KR20070058467A

KR20070058467A - 효모 프로모터

Info

Publication number: KR20070058467A
Application number: KR1020077004760A
Authority: KR
Inventors: 아키히로 메타; 요 나카하라; 히로푸미 히구치
Original assignee: 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-02
Publication date: 2007-06-08
Also published as: JP4819683B2; AU2005268221A1; US20080064061A1; EP1788084A4; CN101035895A; CA2575714A1; EP1788084A1; JPWO2006013859A1; WO2006013859A1

Abstract

효모에서 강력한 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편을 제공한다. 효모의 전사 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편으로서, 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 함유하는 일부 서열, 또는 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 함유하는 일부 서열과 상보적인 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열로서 해당 전부 또는 일부 서열의 전사 프로모터 활성을 보유하는 서열을 가지는, DNA 단편; 이 DNA 단편과 그의 하류에 외래 단백질을 코팅하는 유전자를 함유하여서 이루어진 조환 DNA 단편으로부터 구서오디는 발현 플라즈미드; 상기 조환 DNA 단편 또는 상기 발현 플라즈미드에 의해 형질전환된 효모 등의 숙주 세포; 및 상기 숙조 세포를 배양하고, 배양물로부터 외래 단백질을 얻는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 효모를 숙주로 하는 이종 유전자 발현계에서 이용될 수 있는, 강력한 프로모터가 제공된다.

Description

효모 프로모터{Yeast Promoter}

본 발명은 신규한 효모 프로모터에 관한 것이다. 더 구체적으로는 전사 프로모터 활성을 가지는 신규한 DNA 서열, 이 서열을 함유하는 발현 벡터, 및 조환 단백질, 예를 들어 이종 단백질 생산을 위한 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 DNA 서열을 함유하는 조환 세포에도 관한 것이다.

최근, 유전자 공학의 기술을 효모에 응용함으로써, 의약품이나 식품 등의 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 효모주의 제조를 연구하고 있다. 이종 단백질을 생산하기 위해, 이에 대응하는 이종 유전자를 사카로미세스속의 효모, 특히 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae, 이하 「S. cerevisiae」로 약기한다)에 도입하는 기술은 알려져 있다. S. cerevisiae 세포 내에서 이종 유전자(게놈 DNA, cDNA를 포함한다)를 발현할 때, 그 상류에 효모 내에서 발현 가능한 「프로모터」를 연결할 필요가 있다.

프로모터로서는 목적으로 하는 단백질을 효모 내에서 대량으로 발현시키는 것이 바람직하며, 현재까지 몇몇 강력한 프로모터가 알려져 있다. 예들 들어, S. cerevisiae의 프로모터로서 강한 발현량을 나타내는 것으로 알려져 있는 3-포스포글리세레이트키나제(PGK1) 유전자의 프로모터(비특허문헌 1)나 번역신장인자(TEF1) 의 프로모터(비특허문헌 2) 등이 효모에서의 이종 유전자 발현에 사용된다.

비특허문헌 1: Ogden 등, 1986, Mol. Cell. Biol., 6(12), p. 4335-4343

비특허문헌 2: Cottrelle 등, 1985, J. Biological Chemistry, 260(5), p. 3090-3096

[발명의 개시]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

본 발명의 목적은 효모를 숙주로 하는 이종 유전자 발현계에서 이용 가능한 종래의 프로모터보다 더 강력한 프로모터를 제공하는 데 있다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자들은 상기 과제를 해결하고자, S. cerevisiae의 유전자 발현 상황에 대해, 예의 검토한 결과, S. cerevisiae 염색체로부터 강력한 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 취득하는 데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 효모의 전사 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편으로서, 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열, 또는 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열과 상보적인 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열로서 해당 전부 또는 일부 서열의 전사 프로모터 활성을 보유하는 서열을 가지는, DNA 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 DNA 서열과 그의 하류에 위치하는 외래 유전자를 포함하여 구성되는 발현 플라즈미드에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 발현 플라즈미드에 의한 형질 전환에 의해 취득한 형질전환체에 관한 것이다. 추가로 또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고, 이어서 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 하기 A) 내지 K)의 발명을 포함하는 것이다.

