JP6991126B2 - エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、酵母を宿主として分泌生産する場合に、Ｎ結合型糖鎖を有さないポリペプチドとして分泌生産される、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母、該ポリペプチドの製造方法等に関する。

セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の野生型のエンドヌクレアーゼとして配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが知られている。このエンドヌクレアーゼは一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを塩基配列非選択的に分解することができる。このため、生化学分野の様々な場面において有用である。セラチア・マルセセンスは大腸菌と同様にグラム陰性桿菌に分類されるため、セラチア・マルセセンス由来の野生型エンドヌクレアーゼは、それをコードする塩基配列を含むベクターにより形質転換した大腸菌を培養し、前記エンドヌクレアーゼを培養上清中に分泌させることにより製造する方法がこれまでに知られている（特許文献１、非特許文献１、２）。

特許第２６０４３６５号公報

Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ５６， Ｎｏ． ６， ｐ．１８３３－１８３８ （１９９０） Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． Ｖｏｌ． ５４， ｐ． １７－２７ （１９８９）

酵母の一種であるコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）はタンパク質発現能力に優れ、工業生産上有利である安価な炭素源を活用できるメタノール資化性酵母である。このほかの酵母も、タンパク質発現能力に優れており、ポリペプチドの大量生産のための宿主として有用であると考えられる。しかしながら、従来、セラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼを、真核生物である酵母を宿主とするポリペプチド発現系により発現させ分泌生産する試みはなされていない。

そこで本発明は、セラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼの変異体ポリペプチドを、酵母を宿主とするポリペプチド発現系により生産するための技術を提供する。

本発明者らは驚くべきことに、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるセラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼを、酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとともに酵母を宿主とする発現系で発現させ分泌生産させた場合に、Ｎ結合型糖鎖が付加されたポリペプチドとして分泌生産されること、Ｎ結合型糖鎖の結合数は２又は１であるため、この方法により分泌生産される野生型エンドヌクレアーゼは化学構造が不均一であることを見出した。

本発明者らは、セラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼの変異体ポリペプチドを、酵母を宿主とするポリペプチド発現系により、Ｎ結合型糖鎖を付加することなく分泌生産することができる技術を研究し、以下の本発明を完成させた。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の条件：
（ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を含む、
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ａ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列、
（ｂ）酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、Ｎ結合型糖鎖を有さないポリペプチドとして分泌生産される、
（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性を有する
を全て満足することを特徴とするポリペプチド。
（２）前記（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基が共にＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列である、（１）に記載のポリペプチド。
（３）前記、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基が共にＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列が、
下記の条件（ｄ）及び（ｅ）：
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がアスパラギン以外のアミノ酸残基である、
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基である
のうち少なくとも１つを満足し、且つ、
下記の条件（ｆ）及び（ｇ）：
（ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ３４に相当するアミノ酸残基がプロリンである、
（ｇ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基である
のうち少なくとも１つを満足する、（２）に記載のポリペプチド。
（４）前記条件（ｄ）が、
（ｄ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がグリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン又はフェニルアラニンである、
という条件であり、
前記条件（ｅ）が、
（ｅ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基がバリン、アラニン又はリシンである、
という条件であり、
前記条件（ｇ）が、
（ｇ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基がリシン、バリン、アルギニン又はロイシンである、
という条件であり、
前記条件（ｄ１）及び（ｅ１）のうち少なくとも１つを満足し、且つ、前記条件（ｆ）及び（ｇ１）のうち少なくとも１つを満足する、（３）に記載のポリペプチド。
（５）（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター。
（６）（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母。
（７）（６）に記載の酵母を培養する培養工程を含む、（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
（８）（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６－０６９６２７号の開示内容を包含する。

本発明によれば、セラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼの変異体ポリペプチドを、Ｎ結合型糖鎖を付加することなく、酵母を宿主とするポリペプチド発現系により分泌生産することができる。

図１は、酵母培養上清中に分泌された野生型エンドヌクレアーゼ（レーン１）及び前記野生型エンドヌクレアーゼのＮ結合型糖鎖を切断したポリペプチド（レーン２）の電気泳動の結果を示す。 図２は、酵母培養上清中に分泌された野生型エンドヌクレアーゼ（レーン１）、及び変異ポリペプチド（レーン２、３、４）の電気泳動の結果を示す。

以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
１．用語の定義
本発明において、２つのポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、ポリヌクレオチドＸを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でポリヌクレオチドＹとハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、ポリヌクレオチドＹがフィルター上に結合したポリヌクレオチドとして取得できる場合に、ポリヌクレオチドＹを「ポリヌクレオチドＸとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」と言うことができる。或いはポリヌクレオチドＸとポリヌクレオチドＹとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。ポリヌクレオチドＹは好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合したポリヌクレオチドとして取得できるポリヌクレオチドである。基準となるポリヌクレオチドＸは、コロニー又はプラーク由来のポリヌクレオチドＸであってよい。

本発明において塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラムやｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Ｘとの「配列同一性」とは、塩基配列Ｘと評価対象塩基配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。なお、ＤＮＡの塩基配列とＲＮＡの塩基配列とを比較するとき、ＴとＵとは同一の塩基とみなす。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。

本発明において「ポリヌクレオチド」とは、「核酸」と呼ぶこともでき、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡを指す。本発明において「ポリヌクレオチド」は、その相補鎖と二本鎖化された形態で存在していてもよい。特に「ポリヌクレオチド」がＤＮＡである場合、所定の塩基配列を含むＤＮＡが、その相補塩基配列を含むＤＮＡと二本鎖化された形態で存在することが好ましい。

