JP2022552378A - パーキンソン病を治療するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードするｍＲＮＡ - Google Patents

パーキンソン病を治療するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードするｍＲＮＡ Download PDF

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Abstract

本開示は、パーキンソン病の治療における、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物及びその使用を特徴とする。本開示のＬＮＰ組成物は、かかる治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡ治療薬を含む。本発明は、例えば、対象におけるパーキンソン病の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、前記ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドが、配列番号１、配列番号８、または配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、ＬＮＰ組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１５日に出願された米国仮出願第６２／９１５，３１７号及び２０２０年４月２１日に出願された米国仮出願第６３／０１３，１３９号の利益を主張する。当該出願の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより付与されたＰ０１ ＤＡ０２８５５５、Ｒ０１ ＮＳ０３６１２６、Ｐ３０ ＭＨ０６２２６１、Ｒ０１ ＡＧ０４３５４０、及び２Ｒ０１ ＮＳ０３４２３９の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。２０２０年１０月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｍ２１８０－７００２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、６１，２７８バイトのサイズである。
制御性Ｔ細胞（Ｔ制御性細胞またはＴｒｅｇとしても知られている）は、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病及びパーキンソン病の予防及び／または治療に対して有力な治療価値を有する。パーキンソン病では、疾患の発症及び進行は、多くの場合、Ｔｒｅｇの数ならびにそれらの抗増殖及び抗炎症作用の減少に関連している。しかしながら、これが発生する機序は研究中である。従って、パーキンソン病において制御性Ｔ細胞を刺激することができる治療法を開発するという満たされていないニーズが存在する。
本開示は、とりわけ、パーキンソン病の治療用の、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を使用する方法を提供する。本開示のＬＮＰ組成物は、本明細書に記載の方法で用いるヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡ治療薬を含む。ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象におけるパーキンソン病の治療に使用され得る。本開示のさらなる態様を以下にさらに詳細に記載する。
従って、１つの態様では、本開示は、対象におけるパーキンソン病の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を提供する。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本明細書に提供するのは、対象におけるパーキンソン病の治療方法であり、該対象に対して、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の有効量を投与することを含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物の実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８８のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１６に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２１に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２４に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０１に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０４に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０６に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１１に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１４に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、ＬＮＰの投与により、サンプル（例えば、対象からのサンプル）における、例えば、実施例２～８のいずれか１つに記載のアッセイによって特定されるＴ制御性細胞のレベル及び／または活性が増加する。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＦｏｘＰ３＋発現及び／またはＣＤ２５＋発現Ｔ制御性細胞を含む。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＦｏｘＰ３＋発現Ｔ制御性細胞を含む。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＣＤ２５＋発現Ｔ制御性細胞を含む。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＦｏｘＰ３＋発現及びＣＤ２５＋発現Ｔ制御性細胞を含む。
実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ制御性細胞である。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＣＤ４＋Ｔ制御性細胞である。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＣＤ８＋Ｔ制御性細胞である。実施形態では、該Ｔ制御性細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ制御性細胞である。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加は、該ＬＮＰと接触されないこと、または組み換えＧＭ－ＣＳＦと接触されること以外は同様のサンプルにおけるＴ制御性細胞のレベル及び／または活性と比較される。実施形態では、Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加は、インビボで生じる。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加は、以下のパラメータの１つ、２つ、もしくはすべて、またはそれらの組み合わせを含む：
（ａ）Ｔ制御性細胞（例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔ制御性細胞）のレベル（例えば、数または割合）の増加、
（ｂ）図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性もしくは発現レベルの増加、または図６Ｂもしくは図６Ｃに記載の１つ以上の経路の活性もしくは発現レベルの増加、あるいは
（ｃ）図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性もしくは発現レベルの低下、または図６Ｂもしくは図６Ｃに記載の１つ以上の経路の活性もしくは発現レベルの低下。
実施形態では、Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加は、図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性もしくは発現レベルの増加、または図６Ｂもしくは図６Ｃに記載の１つ以上の経路の活性もしくは発現レベルの増加を含む。実施形態では、Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加は、図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性または発現レベルの増加を含む。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、約２～５倍、約２～４．５倍、約２～４倍、約２～３．５倍、または約２～３倍である。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、約２倍である。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、約３倍である。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、約４倍である。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、約５倍である。実施形態では、該活性及び／または発現レベルの増加は、５倍を超える。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰの投与により、ＧＭ－ＣＳＦのバイオアベイラビリティが（例えば、当該対象からのサンプルにおいて）増加する。実施形態では、該バイオアベイラビリティの増加は、組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムの投与と比較される。実施形態では、該バイオアベイラビリティの増加は、少なくとも１．５～１０倍、少なくとも１．５～９倍、少なくとも１．５～８倍、少なくとも１．５～７倍、少なくとも１．５～６倍、少なくとも１．５～５倍、少なくとも１．５～４倍、少なくとも１．５～３倍または少なくとも１．５～２倍である。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰの投与により、ＧＭ－ＣＳＦの発現レベル、例えば、安定性または半減期が（例えば、当該対象からの血漿サンプルにおいて）、ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰを投与されていない対象と比較して、または組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムを投与された対象と比較して増加する。ＧＭ－ＣＳＦの発現レベルの増加は、例えば、実施例２のアッセイによって測定して、約１０～５０倍である。実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦの発現レベルの増加は、約１０～４５倍、約１０～４０倍、約１０～３５倍、約１０～３０倍、約１０～２５倍、約１０～２０倍または約１０～１５倍である。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、組織中のＧＭ－ＣＳＦのレベルは、参照、例えば、適切な対照と比較して増加しない。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰは、異なる形態で投与されるＧＭ－ＣＳＦの用量と比較して、低用量（例えば、低有効量）で投与され得る。実施形態では、該ＬＮＰの低用量は、組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムの用量と比較される。実施形態では、該ＬＮＰにおけるＧＭ－ＣＳＦの用量は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低い。実施形態では、該ＬＮＰにおけるＧＭ－ＣＳＦの用量は、例えば、組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムと比較して、約１．５～１０倍低いか、約１．５～９倍低いか、約１．５～８倍低いか、約１．５～７倍低いか、約１．５～６倍低いか、約１．５～５倍低いか、約１．５～４倍低いか、約１．５～３倍低いか、または約１．５～２倍低い。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、ＬＮＰの投与により、ニューロンのレベル（例えば、ニューロンの数または割合）の低下が、例えば、ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰを投与されていない対象におけるニューロンのレベルと比較して、または組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムを投与された対象におけるニューロンのレベルと比較して、防止される。実施形態では、ニューロンのレベル、例えば、数は、該ＬＮＰを投与された対象からのサンプルにおいて、例えば、実施例４または５に記載のアッセイによって測定して、少なくとも２０～５０％高い。
実施形態では、黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化は、ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰの投与後に、例えば、参照、例えば、適切な対照と比較して低下する。実施形態では、該黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化の低下は、例えば、ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰの投与がない参照における黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化と比較して、ほぼ少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低い。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的修飾を含む。実施形態では、該化学的修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。実施形態では、該化学的修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。実施形態では、該化学的修飾は、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、完全修飾されたＮ１－メチルプソイドウリジンを含むｍＲＮＡを含む。本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたＮ１－メチルプソイドウリジンも完全修飾されたＮ１－メチルプソイドウリジンも含まないこと以外は同一のｍＲＮＡを含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ修飾脂質を含む。実施形態では、該イオン性脂質は、化合物１８を含む。実施形態では、該リン脂質は、化合物Ｈ－４０９を含む。実施形態では、該構造脂質は、コレステロールを含む。実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物Ｐ－４２８を含む。
本開示の核酸（ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡをコードする）は、通常は脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性カチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のイオン性カチオン性脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のイオン性カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のイオン性カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比５～２５％の非カチオン性脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、または２０～２５％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２５～５５％のステロールを含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０～６０％のイオン性カチオン性脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約２０～６０％の化合物１８、５～２５％のリン脂質、２５～５５％のコレステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物１８、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物１８、約１０％の化合物Ｈ－４０９、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物１８、約１０％の化合物Ｈ－４０９、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％の化合物Ｐ－４２８を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ修飾脂質を含む。実施形態では、該イオン性脂質は、化合物２５を含む。実施形態では、該リン脂質は、化合物Ｈ－４０９を含む。実施形態では、該構造脂質は、コレステロールを含む。実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物Ｐ－４２８を含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約２０～６０％の化合物２５、５～２５％のリン脂質、２５～５５％のコレステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物２５、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物２５、約１０％の化合物Ｈ－４０９、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約５０％の化合物２５、約１０％の化合物Ｈ－４０９、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％の化合物Ｐ－４２８を含む。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ＬＮＰを投与される対象は、哺乳類、例えば、マウス、ラットまたはヒトである。実施形態では、該対象は、ヒトである。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該組成物は、筋肉内または皮下投与される。実施形態では、該組成物は、筋肉内投与される。実施形態では、該組成物は、皮下投与される。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ＬＮＰは、毎日、約２～３５日間、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、２１、２８、３０または３５日間投与される。実施形態では、該ＬＮＰは、毎日、約２～３５日間、約２～３４日間、約２～３３日間、約２～３２日間、約２～３１日間、約２～３０日間、約２～２９日間、約２～２８日間、約２～２７日間、約２～２６日間、約２～２５日間、約２～２４日間、約２～２３日間、約２～２２日間、約２～２１日間、約２～２０日間、約２～１９日間、約２～１８日間、約２～１７日間、約２～１６日間、約２～１５日間、約２～１４日間、約２～１３日間、約２～１２日間、約２～１１日間、約２～１０日間、約２～９日間、約２～８日間、約２～７日間、約２～６日間、約２～５日間、約３～３５日間、約５～３５日間、約１０～３５日間、約１４～３５日間、約２１～３５日間、約２８～３５日間、約３０～３５日間、または約２１～３０日間投与される。実施形態では、該ＬＮＰは、毎日、約４日間投与される。実施形態では、該ＬＮＰは、毎日、約２８日間投与される。別の実施形態では、該ＬＮＰは、それほど頻繁ではなく、例えば、毎週、隔週、毎月、またはより少ない頻度で投与される。
本明細書に開示する方法または本明細書に開示する使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該ＬＮＰは、単剤療法として投与される。
前述のＬＮＰ組成物または当該ＬＮＰ組成物の使用方法のいずれかのさらなる特徴としては、以下の列挙される実施形態の１つ以上が挙げられる。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の列挙される実施形態によって包含されることが意図される。
本開示の他の実施形態
Ｅ１．対象におけるパーキンソン病の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、前記ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドが、配列番号１、配列番号８、配列番号１８７、配列番号２１５、または配列番号２２０のアミノ酸配列を含む、ＬＮＰ組成物。
Ｅ２．対象におけるパーキンソン病の治療方法であって、前記対象に対して、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の有効量を投与することを含む方法であって、前記ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドが、配列番号１、配列番号８、配列番号１８７、配列番号２１５、または配列番号２２０のアミノ酸配列を含む、方法。
Ｅ３．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ４．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号３の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ５．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号４の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ６．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号５の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ７．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号６の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ８．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号７の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ９．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１８８の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１０．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１６の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１１．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１９の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１２．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２２１の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１３．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２２４の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１４．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２０１または２０４の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１５．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２０６または２０９の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１６．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１１または２１４の配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または実施形態２に記載の方法。
Ｅ１７．ＬＮＰの投与により、サンプル（例えば、対象からのサンプル）における、例えば、実施例２～８のいずれか１つに記載のアッセイによって特定されるＴ制御性細胞のレベル及び／または活性が増加する、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ１８．前記Ｔ制御性細胞が、ＦｏｘＰ３＋発現及び／またはＣＤ２５＋発現Ｔ制御性細胞を含む、実施形態１７に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ１９．前記Ｔ制御性細胞が、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ制御性細胞である、実施形態１７または１８に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２０．前記Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加が、前記ＬＮＰと接触されないこと、または組み換えＧＭ－ＣＳＦと接触されること以外は同様のサンプルにおけるＴ制御性細胞のレベル及び／または活性と比較される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２１．前記Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加が、インビボで生じる、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２２．前記Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加が、以下のパラメータの１つ、２つ、もしくはすべて、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法：
（ａ）Ｔ制御性細胞（例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔ制御性細胞）のレベル（例えば、数または割合）の増加、
（ｂ）図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性もしくは発現レベルの増加、または図６Ｂもしくは図６Ｃに記載の１つ以上の経路の活性もしくは発現レベルの増加、あるいは
（ｃ）図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性もしくは発現レベルの低下、または図６Ｂもしくは図６Ｃに記載の１つ以上の経路の活性もしくは発現レベルの低下。
Ｅ２３．前記Ｔ制御性細胞のレベル及び／または活性の増加が、例えば、実施例２～８のいずれか１つに記載のアッセイによって測定して、約１．５～５倍である、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２４．図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性及び／または発現レベルの増加が、約２～５倍であるかまたは５倍を超える、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２５．図６Ａに記載の１つ以上の遺伝子の活性及び／または発現レベルの低下が、約２倍である、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２６．前記ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰの投与により、ＧＭ－ＣＳＦのバイオアベイラビリティが（例えば、前記対象からのサンプルにおいて）、組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムの投与と比較して増加する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２７．前記バイオアベイラビリティの増加が、少なくとも１．５～１０倍である、実施形態２６に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２８．前記ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰの投与により、ＧＭ－ＣＳＦの発現レベル、例えば、安定性または半減期が（例えば、前記対象からの血漿サンプルにおいて）、前記ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰを投与されていない対象と比較して、または組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムを投与された対象と比較して増加する、実施形態２６または２７に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ２９．前記ＧＭ－ＣＳＦの発現レベルの増加が、例えば、実施例２のアッセイによって測定して、約１０～５０倍である、実施形態２８に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３０．前記ＬＮＰが、組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムの投与と比較して、低用量（例えば、低有効用量）で投与され得る、実施形態２６～２９のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３１．前記ＬＮＰにおけるＧＭ－ＣＳＦの用量が、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低い、実施形態３０に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３２．前記ＬＮＰの投与により、ニューロンのレベル（例えば、ニューロンの数または割合）の低下が、例えば、前記ＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰを投与されていない対象におけるニューロンのレベルと比較して、または組み換えＧＭ－ＣＳＦ、例えば、サルグラモスチムを投与された対象におけるニューロンのレベルと比較して、防止される、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３３．前記ニューロンのレベル、例えば、数が、前記ＬＮＰを投与された対象からのサンプルにおいて、例えば、実施例４または５に記載のアッセイによって測定して、少なくとも２０～５０％高い、実施形態３２に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３４．前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学的修飾を含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３５．前記化学的修飾が、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態３４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３６．前記化学的修飾が、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３５に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３７．前記化学的修飾が、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである、実施形態３５または３６に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３８．前記ポリヌクレオチドが、完全修飾されたＮ１－メチルプソイドウリジンを含むｍＲＮＡを含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ３９．前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ修飾脂質を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４０．前記イオン性脂質が、化合物１８または化合物２５を含む、実施形態３９に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４１．前記リン脂質が、化合物Ｈ－４０９である、実施形態３９または４０に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４２．前記構造脂質が、コレステロールである、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４３．前記ＰＥＧ－脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物Ｐ－４２８である、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４４．前記ＬＮＰが、モル比約２０～６０％の化合物１８または化合物２５、５～２５％のリン脂質、２５～５５％のコレステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４５．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物１８、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ修飾脂質を含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４６．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物１８、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４７．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物１８、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％の化合物Ｐ－４２８を含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４８．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物２５、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ修飾脂質を含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ４９．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物２５、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％のＰＥＧ－ＤＭＧを含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５０．前記脂質ナノ粒子が、モル比約５０％の化合物２５、約１０％のリン脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１．５％の化合物Ｐ－４２８を含む、実施形態４４に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５１．前記対象が、哺乳類、例えば、マウス、ラットまたはヒトである、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５２．前記組成物が、筋肉内または皮下投与される、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５３．前記ＬＮＰが、毎日、約２～３５日間、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、２１、２８、３０または３５日間投与される、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５４．前記ＬＮＰが、毎日、約４日間投与される、実施形態５３に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５５．前記ＬＮＰが、毎日、約２８日間投与される、実施形態５３に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５６．前記ＬＮＰが、単剤療法として投与される、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５７．組織中のＧＭ－ＣＳＦのレベルが、参照、例えば、適切な対照と比較して増加しない、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５８．黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化が、ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰの投与後に、参照、例えば、適切な対照と比較して低下する、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
Ｅ５９．前記黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化の低下が、例えば、ＧＭ－ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰの投与がない参照における黒質線条体神経変性及び／またはミクログリア活性化と比較して、ほぼ少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低い、実施形態５８に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。複数の漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ足場または対照ＮＴＦＩＸでの処理前（前）及び６時間後（後）の末梢血中の血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルの定量化を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。複数の漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ足場で処理したマウス由来の脾臓における脾腫を示す代表的な画像を示す。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。最初の処理から４日後の臓器重量の定量化、及び臓器重量の線形回帰分析を示すグラフを示す。（Ｒ２＝０．４６７４、Ｐ＝０．０００９）。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後の全血中の白血球（ＷＢＣ）の絶対数を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後の全血中の単球の絶対数を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後の全血中の好中球の絶対数を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後の全血中のリンパ球の絶対数を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後のアルカリホスファターゼに関する血液化学プロファイルの変化を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後のアルブミンに関する血液化学プロファイルの変化を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後のアミラーゼに関する血液化学プロファイルの変化を示すグラフを示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５、ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理後の末梢血中のＴｒｅｇ頻度を示すグラフを示す（ｎ＝４～５、Ｒ２＝０．３７、Ｐ＝０．００６）。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理と比較した、漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血中のＣＤ３＋細胞の定量化を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理と比較した、漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血中のＣＤ８＋細胞の定量化を示すグラフを示す。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理と比較した、漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血中のＣＤ４＋細胞の定量化を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理と比較した、漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の定量化を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。ａ０ｍｇ／ｋｇと比較してｐ＜０．０５。 漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋のＴｒｅｇ数の増加を示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激したＣＦＳＥ染色Ｔｒｅｓｐ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）のＴｒｅｇが媒介する阻害（±ＳＥＭ）の評価を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の４日後に単離した。線形回帰分析は、０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及びＧＭ－ＣＳＦの直線に関してｐ＜０．０４、Ｒ２≧０．９１、ならびに０．１ｍｇ／ｋｇに関してｐ＝０．０８、Ｒ２＝０．８４を示す。平均±ＳＥＭの差（ｎ＝４～５／群）を特定した。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。処理動物におけるＣＤ１１ｃ＋の頻度を示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。処理動物における全ＣＤ４５＋ＣＤ３－集団でゲートした代表的なフローサイトメトリープロットを示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。全ＣＤ１１ｃ＋集団内のＣＤ１１ｂ＋またはＣＤ８α亜集団の頻度を示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。全ＣＤ１１ｃ＋集団内のＣＤ１１ｂ＋またはＣＤ８α亜集団の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。全ＣＤ４５＋ＣＤ３－集団内のＣＤ１１ｂ＋集団の頻度を示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。全ＣＤ４５＋ＣＤ３－集団内のＣＤ１１ｂ＋集団の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。示した結果は、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ処理後のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける用量依存的な骨髄集団の増加を示す。全ＣＤ１１ｃ＋細胞でゲートしたＣＤ８６、ＣＤ４０及びクラスＩＩのＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現（ＭＦＩで表される）を示す。示した結果は、２つの独立した実験からの平均＋／－ＳＥＭである。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理したアルファ－ｓｙｎモデルの動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。マウスの黒質（ＳＮ）内のドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロン及び線条体（ＳＴＲ）内のＴＨ＋細胞終末の顕微鏡写真を示す（ＳＮ ＴＨ＋＝スケールバー、５００μｍ、ＳＴＲ＝スケールバー、１０００μｍ）。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理したアルファ－ｓｙｎモデルの動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。ＭＰＴＰ中毒後のＳＮ内で生存するＴＨ＋／ニッスル＋及び非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋）ニューロンの総数の立体解析学的定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝８）の差を特定した。ＰＢＳで処理した群（図では「ａ」の文字で示される）、ＭＰＴＰで処理した群（図では「ｂ」の文字で示される）、０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｃ」の文字で示される）、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｄ」で示される）と比較してｐ＜０．０５。残存総ニューロン数の平均パーセントは、各処理バーに示されている。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理したアルファ－ｓｙｎモデルの動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。線条体のドーパミン作動性終末におけるＰＢＳ対照に対して正規化したＴＨ密度の相対的倍率変化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝８）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理したアルファ－ｓｙｎモデルの動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。ＳＮにおけるＭａｃ－１＋ミクログリアの顕微鏡写真を示す。すべての画像に関して、マウスをＰＢＳ、ＭＰＴＰ、０．００１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、または０．１ｍｇ／ｋｇの組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質で処理した（スケールバー、５００μｍ、挿入画像＝２００ｘ）。 ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理したアルファ－ｓｙｎモデルの動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。ＭＰＴＰ中毒から２日後の中脳から採取した反応性ミクログリアの定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝６）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）及びＭＰＴＰ（図では「ｂ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ｍＲＮＡが誘導するＴｒｅｇの養子移入が、ＭＰＴＰが誘導する病変に対して保護的であることを示す。ＰＢＳまたはＭＰＴＰでの処理後、０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかで処理したマウスから単離したＴｒｅｇの養子移入を受けたマウスの黒質（ＳＮ、上段）内のＴＨ＋／ニッスル＋ドーパミン作動性ニューロンの代表的な画像と、線条体（ＳＴＲ、下段）への投射を示す（ＳＮ ＴＨ＋＝スケールバー、５００μｍ、ＳＴＲ＝スケールバー、１０００μｍ）。 ｍＲＮＡが誘導するＴｒｅｇの養子移入が、ＭＰＴＰが誘導する病変に対して保護的であることを示す。ＭＰＴＰ中毒及び１×１０６のＴｒｅｇ養子移入後のＳＮ内で生存するドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）及び非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋）ニューロンの総数の定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝６～７）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ｍＲＮＡが誘導するＴｒｅｇの養子移入が、ＭＰＴＰが誘導する病変に対して保護的であることを示す。ＭＰＴＰ中毒に続いてＴｒｅｇの養子移入を受けたＳＴＲ内のＴＨ＋細胞終末の濃度測定分析を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝６～７）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した後のＣＤ４＋Ｔ細胞集団における遺伝子発現パターンを示す。上方制御または下方制御が２以上の遺伝子の表を示す。遺伝子を、上方制御または下方制御の程度に従って分類し、図６Ａの凡例に記載の通りに異なる柄で示した。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した後のＣＤ４＋Ｔ細胞集団における遺伝子発現パターンを示す。Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎネットワーク内の調節異常遺伝子の経路解析図を示す。 ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した後のＣＤ４＋Ｔ細胞集団における遺伝子発現パターンを示す。Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔネットワーク内の調節異常遺伝子の経路解析図を示す。クロスハッチング柄のノードは、下方制御された遺伝子を示す。点及び長点柄のノードは、上方制御された遺伝子を示す。柄のないノードは、測定されなかったが各々対応するシグナル伝達経路に関与しているｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）によって識別される遺伝子を示す。灰色の矢印は、２つの接続遺伝子間の直接的な関係を示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。ＰＢＳ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇのラットＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、または０．１ｍｇ／ｋｇの組み換えラットＧＭ－ＣＳＦタンパク質で処理した後の体重に対して正規化した脾臓重量の定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝３）の差を特定した。０ｍｇ／ｋｇ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ３＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝３）の差を特定した。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝３）の差を特定した。０ｍｇ／ｋｇ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝３）の差を特定した。０ｍｇ／ｋｇ（図では「ａ」の文字で示される）及び０．１ｍｇ／ｋｇのＧＭ－ＣＳＦ（図では「ｂ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。様々なＴｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比でのエキソビボでのＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）が媒介する細胞抑制（±ＳＥＭ）の定量化を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇが媒介する抑制は、阻害パーセントとして表される。線形回帰分析は、すべての処理に関してｐ＜０．０１、Ｒ２≧０．８７を示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）ベクター、ＡＡＶ２／１－α－ｓｙｎ（ＡＡＶ－α－ｓｙｎ）ベクター、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかでの処理前（前）（黒いバー）及び処理後（後）（灰色のバー）のＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。末梢全血を、リンパ球集団内のＣＤ３＋細胞の頻度に関して分析した。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝７）の差を特定した。＊前と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）ベクター、ＡＡＶ２／１－α－ｓｙｎ（ＡＡＶ－α－ｓｙｎ）ベクター、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかでの処理前（前）（黒いバー）及び処理後（後）（灰色のバー）のＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。末梢全血を、リンパ球集団内のＣＤ４＋細胞の頻度に関して分析した。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）ベクター、ＡＡＶ２／１－α－ｓｙｎ（ＡＡＶ－α－ｓｙｎ）ベクター、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかでの処理前（前）（黒いバー）及び処理後（後）（灰色のバー）のＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。末梢全血を、リンパ球集団内のＣＤ８＋細胞の頻度に関して分析した。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。Ｓｈａｍ、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ（ＡＡＶ－ＧＦＰ）ベクター、ＡＡＶ２／１－α－ｓｙｎ（ＡＡＶ－α－ｓｙｎ）ベクター、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかでの処理前（前）（黒いバー）及び処理後（後）（灰色のバー）のＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。末梢全血を、リンパ球集団内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の頻度に関して分析した。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝７）の差を特定した。＊前、Ｓｈａｍ－後（図では「ａ」の文字で示される）、ＡＡＶ－ＧＦＰ－後（図では「ｂ」の文字で示される）、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ－後（図では「ｃ」の文字で示される）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ－後（図では「ｄ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットモデルにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの長期処理の神経保護的効果及び抗炎症作用を示す。定位固定法を用いて、同側でＰＢＳ（Ｓｈａｍ）、ＡＡＶ対照（ＡＡＶ－ＧＦＰ）、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ単独、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎのいずれかを注射した後、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇの２つの異なる用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの黒質（１列及び２列）内のＴＨ＋／ニッスル＋ドーパミン作動性ニューロンの代表的な画像を示す（スケールバー、１０００μｍ）。処理後の線条体内のＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロン終末の代表的な画像を３列に示す（スケールバー、１０００μｍ）。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットモデルにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの長期処理の神経保護的効果及び抗炎症作用を示す。α－ｓｙｎ過剰発現後のＳＮの同側及び反対側の半球内で生存するドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋、黒いバー）及び非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋、灰色のバー）ニューロンの総数の同側／反対側比の立体解析学的定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝７）の差を特定した。Ｓｈａｍ（図では「ａ」の文字で示される）、ＡＡＶ－ＧＦＰ（図では「ｂ」の文字で示される）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ処理（図では「ｃ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットモデルにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの長期処理の神経保護的効果及び抗炎症作用を示す。線条体の同側及び反対側半球内の線条体ＴＨドーパミン作動性終末密度の同側／反対側比を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝７）の差を特定した。Ｓｈａｍ（図では「ａ」の文字で示される）、ＡＡＶ－ＧＦＰ（図では「ｂ」の文字で示される）、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ（図では「ｃ」の文字で示される）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（図では「ｄ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットモデルにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの長期処理の神経保護的効果及び抗炎症作用を示す。反対側及び同側の両方の黒質内のＩｂａ１＋ミクログリアの代表的な画像を示す（スケールバー、４０μｍ）。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットモデルにおけるＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの長期処理の神経保護的効果及び抗炎症作用を示す。立体的解析を利用して、同側と反対側の密度の比として示される反応性のアメーバ様Ｉｂａ１＋ミクログリア密度の定量化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝７）の差を特定した。Ｓｈａｍ（図では「ａ」の文字で示される）、ＡＡＶ－ＧＦＰ（図では「ｂ」の文字で示される）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎ（図では「ｃ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 Ａ～Ｄは、ＡＡＶアルファ－ｓｙｎ及びＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理、またはＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ単独での処理後の末梢サイトカインプロファイルを示す。Ａは、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ及び０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血血漿中のＣＩＮＣ－１、ＣＩＮＣ－２ａ／ｂ、ＣＩＮＣ－３、ＣＮＴＦ、フラクタルカイン、ＧＭＣＳＦ、ｓｉＣＡＭ－１、及びＩＰ－１０末梢サイトカインの倍率変化を示すグラフを示す。Ｂは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、及びＩＬ－４の倍率変化を示すグラフを示す。Ｃは、ＬＩＸ、Ｌ－セレクチン、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ７、及びＴＩＭＰ－１の倍率変化を示すグラフを示す。Ｄは、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＴＮＦα、及びＶＥＧＦＡの倍率変化を示すグラフを示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝４）の差を特定した。ＡＡＶ－α－ｓｙｎ（図では「ａ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。複数の漸増用量のＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ足場、対照ＮＴＦＩＸ、またはＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理から６時間後、ならびに１、３、及び５日後の末梢血中の血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルの定量化を示すグラフを示す。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。最初の処理から１、３、及び５日後の臓器重量の定量化を示すグラフを示す。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる筋肉内処理の効果を示す。処理後の全血中の白血球（ＷＢＣ）（左上）、単球（左下）、好中球（右下）、及びリンパ球（右上）の絶対数を示すグラフを示す。 漸増用量のＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを投与したマウスにおける処理後１、３、及び５日目での免疫組織化学効果を示す。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質及び対照ＮＴＦＩＸでの処理と比較した、漸増用量のＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後の末梢血中のＣＤ３＋（右上）、ＣＤ８＋（右下）、ＣＤ４＋（左下）、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋（左上）細胞の定量化を示すグラフを示す。 漸増用量のＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを投与したマウスにおける処理後１、３、及び５日目での免疫組織化学効果を示す。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激したＣＦＳＥ染色Ｔｒｅｓｐ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）のＴｒｅｇが媒介する阻害（±ＳＥＭ）の評価を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇは、未処理（０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）、または組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスから、処理の１、３、及び５日後に単離した。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。ＭＰＴＰ中毒後の黒質（ＳＮ）内で生存するドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）及び非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋）ニューロンの総数の立体解析学的定量化を示すグラフとともに、マウスのＳＮ内のＴＨ＋／ニッスル＋ニューロンの顕微鏡写真を示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝１５）の差を特定した。ＰＢＳで処理した群（図では「ａ」の文字で示される）、ＭＰＴＰで処理した群（図では「ｂ」の文字で示される）、０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｃ」の文字で示される）、０．０３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｄ」の文字で示される）、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｅ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。線条体のドーパミン作動性終末におけるＰＢＳ対照に対して正規化したＴＨ密度の相対的倍率変化を示すグラフとともに、マウスの線条体（ＳＴＲ）内のドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの顕微鏡写真を示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝１５）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）、ＭＰＴＰで処理した群（図では「ｂ」の文字で示される）、０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｃ」の文字で示される）、０．０３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｄ」の文字で示される）、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｅ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した動物におけるＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱を示す。ＳＮにおけるＭａｃ－１＋ミクログリアの顕微鏡写真を示す。すべての画像に関して、マウスをＰＢＳ、ＭＰＴＰ、０．０１ｍｇ／ｋｇのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、０．０３ｍｇ／ｋｇのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、または０．１ｍｇ／ｋｇのＮＴＦＩＸで処理した。ＭＰＴＰ中毒から２日後の中脳から採取した反応性ミクログリアの定量化を示すグラフも示す。平均（±ＳＥＭ、ｎ＝１５）の差を特定した。ＰＢＳ（図では「ａ」の文字で示される）、ＭＰＴＰで処理した群（図では「ｂ」の文字で示される）、０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｃ」の文字で示される）、０．０３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｄ」の文字で示される）、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群（図では「ｅ」の文字で示される）と比較してｐ＜０．０５。 ＰＢＳ、ＭＰＴＰ、０．１ｍｇ／ｋｇの組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡで処理した群に関して、ＭＰＴＰ中毒後の黒質（ＳＮ内）で生存するドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）及び非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋）ニューロンの総数の立体解析学的定量化を示すグラフとともに、マウスのＳＮ内のＴＨ＋／ニッスル＋ニューロンの顕微鏡写真を示す。 ＰＢＳ、ＭＰＴＰ、０．１ｍｇ／ｋｇの組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質、及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群に関して、線条体のドーパミン作動性終末におけるＴＨ密度の相対的倍率変化を示すグラフとともに、マウスの線条体（ＳＴＲ）内のドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの顕微鏡写真を示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。様々なＴｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比でのエキソビボでのＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）が媒介する細胞抑制（±ＳＥＭ）の定量化を示すグラフを示す。Ｔｒｅｇが媒介する抑制は、阻害パーセントとして表される。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後に採取した脾臓におけるＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後に採取した脾臓におけるＣＤ８＋、及びＣＤ４５Ｒ＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ３＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ８＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。 α－ｓｙｎ過剰発現Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の結果を示す。処理後の末梢血中のＣＤ４５Ｒ＋サブセットを含むＴ細胞表現型頻度のフローサイトメトリー分析を示すグラフを示す。
制御性Ｔ細胞（Ｔ制御性細胞またはＴｒｅｇとしても知られている）は、パーキンソン病（ＰＤ）の予防及び／または治療に対して有力な治療価値を有する。パーキンソン病では、疾患の発症及び進行は、多くの場合、Ｔｒｅｇの数ならびにそれらの抗増殖及び抗炎症作用の減少に関連している。しかしながら、これが発生する機序は研究中である。
ＧＭ－ＣＳＦ（ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）、サルグラモスチム）の治療可能性は、ＰＤ患者を対象とした第Ｉ相臨床試験で最近明らかにされた（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＮＰＪ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ Ｄｉｓ ３，１０）。ＧＭ－ＣＳＦを２か月間毎日投与することで、Ｔｒｅｇの数と機能が増加した。しかしながら、毎日の治療は一般に忍容性良好であったものの、注射部位反応、白血球数増加、及び骨痛を含め、すべての被験者が軽度～中等度の有害事象を経験した。さらに、組み換えＧＭ－ＣＳＦの限られたバイオアベイラビリティ及び短い半減期のため、比較的高用量及び頻回の投与が必要である。従って、ＧＭ－ＣＳＦの代替送達戦略を開発する必要がある。
従って、本明細書に開示するのは、ＰＤを有する対象の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。実施例２～８に示すように、ＬＮＰ製剤化ＧＭ－ＣＳＦ ｍＲＮＡの投与により、例えば、Ｔｒｅｇ数、機能、及び分岐するヒト疾患モデルにおける優れた神経保護活性の増強がもたらされ、天然のＧＭ－ＣＳＦタンパク質を超える進歩が示された。
ある態様では、本開示は、とりわけ、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を使用する方法を提供する。本明細書に記載の使用のための本開示のＬＮＰ組成物は、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡ治療薬を含む。ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象におけるパーキンソン病の治療に使用され得る。
定義
投与すること：本明細書で使用される、「投与すること」とは、組成物を対象または患者に送達する方法を指す。投与方法は、身体の特定の領域または系への送達を標的とする（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。例えば、投与は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、及び任意の適切な注入技術）、経口、経皮または皮内、皮下、直腸、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または点滴薬による）、粘膜、鼻、頬、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内で、気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって、経口スプレー及び／または粉末、点鼻薬、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを通して行われ得る。
およそ、約：本明細書で使用される、１つ以上の目的の値に適用される、「およそ」または「約」という用語は、述べられた基準値と類似した値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満に含まれる値の範囲を指す。例えば、ＬＮＰの脂質成分中の所与の化合物の量の文脈で使用される場合、「約」は、列挙された値の＋／－５％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むＬＮＰは、３０～５０％の該化合物を含み得る。
コンジュゲートされる：本明細書で使用される、「コンジュゲートされる」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、該部分が、直接または連結剤として機能する１つ以上のさらなる部分を介して、互いに物理的に会合または接続され、十分に安定な構造が形成され、該構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で該部分が物理的に会合したままであることを意味する。いくつかの実施形態では、２つ以上の部分は、直接共有化学結合によってコンジュゲートされ得る。他の実施形態では、２つ以上の部分は、イオン結合または水素結合によってコンジュゲートされ得る。
接触させること：本明細書で使用される、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞をｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることとは、該細胞及びｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子に物理的接続を共有させることを意味する。細胞を、インビボ、インビトロ、及びエキソビボのいずれの外部実体とも接触させる方法は、生物学分野において周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳類細胞を組成物（例えば、本開示のナノ粒子、または医薬組成物）と接触させるステップは、インビボで行われる。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳類）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳類細胞）との接触は、任意の適切な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下投与を含めた生物への非経口投与）によって行われ得る。インビトロに存在する細胞の場合、組成物（例えば、脂質ナノ粒子）及び細胞は、例えば、該組成物を該細胞の培地に添加することによって接触される場合があり、トランスフェクションを伴う場合もトランスフェクションをもたらす場合もある。さらに、複数の細胞を、ナノ粒子組成物と接触させてもよい。
送達すること：本明細書で使用される、「送達すること」という用語は、実体を目的地に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することとは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路によって）投与することを含み得る。哺乳類または哺乳類細胞へのＬＮＰの投与は、１つ以上の細胞を脂質ナノ粒子と接触させることを含み得る。
封入する：本明細書で使用される、「封入する」という用語は、囲む、包囲する、または包み込むことを意味する。いくつかの実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物は、完全に封入される場合もあれば、部分的に封入される場合もあれば、実質的に封入される場合もある。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子、例えば、リポソームに封入され得る。
封入効率：本明細書で使用される、「封入効率」とは、ＬＮＰの調製に使用される治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に最初に提供される合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰに封入される場合、封入効率は９７％として与えられ得る。本明細書で使用される、「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な囲み、閉じ込め、包囲、または包み込みを指し得る。
有効量：本明細書で使用される、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、従って、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、本開示の脂質組成物（例えばＬＮＰ）中の標的細胞送達促進脂質の量の観点から、標的細胞送達促進脂質の有効量は、該標的細胞送達促進脂質を欠く脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）と比較して、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）によってもたらされる有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージを増加させること、及び／または該脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）と会合した／それによって封入された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルを増加させることが挙げられる。有効量の脂質ナノ粒子が対象の標的細胞に取り込まれるように、標的細胞送達促進脂質含有脂質ナノ粒子を投与するという観点から、標的細胞送達促進脂質含有ＬＮＰの有効量とは、標的細胞送達促進脂質を欠くＬＮＰと比較して、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。対象における有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、標的細胞送達促進脂質を欠くＬＮＰと比較して、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージを増加させること、標的細胞送達促進脂質含有ＬＮＰと会合した／それによって封入された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルを増加させること、及び／または標的細胞送達促進脂質含有ＬＮＰと会合した／それによって封入された核酸もしくはそのコードされたタンパク質のインビボにおける予防または治療効果を増加させることが挙げられる。いくつかの実施形態では、治療有効量の標的細胞送達促進脂質含有ＬＮＰは、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているかまたはそれに罹患しやすい対象に投与された場合、該感染、疾患、障害、及び／または状態を治療する、それらの症状を改善する、診断する、予防する、及び／またはそれらの発症を遅延させるのに十分である。別の実施形態では、有効量の脂質ナノ粒子は、標的細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上における所望のタンパク質の発現をもたらすのに十分である。
発現：本明細書で使用される、核酸配列の「発現」とは、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エキソビボ：本明細書で使用される、「エキソビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）の外部で生じる事象を指す。エキソビボの事象は、天然の（例えば、インビボ）環境からの変更が最小限の環境で生じ得る。
断片：本明細書で使用される、「断片」とは、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することにより得られる、または組み換えＤＮＡ技術を介して得られるポリペプチドを含み得る。タンパク質の断片は、例えば、タンパク質の断片がタンパク質の機能活性を保持するように、１つ以上の機能ドメインを含むタンパク質の部分であり得る。
ＧＣリッチ：本明細書で使用される、「ＧＣリッチ」という用語は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはその誘導体もしくはアナログを含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）またはその任意の部分（例えば、ＲＮＡ要素）のＧＣ含量が約５０％を超える核酸塩基組成を指す。「ＧＣリッチ」という用語は、遺伝子、非コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡ要素、配列モチーフ、または約５０％のＧＣ含量を含むそれらの任意の別個の配列、断片、またはセグメントが挙げられるがこれらに限定されないポリヌクレオチドのすべてまたは一部を指す。本開示のいくつかの実施形態では、ＧＣリッチポリヌクレオチド、またはそれらの任意の部分は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基のみから構成される。
ＧＣ含量：本明細書で使用される、「ＧＣ含量」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその一部（例えば、ＲＮＡ要素）におけるグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはそれらの誘導体もしくはアナログである核酸塩基のパーセンテージを指す（ＤＮＡ及びＲＮＡ中のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、及びそれらの誘導体またはアナログを含めた可能な核酸塩基の総数から）。「ＧＣ含量」という用語は、遺伝子、非コード領域、５’もしくは３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡ要素、配列モチーフ、またそれらの任意の別個の配列、断片、またはセグメントが挙げられるがこれらに限定されないポリヌクレオチドのすべてまたは一部を指す。
異種：本明細書で使用される、「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が、所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに通常は存在しないことを示す。例えば、１つのタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第二のタンパク質に対して異種であり得る。
単離された：本明細書で使用される、「単離された」という用語は、会合していた（天然にまたは実験的設定においてにかかわらず）成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に関連して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に会合した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離される可能性がある。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％を超えて、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、実質的に他の成分を含まない場合、「純粋」である。
コザック配列：「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも呼ばれる）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を向上させる翻訳開始エンハンサー要素を指し、真核生物では、５’ＵＴＲに位置する。該コザックコンセンサス配列は、元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳における開始コドン（ＡＵＧ）周囲の単一突然変異の影響の分析に従い、ＧＣＣＲＣＣ、ここで、Ｒ＝プリン、の配列として定義された（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：２８３－２９２）。本明細書に開示するポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾を含む。（翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８０７，７０７号、参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙの米国特許第５，７２３，３３２号、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷｉｌｓｏｎの米国特許第５，８９１，６６５号を参照されたい）。
スキャンニング漏れ：ＰＩＣが開始コドンを迂回し、その代わりに代替の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）または代替の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）開始コドンが認識されるまで下流のスキャニングを継続する「スキャンニング漏れ」として知られる現象が生じる場合がある。発生頻度によっては、ＰＩＣによる開始コドンの迂回により翻訳効率が低下する場合がある。さらに、この下流のＡＵＧコドンからの翻訳が生じる可能性があり、その結果、望ましくない異常な翻訳産物が産生され、望ましい治療反応を引き出すことができない可能性がある。場合によっては、この異常な翻訳産物が、実際に有害な反応を引き起こし得る（Ｋｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３（４）：５０１－５０７）。
リポソーム：本明細書で使用される、「リポソーム」とは、水性の内部を囲む脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１つ以上の脂質膜を有し得る。リポソームとしては、単層リポソーム（当技術分野では単ラメラリポソームとしても知られている）及び多層（リポソーム（当技術分野では多重膜リポソームとしても知られている）が挙げられる。
修飾された：本明細書で使用される、「修飾された」または「修飾」とは、分子（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造の変化した状態または変化を指す。分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、化学的に、構造的に、及び／または機能的に等の様々な方法で修飾され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ要素の組み込みによって構造的に修飾される場合があり、該ＲＮＡ要素は、１つ以上の機能（例えば、翻訳調節活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡの二次構造（複数可）を含む。従って、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾で構成され得る（例えば、１つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾を、それらの任意の組み合わせを含めて含み得る）。１つの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然のリボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣについて非天然のヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。非標準的ヌクレオチド、例えば、キャップ構造は、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造と異なってはいるが、「修飾された」とは見なさない。
ｍＲＮＡ：本明細書で使用される、「ｍＲＮＡ」とは、伝令リボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然型であっても非天然型であってもよい。例えば、ｍＲＮＡは、修飾された及び／または非天然型の成分、例えば、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞内のｍＲＮＡのインビボ翻訳は、ポリペプチドを産生し得る。従来、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコード領域、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ及びポリＡ配列が含まれる。
ナノ粒子：本明細書で使用される、「ナノ粒子」とは、約１０００ｎｍ未満のスケールで任意の１つの構造的特徴を有し、同じ材料のバルクサンプルと比較して新規な特性を示す粒子を指す。日常的には、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満のスケールで任意の１つの構造的特徴を有する。同様に日常的には、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０ｎｍ～約１２０ｎｍのスケールで任意の１つの構造的特徴を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ程度の１つ以上の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ程度の１つ以上の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ程度の１つ以上の寸法を有する粒子である。球状ナノ粒子は、例えば、約５０ｎｍ～約１００ｎｍまたは約７０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径を有する。ナノ粒子は、ほとんどの場合、その輸送及び特性の点で単位として挙動する。対応するバルク材料からナノ粒子を識別する新規な特性は、通常、１０００ｎｍ未満のサイズスケールで、または約１００ｎｍのサイズで明らかになるが、ナノ粒子は、例えば、長円形、管状等である粒子に関しては、より大きなサイズのものであり得ることが留意される。ほとんどの分子のサイズは上記の外形に収まるが、個々の分子は通常、ナノ粒子とは呼ばれない。
核酸：本明細書で使用される、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと呼ばれる。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ等）またはそれらのハイブリッドが挙げられるがこれらに限定されない。
核酸構造：本明細書で使用される、「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と同義で使用される）という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または配列の配置または組織を指す。該用語はまた、２次元または３次元状態の核酸も指す。従って、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または配列の配置または組織を指し、及び／または２次元及び／または３次元状態のＲＮＡ分子を指す。核酸構造は、さらに、本明細書では、組織複雑性の増加に基づいて「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と呼ばれる４つの組織カテゴリーに区分され得る。
核酸塩基：本明細書で使用される、「核酸塩基」（または「ヌクレオチド塩基」もしくは「窒素塩基」）という用語は、核酸に見出されるプリンまたはピリミジンヘテロ環式化合物を指し、核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する天然型プリン及びピリミジンの任意の誘導体またはアナログを含む。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが、天然の核酸に主に見られる核酸塩基である。当技術分野で既知の、及び／または本明細書に記載の他の天然、非天然、及び／または合成核酸塩基を核酸に組み込むことができる。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用される、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）、またはその誘導体もしくはアナログ（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）に共有結合した糖分子（例えば、ＲＮＡのリボースもしくはＤＮＡのデオキシリボース）、またはその誘導体もしくはアナログを含むが、ヌクレオシド間の連結基（例えば、リン酸基）を欠く化合物を指す。本明細書で使用される、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合したヌクレオシド、あるいは核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された化学的及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与するその任意の誘導体、アナログ、または修飾を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される、「ＯＲＦ」と略される「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。該ＯＲＦは、開始コドンで始まり、終止コドンで終わる一続きの非重複、インフレームコドンを含み、リボソームによって翻訳される。