A) 효모의 전사 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편으로서, 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열, 또는 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열과 상보적인 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열로서 당해 전부 또는 일부 서열의 전사 프로모터 활성을 보유하는 서열을 가지는, DNA 단편.

B) 상기 A)에서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 650 bp까지의 DNA 서열(서열번호 6; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 751 번째로부터 1400 번째에 상당)을 함유하는 서열인, DNA 단편.

C) 상기 A) 또는 B)에서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서여의 3' 말단에서 820 bp까지의 DNA 서열(서열번호 5; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 581 번째로부터 1400 번째에 상당)을 포함하는 서열인, DNA 단편.

D) 상기 A) 내지 C) 중 어느 하나에서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 950 bp까지의 DNA 서열(서열번호 4; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 451 번째로부터 1400 번째에 상당)을 포함하는 서열인, DNA 단편.

E) 상기 A) 내지 D) 중 어느 하나에서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 1100 bp까지의 DNA 서열(서열번호 3; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 301 번째로부터 1400 번째에 상당)을 포함하는 서열인, DNA 단편.

F) 상기 A) 내지 EE) 중 어느 하나에서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 1258 bp까지의 DNA 서열(서열번호 2; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 143 번째로부터 1400 번째에 상당)을 포함하는 서열인, DNA 단편.

G) 상기 A) 내지 F) 중 어느 하나에 기재한 DNA 단편과 그의 하류에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하여 이루어진 조환 DNA 단편.

H) 상기 G)에 기재한 조환 DNA 단편을 포함하는 발현 플라즈미드.

I) 상기 G)에 기재한 조환 DNA 단편 또는 상기 H)에 기재한 발현 플라즈미드에 의해 형질전환된 숙주 세포.

J) 상기 I)에서, 숙주 세포가 효모인 숙주 세포.

K) 상기 I) 또는 J)에 기재한 숙주 세포를 배양하고, 이어서 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 외래 단백질의 생산 방법.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명의 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편은 서열번호 1에 제시된 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부의 서열로 표시된다. 이 DNA 단편은 효모에서 NCE102 유전자의 해독틀(reading frame) 상류에 위치하고, 프로모터 영역을 포함하는 것이다.

본 발명에 의한 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편은 서열번호 1로 표시되는 서열에 더해, 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 650 bp까지의 DNA 서열(서열번호 6)을 포함하는 서열이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 의한 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편은 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 820 bp까지의 DNA 서열(서열번호 5)을 포함하는 서열이다.

추가로, 본 발명에 의한 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편으로서는 서열번호 1로 기재되는 DNA 서열 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열과 상보적인 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열로서 당해 전부 또는 일부 서열의 전사 프로모터 활성을 보유하는 서열도 포함한다. 이와 같은 서열에는 서열번호 1의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 포함하는 일부 서열 중의 염기 모두에 대해 결실, 치환, 및 부가, 및 이들의 조합이 존재하지만, 그의 프로모터 활성을 보유하는 서열도 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 「하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열」이란 가혹한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 「프로모터」란 숙주 세포 중에서 구조 유전자에 연결될 때, 그의 구조 유전자에 관해, 그의 프로모터가 존재하지 않는 조건하의 전사, 번역, 또는 mRNA의 안정성을 증대하는 임의의 DNA 서열을 의미한다. 또한, 「외래 유전자」란 그의 유전자가 특정 생물에 유래하는가 아닌가를 묻지 않고, 자연계에는 특정 프로모터와 기능적으로 공존하지 않는 임의의 유전자를 의미한다. 추가로, 본 명세서에서, 「DNA」, 「유전자」, 및 「유전자 DNA」로 칭하는 용어를 실질적으로 동의 용어로서 사용한다.

본 발명의 상기 효모 프로모터를 함유하는 DNA 단편은 관용되는 핵산 합성의 방법에 의해 전체 합성될 수 있다.

본 발명에 의한 프로모터를 함유하는 DNA 단편의 하류에 연결된 외래 유전자(이하, 「프로모터 연결 외래 유전자」로 칭하기도 한다)를 효모에 도입함으로써, 외래 유전자의 발현이 본 발명에 의한 프로모터에 의해 제어되는 효모를 취득할 수 있다.

