CN113913392A - 基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其应用 - Google Patents

基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种构建重组人巨细胞病毒的方法及其应用。本发明构建重组人巨细胞病毒的方法利用Crispr‑Cas9技术快速、高特异性的构建了HCMV编码miRNA缺失株，所得HCMV编码miRNA缺失株在编码hcmv‑miR‑US33as‑5p部位发生基因突变，而在其他部位序列无改变，可在易感染细胞中传代。本发明还利用构建的HCMV编码miRNA缺失株，证实了IFNAR1是hcmv‑miR‑US33as‑5p的靶标，抑制该miRNA分子的表达可导致宿主细胞IFNAR1的恢复性上调。针对hcmv‑miR‑US33as‑5p的抑制物有作为抗疱疹病毒感染防治候选药物中应用的价值。

Description

基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其应用。
背景技术
巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)属于β疱疹病毒家族，传播方式包括输血传播、母婴传播及性传播等，人群感染率极高。研究发现CMV编码的微小RNA(microRNA,miRNA)可能作为一种非抗原的免疫调节手段，在病毒的潜伏过程中发挥了重要作用。目前，miRBase数据库记录的由病毒编码的miRNA共有230多种，绝大多数为疱疹病毒编码。已鉴定和发现的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)编码的成熟miRNA共有26种，鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)编码的成熟miRNA共有29种。CMV编码的miRNA功能包括：miR-US33-5p靶向宿主表达的STX3(Syntaxin3)蛋白，进而抑制病毒DNA的合成；miR-US25-2-3p靶向一种重要的RNA解旋酶eIF4A1(eukaryotictranslation initiationfactor 4A1)因子，从而抑制CAP依赖途径的翻译；miR-US25-1和miR-US25-2靶向抑制宿主细胞的多个转录因子，同时还可靶向抑制病毒自身IE72和IE65的表达等。虽然这些miRNA在体内感染中的表达时相和是否发挥作用尚不清楚，但这提示表达miRNA来进行非抗原性基因表达调控可能是一种疱疹病毒在维持自身长期潜伏所采用的共同策略。
目前已有研究表明HCMV可在体内终身潜伏的原因在于该病毒采用的多种免疫逃逸方式，特别是对宿主分泌的干扰素功能的抑制。其不仅可干扰宿主针对HCMV的杀灭过程，更可能干扰宿主对其他感染的反应，甚至有流行病学资料指出，HCMV感染者在接种免疫应答后的抗体产生反应与未感染者也存在着一定差别，这可能与HCMV在潜伏中发生的免疫逃逸机制有关。IFN是病毒诱导的细胞因子，在病毒感染后与IFNAR1结合，激活Jak-STAT1信号通路，最终释放ISGs，发挥免疫调节和抗病毒功能。在众多ISGs中，不同的ISG发挥着各自不同的作用来抵抗病毒入侵。如Mx1基因编码GTP代谢蛋白，在细胞抗病毒免疫应答中，拮抗DNA或RNA病毒的复制。BST2是干扰素诱导的抗病毒宿主限制因子，可以直接限制感染细胞初始病毒颗粒的释放，这些病毒颗粒可立即被细胞内吞降解，有效地抑制了病毒的释放复制。ISG20是IFN信号通路下游的关键调节因子，可直接或间接的调控多达100个基因参与抗病毒的免疫调节作用。
以上研究中已发现CMV乃至疱疹病毒编码的miRNA可能在病毒潜伏方面发挥重要的作用，因而研究CMV的miRNA功能非常重要。但简单的通过miRNA的模拟物或抑制物无法长期稳定的对HCMV编码miRNA进行调控。而传统的利用人工染色体(BAC)技术对CMV技术改造病毒面临着更多的困难，例如技术和设备要求高，时间周期长，成功率低等，亟需能快速、高特异性的构建△miRNA-HCMV病毒株的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、高特异性的构建研究所需的△miRNA-HCMV病毒株(HCMV编码miRNA缺失株)。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种构建重组人巨细胞病毒的方法，包括利用CRISPR/Cas9方法敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，得到所述miRNA表达量低于所述目的人巨细胞病毒的重组病毒。
上述方法中，所述miRNA分子能抑制宿主IFNAR1表达，所述miRNA分子的核苷酸序列是序列表中序列1。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9方法利用CRISPR/Cas9系统敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，所述CRISPR/Cas9系统包括表达sgRNA的载体，所述sgRNA的编码序列为序列表中序列2第1-19位序列和/或序列表中序列2第1-19位序列的反向互补序列。
