CN114540387B - 一种ires序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。本发明提供了DNA分子甲，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、供目的基因插入的位点和3’UTR。本发明还保护具有所述DNA分子甲的重组载体甲。本发明还提供了DNA分子乙，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、目的基因和3’UTR。本发明还保护具有所述DNA分子乙的重组载体乙。5’UTR如序列表的序列1中第442‑1183位所示。本发明提供了重组载体可用于体外转录mRNA，尤其适用于mRNA疫苗或mRNA药物的制备。本发明对于mRNA疫苗或mRNA药物生产具有重大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。
背景技术
20世纪60年代mRNA首次被科研人员发现，随着mRNA合成、修饰技术和递送技术的发展，现在mRNA作为药物已逐渐被应用到疫苗及疾病治疗等多种领域。简单来讲，mRNA药物是指经过体外转录合成及修饰的mRNA，被递送至细胞或体内，进而表达病毒抗原以激活机体的免疫能力，或产生机体所需要的目的蛋白，达到传染病预防、肿瘤治疗等目的。
相比传统手段，mRNA具有生产方便、半衰期短、无整合风险、安全性高等优势。mRNA不需要入核，进入细胞质即启动蛋白质翻译过程。mRNA不需要整合到基因组，只是瞬时表达编码蛋白，因此不存在插入突变的风险。而且，mRNA在细胞内是暂时性的活跃，可以通过生理途径完全代谢，没有持续积累毒性的风险。此外，mRNA的快速、简易制备方法和低成本也是其成为非常有潜力的候选药物的优势之一。
mRNA的稳定翻译需要5’的帽子结构。真核生物mRNA由7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷(m7GpppN)组成帽子结构。mRNA的加帽过程是mRNA生产中举足轻重的步骤之一。在常规mRNA体外转录制备方案中，常用的加帽方法主要有两种，一种是使用牛痘病毒加帽酶进行转录后加帽，但该方法制备和纯化步骤繁琐，成本较高。另一种是使用抗反转帽结构类似物(ARCA,Anti-reverse cap analogues)进行共转录加帽，该方法加帽效率较低，无法完全满足目前mRNA制备及生产的实际需求。近期，科学家开发了CleanCap加帽技术，加帽效率可达90％，但仍然需要考虑成本。因此，开发更优的mRNA体外转录替代方案，对于mRNA药物的研发及应用前景具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用，具体的，所述应用为体外转录RNA的翻译表达。
本发明提供了一种DNA分子(DNA分子甲)，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、供目的基因插入的位点和3’UTR；所述5’UTR如序列表的序列1中第442-1183位所示。该5’UTR即EV71-IRES(EV71病毒的IRES)。
所述3’UTR为人β-globin的3’UTR。
所述3’UTR为两个连续的人β-globin的3’UTR。
所述3’UTR如序列表的序列1中第2857-3070位所示。
所述DNA分子中还包括启动子和polyA，所述启动子位于5’UTR的上游，所述polyA位于3’UTR的下游。
所述启动子为T7启动子。
所述启动子如序列表的序列1中第422-441位所示。
所述polyA如序列表的序列1中第3077-3196位所示。
所述DNA分子中还包括Kozak序列。
所述Kozak序列位于5’UTR的下游且位于供目的基因插入的位点的上游。
所述Kozak序列如序列表的序列1中第1190-1195位所示。
具体的，所述DNA分子自上游至下游依次包括如下三个区段：序列表的序列1中第422-1195位所示的DNA区段、供目的基因插入的位点和序列表的序列1中第2857-3196位所示的DNA区段。
具体的，所述DNA分子自上游至下游依次由如下三个区段组成：序列表的序列1中第422-1195位所示的DNA区段、供目的基因插入的位点和序列表的序列1中第2857-3196位所示的DNA区段。
本发明还保护具有所述DNA分子甲的重组载体(重组载体甲)。
本发明还保护所述DNA分子甲或所述重组载体甲在制备mRNA中的应用。
应用所述DNA分子甲时，将目的基因插入所述DNA分子甲中的供目的基因插入的位点，然后进行体外转录，得到mRNA。所述目的基因为与所述mRNA对应的DNA分子。具体的，所述对应指的是将mRNA中的U替换为T，其他核苷酸不变。
应用所述重组载体甲时，将目的基因插入所述重组载体甲中所述DNA分子甲中的供目的基因插入的位点，得到重组质粒；将重组质粒进行线性化，然后进行体外转录，得到mRNA。所述目的基因为与所述mRNA对应的DNA分子。具体的，所述对应指的是将mRNA中的U替换为T，其他核苷酸不变。
本发明还保护一种制备mRNA的方法(方法甲)，包括如下步骤：
(1)将目的基因插入所述重组载体甲中的所述DNA分子甲中的供目的基因插入的位点，得到重组质粒；
(2)将权利要求(1)所述重组质粒进行线性化，然后进行体外转录，得到mRNA。
所述目的基因为与所述mRNA对应的DNA分子。具体的，所述对应指的是将mRNA中的U替换为T，其他核苷酸不变。
所述mRNA为用作mRNA疫苗的mRNA。
所述mRNA为用作mRNA药物的mRNA。
所述mRNA为对致病微生物具有预防和/或治疗作用的mRNA。
本发明还保护所述方法甲制备得到的mRNA。
本发明还保护一种DNA分子(DNA分子乙)，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、目的基因和3’UTR；所述5’UTR如序列表的序列1中第442-1183位所示。该5’UTR即EV71-IRES(EV71病毒的IRES)。
所述3’UTR为人β-globin的3’UTR。
所述3’UTR为两个连续的人β-globin的3’UTR。
所述3’UTR如序列表的序列1中第2857-3070位所示。
所述DNA分子中还包括启动子和polyA，所述启动子位于5’UTR的上游，所述polyA位于3’UTR的下游。
所述启动子为T7启动子。
所述启动子如序列表的序列1中第422-441位所示。
所述polyA如序列表的序列1中第3077-3196位所示。