이 프로모터 연결 외래 유전자를 효모에 도입하는 방법으로서는 예를 들어 Hinnen 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933, 1978)의 문헌에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 프로모터 연결 외래 유전자를 벡터에 조합하여 이것을 효모에 도입하는 방법, 직접 효모에 도입하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 프로모터 유전자를 함유하는 DNA 단편과 그의 하류에 위치하는 외래 유전자를 연결하여 이루어지는 DNA 단편을 함유하는 DNA가 벡터에 연결된 발현 플라즈미드가 제공된다.

발현 플라즈미드 구축을 위해 사용되는 벡터로서는 예를 들어 Hinnen 등의 문헌에 기재되어 있는 효모의 2 ㎛ DNA를 기본으로 한 벡터, 또는 일반적인 효모용 벡터인 YRp계(효모 염색체의 ARS 서열을 복제 기점으로 하는 효모용 멀티 카피 벡터), YEp계(효모의 2 ㎛ DNA의 복제 기점을 가진 멀티 카피 벡터), YCp계(효모 염색체의 ARS 서열을 복제 기점으로서 가지며, 또한 효모 염색체의 센트로메릭(centromeric) DNA 서열을 가진 효모용 싱글 카피 벡터), YIp계(효모의 복제 기점을 가지고 있지 않은 효모 염색체 조합용 벡터) 등을 들 수 있다.

연결되는 외래 유전자는 특히 한정되지는 않지만, 예를 들어 인간 혈청 알부민(이하, 「rHSA」로 약기하기도 한다) 유전자 등을 사용할 수 있다. 연결되는 외래 유전자는 여기에 코딩되는 유전자 산물의 발현을 목적으로 하는 데에 한정되지 않고, 안티센스 RNA에 의한 발현 제어도 그의 목적에 포함된다.

발현 플라즈미드에는 형질전환체 선택을 위한 마커 유전자(예를 들어, LEU2 유전자), 형질전환하는 숙주의 종류에 따른 터미네이터(예를 들어, ADH1 유전자의 터미네이터) 등을 연결할 수 있다.

발현 플라즈미드에 의한 숙주 효모의 형질전환법으로서는 예를 들어 전기천공법을 들 수 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

발현 플라즈미드에 의해 형질전환되는 숙주 효모로서는 예를 들어 S. cerevisiae를 들 수 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 의한 형질전환체를 배양함으로써, 외래 단백질을 발현시키고, 당해 외래 단백질을 제조할 수 있다. 발현할 수 있는 외래 단백질로서는 예를 들어 인간 혈청 알부민, 면역 글로블린 등의 의료 분야에서 유용한 물질 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

도 1-1는 플라즈미드 pKHA030의 구축도,

도 1-2는 플라즈미드 pHKA030의 구축도(계속),

도 2는 NCE102 프로모터를 단편화할 때의 각 영역을 나타내는 도면,

도 3은 NCE102 프로모터와 다른 프로모터를 사용한 rHSA 발현 양에 관한 로케트 면역 전기 영동의 결과를 나타내는 도면,

도 4는 NCE102 프로모터와 다른 프로모터의 HSA-mRNA 양 비를 나타내는 도면,

도 5는 NCE102 프로모터 단편화에 의한 HSA-mRNA 양 비를 나타내는 도면.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 여하히 한정되는 것은 아니다.

《실시예 1: 프로모터의 클로닝과 rHSA 발현 플라즈미드의 구축》

S. cerevisiae S288C 주 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성 DNA(HA023): ATAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG(서열번호 11) 및 합성 DNA(HA024): TATGGGATTATATTGTTATTAGGTATGCTTTGAGA(서열번호 12)를 프라이머로 하여, Pwo DNA 폴리머라제(로슈사)를 사용한 PCR(1st PCR)을 수행하였다. 1st PCR은 94℃에서 15 초간, 47℃에서 30 초간, 72℃에서 45 초간의 3 스텝으로 이루어진 사이클을 30 회 반복하고, 최후에 72℃에서 5 분간 보온하는 조건에서 수행하였다. 이 1st PCR에 의해, 아가로스 겔 전기영동상 약 0.83 kbp의 크기로 생각되는 위치에서 확인되는 1st PCR 산물을 생성하였다.