为了解决上述技术问题，本发明还提供上述的方法在鉴定人巨细胞病毒miRNA功能中的应用，以及在制备鉴定人巨细胞病毒miRNA功能的产品(试剂或试剂盒)中的应用。
由上述的方法构建的重组人巨细胞病毒也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供上述的重组人巨细胞病毒在鉴定人巨细胞病毒miRNA功能中的应用，以及在制备鉴定人巨细胞病毒miRNA功能的产品(试剂或试剂盒)中的应用。
本发明还提供了抑制所述miRNA分子的活性和/或降低所述miRNA分子的表达量和/或降低所述miRNA分子的含量的物质在制备抗病毒药物中的应用，所述miRNA分子能抑制宿主IFNAR1表达，所述miRNA分子的核苷酸序列是序列表中序列1。
上述应用中，所述抗病毒药物为抗疱疹病毒的药物，具体为抗巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的药物，更具体为抗人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的药物。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种构建△miRNA-HCMV病毒株的方法，包括敲除目的病毒中编码所述miRNA分子的DNA分子，得到所述miRNA分子表达量低于所述目的病毒的重组病毒。
上述方法中，所述敲除目的病毒中编码所述miRNA分子的DNA分子可为通过CRISPR/Cas9方法实现。
所述CRISPR/Cas9方法利用CRISPR/Cas9系统敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，所述CRISPR/Cas9系统包括表达sgRNA的载体，所述sgRNA的编码序列为序列表中序列2第1-19位的核苷酸序列。
在本发明的具体的实施方式中，利用CRISPR/Cas9技术制备的重组载体为重组载体pLenti-US33as-5p-sgRNA，具有19个核苷酸组成的sgRNA的编码序列，对应所述的DNA分子的位置为序列2的第1-19位。
上述方法中，所述重组病毒理解为不仅包含第一代到第二代重组病毒，也包括其子代。
本发明还提供了构建△miRNA-HCMV病毒株的方法在进行miRNA研究中的应用。
上述应用中，所述筛选miRNA靶标，具体可为比对野生HCMV病毒株和△miRNA-HCMV病毒株对不同靶标的作用效果，筛选出存在显著差异的靶标。
本方法利用Crispr-Cas9技术可以快速、高特异性的构建△miRNA-HCMV病毒株，该方法构建的HCMV编码miRNA缺失株在编码miRNA部位发生基因突变，而在其他部位序列无改变，由于miRNA的表达为HCMV复制的非必须性条件，因而构建的HCMV缺失株可继续在易感染细胞中传代。本发明实施例在构建突变病毒株的基础上，进一步确认了IFNAR1是hcmv-miR-US33as-5p的靶标，抑制该miRNA分子的表达可导致宿主细胞IFNAR1的恢复性上调。由于干扰素及其下游信号通路在抗病毒免疫功能的激活方面具有重要功能，HCMV感染宿主后可在宿主体内建立终身的潜伏而不被免疫清除，因此，HCMV编码的miRNA分子hcmv-miR-US33as-5p可能是病毒建立终身潜伏的重要原因，可作为后续治疗的潜在治疗靶点。
附图说明
图1为实施例1中表达sgRNA-Cas9慢病毒的制备流程图。
图2为实施例1中载体LentiCRISPR v2的结构图。
图3为实施例1中载体插入序列测序图。图3中(1)为三个挑取的阳性菌落(图中标为US33as-5p构建1、US33as-5p构建2、US33as-5p构建3，下同)与空白对照的测序对比图；图3中(2)为三个挑取的阳性菌落与SgRNA-F(图中标为US33as-5p-sgRNA-F，下同)对比图；图3中(3)为三个挑取的阳性菌落与未处理Crispr v2质粒(图中标为Crispr_V2)、SgRNA-F序列对比图。
图4为实施例1中3株△miRNA-HCMV的测序结果图，其中，WT为HCMV Smith株，3株△miRNA-HCMV分别为突变病毒株1(图中标为#1)、突变病毒株2(图中标为#2)和突变病毒株3(图中标为#3)，下划线指示的为US33as-5p-sgRNA基因的编码链序列及3株△miRNA-HCMV相应位置的序列，加粗字体指示的核苷酸序列为hcmv-miR-US33as-5p的编码序列及3株△miRNA-HCMV相应位置的序列，斜体指示的为发生突变的具体碱基。