本発明において、「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。

本発明においてポリペプチドを「コードする塩基配列」とは、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらすポリヌクレオチドの塩基配列を指し、例えば、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指す。

本明細書において、「宿主」とは、ポリヌクレオチドが導入され形質転換される細胞をいい、「宿主細胞」又は「形質転換体」とも呼ばれる。

本発明において、「発現」とは、ポリペプチドの生成をもたらす塩基配列の転写及び翻訳を指す。また、その発現は外部刺激や生育条件等に依存せずにほぼ一定の状態でもよいし、依存してもよい。発現を駆動するプロモーターは、ポリペプチドをコードする塩基配列の発現を駆動するプロモーターであれば特に限定されない。

本明細書において「ポリペプチド発現系」は、ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入され、前記ポリペプチドを発現し分泌生産可能な宿主を含む。

本明細書において宿主の生物種は酵母が好ましい。

酵母としてはサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クルイベロマイセス属、ヤロウィナ属等のメタノール資化性を有さない酵母であってもよいし、メタノール資化性酵母であってもよいが、メタノール資化性酵母がより好ましい。一般に、メタノール資化性酵母は、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが、本来メタノール資化性酵母であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母も、本発明におけるメタノール資化性酵母に包含される。

メタノール資化性酵母としては、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属等に属する酵母が挙げられる。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ではピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属ではコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属ではオガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ではキャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）等が好ましい例として挙げられる。

上記のメタノール資化性酵母のなかでも、ピキア属酵母、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母が特に好ましい。

コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属酵母としては、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）が好ましい。コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の別名を有する。

具体的に宿主として使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３（Ｙ－１１４３０、ＣＢＳ７４３５）、コマガタエラ・パストリスＸ－３３等の株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。

オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属酵母としては、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。これら３つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又は別名ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）でも表される。

具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、オガタエア・ポリモルファ８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、オガタエア・パラポリモルファＤＬ－１（ＡＴＣＣ２６０１２）等の菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。

また、本発明においては、ピキア属酵母、コマガタエラ属酵母、オガタエア属酵母等の酵母の株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスＧＳ１１５株（サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能）、ロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ－１由来のＢＹ５２４３（これらはＮａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能）等が挙げられる。本発明においては、これらの株からの誘導株等も使用できる。

本発明において「分泌生産」とは、ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞が、前記ポリペプチドを発現して細胞外に分泌することにより前記ポリペプチドを生産することを指す。
２．本発明のポリペプチド
アミノ酸配列中に、Ａｓｎ－Ｘ１－Ｘ２（ここでＸ１はプロリン以外のアミノ酸残基であり、Ｘ２はセリン又はスレオニンである）からなる保存配列を含むポリペプチドを酵母で発現させ分泌する場合、該保存配列中のＡｓｎにＮ結合型糖鎖が付加される。ただし、前記保存配列が存在するからといって前記酵母は必ずしも前記ＡｓｎにＮ結合型糖鎖を付加するとは限らず、ポリペプチド中の前記保存配列の近傍の三次元構造等の影響により前記ＡｓｎにＮ結合型糖鎖を付加しない場合もある。配列番号１に示す、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の野生型のエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列においては、第２０～２２番のＡｓｎ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ、第３２～３４番のＡｓｎ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ、第３３～３５番のＡｓｎ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ、第１１０～１１２番のＡｓｎ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ、第１７７～１７９番のＡｓｎ－Ａｓｎ－Ｓｅｒが前記保存配列に相当する。本発明者らは、セラチア・マルセセンス野生型エンドヌクレアーゼを、酵母を宿主とする発現系において分泌生産する場合、前記保存配列のうち第２０～２２番のＡｓｎ－Ｖａｌ－ＳｅｒのＡｓｎ２０（Ｎ２０）と、第３３～３５番のＡｓｎ－Ｓｅｒ－ＴｈｒのＡｓｎ３３（Ｎ３３）にＮ結合型糖鎖が付加されること、他の保存配列中のＡｓｎ３２、Ａｓｎ１１０、Ａｓｎ１７７にはＮ結合型糖鎖が付加されないことを見出した。一方で本発明者らが確認したところ、従来技術において配列番号１に示すアミノ酸配列からなるセラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼを、大腸菌を宿主とする発現系で発現させ分泌生産させた場合にはＮ結合型糖鎖は付加されず、分泌生産される野生型エンドヌクレアーゼは化学構造が均一である。

これらの知見をもとに、本発明者らは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系により、Ｎ結合型糖鎖を付加することなく分泌生産することができる、セラチア・マルセセンス由来野生型エンドヌクレアーゼの変異体ポリペプチドとして、以下に詳述する本発明のポリペプチドを完成させた。

本発明の一実施形態は、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の条件の全てを満足するポリペプチドに関する。

前記（ａ）は、本発明のポリペプチドは、以下の（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を含むという条件である。

（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列：
（ａ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列。

配列番号１に示すアミノ酸配列は、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の野生型のエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列である。配列番号１に示すアミノ酸配列にはシグナル配列は含まない。

本明細書では、前記（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を、「本発明のポリペプチドのアミノ酸配列」と表現する場合がある。

