CN110760535A

CN110760535A - 一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用

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Publication number: CN110760535A
Application number: CN201911011933.XA
Authority: CN
Inventors: 王芳
Original assignee: Qingdao Ningyi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Ningyi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明提供了一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法和利用载体转录得到mRNA的方法，属于分子克隆以及体外转录技术领域。将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体。本发明提供的载体中含有5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列，可以有效地进行mRNA的体外转录，避免了帽结构类似物的加入，3'UTR序列延长了翻译蛋白的半衰期并提高翻译效率。

Description

一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用

技术领域

本发明属于分子克隆以及体外转录技术领域，尤其涉及一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用。

背景技术

疫苗是预防和控制传染病发生和流行的重要手段。经典疫苗的包括灭活疫苗和减毒活疫苗，但是无论从效果以及研发速度方面都具有一定的局限性。

20世纪70年代以后，人们开始利用基因工程技术生产疫苗。1990年，Wolff首先发现小鼠肌肉内注射质粒DNA，质粒及其携带的基因可以被细胞摄取并表达。在当时，局限于mRNA的低稳定性，研究多集中在质粒DNA和病毒DNA。不过自从1961年发现mRNA以来，mRNA一直是疫苗基础和应用研究的主题。

mRNA疫苗是将体外转录的mRNA传递至细胞，翻译产生蛋白，进而扩大机体的免疫能力。从概念上讲，mRNA疫苗不同于其他的核酸疫苗。首先，mRNA不需要入核，进入细胞质即开始翻译过程。另外，不同于质粒DNA和病毒载体，mRNA不需要整合到基因组进而不存在插入突变的风险。此外，mRNA作为疫苗其优势的地方在于mRNA在细胞内是暂时性的活跃，可以通过生理途径完全代谢。mRNA的快速、简易制备方法和低成本也是作为疫苗的优势之一。

利用mRNA疫苗来预防感染性疾病已有相关的研究报道。1993年发现脂质体包裹编码流感病毒NP蛋白的mRNA在小鼠体内可以激活T细胞免疫应答从而保护小鼠。滴鼻给合成脂质纳米粒包裹的mRNA可以保护小鼠免受RSV和流感的感染。针对2017年突发的Zika病毒，研究发现小鼠肌肉注射单剂量的修饰mRNA可以有效的避免Zika病毒对小鼠的感染。同样针对高致病性禽流感H7N9，注射单剂量的mRNA疫苗对小鼠可以达到长达21天的免疫保护效果。而mRNA疫苗的制备只需要8天左右的时间，大大缩短了疾病突发的反映应对时间，降低了新发突发感染性疾病可能带来的危害。

mRNA疫苗主要包括两种：扩增型mRNA(Self-amplifying mRNA)和传统的非扩增型mRNA。二者都能利用宿主细胞的转化机制产生抗原靶点，启动适应性免疫应答。传统的非扩增型mRNA疫苗与宿主细胞的mRNA分子相似，只编码感兴趣的抗原。与此相反，扩增型的mRNA疫苗编码了一种基因工程修饰的RNA病毒基因组从而实现在宿主细胞内的扩增。

目前的mRNA疫苗大多是扩增型，采用Alphavirus病毒载体以保证其在细胞内的快速高效的翻译，本身会引起细胞免疫，从而限制了mRNA疫苗作为一种高效、快速的免疫手段的临床应用。因此，如何优化mRNA的设计，尽可能的降低mRNA本身所引起的细胞免疫仍然是mRNA疫苗应用的重中之重。

mRNA的稳定翻译需要5’的帽子结构。真核生物mRNA由7-甲级鸟嘌呤核苷酸(m7G)以及5’-5’三磷酸组成(m7GpppN)组成帽子结构，翻译起始需要5’帽结构结合到真核生物翻译起始因子EIF4E上，由mRNA脱帽酶DCP1，DCP2和DCPS调控mRNA的降解。

体外转录mRNA加帽有两种方法，一种是合成mRNA后用重组的痘苗病毒加帽酶添加帽子结构。这种方法产生的帽子结构与自然形成的真核生物帽子结构结构相同。另一种更加常用的方法是在体外转录反应过程中加入合成的帽子结构类似物。这种方法的局限性在于体外转录完全反应需要合适的帽结构类似物与GTP核苷酸的比例(4：1)，避免出现一些mRNA未加帽以及未完全转录的现象。早期的体外转录mRNA加帽多采用m7GpppG帽结构类似物，并且大多数临床试验仍然采用这种方式。然而m7GpppG类似物中有相当大一部分被纳入到mRNA的反向结构中，不被转录翻译机制所识别，从而导致转录活性的降低。因此出现了抗反向帽结构类似物(ARCAs:anti-reverse cap analogues)，ARCAs可以拮抗mRNA脱帽酶DCP2的活性，从而达到延长mRNA半衰期的目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用，本发明提供的载体中含有5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列，可以有效地进行mRNA的体外转录，避免了帽结构类似物的加入，延长了翻译蛋白的半衰期。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于体外转录mRNA的载体，将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到质粒或载体载体中，得到用于体外转录mRNA的载体；

所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的用于体外转录mRNA的载体的构建方法，包括以下步骤：

