CN117230062A - 人工优化设计的5`utr序列提高外源基因的翻译表达 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人工优化设计的5'UTR序列以提高外源基因的翻译表达。具体地,本发明提供了一种5'UTR元件,所述5'UTR元件具有选自下组的序列:如SEQID NO:10‑13所示的核苷酸序列或其衍生序列,还提供了所述5'UTR元件在mRNA分子结构优化等方面的应用。本发明的5'UTR元件不仅能增强目的基因的表达,还能维持较高的mRNA稳定性,有利于降低mRNA的工业化生产成本和时间成本。本发明的平台性方法可高通量高效地评价5'UTR的翻译表达效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地,涉及mRNA合成技术领域,涉及一种具有增强在真核细胞中基因表达水平的5'UTR结构序列。
背景技术
在体内表达重组基因可以用于疫苗治疗和基因治疗。此前质粒DNA和重组病毒已被广泛使用,基于体外转录(IVT,in vitro transcription)合成技术的 mRNA疫苗技术和mRNA治疗方法也因制备工艺的进展正加速进入临床试验。为了更有效地表达mRNA,一个完整的mRNA分子应该包括5'帽子、5'UTR (untranslated region,非翻译区)、目的基因编码区、3'UTR以及多聚腺苷酸 (polyA)尾。其中,5'UTR和3'UTR,含有多种顺式作用元件,对维持mRNA的稳定性和所编码蛋白质的表达至关重要。
优化5'UTR结构可以促进其编码蛋白质的高表达。5'UTR主要表现两个方面的功能:稳定mRNA分子结构以及方便核糖体亚基的亚结构单位扫描、识别和定位起始密码子。因此,5'UTR在提高目的基因的表达量和增加其在细胞内的稳定性方面发挥重要作用。
然而,目前的5'UTR结构在细胞水平和体内的表达量还不够高,因此在实际应用中需要引入更多的工艺流程去增强其表达量才能达到临床要求,耗时长,工艺繁琐,且增加了成本,效果仍难以令人满意。使用目的基因自身的5'UTR 可能因为不表达目的基因基因全长而只表达其片段而不适合,或者其效率对目的基因经常并不是最优,也可能因为其长度可能太长而影响mRNA制备的载量。选择高表达人源基因的5'UTR结构也因筛选工作巨大,基因种类庞大,生理条件的差异而事倍功半。人工从头设计是突破工作量巨大的一种尝试,但要有相应的数据积累和对5'UTR结构和性质的理解。
因此,本领域迫切需要开发一种人工设计的能增强目的基因表达的5'UTR 结构,以实现在mRNA治疗中更优的应用;也需要建立一种5'UTR结构效率评价方法,充分评价和验证5'UTR的效果,并以此基础筛选出更佳的5'UTR结构。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能增强目的基因表达的5'UTR结构。
在本发明的第一方面,提供了一种5'UTR元件,所述5'UTR元件具有选自下组的序列:如SEQ ID NO:10-13所示的核苷酸序列或其衍生序列,
其中,所述衍生序列是指对上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)核苷酸并能保留增强目的基因的表达能力的衍生序列。
在另一优选例中,所述衍生序列包括与上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列的同源性为至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少 99%的核苷酸序列。
在本发明的第二方面,提供了一种DNA模板,所述DNA模板包含如本发明第一方面所述的5'UTR元件。
在另一优选例中,所述的DNA模板具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (I)
式中,
Z1、Z7为无或酶切位点;
Z2为无或启动子元件;
Z3为如本发明第一方面所述的5'UTR元件;
Z4为目的编码序列;
Z5为3'-UTR元件;
Z6为polyA尾元件。
在另一优选例中,所述酶切位点为限制性内切酶位点。
在另一优选例中,所述限制性内切酶选自type II型限制性内切酶的一种或多种。
在另一优选例中,所述限制性内切酶选自下组的一种或多种:type IIS型限制性内切酶、BamHI、Spe I、Mlu I、Hind III、Bgl II、Bcu I、BshT1、CsiI、Mbo I。
在另一优选例中,所述type IIS型限制性内切酶选自下组:BspQ I、Bve I、Faq I、Bpi I等。
在另一优选例中,所述限制性内切酶为BamHI。
在另一优选例中,所述Z2选自下组:T7启动子、SP6启动子、T3启动子,或其组合。
在另一优选例中,所述Z2为T7启动子。
在另一优选例中,所述Z4为选自下组免疫原的编码序列:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位,或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
在另一优选例中,所述Z4为mcherry基因的编码序列。
在另一优选例中,所述Z4为预获得高表达的目的基因的编码序列。
在另一优选例中,所述Z5为HBB(β-globin)。
在本发明的第三方面,提供了一种mRNA,所述mRNA为如本发明第二方面所述的DNA模板的转录本。
在另一优选例中,所述的mRNA具有式II结构:
X1-X2-X3-X4-X5 (II)
式中,
X1为无或5'帽子元件;
X2为5'UTR区;
X3为目的编码区;
X4为3'UTR区;
X5为polyA尾区。
在另一优选例中,所述的5'帽子元件通过选自下组的方法引入:酶法加帽法、帽类似物共转录加帽(或称一步合成加帽)法;优选为酶法加帽法。
在另一优选例中,所述X1选自下组:Cap 0、Cap 1、Cap 2。
在另一优选例中,所述X1为Cap 1。
在另一优选例中,所述X3为选自下组免疫原的编码区:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位,或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
在另一优选例中,所述X3为mcherry基因的编码区。
在另一优选例中,所述X3为预获得高表达的目的基因的编码区。
在另一优选例中,所述X4为HBB(β-globin)。
