JPWO2006013859A1 - 酵母プロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
A)酵母の転写プロモーター活性を有するDNA断片であって、配列番号1に記載されるDNA配列の全部またはその3’側末を含む一部の配列、または配列番号1に記載されるDNA配列の全部またはその3’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるDNA配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、DNA断片。
S. cerevisiae S288C株ゲノムDNAを鋳型、合成DNA(HA023):ATAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG(配列番号11)および合成DNA(HA024):TATGGGATTATATTGTTATTAGGTATGCTTTGAGA(配列番号12)をプライマーとして、Pwo DNAポリメラーゼ(ロッシュ社)を用いたPCR(1st PCR)を行った。1st PCRは、94℃で15秒間、47℃で30秒間、72℃で45秒間の3ステップからなるサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件で行った。この1st PCRにより、アガロースゲル電気泳動上約0.83kbpの大きさと考えられる位置に確認される1st PCR産物を切り出した。
実施例1でクローニングした領域の塩基配列は、pKHA030を鋳型、CEQ DTCS-Quick Start Kit(ベックマンコールター社)を用いたPCRを行い、CEQ2000XL塩基配列読み取り装置(ベックマンコールター社)を用いて、サンガーの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)に従って決定した。
本発明者らは、酵母S. cerevisiae S288C株ゲノムDNAにおける本発明のプロモーター領域(820bp)よりさらに580bpを加えた5'上流まで範囲を取り、この1400bpを5'上流側から断片化することを試みた。ここで、ゲノムDNA上での本発明プロモーターの遺伝子産物翻訳が始まる地点(AUGコドンのA)をゼロ点とし、これより上流に位置するプロモーター領域(820bp)を-820bpとする(配列番号5;配列番号1のDNA配列中、581番目から1400番目に相当)。以下の各DNA断片の調製を実施例1及び実施例2に示した方法と同様に行い(図2)、rHSA発現プラスミド(表1)をそれぞれ構築した:-1400bp(配列番号1のDNA配列;1番目から1400番目に相当);-1258bp(配列番号2;配列番号1のDNA配列中、143番目から1400番目に相当);-1100bp(配列番号3;配列番号1のDNA配列中、301番目から1400番目に相当);-950bp(配列番号4;配列番号1のDNA配列中、451番目から1400番目に相当);-650bp(配列番号6;配列番号1のDNA配列中、751番目から1400番目に相当);-500bp(配列番号7;配列番号1のDNA配列中、901番目から1400番目に相当);-350bp(配列番号8;配列番号1のDNA配列中、1051番目から1400番目に相当);-200bp(配列番号9;配列番号1のDNA配列中、1201番目から1400番目に相当);-50bp(配列番号10;配列番号1のDNA配列中、1351番目から1400番目に相当)及び-0bp。
プラスミドpKHA030、および、実施例3にて構築したrHSA発現プラスミドを、Hinnenらの文献に記載の方法によって、S. cerevisiae株(cir0 a,leu2-3,leu2-112,can1,pra1,yap3,hsp150)に導入した。形質転換体を、ロイシンを欠いている緩衝最小寒天培地(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15%(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5%(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、2%(w/v)スクロース、および1%(w/v)バクトアガー)上で選択した。
得られた形質転換体を緩衝最小液体培地(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15%(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5%(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、2%(w/v)スクロース)10mLを含む50mLフラスコで30℃、200rpmで96時間培養し、rHSA発現量をロケット免疫電気泳動にて評価した。まず、培養液(N=5)の遠心分離を行い、それぞれ上清を回収した。これらの上清4μLを抗ヒトアルブミン抗体(シグマ社)を含む1.0%(w/v)アガロースゲルに供給し、電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(R-250)で染色し、得られたロケット様のピークの高さから各培養上清中のrHSA濃度を比較した。
実施例4にて得られた形質転換体を緩衝最小液体培地(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15%(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5%(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、2%(w/v)スクロース)10mLを含む50mLフラスコで30℃、200rpmで培養し、72時間後の酵母菌体を回収した。回収した菌体からRNeasy Mini Kit(キアゲン社)を用いて全RNAを抽出し、同時にDNase処理も行った。
Claims (11)
- 酵母の転写プロモーター活性を有するDNA断片であって、配列番号1に記載されるDNA配列の全部またはその3’側末を含む一部の配列、または配列番号1に記載されるDNA配列の全部またはその3’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるDNA配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、DNA断片。
- 当該DNA配列の一部が、少なくとも配列番号1のDNA配列の3’末から650bpまでのDNA配列(配列番号6)を含む配列である、請求項1に記載のDNA断片。
- 当該DNA配列の一部が、少なくとも配列番号1のDNA配列の3’末から820bpまでのDNA配列(配列番号5)を含む配列である、請求項1または2に記載のDNA断片。
- 当該DNA配列の一部が、少なくとも配列番号1のDNA配列の3’末から950bpまでのDNA配列(配列番号4)を含む配列である、請求項1から3のいずれかに記載のDNA断片。
- 当該DNA配列の一部が、少なくとも配列番号1のDNA配列の3’末から1100bpまでのDNA配列(配列番号3)を含む配列である、請求項1から4のいずれかに記載のDNA断片。
- 当該DNA配列の一部が、少なくとも配列番号1のDNA配列の3’末から1258bpまでのDNA配列(配列番号2)を含む配列である、請求項1から5のいずれかに記載のDNA断片。
- 請求項1から6のいずれかに記載のDNA断片と、その下流に外来タンパク質をコードする遺伝子とを含んでなる組換えDNA断片。
- 請求項7に記載の組換えDNA断片を含む発現プラスミド。
- 請求項7に記載の組換えDNA断片または請求項8に記載の発現プラスミドによって形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が酵母である、請求項9に記載の宿主細胞。
- 請求項9または10に記載の宿主細胞を培養し、ついで培養物から外来タンパク質を回収することを含む、外来タンパク質の生産方法。
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