患者：本明細書で使用される、「患者」とは、治療を求めている場合もあれば、治療を必要とする場合もある対象、治療が必要な対象、治療を受けている対象、治療を受ける予定の対象、または教育を受けた専門家によって特定の疾患もしくは状態の医療を受けている対象を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒト患者である。いくつかの実施形態では、患者は、例えば、本明細書に記載の通り、自己免疫疾患に罹患している患者である。
医薬的に許容される：「医薬的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なくヒト及び動物の組織と接触する用途に適した、合理的なリスク・ベネフィット比に見合った化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために使用される。
医薬的に許容される賦形剤：本明細書で使用される、「医薬的に許容される賦形剤」という句は、本明細書に記載の化合物を除いた任意の成分（例えば、該活性化合物を懸濁または溶解することが可能な媒体）であるとともに、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性の特性を有する成分を指す。賦形剤としては、例えば、接着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、造膜剤またはコーティング、香味料、香料、流動促進剤（流動向上剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁または分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるがこれらに限定されない。
医薬的に許容される塩：本明細書で使用される、「医薬的に許容される塩」とは、本開示の化合物の誘導体を指し、この場合、該親化合物は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に転換することにより（例えば、遊離の塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）修飾されている。医薬的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるがこれらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコへプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が挙げられるがこれらに限定されない非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の医薬的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の医薬的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から従来の化学的手法で合成され得る。一般に、かかる塩は、これら化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適切な塩基または酸と水中もしくは有機溶媒中またはこれら２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水媒体が好ましい。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出される。これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ポリペプチド：本明細書で使用される、「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、通常は、天然に産生される（例えば、単離または精製される）場合もあれば合成される場合もあるペプチド結合によって接合されるアミノ酸残基のポリマーを指す。
転写開始前複合体（ＰＩＣ）：本明細書で使用される、「転写開始前複合体」（または「４３Ｓ転写開始前複合体」、「ＰＩＣ」と略される）という用語は、４０Ｓリボソームサブユニット、真核生物の開始因子（ｅＩＦ１、ｅＩＦ１Ａ、ｅＩＦ３、ｅＩＦ５）、及びｅＩＦ２－ＧＴＰ－Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔ三重複合体を含むリボ核タンパク質複合体を指し、これは、本質的にｍＲＮＡ分子の５’キャップへの結合が可能であり、結合後、該５’ＵＴＲのリボソームスキャンニングを実施することが可能である。
ＲＮＡ：本明細書で使用される、「ＲＮＡ」とは、天然型でも非天然型でもよいリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、修飾された及び／または非天然型の成分、例えば、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞内のｍＲＮＡのインビボ翻訳は、コードされたポリペプチドを産生し得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる限定されない群から選択され得る。
ＲＮＡ要素：本明細書で使用される、「ＲＮＡ要素」という用語は、生物学的機能を与え、及び／または生物活性（例えば、翻訳調節活性）を有するＲＮＡ分子の部分、断片、またはセグメントを指す。１つ以上のＲＮＡ要素、例えば、本明細書に記載のものの組み込みによるポリヌクレオチドの修飾は、当該修飾ポリヌクレオチドに１つ以上の所望の機能特性を与える。本明細書に記載のＲＮＡ要素は、天然型の場合、非天然型の場合、合成の場合、操作されている場合、またはそれらの任意の組み合わせの場合がある。例えば、調節活性を与える天然型ＲＮＡ要素としては、ウイルス、原核生物及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体に見出される要素が挙げられる。特定の真核生物のｍＲＮＡ及び翻訳されたウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡ要素は、細胞の多くの機能を媒介することに関与していることが示された。例示的な天然のＲＮＡ要素としては、翻訳開始要素（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ ７（２）：１９４－２０６参照）、翻訳エンハンサー要素（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサー要素、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１－６４３１参照）、ｍＲＮＡ安定性要素（例えば、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３－１２６参照）、翻訳抑制要素（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２参照）、タンパク質結合ＲＮＡ要素（例えば、鉄応答要素、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１－３３１０参照）、細胞質ポリアデニル化要素（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び触媒ＲＮＡ要素（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９－１０）：６３４－６４１参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
滞留時間：本明細書で使用される、「滞留時間」という用語は、ｍＲＮＡ分子に沿った個別の位置または場所での転写開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの占有時間を指す。
特異的送達：本明細書で使用される、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、ナノ粒子による、目的の標的細胞（例えば、哺乳類の標的細胞）への、オフターゲット細胞（例えば、非標的細胞）より多く（例えば、少なくとも１０％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）の治療薬及び／または予防薬の送達を意味する。特定の細胞へのナノ粒子の送達のレベルは、非標的細胞に対する標的細胞で産生されるタンパク質の量を比較すること（例えば、フローサイトメトリーを使用した平均蛍光強度によって）、該タンパク質を発現する非標的細胞に対する標的細胞の％を比較すること（例えば、定量的フローサイトメトリーによって）、非標的細胞に対する標的細胞で産生されるタンパク質の量と、非標的細胞に対する該標的細胞の総タンパク質量を比較すること、または非標的細胞に対する標的細胞中の治療薬及び／または予防薬の量と、非標的細胞に対する該標的細胞中の治療薬及び／または予防薬の総量を比較することによって測定され得る。標的細胞へのナノ粒子の特異的送達能力は、治療される対象で特定する必要はなく、動物モデル（例えば、マウスまたはＮＨＰモデル）等の代理のもので測定され得ることが理解されよう。
対象：本明細書で使用される、「対象」という用語は、例えば、実験的、診断的、予防的、及び／または治療的目的のために、本開示による組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳類）及び／または植物が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、患者であり得る。
実質的に：本明細書で使用される、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全面的もしくはほぼ全面的な範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学の分野における当業者には、生物学的及び化学的現象が、完成まで進むこと及び／または完全性へと進むことまたは絶対的な結果を達成することもしくは回避することがめったにないことが理解されよう。「実質的に」という用語は、従って、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に内在する完全性の潜在的な欠如を捕えるために使用される。
～に罹患している：疾患、障害、及び／または状態「に罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または状態であると診断されているか、またはその１つ以上の症状を示す。
標的部分：本明細書で使用される、「標的部分」とは、ナノ粒子に特定の細胞、組織、及び／または器官型を標的とさせ得る化合物または薬剤である。
治療薬：「治療薬」という用語は、対象に投与された場合に、治療的、診断的、及び／または予防的効果を有する、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
トランスフェクション：本明細書で使用される、「トランスフェクション」という用語は、種（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）を細胞に導入する方法を指す。
翻訳調節活性：本明細書で使用される、「翻訳調節活性」（「翻訳調節機能」と同義で使用される）という用語は、翻訳装置の活性、すなわち、該ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性等を調節する（例えば、調整する、影響を与える、制御する、変化させる）生物学的機能、機序、またはプロセスを指す。いくつかの態様では、該所望の翻訳調節活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を促進及び／または強化する。いくつかの態様では、該所望の翻訳調節活性は、スキャンニング漏れを低減及び／または抑制する。
治療すること：本明細書で使用される、「治療すること」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または状態を部分的にまたは完全に緩和すること、軽快すること、改善すること、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度の低下させること、及び／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の発生率を低下させることを指す。例えば、がんを「治療すること」とは、腫瘍の生存、成長、及び／または拡散を阻害することを指し得る。治療は、疾患、障害、及び／または状態の兆候を示していない対象に対して、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期症状を示しているのみの対象に対して、該疾患、障害、及び／または状態と関連する病態の発症のリスクを低下させる目的で施される場合がある。
予防すること：本明細書で使用される、「予防すること」という用語は、感染症、疾患、障害及び／または状態の１つ以上の症状または特徴の発症を部分的にまたは完全に阻害することを指す。
未修飾の：本明細書で使用される、「未修飾の」とは、何らかの方法で変更される前の任意の物質、化合物または分子を指す。未修飾のとは、必ずではないが、生体分子の野生型または天然型を指す場合がある。分子は、各修飾分子が後続の修飾に対して「未修飾の」出発分子としての役割を果たし得る一連の修飾を受ける場合がある。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、同義であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（該配列中のウリジンもしくはウラシルの総数）または相対値（該核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンもしくはウラシルのパーセンテージ）として表すことができる。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含量及び／またはウリジンパターンと比較して、異なる全体的なまたは局所的なウリジン含量（高いもしくは低いウリジン含量）あるいは異なるウリジンパターン（例えば、傾斜分布またはクラスタリング）を備えた配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の観点から、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等及び同義であると見なされる。
「高ウリジンコドン」とは、２つまたは３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「ウリジンなしのコドン」は、ウリジンを含まないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンでの置換、高ウリジンコドンのウリジンなしのコドンでの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンでの置換、低ウリジンコドンのウリジンなしのコドンでの置換、ウリジンなしのコドンの低ウリジンコドンでの置換、ウリジンなしのコドンの高ウリジンコドンでの置換、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ウリジンなしのコドンは、別のウリジンなしのコドンで置き換えることができる。ウリジン修飾配列は、ウリジンが濃縮される場合もあれば、ウリジンが希薄にされる場合もある。
ウリジンが濃縮される：本明細書で使用される、「ウリジンが濃縮される」という用語及び文法上の異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量と比較した、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）におけるウリジン含量（絶対値またはパーセンテージの値で表される）の増加を指す。ウリジン濃縮は、候補核酸配列におけるコドンをウリジン核酸塩基が少ない同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン濃縮は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）の場合もあれば、局所的（すなわち、候補核酸配列の部分列または領域に対する）の場合もある。
ウリジンが希薄にされる：本明細書で使用される、「ウリジンが希薄にされる」という用語及び文法上の異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量と比較した、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）におけるウリジン含量（絶対値またはパーセンテージの値で表される）の低下を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列におけるコドンをウリジン核酸塩基が少ない同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）の場合もあれば、局所的（すなわち、候補核酸配列の部分列または領域に対する）の場合もある。
パーキンソン病の治療で使用するＧＭ－ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰ
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞及び線維芽細胞を含めた多くの細胞によって分泌されるサイトカインである。ＧＭ－ＣＳＦは、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても知られている。ＧＭ－ＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（例えば、好中球）及び単球を生成することができ、これらが成熟してマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）になり得る。ＧＭ－ＣＳＦは、ＤＣの成熟、機能、及び動員を増加させることもできる。
ある態様では、本開示は、パーキンソン病の治療で使用する、例えば、本明細書に記載のヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むＬＮＰ組成物を提供する。実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。
実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、表１Ａまたは４Ａに示すヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、表１Ａもしくは４Ａに示すヌクレオチド配列、または表１Ａもしくは４Ａに示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号２の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号３の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号５の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号６の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号７の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１８８の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１８８のヌクレオチド配列を含む。
ある態様では、本開示は、パーキンソン病の治療で使用する、例えば、本明細書に記載のマウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むＬＮＰ組成物を提供する。実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。
実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、表１Ａに示すマウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号９のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、表１Ａに示すヌクレオチド配列、または表１Ａに示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号５の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該マウスＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
ある態様では、本開示は、パーキンソン病の治療で使用する、例えば、本明細書に記載のラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むＬＮＰ組成物を提供する。実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。
実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、表１Ａまたは４Ａに示すラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、表１Ａもしくは４Ａに示すヌクレオチド配列、または表１Ａもしくは４Ａに示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号６の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号７の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ラットＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
ある態様では、本開示は、パーキンソン病の治療で使用する、例えば、本明細書に記載のｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むＬＮＰ組成物を提供する。実施形態では、該ＬＮＰ組成物は、ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。
実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、表１Ａに示すｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドのアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、リーダー配列を含まない配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、表１Ａに示すヌクレオチド配列、または表１Ａに示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１２の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該ｃｙｎｏ ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。
実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦ分子は、さらに、半減期延長剤、例えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎまたはトランスフェリン等の血清タンパク質に結合するタンパク質（またはその断片）を含む。実施形態では、該半減期延長剤は、アルブミンもしくはその断片、または抗体分子のＦｃドメイン（例えば、ＦｃＲｎ結合が強化されたＦｃドメイン）を含む。実施形態では、該半減期延長剤は、アルブミン、またはその断片である。実施形態では、該半減期延長剤は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ｃｙｎｏ血清アルブミン（ＣＳＡ）またはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）である。実施形態では、該半減期延長剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。実施形態では、該半減期延長剤は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）である。実施形態では、該半減期延長剤は、ｃｙｎｏ血清アルブミン（ＣＳＡ）である。実施形態では、該半減期延長剤は、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）である。好ましい実施形態では、該血清アルブミン分子の種は、治療される種と同じである。
実施形態では、該半減期延長剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１８９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＨＳＡは、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、半減期延長剤を含むＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、該半減期延長剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。実施形態では、該ＨＳＡを含むＧＭ－ＣＳＦ分子、例えば、ＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦは、表１Ａまたは４Ａに示すＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＨＳＡを含むＧＭ－ＣＳＦ分子、例えば、ＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦは、表１Ａまたは４Ａに示すＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ配列のアミノ酸配列を含む。実施形態では、該半減期延長剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。実施形態では、該ＨＳＡを含むＧＭ－ＣＳＦ分子、例えば、ＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１８７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、該ＨＳＡを含むＧＭ－ＣＳＦ分子、例えば、ＨＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む。
実施形態では、半減期延長剤を含むＧＭ－ＣＳＦ分子をコードする第二のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むＬＮＰ組成物は、配列番号１８８の核酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。実施形態では、該半減期延長剤を含むＧＭ－ＣＳＦ分子をコードする第二のポリヌクレオチドは、配列番号１８８のヌクレオチド配列を含む。
実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、さらに１つ以上の要素、例えば、本明細書に開示する５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ、例えば、表４Ｂのものを含む。実施形態では、該５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位、例えば、本明細書に開示するものを含む。例示的な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、本明細書の「５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ」と題されたセクションに開示されている。
Figure 2022552378000001
Figure 2022552378000002
Figure 2022552378000003
Figure 2022552378000004
Figure 2022552378000005
Figure 2022552378000006
Figure 2022552378000007
Figure 2022552378000008
理論に拘束されることを望むものではないが、当業者には、ＨＳＡが一般にプレプロペプチドとして作製されるため、いくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＲＧＶＦＲＲＤが、本明細書に記載のリーダー配列の一部を構成し得ることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）５’キャップ、例えば、本明細書に開示するもの、（２）５’ＵＴＲ、例えば、表４Ａに示すもの、（３）表１Ａ、または４Ａに示すヌクレオチド配列ＯＲＦ、（４）終止コドン、（５）３’ＵＴＲ、例えば、表４Ａに示すもの、及び（６）ポリＡテール、例えば、本明細書に開示するもの、例えば、約１００残基のポリＡテール、例えば、配列番号２５を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２０４を含み、これは、５’から３’末端に向かって、配列番号２０２の５’ＵＴＲ、配列番号２０１のＯＲＦ配列、配列番号２０３の３’ＵＴＲ及び配列番号２５のポリＡテールからなる。
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２０９を含み、これは、５’から３’末端に向かって、配列番号２０７の５’ＵＴＲ、配列番号２０６のＯＲＦ配列、配列番号２０８の３’ＵＴＲ及び配列番号２５のポリＡテールからなる。
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２１４を含み、これは、５’から３’末端に向かって、配列番号２１２の５’ＵＴＲ、配列番号２１１のＯＲＦ配列、配列番号２１３の３’ＵＴＲ及び配列番号２５のポリＡテールからなる。
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２１９を含み、これは、５’から３’末端に向かって、配列番号２１７の５’ＵＴＲ、配列番号２１６のＯＲＦ配列、配列番号２１８の３’ＵＴＲ及び配列番号２５のポリＡテールからなる。
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２２４を含み、これは、５’から３’末端に向かって、配列番号２２２の５’ＵＴＲ、配列番号２２１のＯＲＦ配列、配列番号２２３の３’ＵＴＲ及び配列番号２５のポリＡテールからなる。
Figure 2022552378000009
Figure 2022552378000010
Figure 2022552378000011
Figure 2022552378000012
Figure 2022552378000013
Figure 2022552378000014
Figure 2022552378000015
Figure 2022552378000016
Figure 2022552378000017
ＬＮＰの脂質含量
上記のように、脂質に関して、本明細書に開示するＬＮＰは、（ｉ）イオン性脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び０（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらの脂質のカテゴリーを、以下でより詳細に説明する。
イオン性脂質
本開示の脂質ナノ粒子は、１つ以上のイオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のイオン性脂質は、中心アミン部分及び少なくとも１つの生分解性基を含む。本明細書に記載のイオン性脂質は、核酸分子を哺乳類の細胞または器官へ送達するための本開示の脂質ナノ粒子に有利に使用され得る。
いくつかの態様では、本開示のイオン性脂質は、式Ｉの化合物：

Figure 2022552378000018
 もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のうちの１つ以上でよく、式中：
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１－１３アルキルまたはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、ここで、Ｒ４が（ＣＨ２）ｎＱ、（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、またはＣＱ（Ｒ）２の場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５の場合にＮ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２の場合に５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）、
Figure 2022552378000019
 もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）、
Figure 2022552378000020
 もしくはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
本開示のイオン性脂質の構造は、それらを本発明の他の脂質と区別するための接頭辞Ｉを含む。
実施形態では、該ＬＮＰは、化合物Ｉ－１８を含むイオン性脂質を含む。
Figure 2022552378000021
実施形態では、該ＬＮＰは、化合物Ｉ－２５を含むイオン性脂質を含む。
Figure 2022552378000022
コレステロール／構造脂質
本明細書に記載のＬＮＰは、１つ以上の構造脂質を含む。
本明細書で使用される、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。該脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むことで、粒子内の他の脂質の凝集の軽減が促される可能性がある。構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、及びこれらの混合物を挙げることができるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン及びヒドロコルチゾン等）、またはそれらの組み合わせを含む。
該脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むことで、粒子内の他の脂質の凝集の軽減が促される可能性がある。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義される、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質は、コレステロールのアナログである。
非カチオン性ヘルパー脂質／リン脂質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質系組成物（例えば、ＬＮＰ）は、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態では、該非カチオン性ヘルパー脂質は、リン脂質である。いくつかの実施形態では、該非カチオン性ヘルパー脂質は、リン脂質の代替物または置換物である。
本明細書で使用される、「非カチオン性ヘルパー脂質」という用語は、少なくとも８炭素長の少なくとも１つの脂肪酸鎖及び少なくとも１つの極性頭基部分を含む脂質を指す。１つの実施形態では、該ヘルパー脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）ではない。１つの実施形態では、該非カチオン性ヘルパー脂質は、リン脂質またはリン脂質代替物である。いくつかの実施形態では、該リン脂質またはリン脂質代替物は、例えば、１つ以上の飽和または（ポリ）不飽和リン脂質の場合もあれば、リン脂質代替物の場合も、それらの組み合わせの場合もある。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質としてはまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも挙げられる。
いくつかの実施形態では、該非カチオン性ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣアナログ、ＤＳＰＣ代替物、オレイン酸、またはオレイン酸アナログである。
いくつかの実施形態では、非カチオン性ヘルパー脂質は、非ホスファチジルコリン（ＰＣ）双性イオン性脂質、ＤＳＰＣアナログ、オレイン酸、オレイン酸アナログ、または１，２－ジステアロイル－ｉ７７－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）代替物である。
リン脂質
本明細書に開示する医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の非カチオン性ヘルパー脂質を含むことができる。いくつかの実施形態では、該非カチオン性ヘルパー脂質は、リン脂質、例えば、１つ以上の飽和または（ポリ）不飽和リン脂質、またはそれらの組み合わせである。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。本明細書で使用される、「リン脂質」とは、リン酸部分及び１つ以上の炭素鎖、例えば、不飽和脂肪酸鎖を含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重または三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含み得る。リン脂質またはそのアナログもしくは誘導体は、コリンを含み得る。リン脂質またはそのアナログもしくは誘導体は、コリンを含まない場合もある。特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負電荷を有するリン脂質と相互作用し得る。リン脂質が膜に融合することで、脂質含有組成物の１つ以上の要素が膜を通過することが可能になる場合があり、例えば、１つ以上の要素の細胞への送達が可能になる。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負電荷を有するリン脂質と相互作用し得る。リン脂質が膜に融合することで、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することが可能になる場合があり、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達が可能になる。
本開示の脂質ナノ粒子の脂質成分は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の（ポリ）不飽和脂質を含み得る。リン脂質は、１つ以上の脂質二重層に集合し得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含み得る。例えば、リン脂質は、式（Ｈ ＩＩＩ）による脂質であり得る：
Figure 2022552378000023
 式中、Ｒｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ１及びＲ２は、不飽和を含むまたは含まない脂肪酸部分を表し、同じでも異なってもよい。リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含めた修飾及び置換を有する天然種を含めた非天然種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化または架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による付加環化を受ける可能性がある。かかる反応は、膜浸透もしくは細胞認識を促進するためにＬＮＰの脂質二重層を官能化するか、またはＬＮＰを標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）等の有用な成分にコンジュゲートするのに有用であり得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
本明細書に記載の組成物及び方法において有用なリン脂質は、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６．０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ（１８：２／１８：２）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＥ １８：３（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＡＰＥ １８：３（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２２：６（ｃｉｓ）ＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、
及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣを含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、ＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＭＰＥを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＥの両方を含む。
１つの実施形態では、標的細胞送達ＬＮＰで使用する非カチオン性ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＥ、及びＤＯＰＣまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質としてはまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも挙げられる。
リン脂質の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
Figure 2022552378000024
Figure 2022552378000025
Figure 2022552378000026
Figure 2022552378000027
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジオクタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）のアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、式（Ｈ ＩＸ）の化合物：
Figure 2022552378000028
 またはその塩であり、式中：
各Ｒ１は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または、任意に、２つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
Figure 2022552378000029
 のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意に、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
ただし、該化合物は、下記式のものではない：
Figure 2022552378000030
 式中、Ｒ２の各例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
ｉ）リン脂質の頭部修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部（例えば、修飾されたコリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を備えたリン脂質は、修飾された４級アミンを備えたＤＳＰＣ、またはそのアナログである。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、少なくとも１つのＲ１はメチルではない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000031
 またはその塩のものであり、式中：
各ｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは、独立して、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ）の化合物は、下記式のうちの１つ：

Figure 2022552378000032
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ）の化合物は、下記のうちの１つ：
Figure 2022552378000033
Figure 2022552378000034
 またはその塩である。
１つの実施形態では、標的細胞送達ＬＮＰは、非カチオン性ヘルパー脂質として化合物Ｈ－４０９を含む。
（ｉｉ）リン脂質の尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を備えたＤＳＰＣ（１，２－ジオクタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、またはそのアナログである。本明細書に記載の「修飾された尾部」とは、短縮されたまたは延長された脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖を有する尾部、置換が導入された脂肪族鎖を有する尾部、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖を有する尾部、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、（Ｈ ＩＸ）の化合物は、式（Ｈ ＩＸ－ａ）、またはその塩のものであり、ここで、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各例は、任意に置換されるＣ１－３０アルキルであり、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられる。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ）の化合物は、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）：
Figure 2022552378000035
 またはその塩のものであり、式中：
各ｘは、独立して、０と３０を含めた０～３０の整数であり、
Ｇの各例は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ ＩＸ－ｃ－１）：
Figure 2022552378000036
 またはその塩のものであり、式中：
ｖの各例は、独立して１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ ＩＸ－ｃ－２）：
Figure 2022552378000037
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、下記式：
Figure 2022552378000038
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、下記：
Figure 2022552378000039
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ ＩＸ－ｃ－３）：
Figure 2022552378000040
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、下記式：
Figure 2022552378000041
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ－ｃ）の化合物は、下記：
Figure 2022552378000042
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。従って、ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、式（Ｈ ＩＸ）の化合物であり、ここで、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000043