在本发明的第四方面,提供了一种表达载体,所述载体含有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第三方面所述的mRNA。
在另一优选例中,所述载体选自下组:DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统,或其组合。优选地,所述载体为质粒载体。
在另一优选例中,所述质粒载体为pcDNA3.1载体。
在另一优选例中,所述载体为pUC57载体。
在另一优选例中,所述载体为pUC57-Kan载体。
在另一优选例中,所述载体中还包括启动子。
在另一优选例中,所述启动子选自下组:T7启动子、SP6启动子、T3启动子,或其组合。
在另一优选例中,所述启动子为T7启动子。
在本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体或如本发明第三方面所述的mRNA,或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR元件。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞选自下组:大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为人源细胞系。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为HEK293T细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为人体细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为DC细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞。
在本发明的第六方面,提供了一种构建如本发明第三方面所述的mRNA的方法,所述方法包括步骤:
(i)提供如本发明第一方面所述的5'UTR元件,将所述5'UTR元件融合到目的基因编码序列的上游,并构建一含有如本发明第二方面所述DNA模板的载体;
(ii)将(i)中获得的载体酶切线性化获得所述DNA模板,并进行转录,从而获得所述mRNA;和
(iii)任选地,对步骤(ii)中获得的所述mRNA进行纯化和/或修饰。
在另一优选例中,在步骤(ii)中还包括子步骤:
(z1)对(ii)中获得的DNA模板进行纯化和/或定量分析;和/或
(z2)对(ii)中获得的DNA模板进行转录时,还进行碱基修饰和/或用修饰性碱基发生替换。
在另一优选例中,所述定量分析包括浓度测定、纯度分析。
在另一优选例中,所述步骤(iii)中的修饰包括加帽反应。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
(iv)对所述mRNA进行浓度测定和/或纯度分析。
在本发明的第七方面,提供了一种产生如本发明第三方面所述的mRNA的方法,所述方法包括步骤:
(a)在适合的条件下,培养如本发明第五方面所述的宿主细胞,从而获得一载体的培养物,其中所述载体含有如本发明第二方面所述的DNA模板;
(b)从(a)中获得的所述培养物中分离和/或回收所述载体,并酶切线性化获得所述DNA模板;
(c)将(b)中获得的所述DNA模板进行转录,从而获得所述mRNA;和
(d)任选地,对步骤(c)获得的所述mRNA进行纯化和/或修饰。
在本发明的第八方面,提供了一种mRNA疫苗的制备方法,所述方法包括步骤:
(i)提供一种用于表达免疫原的mRNA,所述mRNA为如本发明第三方面所述的mRNA,或通过如本发明第六方面或第七方面所述的方法获得;和
(ii)将(i)中所述mRNA与药学上可接受的载体混合,从而获得所述mRNA疫苗。
在另一优选例中,所述免疫原选自下组:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位、,或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
在另一优选例中,所述药学上可接受的载体包括但不限于:LNP或者其它脂质体。
在本发明的第九方面,提供了一种mRNA疫苗组合物,所述疫苗组合物含有:
(a)用于表达免疫原的mRNA,所述mRNA为如本发明第三方面所述的mRNA,或通过如本发明第六方面或第七方面所述的方法获得;和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述免疫原选自下组:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位,或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
在另一优选例中,所述疫苗组合物中mRNA本身还可以充当佐剂。
在另一优选例中,所述疫苗组合物的剂型选自下组:注射剂、冻干剂。
在另一优选例中,所述疫苗组合物包括0.01~99.99%的如本发明第三方面所述的mRNA,和0.01~99.99%的药学上可接受的载体,所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。
在本发明的第十方面,提供了一种提高目的基因表达的方法,所述方法包括步骤:
(a)提供一种高表达元件,所述高表达元件包含选自下组的成分:如本发明第一方面所述的5'UTR元件、如本发明第二方面所述的DNA模板、如本发明第三方面所述的mRNA,或如本发明第四方面所述的载体;和
(b)在合适的条件下,将(a)中所述高表达元件导入一宿主细胞,使所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体或如本发明第三方面所述的mRNA,或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR 元件,从而提高所述宿主细胞中目的基因的表达。
在本发明的第十一方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)一种质粒,所述质粒含有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR元件;和
(b)一说明书,所述说明书描述了利用所述质粒进行体内转录或体外转录获得mRNA并在合适的宿主细胞中翻译表达的方法。
在另一优选例中,所述说明书描述了将所述质粒导入一宿主细胞,使所述宿主细胞基因组中整合有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR元件的方法。