所述DNA分子中还包括Kozak序列。
所述Kozak序列位于5’UTR的下游且位于目的基因的上游。
所述Kozak序列如序列表的序列1中第1190-1195位所示。
具体的，所述DNA分子自上游至下游依次包括如下三个区段：序列表的序列1中第422-1195位所示的DNA区段、目的基因和序列表的序列1中第2857-3196位所示的DNA区段。
具体的，所述DNA分子自上游至下游依次由如下三个区段组成：序列表的序列1中第422-1195位所示的DNA区段、目的基因和序列表的序列1中第2857-3196位所示的DNA区段。
本发明还保护具有所述DNA分子乙的重组载体(重组载体乙)。
本发明还保护所述DNA分子乙或所述重组载体乙在制备mRNA中的应用。
应用所述DNA分子乙时，将所述DNA分子乙进行体外转录，得到mRNA。
应用所述重组载体乙时，先进行线性化，然后进行体外转录，得到mRNA。
所述目的基因为与所述mRNA对应的DNA分子。具体的，所述对应指的是将mRNA中的U替换为T，其他核苷酸不变。
本发明还保护一种制备mRNA的方法(方法乙)，包括如下步骤：将所述重组质粒乙进行线性化，然后进行体外转录，得到mRNA。
所述mRNA为用作mRNA疫苗的mRNA。
所述mRNA为用作mRNA药物的mRNA。
所述mRNA为对致病微生物具有预防和/或治疗作用的mRNA。
本发明还保护所述方法乙制备得到的mRNA。
本发明还保护一种mRNA，是由DNA分子甲或DNA分子乙转录得到的。
本发明还保护一种mRNA，是由重组载体甲或重组载体乙转录得到的。
本发明中，利用EV71病毒5’端非翻译区翻译调控的顺式作用元件内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)体外转录mRNA，得到的mRNA可以在不依赖帽结构的情况下，在真核细胞及动物体内稳定启动翻译，替代目前通过“加帽”方式来提高mRNA稳定性的技术。
本发明提供了用于体外转录mRNA的重组载体。所述重组载体中，自上游至下游依次具有启动子、EV71病毒IRES元件(5’UTR)、目的基因、3’UTR和polyA。本发明提供的重组载体可以通过体外转录得到目的基因的mRNA，该mRNA能够在非依赖帽结构下进行真核细胞内核糖体启动的翻译表达。本发明提供的重组载体尤其适用于mRNA疫苗或mRNA药物的制备,具有制备流程简化、制备成本极大降低等优点。本发明对于mRNA疫苗或mRNA药物生产具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为检测质粒的线性化的电泳图。
图2为实施例2中的luciferase活性测定结果图。
图3为实施例3中检测动物活体的荧光的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、重组载体的构建
分别制备重组载体pUC57-IRES-luc、对照载体甲和对照载体乙。
重组载体pUC57-IRES-luc为环形质粒，如序列表的序列1所示。
序列表的序列1中，第422-441位核苷酸为T7启动子，第442-1183位核苷酸为EV71-IRES(EV71病毒的IRES)，第1190-1195位核苷酸为Kozak序列，第1196-2848位核苷酸为荧光素酶报告基因，第2857-3070位核苷酸为两个连续的3’UTR(人β-globin基因的3’UTR)，第3077-3196位核苷酸为polyA尾，第3198-3204位核苷酸为限制性内切酶SapⅠ的识别序列。
与重组载体pUC57-IRES-luc相比，对照载体甲的区别仅在于用序列表的序列2所示的HCV-IRES1-340区段代替了EV71-IRES。
与重组载体pUC57-IRES-luc相比，对照载体乙的区别仅在于用序列表的序列3所示的HCV-IRES1-373区段代替了EV71-IRES。
HCV-IRES即HCV病毒的IRES。
实施例2、不同IRES的效果比较
供试质粒分别为：实施例1制备的重组载体pUC57-IRES-luc、对照质粒甲或对照质粒乙。
一、质粒线性化
1、取供试质粒，用限制性内切酶SapⅠ进行酶切。
反应体系：供试质粒10μg、限制性内切酶Sap I(10000U/mL)1μL、10xCutsmartbuffer 5μL，用ddH2O补足50μL。限制性内切酶Sap I和10xCutsmart buffer为配套产品，NEB，产品目录号为R0569L。
反应条件：37℃，3h。
2、完成步骤1后，取2μL酶切产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测质粒的线性化情况。结果见图1，重组质粒被线性化，分子大小正确。
3、完成步骤2后，利用快速DNA产物纯化试剂盒(康维世纪，CW2301M)回收纯化线性化质粒。
二、体外转录
取步骤1得到的线性化质粒并作为体外转录的模板，利用高产量T7 RNA转录试剂盒进行体外转录。高产量T7 RNA转录试剂盒，产品名称为High Yield T7 RNA SynthesisKit，上海兆维科技发展有限公司，产品目录号为ON-040；5×Reaction Buffer、100mM ATPSolution、100mM CTP Solution、100mM GTP Solution、Enzyme mix、DNase I、AmmoniumAcetate Stop Solution、Lithium Chloride(LiCl)Precipitation Solution均为高产量T7 RNA转录试剂盒中的组件。100mMΨUTP Solution，全称为N1-Me-pUTP，100mM，上海兆维科技发展有限公司，产品目录号为R5-027。
体外转录的具体步骤：首先，制备反应体系，混匀后37℃反应3h；然后，加入1μLDNase I(含量为1U)，37℃反应15min；然后加入15μL Ammonium Acetate Stop Solution。
反应体系：5×Reaction Buffer 4μL、100mM ATP Solution 2μL、100mMΨUTPSolution 1μL、100mM CTP Solution 2μL、100mM GTP Solution 2μL、Enzyme mix 2μL、线性化质粒(DNA含量为500ng-1μg)，Nuclease-free H2O补齐至20μL。
三、RNA纯化