图5为实施例1中3株△miRNA-HCMV的荧光定量qPCR法检测hcmv-miR-US33as-5p的表达验证图，其中，WT为HCMV Smith株，3株△miRNA-HCMV分别为突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3，处理miRNA扩增得到hcmv-miR-US33as-5p，设置3种对照miRNA，分别扩增得到为hcmv-miR-UL112-3p、hcmv-miR-US4-5p、hcmv-miR-UL59。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，N.D.代表未检出。
图6为实施例2中hcmv-miR-US33as-5p进行靶标预测评分结果图。
图7为实施例2中针对不同预测靶标设计的引物对扩增后荧光素酶活性报告基因检测结果图。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，**表示显著性分析结果为P≤0.05。
图8为实施例2中靶标表达的qPCR验证图。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，**表示显著性分析结果为P≤0.05。
图9为实施例2中干扰素对HCMV感染的抗病毒作用结果图。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，**表示显著性分析结果为P≤0.05。
图10为实施例2中IFN下游分子的表达qPCR验证图。所示数据表示为平均值±标准差，重复数为3，**表示显著性分析结果为P≤0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1分子生物学试剂
一步法反转录试剂盒(D1801)为海基生物公司产品。
IFN-α2b(SRP4595)为Sigma公司产品。
2载体与细胞株、病毒株、基因
载体LentiCRISPR v2(addgene#52961)为addgene载体库产品。
载体psPAX2(addgene 12260)为addgene载体库产品。
载体pVSVg(addgene 8454)为addgene载体库产品。
Stbl3感受态细胞(CD521-01)为全世金生物公司产品。
293FT细胞(3111C0001CCC000364)为协和细胞资源中心产品。
MRC-5细胞(3111C0001CCC000044)为协和细胞资源中心产品。
HCMV Smith株在文献“宋鑫.HCMV-miR-US33as-5p在免疫逃逸中的作用机制研究.中国人民解放军军事医学科学院,2016.”中公开过，在该文献中记载为“HCMV AD169株”，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
hcmv-miR-US33as-5p模拟物为广州锐博生物技术公司产品。
3溶液和培养基
下述实施例中所用的溶液和培养基的配制方法如下：
LB培养基的配制方法为：准确秤取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g；加去离子水定容至1L，高压灭菌，4℃冷藏备用。
氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB溶液的配制方法为：1)取氨苄青霉素(0.5g/瓶)(悦康药业集团有限公司产品，批号：22081002)，加入5mL高压灭菌后的去离子水，直接混匀得到浓度为100mg/mL的氨苄储存液，-20℃冷冻备用；2)准确秤取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，加去离子水定容至1L，高压灭菌得到LB溶液；3)临用前，按照1：1000将氨苄储存液和LB溶液混匀，得到氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB溶液。
带氨苄抗性的LB平板的制备方法为：1)取氨苄青霉素(0.5g/瓶)(悦康药业集团有限公司产品，批号：22081002)，加入5mL高压灭菌后的去离子水，直接混匀得到浓度为100mg/mL的氨苄储存液，-20℃冷冻备用；2)准确秤取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、15g琼脂粉，加去离子水定容至1L，高压灭菌；待冷却至50℃，按照1：1000加入氨苄储存液，混匀后，迅速倒入高压后的平皿中静置，待冷却凝固后倒扣平皿得到带氨苄抗性的LB平板，4°冷藏备用。
10％胎牛血清的DMEM培养液的配制方法为：在DMEM培养基里，无菌条件下按照10％体积加入血清，血清货号(04-001-1ACS)，血清公司BiologicalIndustries。
加入嘌呤霉素(2.5μg/mL)的培养基的配制方法为：
取100mL 10％FBS MEM培养基，加入0.25μg嘌呤霉素，混匀待用。嘌呤霉素(货号HY-B1743A)为MCE公司产品。
无血清MEM培养基(货号C11095500BT)为Gibco公司产品。
10％FBS MEM培养基的配制方法为：在MEM培养基里，无菌条件下按照10％体积加入血清，血清货号(04-001-1ACS)，血清公司BiologicalIndustries。