在另一优选例中,所述说明书描述了利用所述质粒进行体外转录获得mRNA,并用所述mRNA转染宿主细胞的方法。
在本发明的第十二方面,提供了一种如本发明第一方面所述的5'UTR元件、如本发明第二方面所述的DNA模板、如本发明第三方面所述的mRNA、如本发明第四方面所述的载体,或如本发明第十一方面所述的试剂盒的用途,用于增强目的基因的表达。
在本发明的第十三方面,提供了一种如本发明第九方面所述的mRNA疫苗组合物,或如本发明第五方面所述的宿主细胞的用途,其被用于制备一药物,所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
在另一优选例中,所述肿瘤的抗原选自下组:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位片段,或其组合。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
在本发明的第十四方面,提供了一种模式表达载体,所述载体包含:
(a)含有红色荧光蛋白mcherry的编码基因序列;和
(b)人globin的5'UTR和3'UTR,并含有polyA尾。
在另一优选例中,所述polyA尾前后含有限制性内切酶。
在另一优选例中,所述3'UTR为HBB(β-globin)。
在本发明的第十五方面,提供了一种评价5'UTR元件翻译表达效率的方法,所述方法包括步骤:
(a)提供如本发明第十四方面所述的模式表达载体或其mRNA,和一待测 5'UTR元件;
(b)以mcherry基因为模板,将待测5'UTR元件融合到所述mcherry基因的上游后,构建包含所述待测5'UTR元件的待测表达载体,其中所述待测表达载体的结构中仅有5'UTR元件与所述模式表达载体不同;
(c)制备所述待测表达载体的mRNA和/或所述模式表达载体的mRNA,其中所述模式表达载体的mRNA作为阳性参照;和
(d)使用所述阳性参照和所述待测表达载体的mRNA,在相同条件下,分别转染合适的宿主细胞,并检测其荧光表达强度,计算出待测5'UTR元件的荧光强度相对值E1,E1=(待测表达载体的mRNA荧光强度均数-空白组均数)/(阳性参照荧光强度均数-空白组均数)*100%;
若E1>1,则表明所述待测5'UTR元件的翻译表达效率高于人globin 5'UTR元件的翻译表达效率;
若E1=1,则表明所述待测5'UTR元件的翻译表达效率等于人globin 5'UTR元件的翻译表达效率;
若E1<1,则表明所述待测5'UTR元件的翻译表达效率小于人globin 5'UTR元件的翻译表达效率。
在另一优选例中,在步骤(c)中还包括子步骤:
(m1)对所述阳性参考和所述待测表达载体的mRNA进行浓度测定和/或纯度分析。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了以红色荧光蛋白mcherry基因为模板,构建UTR效率评价平台的实验流程。
图2显示了红色荧光蛋白mcherry基因模板的分子结构。
图3显示了人的β-globin基因与mRNA疫苗BNT162b2的5'UTR作为评价体系的对照。
图4显示了使用转染试剂转染各5'UTR翻译效果与globin的比较。
图5显示了mRNA-LNP包封后,设计的融合不同5'UTR结构的mcherry的mRNA转染293T细胞后,各样品的转染效率。
图6显示了mRNA-LNP包封后,转染了HTB20-HTB23各UTR与globin相比的相对荧光值强度。
图7显示了苜蓿嵌合病毒(AMV,33nt)二级结构示意图。左图为最小自由能二级结构,右图为其质心二级结构。
图8显示了自设计的HTB020二级结构示意图。左图为最小自由能二级结构,右图为其质心二级结构。
图9显示了自设计的HTB021二级结构示意图。左图为最小自由能二级结构,右图为其质心二级结构。
图10显示了自设计的HTB022二级结构示意图。左图为最小自由能二级结构,右图为其质心二级结构。
图11显示了自设计的HTB023二级结构示意图。左图为最小自由能二级结构,右图为其质心二级结构。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次开发了一种能增强目的基因表达的5'UTR结构。发明人基于RNA结构预测,设计出一系列的 5'UTR结构,转录制备的mRNA在转染体外培养的293T细胞后,都表现出比对照globin的5'UTR更高的翻译表达效率,因而能增强目的基因的表达。本发明的5'UTR结构可应用于mRNA疫苗领域和mRNA治疗等领域,以较少的 mRNA的制备用量和费用即可获得需要的效果,有利于降低工业化生产成本和时间成本。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
众所周知的,核酸或者多聚核苷酸包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA),本发明在说明核酸序列时,RNA和DNA序列是可以互换的。本发明所指的核酸一般是指RNA,特别是指mRNA。
如本文所用,术语“5'UTR”的含义包括mRNA上的5'UTR区结构或该结构对应于DNA模板上的编码序列。
如本文所用,术语“3'UTR”的含义包括mRNA上的3'UTR区结构或该结构对应于DNA模板上的编码序列。
如本文所用,术语“polyA尾”的含义包括mRNA上的polyA尾区结构或该结构对应于DNA模板上的编码序列。
本发明的5'UTR元件
如本文所用,术语“本发明的5'UTR结构”、“能增强目的基因表达的 5'UTR结构”、“本发明的5'UTR”、“人工设计的5'UTR”、“5'UTR元件”等可互换使用,均指经发明人大量筛选后获得的可增强目的基因表达的5'UTR元件,具有选自下组的序列:如SEQ ID NO:10-13所示的核苷酸序列或其衍生序列。
应理解,本发明的5'UTR元件一般位于DNA模板上,是指所述DNA模板的转录本mRNA上对应的5'UTR区的编码序列。通过将本发明的5'UTR元件引入DNA 模板,可以实现对mRNA的从头设计。本发明5'UTR元件可以用于mRNA治疗、 mRNA疫苗和个性化免疫治疗的mRNA分子结构和DNA分子模板设计,以提高翻译效率,增强目的基因的表达量。
本发明的DNA模板
如本文所用,术语“本发明的DNA模板”、“DNA模板”、“模板链”、“模板”等可互换使用,均指本发明第二方面中所述的DNA模板。