1)采用XbalI和BamHI-HF酶切5'UTR质粒，得到5'UTR序列；

采用BamHI-HF和AscI酶切目的基因质粒，得到目的基因序列；

采用AscI和EcoRI-HF酶切3'UTR质粒，得到3'UTR序列；

采用EcoRI-HF和NotI-HF酶切polyA质粒，得到polyA序列；

采用XbalI和NotI酶对载体进行酶切，得到酶切载体；

2)将所述步骤1)得到的5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列、polyA序列和酶切载体用T4连接酶连接，得到用于体外转录mRNA的载体。

优选的，所述步骤2)连接的体系每10μl包括：浓度为200ng/μl的5'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的3'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的目的基因序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的polyA序列溶液1.5μl、1μl T4连接酶、1μl 10×T4连接酶缓冲液和浓度为100ng/μl的酶切载体2μl；

所述连接的条件包括：37℃连接1h。

优选的，所述步骤1)5'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述3'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述polyA质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的用于体外转录mRNA的载体转录得到mRNA的方法，包括以下步骤：

a、将上述技术方案所述的用于体外转录mRNA的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

b、将所述步骤a得到的线性化载体在37℃下金属浴4h，将得到的金属浴产物与DNA酶混合后在37℃下孵育15min，得到孵育物，将所述孵育物进行纯化，得到纯化物，将所述纯化物经去磷酸化酶在37℃下处理30min，得到处理物，将所述处理物纯化后，得到mRNA。

优选的，所述金属浴的体系每40μl包括：浓度为1μg/μl的线性化载体溶液1μl、19μl Nuclease-free water、酶活为40U的RNase inhibitor 1μl、11μl NTP混合液、4μl 10×反应缓冲液、4μl 10×T7 RNA聚合酶混合物；

所述NTP混合液每11μl包括：浓度为75mM的ATP 4μl、浓度为75mM的GTP 1μl、浓度为100mM的Me-CTP 3μl和浓度为100mM的Pesudo-UTP3μl。

优选的，所述线性化处理包括：将所述用于体外转录mRNA的载体进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行酶切，得到线性化载体；

所述PCR扩增使用的体系每20μl包括：10μl 2×Pfu PCR MasterMix、浓度为10μM的上游引物M13F 1μl、浓度为10μM的下游引物M13R 1μl、7μl超纯水和浓度为50ng/μl的用于体外转录mRNA的载体1μl；

所述PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

优选的，所述所述上游引物M13F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述下游引物M13R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的载体在体外转录mRNA中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的载体在延长目的基因翻译出的蛋白的半衰期中的应用。

本发明提供了一种用于体外转录mRNA的载体，将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体；所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明提供的载体中含有5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列，可以有效地进行mRNA的体外转录，避免了帽结构类似物的加入，3'UTR序列延长了翻译蛋白的半衰期并提高翻译效率。

附图说明

图1为体外转录mRNA用质粒模板结构示意图；

图2为1％琼脂糖凝胶验证体外转录mRNA条带大小；

图3为Western Blot检测体外转录mRNA翻译EGFP蛋白的表达；

图4为流式检测体外转录mRNA翻译EGFP蛋白半衰期；

图5为qRT-PCR检测体外转录mRNA诱导体内免疫反应的表达。

具体实施方式

本发明提供了一种用于体外转录mRNA的载体，将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体；所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

tctagataatacgactcactatagggcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaggatcc。

在本发明中，所述5’UTR序列中包括酶切位点XbaI和BamHI，以及T7聚合酶启动子用来启动mRNA的体外转录，所述5’UTR用来起始细胞内核糖体的识别，蛋白质的翻译。

在本发明中，所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

ggcgcgccgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctgaattc。

在本发明中，所述3’UTR序列中包括酶切位点AscI和EcoRI，由人β球蛋白的3’UTR序列两次重复组成，所述3’UTR用来调控蛋白质的翻译，调节mRNA的稳定性。

在本发明中，所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

gaattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcacgaagagcgcggccgc。

在本发明中，所述polyA序列包括酶切位点EcoRI和SapI以及NotI，所述polyA用来调节mRNA的稳定性和蛋白质的翻译效率。

在本发明中，所述目的基因序列优选为上述技术方案所述的用于体外转录mRNA的载体要表达的基因，所述目的基因优选包括EGFP基因、红色荧光蛋白RFP基因、荧光素酶Luc基因、抗体基因、抗原基因及蛋白药物基因等等。

在本发明中，当所述目的基因优选为EGFP基因时，所述EGFP序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

ggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaggcgcgcc。

在本发明中，所述EGFP序列是绿色荧光蛋白编码序列，包括酶切位点BamHI和AscI，以及真核生物翻译增强序列Kozak，起始密码子ATG和终止密码子TAA。

1)采用XbalI和BamHI-HF酶切5'UTR质粒，得到5'UTR序列；

采用BamHI-HF和AscI酶切目的基因质粒，得到目的基因序列；

采用AscI和EcoRI-HF酶切3'UTR质粒，得到3'UTR序列；

采用EcoRI-HF和NotI-HF酶切polyA质粒，得到polyA序列；

采用XbalI和NotI酶对载体进行酶切，得到酶切载体；

本发明对所述BamHI-HF和AscI酶切目的基因质粒的酶切方法没有特殊限定，采用常规BamHI-HF和AscI酶切的条件即可。本发明对所述AscI和EcoRI-HF酶切3'UTR质粒的酶切方法没有特殊限定，采用常规AscI和EcoRI-HF酶切的条件即可。本发明对所述EcoRI-HF和NotI-HF酶切polyA质粒的方法没有特殊限定，采用常规EcoRI-HF和NotI-HF的酶切条件即可。本发明对XbalI和NotI酶切载体的方法没有特殊限定，采用常规XbalI和NotI酶切的条件即可。在本发明中，所述载体优选包括puc57载体。