完成步骤二后，向反应体系中加入1/2体积Lithium Chloride PrecipitationSolution(使LiCl终浓度为2.5M)，-20℃放置30min。然后12000g离心15min(RNA沉淀在底部)，吸弃上清液，加入1mL 70％乙醇水溶液清洗RNA，然后12000g离心5min，吸弃上清液。晾干，然后加入50μL无RNA酶的水溶解沉淀，利用紫外分光光度计进行mRNA定量，得到未加帽的体外转录mRNA。
重组载体pUC57-IRES-luc依次进行上述步骤一、二和三，得到的mRNA如序列表的序列4所示，命名为EV71-IRES-luc mRNA。
对照质粒甲依次进行上述步骤一、二和三，得到的mRNA如序列表的序列5所示，命名为HCV(1-340)-IRES-luc mRNA。
对照质粒乙依次进行上述步骤一、二和三，得到的mRNA如序列表的序列6所示，命名为HCV(1-373)-IRES-luc mRNA。
四、mRNA转染及表达
1、将293T细胞消化后铺于六孔板内，每孔5×105个细胞，培养24小时。
2、完成步骤1后，借助Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen，按说明书操作)转染步骤三制备的未加帽的体外转录mRNA，每孔1μg mRNA。
3、完成步骤2后，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
4、完成步骤3后，收集细胞，每孔加入100μL 1×细胞裂解液，37℃裂解30min。
细胞裂解液：Promega，E1531。
5、完成步骤4后，每孔吸取10μL，利用荧光素酶活性测定试剂盒(Promega，E1500)在Centro XS3 LB 960微孔板发光检测仪(Berthold Technologies)上进行luciferase活性测定。
结果见图2。转染EV71-IRES-luc mRNA的细胞的luciferase活性最高。
实施例3、mRNA包载及小鼠体内表达
一、mRNA-LNP包载
1、取实施例2的步骤三制备的未加帽的体外转录mRNA(EV71-IRES-luc mRNA)，采用20mM醋酸水溶液(pH 5.0)稀释，得到RNA浓度为200μg/ml的RNA溶液。设置注射泵流速(mRNA溶液的流速为9ml/min，脂质混合物的流速为3ml/min)，同时启动注射泵，最终使mRNA溶液与脂质混合物按3:1的体积进行混合，并用278mM蔗糖水溶液进行10倍稀释。经过超滤管(Millipore，UFC910096)离心浓缩后进行三次溶液置换(置换液：含2mM醋酸和250mM蔗糖，余量为水)。
脂质混合物(1ml)的配方见表1。
表1
| 物料名称 | 母液浓度 | 用量 |
| SM102 | 25mg/mL | 274.64μL |
| DSPC | 25mg/mL | 61.12μL |
| 胆固醇 | 25mg/mL | 115.14μL |
| DMG-PEG2000 | 25mg/mL | 29.11μL |
| 无水乙醇 | 作为溶剂 | 520μL |
2、取步骤1得到的溶液，加入1/24体积的Tris水溶液(500mM,pH 7.0)，得到LNP包载的mRNA溶液。LNP即脂质纳米颗粒。
3、取步骤2得到的LNP包载的mRNA溶液，利用粒径仪(马尔文)检测LNP包载的mRNA的粒径，利用Ribogreen RNA定量试剂盒(Invitrogen，R11490)测定样品中mRNA含量，并计算包封率。
LNP包载的mRNA的粒径为167d.nm，包封率为65％。
二、肌肉注射给药
取步骤一制备的LNP包载的mRNA溶液，用PBS缓冲液稀释，得到注射用液。
20g左右的BALB/c雌性小鼠，用胰岛素注射器在小鼠股四头肌部位注射注射用液，每只小鼠注射50μl。设计两种剂量：一种剂量为“每50微升注射用液含10μg mRNA”，另一种剂量为“每50微升注射用液含14μg mRNA”。
20g左右的BALB/c雌性小鼠，用胰岛素注射器在小鼠股四头肌部位注射PBS缓冲液，每只小鼠注射50μl。
三、活体动物成像观测
小鼠注射24h后，用Perkinelmer的IVIS检测Luciferase的体内表达情况。
底物为D-luciferin Sodium salt(GOLDBIO,LUCNA-1G)，用生理盐水配成15mg/ml的浓度，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装避光保存于-20℃。成像前每只20g左右的小鼠腹腔注射200μl底物溶液，作用10-20分钟，然后使用异氟烷气体麻醉后将小鼠趴在成像板上检测动物活体的荧光。
结果如图3所示，EV71-IRES-luc mRNA在小鼠体内表达，且呈剂量依赖性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<120> 一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用
<130> GNCYX220272
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagactgtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggattctag 420
ataatacgac tcactatagg gttaaaacag cctgtgggtt gcacccactc acagggccta 480
ctgggcgcaa gcactctggc acctcggtac ctttgtgcgc ctgttttata cccccccccc 540
agtgaaactt agaagcagca aaccacgatc aatagcaggc ataacgctcc agttatgtct 600
tgatcaagca cttctgtttc cccggactga gtatcaatag actgctcgcg cggttgaagg 660
agaaaacgtt cgttatccgg ctagctactt cggaaaacct agtaacacca tgaaagttgc 720
ggagagcttc gttcagcact cccccagtgt agatcaggtc gatgagtcac cgcattcccc 780
acgggcgacc gtggcggtgg ctgcgttggc ggcctgccca tggggtaacc catggggcgc 840
tctaatacgg acatggtgtg aagagtctac tgagctagtt agtagtcctc cggcccctga 900