典型地,本发明的DNA模板具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 (I)
其中,Z1~Z7如上所述。应理解,Z3为所述DNA模板的转录本mRNA上对应的5'UTR区的编码序列;Z5为所述DNA模板的转录本mRNA上对应的3'UTR区的编码序列;Z6为所述DNA模板的转录本mRNA上对应的polyA尾区的编码序列。
一种代表性的DNA模板的结构示意图如图2所示。
本发明的mRNA
如本文所用,术语“本发明的mRNA”指本发明第三方面中所述的mRNA。
典型地,本发明的mRNA具有式II结构:
X1-X2-X3-X4-X5 (II)
其中,X1~X5如上所述。
应理解,适合用本发明的mRNA表达的蛋白或多肽没有特别限制,包括抗原蛋白或抗原肽,或其他有用的蛋白。在本发明中,可将外源蛋白的ORF置于本发明的 mRNA之中,从而实现高效的表达。
免疫原
应理解,适合用本发明的mRNA表达的免疫原没有特别限制,包括抗原蛋白或抗原肽。优选地,所述免疫原选自下组:肿瘤相关抗原或其抗原表位、肿瘤特异性抗原或其抗原表位,或其组合。其中,所述肿瘤特异性抗原包括但不限于:肿瘤新生抗原或其抗原表位。
试剂盒及其用途
本发明还提供一种用于增强目的基因表达的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)一种质粒,所述质粒含有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR元件;和
(b)一说明书,所述说明书描述了利用所述质粒进行体内转录或体外转录获得mRNA并在合适的宿主细胞中翻译表达的方法。
当进行体外转录时,说明书中记载了利用所述质粒进行体外转录获得mRNA,并用所述mRNA转染宿主细胞的方法,其中所述mRNA可选地经过纯化和/或修饰,相应的纯化和/或修饰方法也记载于说明书中;当进行体内转录时,说明书中描述了检测所述宿主细胞中是否已成功导入所述质粒的方法,还描述了检测所述宿主细胞基因组中是否已成功整合有如本发明第二方面所述的DNA模板或如本发明第一方面所述的5'UTR元件的方法。
在另一优选例中,所述说明书中还可记载检测所述宿主细胞中目的基因表达的方法。
mRNA疫苗组合物或制剂及施用方法
本发明提供一种mRNA疫苗组合物或制剂在预防和/或治疗肿瘤方面中的用途。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。本发明的药物组合物或药盒含有本发明的mRNA疫苗组合物、其他肿瘤药物,以及它们药学上可接受的载体。
如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料,它们适合于人体或动物使用,而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和,而不明显降低药效。
应理解,在本发明中,所述的药学上可接受的载体没有特别的限制,可选用本领域常用材料,或用常规方法制得,或从市场购买得到。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
在本发明的一个优选例中,所述的组合物或制剂的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
在本发明的一个优选例中,所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
代表性地,所述的组合物或制剂的剂型为片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球或膜剂。
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物制剂还可与其他协同治疗剂一起使用(包括之前、之中或之后使用)。使用药物组合物或制剂时,是将安全有效量的药物施用于所需对象(如人或非人哺乳动物),所述安全有效量通常至少约10 微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
5'UTR优化策略
设计和选择使用的5'UTR结构,对于确保其后编码的目的蛋白基因的表达非常重要,比如对于一些编码抗原的基因的表达,目的基因的高表达才足以使机体获得有效免疫力。因此,5'UTR的优化尤为重要。
在mRNA疫苗领域,主要有三个方法来优化5'UTR结构,第一是使用要表达的目的基因自身的5'UTR结构;第二是简单地使用高表达的人源基因的 5'UTR结构,比如使用人globin(珠蛋白)基因的5'UTR结构;第三就是人工设计序列,有基于人源基因组学和转录组学的筛选,也有基于RNA结构预测的,如最低能量结构预测。
本发明的5'UTR结构经一系列设计与优化后,其序列无复杂二级结构,呈环状或者环状加一个短茎状结构,能有效提高目的基因的表达。
构建本发明5'UTR的方法
在一个优选的实施例中,本发明的5'UTR可通过以下方法构建获得,所述方法包括步骤:
(a)以目的基因为模板,通过PCR扩增构建待优化的5'URT并将其融合于目的基因上游;
(b)回收所述PCR扩增最后一轮的PCR产物,从而获得含有待优化的5'URT 的待测载体;
(c)制备所述待测载体的mRNA,并将其与模式表达载体的mRNA分别在相同条件下转染合适的宿主细胞,其中所述模式表达载体的mRNA作为阳性参照;
(d)检测所述阳性参照和所述待测载体的mRNA的荧光表达强度,计算出待优化的5'URT的荧光强度相对值D1,D1=(待测载体的mRNA荧光强度均数-空白组均数)/(阳性参照荧光强度均数-空白组均数)*100%;
若E1≤1,则继续进行后续的优化步骤;
若E1>1,则任选地进行后续的优化步骤;和
(e)将来源于苜蓿嵌合病毒(AMV)的5'UTR序列的部分,取其33个碱基,在其后面融合待优化的5'URT来源的短茎状结构,并在此基础上对序列进行局部碱基优化,最终设计并获得无复杂二级结构并呈环状或者环状加一个短茎状结构的优化5'URT,即为本发明的5'URT。
在另一优选例中,(a)中所述PCR扩增通过三轮PCR实现待优化的5'UTR的融合。
在另一优选例中,(a)中所述PCR扩增使用的引物选自下组:5'端引物、3'端引物、用于引入启动子的上游引物,或其组合。
在另一优选例中,所述三轮PCR的3'端引物均为如SEQ ID NO:7所示的序列。
在另一优选例中,所述三轮PCR的5'端引物依次为引物f3/f2/f1。
在另一优选例中,所述三轮PCR依次向目的基因上游分别使用所述引物 f3/f2/f1进行扩增,后一个PCR反应使用前一个反应的产物为模板。