半固体培养基的配制方法为：25ml 2×MEM；5mL FBS；预热至37℃；20mL 2.5％低熔点琼脂糖溶于双蒸水，预热至55摄氏度，过滤；随后二者混合，并维持在37℃
实施例1△miRNA-HCMV病毒株的制备
表达sgRNA-Cas9慢病毒的制备流程图见图1，具体步骤如下：
一、载体pLenti-US33as-5p-sgRNA的构建
1、设计miR-US33as-5p的靶序列
hcmv-miR-US33as-5p的序列如下：
5’-GGAUGUGCUCGGACCGUGACGGUG-3’(如序列表中的序列1)
为敲除hcmv-miR-US33as-5p基因，选定sgRNA，其名称为US33as-5p-sgRNA，其核苷酸序列为5’-GCUCACGUUUGGAUGUGCU-3’。US33as-5p-sgRNA基因的编码链序列为：5’-GCTCACGTTTGGATGTGCT-3’(如序列表中的序列2第1-19位)
针对US33as-5p-sgRNA基因，设计DNA引物F和R(带下划线的核苷酸反向互补)，并由北京奥科生物公司合成。
F：5’-CACCGGCTCACGTTTGGATGTGCT-3’；
R：5’-AAACAGCACATCCAAACGTGAGCC-3’。
2、重组表达载体的构建与验证
Crispr工具载体LentiCRISPR v2(addgene#52961)的结构见图2，使用工具酶BsmBI(NEB#R0580S)将该载体酶切线性化，步骤参照说明书，随后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离，选择较大的片段提纯回收(所用仪器：全世金EG101-01)，命名为线性化pLentiCRISPR。
在针对sgRNA的DNA引物F和R的5’端以T4多聚核苷酸激酶(NEB#M0201S)添加磷酸基团，随后梯度降温使双链结合，反应条件为：37℃30min，随后95℃5min，随后以5℃/min梯度降温到25℃。产物以1：200比例稀释，得到含有sgRNA的编码DNA的oligo，命名为US33as-5p-sgRNA基因片段。
将上述US33as-5p-sgRNA基因片段和线性化pLentiCRISPR用DNA连接酶连接，转化入Stbl3感受态细胞，所用仪器为全世金CD521-01，转化后的Stbl3感受态细胞命名为Stbl3-sgRNA。同时设置转化Crispr工具载体LentiCRISPR v2的Stbl3感受态细胞(命名为Stbl3-n)作为空载体对照。
将Stbl3-sgRNA在氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB溶液中摇菌扩增，获得Stbl3-sgRNA菌液，随后在带氨苄抗性的LB平板上涂板，挑取阳性菌落为Stbl3-sgRNA阳性转化子。同样获取Stbl3-n阳性转化子，以此为对照。对Stbl3-sgRNA阳性转化子进行载体插入序列测序。测序引物为hU6-F(5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3')，结果见图3，图3中(1)为三个挑取的阳性菌落(图中标为US33as-5p构建1、US33as-5p构建2、US33as-5p构建3，下同)与空白对照的测序对比图；图3中(2)为三个挑取的阳性菌落与引物F(图中标为US33as-5p-sgRNA-F，5’-CACCGGCTCACGTTTGGATGTGCT-3’；下同)对比图；图3中(3)为三个挑取的阳性菌落与未处理Crispr v2质粒(图中标为Crispr_V2)、引物F序列对比图。图3结果表明sgRNA已成功插入载体，将含有US33as-5p-sgRNA基因的重组载体命名为pLenti-US33as-5p-sgRNA。
取测序验证过的Stbl3-sgRNA阳性转化子于LB培养基中大量扩增，按照EndofreeMaxi Plasmid Kit(QIAGEN cat.no.12362)的说明书提取载体pLenti-US33as-5p-sgRNA，紫外分光光度计下计算载体浓度。
二、miR-US33as-5p敲除的HCMV的感染和验证
1、收获慢病毒
将293FT细胞(人胚肾细胞)接种于10cm培养皿中，在细胞密度约50-60％时，以psPAX2(2.4μg,addgene 12260)、pVSVg(0.25μg,addgene 8454)、步骤一中提取的载体pLenti-US33as-5p-sgRNA(2.6μg)共转染293T细胞，在共转染后的2-3d收获上清液中的慢病毒。
2、感染HCMV
将MRC-5细胞复苏，培养于10％胎牛血清的DMEM培养液中,待细胞汇合至80％-90％，在弃掉培养液后，同时加入聚凝胺(8μg/mL)、步骤1收获的慢病毒1mL、新鲜10％胎牛血清的DMEM培养液3mL，共孵育6h；随后换新鲜10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养36h；换上加入嘌呤霉素(2.5μg/mL)的培养基，继续培养3d，得到感染的MRC-5细胞(命名为MRC-5/US33as-5p-sgRNA)。取未感染的MRC-5细胞作为对照。MRC-5/US33as-5p-sgRNA和对照同时分别添加含相同浓度嘌呤霉素(2.5μg/mL)的培养基，至培养3d后未感染的细胞应彻底死亡。经嘌呤霉素筛选后的MRC-5细胞可连续传代和冻存。