前記（ａ１）においてアミノ酸配列の配列同一性は、好ましくは８６％以上であり、好ましくは８７％以上であり、好ましくは８８％以上であり、好ましくは８９％以上であり、好ましくは９０％以上であり、好ましくは９１％以上であり、好ましくは９２％以上であり、好ましくは９２％以上であり、好ましくは９３％以上であり、好ましくは９４％以上であり、好ましくは９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、好ましくは９７％以上であり、好ましくは９８％以上であり、好ましくは９９％以上である。ただし、前記（ａ１）のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の変異配列であり、配列番号１に示すアミノ酸配列とのアミノ酸配列の配列同一性は１００％未満である。

前記（ａ２）において、「１もしくは複数個」とは、例えば１～４０個、好ましくは１～３５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２５個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～７個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは１もしくは２個、好ましくは２～３５個、好ましくは２～３０個、好ましくは２～２５個、好ましくは２～２０個、好ましくは２～１５個、好ましくは２～１０個、好ましくは２～７個、好ましくは２～５個、好ましくは２～４個、好ましくは２～３個、又は、好ましくは２個をいう。

前記（ｂ）は、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、Ｎ結合型糖鎖を有さないポリペプチドとして分泌生産される、という条件である。ここで、酵母としてはコマガタエラ属酵母等の、ポリペプチドの生産のための宿主として用いようとする１種以上の酵母であればよい。コマガタエラ属酵母としては、コマガタエラ・パストリス（＝ピキア・パストリス）が例示できる。既述の通り本発明者らは、セラチア・マルセセンス野生型エンドヌクレアーゼを、酵母を宿主とする発現系において分泌生産する場合、前記保存配列のうち第２０～２２番のＡｓｎ－Ｖａｌ－ＳｅｒのＡｓｎ２０（Ｎ２０）と、第３３～３５番のＡｓｎ－Ｓｅｒ－ＴｈｒのＡｓｎ３３（Ｎ３３）にＮ結合型糖鎖が付加されること、他の保存配列中のＡｓｎ３２、Ａｓｎ１１０、Ａｓｎ１７７にはＮ結合型糖鎖が付加されないことを見出した。前記（ｂ）を満足する本発明のポリペプチドでは、これらの保存配列中のＡｓｎに相当するアミノ酸残基が、Ｎ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあり、その具体的な態様については後述する。

前記（ｃ）において、「エンドヌクレアーゼ活性を有する」とは、ポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の内部の３’，５’－ホスホジエステル結合を切断して、断片化されたポリヌクレオチドを生じる酵素活性を有することを指す。ポリペプチドがエンドヌクレアーゼ活性を有することは、実施例５に記載のように、適当な温度（例えば３７℃）において、標準的なＤＮＡ試料を適当な緩衝液中で溶解した溶液にポリペプチドを加えたときに、該溶液の波長２６０ｎｍでの吸光度が、ポリペプチド添加後一定時間（例えば１分間）に上昇することを指標として確認することができる。

本発明のポリペプチドの好ましい実施形態では、前記（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアスパラギン２０（Ｎ２０）及びアスパラギン３３（Ｎ３３）に相当するアミノ酸残基が共にＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列である。ここで、「配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列とを、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるように整列（アラインメント）させたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に対応する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を指す。アラインメントの具体的な方法については配列同一性に関して説明したのと同様である。本明細書において「配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸｎに相当するアミノ酸残基」と表現する場合、同様に、配列番号１に示すアミノ酸配列と、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列とを、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにアラインメントさせたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における第ｎ位のアミノ酸残基Ｘに対応する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を指す。

本発明のポリペプチドは、好ましい実施形態において、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基が共にＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にあるアミノ酸配列を有する。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態であるためには、
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がアスパラギン以外のアミノ酸残基である、
（ｈ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるバリン２１（Ｖ２１）に相当するアミノ酸残基がプロリンである、
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるセリン２２（Ｓ２２）に相当するアミノ酸残基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基である
のうち少なくとも１つを満足することが好ましく、特に、前記（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも１つを満足することが好ましい。これらのポリペプチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。

前記条件（ｄ）は、好ましくは、
（ｄ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がグリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン又はフェニルアラニンである、
という条件である。

前記条件（ｅ）は、好ましくは、
（ｅ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基がバリン、アラニン又はリシンである、
という条件である。

本発明のポリペプチドが前記条件（ｄ１）及び（ｅ１）のうち少なくとも１つを満足する場合、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、前記ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が特に高い。

前記条件（ｄ１）のなかでも特に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がグリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン又はイソロイシンであることが好ましく、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン又はアラニンであることがより好ましく、グリシン、プロリン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であることがより好ましく、グリシン又はプロリンであることがより好ましく、グリシンであることが特に好ましい。

前記条件（ｅ１）のなかでも特に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基がバリンであることが好ましい。

本発明のポリペプチドは前記条件（ｄ１）を少なくとも満足することが好ましい。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ３３に相当するアミノ酸残基がＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態であるためには、
（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ３３に相当するアミノ酸残基がアスパラギン以外のアミノ酸残基である、
（ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるセリン３４（Ｓ３４）に相当するアミノ酸残基がプロリンである、
（ｇ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるスレオニン３５（Ｔ３５）に相当するアミノ酸残基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基である
のうち少なくとも１つを満足することが好ましく、特に、前記（ｆ）及び（ｇ）のうち少なくとも１つを満足することが好ましい。これらのポリペプチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ３３に相当するアミノ酸残基にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、該ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。

