호화하는 GC 풍부 mRNA 서열
MAGE-C1(G/C): 사람 종양 항원 MAGE-C1을 암호화하는 GC 풍부 mRNA 서열
서열 내 다음과 같은 요소들은 강조 표시되어 있다: 암호화 영역(ORF)(대문자), ag(굵은 글씨), 히스톤SL(밑줄 표시), 테스트된 추가의 개별 서열들(이탤릭체).
도 6은 ppLuc ( GC )- ag의 mRNA 서열(서열 번호 43)을 보여주는 것이다. 알파-글로빈 3'-UTR(ag) 바로 다음에 있는 제한 위치에서 원래 벡터를 선형화함으로써 폴리(A) 서열이 결실된 mRNA가 제조된다.
도 7은 ppLuc ( GC )- ag -A64의 mRNA 서열(서열 번호 44)을 보여주는 것이다. A64 폴리(A) 서열 바로 다음에 있는 제한 위치에서 원래 벡터를 선형화함으로써 A64 폴리(A) 서열로 종결되는 mRNA가 제조된다.
도 8은 ppLuc ( GC )- ag - 히스톤SL의 mRNA 서열(서열 번호 45)을 보여주는 것이다. A64 폴리(A) 서열이 히스톤SL로 치환되었다. 실시예들에서 사용된 히스톤 스템-루프 서열은 문헌[Cakmakci et al . (2008). Molecular and Cellular Biology, 28(3), 1182-1194]에 기술된 바와 같이 제조되었다.
도 9는 ppLuc ( GC )- ag -A64- 히스톤SL의 mRNA 서열(서열 번호 46)을 보여주는 것이다. 히스톤SL이 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다.
도 10은 ppLuc ( GC )- ag -A120의 mRNA 서열(서열 번호 47)을 보여주는 것이다. A64 폴리(A) 서열이 A120 폴리(A) 서열로 치환되었다.
도 11은 ppLuc ( GC )- ag -A64- ag의 mRNA 서열(서열 번호 48)을 보여주는 것이다. 제2 알파-글로빈 3'-UTR이 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다.
도 12는 ppLuc ( GC )- ag -A64- aCPSL의 mRNA 서열(서열 번호 49)을 보여주는 것이다. 스템-루프는 A64 폴리(A) 서열의 3' 말단에 부착되었다. 스템-루프는 αCP-2KL 단백질의 자체 특이 결합을 위해 라이브러리로부터 선별되었다[Thisted et al ., (2001), The Journal of Biological Chemistry, 276(20), 17484-17496]. αCP-2KL은 αCP-2의 동형 단백질로서, 가장 강력하게 발현되는 αCP 단백질(알파-글로빈 mRNA 폴리(C) 결합 단백질)[Makeyev et al., (2000), Genomics, 67(3), 301-316], 즉 알파-글로빈 3'-UTR에 결합하는 RNA 결합 단백질 군이다[Chkheidze et al., (1999), Molecular and Cellular Biology, 19(7), 4572-4581].
도 13은 ppLuc ( GC )- ag -A64- 폴리오CL의 mRNA 서열(서열 번호 50)을 보여주는 것이다. 폴리오 바이러스 게놈 RNA 유래 5' 클로버잎형 서열부는 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다.
도 14는 ppLuc ( GC )- ag -A64- G30의 mRNA 서열(서열 번호 51)을 보여주는 것이다. 30개의 구아닐레이트로 이루어진 구획은 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다.
도 15는 ppLuc ( GC )- ag -A64- U30의 mRNA 서열(서열 번호 52)을 보여주는 것이다. 30개의 우리딜레이트로 이루어진 구획은 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다.
도 16은 ppLuc ( GC )- ag -A64- SL의 mRNA 서열(서열 번호 53)을 보여주는 것이다. 스템-루프는 A64 폴리(A)의 3' 말단에 부착되었다. 스템-루프의 상부는 문헌[Babendure et al., (2006), RNA (New York, N.Y.), 12(5), 851-861]에 개시된 바와 같이 구하였다. 스템-루프는 길이 17bp인 CG-풍부 스템 및 길이 6bp인 루프로 이루어져 있다.
도 17은 ppLuc ( GC )- ag -A64- N32(서열 번호 54)를 보여주는 것이다. 대안적 제한 위치에서 원래 벡터를 선형화함으로써 폴리(A) 다음에 부가 뉴클레오티드 32개를 포함하는 mRNA가 얻어진다.
도 18은 NY - ESO -1( GC )- ag -A64- C30의 mRNA 서열(서열 번호 55)을 보여주는 것이다.
도 19는 NY - ESO -1( GC )- ag -A64- C30 - 히스톤SL의 mRNA 서열(서열 번호 56)을 보여주는 것이다.
도 20은 서바이빈 ( GC )- ag -A64- C30 - 히스톤SL의 mRNA 서열(서열 번호 57)을 보여주는 것이다.
도 21은 MAGE - C1 ( GC )- ag -A64- C30 - 히스톤SL의 mRNA 서열(서열 번호 58)을 보여주는 것이다.
도 22는 폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합이 mRNA로부터의 단백질 발현을 상승적 방식으로 증가시키는 것을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열, 히스톤SL, 그리고 폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 루시퍼라제 발현에 미치는 영향력이 관찰되었다. 그러므로 상이한 mRNA들은 HeLa 세포 내에 전기 천공으로 도입되었다. 루시퍼라제 수준은 형질 감염 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시에 측정되었다. 폴리(A) 서열도, 히스톤SL도 가지지 않는 mRNA로부터는 소량의 루시퍼라제가 발현된다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL 둘 다는 각각 따로 존재할 때 루시퍼라제 수준을 증가시키긴 한다. 그러나 놀랍게도 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준을, 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가시킨다(즉 상승 작용함). 데이터들을 기반으로, 3회 형질 감염에 대한 평균 RLU±SD(상대적 광단위(relative light unit)±표준 편차)를 구하여 그래프가 작성된다. 비 RLU는 실시예 14.2에 요약되어 있다.
도 23은 폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합이, 이것들의 순서에 상관 없이 mRNA로부터의 단백질 발현을 증가시키는 것을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열, 히스톤SL, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합, 그리고 이 요소들의 순서가, mRNA로부터의 루시퍼라제 발현에 미치는 영향력이 관찰되었다. 그러므로 상이한 mRNA들이 HeLa 세포에 리포펙션되었다. 루시퍼라제 수준은 형질 감염 개시 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시에 측정되었다. A64 폴리(A) 서열 또는 히스톤SL 둘 다가 각각 따로 존재할 때 루시퍼라제 수준들은 거의 동일하다. A64로부터 A120 또는 A300에 이르기까지의 폴리(A) 서열의 길이가 증가함에 따라 루시퍼라제 수준은 보통 수준으로 증가한다. 이와는 대조적으로 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재할 때 루시퍼라제 수준은 폴리(A) 서열의 길이를 늘였을 때보다 훨씬 더 증가한다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재할 때에는 루시퍼라제 수준이 상기 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가한 것으로 보아, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합은 상승 작용하는 것으로 생각된다. A64-히스톤SL 또는 히스톤SL-A250 mRNA와 함께 있을 때, 폴리(A) 서열과 히스톤SL 조합의 상승 효과는, 이 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 순서, 그리고 폴리(A)의 길이와는 상관없는 것으로 확인된다. 데이터들을 기반으로, 3회 형질 감염에 대한 평균 RLU±SD를 구하여 그래프가 작성된다. 비 RLU는 실시예 14.3에 요약되어 있다.
도 24는 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합에 의하여 단백질 발현이 특이적으로 증가함을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합, 또는 폴리(A) 서열과 대안적 서열의 조합이, mRNA로부터의 루시퍼라제 발현에 미치는 영향력이 관찰되었다. 그러므로 상이한 mRNA들이 HeLa 세포에 전기 천공으로 도입되었다. 루시퍼라제 수준은 형질 감염 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시에 측정되었다. 폴리(A) 서열 또는 히스톤SL 둘 다가 각각 따로 존재할 때 루시퍼라제 수준들은 거의 동일하다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준은, 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가한다(즉 상승 작용함). 이와는 대조적으로, 기타 서열들 중 임의의 것과 폴리(A) 서열이 조합되면, 폴리(A) 서열만을 포함하는 mRNA의 경우에 비하여 루시퍼라제 수준이 어떠한 영향도 받지 않는다. 그러므로 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합은 특이적이면서 상승적으로 작용을 한다. 데이터들을 기반으로, 3회 형질 감염에 대한 평균 RLU±SD를 구하여 그래프가 작성된다. 비 RLU는 실시예 14.4에 요약되어 있다.