합성 DNA(HA005):ATGAAGTGGGTTTTCATCGTCTCCATTTTGTTCTTGTTCTCCTCTGCTT ACTCTA(서열번호 13)와 합성 DNA(HA006): GATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAACAAA ATGGAGACGATGAAAACCCACTTCAT(서열번호 14)를 혼합하고, 96℃에서 10 분간 보온한 후, 실온까지 냉각하여 아닐링을 수행하였다.

아닐링을 수행한 합성 DNA 링커 HA005/HA006과 1st PCR 산물을 평활 말단에 서 라이게이션하고, 다음에 이 라이게이션 반응액을 주형으로 하고, 합성 DNA(HA030): ATCCAAAGATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC(서열번호 15) 및 합성 DNA(HA039): AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG(서열번호 16)를 프라이머로 하는 PCR(2nd PCR)을 수행하였다. 2nd PCR은 94℃에서 15 초간, 53℃에서 30 초간, 72℃에서 45 초간의 3 스텝으로 이루어진 사이클을 30 회 반복하고, 최후에 72℃에서 2 분간 보온하는 조건하에 수행하였다. 이 2nd PCR에 의해, 아가로스 겔 전기영동상 약 0.83 kbp의 크기로 생각되는 위치에서 확인되는 2nd PCR 산물을 생성하였다.

정제 2nd PCR 산물을 제한 효소 NotI 및 BglII로 소화하고, 아가로스 겔 전기 영동 상 약 0.90 kbp의 크기로 생각되는 위치에서 확인되는 소화 반응 산물을 생성하였다.

이 소화 반응 산물을 rHSA 발현 플라스미드 pDB2244(WO00/44772호 공보)로부터 유도된 rHSA 발현 플라스미드 pDB2305의 PRB1 프로모터를 함유하는 NotI-BglII 영역과 치환되어, 신규 rHSA 발현 플라스미드 pKHA030을 얻었다.

상술한 본 발명의 프로모터의 클로닝과 rHSA 발현 플라스미드의 구축에 대해 도 1에 제시하였다.

《실시예 2: 프로모터의 염기 서열의 결정》

실시예 1에서 클로닝한 영역의 염기서열은 pKHA030을 주형, CEQ DTCS-Quick Start Kit(벡만 콜터사, Beckman Coulter K.K.)를 이용한 PCR을 수행하고, CEQ2000XL 염기서열 판독 장치(벡만 콜터사)를 이용하여, 상거 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)에 따라 결정하였다.

《실시예 3: 프로모터 영역의 변경》

본 발명자들은 효모 S. cerevisiae S288C 주 게놈 DNA에서 본 발명의 프로모터 영역(820 bp)으로부터 추가로 580 bp를 더한 5' 상류까지 범위를 취해, 이 1400 bp를 5' 상류 측에서 단편화하는 것을 시험하였다. 여기서, 게놈 DNA 상에서 본 발명의 프로모터의 유전자 산물 번역이 시작되는 지점(AUG 코돈의 A)을 제로 점으로 하고, 이곳부터 상류에 위치하는 프로모터 영역(820 bp)을 -8200 bp로 한다(서열번호 5; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 581 번째로부터 1400 번째에 상당). 이하의 각 DNA 단편의 제조를 실시예 1 및 실시예 2에 제시한 방법과 동일하게 수행하고(도 2), rHSA 발현 플라스미드(표 1)를 각각 구축하였다: -1400bp(서열번호 1의 DNA 배열; 1 번째로부터 1400 번째에 상당); -1258 bp(서열번호 2; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 143 번째로부터 1400 번째에 상당); -1100 bp(서열번호 3; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 301 번째로부터 1400 번째에 상당); -950 bp(서열번호 4; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 451 번째로부터 1400 번째에 상당); -650 bp(서열번호 6; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 751 번째로부터 1400 번째에 상당); -500 bp(서열번호 7; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 901 번째로부터 1400 번째에 상당); -350 bp(서열번호 8; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 1051 번째로부터 1400 번째에 상당); -200 bp(서열번호 9; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 1201 번째로부터 1400 번째에 상당); -50 bp(서열번호 10; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 1351 번째로부터 1400 번째에 상당) 및 -0 bp.

rHSA 발현 플라스미드	NCE102 프로모터 영역[bp]
pKHA063	-1400
pKHA065	-1258
pKHA067	-1100
pKHA069	-950
pKHA030	-820
pKHA071	-650
pKHA073	-500
pKHA075	-350
pKHA077	-200
pKHA079	-50
pKHA099	0