本发明将得到的5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列、polyA序列和酶切载体用T4连接酶连接，得到用于体外转录mRNA的载体。

在本发明中，所述连接的体系每10μl优选包括：浓度为200ng/μl的5'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的3'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的目的基因序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的polyA序列溶液1.5μl、1μl T4连接酶、1μl 10×T4连接酶缓冲液和浓度为100ng/μl的酶切载体2μl。在本发明中，所述连接的条件优选包括：37℃连接1h。

在本发明中，所述5'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：

在本发明中，当所述目的基因优选为EGFP基因时，使用的EGFP质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下所示：

在本发明中，所述3'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下所示：

在本发明中，所述polyA质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下所示：

本发明将用于体外转录mRNA的载体进行线性化处理，得到线性化载体。

在本发明中，所述线性化处理优选包括：将所述用于体外转录mRNA的载体进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行酶切，得到线性化载体。

在本发明中，所述PCR扩增使用的体系每20μl优选包括：10μl 2×PfuPCRMasterMix、浓度为10μM的上游引物M13F 1μl、浓度为10μM的下游引物M13R 1μl、7μl超纯水和浓度为50ng/μl的用于体外转录mRNA的载体1μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述PCR扩增的程序优选包括：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

在本发明中，所述上游引物M13F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，具体如下所示：

tgtaaaacgacggccagt；

所述下游引物M13R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，具体如下所示：

caggaaacagctatgacc。

在本发明中，所述扩增产物进行酶切的条件优选包括：酶切使用的体系每40μl优选包括：4μl 10×Cutsmart Buffer、2μl SapI(Neb)、2μl水和浓度为200g/μl的扩增产物32μl。在本发明中，所述酶切在37℃下酶切4h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

本发明将线性化载体在37℃下金属浴4h，将得到的金属浴产物与DNA酶混合后在37℃下孵育15min，得到孵育物，将所述孵育物进行纯化，得到纯化物，将所述纯化物经去磷酸化酶在37℃下处理30min，得到处理物，将所述处理物纯化后，得到mRNA。

在本发明中，所述金属浴的体系每40μl优选包括：浓度为1μg/μl的线性化载体溶液1μl、19μl Nuclease-free water、酶活为40U的RNase inhibitor 1μl、11μl NTP混合液、4μl 10×反应缓冲液、4μl 10×T7 RNA聚合酶混合物。在本发明中，所述NTP混合液每11μl优选包括：浓度为75mM的ATP 4μl、浓度为75mM的GTP 1μl、浓度为100mM的Me-CTP 3μl和浓度为100mM的Pesudo-UTP 3μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

在本发明中，所述金属浴产物与DNA酶的体积比优选为40:1，所述DNA酶的酶活优选为2U/μl。

在本发明中，所述孵育物优选使用RNA纯化试剂盒进行纯化，本发明对所述RNA纯化试剂盒的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述处理物优选使用RNA纯化试剂盒进行纯化，本发明对所述RNA纯化试剂盒的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

通过分子克隆构建体外转录mRNA的质粒载体

1方法

1.1目的片段的合成

带有酶切位点的5'UTR质粒、EGFP质粒、3'UTR质粒和polyA质粒由华大基因公司合成。

1.2目的片段的酶切

表1 5'UTR质粒酶切体系

成分	浓度	体积(μl)
			CutsmartBuffer	10×	2
XbaI		1
			BamHI-HF		1
5'UTR质粒模板	200ng/μl	10
			水		6
总体积		20

酶切条件：37℃4小时。1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，分离酶切后250bp(5'UTR序列)的片段进行胶回收纯化。

表2 GFP质粒的酶切体系

成分	浓度	体积(μl)
			Cutsmart Buffer	10×	2
BamHI-HF		1
			AscI		1
EGFP质粒模板	200ng/μl	10
			水		6
总体积		20

酶切条件：37℃4小时，1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，分离酶切后800bp(EGFP序列)的片段进行胶回收纯化。

表3 3'UTR质粒的酶切体系

成分	浓度	体积(μl)
			Cutsmart Buffer	10×	2
AscI		1
			EcoRI-HF		1
3'UTR质粒模板	200ng/μl	10
			水		6
总体积		20

酶切条件：37℃4小时。1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，分离酶切后300bp(3'UTR序列)的片段进行胶回收纯化。

表4 PolyA质粒的酶切体系

成分	浓度	体积(μl)
			Cutsmart Buffer	10×	2
EcoRI-HF		1
			NotI-HF		1
PolyA质粒模板	200ng/μl	10
			水		6
总体积		20

酶切条件：37℃4小时，1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，分离酶切后100bp(polyA序列)的片段进行胶回收纯化。

表5 Puc57载体的酶切体系

成分	浓度	体积(μl)
			Cutsmart Buffer	10×	2
XbaI		1
			NotI-HF		1
puc57载体模板	200ng/μl	10
			水		6
总体积		20

酶切条件：37℃4小时，1％琼脂糖凝胶电泳(120V，30min)，分离酶切后的片段进行胶回收纯化。

1.3酶切产物回收(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)