도 25는 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 mRNA로부터의 단백질 발현이 생체 내에서 상승적 방식으로 증가하는 것을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열, 히스톤SL, 그리고 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 루시퍼라제 발현에 미치는 영향력이 생체 내에서 관찰되었다. 그러므로 상이한 mRNA들이 마우스에 피내 주사되었다. 주사 후 16시간 경과시 마우스를 죽이고 나서, 주사 위치에서의 루시퍼라제 수준들이 측정되었다. 루시퍼라제는 히스톤SL 또는 폴리(A) 서열 중 어느 하나를 가지는 mRNA로부터 발현된다. 그러나 놀랍게도 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준은, 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가한다(즉 상승 작용함). 데이터들을 기반으로, 평균 RLU±SEM(상대적 광단위±평균의 표준 오차)을 구하여 그래프가 작성된다. 비 RLU는 실시예 14.5에 요약되어 있다.
도 26은 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 mRNA로부터의 NY-ESO-1 단백질 발현이 증가하는 것을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열과, 폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 NY-ESO-1 발현에 미치는 영향력이 관찰되었다. 그러므로 상이한 mRNA들이 전기 천공법에 의해 HeLa 세포에 도입되었다. NY-ESO-1 수준은 형질 감염 후 24시간 경과시 유동세포계수법으로 측정되었다. NY-ESO-1은 폴리(A) 서열만을 가지는 mRNA로부터 발현된다. 그러나 놀랍게도 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 NY-ESO-1 수준은, 폴리(A) 서열만이 존재할 때에 관찰되는 NY-ESO-1 수준보다 복합적으로 더 많이 증가한다. 데이터들을 기반으로, 형광 강도에 대해 측정한 카운트(count)를 구하여 그래프가 작성된다. 중앙 형광 강도(Median Fluorescene Intensity; MFI)는 실시예 14.6에 요약되어 있다.
도 27은 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 mRNA를 사용하는 백신화를 통해 생성되는 항체의 수준이 증가한다는 것을 보여주는 것이다.
폴리(A) 서열이, mRNA를 사용하는 백신화를 통해 생성되는 항 NY-ESO-1 항체 유도에 미치는 영향력과, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이, mRNA를 사용하는 백신화를 통해 생성되는 항 NY-ESO-1 항체 유도에 미치는 영향력이 관찰되었다. 그러므로 C57BL/6 마우스는 프로타민과 복합체를 형성한 상이한 mRNA들의 피하 주사를 통해 백신화되었다. 백신화된 마우스와 대조군 마우스에 있어서 NY-ESO-1 특이 항체의 수준이, 일련의 혈청 희석액을 사용하는 ELISA에 의해 분석되었다. 항 NY-ESO-1 IgG2a[b]는 폴리(A) 서열만을 가지는 mRNA에 의해 유도된다. 그러나 놀랍게도 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재하면 항 NY-ESO-1 IgG2a[b] 수준은, 폴리(A) 서열만이 존재할 때에 관찰되는 항 NY-ESO-1 IgG2a[b] 수준보다 복합적으로 더 많이 증가한다. 데이터들을 기반으로, 평균 종말 적정에 대한 그래프가 작성된다. 평균 종말 적정은 실시예 14.7에 요약되어 있다.
실시예 :
이하 실시예들은 본 발명을 자세히 기술하기 위한 것으로서, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
1. 히스톤 스템 -루프 공통 서열들의 제조
실험에 앞서서, 후생 동물과 원생 동물의 히스톤 스템-루프 서열들을 기반으로 히스톤 스템-루프 공통 서열들을 결정하였다. 서열들을, 게놈 서열들과 발현된 서열 태그들을 찾아내어 다수의 천연 히스톤 스템-루프 서열들을 동정한 로페즈(Lopez)외 다수에 의해 제공된 부록으로부터 구하였다[Davila Lopez, M., & Samuelsson, T. (2008), RNA (New York, N.Y.), 14(1), 1-10. doi:10.1261/rna.782308]. 우선, 후생 동물 및 원생 동물로부터 유래하는 모든 서열들(4001개 서열들) 또는 원생 동물로부터 유래하는 모든 서열들(131개 서열들), 또는 후생 동물로부터 유래하는 모든 서열들(3870개 서열들) 또는 척추 동물로부터 유래하는 모든 서열들(1333개 서열들) 또는 사람으로부터 유래하는 모든 서열들(84개 서열들)을 그룹으로 나누어 배열하였다. 그 다음, 발생한 뉴클레오티드들의 양을 매 위치에 대하여 측정하였다. 이와 같이 작성한 표들에 입각하여 5개의 상이한 서열 그룹에 대한 공통 서열[분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드들을 나타내는 서열]들을 제조하였다. 또한 더욱 제한적인 공통 서열들도 제조하였는데, 이 서열들에서는 보존된 뉴클레오티드들이 점점 더 많이 강조되었다.
2. DNA 주형들의 제조
시험관 내 전사용인 벡터로서, T7 프로모터, 포티누스 피랄리스 루시퍼라제를 암호화하는 GC 풍부 서열(ppLuc(GC)), 알파-글로빈(ag)의 3' 비번역 영역(UTR)의 중앙부 그리고 폴리(A) 서열을, 이 순서대로 포함하는 벡터를 구성하였다. 폴리(A) 서열 바로 뒤에는 시험관 내 전사 전 벡터의 선형화에 사용되는 제한 위치를 배치하여, A64 폴리(A) 서열로 종결되는 mRNA를 만들었다. 그러므로 시험관 내 전사에 의해 이 벡터로부터 얻어진 mRNA를 "ppLuc(GC)-ag-A64"라고 명명하였다.
시험관 내 전사 전 대안적 제한 위치들에서 상기 벡터를 선형화하였을 경우, A64의 부가 뉴클레오티드 3' 말단에 의해 연장되었거나, 아니면 A64가 결실된 mRNA가 제조될 수 있었다. 뿐만 아니라, 원래 벡터를, 대안적 서열들을 포함하도록 변형시켰다. 요약하면, 시험관 내 전사를 통하여 이러한 벡터들로부터 다음과 같은 mRNA들을 제조하였다(mRNA 서열들은 도 6~17에 제시함):
ppLuc(GC)-ag (서열 번호 43)
ppLuc(GC)-ag-A64 (서열 번호 44)
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL (서열 번호 45)
ppLuc(GC)-ag-A64-히스톤SL (서열 번호 46)
ppLuc(GC)-ag-A120 (서열 번호 47)
ppLuc(GC)-ag-A64-ag (서열 번호 48)
ppLuc(GC)-ag-A64-aCPSL (서열 번호 49)
ppLuc(GC)-ag-A64-폴리오CL (서열 번호 50)
ppLuc(GC)-ag-A64-G30 (서열 번호 51)
ppLuc(GC)-ag-A64-U30 (서열 번호 52)
ppLuc(GC)-ag-A64-SL (서열 번호 53)
ppLuc(GC)-ag-A64-N32 (서열 번호 54)
또한 종양 항원 NY-ESO-1, 서바이빈 및 MAGE-C1을 암호화하는 DNA 플라스미드 서열들을 전술된 바에 따라서 제조하였다. 요약하면, 시험관 내 전사를 통하여 이러한 벡터들로부터 다음과 같은 mRNA들을 제조하였다(mRNA 서열들은 도 18~21에 제시함):
NY-ESO-1(GC)-ag-A62-C30 (서열 번호 55)
NY-ESO-1(GC)-ag-A62-C30-히스톤SL (서열 번호 56)
서바이빈(GC)-ag-A62-C30-히스톤SL (서열 번호 57)
MAGE-C1(GC)-ag-A64-C30-히스톤SL (서열 번호 58)
3. 시험관 내 전사
실시예 2에 따른 DNA 주형을 선형화한 다음, T7-중합 효소를 사용하여 시험관 내 전사를 수행하였다. 그 다음, DNA-주형을 DNase로 처리하여 분해하였다. 모든 mRNA 전사체들은, 과량의 N7-메틸-구아노신-5'-트리포스페이트-5'-구아노신을 전사 반응에 첨가함으로써 얻어진 5'-CAP 구조를 포함하였다. 이와 같이 제조된 mRNA를 정제한 다음 물에 재현탁하였다.
4. mRNA 의 효소에 의한 아데닐화
2개의 mRNA들을 효소에 의해 아데닐화하였다:
ppLuc(GC)-ag-A64 및 ppLuc(GC)-ag-히스톤SL.