前記条件（ｇ）は、好ましくは、
（ｇ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基がリシン、バリン、アルギニン又はロイシンである、
という条件である。

本発明のポリペプチドが前記条件（ｆ）及び（ｇ１）のうち少なくとも１つを満足する場合、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、前記ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が特に高い。

前記条件（ｇ１）のなかでも特に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基がリシンであることが好ましい。

本発明のポリペプチドは前記条件（ｆ）を少なくとも満足することが好ましい。

本発明のポリペプチドのより具体的な実施形態としては、
（Ｘｐ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、
（ｄ２）Ｎ２０がアスパラギン以外のアミノ酸残基に置換されている、
（ｈ２）Ｖ２１がプロリンに置換されている、
（ｅ２）Ｓ２２がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基に置換されている
のうち少なくとも１つの変異、好ましくは（ｄ２）及び（ｅ２）のうち少なくとも１つの変異、が導入されており、且つ、
（ｉ２）Ｎ３３がアスパラギン以外のアミノ酸残基に置換されている、
（ｆ２）Ｓ３４がプロリンに置換されている、
（ｇ２）Ｔ３５がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基に置換されている
のうち少なくとも１つの変異、好ましくは（ｆ２）及び（ｇ２）のうち少なくとも１つの変異、が導入されているアミノ酸配列を含む（又はからなる）ポリペプチド、或いは、
（Ｙｐ）前記（Ｘｐ）で規定するポリペプチドにおいて、前記（Ｘｐ）で規定する変異に加えて更に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む（又はからなる）、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の条件を満足するポリペプチド
が挙げられ、より好ましくは、前記（Ｘｐ）で規定するポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系を用いて分泌生産する場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基に共にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、該ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。前記（Ｙｐ）における「１もしくは複数個」とは、例えば１～４０個、好ましくは１～３５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２５個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～７個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは１もしくは２個をいう。

前記条件（ｄ２）では更に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０は、前記条件（ｄ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。

前記条件（ｅ２）では更に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２は、前記条件（ｅ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。

前記条件（ｇ２）では更に、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５は、前記条件（ｇ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。

本発明のポリペプチドの上記の具体的な実施形態では、前記条件（ｄ２）及び前記条件（ｆ２）を少なくとも満足することが特に好ましい。

本発明のポリペプチドは、そのＮ末端側及びＣ末端側の一方又は両方に、更に他のポリペプチドが連結された融合ポリペプチドの形態で存在していてもよい。他のポリペプチドとしては、シグナルペプチド、タグペプチド等が例示できるがこれらに限定されない。シグナルペプチドの具体例は後述する通りである。タグペプチドとしては複数（例えば６～１０個）のヒスチジン残基からなるタグペプチド（ヒスチジンタグ）や、ＦＬＡＧタグペプチドが例示できる。
３．本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
本発明はまた、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の条件を満足する本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡであり、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、後述する（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ｄ）、（Ｈ）、（Ｅ）、（Ｉ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｄ１）、（Ｅ１）、（Ｇ１）、（Ｄ２）、（Ｈ２）、（Ｅ２）、（Ｉ２）、（Ｆ２）、（Ｇ２）における「配列番号５」の塩基配列又はその部分塩基配列は、配列番号５においてＴをＵに置換した塩基配列又はその部分塩基配列を指す。

配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列である。

前記（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（以下「本発明の塩基配列」という場合がある）としては、
（Ａ１）配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（Ａ２）配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、及び／又は付加した塩基配列、
（Ａ３）配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの塩基配列
（Ａ４）前記（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）の塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列、又は、
（Ａ５）前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）又は（Ａ４）の塩基配列をエキソンとし、途中にイントロン配列が介在している塩基配列
が例示でき、特に、前記（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）の塩基配列が例示できる。

本明細書では、前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）又は（Ａ５）の塩基配列、特に前記（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）の塩基配列を、「本発明の塩基配列」と表現する場合がある。

前記（Ａ１）において塩基配列の配列同一性は、好ましくは８６％以上であり、好ましくは８７％以上であり、好ましくは８８％以上であり、好ましくは８９％以上であり、好ましくは９０％以上であり、好ましくは９１％以上であり、好ましくは９２％以上であり、好ましくは９２％以上であり、好ましくは９３％以上であり、好ましくは９４％以上であり、好ましくは９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、好ましくは９７％以上であり、好ましくは９８％以上であり、好ましくは９９％以上である。ただし、前記（Ａ１）の塩基配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の変異配列をコードする塩基配列であり、配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列との配列同一性は１００％未満である。

前記（Ａ２）において、「１もしくは複数個」とは、例えば１～１２０個、好ましくは１～１０５個、好ましくは１～９０個、好ましくは１～７５個、好ましくは１～６０個、好ましくは１～４５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２１個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１２個、好ましくは１～９個、好ましくは１～６個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは２～１０５個、好ましくは２～９０個、好ましくは２～７５個、好ましくは２～６０個、好ましくは２～４５個、好ましくは２～３０個、好ましくは２～２１個、好ましくは２～１５個、好ましくは２～１２個、好ましくは２～９個、好ましくは２～６個、好ましくは２～４個、好ましくは２～３個、又は、好ましくは２個をいう。

配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列においてＡ３１３～Ｃ３１５が配列番号１のＮ２０に、Ｇ３１６～Ｔ３１８が配列番号１のＶ２１に、Ｔ３１９～Ｃ３２１が配列番号１のＳ２２に、Ａ３５２～Ｃ３５４が配列番号１のＮ３３に、Ｔ３５５～Ｃ３５７が配列番号１のＳ３４に、Ａ３５８～Ｔ３６０が配列番号１のＴ３５にそれぞれ対応する。