1)琼脂糖凝胶电泳结束后，在紫外切胶仪中，将与目的片段大小吻合的条带切下，提前记录1.5ml空离心管的重量，将切下的凝胶装入离心管并称重计算凝胶重量。将该重量换算成一个凝胶体积(100mg记为100μl体积)。用1ml枪头在离心管中将凝胶捣碎。

2)在离心管中加入三个凝胶体积的Buffer DE-A，放入75℃水浴锅中加热，每隔2min颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化(约4-6min)。

3)在离心管中加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当目的片段小于400bp时，需加入1个凝胶体积的异丙醇。

4)将试剂盒中的DNA制备管取出，末端装载到负压泵上，将上述步骤3中的混合液转移到DNA制备管中，调节负压为-25-30英寸汞柱。

5)待管中液体抽干后，加入500μl BufferW1。

6)待管中液体抽干后，加入700μl BufferW2，抽干后再重复一次。使用BufferW2前确认已经按试剂瓶上的指定体积加入过无水乙醇。

7)将制备管转移到2ml离心管中(试剂盒内提供)，置于离心机10000×g离心3min。

8)将制备管转移到新的1.5ml离心管中(试剂盒内提供)，开盖室温静置8min后，在制备管膜中央加入30μl Elute Buffer，室温静置1min，10000×g离心2min，得到回收好的酶切产物，用于下一步酶切或-20℃保存。

1.4目的片段与载体的连接得到用于体外转录mRNA的载体

将回收的目的片段和载体按如下反应体系配制连接体系。原则上控制载体和目的片段的摩尔比为1:8或更高，如目的片段较小则需要提高目的片段的比例，反之则适量降低。

表6连接体系

连接的条件：37℃连接1h。连接后得到连接产物。

1.5连接产物转化化学感受态细胞

1)从-80℃冰箱取出感受态Trans5α细胞，于冰上融化，在酒精灯旁取出50μl感受态放入提前预冷的1.5ml离心管中，加入5μl连接产物，用移液器混匀，迅速置于冰上，冰上静置30min。

2)放入42℃水浴中热击90s，迅速放入冰中，静置2min。

3)加入800μl无抗性的LB培养基，37℃180rpm震荡培养45min。

4)1000×g离心3min将菌体沉淀到管底，弃去多余的上清，保留50-100μl。

5)用移液器将菌体及上清混匀，全部取出涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上。倒置于37℃培养箱培养过夜。

1.6单克隆的挑取

用无菌枪头挑取单菌落，置于摇菌管中培养。培养后送至测序公司测序。测序正常的结果序列如SEQ ID No.12所示，具体如下所示：

tctagataatacgactcactatagggcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacctccatcggcgacggcctcgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaggcgcgccgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctgaattcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcacgaagagcgcggccgcaa。

1.7质粒的大量提取

将测序正确的菌液按1:100的比例接种到加有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃220rpm震荡培养16h。利用Macherey-Nagel公司的质粒大量提取试剂盒NucleoBondXtraEF plasmidpurification提取。步骤如下：

1)取250ml菌液，4℃6000rpm离心25min，弃去上清，倒置与吸水纸上，尽量去掉培养基。

2)加入12ml Buffer RES-EF重悬菌液，vortex使菌体充分散开，确保无菌块存在，使用RES-EF之前需按说明书要求加入RNaseA。

3)加入12ml LYS-EF(蓝色)裂解细胞，温和并充分上下翻转至液体状态均一，避免剧烈振荡，室温放置5min，使用LYS-EF前确保溶液无沉淀，若有沉淀可适当加温使其溶解。

4)步骤3室温放置的过程中同时进行柱平衡：将过滤柱放入NucleoBond XtraColumn柱(均为试剂盒提供)中，并安放于架子上，用35ml Buffer EQU-EF沿过滤柱边缘加入，充分润湿滤柱。

5)加入12ml中和液BufferNEU-EF，温和并充分上下翻转至蓝色消失，避免剧烈振荡，置于冰上静置5min。

6)冰上静置5min后，再温和颠倒3次后倒入滤柱中，使滤液依靠重力自然滴尽，质粒通过滤柱后结合在NucleoBond Xtra Column柱上。

7)用10ml BufferFIL-EF，沿滤柱内壁均匀加入，将滤柱内的残留细胞裂解液洗出，使滤液依靠重力自然滴尽。

8)弃去滤有蛋白以及菌体基因组的滤柱。

9)向NucleoBond Xtra Column柱中加入将90ml Buffer ENDO-EF，去除内毒素，使滤液依靠重力自然滴尽。

10)向NucleoBond Xtra Column柱中加入将45ml BufferWASH-EF，洗去杂质，使滤液依靠重力自然滴尽。

11)将NucleoBond Xtra Column柱出口接入50ml离心管中，以15ml洗脱液BufferELU-EF洗脱柱上结合的质粒DNA，使滤液依靠重力自然滴尽，收集流穿液，收集的流穿液可以暂时放于4℃，但最好不要过夜。

12)在收集的流穿液中加入10.5ml异丙醇沉淀DNA，vortex使溶液充分混匀，室温静置2min，该步确保在室温进行。

13)拔出试剂盒中提供的注射器的内芯，将NucleoBond Finalizer安装在注射器出口处，将步骤12中所得混合液倒入注射器中，安装好注射器内芯，缓慢均匀的将注射器中的液体打出，是DNA沉淀截留在NucleoBond Finalizer上。