이를 위해서 RNA를 이.콜라이 폴리(A)-중합 효소 및 ATP와 함께 제조자의 지시에 따라서 항온 처리하였다(폴리(A) 중합 효소 미부화 키트, 에피센터, 매디슨, USA). 폴리(A) 서열이 연장된 mRNA를 정제한 다음, 물에 재현탁하였다. 폴리(A) 서열의 길이를 아가로스 겔 전기 영동을 통해 측정하였다. 개시 mRNA를 약 250개의 아데닐레이트로 연장시켰으며, 이로써 생성된 mRNA들을 각각 다음과 같이 명명하였다:
ppLuc(GC)-ag-A300 및 ppLuc(GC)-ag-히스톤SL-A250
5. mRNA 전기 천공법에 의한 루시퍼라제 발현
HeLa 세포들을 트립신 처리하고 나서 opti-MEM으로 세정하였다. opti-MEM 200㎕ 중 1×105개의 세포들을 각각 전기 천공하여 ppLuc 암호화 mRNA 0.5㎍을 도입하였다. 대조군으로서, ppLuc를 암호화하지 않는 mRNA를 별도로 전기 천공하여 도입하였다. 전기 천공된 세포들을 RPMI 1640 배지 1㎖ 중 24웰 평판에 접종하였다. 형질 감염 후 6시간, 24시간 또는 48시간 경과시, 배지를 흡인한 다음, 세포들을 용해 완충액(25mM 트리스, pH7.5(HCl), 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 2mM DTT, 1mM PMSF) 200㎕ 중에서 용해하였다. ppLuc 활성을 측정할 때까지 용해물을 -20℃에 보관하여 두었다.
6. mRNA 리포펙션에 의한 루시퍼라제 발현
HeLa 세포들을 96웰 평판에, 밀도 2×104 세포/웰이 되도록 접종하였다. 그 다음날, 세포들을 opti-MEM 중에서 세정한 다음, 이 세포들을 리포펙틴 복합체화 ppLuc 암호화 mRNA 0.25㎍으로 형질 감염시켰다(opti-MEM 150㎕ 중). 대조군으로서, ppLuc를 암호화하지 않는 mRNA를 별도로 리포펙션하였다. 형질 감염 개시 후 6시간 경과시에 몇몇 웰에 담겨있는 opti-MEM을 흡인해낸 다음, 세포들을 용해 완충액 200㎕ 중에서 용해하였다. 이때, 나머지 웰들에 담겨있던 opti-MEM은 RPMI 1640 배지로 교환하였다. 형질 감염 개시 후 24시간 또는 48시간 경과시에 이 웰들에 담겨있던 배지를 흡인해낸 다음, 세포들을 용해 완충액 200㎕ 중에서 용해하였다. ppLuc 활성을 측정할 때까지 용해물을 -20℃에 보관하여 두었다.
7. 루시퍼라제 분석
바이오텍 시너지HT(BioTek SynergyHT) 평판 판독기 중에서 5초의 측정 시간을 가지고 ppLuc 활성을 상대적 광단위(RLU)로서 측정하였다[용해물 50㎕ 및 루시페린 완충액(25mM 글리실글리신, pH7.8(NaOH), 15mM MgSO4, 2mM ATP, 75μM 루시페린) 200㎕ 사용]. 총 RLU로부터 대조군 RNA의 RLU를 공제하여 비 RLU를 산정하였다.
8. 피 내 mRNA 주사를 통한 루시퍼라제 발현(생체 내 루시퍼라제 발현)
럼푼과 케타벳의 혼합물로 마우스를 마취시켰다. ppLuc 암호화 mRNA 각각을 피 내 주사하였다[주사액당 50㎕ 중 mRNA 0.5㎍]. 대조군으로서 ppLuc를 암호화하지 않는 mRNA를 별도로 주사하였다. 주사 후 16시간 경과시 마우스를 죽이고 조직을 수집하였다. 조직 샘플을 액체 질소 중에서 급속 동결(flash frozen)하고 나서, 용해 완충액[25mM 트리스, pH7.5(HCl), 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 2mM DTT, 1mM PMSF] 800㎕ 중 조직 용해 장치(키아젠(Qiagen))에서 용해하였다. 이후 샘플들을 13500rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다(4℃). ppLuc 활성을 측정할 때까지 용해물을 -80℃에 보관하여 두었다(상기 "7. 루시퍼라제 분석" 참조).
9. mRNA 전기 천공법에 의한 NY - ESO -1 발현
HeLa 세포를 트립신으로 처리한 후 opti-MEM 중에서 세정하였다. 200㎕ optiMEM 중 2×105개의 세포들을 전기 천공하여 NY-ESO-1 암호화 mRNA 10㎍을 도입하였다. 3회의 전기 천공을 거친 세포를 합한 다음, RPMI 1640 배지 2㎖ 중 6웰 평판에 접종하였다. 형질 감염후 24시간 경과시 세포를 수집하여, 이를 96웰 V 바닥 평판으로 옮겼다(mRNA당 2웰). 세포를 인산염 완충된 염수(PBS)로 세정한 다음, 웰당 사이토픽스(Cytofix)/사이토펌(Cytoperm)(벡톤 디킨슨(Becton Dickinsob)(BD)) 200㎕로 투과 처리하였다. 15분 경과시 세포를 펌워시(PermWash)(BD)로 세정하였다. 그 다음, 세포를 실온에서 1시간 동안 마우스 항 NY-ESO-1 IgG1 또는 이소타입 대조군(20㎍/㎖)과 함께 항온 처리하였다. 세포를 다시 펌워시로 2회 세정하였다. 이후, 세포를 4℃에서 1시간 동안 염소 항 마우스 IgG와 결합한 알렉사-647의 1:500 희석액과 함께 항온 처리하였다. 마지막으로 세포를 펌워시로 2회 세정하였다. 세포를 완충액[PBS, 2% FCS, 2mM EDTA, 0.01% 소듐 아지드] 200㎕ 중에 재현탁하였다. NY-ESO-1 발현을 유동세포계수법으로 중앙 형광 강도(MFI)로서 정량하였다.
10. mRNA 를 사용하는 백신화를 통한 항 NY - ESO -1 항체의 유도
C57BL/6 마우스에, 프로타민이 복합체화된 NY-ESO-1 암호화 mRNA를 피 내 주사함으로써(14일 동안 5회) 이 마우스를 백신화하였다. 대조군 마우스는 완충액으로 처리하였다. 마지막 백신화 이후 8일 경과시에 백신화된 마우스와 대조군 마우스 체내 NY-ESO-1 특이 항체의 수준을 ELISA에 의해 분석하였는데: 이 경우, 96웰 ELISA 평판(Nunc)을 10㎍/㎖의 재조합 NY-ESO-1 단백질 100㎕(웰 당)로 코팅하였다(16시간, 4℃). 평판을 세정 완충액(PBS, 0.05% 트윈(Tween)-20)으로 2회 세정하였다. 비 특이 결합을 차단하기 위해, 이후 평판을 차단 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20, 1% BSA)과 함께 항온 처리하였다(2시간, 37℃). 차단 후 연속 희석 마우스 혈청을 웰 당 100㎕씩 가한 다음, 이를 실온에서 4시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 평판을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 이후, 차단 완충액 중 1:600으로 희석된 바이오틴화 래트 항 마우스 IgG2a[b] 검출 항체(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 100㎕(웰 당)를 평판에 결합시켰다(1시간, 실온). 평판을 세정 완충액으로 다시 3회 세정한 다음, 호오스-래디쉬 퍼옥시다제 결합 스트렙타비딘 100㎕(웰 당)와 함께 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 세정 완충액으로 4회 세정한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(서모 사이언티픽(ThermoScientific))을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 색에 변화가 일어날 때 여기에 20% 황산을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
11. mRNA 를 사용하는 백신화를 통한 항 서바이빈 항체의 유도