在另一优选例中,所述5'端引物选自:如SEQ ID NO:1-6所示的序列,或其组合。
在另一优选例中,所述引物f3/f2/f1分别为如SEQ ID NO:1、2、3所示的序列。
在另一优选例中,所述引物f3/f2/f1分别为如SEQ ID NO:4、2、3所示的序列。
在另一优选例中,所述引物f3/f2/f1分别为如SEQ ID NO:5、2、3所示的序列。
在另一优选例中,所述引物f3/f2/f1分别为如SEQ ID NO:6、2、3所示的序列。
在另一优选例中,所述三轮PCR完成后还进行两轮相同的PCR扩增,分别使用如SEQID NO:8或9所示的序列作为上游引物,下游引物都是使用如SEQ ID NO:7所示的序列。
本发明的主要优点包括:
1.使用本发明的5'UTR结构,可以促进其下游的编码基因序列在细胞水平和体内的高效表达,这种高效表达包括但不限于人体细胞。
2.本发明的对序列的设计方法,参考设计后序列的二级结构反馈,操作比较简单。而对mRNA的二级结构序列预测,目前已经有多种软件和方法,比较成熟,易于实现。
3.对设计后5'UTR的效果评价,本发明人也建立了平台性的方法,高通量且高效率,能快速得到结果。
4.本发明的5'UTR结构不仅能增强目的基因的表达,还能维持较高的 mRNA稳定性,保持90%以上的mRNA-LNP细胞转染率。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料、试剂与耗材
所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到:
含有红色荧光蛋白mcherry的编码基因序列(金斯瑞生物科技有限公司合成);载体pcDNA3.1;实施例1表1中的各个引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成);PCR扩增高保真酶(Takara的PrimeSTAR Max Premix, code No.R045Q);人globin的5'UTR和3'UTR;PCR仪;PCR回收试剂盒(生工生物公司(上海)有限公司);限制性内切酶SacI和SacII;T4DNA连接酶;无内毒质粒抽提试剂盒;BamHI酶;恒温水浴锅;胶回收试剂盒;紫外分光光度计;灭菌水;PrimeSTAR Max Premix;RNase free H2O;Transcription Buffer;CTP/GTP/ATP/UTP;T7 RNA Polymerase Mix;移液器;离心机;RNA纯化试剂盒;氯化锂;70%乙醇;RNase free H2O;超低温冰箱;Capping Reaction Buffer;GTP;SAM;Vaccinia CappingEnzyme;2'-O-Methyltransferase;RNA 聚合酶;T7 Reaction Buffer;T7 NTP/ARCA;涡旋震荡仪;T7 Enzyme Mix;电泳仪;HEK293T细胞;Lipo8000转染试剂(碧云天,产品编号C0533);无血清DMEM;SpectraMax酶标仪;裂解液等。
方法概述
本实施以表达红色荧光蛋白的mcherry基因作为模板,经过酶切线性化、体外转录和加帽纯化制备其mRNA。转染细胞后,通过测量红色荧光的强度,来比较和评判使用不同5'UTR结构对mRNA翻译表达量的影响。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1.UTR翻译效率评价体系构建
本研究在评价设计的UTR结构之前,先建立了UTR翻译效率的评价体系,流程图如图1所示,具体操作在后续实施例中也分别详列。
构建的mRNA分子及其模板,如图2所示,含有T7启动子区、5'UTR区、编码区、3'UTR区和polyA尾区。
使用易于检测的表达红色荧光的mcherry基因作为模式基因,构建了融合不同的5'UTR结构序列,以评判不同的5'UTR序列对其后红色荧光基因翻译表达的效率差别。T7启动子和3'UTR及polyA序列都是固定的,其中3'UTR本发明人选择使用HBB(β-globin)。
本发明人先构建了常用的高表达或稳定表达的globin的5'UTR的结构,选择BNT162b2新冠mRNA疫苗的5'UTR作为对照,对翻译表达效率做出评价,检测两组5'UTR的mcherry荧光强度,计算出相对于HBB组的mcherry荧光强度比例。
结果如图3所示,成功检测到BNT162b组的mcherry荧光强度,并计算出相对荧光强度比例,确定了使用人的β-globin基因的5'UTR作为评价体系的对照的翻译效率评价体系。
实施例2.表达载体构建
(1)含有红色荧光蛋白mcherry的编码基因序列,由金斯瑞生物科技有限公司合成,将其克隆至载体pcDNA3.1,使用人globin的5'UTR和3'UTR并含有polyA尾。在polyA尾前后含有限制性内切酶,以方便克隆和线性化。
以此globin的UTR为对照,比较评判不同5'UTR结构的翻译表达效率。
(2)同时,也以此mcherry基因为模板,采用PCR扩增的策略,使用4组不同的引物(引物组#1-#4)不断向5'端延伸,形成4个分别具有不同5'UTR结构的序列,也插入pcDNA3.1载体。
每个引物组设计了三条特异性的5'端引物(例如引物组#1的三条特异性5' 端引物即为表1中的1f3、1f2、1f1;其他的引物类似地表示,引物序列可能使用与前一组相同的,以前一组的名称表示),其上游再设计两条引物Upper1、 Upper2用于引入T7启动子序列,而3'端引物Rev共用(两条上游引物与3'端引物归于表1中的非特异性引物组)。
引物序列如表1所示:
表1
/>
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR扩增高保真酶选用 Takara的PrimeSTAR Max Premix(code No.R045Q)。
(3)通过连续PCR反应的方式,合成融合到mcherry基因上游的5'UTR。
PCR反应体系如表2:
表2
PCR反应条件设置:
反应的引物设置:
欲将设计的5个UTR结构分别融合到mcherry基因的序列上,需要分别通过三轮PCR来扩增并实现5'UTR的融合。三轮扩增3'端引物(即表2中的 Primer 2)都使用表1中的Rev(TTTTTCCGCGGTTCGCAATG)引物,而5'端引物(即表2中的Primer 1)依次向上游分别使用各自的引物f3/f2/f1依次扩增,后一个PCR反应使用前一个反应的产物为模板。