14)取下NucleoBond Finalizer，拔出注射器内芯，再装上NucleoBondFinalizer，注射器中加入EtOH 5ml，使用前确保EtOH已按说明书要求加入了无水乙醇，安装好注射器内芯，缓慢均匀的将注射器中的液体打出。

15)快速空打注射器，使残留液体尽量打出，反复八次以上，每次都须先取下NucleoBond Finalizer，再用注射器吸取空气，避免干燥的DNA损失。

16)取下NucleoBondFinalizer，室温放置8分钟，使残留的乙醇挥发。用1ml注射器吸取1ml BufferTE-EF，接上滤器，均匀缓慢推动内芯，洗脱NucleoBondFinalizer上截留的DNA，静置1min，使膜上的DNA充分溶解。

17)取下NucleoBond Finalizer，将洗脱下来的DNA重新吸入到1ml注射器中，均匀缓慢推动，洗脱第二次，最后再本步骤重复洗脱一次。

18)将洗脱的DNA颠倒混匀，利用Nanodrop1000测定大提所得质粒浓度，以及260/280。

1.8提取的质粒送至测序公司测序，验证序列准确性。测序准确的结果序列如SEQID Mo.13所示，具体如下：

实施例2

体外转录mRNA并进行表达

2.1体外转录模板的制备

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)

利用PfuPCRMasterMix(KP201)PCR扩增目的片段，体系如下：

表7扩增体系

PCR体系	体积
		2×Pfu PCR MasterMix	10
上游引物M13F(10uM)	1
		下游引物M13R(10uM)	1
水	7
		用于体外转录mRNA的载体(50ng)	1
总体积	20

扩增条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

2.2琼脂糖凝胶电泳

1)1％的琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE，微波炉加热至琼脂糖完全融化，加入6ul Gel-Red,倒入模具中冷却备用。

2)琼脂糖凝胶电泳PCR反应结束后，20μl体系中加入4μl 6×上样缓冲液，混匀。将样品点入制作好的琼脂糖凝胶中。电泳条件为恒压120V30min。

2.3 PCR产物回收(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒)

5)待管中液体抽干后，加入500ul BufferW1。

6)待管中液体抽干后，加入700ul BufferW2，抽干后再重复一次。使用BufferW2前确认已经按试剂瓶上的指定体积加入过无水乙醇。

8)将制备管转移到新的1.5ml离心管中(试剂盒内提供)，开盖室温静置8min后，在制备管膜中央加入30ul Elute Buffer，室温静置1min，10000×g离心2min，得到回收好的PCR产物，用于下一步酶切或-20℃保存。

2.4PCR产物的酶切

表8配制酶切体系

成分	体积
		PCR产物(50ng/μl)	32μl
SapI(Neb)	2μl
		Cutsmart Buffer	4μl
水	2μl
		总体积	40μl

2.5酶切产物的回收

产物通过0.8％的琼脂糖凝胶分离，确认酶切完全后按2.3所述步骤切胶回收。目的片段的回收可以如下操作：

1)在离心管中加入三个凝胶体积的Buffer DE-A，放入75℃水浴锅中加热，每隔2min颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化(约4-6min)。

2)在离心管中加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当目的片段小于400bp时，需加入1个凝胶体积的异丙醇。

3)将试剂盒中的DNA制备管取出，末端装载到负压泵上，将上述步骤3中的混合液转移到DNA制备管中，调节负压为-25-30英寸汞柱。

4)待管中液体抽干后，加入500μl BufferW1。

5)待管中液体抽干后，加入700μl BufferW2，抽干后再重复一次。使用BufferW2前确认已经按试剂瓶上的指定体积加入过无水乙醇。

6)将制备管转移到2ml离心管中(试剂盒内提供)，置于离心机10000×g离心3min。

7)将制备管转移到新的1.5ml离心管中(试剂盒内提供)，开盖室温静置8min后，在制备管膜中央加入20μl Elute Buffer，室温静置1min，10000×g离心2min，得到回收好的PCR产物并调整浓度到1μg/μl，用于下一步转录或-80℃保存。

2.6体外转录mRNA

2.6.1按照表格混匀NTP混合物。

表9 NTP混合物配置

成分	浓度(mM)	终浓度(mM)	体积(μl)
				ATP(from MEGAscript T7 kit)	75	7.5	4
GTP(from MEGAscript T7 kit)	75	1.875	1
				Me-CTP(from Trilink)	100	7.5	3
Pesudo-UTP(from Trilink)	100	7.5	3
				总体积			11