C57BL/6 마우스에, 프로타민이 복합체화된 서바이빈 암호화 mRNA를 피 내 주사함으로써(14일 동안 5회) 이 마우스를 백신화하였다. 대조군 마우스는 완충액으로 처리하였다. 마지막 백신화 이후 8일 경과시에 백신화된 마우스와 대조군 마우스 체내 서바이빈 특이 항체의 수준을 ELISA에 의해 분석하였는데: 이 경우, 96웰 ELISA 평판(Nunc)을 10㎍/㎖의 재조합 서바이빈 단백질 100㎕(웰 당)로 코팅하였다(16시간, 4℃). 평판을 세정 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20)으로 2회 세정하였다. 비 특이 결합을 차단하기 위해, 이후 평판을 차단 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20, 1% BSA)과 함께 항온 처리하였다(2시간, 37℃). 차단 후 연속 희석 마우스 혈청을 웰 당 100㎕씩 가한 다음, 이를 실온에서 4시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 평판을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 이후, 차단 완충액 중 1:600으로 희석된 바이오틴화 래트 항 마우스 IgG2a[b] 검출 항체(BD 바이오사이언시스) 100㎕(웰 당)를 평판에 결합시켰다(1시간, 실온). 평판을 세정 완충액으로 다시 3회 세정한 다음, 호오스-래디쉬 퍼옥시다제 결합 스트렙타비딘 100㎕(웰 당)와 함께 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 세정 완충액으로 4회 세정한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(서모 사이언티픽)을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 색에 변화가 일어날 때 여기에 20% 황산을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
12. mRNA 를 사용하는 백신화를 통한 항 MAGE-C1 항체의 유도
C57BL/6 마우스에, 프로타민이 복합체화된 MAGE-C1 암호화 mRNA를 피 내 주사함으로써(14일 동안 5회) 이 마우스를 백신화하였다. 대조군 마우스는 완충액으로 처리하였다. 마지막 백신화 이후 8일 경과시에 백신화된 마우스와 대조군 마우스 체내 MAGE-C1 특이 항체의 수준을 ELISA에 의해 분석하였는데: 이 경우, 96웰 ELISA 평판(Nunc)을 10㎍/㎖의 재조합 MAGE-C1 단백질 100㎕(웰 당)로 코팅하였다(16시간, 4℃). 평판을 세정 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20)으로 2회 세정하였다. 비 특이 결합을 차단하기 위해, 이후 평판을 차단 완충액(PBS, 0.05% 트윈-20, 1% BSA)과 함께 항온 처리하였다(2시간, 37℃). 차단 후 연속 희석 마우스 혈청을 웰 당 100㎕씩 가한 다음, 이를 실온에서 4시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 평판을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 이후, 차단 완충액 중 1:600으로 희석된 바이오틴화 래트 항 마우스 IgG2a[b] 검출 항체(BD 바이오사이언시스) 100㎕(웰 당)를 평판에 결합시켰다(1시간, 실온). 평판을 세정 완충액으로 다시 3회 세정한 다음, 호오스-래디쉬 퍼옥시다제 결합 스트렙타비딘 100㎕(웰 당)와 함께 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 세정 완충액으로 4회 세정한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(서모 사이언티픽)을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 색에 변화가 일어날 때 여기에 20% 황산을 웰 당 100㎕씩 첨가하였다. 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
13. ELISPOT 에 의한 항원 특이 세포 면역 반응(T 세포 면역 반응)의 확인
C57BL/6 마우스에, 프로타민이 복합체화된 MAGE-C1 암호화 mRNA를 피 내 주사함으로써(14일 동안 5회) 이 마우스를 백신화하였다. 대조군 마우스는 완충액으로 처리하였다. 마지막 백신화 이후 1주일 경과시 마우스를 죽이고, 비장을 꺼내어 이로부터 비장 세포를 분리하였다. 상기 항원 유래 펩티드(펩티드 라이브러리) 존재하에 7일 동안 상기 비장 세포를 재자극하였거나, 항원을 암호화하는 mRNA로 전기 천공된, 천연 동계 마우스의 골수 세포로부터 얻어진 수지상 세포와 함께 공동 항온 처리하였다. 항원 특이 세포 면역 반응을 분석하기 위해, 재자극 후 IFN감마 분비 여부를 확인하였다. IFN감마를 확인하기 위해, 코트 멀티스크린 평판(coat multiscreen plate)(밀리포어(Millipore))를, IFNγ에 대한 항체(BD 파밍겐(BD Pharmingen), 독일 하이델베르그)를 포함하는 코팅 완충액(0.1M 탄산염-중탄산염 완충액, pH9.6, 10.59g/l Na2CO3, 8.4g/l NaHCO3)과 함께 밤새도록 항온 처리하였다. 상기 평판 중에서 자극제 및 효과기 세포(비율 1:20)도 함께 24시간 동안 항온 처리하였다. 평판을 1×PBS로 세정한 다음, 바이오틴 결합 2차 항체와 함께 항온 처리하였다. 이를 1×PBS/0.05% 트윈-20으로 세정한 다음, 기질 (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염/니트로 블루 테트라졸륨 액체 기질 시스템(시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 독일 타우프키르헨)을 상기 평판에 가하였더니, 기질 전환을 눈으로 확인할 수 있었다.
14. 결과
14.1 히스톤 스템 -루프 서열:
히스톤 스템-루프 서열들을 특성 규명하기 위해서, 후생 동물과 원생 동물로부터 유래하는 서열들(4001개 서열들) 또는 원생 동물로부터 유래하는 서열들(131개 서열들) 또는 대안적으로 후생 동물로부터 유래하는 서열들(3870개 서열들) 또는 척추 동물로부터 유래하는 서열들(1333개 서열들) 또는 사람으로부터 유래하는 서열들(84개 서열들)을 그룹으로 나누어 배열하였다. 그 다음, 발생한 뉴클레오티드들의 양을 매 위치에 대하여 측정하였다. 이와 같이 작성한 표들에 입각하여 5개의 상이한 서열 그룹에 대한 공통 서열[분석된 서열들 내에 존재하는 모든 뉴클레오티드들을 나타내는 서열]들을 제조하였다. 합하여진 후생 동물 및 원생 동물의 공통 서열 내 뉴클레오티드 3개는 염기쌍을 형성하면서 보존되어 있었다[루프 내 T/U 및 스템 내 G 및 C]. 구조적으로 통상 6개의 염기쌍으로 이루어진 스템과 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 루프가 형성되었다. 그러나 편향된 구조들이 일반적으로 관찰되었다: 84개의 사람 히스톤 스템-루프들 중 2개는 4개의 염기쌍과 하나의 미스 매치부를 포함하는, 5개의 뉴클레오티드들만으로 이루어진스템을 포함하였다. 또 다른 사람 히스톤 스템-루프는 5개의 염기쌍들만으로 이루어진 스템을 포함하였다. 추가로 사람 히스톤 스템-루프 4개는 길이가 6 뉴클레오티드인 스템을 포함하였으나, 3개의 상이한 위치 각각에는 하나의 미스 매치부를 포함하였다. 뿐만 아니라 4개의 사람 히스톤 스템-루프는 2개의 상이한 위치 각각에 하나의 워블 염기쌍을 포함하였다. 루프에 있어서, 5개의 뉴클레오티드들로 이루어진 루프가 디.디스코이데움(D. discoideum)에서 확인된 것으로 보아, 길이 4 뉴클레오티드는 엄격하게 요구되지는 않는 것으로 보였다.
분석된 서열들에 존재하는 모든 뉴클레오티드들을 나타내는 공통 서열들 이외에, 더욱 제한적인 공통 서열들도 얻어졌는데, 이 서열들에서는 보존된 뉴클레오티드들이 점점 더 많이 강조되었다. 요약하면 다음과 같은 서열들이 얻어졌다:
(Cons): 존재하는 모든 뉴클레오티드들을 나타냄.
(99%): 존재하는 모든 뉴클레오티드들의 99% 이상을 나타냄.
(95%): 존재하는 모든 뉴클레오티드들의 95% 이상을 나타냄.
(90%): 존재하는 모든 뉴클레오티드들의 90% 이상을 나타냄.