经过三轮扩增后,构建出5个不同的UTR序列,最后通过两轮相同的PCR 扩增,分别使用表1中的上游引物Upper2和Upper1,用于引入T7启动子序列,下游引物都是使用表1中的Rev。
使用市售的PCR回收试剂盒(如生工生物公司(上海)有限公司的PCR回收试剂盒)按照说明书回收扩增到的最后一轮的PCR产物。
回收的PCR产物片段和质粒载体分别用限制性内切酶SacI和SacII进行双酶切后,分别用PCR回收试剂盒回收片段和载体。
然后用T4 DNA连接酶连接片段和载体,筛选构建到了5个不同UTR结构的mcherry表达载体,并经测序验证无误。
实施例3.质粒的线性化酶切和回收
经过验证的质粒,使用市售无内毒质粒抽提试剂盒进行抽提。
使用质粒上mcherry基因polyA尾巴后的限制性内切酶进行质粒的单酶切。在此,发明人使用BamHI酶切10μg的抽提的质粒,37℃温浴过夜后,使用胶回收试剂盒回收线性化的质粒。
紫外分光光度法测定回收的线性化质粒的浓度。
实施例4.体外转录和纯化回收
(1)将除T7 RNA Polymerase Mix外的组分振荡混匀,短暂离心收集于管底,冰上储存备用。若要同时进行多个反应体系的制备,可提前预混一管Master mix(10×ReactionBuffer+NTP)后再分装10μL到每个反应管中。
(2)室温下,按表3制备反应体系:
表3
(3)用移液器轻柔混匀各组分,并短暂离心收集,于37℃孵育2h。
(4)可以使用市售多种RNA纯化试剂盒纯化,也可以使用氯化锂纯化法进行纯化。
(5)向20μL反应混合物中,加入30μL RNase free H2O和30μL 7.5M氯化锂。
(6)混合均匀后,置于-20℃至少30min后,以最大转速,4℃离心15min,收集沉淀。
(7)加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。以最大转速,4℃离心 10min,小心吸弃上清保留沉淀。室温干燥约10分钟。
(8)用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
实施例5.加帽反应和回收
本步骤适用于20μL反应体系中10μg以内的RNA的加帽和2'-O甲基化一步反应,且可根据实验需要放大。本反应将未加帽RNA与Vaccinia Capping System和2'-O-Methyltransferase共孵育,Vaccinia Capping System首先将RNA 5'末端加帽,随后2'-O-Methyltransferase将其甲基化得到Cap 1RNA。
(1)取10μg RNA至1.5mL离心管中,使用RNase-Free Water稀释至14 μL。
(2)65℃加热5min。
(3)将加热后的离心管放置冰上5min。
(4)按如表4的顺序加入以下组分:
表4
组分 | 体积 |
经上述处理后的变性RNA | 14μL |
10×Capping Reaction Buffer | 2μL |
GTP(10mM) | 1μL |
SAM(2mM,32mM母液稀释) | 1μL |
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μL) | 1μL |
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase(50U/μL) | 1μL |
(5)37℃孵育1h。用试剂盒或者LiCl法纯化。
实施例6.共转染加帽法
(1)化冻试剂,RNA聚合酶放置在冰上。将10×T7 Reaction Buffer和2×T7 NTP/ARCA涡旋震荡直到完全溶解。当完全溶解后,将2×T7 NTP/ARCA放置冰上,将10×T7Reaction Buffer放置在室温。所有试剂使用前短暂离心,使溶液都集中在管底。
(2)在室温下如表5配制反应液到RNase free的PCR管里:
表5
组分 | 体积(μL) |
RNase free H2O | 补充至总体积20μL |
T7 2×NTP/ARCA | 10μL |
10×T7 Reaction Buffer | 2μL |
线性化模板DNA | 1μg |
T7 Enzyme Mix | 2μL |
(3)充分混匀后,短暂离心使集中在管底。
(4)37℃温育2hr。
(5)可以使用市售多种RNA纯化试剂盒纯化,也可以使用氯化锂纯化法进行纯化。本实施采用LiCl法沉淀纯化。
(6)向20μL反应混合物中,加入30μL RNase free H2O和30μL 7.5M氯化锂。
(7)混合均匀后,置于-20℃至少30min后,以最大转速,4℃离心15min,收集沉淀。
(8)加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。以最大转速,4℃离心 10min,小心吸弃上清保留沉淀。室温干燥约10分钟。
(9)用20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。
实施例7.浓度测定和纯度分析
使用紫外吸收法来对RNA进行定量,经过纯化的RNA,通过测定其A260 读数来确定RNA的产量。对于单链RNA,1A260相当于40μg/mL,所以RNA 的产量可以如下计算:A260×稀释倍数×40=μg/mL RNA。
通过变性胶电泳来初步确定mRNA样品的纯度。使用HPLC来更精准的测定mRNA的纯度。
实施例8.细胞的培养和转染
本实验将制备的mRNA转染人源的细胞系,用于检测不同5'UTR结构的 mCherry在细胞内的荧光表达强度。本实验选择HEK293T细胞,使用碧云天的 Lipo8000转染试剂(产品编号C0533)。
(1)接种细胞:复苏培养的293T细胞,在转染前一天,待细胞长至70%~80%汇合度时,按照每孔20万细胞接种至24孔板培养;
(2)换液:待细胞汇合度达到70%~80%时,把培养有细胞的每孔更换成500 μL新鲜培养液。
(3)添加RNA样品:(转染步骤参照Lipo8000转染SiRNA操作步骤)
配制转染液体(以孔为单位):25μL无血清DMEM+0.5μL Lipo8000+0.5 μg mRNA,轻轻混匀,室温静置孵育20min,将包裹完毕的mRNA均匀滴入孔中,并轻轻摇匀24孔板。
(4)继续37℃培养。24hr左右,即可检测荧光的强度。
实施例9.荧光强度的检测和分析
(1)检测荧光细胞预处理:培养24h后,去除孔中培养液,加入裂解液500 μL/孔,低温震摇10min后,4℃静置5min,再低温振摇5min后进行检测;