《실시예 4: 효모 형질전환체의 취득》

플라스미드 pKHA030, 및 실시예 3에서 구축된 rHSA 발현 플라스미드를 Hinnen 등의 문헌에 기재된 방법에 따라, S. cerevisiae 주(cir⁰ a, leu2-3, leu2-112, canl, pral, yap3, hsp150)에 도입하였다. 형질전환체를 로이신을 없앤 완충 최소한천 배지(아미노산, 황산암모늄을 함유하고 있지 않은 0.15%(w/v) 효모 니트로겐 베이스, 0.5%(w/v) 황산암모늄, 36 mM 시트르산, 126 mM 인산수소이나트륨, pH 6.5, 2%(w/v) 슈크로스, 및 1%(w/v) 박토 아가)상에서 선택하였다.

《실시예 5: rHSA 분비 발현량의 평가》

얻어진 형질전환체를 완충 최소액체 배지(아미노산, 황산암모늄을 함유하지 않은 0.15%(w/v) 효모 니트로겐 베이스, 0.5%(w/v) 황산암모늄, 36 mM 시트르산, 126 mM 인산수소이나트륨, pH 6.5, 2%(w/v) 슈크로스) 10 mL를 함유한 50 mL 플라스크에 30℃, 200 rpm에서 96 시간 배양하고, rHSA 발현량을 로케트 면역 전기 영동으로서 평가하였다. 우선, 배양액(N=5)의 원심분리를 수행하고, 각각 상청을 회수하였다. 이들의 상청 4 ㎕를 항 인간 알부민 항체(시그마사)를 함유한 1.0%(w/v) 아가로스 겔에 공급하고, 전기영동을 수행하였다. 영동한 후의 겔을 쿠마시 블릴리언트 블루(R-250)로 염색하고, 얻어진 로케트류 피크의 높이로부터 각 배양 상청 중의 rHSA 농도를 비교하였다.

도 3에 도시한 바와 같이, NCE102 프로모터(-820 bp)를 함유한 플라스미드 pKHA030을 도입한 효모의 rHSA 발현량은 PGK1 프로모터, TEF1 프로모터를 함유하는 플라스미드를 도입한 효모의 rHSA 발현량보다 명백히 많았다.

《실시예 6: HSA-mRNA 전사량의 평가》

실시예 4에서 얻어진 형질전환체를 완충 최소 액체 배지(아미노산, 황산암모늄을 포함하지 않은 0.15%(w/v) 효모 니트로겐 베이스, 0.5%(w/v) 황산암모늄, 36 mM 시트르산, 126 mM 인산수소이나트륨, pH 6.5, 2%(w/v) 슈크로스) 10 mL를 함유한 50 mL 플라스크에 30℃, 200 rpm에서 배양하고, 72 시간 후의 효모 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 RNeasy Mini Kit(키아겐사)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 동시에 DNase 처리도 수행하였다.

추출한 전체 RNA를 주형으로 하고, HSA 유전자 검출용 합성 DNA(HA045): GTCCGAAGTCGCTCACAGATTCAA(서열번호 17)와 합성 DNA(HA046): GCAGATTCGTCAGCAACACAAGTC(서열번호 18) 또는 PGK1 유전자 검출용 합성 DNA(HA062): GCGTGTCTTCATCAGAGTTGACTTC(서열번호 19)와 합성 DNA(HA063): CCAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA(서열번호 20), QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(키아겐사)를 이용하여, 라이트사이클러(LightCycler) 시스템(로슈사)에 의한 각 프로모터의 전사활성을 비교하였다. 우선, 50℃에서 20 분간 보온하여 역전사 반응을 수행하고, 96℃에서 15 분간의 열변성을 수행하였다. 계속하여, 94℃에서 15 초간, 53℃에서 20 초간, 72℃에서 10 초간의 3 스텝으로 이루어진 사이클을 40 회 반복하고, HA045/HA046에 의해 증폭하는 PGK1 유전자 단편의 증폭량을 측정하였다. 여기서, 각 사이클에서 HSA-cDNA 양 및 PGK1-cDNA 양의 절대치는 양자 각각의 mRNA 양에 동일하게 가정하였다. 각 프로모터의 전사활성은 HSA-mRNA 양/PGK1-mRNA 양의 비(이하, 「HSA-mRNA 양 비」로 약기한다)를 취해 수치화하였다.