히스톤 스템-루프 서열들의 분석 결과들을 이하 표 2~6에 요약하여 제시하였다(도 1~5도 참조):
Figure pct00019
원생 동물 히스톤 스템-루프 공통 서열:
(131개 원생 동물 히스톤 스템-루프 서열들의 배열을 바탕으로 함)(도 2 참조)
< < < < < < > > > > > >
# A 52 32 71 82 76 13 0 12 12 9 1 46 3 0 75 82 53 79 20 0 4 94 17 35 74 56
# T 20 32 37 21 8 3 0 21 85 58 86 70 65 131 28 1 17 13 10 0 15 7 31 32 20 28
# C 45 59 20 25 38 0 0 86 8 54 42 13 58 0 27 2 6 31 10 131 112 5 82 58 30 40
# G 14 8 3 3 9 115 131 12 26 10 2 2 5 0 1 46 55 8 91 0 0 25 1 6 7 7
Cons N* N* N N N D G N N N N N N T N N N N N C H N N N* N* N*
99% N* N* N N N D G N N N B N N T H V N N N C H N H N* N* N*
95% N* N* H H N R G N N N Y H B T H R D N N C Y D H H* N* N*
90% N* H* H H V R G N D B Y H Y T H R D H N C Y R H H* H* H*
Figure pct00020
Figure pct00021
호모 사피엔스 히스톤 스템-루프 공통 서열:
(84개 사람 히스톤 스템-루프 서열들의 배열을 바탕으로 함)(도 5 참조)
< < < < < < > > > > > >
# A 10 17 84 84 76 1 0 1 0 0 0 1 0 0 12 84 0 65 3 0 0 69 5 0 10 64
# T 8 6 0 0 2 2 0 1 67 0 84 80 81 84 5 0 0 0 0 0 0 0 4 25 24 3
# C 62 61 0 0 6 0 0 82 17 84 0 0 3 0 67 0 1 0 0 84 84 5 75 57 44 17
# G 4 0 0 0 0 81 84 0 0 0 0 3 0 0 0 0 83 19 81 0 0 10 0 2 6 0
Cons N* H* A A H D G H Y C T D Y T H A S R R C C V H B* N* H*
99% N* H* A A H D G H Y C T D Y T H A S R R C C V H B* N* H*
95% H* H* A A M G G C Y C T T T T H A G R G C C V M Y* N* M*
90% H* M* A A A G G C Y C T T T T M A G R G C C R M Y* H* M*
상기 표들에서 사용된 축약어들은 다음과 같이 정의되었다:
축약어 뉴클레오티드 염기 비고
G G 구아닌
A A 아데닌
T T 티민
U U 우라실
C C 시토신
R G 또는 A 퓨린
Y T/U 또는 C 피리미딘
M A 또는 C 아미노
K G 또는 T/U 케토
S G 또는 C 강(H 결합 3개)
W A 또는 T/U 약(H 결합 2개)
H A 또는 C 또는 T/U G는 아님
B G 또는 T/U 또는 C A는 아님
V G 또는 C 또는 A T/U는 아님
D G 또는 A 또는 T/U C는 아님
N G 또는 C 또는 T/U 또는 A 임의의 염기
* 존재하거나
존재하지 않음		 염기는 존재할 수 있거나 존재할 수 없음
14.2 폴리 (A) 서열 및 히스톤SL 의 조합은 상승적 방식으로 mRNA 로부터의 단백질 발현을 증가시킴:
폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 단백질 발현에 미치는 영향력을 연구하기 위해, 알파-글로빈 3'-UTR의 상이한 서열들 3' 말단을 가지는 mRNA를 합성하였다: 3'-UTR의 3' 말단만으로 종결되기 때문에 폴리(A) 서열과 히스톤SL 둘 다가 결실된 mRNA, 또는 이와는 달리 A64 폴리(A) 서열 또는 히스톤SL 중 어느 하나를 포함하는 mRNA, 또는 A64 폴리(A) 서열 및 히스톤SL 둘 다를 3'-UTR의 3' 말단에 포함하는 mRNA. 루시퍼라제 암호화 mRNA 또는 대조군 mRNA를 전기 천공법을 통해 HeLa 세포에 도입하였다. 형질 감염 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시 루시퍼라제 수준을 측정하였다(이하 표 8 및 도 22 참조).
mRNA 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
ppLuc(GC)-ag-A64-히스톤SL 466553 375169 70735
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL 50947 3022 84
ppLuc(GC)-ag-A64 10471 19529 4364
ppLuc(GC)-ag 997 217 42
폴리(A) 서열도, 히스톤SL도 포함하지 않는 mRNA로부터는 소량의 루시퍼라제가 발현되었다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL은 둘 다 따로 존재할 때 유사한 정도로 루시퍼라제 수준을 증가시켰다. 상기 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 각각 따로 포함하는 mRNA들 중 어느 하나는 폴리(A) 서열과 히스톤SL 둘다가 결실된 mRNA보다 루시퍼라제 수준을 훨씬 많이 증가시켰다. 그러나 놀랍게도 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준을, 상기 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가시켰다. 동일한 mRNA 내에 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재할 때의 루시퍼라제 수준 증가 폭은 상기 두 요소들이 상승적으로 작용함을 입증해주는 것이다.
폴리(A)-히스톤SL mRNA(+/+)로부터 유래하는 신호를, 히스톤SL mRNA(-/+) + 폴리(A) mRNA(+/-)로부터 유래하는 신호의 합으로 나누어 폴리(A) 서열과 히스톤SL 사이의 상승 효과를 정량하였다(이하 표 9 참조).
A64 히스톤SL 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
+ + 466553 375169 70735
+ 50947 3022 84
+ 10471 19529 4364
상승효과 7.6 16.6 15.9
이와 같이 산정된 인자는, 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 생성되는 루시퍼라제의 수준이, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때 예상되는 루시퍼라제의 수준보다 얼마나 더 높은지를 말해준다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 생성되는 루시퍼라제의 수준은, 이 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때의 루시퍼라제의 수준보다 16.6배 이하로 높았다. 이러한 결과는, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이 단백질 발현을 눈에 띄게 상승적으로 증가시킨다는 것을 확인시켜 준다.
14.3 폴리 (A) 서열과 히스톤SL 의 조합은, 이것들의 순서와는 상관없이 mRNA 로부터의 단백질 발현을 증가시킴
폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합의 효과는 폴리(A) 서열의 길이와, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 순서에 따라서 달라질 수 있다. 그러므로 폴리(A) 서열의 길이가 증가한 mRNA와, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 순서가 역전된 mRNA를 합성하였는데: 이와 같은 mRNA 2개는 3'-UTR의 3' 말단에 A120 또는 A300 폴리(A) 서열을 포함하였다. 추가 mRNA 하나는 3'-UTR의 3' 말단에 히스톤SL을 선두에 포함하였고, 그 뒤를 A250 폴리(A) 서열이 따랐다. 루시퍼라제 암호화 mRNA 또는 대조군 mRNA를 HeLa 세포에 리포펙션시켰다. 형질 감염 개시 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시 루시퍼라제 수준을 측정하였다(이하 표 10 및 도 23 참조).
mRNA 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL-A250 98472 734222 146479
ppLuc(GC)-ag-A64-히스톤SL 123674 317343 89579
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL 7291 4565 916
ppLuc(GC)-ag-A300 4357 38560 11829
ppLuc(GC)-ag-A120 4371 45929 10142
ppLuc(GC)-ag-A64 1928 26781 537
A64 폴리(A) 서열 또는 히스톤SL은 둘 다 각각 따로 존재할 때 거의 동일한 루시퍼라제 수준을 보였다. 이전 실험에서, A64와 히스톤SL이 함께 존재할 때 루시퍼라제 수준을, 이 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 훨씬 더 많이 증가시킨 것과 일치하는 결과이다. 동일한 mRNA 내에 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재할 때의 루시퍼라제 수준 증가 폭은 상기 두 요소들이 상승적으로 작용함을 입증해주는 것이다. A64와 히스톤SL 간 상승 효과를, A64-히스톤SL, A64 및 히스톤SL mRNA의 루시퍼라제 수준을 바탕으로 이전과 동일하게 정량하였다(이하 표 11 참조). A64와 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 유래하는 루시퍼라제의 수준은, 이 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때의 루시퍼라제의 수준보다 61.7배 이하로 높았다.
A64 히스톤SL 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
+ + 123674 317343 89579
+ 7291 4565 916
+ 1928 26781 537
상승효과 13.4 10.1 61.7
이와는 대조적으로, A64로부터 A120 또는 A300에 이르기까지 폴리(A) 서열의 길이가 증가함에 따라 루시퍼라제 수준은 단지 보통 수준으로만 증가하였다(표 10 및 도 19 참조). 길이가 가장 긴 폴리(A) 서열, 즉 A300을 포함하는 mRNA를 또한 유사한 길이를 가지는 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 포함된 mRNA(히스톤SL-A250)와 비교하였다. 이와 같은 mRNA는 길이가 긴 폴리(A) 서열을 가졌음과 아울러, 이 mRNA 내 히스톤SL과 폴리(A) 서열의 순서는 A64-히스톤SL mRNA와 비교하였을 때 역전되었다.
A250과 히스톤SL이 함께 존재할 때, 루시퍼라제 수준은, 히스톤SL 또는 A300 중 어느 하나만이 존재할 때 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 더 많이 증가하였다. 또한 A250과 히스톤SL 간 상승 효과를 이전과 같이 정량하였는데, 즉 히스톤SL-A250 mRNA로부터의 RLU와 A300 mRNA 및 히스톤SL mRNA로부터의 RLU를 비교함으로써 정량하였다(이하 표 12 참조). A250과 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 유래하는 루시퍼라제의 수준은, 이 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때의 루시퍼라제의 수준보다 17.0배 이하로 높았다.
히스톤SL A250/A300 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
+ + 98472 734222 146479
+ 7291 4565 916
+ 4357 38560 11829
상승효과 8.5 17.0 11.5
요약하면, 히스톤SL과 폴리(A) 서열의 조합의, mRNA로부터의 단백질 발현에 대한 고도의 상승 효과가, 실질적으로 상이한 폴리(A) 서열의 길이에 대해 입증되었으며, 이 상승 효과는 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 순서와는 무관하다는 것도 입증되었다.