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ ＩＸ）の化合物は、下記のうちの１つ：
Figure 2022552378000044
Figure 2022552378000045
 またはそれらの塩である。
ある特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに別の脂質が使用される。かかる別の脂質の非限定的な例としては、下記が挙げられる：
Figure 2022552378000046
リン脂質の尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、修飾された尾部を備えたＤＳＰＣ、またはそのアナログである。本明細書に記載の「修飾された尾部」とは、短縮されたまたは延長された脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖を有する尾部、置換が導入された脂肪族鎖を有する尾部、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖を有する尾部、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、（Ｈ Ｉ）の化合物は、式（Ｈ Ｉ－ａ）、またはその塩のものであり、ここで、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各例は、任意に置換されるＣ１－３０アルキルであり、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられる。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ａ）の化合物は、式（Ｈ Ｉ－ｃ）：
Figure 2022552378000047
 またはその塩のものであり、式中：
各ｘは、独立して、０と３０を含めた０～３０の整数であり、
Ｇの各例は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ Ｉ－ｃ－１）：
Figure 2022552378000048
 またはその塩のものであり、式中：
ｖの各例は、独立して１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ Ｉ－ｃ－２）：
Figure 2022552378000049
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ－ｃ）の化合物は、下記式：
Figure 2022552378000050
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、下記：
Figure 2022552378000051
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、式（Ｈ Ｉ－ｃ－３）：
Figure 2022552378000052
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、下記式：
Figure 2022552378000053
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ－ｃ）の化合物は、下記：
Figure 2022552378000054
 またはその塩である。
ホスホコリンリンカーの修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。従って、ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、式（Ｈ Ｉ）の化合物であり、ここで、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000055
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（Ｈ Ｉ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000056
Figure 2022552378000057
 またはそれらの塩である。
以下の実施例で示すように、ＤＳＰＣ以外のリン脂質を有する多数のＬＮＰ製剤を調製し、活性について試験した。
リン脂質の代替物または置換物
いくつかの実施形態では、該脂質系組成物（例えば、脂質ナノ粒子）は、リン脂質の代わりにオレイン酸またはオレイン酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、オレイン酸アナログは、修飾されたオレイン酸尾部、修飾されたカルボン酸部分、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、オレイン酸アナログは、オレイン酸のカルボン酸部分が異なる基で置き換えられている化合物である。
いくつかの実施形態では、該脂質系組成物（例えば、脂質ナノ粒子）は、リン脂質の代わりに異なる双性イオン性基を含む。
例示的なリン脂質代替物及び／または置換物は、参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／０９９８２３号に示されている。
例示的なリン脂質代替物及び／または置換物は、参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／０９９８２３号に示されている。
（ｉ）ＰＥＧ脂質
ＰＥＧ－脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質としては、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリル（ｄｉｓｔｅｒｙｌ）グリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃａｍｉｄｅ）（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。１つの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ－脂質、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載のものは、当技術分野では既知である。
一般に、本明細書に記載の様々な式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、参照により全体として組み込まれる、２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」に記載の通りに合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む１つ以上の分子を含み得る。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれることもある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する：
Figure 2022552378000058
 １つの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれら例示的なＰＥＧ脂質のいずれかを修飾して、該ＰＥＧ鎖にヒドロキシル基を含めてもよい。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義される、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書では、「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、当該脂質に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、当該ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、当該ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＰＩ）の化合物：
Figure 2022552378000059
 またはその塩もしくは異性体であり、式中：
ｒは、１～１００の整数であり、
Ｒ５ＰＥＧは、Ｃ１０－４０アルキル、Ｃ１０－４０アルケニル、またはＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、または窒素保護基である。
例えば、Ｒ５ＰＥＧは、Ｃ１７アルキルである。例えば、該ＰＥＧ脂質は、式（ＰＩ－ａ）の化合物：
Figure 2022552378000060
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｒは、１～１００の整数である。
例えば、該ＰＥＧ脂質は、下記式の化合物：
Figure 2022552378000061
 またはその塩もしくは異性体である。
該ＰＥＧ脂質は、式（ＰＩＩ）の化合物：
Figure 2022552378000062
 またはその塩もしくは異性体であってもよく、式中：
ｓは、１～１００の整数であり、
Ｒ”は、水素、Ｃ１－１０アルキル、または酸素保護基であり、
Ｒ７ＰＥＧは、Ｃ１０－４０アルキル、Ｃ１０－４０アルケニル、またはＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、独立して、Ｃ３－１０カルボシクリレン、４～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６－１０アリーレン、４～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、または窒素保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒ７ＰＥＧは、Ｃ１０－６０アルキルであり、Ｒ７ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、－Ｃ（Ｏ）－で置き換えられる。例えば、Ｒ７ＰＥＧは、Ｃ３１アルキルであり、Ｒ７ＰＥＧのメチレン基のうちの２つは、－Ｃ（Ｏ）－で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、メチルである。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、式（ＰＩＩ－ａ）の化合物：
Figure 2022552378000063
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは、１～１００の整数である。
例えば、該ＰＥＧ脂質は、下記式の化合物：
Figure 2022552378000064
 またはその塩もしくは異性体である。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＩＩＩ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（ＩＩＩ）の化合物：
Figure 2022552378000065
 またはそれらの塩であり、式中：
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含めた１～１００の整数であり、
Ｌ１は、任意に置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
Figure 2022552378000066
 のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意に、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１－３０アルキル、任意に置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は－ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、式（ＰＩＩＩ－ＯＨ）：
Figure 2022552378000067
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分（例えば、トリアゾール）である。ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、式（ＰＩＩＩ－ａ－１）もしくは（ＰＩＩＩ－ａ－２）：
Figure 2022552378000068
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000069
 またはその塩のものであり、式中、
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000070
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000071
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000072
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、Ｄは、生理学的条件下で切断可能な部分（例えば、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、尿素）である。ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、式（ＰＩＩＩ－ｂ－１）もしくは（ＰＩＩＩ－ｂ－２）：
Figure 2022552378000073
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、式（ＰＩＩＩ－ｂ－１－ＯＨ）もしくは（ＰＩＩＩ－ｂ－２－ＯＨ）：
Figure 2022552378000074
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000075
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000076
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000077
 またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＩＩ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000078
 またはそれらの塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＩＶ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（ＰＩＶ）の化合物：
Figure 2022552378000079
 またはその塩であり、式中：
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１及び１００を含めた１～１００の整数であり、
Ｒ５は、任意に置換されるＣ１０－４０アルキル、任意に置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意に置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、－ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＶ）の化合物は、式（ＰＩＶ－ＯＨ）：
Figure 2022552378000080
 またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、ｒは、４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＩＶ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000081
 またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、ｒは、４０～５０である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
さらに他の実施形態では、式（ＰＩＶ）の化合物は：
Figure 2022552378000082
 またはその塩である。
１つの実施形態では、式（ＰＩＶ）の化合物は、
Figure 2022552378000083
 である。
ポリマー組成物の多分散性を理解する当業者には、ｎ値４５（例えば、Ｐ－４２８等の構造式において）が、実際のＰＥＧ含有組成物では４０～５０の値の分布を表し得ることが理解されよう。
１つの態様では、本明細書に提供するのは、パーキンソン病の治療で使用する式（ＰＶ）：
Figure 2022552378000084
 のＰＥＧ脂質またはそれらの医薬的に許容される塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり、式中：
Ｌ１は、結合、任意に置換されるＣ１－３アルキレン、任意に置換されるＣ１－３ヘテロアルキレン、任意に置換されるＣ２－３アルケニレン、任意に置換されるＣ２－３アルキニレンであり、
Ｒ１は、任意に置換されるＣ５－３０アルキル、任意に置換されるＣ５－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ５－３０アルキニルであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または酸素保護基であり、
ｒは、２及び１００を含めた２～１００の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶ）のＰＥＧ脂質は、下記式：
Figure 2022552378000085
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
Ｙ１は、結合、－ＣＲ２－、－Ｏ－、－ＮＲＮ－、または－Ｓ－であり、
Ｒの各例は、独立して、水素、ハロゲン、または任意に置換されるアルキルであり、
ＲＮは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000086
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
Ｒの各例は、独立して、水素、ハロゲン、または任意に置換されるアルキルである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：

Figure 2022552378000087
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
ｓは、５及び２５を含めた５～２５の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：

Figure 2022552378000088
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶ）のＰＥＧ脂質は：
Figure 2022552378000089
Figure 2022552378000090
 ならびにそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される。
別の態様では、本明細書に提供するのは、パーキンソン病の治療用の式（ＰＶＩ）：
Figure 2022552378000091
 のＰＥＧ脂質またはそれらの医薬的に許容される塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり、式中：
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または酸素保護基であり、
ｒは、２及び１００を含めた２～１００の整数であり、
ｍは、５及び１５を含めた５～１５の整数、または１９及び３０を含めた１９～３０の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000092
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000093
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
別の態様では、本明細書に提供するのは、パーキンソン病の治療用の式（ＰＶＩＩ）：
Figure 2022552378000094
 のＰＥＧ脂質またはそれらの医薬的に許容される塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり、式中：
Ｙ２は－Ｏ－、－ＮＲＮ－、または－Ｓ－であり、
Ｒ１の各例は、独立して、任意に置換されるＣ５－３０アルキル、任意に置換されるＣ５－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ５－３０アルキニルであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または酸素保護基であり、
ＲＮは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または窒素保護基であり、
ｒは、２及び１００を含めた２～１００の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000095
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000096
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
ｓの各例は、独立して、５及び２５を含めた５～２５の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000097
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩ）のＰＥＧ脂質は：
Figure 2022552378000098
 ならびにそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される。
別の態様では、本明細書に提供するのは、パーキンソン病の治療用の式（ＰＶＩＩＩ）：
Figure 2022552378000099
 のＰＥＧ脂質またはそれらの医薬的に許容される塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり、式中：
Ｌ１は、結合、任意に置換されるＣ１－３アルキレン、任意に置換されるＣ１－３ヘテロアルキレン、任意に置換されるＣ２－３アルケニレン、任意に置換されるＣ２－３アルキニレンであり、
Ｒ１の各例は、独立して、任意に置換されるＣ５－３０アルキル、任意に置換されるＣ３－３０アルケニル、または任意に置換されるＣ５－３０アルキニルであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または酸素保護基であり、
ｒは、２及び１００を含めた２～１００の整数である。ただし、Ｌ１が－ＣＨ２ＣＨ２－または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の場合、ＲＯは、メチルではない。
ある特定の実施形態では、Ｌ１が、任意に置換されるＣ２またはＣ３アルキレンの場合、ＲＯは、任意に置換されるアルキルではない。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、任意に置換されるＣ２またはＣ３アルキレンの場合、ＲＯは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＨ２ＣＨ２－または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の場合、ＲＯは、任意に置換されるアルキルではない。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＨ２ＣＨ２－または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－の場合、ＲＯは、水素である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩＩ）のＰＥＧ脂質は、式：
Figure 2022552378000100
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
Ｙ１は、結合、－ＣＲ２－、－Ｏ－、－ＮＲＮ－、または－Ｓ－であり、
Ｒの各例は、独立して、水素、ハロゲン、または任意に置換されるアルキルであり、
ＲＮは、水素、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアシル、または窒素保護基である。
ただし、Ｙ１が、結合または－ＣＨ２－の場合、ＲＯは、メチルではない。
ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＲ２－の場合、ＲＯは、任意に置換されるアルキルではない。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＲ２－の場合、ＲＯは、水素である。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＨ２－の場合、ＲＯは、任意に置換されるアルキルではない。ある特定の実施形態では、Ｌ１が、－ＣＨ２－の場合、ＲＯは、水素である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000101
Figure 2022552378000102
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
Ｒの各例は、独立して、水素、ハロゲン、または任意に置換されるアルキルである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000103
Figure 2022552378000104
 またはその医薬的に許容される塩のものであり、式中：
Ｒの各例は、独立して、水素、ハロゲン、または任意に置換されるアルキルであり、
各ｓは、独立して、５及び２５を含めた５～２５の整数である。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩＩ）のＰＥＧ脂質は、下記式のうちの１つ：
Figure 2022552378000105
Figure 2022552378000106
 またはその医薬的に許容される塩のものである。
ある特定の実施形態では、式（ＰＶＩＩＩ）のＰＥＧ脂質は：
Figure 2022552378000107
Figure 2022552378000108
 及びそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される。
前述のまたは関連する態様のうちのいずれかでは、ｒが４０～５０である本発明のＰＥＧ脂質を特徴とする。
本明細書に提供するＬＮＰは、ある特定の実施形態では、既存のＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ製剤と比較して、増加したＰＥＧ放出を示す。本明細書で使用される、「ＰＥＧ放出」とは、ＰＥＧ脂質からのＰＥＧ基の切断を指す。多くの場合、ＰＥＧ脂質からのＰＥＧ基の切断は、血清によって引き起こされるエステラーゼ切断を介して、または加水分解によって生じる。本明細書に提供するＰＥＧ脂質は、ある特定の実施形態では、ＰＥＧ放出の速度を制御するように設計されている。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、５０％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、６０％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、７０％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、８０％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、該ＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、９０％を超えるＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、９０％を超えるＰＥＧ放出を示す。
他の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％未満のＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後に、６０％未満のＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後に、７０％未満のＰＥＧ放出を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＬＮＰは、ヒト血清中で約６時間後に、８０％未満のＰＥＧ放出を示す。
本明細書に提供するＰＥＧ脂質に加えて、該ＬＮＰは、１つ以上のさらなる脂質成分を含み得る。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、該ＬＮＰ中に、他の脂質に対してモル比０．１５～１５％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比０．１５～５％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比１～５％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比０．１５～２％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比１～２％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比約１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、または２％で存在する。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、他の脂質に対してモル比約１．５％で存在する。
１つの実施形態では、本明細書に開示する医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％に及ぶ。
１つの実施形態では、本明細書に開示する脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。１つの実施形態では、本明細書に開示する脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約１．５ｍｏｌ％である。
１つの実施形態では、本明細書に開示する脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５ｍｏｌ％である。
例示的な合成：
Figure 2022552378000109
 パラジウム炭素（１０重量％、７４ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を含む窒素充填フラスコに、ベンジル－ＰＥＧ２０００－エステル－Ｃ１８（８２２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を添加した。フラスコを排気し、Ｈ２を３回充填し、室温及び１気圧のＨ２で１２時間撹拌した。その混合物をセライトを通して濾過し、ＤＣＭですすぎ、その濾液を真空中で濃縮して、所望の生成物を得た（６９２ｍｇ、８８％）。この方法を用いると、ｎ＝４０～５０となる。１つの実施形態では、得られた多分散混合物のｎは、平均４５で表される。
例えば、ｒの値は、ＰＥＧ脂質内のＰＥＧ部分の分子量に基づいて決定され得る。例えば、分子量２，０００（例えば、ＰＥＧ２０００）は、ｎの値が約４５に対応する。所与の組成物について、ポリマーはしばしば異なるポリマー鎖長の分布として見出されるため、ｎの値は、当技術分野で許容される範囲内の値の分布を意味し得る。例えば、かかるポリマー組成物の多分散性を理解する当業者には、ｎ値４５（例えば、構造式において）が、実際のＰＥＧ含有組成物、例えば、ＤＭＧ ＰＥＧ２００のｐｅｇ脂質組成物では４０～５０の値の分布を表し得ることが理解されよう。
いくつかの態様では、本明細書に開示する医薬組成物の標的細胞送達脂質は、ＰＥＧ－脂質を含まない。
１つの実施形態では、本開示の標的細胞送達ＬＮＰは、ＰＥＧ－脂質を含む。１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧではない。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの態様では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される。他の態様では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。
１つの実施形態では、本開示の標的細胞送達ＬＮＰは、鎖長が約１４より長い、または分岐の場合は約１０より長いＰＥＧ－脂質を含む。
１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、化合物番号Ｐ４１５、Ｐ４１６、Ｐ４１７、Ｐ４１９、Ｐ４２０、Ｐ４２３、Ｐ４２４、Ｐ４２８、Ｐ Ｌ１、Ｐ Ｌ２、Ｐ Ｌ１６、Ｐ Ｌ１７、Ｐ Ｌ１８、Ｐ Ｌ１９、Ｐ Ｌ２２及びＰ Ｌ２３のうちのいずれかからなる群から選択される化合物である。１つの実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、化合物番号Ｐ４１５、Ｐ４１７、Ｐ４２０、Ｐ４２３、Ｐ４２４、Ｐ４２８、Ｐ Ｌ１、Ｐ Ｌ２、Ｐ Ｌ１６、Ｐ Ｌ１７、Ｐ Ｌ１８、Ｐ Ｌ１９、Ｐ Ｌ２２及びＰ Ｌ２３のいずれかからなる群から選択される化合物である。
１つの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８、ＰＬ１６、ＰＬ１７、ＰＬ１８、ＰＬ１９、ＰＬ１、及びＰＬ２からなる群から選択される。
パーキンソン病の治療にＬＮＰ組成物を使用する方法、及びかかる治療方法で使用する構築物の最適化
ある態様では、本開示は、対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
関連する態様では、本明細書に提供するのは、対象におけるパーキンソン病（ＰＤ）の治療方法であり、該対象に対して、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の有効量を投与することを含む。実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示する治療方法または使用のための組成物のいずれかの実施形態では、該対象は、ＰＤを有するか、またはＰＤを有すると特定されている。
実施形態では、該対象は、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、またはラットである。実施形態では、該対象は、ヒトである。
配列最適化及びその方法
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示するポリペプチド、例えば、ＧＭ－ＣＳＦをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、該ＯＲＦは、配列最適化されている。
本明細書に開示する配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、独特の組成特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする）のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは、参照野生型ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに対して変更される（例えば、低減される）。かかる配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と呼ばれる。ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、配列のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除し、１００を掛けることによって特定され得る。いくつかの実施形態では、該配列最適化ヌクレオチド配列は、参照野生型配列のウラシルまたはチミン含量より低いウラシルまたはチミン含量を有する。いくつかの実施形態では、本開示の配列最適化ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列のウラシルまたはチミン含量より高いが、それでもなお、有益な効果、例えば、参照野生型配列と比較した場合に発現及び／またはシグナル応答の増加を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の最適化配列は、該配列において独自の範囲のウラシルまたはチミン（ＤＮＡの場合）を含む。該最適化配列のウラシルまたはチミン含量は、様々な方法、例えば、理論最小値に対する最適化配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）、野生型に対する最適化配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）、及び全ヌクレオチド含量に対する最適化配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）で表現され得る。ＤＮＡの場合、ウラシルの代わりにチミンが存在することが認識されており、Ｕが現れる場所にＴが代用される。従って、例えば、％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連するＲＮＡについてのすべての開示は、ＤＮＡについての％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに同じように当てはまる。
ウラシルまたはチミンの理論最小値に対するウラシルまたはチミンの含量とは、配列最適化ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミンの数を、すべてのコドンが最低限のウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられている仮想ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を掛けることによって特定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書では％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略される。
いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、連続したウラシル数が少ない。例えば、２つの連続したロイシンは、４つのウラシルクラスターを含む配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分列は、例えば、ウラシルクラスターを除去するＣＵＧＣＵＣで置換され得る。フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。従って、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣに置き換えられたとしても、同義コドンには依然としてウラシル対（ＵＵ）が含まれている。従って、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされたポリペプチド中のフェニルアラニンの数を変更することなく排除することができないウラシル対（ＵＵ）の最小数を規定する。
いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、三連ウラシル（ＵＵＵ）の数が少ない。いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）の数に対して、ウラシル対（ＵＵ）の数が少ない。いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）の最小限の数に対応する数のウラシル対（ＵＵ）の数を有する。
「野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）に対するウラシル対（ＵＵ）」という句は、配列最適化ヌクレオチド配列のウラシル対（ＵＵ）の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列中のウラシル対（ＵＵ）の総数で除し、１００を掛けることによって特定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書では％ＵＵｗｔと略される。いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１００％未満の間の％ＵＵｗｔを有する。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示するＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾された核酸塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、該ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～１４７のいずれか、または化合物１～２３２のいずれかとともに製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、その野生型配列、機能的断片、またはバリアント）を含むポリヌクレオチド）は、配列最適化される。
配列最適化ヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書では「核酸」とも呼ばれる）は、参照配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする野生型配列）に対して、少なくとも１つのコドン修飾を含む。従って、配列最適化核酸では、少なくとも１つのコドンは、参照配列（例えば、野生型配列）での対応するコドンと異なる。
一般に、配列最適化核酸は、少なくとも、参照配列中のコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含むステップによって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列中の各アミノ酸をコードするコドンを示す表）を適用することによって、または一連の規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸のとなりにある場合、グリシンはある特定のコドンによってコードされるが、極性アミノ酸のとなりにある場合は別のコドンによってコードされる）を適用することによって達成され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示する配列最適化方法は、厳密にはコドン最適化を対象としない、有害なモチーフの除去（不安定モチーフ置換）等のさらなる最適化ステップを含む。これらの配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤は、それを必要とする対象に投与され、機能的に活性なＧＭ－ＣＳＦポリペプチドのインビボ発現が促進され得る。
配列最適化のさらなる例示的な方法は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節要素、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬似受容体として作用するように設計された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、かかる調節要素を含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと言われる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みは、天然型ｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞型特異的発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチド、ひいては、それからコードされるポリペプチドの調節をもたらす。
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、さらに送達剤を含む。
いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示する配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示する配列最適化核酸配列に対して大幅な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲ結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然型ｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドに結合する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、該ポリヌクレオチドの安定性を低下させること、またはその翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡのシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８または２～７を含み得る。
マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉＲＮＡ）としばしば呼ばれる短いヘアピン構造を形成するように自身で折り返すＲＮＡ転写物の領域から酵素的に生じる。ｍｉＲＮＡ前駆体は通常、その３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する。このｍＲＮＡ前駆体は、核内でプロセシングされ、続いて細胞質に輸送され、そこでＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素）によってさらにプロセシングされ、約２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。該成熟マイクロＲＮＡは、その後、リボ核粒子に組み込まれ、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体、ＲＩＳＣを形成する。当該技術分野において承認されている成熟ｍｉＲＮＡの命名法は、通常、該成熟ｍｉＲＮＡが生じるｍｉＲＮＡ前駆体のアームを指定する。すなわち、「５ｐ」は、該マイクロＲＮＡが該ｍｉＲＮＡ前駆体のヘアピンの５プライムアームに由来することを意味し、「３ｐ」は、該マイクロＲＮＡが該ｍｉＲＮＡ前駆体のヘアピンの３プライム末端に由来することを意味する。本明細書において番号で言及されるｍｉＲは、同じｍｉＲＮＡ前駆体の対向するアームに由来する２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれか（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）を指すことができる。本明細書で言及されるすべてのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの指定により特に指定されない限り、３ｐ及び５ｐアーム／配列の両方を含むことが意図される。本明細書で使用される、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内または５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含めたＲＮＡ転写物内の配列を指し、ｍｉＲＮＡのすべてまたは領域に対して、該ｍｉＲＮＡと相互作用し、会合し、または結合するのに十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドは、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡが媒介する調節、例えば、該ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡが媒介する翻訳抑制または分解を促進するのに十分な相補性度を指す。本発明の例示的な態様では、該ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、該ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡが媒介する分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が媒介する切断を促進するのに十分な相補性度を指す。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば、天然型ｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分、または天然型ｍｉＲＮＡ配列より短い１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分に対して相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解の場合、十分なまたは完全な相補性（例えば、天然型ｍｉＲＮＡの長さのすべてまたはかなりの部分にわたって十分な相補性または完全な相補性）が好ましい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡのシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡのシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ、２つ、または３つのヌクレオチド置換、末端付加、及び／または切断を別にすればｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡより５’末端、３’末端、またはその両方で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、対応するマイクロＲＮＡより５’末端、３’末端、またはその両方で２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位はそれでもなお、１つ以上の該ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込んだｍＲＮＡを分解することや、該ｍＲＮＡの翻訳を妨げることが可能である。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、Ｄｉｃｅｒを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへ該ｍｉＲＮＡ結合部位が結合することで、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡが分解され、または該ｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断する。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導する。別の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことによって、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であれば、該ポリヌクレオチドを分解のための、または翻訳の低減のための標的とすることができる。これにより、該ポリヌクレオチドの送達に際するオフターゲット効果が低減され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達されることを意図していないが、当該組織または細胞に行き着く場合、該組織または細胞に豊富なｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が該ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに組み込まれれば、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。従って、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、核酸分子の送達に際するオフターゲット効果の危険が低下する場合があり、及び／または該ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異的調節が可能になる場合がある。さらに他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、インビボでの核酸送達に際する免疫応答を調節することができる。さらなる実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の加速血中クリアランス（ＡＢＣ）を調節することができる。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を高めるためにそれらが天然に存在するポリヌクレオチド配列から除去される場合がある。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位を、該ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞でのタンパク質発現を改善するためにポリヌクレオチドから除去することができる。
複数の組織での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか挿入するかの決定は、発達中及び／または疾患における組織及び／または細胞でのｍｉＲＮＡの発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいてなされ得る。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、及びそれらの発現パターンならびに生物学における役割の特定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びそれらの中のすべての参考文献、参照によりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ、ひいてはタンパク質発現を調節することが既知の組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等で差次的に発現されることが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの特徴を調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は免疫細胞でのみ発現され、特に骨髄樹状細胞で豊富である。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、該ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにｍｉＲ－１４２結合部位を付加することで遮断することができ、組織及び細胞へのより安定した遺伝子導入を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２、参照によりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。
抗原が媒介する免疫応答とは、生物に入った場合に抗原提示細胞によってプロセシングされ、該抗原提示細胞の表面で提示される外来抗原によって誘発される免疫応答を指すことができる。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、該抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
ｍｉＲ－１４２結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへ導入することで、ｍｉＲ－１４２が媒介する分解を介して抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それにより、該ポリヌクレオチドの送達後に抗原が媒介する免疫応答を防ぐことができる。該ポリヌクレオチドは、次いで、細胞傷害性排除を誘発することなく標的組織または細胞で安定に発現される。
１つの実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現されることが既知のｍｉＲＮＡの結合部位を本発明のポリヌクレオチドに組み込み、ｍｉＲＮＡが媒介するＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞でのポリヌクレオチドの発現を抑制し、該抗原が媒介する免疫応答を抑えることができる。該ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ－１２２結合部位を除去することができ、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、当該５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負調節要素を単独で、またはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせて含むことができる。非限定的な例として、該さらなる負調節要素は、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、新規なｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析により免疫細胞で特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、参照によりその各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
肝臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、及びｍｉＲ－９３９－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、肝臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
肺で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、及びｍｉＲ－３８１－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、肺における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
心臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、心臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
神経系で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、及びｍｉＲ－９－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。神経系で豊富なｍｉＲＮＡとしてはさらに、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２が挙げられるがこれらに限定されないニューロンで特異的に発現されるもの、ならびにｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、及びｍｉＲ－６５７が挙げられるがこれらに限定されないグリア細胞で特異的に発現されるものが挙げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、神経系における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
膵臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、及びｍｉＲ－９４４が挙げられるがこれらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、膵臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
腎臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、及びｍｉＲ－５６２が挙げられるがこれらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、腎臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
筋肉で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、及びｍｉＲ－２５－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、筋肉における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で組み込むことも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて組み込むこともできる。
ｍｉＲＮＡはまた、異なる細胞型、例えば、これらに限定されないが、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞でも差次的に発現される。
内皮細胞で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。内皮細胞において多くの新規なｍｉＲＮＡがディープシーケンシング解析から発見される（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、内皮細胞における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
上皮細胞で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、呼吸器線毛上皮細胞で特異的なｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２及びｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、肺上皮細胞で特異的なｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１２６、腎上皮細胞で特異的なｍｉＲ－３８２－３ｐ、ｍｉＲ－３８２－５ｐ、ならびに角膜上皮細胞で特異的なｍｉＲ－７６２が挙げられるがこれらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、上皮細胞における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
さらに、ｍｉＲＮＡの大集団が胚性幹細胞に濃縮され、幹細胞の自己再生ならびに様々な細胞系統、例えば、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞及び筋細胞の発生及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７－７６４、Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６），４２８－４３６、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７、参照によりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１，ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。多くの予測新規ｍｉＲＮＡが、ヒト胚性幹細胞のディープシーケンシングで発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２、Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５、参照によりこれらの各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびにＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、及び／またはサイトカインを分泌することができることが知られる細胞、例えば、内皮細胞及び血小板での発現ならびに存在量に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡのセットは、従って、これらの細胞の免疫原性に部分的に関与し得るｍｉＲを含み、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）への対応するｍｉＲ部位の組み込みが、該特定の細胞型における該ｍＲＮＡの不安定化、及び／またはこれらｍＲＮＡからの翻訳の抑制につながり得る。非限定的な代表的な例としては、造血細胞の多くに特異的なｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５及びｍｉＲ－２２３、Ｂ細胞で発現されるｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６及びｍｉＲ－２２３、造血前駆細胞で発現されるｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板及び内皮細胞で発現されるｍｉＲ－１２６が挙げられる。さらなるｍｉＲの組織発現についての議論は、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ－Ｍｏｎｔｏｙａ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０２２５９、Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １２９：１４０１－１４１４、Ｂｉｓｓｅｌｓ、Ｕ．ｅｔ ａｌ．（２００９）ＲＮＡ １５：２３７５－２３８４を参照されたい。任意の１つのｍｉＲ部位の３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲへの組み込みは、複数の目的の細胞型においてかかる効果を媒介し得る（例えば、ｍｉＲ－１４２は、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方で豊富である）。
いくつかの実施形態では、同じ細胞型を複数のｍｉＲで標的化すること、ならびに３ｐ及び５ｐのそれぞれのアームに対する結合部位を、両方が豊富にある（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ１４２－５ｐが両方とも造血幹細胞で豊富である）場合に組み込むことが有益であり得る。従って、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５及びｍｉＲ－２２３からなる群（これらは多くの造血細胞で発現される）、または（ｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６及びｍｉＲ－２２３からなる群（これらはＢ細胞で発現される）、もしくはｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６からなる群（これらは造血前駆細胞で発現される）から、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つもしくはそれ以上）のｍｉＲ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、複数の目的の細胞型が同時に標的化されるように様々なｍｉＲ（例えば、造血系及び内皮細胞の多くの細胞を標的とするｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６）を組み合わせることもまた有益であり得る。従って、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血系の細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５もしくはｍｉＲ－２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ－１２６）か、または（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲは、Ｂ細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６もしくはｍｉＲ－２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ－１２６）か、または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血前駆細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａもしくはｍｉＲ－１６）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ－１２６）か、または（ｉｖ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血系の細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５もしくはｍｉＲ－２２３）、少なくとも１つのｍｉＲは、Ｂ細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６もしくはｍｉＲ－２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ－１２６）か、あるいは上記の４つのクラスのｍｉＲ結合部位（すなわち、造血系を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、造血前駆細胞を標的とするもの及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）の任意の他の可能な組み合わせを標的とする。
１つの実施形態では、免疫応答を調節するため、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むことができる。従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みは、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞活性化、活性化Ｂ細胞の頻度で測定される）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ及び／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが分かっている。さらに、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みは、該ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）反応を低減または阻害することができる。
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物で送達されるポリヌクレオチドの加速血中クリアランスを調節するため、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含むことができる。１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みにより、該ｍＲＮＡの送達に使用される脂質含有化合物または組成物の加速血中クリアランス（ＡＢＣ）が低減または阻害されることが分かっている。さらに、１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みにより、該ｍＲＮＡを含む脂質含有化合物または組成物の投与後、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルが低下し（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭのＢ細胞による急性産生が低減または阻害され）、及び／または形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化が低減または阻害されることが分かっている。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列は、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号において教示されるものが挙げられるがこれらに限定されない免疫細胞で発現される任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。これら公開の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。免疫細胞で発現されるｍｉＲの非限定的な例としては、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／またはマクロファージで発現されるものが挙げられる。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７は骨髄細胞で発現され、ｍｉＲ－１５５は、樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞で発現され、ｍｉＲ－１４６は、ＴＬＲ刺激によりマクロファージにおいて上方制御され、ｍｉＲ－１２６は形質細胞様樹状細胞で発現される。ある特定の実施形態では、該ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現される。例えば、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）ならびにｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５－５ｐ）は、免疫細胞で豊富に発現される。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知であり、従って、当業者は、ワトソン・クリックの相補性に基づいてこれらマイクロＲＮＡが結合する結合配列または標的配列を容易に設計することができる。
従って、様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、該ｍＲＮＡは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの１～４個、すなわち、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのものであり得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現される同じｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピー、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲＮＡ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを使用することで、単一のｍｉＲＮＡ結合部位を使用することに比べて有利な特性を示すことができる。３つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１５５（３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）及び配列番号１５７（３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現される少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１１１（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号１５８（２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、ならびに配列番号１６１（２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ－１４２－３ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐもしくはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３もしくはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐもしくはｍｉＲ－１２６－５ｐ）の結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ－１２６－３ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐもしくはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐもしくはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐもしくはｍｉＲ－１４２－５ｐ）の結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ－１４２－５ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐもしくはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３もしくはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐもしくはｍｉＲ－１２６－５ｐ）の結合部位を含む。
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ－１５５－５ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐもしくはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３もしくはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐもしくはｍｉＲ－１２６－５ｐ）の結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡはまた、複雑な生物学的プロセス、例えば、血管新生を調節することもできる（例えば、ｍｉＲ－１３２）（Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本発明のポリヌクレオチドでは、かかるプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入し、該ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連した細胞型または関連した生物学的プロセスに合わせることができる。この状況では、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、該ｍｉＲＮＡ結合部位の配列の任意の１つ以上の１つ以上のコピーを含め、表３Ｃまたは表４Ｂから選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、さらに、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の表３Ｃまたは表４Ｂから選択される同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位をそれらの任意の組み合わせを含めて含む。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合するか、またはｍｉＲ－１４２に相補的である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１４２は、配列番号１１４を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号１１６を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号１１８を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６または配列番号１１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合するか、またはｍｉＲ－１２６に相補的である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６は、配列番号１１９を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号１２１を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位は、配列番号１２３を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１または配列番号１２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、第一のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合し、第二のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する。特定の実施形態では、該３’ＵＴＲのｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６への結合は、配列番号１６３の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
Figure 2022552378000110
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに、該ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で挿入される。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲ及び該３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。該ポリヌクレオチドの挿入部位は、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該ポリヌクレオチドへの挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下での機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、また、該ｍｉＲＮＡの存在下では、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該ポリヌクレオチドへの挿入及び該ｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合が、該ポリヌクレオチドを分解することまたは該ポリヌクレオチドの翻訳を妨げることが可能な限り、該ポリヌクレオチド内のどこであってもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドにおける当該ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ内のコード領域の終止コドンの直後の３’ＵＴＲ内に挿入される。いくつかの実施形態では、当該構築物に複数の終止コドンのコピーが存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最後の終止コドンの直後に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、当該終止コドンのさらに下流に挿入され、この場合、該終止コドンと該ｍｉＲ結合部位（複数可）の間には３’ＵＴＲ塩基が存在する。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲのｍｉＲに対して可能な挿入部位の３つの非限定的な例が配列番号１６２、１６３、及び１６４に示され、これらは、該３’ＵＴＲ内にそれぞれ、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を備えた３’ＵＴＲ配列を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、該５’ＵＴＲ内の１つ以上の可能な挿入部位に配置され得る。例えば、５’ＵＴＲのｍｉＲに対して可能な挿入部位の３つの非限定的な例が配列番号１６５、１６６、または１６７に示され、これらは、該５’ＵＴＲ内にそれぞれ、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに挿入されたｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を備えた５’ＵＴＲ配列を示す。
１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は該終止コドン後の３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチド内に配置される。１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン後の３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチド内に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン直後の３’ＵＴＲ内、または、該終止コドン後の３’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチド内もしくは該終止コドン後の３’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、該３’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にはスペーサー領域（例えば、１０～１００、２０～７０または３０～５０ヌクレオチド長）が存在し得る。別の実施形態では、該３’ＵＴＲは、該ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の終わりと該ポリＡテールヌクレオチドの間にスペーサー領域を含む。例えば、１０～１００、２０～７０または３０～５０ヌクレオチド長のスペーサー領域は、該ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の終わりと該ポリＡテールの始まりの間に位置し得る。
１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチド内に配置される。１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの１０～５０ヌクレオチド内に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの少なくとも２５ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン直前の５’ＵＴＲ内、または、該開始コドン前の５’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチド内もしくは該開始コドン前の５’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、該５’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にはスペーサー領域（例えば、１０～１００、２０～７０または３０～５０ヌクレオチド長）が存在し得る。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、複数の終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、該終止コドンの下流に配置される。例えば、３’ＵＴＲは、１、２、または３つの終止コドンを含み得る。使用され得る３重終止コドンの非限定的な例としては、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ（配列番号１２４）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ（配列番号１２５）、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ（配列番号１２６）、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１２７）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１２８）、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１２９）、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３０）、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１３１）、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１３２）、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３３）が挙げられる。３’ＵＴＲ内で、例えば、１、２、３または４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、該終止コドン（複数可）と直接隣接して、または最後の終止コドンの下流の任意のヌクレオチド数の箇所に配置され得る。該３’ＵＴＲが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、これらの結合部位は、該構築物において互いに直接隣接して（すなわち、交互に）配置され得るか、または、代替的に、スペーサーヌクレオチドが各結合部位間に配置され得る。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、３つの終止コドンを含み、３番目の終止コドンの下流に単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位が配置される。３つの終止コドン、及び最後の終止コドンの下流の異なる位置に配置された単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１５１、１６２、１６３、及び１６４に示される。
Figure 2022552378000111
Figure 2022552378000112
Figure 2022552378000113
Figure 2022552378000114
Figure 2022552378000115
Figure 2022552378000116
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１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞で発現されるｍｉＲの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結されたヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。様々な実施形態では、該３’ＵＴＲは、免疫細胞で発現される、好ましくは免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現されるｍｉＲの１～４個、少なくとも２個、１、２、３または４個のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
１つの実施形態では、免疫細胞で発現される該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６に示される配列を含む。１つの実施形態では、該ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１３４に示される配列を含む。
１つの実施形態では、免疫細胞で発現される該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１に示される配列を含む。１つの実施形態では、該ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１４９に示される配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲの非限定的な例示的な配列としては、以下が挙げられる：ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号１１５）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号１１７）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号１３５）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号１３６）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号１３７）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号１３８）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号１２０）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号１２２）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号１３９）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号１４０）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号１４１）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号１４２）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号１４３）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号１４４）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号１４５）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号１４６）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号１４７）及びｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号１４８）。免疫細胞で発現される（例えば、免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現される）他の適切なｍｉＲ配列は、当技術分野で既知でありまた、例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅにて入手可能である。上述したｍｉＲのいずれかに結合する部位は、該ｍｉＲに対するワトソン・クリック相補性、通常は該ｍｉＲに対する１００％の相補性に基づいて設計することができ、本明細書に記載の本開示のｍＲＮＡ構築物に挿入され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、その３’ＵＴＲ）は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、それにより、例えば、ＩｇＭ、例えば、ＰＥＧに対するものの、Ｂ細胞による産生を低減もしくは阻害することによって、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を低減もしくは阻害することによって、加速血中クリアランスを低減または阻害することができ、また、コードされた目的のタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
ｍｉＲＮＡ遺伝子の調節は、該ｍｉＲＮＡの周囲の配列、例えば、これらに限定されないが、該周囲の配列の種、配列のタイプ（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、該周囲の配列の調節因子及び／または該周囲の配列の構造要素に影響を受ける可能性がある。該ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに影響を受ける可能性がある。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する該ｍｉＲＮＡ配列の調節効果を高め得る。