(2)检测:用SpectraMax酶标仪,每个孔重复检测5次(酶标仪设置为:Read Modes选择“FL”,Read Type选择“Endpoint”,波长设置为指定激发光波长为590nm,信号接收波长为645nm),计算3次读数的均值及变异系数,进行分析,并利用公式,以globin荧光强度为阳性参照,计算相对值:样本校正后读数=(样本读数-空白组均数)/(阳性参照组均数-空白组均数)*100%。
实施例10.UTR序列优化
在实施例9的基础上,发明人进一步进行了序列设计、优化与筛选,获得的荧光值高于对照组globin荧光强度的5'UTR,也就是本发明的能增强目的基因表达的5'UTR序列。
发明人通过以下方法构建了一系列5'UTR序列(HTB20-HTB23):将来源于苜蓿嵌合病毒(AMV)的5'UTR序列的部分,取其33个碱基,它是较短序列且无复杂二级结构的序列。本发明人在其后面融合一个globin的5'UTR来源的短茎状结构,并在此基础上对序列进行局部碱基优化,最终设计并获得了一系列 5'UTR序列HTB20-HTB23,这些序列无复杂二级结构,呈环状或者环状加一个短茎状结构。
设计的UTR结构分别如图7-11所示,其中左图均为MFE(最小自由能) 二级结构,右图均为其Centroid(质心)二级结构。
如图7所示,显示了苜蓿嵌合病毒(AMV,33nt)的二级结构。
如图8所示,显示了HTB020二级结构示意图。
如图9所示,显示了HTB021二级结构示意图。
如图10所示,显示了HTB022二级结构示意图。
如图11所示,显示了HTB023二级结构示意图。
获得的HTB20-HTB23序列如表6所示,这些设计序列具有高序列相似性:
表6
如图4所示,设计组HTB20-HTB23的荧光值高于对照组globin的荧光强度,表明设计组HTB20-HTB23比对照组globin的5'UTR具有更高的翻译表达效率。
以上结果说明,设计组HTB20-HTB23的5'UTR序列能有效增加目的基因的表达,相比于对照组,目的基因的表达能提升至约3~5倍。
实施例11.mRNA-LNP的包封
(1)配制1mL 10×LNP。按表7所示配方精准称量LNP各组分分别到一个小离心管。
表7
组分 | 配制1mL 10×LNP用量 |
SM-102 | 0.1062g |
DMG-PEG2000 | 0.0113g |
DSPC | 0.0236g |
胆固醇 | 0.0445g |
用无水乙醇充分溶解以上试剂,定容至2mL,经0.22μm孔径滤膜过滤除菌后,分装,冻存于-20℃备用。
(2)mRNA和LNP包封试剂准备。本实施例以常用包封总体积1.2mL为例叙述,可根据实际需要对各组分进行等比例放大。
将制备的各5'UTR结构的mcherry的mRNA终浓度调整为200ng/μL。
水相制备:取mRNA 266.7μg,加入DEPC水至500μL,再加入等体积的浓度为100mM的柠檬酸钠溶液(pH4.0),使mRNA溶于终浓度50mM的柠檬酸钠溶液中。
醇相制备:取10×LNP 200μL,加入1.8mL无水乙醇并混匀,获得终浓度为 1×的LNP工作液。
(3)mRNA-LNP的包封。可以用多种LNP制备系统进行此操作,本实施例使用迈安纳快速纳米药物制备系统。
开启系统后,插入处方筛选芯片。分别用1mL注射器吸取水相900μL,醇相300μL并将注射器吸头插入芯片对应方位。
在迈安纳快速纳米药物制备系统电脑端设置包封程序:
取两支15mL管分别置于样品架和废液架后,运行包封程序,收集mRNA- LNP样品(约900μL),将样品转移至1.5ml EP管内。弃置废液(约300μL)。
(4)mRNA-LNP超滤。包封完成后的mRNA-LNP需尽快进行超滤换液或者透析换液,本实施例以超滤换液。
离心机预冷至4℃,将mRNA-LNP转移至超滤管内,加入10倍体积的PBS溶液,离心(水平转子3500g,角转子3000g)10-15min至初始体积。重复上步骤两次。
将超滤后的mRNA-LNP分装至1.5mL EP管,保存于4℃(短期至约一周) 或-20℃(约一个月)。
(5)mRNA-LNP的包封率检测和mRNA定量,包封率检测使用Ribogreen染料法,比较mRNA-LNP用去污剂处理前后的荧光强度的变化,与标准曲线比较来定量包封的mRNA的量。
(6)mRNA-LNP转染细胞和荧光检测,参照实施例8和实施例9中进行。需注意的是,细胞转染时,根据mRNA-LNP包封率检测的mRNA浓度,来确定使用相同量的mRNA的mRNA-LNP的体积。转染时直接在细胞里加入确定质量(一般为0.5μg)的mRNA-LNP。
如图5所示,设计组HTB20-HTB23的mRNA-LNP细胞转染率均能达到 90%以上,与对照组的转染率基本无差距,表明本发明的5'UTR序列在能增强目的基因表达的同时,也不会对mRNA-LNP细胞转染率造成不利的影响, mRNA的稳定性高。
如图6所示,使用高转染效率的mRNA-LNP系统后,再一次验证了与globin 的对比,各5'UTR的翻译效果,设计组HTB20-HTB23的翻译效果达到了对照组的约4~6倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海惠盾生物技术有限公司
<120> 人工优化设计的5'UTR序列提高外源基因的翻译表达
<130> P2022-1076
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物1f3
<400> 1
ccatcttctg gtccccacag actcagagag aacccgccac c 41
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物1f2
<400> 2
tttaattttc tttcaaatac ttccatcttc tcctccccac aca 43
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物1f1
<400> 3
taatacgact cactataggg tgcccatagg aattgctctc aaaaaactgg ac 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物2f3
<400> 4
ccatcttctc ctccccacac actcagaaga acccgccacc atggtgagca ag 52