14.4 폴리 (A) 서열과 히스톤SL 의 조합에 의한 단백질 발현의 증가는 특이적임
폴리(A) 서열 및 히스톤SL의 조합의, mRNA로부터의 단백질 발현에 미치는 영향력이 특이적인지 여부를 연구하기 위해, 대안적 서열들과 폴리(A) 서열을 함께 가지는 mRNA를 합성하였다: 이와 같은 mRNA들은 A64의 3' 말단에 7개의 별개 서열들 중 하나를 각각 포함하였다. 루시퍼라제 암호화 mRNA 또는 대조군 mRNA를 전기 천공법에 의해 HeLa 세포에 도입하였다. 형질 감염 후 6시간, 24시간 및 48시간 경과시 루시퍼라제 수준을 측정하였다(이하 표 13 및 도 24 참조).
mRNA 6시간 경과시 RLU 24시간 경과시 RLU 48시간 경과시 RLU
ppLuc(GC)-ag-A64-N32 33501 38979 2641
ppLuc(GC)-ag-A64-SL 28176 20364 874
ppLuc(GC)-ag-A64-U30 41632 54676 3408
ppLuc(GC)-ag-A64-G30 46763 49210 3382
ppLuc(GC)-ag-A64-PolioCL 46428 26090 1655
ppLuc(GC)-ag-A64-aCPSL 34176 53090 3338
ppLuc(GC)-ag-A64-ag 18534 18194 989
ppLuc(GC)-ag-A64-히스톤SL 282677 437543 69292
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL 27597 3171 0
ppLuc(GC)-ag-A64 14339 48414 9357
폴리(A) 서열 또는 히스톤SL은 둘 다 각각 따로 존재할 때 거의 동일한 루시퍼라제 수준을 보였다. 또한 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준을, 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 훨씬 더 많이 증가시켰다(즉 상승 작용함). 이와는 대조적으로 대안적 서열들 중 임의의 것과 폴리(A) 서열이 함께 존재하면, 폴리(A) 서열만을 포함하는 mRNA에 비하여 루시퍼라제 수준이 어떠한 영향도 받지 않았다. 그러므로 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합은 mRNA로부터의 단백질 발현을 상승적 방식으로 증가시켰으며, 이러한 효과는 특이적이다.
14.5 폴리 (A) 서열과 히스톤SL 의 조합은, mRNA 로부터의 단백질 발현을 생체 내에서 상승적 방식으로 증가시킴
폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 단백질 발현에 미치는 생체 내 영향력을 연구하기 위해, 알파-글로빈 3'-UTR의 3' 말단에 상이한 서열들을 포함하는 루시퍼라제 암호화 mRNA 또는 대조군 mRNA를 마우스에 피 내 주사하였다: mRNA는 A64 폴리(A) 서열 또는 히스톤SL 중 어느 하나를 포함하였거나, 이와는 달리 3'-UTR의 3' 말단에 A64 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 둘 다 포함하였다. 주사 후 16시간 경과시 루시퍼라제 수준을 측정하였다(이하 표 14 및 도 25 참조).
mRNA 16시간 경과시 RLU
ppLuc(GC)-ag-A64-히스톤SL 38081
ppLuc(GC)-ag-히스톤SL 137
ppLuc(GC)-ag-A64 4607
히스톤SL 또는 폴리(A) 서열 둘 중 하나만을 가지는 mRNA로부터 루시퍼라제를 발현시켰다. 그러나 놀랍게도 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 루시퍼라제 수준을, 상기 각각의 요소들 중 어느 하나만이 존재할 때에 관찰되는 루시퍼라제 수준보다 복합적으로 훨씬 더 많이 증가시켰다. 동일한 mRNA 내에 폴리(A) 서열과 히스톤SL이 함께 존재할 때의 루시퍼라제 수준 증가 폭은 상기 두 요소들이 상승적으로 작용함을 입증해주는 것이다.
폴리(A)-히스톤SL mRNA(+/+)로부터 유래하는 신호를, 히스톤SL mRNA(-/+) + 폴리(A) mRNA(+/-)로부터 유래하는 신호의 합으로 나누어 폴리(A) 서열과 히스톤SL 사이의 상승 효과를 정량하였다(이하 표 15 참조).
A64 히스톤SL 16시간 경과시 RLU
+ + 38081
+ 137
+ 4607
상승효과 8.0
이와 같이 산정된 인자는 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 생성되는 루시퍼라제의 수준이, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때 예상되는 루시퍼라제의 수준보다 얼마나 더 높은지를 말해준다. 폴리(A) 서열과 히스톤SL을 함께 포함하는 mRNA로부터 생성되는 루시퍼라제의 수준은, 이 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 효과가 오로지 부가적일 때의 루시퍼라제의 수준보다 8배 높았다. 이러한 결과는, 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이 생체 내에서 단백질 발현을 눈에 띄게 상승적으로 증가시킨다는 것을 확인시켜 준다.
14.6 폴리 (A) 서열과 히스톤SL 의 조합은, mRNA 로부터의 NY - ESO -1 단백질 발현을 증가시킴
폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이, mRNA로부터의 단백질 발현에 미치는 영향력을 연구하기 위해, 알파-글로빈 3'-UTR의 3' 말단에 상이한 서열들을 포함하는 NY-ESO-1 암호화 mRNA를 합성하였다: mRNA는 A64 폴리(A) 서열 또는 이 A64 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합 중 어느 하나를 3'-UTR의 3' 말단에 포함하였다. NY-ESO-1 암호화 mRNA를 전기 천공법으로 HeLa 세포에 도입하였다. 형질 감염 후 24시간 경과시 NY-ESO-1 수준을 유동세포계수법으로 측정하였다(이하 표 16 및 도 26 참조).
24시간 경과시 MFI
mRNA 항- NY - ESO -1 이소타입 대조군
NY-ESO-1(GC)-ag-A64-히스톤SL 15600 1831
NY-ESO-1(GC)-ag-A64 1294 849
NY-ESO-1은 폴리(A) 서열만을 가지는 mRNA로부터 발현되었다. 그러나 놀랍게도, 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 NY-ESO-1 수준을, 오로지 폴리(A) 서열만이 존재할 때에 관찰되는 NY-ESO-1 수준보다 복합적으로 훨씬 더 많이 증가시켰다.
14.7 폴리 (A) 서열과 히스톤SL 의 조합은 mRNA 를 사용하는 백신화에 의해 유도된 항체의 수준을 증가시킴
폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합이, mRNA를 사용하는 백신화에 의해 유도된 항체의 유도에 미치는 영향력을 연구하기 위해, C57BL/6 마우스에, 프로타민이 복합체화된 NY-ESO-1 암호화 mRNA[알파-글로빈 3'-UTR의 3' 말단에 상이한 서열들을 포함]를 피 내 주사하여 이 마우스를 백신화하였다: mRNA는 A64 폴리(A) 서열 또는 이 A64 폴리(A) 서열과 히스톤SL의 조합 중 어느 하나를 3'-UTR의 3' 말단에 포함하였다. 백신화된 마우스와 대조군 마우스 체내에서 NY-ESO-1 특이 항체의 수준을 ELISA에 의해 분석하였다[이 경우, 일련의 혈청 희석액을 사용함](이하 표 17 및 도 27 참조).