本発明の塩基配列の好ましい実施形態では、前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）又は（Ａ５）の塩基配列、特に前記（Ａ１）、（Ａ２）又は（Ａ３）の塩基配列が、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５、及び、Ａ３５２～Ｃ３５４に相当する塩基がコードするアミノ酸残基が共にＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態にある塩基配列である。ここで、「配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５、及び、Ａ３５２～Ｃ３５４に相当する塩基」とは、配列番号５に示す塩基配列と、本発明の塩基配列とを、両者の塩基一致度が最も高くなるように整列（アラインメント）させたときに、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５、及び、Ａ３５２～Ｃ３５４に対応する本発明の塩基配列における塩基を指す。アラインメントの具体的な方法については配列同一性に関して説明したのと同様である。本明細書において「配列番号５に示す塩基配列におけるＹｎ～Ｚｍに相当する塩基」と表現する場合、同様に、配列番号５に示す塩基配列と、本発明の塩基配列とを、両者の塩基一致度が最も高くなるようにアラインメントさせたときに、配列番号５に示す塩基配列における第ｎ位の塩基Ｙから第ｍ位の塩基Ｚまでの塩基に対応する本発明の塩基配列における塩基を指す。

本発明の塩基配列が、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５に相当する塩基残基がコードするアミノ酸残基がＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態であるためには、
（Ｄ）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５に相当する塩基がアスパラギン以外のアミノ酸残基をコードする、
（Ｈ）配列番号５に示す塩基配列におけるＧ３１６～Ｔ３１８に相当する塩基がプロリンをコードする、
（Ｅ）配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１に相当する塩基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基をコードする
のうち少なくとも１つを満足することが好ましく、特に、前記（Ｄ）及び（Ｅ）のうち少なくとも１つを満足することが好ましい。これらの塩基配列を含むポリヌクレオチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系に導入して前記塩基配列がコードするポリペプチドを分泌生産する場合に、前記ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。

前記条件（Ｄ）は、好ましくは、
（Ｄ１）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５に相当する塩基がグリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン又はフェニルアラニンをコードする、
という条件である。

前記条件（Ｅ）は、好ましくは、
（Ｅ１）配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１に相当する塩基がバリン、アラニン又はリシンをコードする、
という条件である。

本発明の塩基配列が前記条件（Ｄ１）及び（Ｅ１）のうち少なくとも１つを満足する場合、本発明の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系に導入して本発明の塩基配列がコードするポリペプチドを分泌生産する場合に、前記ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が特に高い。

前記条件（Ｄ１）のなかでも特に、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５に相当する塩基がグリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン又はイソロイシンをコードすることが好ましく、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン又はアラニンをコードすることがより好ましく、グリシン、プロリン、アスパラギン酸又はグルタミン酸をコードすることが特に好ましい。

前記条件（Ｅ１）のなかでも特に、配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１に相当する塩基がバリンをコードすることが好ましい。

本発明の塩基配列は前記条件（Ｄ１）を少なくとも満足することが好ましい。

本発明の塩基配列が、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５２～Ｃ３５４に相当する塩基残基がコードするアミノ酸残基がＮ結合型糖鎖修飾を受けない状態であるためには、
（Ｉ）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５２～Ｃ３５４に相当する塩基がアスパラギン以外のアミノ酸残基をコードする、
（Ｆ）配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３５５～Ｃ３５７に相当する塩基がプロリンをコードする、
（Ｇ）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０に相当する塩基がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基をコードする
のうち少なくとも１つを満足することが好ましく、特に、前記（Ｆ）及び（Ｇ）のうち少なくとも１つを満足することが好ましい。これらの塩基配列を含むポリヌクレオチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系に導入して前記塩基配列がコードするポリペプチドを分泌生産する場合に、前記ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ３３に相当するアミノ酸残基にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、該ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。

前記条件（Ｇ）は、好ましくは、
（Ｇ１）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０に相当する塩基がリシン、バリン、アルギニン又はロイシンをコードする
という条件である。

本発明の塩基配列が前記条件（Ｆ）及び（Ｇ１）のうち少なくとも１つを満足する場合、本発明の塩基配列を含むポリヌクレオチドを、酵母を宿主とするポリペプチド発現系に導入して本発明の塩基配列がコードするポリペプチドを分泌生産する場合に、前記ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が特に高い。

前記条件（Ｇ１）のなかでも特に、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０に相当する塩基がリシンをコードすることが好ましい。