atgcggctaa tcccaactgc ggagcacacg cccacaagcc agcgggtagt gtgtcgtaac 960
gggtaactct gcagcggaac cgactacttt gggtgtccgt gtttcctttt atttttatat 1020
tggctgctta tggtgacaat taaagaattg ttaccatata gctattggat tggccatccg 1080
gtgtgcaaca gagcaattat ttacctattt attggttttg taccattaac cttgaattct 1140
gtgaccaccc ttaattatat cttgaccctt aacacagcta aacggatccg ccaccatgga 1200
agacgccaaa aacattaaga agggcccagc gccattctac ccactcgaag acgggaccgc 1260
cggcgagcag ctgcacaaag ccatgaagcg ctacgccctg gtgcccggca ccatcgcctt 1320
taccgacgca catatcgagg tggacattac ctacgccgag tacttcgaga tgagcgttcg 1380
gctggcagaa gctatgaagc gctatgggct gaatacaaac catcggatcg tggtgtgcag 1440
cgagaatagc ttgcagttct tcatgcccgt gttgggtgcc ctgttcatcg gtgtggctgt 1500
ggccccagct aacgacatct acaacgagcg cgagctgctg aacagcatgg gcatcagcca 1560
gcccaccgtc gtattcgtga gcaagaaagg gctgcaaaag atcctcaacg tgcaaaagaa 1620
gctaccgatc atacaaaaga tcatcatcat ggatagcaag accgactacc agggcttcca 1680
aagcatgtac accttcgtga cttcccattt gccacccggc ttcaacgagt acgacttcgt 1740
gcccgagagc ttcgaccggg acaaaaccat cgccctgatc atgaacagta gtggcagtac 1800
cggattgccc aagggcgtag ccctaccgca ccgcaccgct tgtgtccgat tcagtcatgc 1860
ccgcgacccc atcttcggca accagatcat ccccgacacc gctatcctca gcgtggtgcc 1920
atttcaccac ggcttcggca tgttcaccac gctgggctac ttgatctgcg gctttcgggt 1980
cgtgctcatg taccgcttcg aggaggagct attcttgcgc agcttgcaag actataagat 2040
tcaatctgcc ctgctggtgc ccacactatt tagcttcttc gctaagagca ctctcatcga 2100
caagtacgac ctaagcaact tgcacgagat cgccagcggc ggggcgccgc tcagcaagga 2160
ggtaggtgag gccgtggcca aacgcttcca cctaccaggc atccgccagg gctacggcct 2220
gacagaaaca accagcgcca ttctgatcac ccccgaaggg gacgacaagc ctggcgcagt 2280
aggcaaggtg gtgcccttct tcgaggctaa ggtggtggac ttggacaccg gtaagacact 2340
gggtgtgaac cagcgcggcg agctgtgcgt ccgtggcccc atgatcatga gcggctacgt 2400
taacaacccc gaggctacaa acgctctcat cgacaaggac ggctggctgc acagcggcga 2460
catcgcctac tgggacgagg acgagcactt cttcatcgtg gaccggctca aaagcctgat 2520
caaatacaag ggctaccagg tagccccagc cgaactggag agcatcctgc tgcaacaccc 2580
caacatcttc gacgccgggg tcgccggcct gcccgacgac gatgccggcg agctgcccgc 2640
cgcagtcgtc gtgctggaac acggtaaaac catgaccgag aaggagatcg tggactatgt 2700
ggccagccag gttacaaccg ccaagaagct gcgcggtggt gttgtgttcg tggacgaggt 2760
gcctaaagga ctgaccggca agttggacgc ccgcaagatc cgcgagattc tcattaaggc 2820
caagaagggc ggaaagatcg ccgtgtaagg cgcgccgctc gctttcttgc tgtccaattt 2880
ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg 2940
ccttgagcat ctggattctg cctgctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc 3000
ctttgttccc taagtccaac tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg 3060
gattctgcct gaattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180
aaaaaaaaaa aaaaaacgaa gagcgcggcc gcgagcgagc ttggctcgag catggtcata 3240
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 3300