以HCMV Smith株感染经嘌呤霉素筛选后的MRC-5/US33as-5p-sgRNA(MOI＝0.3)，感染72h-96h时，将整皿细胞在-80℃下冻融3次，随后以3000r/min 20min离心，将上清液分装冻存于-80℃冰柜，得到粗制△miRNA-HCMV(HCMV编码miRNA缺失株)。
3、△miRNA-HCMV病毒株的分离、扩增、滴定
将MRC-5细胞种植于12孔板，待细胞汇合至70％左右，将步骤2收获的粗制△miRNA-HCMV以无血清MEM培养基按照10倍梯度稀释孵育细胞，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共7个浓度的病毒稀释液，每个浓度的病毒稀释液接种12个孔。孵育2小时后，弃掉病毒液，换10％FBS MEM培养基继续培养24h；弃掉培养基，将半固体培养基覆盖于各孔继续培养72h，将病毒液弃掉，随后每孔中加入2mL半固体培养基，室温下静置30min；放回细胞培养箱(温度恒定为37℃)连续培养12d，用枪头挑取噬斑，接种于培养MRC-5细胞的12孔板上，随后对挑取的病毒进行连续传代，共得到3株△miRNA-HCMV病毒株，分别定名为突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3。
分别提取3株△miRNA-HCMV病毒株的DNA，以HCMV Smith株(野生型，WT)的DNA作为对照，使用高保真酶进行PCR，PCR引物为F1和R1，将产物进行测序鉴定病毒序列。
F1：5’-TAGCGGTCGTGCTTGTCTTT-3’
R1：5’-GCCCATAGGTCTCCGAACAG-3’。
测序结果见图4，HCMV Smith株(WT)测定的核苷酸序列为
Figure BDA0002578546650000081
Figure BDA0002578546650000082
Figure BDA0002578546650000083
(下划线指示的为US33as-5p-sgRNA基因的编码链序列，加粗字体指示的核苷酸序列为hcmv-miR-US33as-5p的编码序列)。突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3均在与sgRNA结合部位基因及其下游发生了单碱基的插入或小片段的缺失突变：突变病毒株1(记为1#)缺失了6个碱基，即序列表中序列2缺失了第11-16位；突变病毒株2(记为2#)替换了3个碱基，即序列表中序列2第12位的G替换为了C、第15-16位的GT替换为了AA；突变病毒株3(记为3#)添加了1个碱基，即序列表中序列2第16位和第17位之间添加了一个A。
4、△miRNA-HCMV病毒株编码miRNA的鉴定
以3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)、HCMVSmith株(WT)分别感染MRC-5细胞(MOI＝0.5)，感染3d后加入Trizol试剂，按照说明书提取总RNA。
病毒株表达hcmv-miR-US33as-5p的鉴定：将总RNA以一步法反转录试剂盒反转录(海基生物D1801)为cDNA，U6为内参(试剂盒自带)，实时荧光定量qPCR法检测miRNA的表达差异。检测hcmv-miR-US33as-5p表达的引物为F2和R2。
F2：5’-TCAGGATGTGCTCGGACCGTG-3’；
R2：5’-TCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACCGTC-3’。
选取HCMV其他部分序列编码的miRNA作为对照，所选miRNA具体为hcmv-miR-UL112-3p、hcmv-miR-US4-5p、hcmv-miR-UL59，各miRNA所用引物分别为：
hcmv-miR-UL112-3p所用引物为F3和R3:
F3：5’-GAAGTGACGGTGAGATCCA-3’；
R3：5’-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAGCCT-3’。
hcmv-miR-US4-5p所用引物为F4和R4:
F4：5’-CGTGCAGGGGGATG-3’；
R4：5’-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAGAC-3’；
hcmv-miR-UL59所用引物为F5和R5:
F5：5’-GGTTCTCTCGCTCGTCAT-3’；
R5：5’-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTACGG-3’。
分别以3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)、和HCMV Smith株(WT)的cDNA为模板，用引物F2和R2进行实时荧光定量qPCR，检测hcmv-miR-US33as-5p的表达情况。