NCE102 프로모터(-820 bp)를 함유하는 플라스미드 pKHA030을 도입한 효모의 HSA-mRNA 양 비는 PGK1 프로모터, TEF1 프로모터를 함유하는 플라스미드를 도입한 효모의 HSA-mRNA 양 비보다, 명백히 높았다(도 4).

또한, NCE102 프로모터를 단편화한 경우는 도 5에 도시한 바와 같이 HSA-mRNA 양 비가 변화하고, -650 bp(서열번호 6; 서열번호 1의 DNA 서열 중, 751 번째로부터 1400 번째에 상당)보다 긴 영역을 사용한 때에 HSA-mRNA 양 비가 높았다.

발명에 의한 DNA 단편은 효모 내에서 높은 프로모터 활성을 가지는 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 의한 DNA 단편을 외래 유전자와 함께 연결한 플라즈미드를 숙주, 특히 효모에 도입함으로써, 외래 유전자를 고발현 레벨로 발현할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute <120> Yeast Promoter <130> 666117 <140> JP 2004-230227 <141> 2004-08-06 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1400 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 1 atgaacatat atgaagttgc acacatcagc gggaaagatg tctctaccgc tcgaggagcc 60 acacgtttga tttgcaatcc atgaaataga actgctaatc ccatatacaa ttaactatat 120 caatttcctg aacaaagaga ttacaatcaa cggcaaagcc gcctgcctct ccggagatct 180 ccttttttct tctttctttt gtcctatgtt gcatagttgc tcatgtcttt tccttaggcg 240 gacaattaag agcagccaca atatttccaa aactaaattg ctaaaaaagc gtagcaaaaa 300 attctcgtca ttcccacttt ccctacctta acccttgatg ttaacgccgt ttcgctcatc 360 ggaacaaact atacagataa ttaagctttt cggcagcggt gagaaaggaa gcagccagga 420 ggaatacgcg gctttctcgc ggagcccgat tgccgataca aaggaactgt tgcctcctcc 480 cggctatttc cataggcctt cattcagcat actgttgtgt agttgcatca catccttgtt 540 gaatgaattc caactatttc gataaaccat cccatgaagg agaatgcaat gcggcttttg 600 tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg gttaattctg tcactagggg tccgaatctc 660 ggattaagta taaaatatgt attaccctga tgattgaccg gatgatgtaa ggatgcatgt 720 ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga cggggccccg aaacaccacc cccattttaa 780 cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca 840 tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg 900 acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg atcgccccct cacagaaact 960 tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg gtttgatttt tttttcttcc 1020 tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc 1080 ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct ttataaaaga gtctttgttt 1140 tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa 1200 atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt 1260 tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt 1320 taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct 1380 aataacaata taatcccata 1400 <210> 2 <211> 1258 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 2 acaatcaacg gcaaagccgc ctgcctctcc ggagatctcc ttttttcttc tttcttttgt 60 cctatgttgc atagttgctc atgtcttttc cttaggcgga caattaagag cagccacaat 120 atttccaaaa ctaaattgct aaaaaagcgt agcaaaaaat tctcgtcatt cccactttcc 180 ctaccttaac ccttgatgtt aacgccgttt cgctcatcgg aacaaactat acagataatt 240 aagcttttcg gcagcggtga gaaaggaagc agccaggagg aatacgcggc tttctcgcgg 300 agcccgattg ccgatacaaa ggaactgttg cctcctcccg gctatttcca taggccttca 360 ttcagcatac tgttgtgtag ttgcatcaca tccttgttga atgaattcca actatttcga 420 taaaccatcc catgaaggag aatgcaatgc ggcttttgtt tgtaaacggg cttgagaggt 480 tctatgcggt taattctgtc actaggggtc cgaatctcgg attaagtata aaatatgtat 540 taccctgatg attgaccgga tgatgtaagg atgcatgtcc ctactgtttt ggtatttcca 600 catacggacg gggccccgaa acaccacccc cattttaacg gccgcatctg agcatcggcc 660 catttggcac acgcccgtta gtgacgttgg taggggcatt tccctgaggt aggcccaagg 720 ttgctttaaa aggtccatcg caaacccctt gtccgcggac ctctgcgtca taattaaaat 780 gcccaaaaca taaaagtgat cgccccctca cagaaactta tgggcagctt gctgccttaa 840 cggaattgac tagaattggt ttgatttttt tttcttccta cttcttcttc catttccctc 900 ccctcttcct catatatgta tacagaaaaa tcatacccct ataaattcct tggccccaat 960 cttctgtcag attttccttt ataaaagagt ctttgttttg taattaaaag atactttttt 1020 ctttcttctt ctacgtctcc tttttttttt ttaagaaaat ttaacttata ccactatttt 1080 gttcgcaatt gatcaagaaa aaatacaatt gaaaaggttt tacattttta atttttctgc 1140 tcatcgcgct tttttaaaag gataaataaa catttcttta aaaaacatct tcaataagaa 1200 aaatcggtta aaaaaacttt tcttctcaaa gcatacctaa taacaatata atcccata 1258 <210> 3 <211> 1100 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 3 attctcgtca ttcccacttt ccctacctta acccttgatg ttaacgccgt ttcgctcatc 60 ggaacaaact atacagataa ttaagctttt cggcagcggt gagaaaggaa gcagccagga 120 ggaatacgcg gctttctcgc ggagcccgat tgccgataca aaggaactgt tgcctcctcc 180 cggctatttc cataggcctt cattcagcat actgttgtgt agttgcatca catccttgtt 240 gaatgaattc caactatttc gataaaccat cccatgaagg agaatgcaat gcggcttttg 300 tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg gttaattctg tcactagggg tccgaatctc 360 ggattaagta taaaatatgt attaccctga tgattgaccg gatgatgtaa ggatgcatgt 420 ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga cggggccccg aaacaccacc cccattttaa 480 cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca 540 tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg 600 acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg atcgccccct cacagaaact 660 tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg gtttgatttt tttttcttcc 720 tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc 780 ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct ttataaaaga gtctttgttt 840 tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa 900 atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt 960 tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt 1020 taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct 1080 aataacaata taatcccata 1100 <210> 4 <211> 950 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 4 tgccgataca aaggaactgt tgcctcctcc cggctatttc cataggcctt cattcagcat 60 actgttgtgt agttgcatca catccttgtt gaatgaattc caactatttc gataaaccat 120 cccatgaagg agaatgcaat gcggcttttg tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg 180 gttaattctg tcactagggg tccgaatctc ggattaagta taaaatatgt attaccctga 240 tgattgaccg gatgatgtaa ggatgcatgt ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga 300 cggggccccg aaacaccacc cccattttaa cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc 360 acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta 420 aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa 480 cataaaagtg atcgccccct cacagaaact tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg 540 actagaattg gtttgatttt tttttcttcc tacttcttct tccatttccc tcccctcttc 600 ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc 660 agattttcct ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc 720 ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa 780 ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg 840 cttttttaaa aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt 900 taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 950 <210> 5 <211> 820 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 5 agaatgcaat gcggcttttg tttgtaaacg ggcttgagag gttctatgcg gttaattctg 60 tcactagggg tccgaatctc ggattaagta taaaatatgt attaccctga tgattgaccg 120 gatgatgtaa ggatgcatgt ccctactgtt ttggtatttc cacatacgga cggggccccg 180 aaacaccacc cccattttaa cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc acacgcccgt 240 tagtgacgtt ggtaggggca tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta aaaggtccat 300 cgcaaacccc ttgtccgcgg acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg 360 atcgccccct cacagaaact tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg 420 gtttgatttt tttttcttcc tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg 480 tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct 540 ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct 600 cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga 660 aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa 720 aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact 780 tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 820 <210> 6 <211> 650 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 6 cggggccccg aaacaccacc cccattttaa cggccgcatc tgagcatcgg cccatttggc 60 acacgcccgt tagtgacgtt ggtaggggca tttccctgag gtaggcccaa ggttgcttta 120 aaaggtccat cgcaaacccc ttgtccgcgg acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa 180 cataaaagtg atcgccccct cacagaaact tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg 240 actagaattg gtttgatttt tttttcttcc tacttcttct tccatttccc tcccctcttc 300 ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc 360 agattttcct ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc 420 ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa 480 ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg 540 cttttttaaa aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt 600 taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 650 <210> 7 <211> 500 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 7 acctctgcgt cataattaaa atgcccaaaa cataaaagtg atcgccccct cacagaaact 60 tatgggcagc ttgctgcctt aacggaattg actagaattg gtttgatttt tttttcttcc 120 tacttcttct tccatttccc tcccctcttc ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc 180 ctataaattc cttggcccca atcttctgtc agattttcct ttataaaaga gtctttgttt 240 tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa 300 atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt 360 tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt 420 taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct 480 aataacaata taatcccata 500 <210> 8 <211> 350 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 8 ctcatatatg tatacagaaa aatcataccc ctataaattc cttggcccca atcttctgtc 60 agattttcct ttataaaaga gtctttgttt tgtaattaaa agatactttt ttctttcttc 120 ttctacgtct cctttttttt ttttaagaaa atttaactta taccactatt ttgttcgcaa 180 ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt tttacatttt taatttttct gctcatcgcg 240 cttttttaaa aggataaata aacatttctt taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt 300 taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 350 <210> 9 <211> 200 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <223> Promoter <400> 9 atttaactta taccactatt ttgttcgcaa ttgatcaaga aaaaatacaa ttgaaaaggt 60 tttacatttt taatttttct gctcatcgcg cttttttaaa aggataaata aacatttctt 120 taaaaaacat cttcaataag aaaaatcggt taaaaaaact tttcttctca aagcatacct 180 aataacaata taatcccata 200 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 10 taaaaaaact tttcttctca aagcatacct aataacaata taatcccata 50 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 11 atagcggccg cagaatgcaa tgcggctttt gtttg 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 12 tatgggatta tattgttatt aggtatgctt tgaga 35 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 13 atgaagtggg ttttcatcgt ctccattttg ttcttgttct cctctgctta ctcta 55 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 14 gatctagagt aagcagagga gaacaagaac aaaatggaga cgatgaaaac ccacttcat 59 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 15 atccaaagat ctagagtaag cagaggagaa caagaac 37 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 16 aaggaaaaaa gcggccgcag aatgcaatgc ggcttttgtt tg 42 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 17 gtccgaagtc gctcacagat tcaa 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 18 gcagattcgt cagcaacaca agtc 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 19 gcgtgtcttc atcagagttg acttc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthesized DNA for Primer of PCR <400> 20 ccaagtgaga agccaagaca acgta 25