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 3360
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 3420
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctgttcc gcttcctcgc tcactgactc 3480
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 3540
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 3600
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 3660
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 3720
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 3780
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 3840
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3900
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 3960
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 4020
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 4080
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 4140
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 4200
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 4260
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 4320
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 4380
aacttggtct gacagttaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 4440
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 4500
accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc 4560
aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 4620
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt ctttccagac 4680
ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt 4740
attcattcgt gattgcgcct gagcgaaacg aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt 4800
acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc 4860
acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttcccaggga tcgcagtggt 4920
gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa 4980
ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt 5040
gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcgat agattgtcgc 5100
acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt 5160
ggaatttaat cgcggcctag agcaagacgt ttcccgttga atatggctca tactcttcct 5220
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 5280
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 5340
tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 5400
gcccttttgt c 5411
<210> 2
<211> 340
<212> DNA
<213> Hepatitis C virus
<400> 2
acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60
cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120
ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180
aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg 240
caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300
cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc 340
<210> 3
<211> 373
<212> DNA
<213> Hepatitis C virus
<400> 3
acctgcccct aataggggcg acactccgcc atgaatcact cccctgtgag gaactactgt 60
cttcacgcag aaagcgccta gccatggcgt tagtatgagt gtcgtacagc ctccaggccc 120