分别以3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)、和HCMV Smith株(WT)的cDNA为模板，用引物F3和R3进行实时荧光定量qPCR，检测hcmv-miR-UL112-3p的表达情况。
分别以3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)、和HCMV Smith株(WT)的cDNA为模板，用引物F4和R4进行实时荧光定量qPCR，检测hcmv-miR-US4-5p的表达情况。
分别以3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)、和HCMV Smith株(WT)的cDNA为模板，用引物F5和R5进行实时荧光定量qPCR，检测hcmv-miR-UL59的表达情况。
结果见图5，表明3株△miRNA-HCMV病毒株(突变病毒株1、突变病毒株2和突变病毒株3)均有hcmv-miR-UL112-3p、hcmv-miR-US4-5p和hcmv-miR-UL59miRNA这三个对照miRNA的表达，没有hcmv-miR-US33as-5p的表达，说明3株△miRNA-HCMV病毒株的hcmv-miR-US33as-5p基因已敲除。
实施例2、hcmv-miR-US33as-5p靶点鉴定及其对干扰素保护作用的验证
一、hcmv-miR-US33as-5p靶点的筛选与鉴定
1、hcmv-miR-US33as-5p靶点筛选
使用预测软件对hcmv-miR-US33as-5p(又名hcmv-US33as-5p)进行靶标的预测分析，结果见图6，预测靶标分别为表1中的13种基因。
表1 针对hcmv-miR-US33as-5p预测的靶标设计的不同引物对序列
Figure BDA0002578546650000091
Figure BDA0002578546650000101
将软件预测的靶标分别构建了含预测靶标3’-UTR的双荧光素酶报告质粒，与hcmv-miR-US33as-5p模拟物共转染293FT细胞，得到转入预测靶标3’-UTR且表达荧光素酶的13种重组293FT细胞，以转染含预测靶标3’-UTR+NC-RNA的293FT细胞作为阴性对照，通过测定荧光素酶活性的变化对hcmv-miR-US33as-5p靶标进行筛选。其中，含预测靶标3’-UTR的双荧光素酶报告质粒的构建方法如下：分别设计及合成预测靶标的引物，并在上游引物中加SacI(gagctc)酶切位点、下游引物加Xba I
Figure BDA0002578546650000102
酶切位点，使用的14对引物如表1所示。以293FT细胞的基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增预测靶标3’-UTR，然后将其插入双荧光素酶报告质粒(Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit)(Genomeditech公司)与荧光素酶基因连接，分别得到含有各个预测靶标3’-UTR的重组质粒。
荧光素酶活性的变化结果见图7，证明hcmv-miR-US33as-5p可靶向IFNAR1及STAT，鉴于STAT也属于IFNAR1下游信号通路，说明hcmv-miR-US33as-5p对宿主抗病毒免疫中IFNAR1起到关键作用。
2、hcmv-miR-US33as-5p靶点验证
将MRC-5细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至70％左右，每孔分别加入HCMV Smith株(以下记为WT-HCMV)和实施例1中得到的突变病毒株1(记为△miRNA-HCMV)，感染3d后，加入Trizol试剂提取总RNA后，以试剂盒反转录cDNA，并分别以如下3对引物进行扩增，其中以GAPDH基因为内参基因：
IFNAR1引物对：
IFNAR1-F：5’-ATGATGGTCGTCCTCCTGGG-3’；
IFNAR1-R：5’-ATTCCCGACAGACTCATCGC-3’。
IFNAR2引物对：
IFNAR2-F：5’-TGCGAAATTTCCGGTCCATC-3’；
IFNAR2-R：5’-TCGTGTGTGCTTCTCCACTC-3’。
GAPDH引物对：
GAPDH-F：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；
GAPDH-R：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’。
扩增条件为：94℃5min预变性，随后以94℃30s，58℃30s，72℃45s循环30个循环，72℃5min后结束反应。
结果如图8所示，与WT-HCMV相比，△miRNA-HCMV中IFNAR1基因的表达量显著提高，而IFNAR2基因的表达量没有显著差异。说明IFNAR1基因是hcmv-miR-US33as-5p的靶标。
二、hcmv-miR-US33as-5p对HCMV病毒抗干扰素保护作用的验证