Claims

효모의 전사 프로모터 활성을 가지는 DNA 단편으로서, 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 함유하는 일부 서열, 또는 서열번호 1에 기재되는 DNA 서열의 전부 또는 그의 3' 측 말단을 함유하는 일부 서열과 상보적인 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 서열이며 당해 전부 또는 일부 서열의 전사 프로모터 활성을 보유하는 서열을 가지는, DNA 단편.
제 1 항에 있어서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 650 bp까지의 DNA 서열(서열번호 6)을 함유하는 서열인, DNA 단편.
제 1 또는 2 항에 있어서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 820 bp까지의 DNA 서열(서열번호 5)을 함유하는 서열인, DNA 단편.
제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 950 bp까지의 DNA 서열(서열번호 4)을 함유하는 서열인, DNA 단편.
제 1 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서 열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 1100 bp까지의 DNA 서열(서열번호 3)을 함유하는 서열인, DNA 단편.
제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 당해 DNA 서열의 일부가 적어도 서열번호 1의 DNA 서열의 3' 말단에서 1258 bp까지의 DNA 서열(서열번호 2)을 함유하는 서열인, DNA 단편.
제 1 내지 6 항 중 어느 한 항에 기재한 DNA 단편과 그의 하류에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하여 이루어진 조환 DNA 단편.
제 7 항에 기재한 조환 DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드.
제 7 항에 기재한 조환 DNA 단편 또는 제 8 항에 기재한 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 숙주 세포.
제 9 항에 있어서, 효모인 숙주 세포.
제 9 또는 10 항에 기재한 숙주 세포를 배양하고, 이어서 배양물로부터 외래 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 외래 단백질의 생산 방법.