2.6.2按照表格体外转录反应

表10体外转录体系

2.6.3 37℃金属浴孵育4h。

2.6.4加入1μlDNA酶(2U/μl)，37℃孵育15min。

2.6.5利用RNA纯化试剂盒纯化体外转录产物。

2.6.6用去磷酸化酶处理体外转录产物，37℃处理30min。

2.6.7再次利用RNA纯化试剂盒纯化体外转录产物，得到mRNA。

取3μl RNA ladder和200ng mRNA，加入7μl loading buffer，70℃处理10min，跑胶1％琼脂糖凝胶验证，结果见图2，从图2中可以得出体外转录mRNA的产物条带大小在1000bp左右，和预期的片段大小一致，认为无误。

mRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，具体如下所示：

ucuagauaauacgacucacuauagggccccucucccuccccccccccuaacguuacuggccgaagccgcuuggaauaaggccggugugcguuugucuauauguuauuuuccaccauauugccgucuuuuggcaaugugagggcccggaaaccuggcccugucuucuugacgagcauuccuaggggucuuuccccucucgccaaaggaaugcaaggucuguugaaugucgugaaggaagcaguuccucuggaagcuucuugaagacaaacaacgucuguagcgacccuuugcaggcagcggaaccccccaccuggcgacaggugccucugcggccaaaagccacguguauaagauacaccugcaaaggcggcacaaccccagugccacguugugaguuggauaguuguggaaagagucaaauggcucuccucaagcguauucaacaaggggcugaaggaugcccagaagguaccccauuguaugggaucugaucuggggccucggugcacaugcuuuacauguguuuagucgagguuaaaaaaacgucuaggccccccgaaccacggggacgugguuuuccuuugaaaaggauccgccaccauggugagcaagggcgaggagcuguucaccgggguggugcccauccuggucgagcuggacggcgacguaaacggccacaaguucagcguguccggcgagggcgagggcgaugccaccuacggcaagcugacccugaaguucaucugcaccaccggcaagcugcccgugcccuggcccacccucgugaccacccugaccuacggcgugcagugcuucagccgcuaccccgaccacaugaagcagcacgacuucuucaaguccgccaugcccgaaggcuacguccaggagcgcaccaucuucuucaaggacgacggcaacuacaagacccgcgccgaggugaaguucgagggcgacacccuggugaaccgcaucgagcugaagggcaucgacuucaaggaggacggcaacauccuggggcacaagcuggaguacaacuacaacagccacaacgucuauaucauggccgacaagcagaagaacggcaucaaggugaacuucaagauccgccacaacaucgaggacggcagcgugcagcucgccgaccacuaccagcagaacaccuccaucggcgacggccucgugcugcugcccgacaaccacuaccugagcacccaguccgcccugagcaaagaccccaacgagaagcgcgaucacaugguccugcuggaguucgugaccgccgccgggaucacucucggcauggacgagcuguacaaguaaggcgcgccgcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccugcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccugaauucaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

2.7蛋白翻译

2.7.1293T铺12孔板，2×10⁵/ml24h后，转染mRNA 2.5μg

以六孔板为例：

1)转染前18-24h，在六孔板中接种293T细胞，每空接种5×10⁵，转染时细胞融合度为50％左右。每孔2ml完全培养基培养。

2)转染前1h，将孔内的完全培养基更换为不含血清的DMEM，置37℃，5％CO₂培养箱培养；

3)转染：取所需的质粒，加入400μl DMEM中，振荡混匀。另取400μl DMEM加入PEI(按照质粒质量：PEI体积＝1:2)振荡混匀，室温静置5min。

4)将步骤3中的质粒混合液与PEI混合液混合在一起，振荡混匀，室温放置20min。

5)将六孔板中的DMEM吸出，加入转染混合液。并置于细胞培养箱内37℃，5％CO₂培养4小时。

6)将六孔板内的转染混合液吸出，加入含10％胎牛血清的完全培养基，37℃，5％CO₂培养。

2.7.2细胞培养24h，48h，72h后收集细胞，500ulPBS重悬后流式检测EGFP信号。

流式细胞术具体操作如下：

1)收获细胞：

贴壁细胞处理：吸走六孔板中细胞培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)1ml润洗细胞，吸走PBS，加入400μl 0.25％的胰酶消化细胞30-60s，加500μl含血清的完全培养基终止消化，200g 3min离心，弃去上清，1ml PBS重悬细胞，200g 3min离心，弃去上清，4％多聚甲醛固定15min。

2)流式检测与分析：根据实验目的设置检测参数，调整激光电压，细胞样品上机检测。最后统计分析数据。结果见图4，从图4中可以得出，和文献报道(An,D.,et al.,Systemic Messenger RNA Therapy as a Treatment for MethylmalonicAcidemia.CellRep,2017.21(12):p.3548-3558.)的5’UTR序列相比，文献中的5’UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，具体如下所示：

tctagataatacgactcactatagggaaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagacgcggatcc。

本申请采用的IRES序列作为5’UTR体外转录出来的mRNA无需ARCA帽结构(Cap-)就能翻译EGFP蛋白的表达，并且翻译出的蛋白半衰期明显升高，72h仍可以明显检测到EGFP蛋白的表达。

2.7.3WesternBlot检测GFP蛋白的表达

(l)首先制备12％的分离胶(4mL 30％丙烯酰胺溶液，2.5mL Tris/HCI pH8.8，100μL 10％SDS，100μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合60min。

(2)倒干净上层水，再制备5％的积层胶(0.5mL 30％丙烯酰胺溶液，0.5mL TriS/HCI pH6.8，40μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，在积层胶上插入梳齿，室温下聚合50min。待胶完全凝聚后，小心拔下梳齿。