１つの実施形態では、該５’ＵＴＲの他の調節要素及び／または構造要素は、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子調節に影響を与え得る。調節要素及び／または構造要素の１つの例は、該５’ＵＴＲの構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。該５’ＵＴＲのこの二次的構造化要素へのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。本発明のポリヌクレオチドはさらに、マイクロＲＮＡが媒介する遺伝子調節を高めるためにこの構造化５’ＵＴＲを含むことができる。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに組み込まれ得る。この状況では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに組み込まれ得る。例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２、または１個のｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに組み込まれ得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ部位でも異なるｍｉＲＮＡ部位でもよい。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの複数のコピーが組み込まれる組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とすることができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにおける組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、特定の細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞等）における発現度が低減され得る。
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間、及び／または３’ＵＴＲの３’末端付近で組み込むことができる。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの５’末端付近及び該３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で組み込むことができる。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの３’末端付近及び該３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で組み込むことができる。別の非限定的な例では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの５’末端付近及び該３’ＵＴＲの３’末端付近で組み込むことができる。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、該ポリヌクレオチドに少なくとも１つのセンサー配列を組み込むこと及び該ポリヌクレオチドを投与用に製剤化することによって制御され得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと及び該ポリヌクレオチドを、本明細書に記載の脂質のいずれかを含めたイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、組織または細胞を標的とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件でさらに標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞で、または生物学的条件の観点から最適なタンパク質発現のために設計され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡのシード配列に対して１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡのシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡのシード配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。該ｍｉＲＮＡのシード配列は、ｍｉＲＮＡの結合親和性が低下するように、従って、該ポリヌクレオチドの抑制的調節の低下をもたらすように部分的に変異させることができる。本質的に、該ｍｉＲＮＡ結合部位と該ｍｉＲＮＡのシード間のマッチまたはミスマッチの程度は、該ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力をより細かく調整するためのレオスタットの機能を果たし得る。さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異もまた、ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力に影響を与え得る。
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込むことができる。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡのシード配列は、ステムループのループに組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該ステムループの５’または３’ステムに組み込むことができる。
１つの実施形態では、該５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を用いて、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化することができる。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を用いて、翻訳開始部位、例えば、これに限定されないが、開始コドンのアクセシビリティを低下させることができる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたい。これは、開始コドンの周り（－４～＋３７、ここでは、ＡＵＧコドンのＡが＋１）にアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）を使用し、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセシビリティを低下させた。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドンの周りの配列をＬＮＡまたはＥＪＣで変更することが、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響を与えることを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位付近にｍｉＲＮＡ配列を含んで、翻訳開始部位へのアクセシビリティを低下させることができる。翻訳開始部位は、該ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその中にある場合がある。非限定的な例として、翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列内、例えば、シード配列または結合部位に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を減弱するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。該ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列でも、該ｍｉＲＮＡのシード配列でも、シードを含まない該ｍｉＲＮＡ配列でも、それらの組み合わせでもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減弱するために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞でのコードされたポリペプチドの発現を減弱するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。本発明のポリヌクレオチドの非限定的な例としては、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列及び／またはシード配列を含まないｍｉＲ－１４６結合部位を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞でｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含んで、治療薬の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。非限定的な例として、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドを、抗原提示細胞内でより不安定にすることができる。これらｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉＲ－１４６－３ｐが挙げられる。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができるポリヌクレオチドの領域に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＧＭＣＳＦポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
ＩＶＴポリヌクレオチド構造
いくつかの実施形態では、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む本開示のポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドである。従来、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ及びポリＡテールが含まれる。本開示のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、例えば、核酸ベースの治療法を使用した効果的なポリペプチド産生の既存の問題を克服するのに役立つ機能的及び／または構造的設計特性において、野生型ｍＲＮＡと区別され得る。
ＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物は、両側に第一のフランキング領域及び第二のフランキング領域がある連結されたヌクレオチドの第一の領域を含む。この第一の領域は、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドを含むことができるが、これに限定されない。該第一のフランキング領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、該ポリペプチドの天然の５’ＵＴＲまたは非天然の５’ＵＴＲ、例えば、これらに限定されないが、異種５’ＵＴＲもしくは合成５’ＵＴＲをコードする核酸のいずれかの５’ＵＴＲとして機能する連結されたヌクレオシドの配列を含み得る。該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするＩＶＴは、その５’末端に１つ以上のシグナル配列をコードするシグナル配列領域を含み得る。該フランキング領域は、１つ以上の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。該フランキング領域はまた、５’末端キャップも含み得る。該第二のフランキング領域は、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドの天然の３’ＵＴＲまたは非天然の３’ＵＴＲ、例えば、これらに限定されないが、異種３’ＵＴＲもしくは合成３’ＵＴＲをコードし得る１つ以上の完全または不完全３’ＵＴＲを含む連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。該フランキング領域はまた、３’テーリング配列も含み得る。該３’テーリング配列は、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット及び／またはステムループ配列であり得るが、これらに限定されない。
ＩＶＴポリヌクレオチド構造のさらなる例示的な特徴は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドのコード領域と同種でも異種でもよい。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするＯＲＦと同種である。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするＯＲＦと異種である。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組合せは、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組合せは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルプソイドウラシルまたは５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、調節的な役割、例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の向上もしくは低下を与える特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つ以上の調節機能は常法を用いて測定され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ、完全長の５’または３’ＵＴＲの１つ以上の調節機能を含む。天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のような記号を有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号８７）を有し、ここで、Ｒは、後ろに別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。５’ＵＴＲはまた、延長因子の結合に関与する二次構造を形成することでも知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現される遺伝子に通常見られる特徴を操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を高めることができる。例えば、肝臓で発現されるｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５’ＵＴＲの導入で、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲの使用で、その組織での発現を改善することは、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）で可能である。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達の過程のある時点で発現されるタンパク質のファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起源、または発現パターンを共有する）に属することができる。該遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して新たなポリヌクレオチドを生成することができる。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、該３’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、該５’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。
共有国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、参照により全体として本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦのフランキング領域として本発明のポリヌクレオチドに使用され得る例示的なＵＴＲのリストを提供している。
本出願の例示的なＵＴＲとしては、グロビン、例えば、α－またはβ－グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）、強力なコザック翻訳開始シグナル、ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５αポリペプチド）、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）、ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）、ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）、熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）、翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）、グルコーストランスポーター（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコーストランスポーター１））、アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）、ＧＡＰＤＨ、チュブリン、ヒストン、クエン酸回路酵素、トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト））、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）、リボソームタンパク質（例えば、ｒｐｓ９等のヒトまたはマウスリボソームタンパク質）、ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）、成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））、延長因子（例えば、延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））、リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）、及びヌクレオビンディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、β－グロビンの５’ＵＴＲ、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、シトクロムｂ－２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）の５’ＵＴＲ、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）の５’ＵＴＲ、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム、デング熱ウイルス（ＤＥＮ）の５’ＵＴＲ、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の５’ＵＴＲ、ｅｌＦ４Ｇの５’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１の５’ＵＴＲ、それらの機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、β－グロビンの３’ＵＴＲ、ＣＹＢＡの３’ＵＴＲ、アルブミンの３’ＵＴＲ、成長ホルモン（ＧＨ）の３’ＵＴＲ、ＶＥＥＶの３’ＵＴＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３’ＵＴＲ、α－グロビンの３’ＵＴＲ、ＤＥＮの３’ＵＴＲ、ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）の３’ＵＴＲ、延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）の３’ＵＴＲ、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の３’ＵＴＲ、ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１の３’ＵＴＲ、ＭＥＦ２Ａの３’ＵＴＲ、β－Ｆ１－ＡＴＰアーゼの３’ＵＴＲ、それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡ由来の野生型ＵＴＲが本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対する該ＵＴＲの向きもしくは位置を変更することによって、またはさらなるヌクレオチドを含めること、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、バリアントＵＴＲを産生するように野生型または天然のＵＴＲに対して変更され得る。いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの突然変異体、または１つ以上のヌクレオチドが当該ＵＴＲの末端に追加されたまたは当該ＵＴＲの末端から除去されたバリアントが使用され得る。
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲが１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＭａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２を参照されたい。
ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置することもできれば、向きまたは位置を変更することもできる。従って、５’及び／または３’ＵＴＲは、反転すること、短縮すること、延長すること、または１つ以上の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、もしくは四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを直列または実質的に直列に含む。例えば、二重ベータ－グロビンの３’ＵＴＲを使用することができる（参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０１２９８７７参照）。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示するＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、以下を含む：
５’ＵＴＲ－００１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１８５）、
５’ＵＴＲ－００２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８９）、
５’ＵＴＲ－００３（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２参照）、
５’ＵＴＲ－００４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９０）；
５’ＵＴＲ－００５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９１）、
５’ＵＴＲ－００６（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２参照）、
５’ＵＴＲ－００７（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９２）、
５’ＵＴＲ－００８（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９３）、
５’ＵＴＲ－００９（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９４）、
５’ＵＴＲ－０１０、上流
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９５）、
５’ＵＴＲ－０１１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９６）、
５’ＵＴＲ－０１２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９７）、
５’ＵＴＲ－０１３（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９８）、
５’ＵＴＲ－０１４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９９）、
５’ＵＴＲ－０１５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１００）、
５’ＵＴＲ－０１６（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０１）、
５’ＵＴＲ－０１７（上流ＵＴＲ）、または
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０２）、
５’ＵＴＲ－０１８（上流ＵＴＲ）５’ＵＴＲ
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８８）。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、以下を含む：
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０４）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０５）、または
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０６）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０７）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０８）、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０９）。
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１０）、
３’ＵＴＲ－０１８（配列番号１５０参照）、
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２とｍｉＲ１２６結合部位バリアント１）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１１）
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２とｍｉＲ１２６結合部位バリアント２）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１２）、または
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位バリアント３）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１８６）。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、本明細書に提供する５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号１８５、８８～１０２、または１６５～１６７のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号１０４～１１２、１５０、１５１、または１７８のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号１８５、配列番号１９３、配列番号３９、または配列番号１９４のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１８６、配列番号１７７、配列番号１１１、または配列番号１７８のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列を含み、該３’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含むことができる。例えば、該ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲ由来の第一のポリヌクレオチド断片及び第二のポリヌクレオチド断片を含むことができる（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２９３６２５参照）。
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列を組み込むことが、タンパク質産生及びポリヌクレオチドの発現レベルを向上し得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはそれに加えて配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３参照。参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスのカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、該ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、または翻訳エンハンサー要素（複数可）（総称して「ＴＥＥ」、これは、ポリペプチドの量またはポリヌクレオチドから生じるタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含み得る。非限定的な例として、該ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に配置され得る。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲはＴＥＥを含む。１つの態様では、ＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳等であるがこれに限定されない核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存要素である。
５’キャップを有する領域
本開示はまた、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外移行に関与し、ｍＲＮＡの安定性を高め、該ｍＲＮＡのキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、細胞のｍＲＮＡの安定性と翻訳能力に、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して関与し、成熟サイクリックｍＲＮＡ種を形成する。該キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの過程で５’近位イントロンの除去を助ける。
内因性ｍＲＮＡ分子は、該ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチド間で５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成するように５’末端キャップされ得る。この５’－グアニル酸キャップはその後メチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。該ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意に２’－Ｏ－メチル化もされ得る。該グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断を介した５’－デキャッピングで、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を分解の標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、非加水分解性キャップ構造を含み、デキャッピングを防止し、ひいてはｍＲＮＡの半減期を延長する。キャップ構造の加水分解には、５’－ｐｐｐ－５’－ホスホロジエステル結合の切断が必要なため、修飾ヌクレオチドがキャッピング反応の過程で使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製ワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従い、α－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用し、該５’－ｐｐｐ－５’キャップにホスホロチオエート結合を生成することができる。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α－メチル－ホスホネート及びセレノ－リン酸ヌクレオチドが使用され得る。
さらなる修飾としては、該ポリヌクレオチド（上記）の５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の糖環の２’－ヒドロキシル基における２’－Ｏ－メチル化が挙げられるがこれに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を用いて、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドの５’キャップを生成することができる。キャップアナログは、本明細書では合成キャップアナログ、化学キャップ、化学キャップアナログ、または構造的もしくは機能的キャップアナログとも呼ばれるが、天然の（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’キャップとはそれらの化学構造において異なるが、キャップ機能は保持する。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）もしくは酵素的に合成することができ、及び／または本発明のポリヌクレオチドに結合することができる。
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基で連結された２つのグアニンを含み、１つのグアニンがＮ７メチル基及び３’－Ｏ－メチル基を含む（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ、これは、同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）。他の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、該キャップされたポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結する。該Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアニンは、該キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシンに２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
いくつかの実施形態では、該キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的な例として、該ジヌクレオチドキャップアナログ、例えば、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップアナログは、異なるリン酸位置で、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
別の実施形態では、該キャップは、キャップアナログであり、当技術分野で既知の及び／または本明細書に記載のキャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップアナログのＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載の様々なキャップアナログ及びキャップアナログの合成方法を参照されたい。参照によりその内容は全体として本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４－クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
キャップアナログは、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時キャッピングを可能にするが、インビトロ転写反応では、転写物の最大２０％がキャップされないままの可能性がある。これは、内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’キャップ構造由来のキャップアナログの構造上の違いと同様、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下につながり得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、より信頼できる５’キャップ構造を生成するために、製造後（ＩＶＴまたは化学合成にかかわらず）、酵素を用いてキャップすることもできる。本明細書で使用される、「より信頼できる」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型の特徴をしっかりと反映もしくは模倣する特徴を指す。すなわち、「より信頼できる」特徴は、従来技術の合成の特徴またはアナログ等と比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理学的細胞機能及び／または構造をよく表すか、または、対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的特徴を１つ以上の点で上回る。本発明のより信頼できる５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然もしくは生理学的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合が向上したもの、半減期が延長したもの、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が低下したもの及び／または５’デキャッピングが減少したものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチド間で標準的な５’－５’－三リン酸結合を形成することができ、該キャップグアニンはＮ７メチル化を含み、該ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含む。かかる構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、高い翻訳能力及び細胞安定性ならびに低い細胞の炎症性サイトカインの活性化をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるがこれらに限定されない。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、より効率的であり、当該キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップすることができる。これは、キャップアナログがインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結された場合の約８０％と対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性のキャップを含むこともキャップアナログを含むこともできる。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含むことができる。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが挙げられるがこれらに限定されない。
ポリＡテール
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はさらに、ポリＡテールを含む。さらなる実施形態では、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡテールは、デス－３’ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシングの過程で、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡテール）をポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加し、安定性を高めることができる。転写直後、転写物の３’末端を切断し、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリＡポリメラーゼが当該ＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれる該プロセスは、例えば、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含めた約８０～約２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。１つの実施形態では、該ポリＡテールは１００ヌクレオチド長である（配列番号２５）。
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ポリＡテールは、当該構築物が核から移行された後に付加することもできる。
本発明によれば、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス－３’ヒドロキシルテールを含むことができる。それらは、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）によって教示された構造部分または２’－Ｏメチル修飾を含むこともできる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含めた代替ポリＡテール構造を備えた転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡにて検出されている。これらｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積の防止に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テールの欠如によって区別され、その機能は、代わりに安定なステムループ構造及びその同族ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって仮定され、後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰのものと同じ機能を果たす」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
独自のポリＡテールの長さが、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を与える。一般に、存在する場合、ポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、該ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長よりも長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドまたはそれより長い）。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）を含む。
いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、ポリヌクレオチドの全長またはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴または領域の長さを基にすることも、当該ポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さを基にすることもできる。
これに関連して、該ポリＡテールは、当該ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長い場合がある。該ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの一部として設計することもできる。これに関連して、該ポリＡテールは、当該構築物の全長、構築物の領域または当該構築物の全長から該ポリＡテールを引いた長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれ以上であり得る。さらに、組み込まれた結合部位及びポリＡ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドのコンジュゲーションが発現を向上させ得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチドは、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、３’末端を通じ、当該ポリＡテールの３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて互いに連結され得る。トランスフェクション実験は、関連する細胞株で行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。該Ｇカルテットは、４つのグアニンヌクレオチドの環状の水素結合された配置であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成され得る。本実施形態では、該Ｇカルテットは、ポリＡテールの末端に組み込まれる。得られるポリヌクレオチドは、安定性、タンパク質産生及び様々な時点での半減期を含めた他のパラメータについてアッセイされる。該ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡテール（配列番号２６）単独を用いて見られるものの少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが分かっている。
ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ ａａａａａａａａａａ（配列番号２６）
開始コドン領域
本発明は、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似の、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始することができる。該ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドン、例えば、これらに限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧで開始することができる（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照によりその各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＡＣＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＣＴＧまたはＣＵＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＧＴＧまたはＧＵＧで始まる。
翻訳を開始するコドン、例えば、これらに限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を与えることが知られている。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを用いて、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更することができる。