mRNA 평균 IgG2a [b] 종말 적정가
NY-ESO-1(GC)-ag-A64-히스톤SL 763
NY-ESO-1(GC)-ag-A64 20
항 NY-ESO-1 IgG2a[b]가 폴리(A) 서열만을 가지는 mRNA로부터 발현되었다. 그러나 놀랍게도, 폴리(A)와 히스톤SL이 함께 존재하면 NY-ESO-1 IgG2a[b] 수준을, 오로지 폴리(A) 서열만이 존재할 때에 관찰되는 NY-ESO-1 IgG2a[b] 수준보다 복합적으로 훨씬 더 많이 증가시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> CUREVAC GMBH <120> Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(A) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen <130> CU01P128WO1 <140> PCT/EP2012/000674 <141> 2012-02-15 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (Ic): metazoan and protozoan histone stem-loop consensus sequence without stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (10)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 1 ngnnnnnnun nnnncn 16 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IIc): metazoan and protozoan histone stem-loop consensus sequence with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (21)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 2 nnnnnngnnn nnnunnnnnc nnnnnn 26 <210> 3 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (Id): without stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (10)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 3 ncnnnnnnun nnnngn 16 <210> 4 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IId): with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (21)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 4 nnnnnncnnn nnnunnnnng nnnnnn 26 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (Ie): protozoan histone stem-loop consensus sequence without stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (10)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 5 dgnnnnnnun nnnnch 16 <210> 6 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IIe): protozoan histone stem-loop consensus sequence with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (15)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 6 nnnnndgnnn nnnunnnnnc hnnnnn 26 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (If): metazoan histone stem-loop consensus sequence without stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 7 ngnbyynnun vndncn 16 <210> 8 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IIf): metazoan histone stem-loop consensus sequence with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (21)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 8 nnnnnngnby ynnunvndnc nnnnnn 26 <210> 9 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (Ig): vertebrate histone stem-loop consensus sequence without stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 9 nghyyydnuh abrdcn 16 <210> 10 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IIg): vertebrate histone stem-loop consensus sequence with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (21)..(25) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 10 nnhnnnghyy ydnuhabrdc nnnnnh 26 <210> 11 <211> 16 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (Ih): humane histone stem-loop consensus sequence (Homo sapiens) without stem bordering elements <400> 11 dghycudyuh asrrcc 16 <210> 12 <211> 26 <212> RNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence according to formula (IIh): human histone stem-loop consensus sequence (Homo sapiens) with stem bordering elements <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 12 nhaahdghyc udyuhasrrc cvhbnh 26 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ic) <400> 13 vgyyyyhhth rvvrcb 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ic) <400> 14 sgyyyttytm arrrcs 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ic) <400> 15 sgyycttttm agrrcs 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ie) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 16 dgnnnbnnth vnnnch 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ie) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 17 rgnnnyhbth rdnncy 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ie) <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 18 rgndbyhyth rdhncy 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (If) <400> 19 vgyyytyhth rvrrcb 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (If) <400> 20 sgyycttytm agrrcs 16 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (If) <400> 21 sgyycttttm agrrcs 16 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ig) <400> 22 ggyycttyth agrrcc 16 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ig) <400> 23 ggcycttytm agrgcc 16 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ig) <400> 24 ggctcttttm agrgcc 16 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ih) <400> 25 dghyctdyth asrrcc 16 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ih) <400> 26 ggcyctttth agrgcc 16 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequences (without stem-bordering elements) according to formula (Ih) <400> 27 ggcycttttm agrgcc 16 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIc) <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 28 hhhhvvgyyy yhhthrvvrc bvhhnn 26 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIc) <400> 29 mhmhmsgyyy ttytmarrrc smchhh 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIc) <400> 30 mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIe) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (24)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 31 nnnnndgnnn bnnthvnnnc hnhnnn 26 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIe) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 32 nnhhnrgnnn yhbthrdnnc ydhhnn 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIe) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 33 nhhhvrgndb yhythrdhnc yrhhhh 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIf) <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 34 hhmhmvgyyy tyhthrvrrc bvmhhn 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIf) <400> 35 mmmmmsgyyc ttytmagrrc smchhh 26 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIf) <400> 36 mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIg) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 37 hhmamggyyc ttythagrrc cvhnnm 26 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIg) <400> 38 hhaamggcyc ttytmagrgc cvchhm 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIg) <400> 39 mmaamggctc ttttmagrgc cmcymm 26 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIh) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 40 nhaahdghyc tdythasrrc cvhbnh 26 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIh) <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is selected from a nucleotide selected from A, U, T, G and C, or a nucleotide analogue thereof <400> 41 hhaamggcyc tttthagrgc cvmynm 26 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> histone stem-loop sequence (with stem bordering elements) according to formula (IIh) <400> 42 hmaaaggcyc ttttmagrgc crmyhm 26 <210> 43 <211> 1747 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag <400> 43 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auagauc 1747 <210> 44 <211> 1806 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A64 <400> 44 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaa 1806 <210> 45 <211> 1772 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-histoneSL <400> 45 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auagaucuca aaggcucuuu ucagagccac ca 1772 <210> 46 <211> 1835 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A64-histoneSL <400> 46 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaugca ucaaaggcuc uuuucagagc cacca 1835 <210> 47 <211> 1869 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A120 <400> 47 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auagaucuaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaa 1869 <210> 48 <211> 1858 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A64-ag <400> 48 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaugca uccugcccga ugggccuccc aacgggcccu ccuccccucc uugcaccg 1858 <210> 49 <211> 1894 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A64-aCPSL <400> 49 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300 ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360 gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420 gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480 gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540 cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600 caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660 cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720 cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780 ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840 gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900 cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960 gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020 cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080 ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140 ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200 gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260 cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320 cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380 gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440 cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500 gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560 cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620 ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680 agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740 auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaugca ucaauuccua cacgugaggc gcugugauuc ccuauccccc uucauucccu 1860 auacauuagc acagcgccau ugcauguagg aauu 1894 <210> 50 <211> 1909 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of ppLuc(GC)-ag-A64-PolioCL <400> 50 gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60 cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120 ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180 guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240 ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc 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cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc caccaggaau u 761 <210> 57 <211> 646 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of Survivin(GC)-ag-A64-C30-histoneSL <400> 57 gggagaaagc uuaccauggg cgcccccacc cugccgccgg ccuggcagcc guuccucaag 60 gaccaccgca ucucgaccuu caagaacugg ccguuccugg agggcugcgc gugcaccccg 120 gagcggaugg ccgaggccgg cuucauccac ugccccaccg agaacgagcc ggaccuggcc 180 cagugcuucu ucugcuucaa ggagcuggag ggcugggagc cggacgacga cccgaucgag 240 gagcacaaga agcacagcag cggcugcgcc uuccugagcg ugaagaagca guucgaggag 300 cugacgcucg gggaguuccu gaagcuggac