(3)收获的裂解液12000rpm，4℃离心10min。取60μL，加入4×上样缓冲液20μL，98℃煮10min。

(4)制备的电泳胶装进电泳槽，在内槽加满新鲜配制的电泳缓冲液(没过制胶板)，将上步处理好的样品取20μL缓缓加入积层胶梳齿孔中，再在电泳槽外槽内加入适量电泳缓冲液，进行电泳:首先是120V，电泳20分钟，观察样品被很好的压缩成一条线，蛋白预染Marker开始分离，说明样品进入分离胶，可调整电流为160V，继续电泳40分钟，观察蛋白预染Marker很好的分开，结束电泳。

(5)切掉多余胶块，按照从负极到正极分别为滤纸、胶、硝酸纤维素膜(NC膜)、滤纸的顺序叠放在转膜夹板中，放入转膜装置，加满新配的转膜液，冰上或4℃，插上电极进行转膜，80V 120min，将胶上的蛋白转移到NC膜上。

(6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，水平摇床上25rpm，室温孵育l h。

(7)将膜浸在含适当稀释抗体(Flag抗体1:1000稀释)的5％脱脂奶粉中，水平摇床上25rpm，4℃过夜。

(8)50rpm水平摇床上，用TBST洗膜4次，5min/次。

(9)弃掉洗液，加入1:10000稀释的Alexa

488goat anti-mouse二抗，水平摇床上25rpm，室温避光孵育lh。

(10)弃掉二抗，25rpm水平摇床上用TBST洗膜4次，5min/次。

(11)取出膜，利用LI-COR Odyssey仪器扫膜(图3)。

从图3中可以得出，采用IRES作为5’UTR序列体外转录出的mRNA，不需要加入帽子结构(Cap-)就能翻译EGFP蛋白的表达。

2.7.4实时荧光定量PCR检测细胞内免疫反应

(1)细胞总RNA的提取与反转录：293T细胞按照2.7.1的方法转染mRNA，转染换液8h后弃细胞上清，加入1mLTrizol裂解细胞后，交给睿博生物公司进行RNA的提取和反转录成cDNA。

(2)使用一步法荧光定量PCR反应试剂盒以管家基因gapdh为内参，用2^－ΔΔCt法对待测基因mRNA水平进行相对定量。反应体系如表11所示。Real-time RT-PCR引物如表12所示。反应条件为：42℃逆转录5min后95℃，10sec；然后是40次循环，每次循环条件为95℃，5sec；60℃，34sec；熔解曲线为65℃-95℃。

表11实时定量RT-PCR体系

成分	体积(μl)
		2×one step SYBR RT-PCR buffer Ⅲ	25μL
TakaRa Ex Taq HS Mix	1μL
		Primerscript RT enzyme Mix Ⅱ	1μL
ROX reference Dye Ⅱ(50×)	1μL
		PCR forward primer(10μM)	1μL
PCR reverse primer(10μM)	1μL
		Total RNA	4μL
RNA free H<sub>2</sub>O	16μL

表12实时定量RT-PCR引物序列

结果统计如图5。从图5中可以得出，采用IRES作为5’UTR的结构，不加入帽子结构(Cap-)，激活RIG-I和干扰素免疫应答水平较低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛宁逸生物科技有限公司

<120> 一种用于体外转录mRNA的载体及其构建方法、利用载体转录得到mRNA的方法和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctagataat acgactcact atagggcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 60

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 120

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 180

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 240

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 300

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 360

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 420

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 480

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 540

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaagg atcc 594

<210> 2

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatccgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 60

gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 120

gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 180

ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 240

gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 300

cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 360

ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 420

atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 480

aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 540

gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 600

cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 660

gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 720

ctgtacaagt aaggcgcgcc 740

<210> 3

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgcgccgc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt 60

ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctgctcg 120

ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 180

tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctgaattc 228

<210> 4

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcacgaaga 120

gcgcggccgc 130

<210> 5

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctagataat acgactcact atagggcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 60

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 120

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 180

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 240

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 300

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 360

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 420

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 480

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 540

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaagg atcc 594

<210> 6

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatccgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 60

gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 120

gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 180

ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 240

gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 300

cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 360

ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 420

atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 480

aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 540

gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 600

cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 660

gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 720

ctgtacaagt aaggcgcgcc 740

<210> 7

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgcgccgc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt 60

ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctgctcg 120

ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 180

tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctgaattc 228

<210> 8

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcacgaaga 120

gcgcggccgc 130

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 11

<211> 1648

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ucuagauaau acgacucacu auagggcccc ucucccuccc cccccccuaa cguuacuggc 60