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物3f3
<400> 5
ccatcttctc ctccccacac actcacaaca acccgccacc atggtgagca ag 52
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物4f3
<400> 6
ccatcttctg gtccccacag actcagaaga acccgccacc atggtgagca ag 52
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Rev
<400> 7
tttttccgcg gttcgcaatg 20
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Upper2
<400> 8
cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact atagg 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Upper1
<400> 9
cagagctctc tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttat 45
<210> 10
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5'UTR序列HTB20
<400> 10
tttttatttt taattttctt tcaaatactt ccatcttctg gtccccacag actcagagag 60
aacccgccac c 71
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5'UTR序列HTB21
<400> 11
tttttatttt taattttctt tcaaatactt ccatcttctc ctccccacac actcagaaga 60
acccgccacc 70
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5'UTR序列HTB22
<400> 12
tttttatttt taattttctt tcaaatactt ccatcttctc ctccccacac actcacaaca 60
acccgccacc 70
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5'UTR序列HTB23
<400> 13
tttttatttt taattttctt tcaaatactt ccatcttctg gtccccacag actcagaaga 60
acccgccacc 70
Claims (10)
1.一种5'UTR元件,其特征在于,所述5'UTR元件具有选自下组的序列:如SEQ ID NO:10-13所示的核苷酸序列或其衍生序列,
其中,所述衍生序列是指对上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)核苷酸并能保留增强目的基因的表达能力的衍生序列。
2.一种DNA模板,其特征在于,所述DNA模板包含如权利要求1所述的5'UTR元件。
3.一种mRNA,其特征在于,所述mRNA为如权利要求2所述的DNA模板的转录本。
4.一种表达载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求2所述的DNA模板或如权利要求3所述的mRNA。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有如权利要求4所述的载体或如权利要求3所述的mRNA,或其基因组中整合有如权利要求2所述的DNA模板或如权利要求1所述的5'UTR元件。
6.一种构建如权利要求3所述的mRNA的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(i)提供如权利要求1所述的5'UTR元件,将所述5'UTR元件融合到目的基因编码序列的上游,并构建一含有如权利要求2所述DNA模板的载体;
(ii)将(i)中获得的载体酶切线性化获得所述DNA模板,并进行转录,从而获得所述mRNA;和
(iii)任选地,对步骤(ii)中获得的所述mRNA进行纯化和/或修饰。
7.一种产生如权利要求3所述的mRNA的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(a)在适合的条件下,培养如权利要求5所述的宿主细胞,从而获得一载体的培养物,其中所述载体含有如权利要求2所述的DNA模板;
(b)从(a)中获得的所述培养物中分离和/或回收所述载体,并酶切线性化获得所述DNA模板;
(c)将(b)中获得的所述DNA模板进行转录,从而获得所述mRNA;和
(d)任选地,对步骤(c)获得的所述mRNA进行纯化和/或修饰。
8.一种mRNA疫苗的制备方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(i)提供一种用于表达免疫原的mRNA,所述mRNA为如权利要求3所述的mRNA,或通过如权利要求6或7所述的方法获得;和
(ii)将(i)中所述优化mRNA与药学上可接受的载体混合,从而获得所述mRNA疫苗。
9.一种mRNA疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物含有:
(a)用于表达免疫原的mRNA,所述mRNA为如权利要求3所述的mRNA,或通过如权利要求6或7所述的方法获得;和
(b)药学上可接受的载体。
10.一种提高目的基因表达的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(a)提供一种高表达元件,所述高表达元件包含选自下组的成分:如权利要求1所述的5'UTR元件、如权利要求2所述的DNA模板、如权利要求3所述的mRNA,或如权利要求4所述的载体;和
(b)在合适的条件下,将(a)中所述高表达元件导入一宿主细胞,使所述宿主细胞含有如权利要求4所述的载体或如权利要求3所述的mRNA,或其基因组中整合有如权利要求2所述的DNA模板或如权利要求1所述的5'UTR元件,从而提高所述宿主细胞中目的基因的表达。
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