cgggagcggg ccaagaacaa gaucgcgaag 360 gagaccaaca acaagaagaa ggaguucgag gagaccgcca agaaggugcg gcgggccauc 420 gagcagcugg ccgccaugga cugaccacua guuauaagac ugacuagccc gaugggccuc 480 ccaacgggcc cuccuccccu ccuugcaccg agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc 600 cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu cagagccacc agaauu 646 <210> 58 <211> 1813 <212> RNA <213> artificial <220> <223> mRNA sequence of MAGE-C1(GC)-ag-A64-C30-histoneSL <400> 58 gggagaaagc uuaccaugca guccccgcug cagggcgagg aguuccagag cucccugcag 60 agccccgugu ccaucugcag cuccagcacc cccuccagcc ucccgcagag cuuccccgag 120 uccagccagu ccccccccga gggcccgguc cagagccccc ugcacucccc gcagagcccc 180 ccggagggga ugcacuccca gagcccccug cagucccccg agagcgcccc cgagggcgag 240 gacucccuca gcccgcugca gaucccccag uccccgcugg agggggagga cagccucucc 300 agccugcacu ucccccaguc cccgcccgag ugggaggaca gccugagccc ccuccacuuc 360 ccccaguucc cgccccaggg cgaggacuuc caguccagcc ugcagucccc cgugagcauc 420 ugcuccagcu ccacgagccu gucccucccc cagagcuucc cggagucccc ccagagcccg 480 cccgaggggc cggcgcaguc cccccugcag cgccccguga gcuccuucuu cagcuacacc 540 cuggccuccc uccugcagag cucccacgag agcccgcaga gcccgcccga gggccccgcc 600 caguccccgc ugcagagccc cgucuccagc uuccccucca gcaccuccag cucccucagc 660 caguccagcc ccguguccag cuucccgucc agcaccucca gcucccugag caagagcucc 720 cccgagagcc cccugcaguc ccccgugauc agcuucucca gcuccacgag ccucuccccg 780 uucagcgagg aguccagcuc ccccgucgac gaguacacca gcuccagcga cacccugcug 840 gaguccgaca gccucaccga cuccgagagc cugaucgaga gcgagccccu guucaccuac 900 acgcucgacg agaaggugga cgagcuggcc cgguuccugc uccugaagua ccaggugaag 960 cagcccauca ccaaggccga gaugcugacc aacgucaucu cccgcuacac cggcuacuuc 1020 ccggugaucu uccggaaggc gcgcgaguuc aucgagaucc ucuucgggau cagccugcgg 1080 gagguggacc ccgacgacuc cuacgucuuc gugaacacgc uggaccucac cagcgagggc 1140 ugccuguccg acgagcaggg gaugagccag aaccgccugc ucauccugau ccuguccauc 1200 aucuucauca agggcaccua cgccagcgag gaggucaucu gggacgugcu cuccgggauc 1260 ggcgugcggg ccggccgcga gcacuucgcc uucggggagc cccgggagcu gcugaccaag 1320 gucugggugc aggagcacua ccucgaguac cgcgaggugc ccaacagcuc cccgccccgg 1380 uacgaguucc uguggggccc ccgcgcccac agcgagguca ucaagcggaa ggugguggag 1440 uuccuggcga ugcucaagaa cacggucccc aucaccuucc cguccagcua caaggacgcc 1500 cugaaggacg uggaggagcg ggcccaggcc aucaucgaca ccaccgacga cuccacggcc 1560 accgagagcg cguccagcuc cgugaugagc cccagcuucu ccagcgagug accacuaguu 1620 auaagacuga cuagcccgau gggccuccca acgggcccuc cuccccuccu ugcaccgaga 1680 uuaauaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaau gcaucccccc cccccccccc cccccccccc cccccaaagg cucuuuucag 1800 agccaccaga auu 1813

Claims (27)

  1. a) 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역;
    b) 하나 이상의 히스톤 스템-루프; 그리고
    c) 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열로서, 상기 펩티드 또는 단백질은 종양 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 핵산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양 항원은 멜라닌 세포 특이 항원, 암-고환 항원 또는 종양 특이 항원, 바람직하게 CT-X 항원, 비 X CT 항원, CT-X 항원에 대한 결합 파트너 또는 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너 또는 종양 특이 항원, 더욱 바람직하게는 CT-X 항원, 비 X CT 항원에 대한 결합 파트너, 또는 종양 특이 항원, 이 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체인 것인 핵산 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 항원은 다음과 같은 목록으로부터 선택되는 것인 핵산 서열:
    5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-조효소 A 라세마제, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA15-3/CA27-29, CA19-9, CA72-4, CA125, 칼레티큘린, CAMEL, CASP-8/m, 카텝신 B, 카텝신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신 유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, C텐, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, F라우-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미성숙 라미닌 수용체, 칼리크레인-2, 칼리크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈 A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 매트릭스 단백질 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 군 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로티나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1, 및 림프양 혈액 세포의 면역글로불린 이디오타입 또는 림프양 혈액 세포의 T 세포 수용체 이디오타입, 또는 상기 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체; 바람직하게 서바이빈 또는 이의 상동체, MAGE-군 유래 항원 또는 이의 결합 파트너, 또는 상기 종양 항원의 단편, 변이체 또는 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 히스톤 스템-루프는 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 암호화 영역에 이종이고, 바람직하게 상기 암호화 영역은 히스톤 또는 히스톤-유사 기능을 갖는, 히스톤 단백질, 이의 단편, 유도체 또는 변이체를 암호화하지 않는 것인 핵산 서열.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 암호화 영역에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체, 이 종양 항원 단백질의 생물학적 활성을 50% 이상 보유하는 종양 항원 단백질의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산 서열.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 암호화 영역은 리포터 단백질 또는 마커 또는 선별 단백질을 암호화하지 않는 것인 핵산 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산은 RNA, 바람직하게는 mRNA인 것인 핵산 서열.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 히스톤 스템-루프는 하기 화학식 I 또는 II로부터 선택되는 것인 핵산 서열:
    [화학식 I]
    Figure pct00022

    [화학식 II]
    Figure pct00023

    상기 식 중,
    스템 1 또는 스템 2 경계 요소(bordering element)인 N1 -6 은 1~6개, 바람직하게는 2~6개, 더욱 바람직하게는 2~5개, 더더욱 바람직하게는 3~5개, 가장 바람직하게는 4~5개 또는 5개의 N으로 이루어진 연속 서열이되, N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고;
    스템 1 [N0 -2GN3 -5]는 요소 스템 2와 역행 상보성 또는 부분 역행 상보성으로서, 5~7개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
    N0 -2는 0~2개, 바람직하게는 0~1개, 더욱 바람직하게는 1개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
    N3 -5는 3~5개, 바람직하게는 4~5개, 더욱 바람직하게는 4개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고,
    G는 구아노신 또는 이의 유사체로서, 시티딘 또는 이의 유사체에 의해 임의로 치환될 수 있되, 다만 스템 2 내 이의 상보성 뉴클레오티드인 시티딘은 구아노신에 의해 치환되며;
    루프 서열 [N0 -4(U/T)N0-4]은 요소들 스템 1과 스템 2 사이에 위치하는 서열로서, 3~5개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
    N0 -4는 각각 독립적으로 0~4개, 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 1~2개의 N으로 이루어진 다른 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이고,
    U/T는 우리딘 또는 임의로는 티미딘을 나타내며;
    스템 2 [N3 -5CN0 -2]는 요소 스템 1과 역행 상보성 또는 부분 역행 상보성 서열로서, 5~7개의 뉴클레오티드로 이루어진 연속 서열이되,
    N3 -5는 3~5개, 바람직하게는 4~5개, 더욱 바람직하게는 4개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
    N0 -2는 0~2개, 바람직하게는 0~1개, 더욱 바람직하게는 1개의 N으로 이루어진 연속 서열이고, 이때 N은 각각 독립적으로 A, U, T, G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드, 또는 이것들의 뉴클레오티드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오티드이며,
    C는 시티딘 또는 이의 유사체로서, 구아노신 또는 이의 유사체에 의해 임의로 치환될 수 있되, 다만 스템 1 내 이의 상보성 뉴클레오티드인 구아노신은 시티딘에 의해 치환되며;
    이 경우, 상기 스템 1 및 스템 2는 서로 염기쌍을 형성하여 역행 상보성 서열을 형성할 수 있고, 이때 스템 1과 스템 2 사이에서 염기쌍이 형성될 수 있고,
    또는 상기 스템 1 및 스템 2는 부분 역행 상보성 서열을 형성할 수 있으며, 이때 스템 1과 스템 2 사이에서는 불완전 염기쌍이 형성될 수 있는 것인 핵산 서열.
  9. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 히스톤 스템-루프는 하기 화학식 Ia 또는 IIa 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 핵산 서열:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00024

    [화학식 IIa]
    Figure pct00025
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리(A) 서열은 약 25~약 400개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 바람직하게는 약 50~약 400개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 더욱 바람직하게는 약 50~약 300개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 더더욱 바람직하게는 약 50~약 250개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열, 가장 바람직하게는 약 60~약 250개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 공통 서열 NN(U/T)ANA, 바람직하게는 AA(U/T)AAA 또는 A(U/T)(U/T)AAA를 포함하는 것인 핵산 서열.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 변형된 핵산, 특히 안정화된 핵산인 것인 핵산 서열.
  13. 제12항에 있어서, 상기 변형된 핵산의 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역의 G/C 함량은, 야생형 핵산의 암호화 영역의 G/C 함량에 비하여 증가하고, 상기 변형된 핵산의 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게 야생형 핵산의 암호화된 아미노산 서열과 비교되게 변형되지 않은 것인 핵산 서열.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 핵산 서열 하나 이상의 유형을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 핵산 서열 2개 이상의 유형을 포함하고, 이 핵산 서열 각각의 유형은 상이한 펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 상이한 종양 항원을 암호화하는 것인 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 포함된 핵산 서열 하나의 유형은 PSA, PSMA, PSCA, STEAP-1, NY-ESO-1, 5T4, 서바이빈, MAGE-C1 또는 MAGE-C2를 암호화하는 것인 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 NY-ESO1를 암호화하지 않되, 다만 상기 조성물은 오로지 한 가지 유형의 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 핵산 서열을 하나 이상, 바람직하게는 다수 개 또는 하나 이상 포함하는 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트.
  19. 적어도 다음과 같은 a) ~ d)를 포함하는, 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트:
    a) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 PSA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산;
    b) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 PSMA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산;
    c) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 PSCA, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산; 그리고
    d) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 STEAP-1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산.
  20. 적어도 다음과 같은 a) ~ c)를 포함하는, 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트:
    a) i. 종양 항원 NY-ESO-1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 펩티드 또는 단백질 하나 이상을 암호화하는 암호화 영역,
    ii. 하나 이상의 히스톤 스템-루프, 그리고
    iii. 폴리(A) 서열 또는 폴리아데닐화 신호
    를 포함하거나 암호화하는 핵산 서열;
    b) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 5T4, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산; 그리고
    c) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 서바이빈, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산.
  21. 적어도 다음과 같은 a) ~ b)를 추가로 포함하는, 제11항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트:
    a) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 MAGE-C1, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산 서열; 그리고
    b) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 핵산 서열로서, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질은 종양 항원 MAGE-C2, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 핵산 서열.
  22. 의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트.
  23. 암 또는 종양 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열, 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열, 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물과, 임의로는 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트의, 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키는데 있어서의 용도.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물, 키트 또는 여러 부분들로 이루어진 키트의, 암 또는 종양 질환 치료에서 상기 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키는데 있어서의 용도.
  27. 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가시키기 위한 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 핵산 서열 또는 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 의해 정의된 조성물을 제공하는 단계, 및
    b) 이 핵산 서열 또는 조성물을 무세포 발현계, 세포, 조직 또는 유기체에 적용 또는 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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