いくつかの実施形態では、マスキング剤を開始コドンまたは代替的な開始コドンの近傍で使用して該コドンをマスクまたは隠し、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣを記載しているＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）参照。参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンをマスクし、翻訳が代替的な開始コドンで開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、マスキング剤を使用して第一の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスクし、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体内に配置され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体はマスキング剤と同様、当該ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造の制御に役立つ。非限定的な例として、該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体の中央に配置され得る。該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、最初のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、２０番目のヌクレオチドまたは２１番目のヌクレオチドの後に配置され得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンを当該ポリヌクレオチド配列から除去し、開始コドンではないコドンで該ポリヌクレオチドの翻訳を開始させることができる。該ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドンもしくは下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで始まり得る。非限定的な例では、開始コドンであるＡＴＧまたはＡＵＧを当該ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去し、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳を開始させる。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列はさらに、下流の開始コドン及び／または代替的な開始コドンのマスキング剤少なくとも１つを含んで翻訳の開始、当該ポリヌクレオチドの長さ及び／または該ポリヌクレオチドの構造を制御することまたは制御を試みることができる。
終止コドン領域
本発明は、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。該終止コドンは、ＤＮＡの場合にはＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、ＲＮＡの場合にはＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合には終止コドンＴＧＡ、ＲＮＡの場合には終止コドンＵＧＡ、及びさらに１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、該追加の終止コドンは、ＴＡＡでもＵＡＡでもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれ以上を含む。
パーキンソン病の治療で使用するポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、本明細書に開示するポリヌクレオチドまたはその相補体の作製方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示する、及びＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を用いて構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示する、ＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いた化学合成によって構築され得る。他の態様では、本明細書に開示するＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を用いて作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示するＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞による発現、または当技術分野で既知の任意の他の方法の１つ以上の組み合わせによって作製される。
天然型ヌクレオシド、非天然型ヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然型ヌクレオシドを完全にまたは部分的に置き換えることができ、ＧＭ－ＣＳＦ分子をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。得られるｍＲＮＡは、その後、タンパク質の産生能力及び／または治療結果を生み出す能力について試験され得る。
本明細書に開示するポリヌクレオチドの例示的な作製方法としては、インビトロ転写酵素合成及び化学合成が挙げられ、これらは、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
精製
他の態様では、本明細書に開示するＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載のＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野で既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣ系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）によって行われ得る。「精製されたポリヌクレオチド」のように、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合の「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用される、「汚染物質」とは、別の物質を不適当、不純または劣るものにする任意の物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で存在するか、またはそれを処理または精製法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製で不純物を除去し、これにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること、例えば、サイトカイン活性を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、投与前にカラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を用いて精製される。いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を用いて精製された本明細書に開示するＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチドは、異なる精製法で精製されたＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするポリヌクレオチドと比較して、ＧＭ－ＣＳＦ分子の発現が増加する。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、ＧＭ－ＣＳＦ分子をコードする。いくつかの実施形態では、該精製されたポリヌクレオチドは、ヒトＧＭ－ＣＳＦ分子をコードする。
いくつかの実施形態では、該精製されたポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理検査は、例えば、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣであるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、逆転写ＰＣＲが挙げられるがこれに限定されない方法によって配列決定され得る。
ポリヌクレオチドの化学的修飾
本開示は、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。該結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、該核酸は、ヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造、例えば、少なくとも１つの化学的修飾を有するそれら核酸の間の水素結合が可能になる。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示の核酸に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルプソイドウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、該ポリリボヌクレオチドは、化学的修飾が挙げられるがこれに限定されない上記修飾核酸塩基のいずれか少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にＮ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にＮ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含み、当該核酸の１つ以上またはすべてのシチジンの位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含み、当該核酸の１つ以上またはすべてのシチジンの位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、すなわち、全配列を通して修飾される）。例えば、核酸は、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで均一に修飾され得る。つまり、当該ｍＲＮＡ配列のすべてのウリジン残基がＮ１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、上記のような修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、当該分子の全長にわたって部分的にも完全にも修飾され得る。例えば、１つ以上もしくはすべてまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの任意の１つ以上もしくはすべて）が本開示の核酸において、またはその所定の配列領域において（例えば、ポリＡテールを含めたもしくは除いたｍＲＮＡにおいて）均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸における（またはその配列領域における）すべてのヌクレオチドＸは修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つまたはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃの組み合わせのいずれか１つであり得る。
該核酸は、約１％～約１００％修飾されたヌクレオチド（総ヌクレオチド含量に関して、もしくはヌクレオチドの種類の１つ以上に関して、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上に関して）、またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。残存パーセンテージは、未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって説明されることが理解されよう。
該核酸は、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、該核酸は、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを含み得る。いくつかの実施形態では、当該核酸のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。該修飾ウラシルは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。いくつかの実施形態では、当該核酸のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。該修飾シトシンは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。
パーキンソン病の治療で使用する医薬組成物
本開示は、本明細書に開示するＬＮＰ組成物のいずれか、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＬＮＰ組成物を含む医薬製剤を提供する。
本開示のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて、組成物または複合体に製剤化される。医薬組成物は、任意に、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療及び／または予防効果のある物質を含み得る。本開示の医薬組成物は、無菌及び／またはパイロジェンフリーであり得る。該製剤の概論及び／または医薬品製造の概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出され得る。
いくつかの実施形態では、組成物はヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のため、「活性成分」という句は、一般に、本明細書に記載の通りに送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に提供する医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に関するが、当業者には、かかる組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類への投与に適することが理解されよう。様々な動物への投与に適した医薬組成物を提供するために、ヒトへの投与に適した該組成物の修飾が十分に理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者であれば、かかる修飾を、たとえあったとしても単に通常の実験で設計及び／または実施することができる。該医薬組成物の投与が企図される対象としては、ヒト及び／また他の霊長類、哺乳類が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、頬、膣、または移植されたリザーバーの筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される。他の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、皮下または静脈内送達用に製剤化される。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法で調製され得る。概して、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させるステップ、及びその後、必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または複数回投与単位に分割、成形、及び／または包装するステップを含む。
本開示の医薬組成物における活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または状態によって、さらに該組成物が投与される経路によって変化し得る。例として、該組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１％～３０％、５％～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
製剤
本開示のＧＭ－ＣＳＦ分子をコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化され得る。
該１つ以上の賦形剤の機能は、例えば、（１）安定性を高める、（２）細胞のトランスフェクションを増加させる、（３）持続放出または遅延放出（例えば、該ポリヌクレオチドのデポー製剤から）させる、（４）生体内分布を変化させる（例えば、特定の組織または細胞型に該ポリヌクレオチドを標的化する）、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる、及び／または（６）該コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを変化させることである。従来の賦形剤、例えば、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、防腐剤に加えて、本開示の賦形剤としては、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。従って、本開示の製剤は、１つ以上の賦形剤を、各々がともに該ポリヌクレオチドの安定性を増加させ、該ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させ、該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を増加させ、及び／または該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する量で含み得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化され得る。
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法で調製され得る。概して、かかる調製方法は、活性成分を、賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させるステップを含む。
本開示の医薬組成物は、大量に、単一の単位用量として、及び／または単一の単位用量の複数として調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で使用される、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。該活性成分の量は、一般に、対象に投与される該活性成分の用量及び／またはかかる用量の便宜的な部分、例えば、かかる用量の半分または３分の１に等しい。
本開示の医薬組成物における活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または状態によって、さらに該組成物が投与される経路によって変化し得る。例えば、該組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の該活性成分を含み得る。例として、該組成物は、０．１％～１００％、例えば、．５～５０％、１～３０％、５～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。非限定的な例として、該製剤は、１、２、３、４または５個のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つＬＮＰ、例えば、１つのポリヌクレオチドを含む１つのＬＮＰを含む。非限定的な例として、該製剤は、例えば、各ＬＮＰが１つのポリヌクレオチドを含む１、２、３、４または５個のＬＮＰを含む。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰ（例えば、２、３、４、または５個のＬＮＰを含む混合物）は、同じポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰ（例えば、２、３、４、または５個のＬＮＰを含む混合物）は、異なるポリヌクレオチドを含む。
医薬製剤は、さらに、医薬的に許容される賦形剤を含むことができ、これは、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、所望の特定の剤形に適したありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、防腐剤等を含む。医薬組成物の製剤化のための様々な賦形剤及び該組成物を調製するための技術は、当技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６参照）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用をもたらす、または別の方法で該医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用すること等により、物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内であることが企図され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は、増加及び／または減少する。粒径の変化は、炎症等であるがこれに限定されない生物反応に対抗するのに役立つ場合もあれば、哺乳類に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を高める場合もある。
医薬組成物の製造に使用される医薬的に許容される賦形剤としては、不活性希釈剤、界面活性剤及び／または乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、及び／または油が挙げられるがこれらに限定されない。かかる賦形剤は、任意に、本開示の医薬製剤に含まれ得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、コレステロール等の分子を隔離し得るナノ構造でもしくは該ナノ構造とともに投与されるか、該ナノ構造に製剤化されるか、または該ナノ構造とともに送達される。これらのナノ構造の非限定的な例及びこれらのナノ構造を作製する方法は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に記載されている。これらのナノ構造の例示的な構造は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に示されており、コア及び該コアを取り囲むシェルを含むことができる。
均等物及び範囲
当業者は、日常の実験のみを用いて、本明細書に記載の本開示に従う特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本開示の範囲は、下記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、それとは反対の指示がない限り、または文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、１つ以上を意味し得る。群の１つ以上の成員間に「または」を含む請求項または説明は、それとは反対の指示がない限り、または文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、該群の成員の１つ、複数、またはすべてが、所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する場合に満たされていると見なされる。本開示は、該群の正確に１つの成員が所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。本開示は、該群の複数の、またはすべての成員が所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。
「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、さらなる要素またはステップの含有を許容するが、必要とはしないこともまた留意される。「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「～からなる」という用語もまた、従って、包含され開示される。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、特に明記しない限り、または文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲で表される値は、本開示の異なる実施形態において規定される範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲を、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、該範囲の下限の単位の１０分の１までと見なすことができることが理解される。
本明細書で引用されているすべての出典、例えば、参考文献、出版物、データベース、データベース・エントリ、及び技術は、該引用で明示的に述べられていない場合であっても、参照により本出願に組み込まれる。引用された出典と本出願の記述が矛盾する場合は、本出願の記述が優先するものとする。
本開示は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例証のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
Figure 2022552378000118
実施例１：パーキンソン病の治療用の組成物を作製する方法及びかかる組成物を試験する方法
ｍＲＮＡの合成及び製剤化
Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡは、インビトロにて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが媒介する転写を使用して、ウリジンをＮ１－メチルプソイドウリジンで置き換えて合成した。線状化ＤＮＡ鋳型には、先に記載の通り、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及びポリＡテールを組み込む（Ｂａｈｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，１３１６－１３２７）。ｍＲＮＡの翻訳効率を上げるため、最終的なｍＲＮＡをキャップする。精製後、クエン酸緩衝液でｍＲＮＡを希釈することにより、所望のｍＲＮＡ濃度を得た。対照ｍＲＮＡ ＮＴＦＩＸ（非翻訳第ＩＸ因子）を同様の方法で合成した。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、先に記載の方法（Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｅｌｌ １６８，１１１４－１１２５）を修正して調製した。簡潔には、脂質をモル比５０：１０：３８．５：１．５（イオン性脂質：ヘルパー脂質：構造脂質：ＰＥＧ）にてエタノールに溶解し、この脂質混合物を、ｍＲＮＡを含む５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）の酸性化緩衝液と２：１の比（水性：エタノール）にて、同期シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して混合した。製剤を、８％スクロースの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を使用して、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ １００ｋＤａタンジェント流膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を介して透析濾過及び濃縮し、０．２２μｍのフィルターを通し、使用まで凍結した。このＬＮＰの構造及び組成は、先に記載の通りである（Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，１５０９－１５１９）。製剤を、粒径、ＲＮＡ封入、及びエンドトキシンに関して調べた。すべての製剤は、動的光散乱による径が８０～１００ｎｍであり、８０％を超える封入及び１０ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンであることが分かった。以下に記載のすべての実施例において使用されたイオン性脂質は化合物２５であり、使用されたＰＥＧ脂質はＰＥＤ－ＤＭＧであった。
動物、ｍＲＮＡ処理、及びＭＰＴＰ中毒
動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌの施設内倫理委員会によって明記され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの実験動物委員会によって承認されたガイドラインに従って、飼育、維持、及び実験に使用した。マウスの実験では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔｏｃｋ ＃０００６６４）から入手した。順化後、マウスにＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。用量反応試験では、マウスに毎日４日間、０．００００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量で注射した。神経保護実験では、マウスに媒体（ＤＰＢＳ、１０ｍｌ／ｋｇ体重）またはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再構成された１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン塩酸塩（ＭＰＴＰ－ＨＣＬ）のいずれかを注射した。マウスに、各２時間間隔で４回、ＭＰＴＰ－ＨＣｌ（１６ｍｇ遊離塩基／ｋｇ）を皮下注射した。ＭＰＴＰの安全措置は、規定の安全及び取扱プロトコル（Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ，（２００７）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，１４１－１５１）に従った。ＭＰＴＰ中毒後２日目及び７日目にマウスをサクリファイスし、脳を採取し、神経炎症及びニューロン生存率の評価用にそれぞれ処理した。ラットの試験では、７週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＡＳＣＯ）ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに注文した。ラットにＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子をｉ．ｍ．注射した。ナイーブラット試験では、動物に４日間連続して０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかを注射し、５日目にサクリファイスした。ヒトアルファ－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）過剰発現試験では、ラットに４日間連続して定位的注入の直後に注射し、その後サクリファイスまで１日おきに注射した。２８日目、ラットをサクリファイスし、脾臓及び脳を採取及び処理した。
定位的注入
２％イソフルランを含むＯ２でＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを麻酔し、定位固定装置（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）に入れて頭蓋骨を固定した。頭蓋骨を露出させて１～２ｍｍの穴をあけた後、２６ゲージのニードルに取り付けた滅菌ハミルトンシリンジ（モデル８１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を脳に挿入した。ベクターをシリンジポンプにより送達した。α－Ｓｙｎの過剰発現に関しては、ＡＡＶ２／１－ＣＢＡ－ＨｕαＳｙｎ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ（Ｓｔａｎｄａｅｒｔ－５７１３）ベクター（ＡＡＶ－α－Ｓｙｎ）及び対照ＡＡＶ２／１－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ（Ｓｔａｎｄａｅｒｔ－５７１２）ベクター（ＡＡＶ－ＧＦＰ）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ，Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，ＩＡ）から入手した。３μｌのＰＢＳで、ＡＡＶベクターの３×１０９ゲノムコピーを、左半球の黒質上に、前項に対して以下の座標で送達した：ＡＰ、－５．３ｍｍ、ＭＬ、－２．０ｍｍ、ＤＶ、－７．５ｍｍ ＤＶ。
灌流及び免疫組織化学
終末麻酔（Ｆａｔａｌ Ｐｌｕｓ、ペントバルビタール）下、マウス及びラットを心臓穿刺を介してＤＰＢＳに続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＰＢＳで灌流した。ＭＰＴＰの７日後に動物から取り出した全脳を灌流後に採取し、黒質（ＳＮ）のドーパミン作動性ニューロン細胞体及び線条体の終末の生存を評価した。凍結中脳を３０μｍで切片化し、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を免疫染色し（抗ＴＨ、１：２０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ニッスル物質を対比染色した（Ｂｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，９４３５－９４４０）。ミクログリアの反応性を評価するため、ＭＰＴＰの２日後（マウス）またはｄｐｉ２８日（ラット）に脳を採取し、中脳切片（３０μｍ）を、マウスに関してはＭａｃ－１（抗ＣＤ１１ｂ、１：１０００、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）、ラットに関してはＩｂａ－１（１：１０００、ＶＷＲ）を免疫染色した。ドーパミン作動性終末を評価するため、線条体切片（３０μｍ）を抗ＴＨで標識した（１：１０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。抗体標識組織を視覚化するため、切片をストレプトアビジン－ＨＲＰ溶液（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートし、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色原体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下Ｈ２Ｏ２生成システムを使用して発色させた。推定ニューロン及び反応性ミクログリア数は、先に記載の通り、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭＢＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した偏りのない立体的解析によって定量化した（Ｂｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，９４３５－９４４０）。線条体のドーパミン作動性ニューロン終末の密度は、先に記載の通り、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用したデジタル濃度測定によって特定した（Ｂｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，９４３５－９４４０）。
抑制アッセイ
マウスの実験では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞を、ＥａｓｙＳｅｐマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キットＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造業者の指示に従って使用して脾臓から単離した。ラットの実験では、細胞をＥａｓｙＳｅｐラットＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して単離した。単離したラットＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ２５ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１．５×１０７細胞あたり０．７５μｇ／ｍｌの濃度で２０分間染色した。次に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の正の磁気分離用に、ＥａｓｙＳｅｐ ＰＥポジティブセレクションキットＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）の抗ＰＥ磁気ビーズを加えた。単離した細胞集団をフローサイトメトリー分析によって純度について評価したところ、細胞内ＦＯＸＰ３発現により測定して、＞９０％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋及び＞６０％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋であることが特定された。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞画分をラット及びマウスの両未処理群から収集し、抑制アッセイ用のＴキラー（Ｔｒｅｓｐ）集団とした。単離したＴｒｅｓｐをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識した。Ｔｒｅｇを、９６ウェルのＵ底マイクロタイタープレートのウェルに連続２倍希釈し、ＣＦＳＥ染色Ｔｒｅｓｐを濃度５０×１０６細胞／ｍｌでプレーティングし、Ｔｒｅｇ：Ｔｒｅｓｐ比２：１、１：１、１：０．５、１：０．２５、及び１：０．１２５を得た。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をビーズ：細胞比１：１で使用して、マウス細胞の増殖を刺激した。ラット細胞の刺激では、ビーズは本発明者らの実験室でコンジュゲートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０エポキシ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、製造業者のプロトコルに従って、抗ラットＣＤ３及び抗ラットＣＤ２８を使用してコンジュゲートした。得られたＣＤ３：ＣＤ２８比は１：１であり、得られたビーズ：抗体比は、１０００ビーズ：２００μｇ（各抗体１００μｇ）であった。コンジュゲーション後、ビーズを４℃で、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ中、濃度４×１０７ビーズ／ｍｌにて保存した。刺激したＴｒｅｓｐ単独及び未刺激のＴｒｅｓｐを対照としてプレーティングした。抑制アッセイ培養を３７℃にて５％ＣＯ２中で３日間インキュベートし、固定し、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。ＣＦＳＥ蛍光による増殖の程度を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して評価した。
養子移入
Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したドナーマウスから、脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、抑制アッセイに記載したものと同じキットを使用して単離した。レシピエントマウスを記載の通りにＭＰＴＰで中毒させ、１×１０６のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をＭＰＴＰ処理後８～１２時間の間に尾静脈注射を介して養子移入した。ＭＰＴＰ投与後７日目にマウスをサクリファイスし、脳を採取及び処理した。
フローサイトメトリー評価
Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたはタンパク質処理の４日後、ラット及びマウスの全血及び脾臓を収集し、フローサイトメトリー分析によってＴ細胞及びＢ細胞のプロファイルを特定した。全血（５０μｌ）及び脾細胞（１×１０６）を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ８、及びＢ２２０の細胞外マーカーならびにＦＯＸＰ３の細胞内マーカーに対する抗体を使用して蛍光標識した。マウスの血液及び脾細胞を、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ａｎｔｉ－ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ－ａｎｔｉ－ＣＤ２５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した。ラット血液は、ＢＶ－４２１－ａｎｔｉ－ＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ７１０－ａｎｔｉ－ＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ－ａｎｔｉ－ＣＤ２５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢＶ－７８６－ａｎｔｉ－ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＢＵＶ－７３７－ａｎｔｉ－Ｂ２２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。ラット及びマウスの両細胞の細胞内染色では、細胞を４℃にて４５分間、ＦＯＸＰ３／転写因子染色緩衝剤セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して透過処理した。次に、細胞をＡＰＣ－ａｎｔｉ－ＦＯＸＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した後、固定した。サンプルをＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで処理し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。細胞頻度を全リンパ球集団から特定した。
血液化学及び末梢血評価
サクリファイスの時点で、２５０μｌの全血を完全血球算定（ＣＢＣ）レベル用のＫ２ＥＤＴＡ採血チューブまたは血液化学及び代謝物レベル用のヘパリン添加採血チューブに収集した。単離後、ヘパリン添加血液を遠心分離し、血漿を回収した。完全な代謝パネルは、ＶｅｔＳｃａｎ ＶＳ２機器にてＶｅｔＳｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｅｓｔカートリッジ（Ａｂａｘｉｓ）を使用して行った。ＣＢＣ分析では、Ｋ２ＥＤＴＡチューブから収集した全血を直ちにＶｅｔＳｃａｎ ＨＭ５機器でアッセイした。
ＧＭＣＳＦタンパク質の定量化
処理前に、上顎出血を介してマウスから末梢血を採取した。次に、マウスをＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理し、６時間後にマウスから再度採血した。全血を１０，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、血漿を回収した。Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の４日後、マウスをサクリファイスし、脾臓、肝臓、脳、及び鼠径リンパ節等の臓器を採取した。臓器をドライアイスで急速冷凍した。凍結後、５ｍｇの組織をＮＰ４０細胞溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＭＳＦを含むＤＭＳＯを使用して溶解した。サンプルを超音波処理し、遠心分離し、等分した。組織溶解物を使用して、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を行い、全タンパク質濃度を特定した。血漿及び組織の単離後、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルをマウスＧＭ－ＣＳＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造業者のプロトコルを用いて特定した。
サイトカインの評価
α－ｓｙｎの過剰発現及びＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の前に、ラットを上顎出血を介して採血し、末梢血をベースラインとして採集した。採集後、血液を１０，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、血漿を回収して－８０℃で保存した。２８日後、サクリファイスの時点で血液及び血漿を再度採集した。採集後、処理前後の血漿中のサイトカインのレベルをラットサイトカインアレイパネルＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造業者のプロトコルに従って評価した。
ＲＮＡの単離及びトランスクリプトミクス
Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ投与の４日後、マウスをサクリファイスし、脾臓を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐマウスＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造業者の指示通りに使用して単離した。単離した細胞の純度をフローサイトメトリー分析によって評価したところ、すべての単離に関して８８％超であると特定された。細胞の単離後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲｎａｓｅフリー条件下で全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、単離したＲＮＡからＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して生成し、マウスＴヘルパー細胞分化用のＲＴ２ ＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）に対するプライマー混合物を使用して予備増幅を行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌｐｌｅｘ ＥＰ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で行った。データ分析は、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙのウェブベースのデータ分析ソフトウェアバージョン３．５（Ｑｉａｇｅｎ）及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して完了した。ＩＰＡの要件に従って、少なくとも２倍調節異常であることが判明した遺伝子のみを使用した。
統計解析
すべての試験で、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して分析した。すべての値は平均±ＳＥＭとして表されている。群間の平均の差は、アッセイに応じて、一元配置分散分析とそれに続くテューキーまたはニューマン・コイルス事後検定を使用して分析した。すべての試験に関して有意差をｐ＜０．０５のレベルで選択した。Ｔｒｅｇの機能及び用量依存性の測定は、線形回帰分析によってＴｒｅｇ：Ｔｒｅｓｐ比またはＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ用量のいずれかの関数として評価した。Ｔｒｅｇの抑制機能の差は、傾きまたは切片の群間の差によって特定した。すべての直線の勾配は、有意にゼロではないと特定された。
実施例２：ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの注射により、血漿ＧＭ－ＣＳＦ、脾臓のサイズ及び細胞数、ならびにＷＢＣ数が増加した
本実施例は、ＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（表４Ａに示す配列を含むＭｍ．ＧＭＣＳＦ構築物）をマウスに投与することの効果を記載する。Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを合成し、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化し、実施例１に記載の通りに６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。