cgaagccgcu uggaauaagg ccggugugcg uuugucuaua uguuauuuuc caccauauug 120

ccgucuuuug gcaaugugag ggcccggaaa ccuggcccug ucuucuugac gagcauuccu 180

aggggucuuu ccccucucgc caaaggaaug caaggucugu ugaaugucgu gaaggaagca 240

guuccucugg aagcuucuug aagacaaaca acgucuguag cgacccuuug caggcagcgg 300

aaccccccac cuggcgacag gugccucugc ggccaaaagc cacguguaua agauacaccu 360

gcaaaggcgg cacaacccca gugccacguu gugaguugga uaguugugga aagagucaaa 420

uggcucuccu caagcguauu caacaagggg cugaaggaug cccagaaggu accccauugu 480

augggaucug aucuggggcc ucggugcaca ugcuuuacau guguuuaguc gagguuaaaa 540

aaacgucuag gccccccgaa ccacggggac gugguuuucc uuugaaaagg auccgccacc 600

auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 660

ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga ugccaccuac 720

ggcaagcuga cccugaaguu caucugcacc accggcaagc ugcccgugcc cuggcccacc 780

cucgugacca cccugaccua cggcgugcag ugcuucagcc gcuaccccga ccacaugaag 840

cagcacgacu ucuucaaguc cgccaugccc gaaggcuacg uccaggagcg caccaucuuc 900

uucaaggacg acggcaacua caagacccgc gccgagguga aguucgaggg cgacacccug 960

gugaaccgca ucgagcugaa gggcaucgac uucaaggagg acggcaacau ccuggggcac 1020

aagcuggagu acaacuacaa cagccacaac gucuauauca uggccgacaa gcagaagaac 1080

ggcaucaagg ugaacuucaa gauccgccac aacaucgagg acggcagcgu gcagcucgcc 1140

gaccacuacc agcagaacac cuccaucggc gacggccucg ugcugcugcc cgacaaccac 1200

uaccugagca cccaguccgc ccugagcaaa gaccccaacg agaagcgcga ucacaugguc 1260

cugcuggagu ucgugaccgc cgccgggauc acucucggca uggacgagcu guacaaguaa 1320

ggcgcgccgc ucgcuuucuu gcuguccaau uucuauuaaa gguuccuuug uucccuaagu 1380

ccaacuacua aacuggggga uauuaugaag ggccuugagc aucuggauuc ugccugcucg 1440

cuuucuugcu guccaauuuc uauuaaaggu uccuuuguuc ccuaagucca acuacuaaac 1500

ugggggauau uaugaagggc cuugagcauc uggauucugc cugaauucaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1648

<210> 12

<211> 1669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctagataat acgactcact atagggcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 60

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 120

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 180

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 240

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 300

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 360

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 420

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 480

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 540

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaagg atccgccacc 600

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 660

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 720

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 780

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 840

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 900

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 960

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 1020

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 1080

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 1140

gaccactacc agcagaacac ctccatcggc gacggcctcg tgctgctgcc cgacaaccac 1200

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 1260

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 1320

ggcgcgccgc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt 1380

ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctgctcg 1440

ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 1500

tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctgaattcaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagc acgaagagcg cggccgcaa 1669

<210> 13

<211> 1669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tctagataat acgactcact atagggcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 60

cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 120

ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 180

aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 240

gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 300

aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 360

gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 420

tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 480

atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 540

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaagg atccgccacc 600

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 660

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 720

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 780

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 840

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 900

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 960

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 1020

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 1080

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 1140

gaccactacc agcagaacac ctccatcggc gacggcctcg tgctgctgcc cgacaaccac 1200

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 1260

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 1320

ggcgcgccgc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt 1380

ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctgctcg 1440

ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 1500

tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctgaattcaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagc acgaagagcg cggccgcaa 1669

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctagataat acgactcact atagggaaat aagagagaaa agaagagtaa gaagaaatat 60

aagacgcgga tcc 73

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacctctgct tcatcttaca 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgctacctc ttgctcttc 19

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcaaccagt tccagaag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagtccgcat tcatcagg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggaggacgcc gcattgac 18

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgatagacat tagccaggag gttc 24

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtatcgtgg aaggactcat gac 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgccagtga gcttcccgtt cag 23

Claims

1.一种用于体外转录mRNA的载体，其特征在于，将5'UTR序列、目的基因序列、3'UTR序列和polyA序列顺次连接到载体中，得到用于体外转录mRNA的载体；

所述5'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述3'UTR序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述polyA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用XbalI和BamHI-HF酶切5'UTR质粒，得到5'UTR序列；

采用BamHI-HF和AscI酶切目的基因质粒，得到目的基因序列；

采用AscI和EcoRI-HF酶切3'UTR质粒，得到3'UTR序列；

采用EcoRI-HF和NotI-HF酶切polyA质粒，得到polyA序列；

采用XbalI和NotI酶对载体进行酶切，得到酶切载体；

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)连接的体系每10μl包括：浓度为200ng/μl的5'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的3'UTR序列溶液1.5μl、浓度为200ng/ul的目的基因序列溶液1.5μl、浓度为200ng/μl的polyA序列溶液1.5μl、1μl T4连接酶、1μl 10×T4连接酶缓冲液和浓度为100ng/μl的酶切载体2μl；

所述连接的条件包括：37℃连接1h。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)

5'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述3'UTR质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述polyA质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

5.一种利用权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体转录得到mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将权利要求1所述的用于体外转录mRNA的载体进行线性化处理，得到线性化载体；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述金属浴的体系每40μl包括：浓度为1μg/μl的线性化载体溶液1μl、19μl Nuclease-free water、酶活为40U的RNase inhibitor 1μl、11μl NTP混合液、4μl 10×反应缓冲液、4μl 10×T7 RNA聚合酶混合物；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述线性化处理包括：将所述用于体外转录mRNA的载体进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行酶切，得到线性化载体；

所述PCR扩增使用的体系每20μl包括：10μl 2×Pfu PCR MasterMix、浓度为10μM的上游引物M13F 1μl、浓度为10μM的下游引物M13R 1μl、7μl超纯水和浓度为50ng/ul的用于体外转录mRNA的载体1μl；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述所述上游引物M13F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述下游引物M13R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

9.权利要求1所述的载体在体外转录mRNA中的应用。

10.权利要求1所述的载体在延长目的基因翻译出的蛋白的半衰期中的应用。