本発明の塩基配列は前記条件（Ｆ）を少なくとも満足することが好ましい。
（Ｘｎ）本発明の塩基配列のより具体的な実施形態としては、配列番号５の第２５６位～第９９３位の塩基配列において、
（Ｄ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５がアスパラギン以外のアミノ酸残基をコードするように置換されている、
（Ｈ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＧ３１６～Ｔ３１８がプロリンをコードするように置換されている、
（Ｅ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基をコードするように置換されている
のうち少なくとも１つの変異、好ましくは（Ｄ２）及び（Ｅ２）のうち少なくとも１つの変異、が導入されており、且つ、
（Ｉ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５２～Ｃ３５４がアスパラギン以外のアミノ酸残基をコードするように置換されている、
（Ｆ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３５５～Ｃ３５７がプロリンをコードするように置換されている、
（Ｇ２）配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０がセリン又はスレオニン以外のアミノ酸残基をコードするように置換されている
のうち少なくとも１つの変異、好ましくは（Ｆ２）及び（Ｇ２）のうち少なくとも１つの変異、が導入されている塩基配列、
（Ｙｎ）前記（Ｘｎ）で規定する塩基配列において、前記（Ｘｎ）で規定する変異に加えて更に、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、及び／又は付加した、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の条件を満足するポリペプチドをコードする塩基配列、
（Ｚｎ）前記（Ｘｎ）又は（Ｙｎ）で規定する塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列、或いは、
（Ｗｎ）前記（Ｘｎ）、（Ｙｎ）又は（Ｚｎ）の塩基配列をエキソンとし、途中にイントロン配列が介在している塩基配列を含み（又はからなり）、より好ましくは前記（Ｘｎ）で規定する塩基配列を含む（又はからなる）。このような塩基配列を含むポリヌクレオチドは、酵母を宿主とするポリペプチド発現系に導入して前記塩基配列がコードするポリペプチドを分泌生産する場合に、前記ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０及びＮ３３に相当するアミノ酸残基に共にＮ結合型糖鎖が付加していないポリペプチドとして分泌生産され、且つ、該ポリペプチドを含む培養上清のエンドヌクレアーゼ活性が十分に高い。前記（Ｙｎ）において、「１もしくは複数個」とは、例えば１～１２０個、好ましくは１～１０５個、好ましくは１～９０個、好ましくは１～７５個、好ましくは１～６０個、好ましくは１～４５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２１個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１２個、好ましくは１～９個、好ましくは１～６個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個である。

前記条件（Ｄ２）では更に、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５は、前記条件（Ｄ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３１３～Ｃ３１５に相当する塩基がコードするアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基をコードするように置換されていることが好ましい。

前記条件（Ｅ２）では更に、配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１は、前記条件（Ｅ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号５に示す塩基配列におけるＴ３１９～Ｃ３２１に相当する塩基がコードするアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基をコードするように置換されていることが好ましい。

前記条件（Ｇ２）では更に、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０塩基は、前記条件（Ｇ１）又はその好ましい実施形態において、配列番号５に示す塩基配列におけるＡ３５８～Ｔ３６０に相当する塩基がコードするアミノ酸残基の具体例として上述したアミノ酸残基をコードするように置換されていることが好ましい。
４．ベクター
本発明の一実施形態は、本発明のポリペプチドと該ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

本発明のベクターとは人為的に構築された核酸分子であって、通常は、核酸分子内に異種生物に由来する塩基配列を含む。本発明のベクターは酵母に導入され酵母を形質転換するために用いることができる。

本発明のベクターに含まれる、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドについては既述の通りである。

本発明のベクターに含まれる、本発明のポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドは特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエに由来するＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）が挙げられる。また、オガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、又はサッカロマイセス・セレビシエのＰＬＢ１のシグナル配列もまた、本発明のポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとして利用可能である。

本発明のベクターでは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５’末端に、前記シグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを配置すればよい。本発明のベクターは更に、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端の一方又は両方、好ましくは３’末端に、前記タグペプチドをコードする塩基配列を含んでいてもよい。

本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列は発現カセットに挿入された形態でベクター中に含めることができる。「発現カセット」とは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列を含み、それをポリペプチドとして発現可能な状態にすることのできる発現システムをいう。「発現可能な状態」とは、当該発現カセットに含まれる前記塩基配列が、宿主である酵母において発現可能なように、遺伝子発現に必要なエレメントの制御下に配置されている状態をいう。遺伝子発現に必要なエレメントには、プロモーター、ターミネーター等が挙げられる。

本発明のベクターは環状ベクター、直鎖状ベクター、人工染色体等であることができる。

ここで、「プロモーター」とは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列の上流に位置する塩基配列領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合又は作用することによって鋳型である本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列を読み取って相補的なＲＮＡを合成（転写）する。

ポリペプチドを発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。

炭素源がメタノールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ１）プロモーター、ＡＯＸ２（アルコールオキシダーゼ２）プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

炭素源がグルコースやグリセロールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、ＧＡＰプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＡＤＥプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

本発明のベクターの前記発現カセットにおいて、ターミネーターは、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に位置する。ターミネーターは、使用するプロモーター及び宿主酵母に応じて適宜選択することができる。例えば、プロモーターがＡＯＸ１プロモーターである場合、ＡＯＸ１ターミネーターを使用することができる。

本発明のベクターでは、更に、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ－ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ システム等を利用するためのオーバーラップ領域、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）の塩基配列等を含むことができる。選択マーカー遺伝子の具体例は後述する通りである。本発明のベクターは更に、宿主に応じて、自律複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ配列、テロメアＤＮＡ配列を含むこともできる。

本発明のベクターが、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれるベクターである場合、本発明のベクターは、染色体ＤＮＡ内の標的部位と相同組み換え可能な塩基配列（組み換え部位）を更に含むことが好ましい。組み換え部位の塩基配列と、染色体ＤＮＡ内の標的部位の塩基配列との同一性は、７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましい。前記組み換え部位の塩基配列の長さは２０～２０００ｂｐであることが好ましい。