血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルを実施例１に記載の通り、複数の漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたは非特異的ｍＲＮＡ対照（ＮＴＦＩＸ）による処理の前（前）または６時間後（後）の末梢血中で定量化した（図１Ａ）。図１Ａに示す通り、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡは、０．０１、０．０５、及び０．１ｍｇ／ｋｇで処理した後６時間以内に血漿中に検出可能なＧＭ－ＣＳＦタンパク質を誘導する。０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、レベルが１８８ｐｇ／ｍｌから１４８７ｐｇ／ｍｌに増加し、０．０５ｍｇ／ｋｇでの処理により、レベルは７３ｐｇ／ｍｌから６２１５ｐｇ／ｍｌに増加し、０．１ｍｇ／ｋｇでの処理により、レベルは１２ｐｇ／ｍｌから８２１１ｐｇ／ｍｌに増加した。しかしながら、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルの上昇は、低用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したマウス、または翻訳不可能なｍＲＮＡ対照（ＮＴＦＩＸ）で処理したマウスの血漿では検出されなかった。また、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したマウスの脾臓、肝臓、脳、または鼠径リンパ節でＧＭ－ＣＳＦタンパク質の増加は検出されず、すべての処理群に関してすべての組織レベルが７１ｐｇ／ｍｌ未満のままであった。未処理の動物から分離された組織では、１０～５０ｐｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦタンパク質の範囲であり、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理と差がなかった。
複数の漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したマウスの脾臓を画像化した（図１Ｂ）。脾臓重量を、最初の処理から４日後に定量化し、臓器重量の線形回帰分析を行った。漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、脾腫がもたらされ、線形回帰分析により、これが用量依存的であることが分かった（Ｒ２＝０．４６、Ｐ＝０．０００９）（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
処理後の全血中の白血球（ＷＢＣ）、単球、好中球、及びリンパ球の絶対数を測定した。脾臓のサイズの増加とともに、末梢血白血球（ＷＢＣ）の平行した増加が認められた（図１Ｄ～１Ｇ）。絶対血球数は、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与量の増加と平行して、ＷＢＣ（図１Ｄ）、単球（図１Ｅ）及び好中球（図１Ｆ）の増加を示したが、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で増加したのみであった。リンパ球集団はわずかに影響を受けたのみであった（図１Ｇ）。
処理したマウスから単離した全血の完全な代謝パネルを実施例１に記載の通りに行った。処理後のアルカリホスファターゼ、アルブミン及びアミラーゼの血液化学プロファイルを図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊにそれぞれ示す。全体として、クレアチニン、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルコース、尿素窒素、ナトリウム、カルシウム、グロブリン、及びリンのレベルが処理によって変化しなかったため、包括的代謝パネルは、処理によって変化しなかったが、アルカリホスファターゼ（図１Ｈ）、アルブミン（図１Ｉ）、及びアミラーゼ（図１Ｊ）は、０．０１及び／または０．１ｍｇ／ｋｇ処理動物で減少した。
総合すれば、これらの結果は、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるマウスの処理が、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルの上昇、脾臓のサイズの増加、ならびに完全血球算定及び末梢血化学プロファイルの変化をもたらしたことを示す。
実施例３：ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆｍ ＲＮＡはＴｒｅｇを増加させ、１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）中毒モデルで神経保護をもたらした
本実施例は、ＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（表４Ａに示す配列を含むＭｍ．ＧＭＣＳＦ構築物）をＣ５７ＢＬ／６マウス及びＭＰＴＰ中毒Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与することの効果を記載する。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質でのマウスの処理をコンパレータとして使用した。ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの合成及び製剤化、マウスの処理及びＭＰＴＰ中毒、末梢血のフローサイトメトリー評価、抑制アッセイ、ならびに灌流及び免疫組織化学を実施例１に記載の通りに行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの処理後の末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度をフローサイトメトリーで特定した。０～０．０１ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでのマウスの処理では、末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に変化は示されなかった（図２Ａ）。しかしながら、０．１ｍｇ／ｋｇでの処理により、未処理の動物で認められたものよりＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が減少した。対照的に、フローサイトメトリー分析により、線形回帰によって明白なＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度の用量依存的な増加が示された（Ｒ２＝０．７６、Ｐ＝０．０２）（図２Ｂ）。末梢血中のＴｒｅｇ頻度は、漸増用量のＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後、２．８±０．４から１４．３±０．９８％に増加した。同様に、ｍＲＮＡとタンパク質処理を比較すると、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与により、対照及びＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスと比較して、末梢血のリンパ球集団内のＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の頻度が減少することが示された（図２Ｃ～２Ｆ）。ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の頻度が３．５±０．４９から１４．３±０．９９％に増加した（図２Ｆ）。０．００１及び０．０１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡまたは０．１ｍｇ／ｋｇの組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理によってもまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞の頻度が８．２±１．６、９．２±２．０、及び４．９±０．７７％増加した。全体として、これらの結果は、漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞がマウスで増加することを示している。
次に、処理動物及び未処理動物から単離されたＴｒｅｇがＴキラー細胞（Ｔｒｅｓｐ）を阻害する能力を、実施例１に記載の抑制アッセイにより評価した。図２Ｇに示す通り、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理動物から単離された脾臓Ｔｒｅｇは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｒｅｓｐの増殖を抑制した。同様に、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７，９２７－９３８、Ｑｕａｈ ＆ Ｐａｒｉｓｈ（２０１０）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．も参照されたい。線形回帰分析を使用した上昇の特定により、非ｍＲＮＡ処理対照からのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇと比較して、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで０．０１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．００７）または０．１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０４）にて処理したマウスから単離されたＴｒｅｇの抑制能力の増強が示されたが、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理動物からのＴｒｅｇと比較した場合には抑制活性に有意な差は認められなかった。勾配の上昇は、Ｔｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比が低いほど抑制能力が高いことを示した。
認められた上記の％Ｔｒｅｇの変化に加えて、０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇの用量でのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡにより処理したマウスで脾臓のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋標準型樹状細胞（ｃＤＣ）の頻度の増加が認められた（図３Ａ及び３Ｂ）。ＣＤ１１ｂ及びＣＤ８ａの発現を使用して、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによって拡大されたｃＤＣサブセットをさらに特徴づけた。０．００１～０．１ｍｇ／ｋｇの用量でＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡにより処理した場合に両方のサブセットが同程度まで拡大した（図３Ｃ及び３Ｄ）。０．１ｍｇ／ｋｇの製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した群は、ＣＤ１１ｂ＋Ｃｄ１１ｃ－骨髄集団の拡大を示した（図３Ｅ及び３Ｆ）。ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡが拡大されたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞集団の成熟状態を変化させるかどうかを判断するため、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びクラスＩＩ（ＩＡ～ＩＥ）等の成熟マーカーの発現をフローサイトメトリーで評価した。クラスＩＩ（ＩＡ～ＩＥ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、０．０１または０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した後に減少した（図３Ｇ）。
神経保護活性に処理が与える影響を特定するため、マウスをＧＭ－ＣＳＦタンパク質またはＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかで４日間前処理し、その後ＭＰＴＰ中毒を行った。凍結中脳の免疫染色切片の顕微鏡写真を評価し、マウスの黒質（ＳＮ）内のドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの生存及び線条体（ＳＴＲ）内のＴＨ＋細胞終末を評価した。ＭＰＴＰ中毒後、生存黒質ドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの総数を、それらの線条体投射とともに評価した（図４Ａ）。生存ドーパミン作動性ニューロンの数は、未処理の動物と比較して、ＭＰＴＰで処理した場合に１０７７１±３５６から４８９３±４８９に減少した（図４Ｂ）。ＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理により、ＭＰＴＰ単独と比較して、ニューロン生存率が１３％（６２２６±８６６）増加した。漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＭＰＴＰ単独と比較して、ドーパミン作動性ニューロン生存率が２１％（７１６２±３２７）、３４％（８５７６±４９４）、及び３６％（８７５８±２９１）増加した。すべてのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ用量で、ＭＰＴＰ中毒単独よりも高いＴＨ＋ニューロン数が得られた。特に、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理は、非病変対照と有意な差がなく、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの神経保護的効果が裏付けられた。非ドーパミン作動性（ＴＨ－／ニッスル＋）ニューロンの数は、それらにＭＰＴＰ感受性がないため、処理に関係なく変化しなかった（Ｏｔｔｏ ＆ Ｕｎｓｉｃｋｅｒ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３４，３８２－３９３、Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ（２００７）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，１４１－１５１）。しかしながら、線条体終末は、いずれの処理によってもスペアされず、固有のＭＰＴＰ毒性が示された（図４Ｃ）。
次に、ＭＰＴＰが誘導する炎症反応の変化を評価した。ＭＰＴＰ投与の２日後、炎症及びニューロン死のピーク時に、脳を採取し、Ｍａｃ－１発現及びアメーバ様形態によって特定される反応性ミクログリアを評価した（図４Ｄ）（Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ－Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １５６，５０－６１も参照されたい）。ＭＰＴＰは、反応性ミクログリアの数を増やし、カウントがＰＢＳ対照マウスの０細胞／ｍｍ２からＭＰＴＰ中毒後の１０４±５細胞／ｍｍ２まで上昇した（図４Ｅ）。漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ）での処理により、反応性ミクログリア数がそれぞれ、８５±４、９２±５、８５±１０細胞／ｍｍ２まで減少した。０．００１及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ミクログリア反応の統計的に有意な減弱がもたらされた。組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理では、ミクログリア細胞数は９８±７細胞／ｍｍ２まで減少した。全体として、これらの結果は、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理が、マウスにおいてＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱をもたらしたことを示す。
実施例４：ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡはＣＤ４＋Ｔ細胞を形質転換し、骨髄細胞集団を誘導した
本実施例は、実施例３に記載のＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（示される配列を含むＭｍ．ＧＭＣＳＦ構築物）処理によってもたらされる神経保護及び抗炎症効果を記載する。
Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理ドナー由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を単離し、実施例１に記載の通りにＭＰＴＰ中毒レシピエントマウスに養子移入した。７日後、腹側中脳及び線条体を、ＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロンの生存について評価した（図５Ａ）。ＭＰＴＰ中毒により、ニューロン数がＰＢＳ対照の７０６５±８７８から４０４２±５４７に減少した（図５Ｂ）。０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したマウスに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の養子移入により、ＭＰＴＰ中毒単独と比較して、ＴＨ＋／ニッスル＋ニューロンの生存が６０９８±１１１５に増加した。０．０１ｍｇ／ｋｇで処理したマウスから単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、ＭＰＴＰ病変を超えてニューロン生存率レベルを高めることはなかった。線条体終末の濃度測定分析は、養子移入後に変化しなかった（図５Ｃ）。
次に、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡがＣＤ４＋Ｔ細胞集団全体のトランスクリプトーム表現型を変化させる能力を評価した。この目的のために、動物を、ＰＢＳまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかで処理し、得られたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を単離し、実施例１に記載の通りにトランスクリプトームの変化について分析した。ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理により、様々なＴ細胞集団と関連する遺伝子の上方制御及び下方制御の両方がもたらされた（図６Ａ～６Ｂ）。非ｍＲＮＡ処理対照と比較して、２～５倍上方制御された遺伝子は、Ｃｃｒ４、Ｉｌ１３、Ｃｓｆ２、Ｉｌ４、Ｃａｃｎａ１ｆ、Ｈｏｐｘ、Ｐｐａｒｇ、Ｆｏｓｌ１、Ｇａｔａ４、Ｈａｖｃｒ２、Ｔｂｘ２１、Ｆａｓｌ、Ｐｅｒｐ、Ｉｌ１３ｒａ１、Ｉｌ１７ａ、Ｉｆｎｇ、Ｃｈｄ７、及びＩｌ１２ｒｂ２を含んでいた。５倍を超えて上方制御された遺伝子は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ１８、Ａｓｂ２、Ｉｇｓｆ６、Ｉｌ１ｒ２、Ｃｅｂｐｂ、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｃｃｒ６、及びＩｋｚｆｚを含み、２倍を超えて下方制御された遺伝子は、Ｚｅｂ１、Ｔｒｐ５３ｉｎｐ１、Ｒｅｌ、Ｎｒ４ａ３、Ｊａｋ１、Ｓｏｃｓ１、及びＲｕｎｘ３であった。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して得られた遺伝子発現のネットワークマッピングにより、２つの主要なネットワーク：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（図６Ｂ）、及びＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（図６Ｃ）の調節異常が示された。これら２つのネットワーク内の遺伝子解析は、Ｔ細胞の分化、リンパ球形成、発達、及び量に関連する機能要素の変化に関連していた。この分析は、いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによる処理が、Ｔ細胞の分化及びリンパ球数に正の影響を与えることを示唆している。炎症性遺伝子及び抗炎症性遺伝子の両方が上方制御されたが、多くの調節がＴｒｅｇ及びＴｈ２エフェクターの誘導及び安定化に関連する遺伝子に関与しており、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞表現型全体で炎症性から抗炎症性への潜在的なシフトが示唆された。
実施例５：ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理は、パーキンソン病のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モデルで神経保護及び抗炎症反応を引き起こした
本実施例は、パーキンソン病のアルファ－ｓｙｎモデルでの神経保護及び抗炎症反応を記載する。
ナイーブラットを、用量０．０１もしくは０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化ラットＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（表４に示す配列を含むＲｎ．ＧＭＣＳＦ構築物）または用量０．１ｍｇ／ｋｇのラット組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質で４日間処理した。両方のｍＲＮＡ用量により、マウスで同じ脾腫が認められた（図７Ａ）。末梢血中のＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析では、ＣＤ３のパーセンテージにはすべての処理で変化は示されず（図７Ｂ）、ＣＤ４パーセンテージの低下は０．１ｍｇ／ｋｇのＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理で示され（図７Ｃ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージには両方のｍＲＮＡ処理で増加が示された（図７Ｄ）。Ｔｒｅｇ頻度は、未処理の動物における４．１±０．２６％から０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理動物で１２±１．５％、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理動物で２０±２．４％、及びＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理動物で８．６±０．６６％まで増加し、マウスでの観察と類似した。各処理群から濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を次に、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｒｅｓｐの増殖を阻害するための抑制機能の変化について評価した（図７Ｅ）。両用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＰＢＳ対照またはＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇのいずれかと比較して抑制機能が増強された（Ｒ２≧０．８７、Ｐ＜０．０１）。
ＬＮＰ製剤化ラットＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理は、健康なナイーブ動物でＴｒｅｇ頻度及び機能を選択的に増加させる能力があるため、次に、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの効果を、ヒトα－ｓｙｎ過剰発現を利用したパーキンソン病モデルで評価した。ラットに、ＰＢＳ（Ｓｈａｍ）、ＡＡＶ－ＧＦＰ（ベクター対照）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎの片側定位的注入を施し、続いてＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを最初の４日間及びその後１日おきに筋肉内投与した。２８日後、末梢血中のＴ細胞レベルを評価した（図７Ｆ～７Ｉ）。ＣＤ３＋細胞のレベルは、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを投与した動物では治療前のベースラインから減少し、他の処理では有意な変化はなかった（図７Ｆ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のレベルもまた、すべての処理で有意な影響を受けなかったが、ｍＲＮＡ処理で軽度の減少傾向が認められた（図７Ｇ及び７Ｈ）。マウスでの観察を要約すると、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理により、末梢血のリンパ球集団内のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ頻度が有意に増加した（図７Ｉ）。α－ｓｙｎ過剰発現動物での０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理により、Ｔｒｅｇ頻度が２．５からそれぞれ、４．０及び７．４％に増加した。
アルファ－ｓｙｎ過剰発現ラットでのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの神経保護能力を評価した。ＡＡＶ－α－ｓｙｎ感染により、ＳｈａｍまたはＡＡＶ－ＧＦＰ処理動物と比較して、ＴＨ発現の喪失によって特定されるドーパミン作動性ニューロンの減少がもたらされた（図８Ａ）。α－ｓｙｎの過剰発現により、ニューロン数が著しく４９．３％減少した。しかしながら、ＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、用量にかかわらずニューロンの５７％をスペアすることによりニューロンの損失を取り返し（２８．２％及び２８．８％の損失）、ひいては、いくつかの実施形態では、神経保護の可能性を示した（図８Ｂ）。同様に、０．０１及び０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理によってもまた、ドーパミン作動性終末の生存が増加し、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ＋ＰＢＳ処理と比較して、それぞれ、１３．７％及び２７．９％の保護レベルをもたらした（図８Ｃ）。黒質内のＩｂａ－１＋アメーバ様ミクログリアとしての反応性ミクログリアのレベルも評価した（図８Ｄ）。ＡＡＶ－ベクターの投与では、反応性ミクログリア比はＳｈａｍ注射より上昇しなかったが、α－ｓｙｎの過剰発現により、反応性ミクログリアは３倍に増加した（図８Ｅ）。０．０１または０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、α－ｓｙｎに関連するミクログリア反応が有意に減弱し、倍率比はそれぞれ、１．９６±０．２２及び２．２８±０．０９に減少した。ミクログリア反応とともに、血漿中のサイトカインタンパク質レベルも同様にＡＡＶ－α－ｓｙｎ過剰発現から２８日後に評価し、疾患に関連する炎症反応の変化を特定した（図９Ａ～９Ｄ）。０．０１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＣＩＮＣ－１、ＣＩＮＣ－２αβ、ＣＩＮＣ－３、ＣＮＴＦ、ＩＰ－１０、ＬＩＸ、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、及びＴＮＦαが減少した（ｐ＝０．０９）。０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＣＩＮＣ－１、ＣＩＮＣ－２αβ、ＣＩＮＣ－３、ＣＮＴＦ、ＩＰ－１０、ＬＩＸ、ＭＩＰ－１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、及びＴＮＦαが、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ過剰発現単独で認められたレベルに対して減少した。両処理用量で増加することが見出されたタンパク質は、ＣＸＣＬ７、ＴＩＭＰ－１、ＩＦＮγ、及びＩＬ－１０であった。ＬＩＸのレベルは、ＡＡＶ－α－ｓｙｎ過剰発現単独から下方制御された（図９Ｃ）。
総合すれば、これらの結果は、パーキンソン病のアルファ－ｓｙｎモデルでのＬＮＰ製剤化ラットＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理が、神経保護活性、ニューロン生存率の向上及びミクログリア関連炎症の減弱をもたらしたことを示す。
実施例６：ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの注射により、血漿ＧＭ－ＣＳＦ、脾臓サイズ、及びＷＢＣ数が増加した
本実施例は、マウスアルブミン（ＭＳＡ）にコンジュゲートしたＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡとともに製剤化したＬＮＰ（化合物２５を含む）（表４Ａに示す配列を含むＭＳＡ－ｍｍＧＭＣＳＦ構築物）をマウスに投与することの効果を記載する。ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡを合成し、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化し、マウスに用量０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇで０日目に筋肉内投与した。Ｒｍ－ＧＭ－ＣＳＦタンパク質対照をマウスに１日１回５日間、－４、－３、－２、－１及び０日目に腹腔内投与した。末梢血評価、タンパク質定量化、及び免疫組織化学試験のため、マウスを処理後１、３、及び５日目にサクリファイスした。
血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルを実施例１に記載の通り、複数の漸増用量のＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質対照、または非特異的ｍＲＮＡ対照（ＮＴＦＩＸ）による処理の前（前）ならびに６時間ならびに１、３、及び５日後（後）の末梢血中で定量化した（図１０）。図１０に示す通り、ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡは、０．００１、０．０１、及び０．１ｍｇ／ｋｇで処理した後６時間以内に血漿中に検出可能なＧＭ－ＣＳＦタンパク質を誘導した。すべての用量（０．００１、０．０１、及び０．１ｍｇ／ｋｇ）でのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、処理後６時間及び１日の両方での０．１ｍｇ／ｋｇのＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理に対して有意に高いレベルの血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質がもたらされた。ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ及びＧＭ－ＣＳＦタンパク質の用量（すなわち、０．１ｍｇ／ｋｇ）が投与された場合、ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理した対象でのＧＭ－ＣＳＦタンパク質で処理した対象に対するタンパク質レベルの増加は、投与後５日目まで認められた。最大の血漿ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルは、０．００１、０．０１、及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量のＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理後約１日で認められた。
最初の処理から１、３、及び５日後の脾臓重量を特定するため、複数の漸増用量のＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡで処理したマウスから採取した脾臓を測定した。最高用量の０．１ｍｇ／ｋｇのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡにより、脾臓重量が最大に増加し、最大の脾腫は処理後約３日で生じた（図１１）。対応する用量のＧＭ－ＣＳＦタンパク質では、同等の脾腫を生じなかった。
処理後の全血中の白血球（ＷＢＣ）、単球、好中球、及びリンパ球の絶対数を測定した。脾臓のサイズの増加とともに、末梢血白血球（ＷＢＣ）の平行した増加が認められた（図１２）。絶対血球数により、ＷＢＣ、単球、好中球及びリンパ球の最大の増加が処理後約３日で生じたことが明らかになった。
総合すれば、これらの結果は、ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡによるマウスの処理が、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質レベルの上昇、脾臓のサイズの増加、及び完全血球算定の変化をもたらしたことを示す。
実施例７：ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡはＴｒｅｇを増加させ、１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）中毒モデルで神経保護をもたらした
本実施例は、ＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（表４Ａに示す配列を含むＭＳＡ－ｍｍＧＭＣＳＦ構築物）をマウスまたはＭＰＴＰ中毒マウスに投与することの効果を記載する。天然の組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質でのマウスの処理をコンパレータとして使用した。マウスの処理及びＭＰＴＰ中毒、末梢血のフローサイトメトリー評価、抑制アッセイ、ならびに灌流及び免疫組織化学を実施例１に記載の通りに行った。
マウスの処理後の末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度をフローサイトメトリーで特定した。フローサイトメトリー分析により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の頻度が、ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与でのマウス処理後に用量依存的に増加することが示された。末梢血中のＴｒｅｇ頻度の最大の増加は、処理後約５日で認められた。同様に、ｍＲＮＡをタンパク質処理と比較すると、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与により、対照及びＧＭ－ＣＳＦタンパク質処理マウスと比較して、末梢血のリンパ球集団内のＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の頻度が減少することが示された（図１３）。全体として、これらの結果は、漸増用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞がマウスで増加し、５日目でピークに達することを示している。
次に、処理動物及び未処理動物から単離されたＴｒｅｇがＴキラー細胞（Ｔｒｅｓｐ）を阻害する能力を、実施例１に記載の抑制アッセイにより評価した。図１４に示す通り、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理動物から単離された脾臓Ｔｒｅｇは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｒｅｓｐの増殖を抑制した。Ｔｒｅｇの最大阻害能力は、処理後約３日で生じた。最大のＴｒｅｇ活性の時点を、ＭＰＴＰ中毒の点として特徴づけた。
神経保護活性に処理が与える影響を特定するため、マウスをＧＭ－ＣＳＦタンパク質またはＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡのいずれかで４日間前処理し、その後ＭＰＴＰ中毒を行った。凍結中脳の免疫染色切片の顕微鏡写真を評価し、マウスの黒質（ＳＮ）内のドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの生存及び線条体（ＳＴＲ）内のＴＨ＋細胞終末を評価した。ＭＰＴＰ中毒後、例えば、処理から３日後、生存黒質ドーパミン作動性（ＴＨ＋／ニッスル＋）ニューロンの総数を、それらの線条体投射とともに評価した（図１５）。ＭＳＡコンジュゲートＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理により、ＭＰＴＰ単独または翻訳不可能な対照と比較して、ニューロン生存率が増加した。漸増用量のＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＭＰＴＰ単独と比較して、対応する増加がドーパミン作動性ニューロン生存率にもたらされた。すべてのＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ用量で、ＭＰＴＰ中毒単独よりも高いＴＨ＋ニューロン数が得られた。特に、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理は、非病変対照と有意な差がなく、Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの神経保護的効果が裏付けられた。さらに、ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡは、４℃にて少なくとも６か月間はこの効果を損なうことなく保存することが可能であった。０．０１または０．０３ｍｇ／ｋｇのＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの投与ではＭＰＴＰ単独と同様の線条体ＴＨ密度値を得たが、ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの最高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）での投与では、非病変対照と同等の線条体ＴＨ密度が得られ、高用量ではある程度の保護能力が示された（図１６）。さらに、この神経保護活性は、ＧＭ－ＣＳＦタンパク質単独の投与では０．１ｍｇ／ｋｇの用量であっても認められなかった。（図１８及び１９）。
次に、ＭＰＴＰが誘導する炎症反応の変化を評価した。ＭＰＴＰ投与の２日後、炎症及びニューロン死のピーク時に、脳を採取し、Ｍａｃ－１発現及びアメーバ様形態によって特定される反応性ミクログリアを評価した（図１７）。ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ミクログリア反応の統計的に有意な減弱がもたらされ、組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質での処理よりも大幅な減少が生じた。全体として、これらの結果は、ＬＮＰ製剤化ＭＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理が、マウスにおいてＭＰＴＰが誘導する黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化の減弱をもたらしたことを示す。
実施例８：パーキンソン病のアルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）モデルにおけるＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理の試験
本実施例は、ＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆのパーキンソン病のアルファ－ｓｙｎモデルでの効果を記載する。
ラットに、ＰＢＳ（Ｓｈａｍ）、ＡＡＶ－ＧＦＰ（ベクター対照）、またはＡＡＶ－α－ｓｙｎの片側定位的注入を施し、続いてＬＮＰ（化合物２５を含む）製剤化ラットアルブミン（ＲＳＡ）コンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ（表４Ａに示す配列を含むＲＳＡ－ｒｎＧＭＣＳＦ構築物）をＡＡＶの投与時及びその後７日おきに０．１及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内投与した。対照試験は、翻訳不可能なＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡの筋肉内投与を用量０．３ｍｇ／ｋｇで、またはラット組み換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質の腹腔内投与を用量０．１ｍｇ／ｋｇで行った。末梢Ｔ細胞及びＢ細胞集団を評価するため、７、１４、２１、及び２８日目にマウスから採血した。２８日目にマウスをサクリファイスし、脾臓及び脳を採取した。
脾臓のＴ細胞集団のフローサイトメトリー分析により、すべての処理でＣＤ３のパーセンテージにもＣＤ４のパーセンテージにも有意な変化がないことが示されたが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージ及びＣＤ８＋のパーセンテージの増加が両方のｍＲＮＡ処理で、ＣＤ４５Ｒ＋パーセンテージのわずかな増加とともに認められた（図２１及び２２）。
各処理群から濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｒｅｓｐの増殖を阻害するための抑制機能の変化について評価した（図２０）。両用量のＬＮＰ製剤化Ｇｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡでの処理により、ＰＢＳ対照と比較して抑制機能が増強された。
Ｔ細胞レベルを７、１４、２１、及び２８日目の末梢血で評価した（図２３～２７）。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ ＣＤ８＋、及びＣＤ４５Ｒ＋細胞のレベルを評価した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ頻度に軽度の増加傾向が、漸増用量のＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理で認められた（図２５）。
これらの結果は、パーキンソン病のアルファ－ｓｙｎモデルにおいて、ＬＮＰ製剤化ＲＳＡコンジュゲートＧｍ－ｃｓｆ ｍＲＮＡ処理により、Ｔｒｅｇ活性が増加したことを示す。

Claims (20)

  1. 対象におけるパーキンソン病の治療で使用するヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、前記ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドが、配列番号１、配列番号８、または配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、ＬＮＰ組成物。
  2. 対象におけるパーキンソン病の治療方法であって、前記対象に対して、ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の有効量を投与することを含む方法であって、前記ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドが、配列番号１、配列番号８、または配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、方法。
  3. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  4. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号３に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  5. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号１８８に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  6. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１６に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  7. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２２１に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  8. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２１９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  9. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号２２４に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または請求項２に記載の方法。
  10. 前記ヒトＧＭ－ＣＳＦポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学的修飾を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  11. 前記化学的修飾が、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  12. 前記化学的修飾が、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含む、請求項１１に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  13. 前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン性脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えば、ＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  14. 前記イオン性脂質が、化合物１８を含む、請求項１３に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  15. 前記イオン性脂質が、化合物２５を含む、請求項１３に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  16. 前記ＰＥＧ－脂質が、ＰＥＧ ＤＭＧである、請求項１３に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  17. ＬＮＰの投与により、サンプル（例えば、対象からのサンプル）における、例えば、実施例２～８のいずれか１つに記載のアッセイによって特定されるＴ制御性細胞のレベル及び／または活性が増加する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物、または方法。
  18. 前記ＬＮＰの投与により、サンプル（例えば、対象からのサンプル）におけるＴ制御性細胞のレベルが少なくとも約５％増加する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物または方法。
  19. 組織中のＧＭ－ＣＳＦのレベルが、参照、例えば、適切な対照と比較して増加しない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物または方法。
  20. 黒質線条体神経変性及びミクログリア活性化が、参照、例えば、適切な対照と比較して低下する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の使用のためのＬＮＰ組成物または方法。
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