1、将MRC-5细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至70％左右，每孔分别加入HCMVSmith株(记为WTHCMV)和实施例1中得到的突变病毒株1(记为△miRNA-HCMV)，感染2d后，加入IFN-α2b(1500U/mL)刺激6h，提取各孔的DNA，检测病毒拷贝数，引物为F6和R6。
F6：5’-ATGTACGGGGGCATCTCTCT-3’；
R6：5’-GGCTTGGTTATCAGAGGCCG-3’。
扩增条件为：94℃5min预变性，随后以94℃30s，58℃30s，72℃45s循环30个循环，72℃5min后结束反应。
结果如图9中右图，表明与WT HCMV相比，△miRNA-HCMV(图9中以“△miRNA HCMV”表示)感染细胞后可被IFN显著抑制病毒复制拷贝数。
2、将MRC-5细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至70％左右，每孔分别加入HCMVSmith株(记为WT HCMV)和实施例1中得到的突变病毒株1(记为△miRNA-HCMV)，感染2d后，加入IFN-α2b(1500U/mL)刺激6h，直接将各孔在-80°冻存，随后冻融3次，3000r/20min离心，取上清，以TCID50法检测病毒滴度。结果如图9中左图。结果表明与WTHCMV相比，△miRNA-HCMV感染细胞后可被IFN显著抑制病毒滴度。
3、将MRC-5细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至70％左右，每孔分别加入HCMVSmith株(记为WT-HCMV)和实施例1中得到的突变病毒株1(记为△miRNA-HCMV)，感染2d后，加入IFN-α2b(1500U/mL)刺激6h，提取各孔的RNA，以试剂盒反转录cDNA，检测IFN下游信号通路的mRNA表达，检测引物见表2。
表2 检测IFN下游信号通路的mRNA表达设计的不同引物对序列
Figure BDA0002578546650000121
结果如图10所示，表明与WT-HCMV相比，△miRNA-HCMV感染细胞后可被IFN激活下游的信号通路。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 抑制宿主IFNAR1表达的miRNA及相应△miRNA-HCMV病毒株的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus)
<400> 1
ggaugugcuc ggaccgugac ggug 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcacgttt ggatgtgct 19

Claims (10)

1.一种构建重组人巨细胞病毒的方法，其特征在于：包括利用CRISPR/Cas9方法敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，得到所述miRNA表达量低于所述目的人巨细胞病毒的重组病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述miRNA能抑制宿主IFNAR1表达，所述miRNA的核苷酸序列是序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法利用CRISPR/Cas9系统敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，所述CRISPR/Cas9系统包括表达sgRNA的载体，所述sgRNA的编码序列为序列表中序列2第1-19位序列和/或序列表中序列2第1-19位序列的反向互补序列。
4.权利要求1-3任一项所述的方法在鉴定人巨细胞病毒miRNA功能中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的方法在制备鉴定人巨细胞病毒miRNA功能的产品中的应用。
6.由权利要求1-3任一项所述的方法构建的重组人巨细胞病毒。
7.权利要求6所述的重组人巨细胞病毒在鉴定人巨细胞病毒miRNA功能中的应用。
8.权利要求6所述的重组人巨细胞病毒在制备鉴定人巨细胞病毒miRNA功能的产品中的应用。
9.抑制miRNA分子的活性和/或降低所述miRNA分子的表达量和/或降低所述miRNA分子的含量的物质在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述miRNA分子能抑制宿主IFNAR1表达，所述miRNA分子的核苷酸序列是序列表中序列1。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗病毒药物为抗疱疹病毒的药物，具体为抗巨细胞病毒的药物，更具体为抗人巨细胞病毒的药物。
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