本発明のベクターが直鎖状ベクターである場合、該直線状ベクターは、前記発現カセット（及び、必要に応じて、選択マーカー遺伝子等の他のエレメント）を含む塩基配列の領域を含むポリヌクレオチド断片の両側に１つずつ配置された、一対の組み換え部位を含むことが好ましい。前記一対の組み換え部位の一方又は両方は、前記領域内の５’末端又は３’末端の末端部を構成する部分塩基配列であってもよいし、前記領域の５’末端又は３’末端よりも外側に位置する塩基配列であってもよい。前記一対の組み換え部位の一方が、又は、両方が組み合わされて、選択マーカー遺伝子の塩基配列を含むものであってよい。

直鎖状ベクターにおける前記一対の組み換え部位は、より好ましくは、染色体ＤＮＡ内の１つの標的部位と相同な塩基配列のうち、５’末端側の部分塩基配列からなる組み換え部位と、３’末端側の部分塩基配列からなる組み換え部位との対である。このような一対の組み換え部位を両端に含む直線状ベクターは、前記発現カセット（及び、必要に応じて、選択マーカー遺伝子等の他のエレメント）含む塩基配列と、染色体ＤＮＡ内の１つの標的部位と相同な塩基配列とを含むポリペプチドを含む環状ベクターを、前記相同な塩基配列の内部の位置で切り開くことで形成することができる。このような直鎖状ベクターの製造方法は環状ベクターを切り開く方法には限定されず、化学合成法等の他の方法でもよい。前記相同な塩基配列が、選択マーカー遺伝子の塩基配列であってもよい。

本発明のベクターは、通常は、本発明のポリペプチド及びシグナルペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの断片、或いは前記塩基配列からなるポリヌクレオチドの断片が、その両端又は一端に、例えば制限酵素認識部位を介して、１又は複数の、上記で挙げたような他の機能的ポリヌクレオチド断片と連結されて構成される。本発明のベクターにおいて、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列、及び、前記シグナルペプチドをコードする塩基配列（並びに、存在する場合は、前記タグペプチドをコードする塩基配列）は、ポリペプチドの読み取り枠がずれることがなく、一続きの融合ポリペプチドとして翻訳されるように一本のポリヌクレオチド断片上に配置されることが好ましい。前記シグナルペプチドは翻訳後修飾により前記融合ポリペプチドから切除されてもよい。前記塩基配列のうち隣接するもの同士は直接接していてもよいし、リンカーポリペプチドをコードする塩基配列を間に介して接していてもよい。かかるリンカーポリペプチドの長さとしては、１～１００アミノ酸残基が例示できる。

本発明のベクターの範囲には、遺伝子発現に必要な上記のエレメントのポリヌクレオチド断片、他の機能的ポリヌクレオチド断片等が既に付加されている形態だけでなく、これらのポリヌクレオチド断片を付加可能な形態（例えば、これらのポリヌクレオチド断片を付加可能な１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイトを含む形態）の核酸分子も包含される。

本発明のベクターの作製方法は特に限定されないが、例えば全合成法、ＰＣＲ法、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ－ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステム等を使用することができる。
５．酵母
本発明はまた、本発明のポリペプチドと、前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母に関する。ここで本発明の酵母は、前記ポリヌクレオチドを、上記の本発明のベクターの一部として含むことができる。

宿主として用いることができる酵母の具体的な種類については既述の通りである。

前記ポリヌクレオチドを酵母へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、コマガタエラ・パストリスの形質転換法としては、Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｔｈｉｕｍａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２００４ Ｊａｎ；３６（１）：１５２－４．）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。

形質転換を行った後、形質転換体を選択するための選択マーカーは特に限定されない。例えば選択マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＡＲＧ４遺伝子等の栄養要求性相補遺伝子を含むベクターを用い、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジン、アルギニンの栄養要求性酵母株を宿主として形質転換を行い、原栄養株表現型の回復により形質転換体を選択することができる。また、選択マーカー遺伝子としてＧ４１８耐性遺伝子、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を含むベクターを用いる場合、それぞれＧ４１８、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により形質転換体を選択することができる。なお、栄養要求性選択マーカーは、宿主において該選択マーカーが破壊されている場合に用いることができる。そこで必要に応じて宿主において該選択マーカーを破壊することができ、方法は当業者には公知の方法を用いることができる。

本発明の酵母は、本発明のベクターにより形質転換した形質転換体であってもよいし、該形質転換体の後代細胞であってもよい。形質転換体である酵母の１細胞に導入されるベクターのコピー数は特に限定されない。１細胞あたり１コピーでも良いし、２コピー以上の多コピー体として存在していてもよい。１コピー体は環状ベクター、直鎖状ベクター、人工染色体として存在する状態でもよいし、宿主由来の染色体に組み込まれた状態でもよい。２コピー以上の多コピー体は、全て環状ベクター、直鎖状ベクター、人工染色体として存在する状態でもよいし、全て宿主由来の染色体に組み込まれた状態でもよいし、両方の状態が同時に起こっていてもよい。２コピー以上の多コピー体とは、同一のベクターを２コピー以上保有する多コピー体であっても、異なるベクターを１コピー以上保有する多コピー体であってもよい。
６．本発明のポリペプチドの製造方法
本発明は、上記５に記載の本発明の酵母を培養する培養工程を含む、本発明のポリペプチドの製造方法に関する。

前記培養工程で得られた前記酵母の培養物から目的とする本発明のポリペプチドを回収すればよい。ここで「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞又は細胞の破砕物を意味する。本発明の酵母は本発明のポリペプチドを細胞外に分泌生産することができることから、培養物としては特に培養上清が好ましい。すなわち本発明の酵母を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、本発明の酵母を培養し、その培養上清中に本発明のポリペプチドを蓄積させる方法が好ましい。