ccccctcccg ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccggg 180
aagactgggt cctttcttgg ataaacccac tctatgcccg gccatttggg cgtgcccccg 240
caagactgct agccgagtag cgttgggttg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 300
cgcttgcgag tgccccggga ggtctcgtag accgtgcacc atgagcacaa atcctaaacc 360
tcaaagaaaa acc 373
<210> 4
<211> 2758
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggguuaaaac agccuguggg uugcacccac ucacagggcc uacugggcgc aagcacucug 60
gcaccucggu accuuugugc gccuguuuua uacccccccc ccagugaaac uuagaagcag 120
caaaccacga ucaauagcag gcauaacgcu ccaguuaugu cuugaucaag cacuucuguu 180
uccccggacu gaguaucaau agacugcucg cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 240
ggcuagcuac uucggaaaac cuaguaacac caugaaaguu gcggagagcu ucguucagca 300
cucccccagu guagaucagg ucgaugaguc accgcauucc ccacgggcga ccguggcggu 360
ggcugcguug gcggccugcc caugggguaa cccauggggc gcucuaauac ggacauggug 420
ugaagagucu acugagcuag uuaguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 480
gcggagcaca cgcccacaag ccagcgggua gugugucgua acggguaacu cugcagcgga 540
accgacuacu uugggugucc guguuuccuu uuauuuuuau auuggcugcu uauggugaca 600
auuaaagaau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugugcaa cagagcaauu 660
auuuaccuau uuauugguuu uguaccauua accuugaauu cugugaccac ccuuaauuau 720
aucuugaccc uuaacacagc uaaacggauc cgccaccaug gaagacgcca aaaacauuaa 780
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agccaugaag cgcuacgccc uggugcccgg caccaucgcc uuuaccgacg cacauaucga 900
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gcgcuauggg cugaauacaa accaucggau cguggugugc agcgagaaua gcuugcaguu 1020
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2758
<210> 5
<211> 2356
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2389
Claims (7)
1.mRNA分子，自上游至下游依次包括如下元件：5’UTR、目的基因和3’UTR；所述5’UTR如序列表的SEQ ID No.1中第442-1183位所示；所述3’UTR为人β-globin的3’UTR；如序列表的SEQ ID No.1中第2857-3070位所示；所述mRNA分子中还包括polyA，所述polyA位于3’UTR的下游；所述polyA如序列表的SEQ ID No.1中第3077-3196位所示；所述mRNA分子中还包括Kozak序列，所述Kozak序列位于5’UTR的下游且位于目的基因的上游，所述Kozak序列如序列表的SEQ ID No.1中第1190-1195位所示。
2. 如权利要求1所述的mRNA分子，所述mRNA分子的序列如SEQ ID No. 4所示。
3.编码具有权利要求1或2所述mRNA分子的重组载体。
4.编码具有权利要求1或2所述mRNA分子的重组质粒。
5.一种制备mRNA的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述重组质粒进行线性化，然后进行体外转录，得到mRNA。
6.权利要求1或2所述mRNA分子或权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组质粒或权利要求5所述mRNA制备方法在制备mRNA疫苗中的应用。
7.权利要求1或2所述mRNA分子或权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组质粒或权利要求5所述mRNA制备方法在制备mRNA药物中的应用。
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2022
- 2022-03-28 CN CN202210310177.6A patent/CN114540387B/zh active Active
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| 一种以EV71病毒编码模式表达的SARS-CoV-2 S1抗原mRNA实验性疫苗的探索;徐祥熊;中国优秀硕士学位论文全文库（电子期刊）医药卫生科技辑;第1-111页 * |
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