酵母の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。該栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油類、又はこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。

本発明の好ましい態様として、酵母にピキア属酵母、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールのうち１種でもよく、又は２種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。

酵母の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５～１０．０、温度範囲１０℃～４８℃の範囲で、好気的に１０時間～１０日間培養することにより行うことができる。

前記培養物からの本発明のポリペプチドの回収方法については、公知の精製法を適当に組み合わせて用いることができる。例えば、まず、本発明の酵母と培地とを含む培養液を遠心分離、あるいは、濾過処理して、液体画分、すなわち培養上清から酵母細胞を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿等）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該培養上清から本発明のポリペプチドを回収する。

前記培養物中において本発明のポリペプチドはＮ結合型糖鎖が付加されていない。一方で、酵母が発現し分泌生産する他のポリペプチドはＮ結合型糖鎖が付加されていることが通常である。そこで、前記培養物から、糖鎖を認識するレクチン・抗体等を利用して、Ｎ結合型糖鎖を有するポリペプチドと、Ｎ結合型糖鎖を有さないポリペプチドとを分離することで、目的とする本発明のポリペプチドの回収の効率を高めることも可能である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。

また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌E.coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、QIAprep spin miniprep kit（QIAGEN社製）を用いて行った。

ベクターの構築において利用した、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号２）、ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号３）、ＨＩＳ４遺伝子（配列番号４）はコマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株の染色体ＤＮＡ（塩基配列はＥＭＢＬ （Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ． ＦＲ８３９６２８～ＦＲ８３９６３１に記載）混合物をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。

ベクターの構築において利用した、Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル配列（ＭＦ配列）（配列番号１０５）が付与されたＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの野生型エンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号５）は公開配列情報（Ｃａｌｓｂｅｒｇ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｖｏｌ５４ ｐ１７－２７ １９８９）に基づいて合成ＤＮＡを調製した。

ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体ＤＮＡの調製は、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株からＧｅｎとるくん^ＴＭ（タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
＜比較例１:野生型エンドヌクレアーゼ発現ベクターの構築＞
ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ－ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号６）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３２１９）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ－１を構築した。

また、ＡＯＸ１プロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー１（配列番号７）及び２（配列番号８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ－１のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－Ｐａｏｘを構築した。

次に、ＡＯＸ１ターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー３（配列番号９）及び４（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘを構築した。

次に、ＨＩＳ４遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記染色体ＤＮＡ混合物を鋳型としプライマー５（配列番号１１）及び６（配列番号１２）を用いたＰＣＲにより調製し、ＥｃｏＲＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘのＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。

次に、ＭＦ配列が付与されたエンドヌクレアーゼ遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した核酸断片を、前記合成ＤＮＡを鋳型としプライマー７（配列番号１３）及び８（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢｇｌＩＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＥＮＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。このｐＵＣ－ＰａｏｘＥＮＴａｏｘＨＩＳ４は、野生型エンドヌクレアーゼ遺伝子がＡＯＸ１プロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。
＜比較例２:形質転換酵母の取得＞
比較例１で構築した野生型エンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。

コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株由来ヒスチジン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１～１．５になるまで振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。

この懸濁液を３０℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌのＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。

比較例１で構築した野生型エンドヌクレアーゼ発現ベクターｐＵＣ－ＰａｏｘＥＮＴａｏｘＨＩＳ４を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍｌのアンピシリン含有２ＹＴ培地（１．６％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％ 塩化ナトリウム、０．０１％アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製））で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ－ＰａｏｘＥＮＴａｏｘＨＩＳ４を取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、ＨＩＳ４遺伝子内のＳａｌＩ認識配列で切断された直鎖状ベクターを調製した。

上述のコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ－ＰａｏｘＥＮＴａｏｘＨＩＳ４溶液１μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔２ｍｍ（ビーエム機器社製））に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３０℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、野生型エンドヌクレアーゼ発現酵母を取得した。
＜比較例３：形質転換酵母の培養＞
比較例２で得られた野生型エンドヌクレアーゼ発現酵母を２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に接種し、これを３０℃、７２時間振盪培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養上清を回収した。
＜比較例４：培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
比較例３で得られた培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。

１２μｌの培養上清と３μｌの５×サンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６．７％ ＳＤＳ、０．０１％ ＢＰＢ）を混合し、９５℃、８分間処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ^ＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、バイオラッド社製）と共に、ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ－２５０ステイン；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、アミノ酸配列から推定される分子量よりも高分子量側に２本のバンドを確認した（図１－レーン１の枠内）。この培養上清を、Ｎ型糖鎖切断キット（Ｅｎｄｏ Ｈｆ、ＢｉｏＬａｂｓ社製）で処理すると、上述の２本のバンドは消失し、アミノ酸配列から推定される分子量位置にバンドを確認した（図１－レーン２の枠内）。本結果は、野生型エンドヌクレアーゼをコマガタエラ酵母で分泌生産すると、１又は２ヶ所でＮ型糖鎖修飾された修飾体として生産することを示している。
＜実施例１:変異エンドヌクレアーゼ発現ベクターの構築１＞
ＭＦ配列が付与された野生型エンドヌクレアーゼ遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにＮ２０Ｑ変異体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー９（配列番号１５）、プライマー１０（配列番号１６）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたＮ２０Ｑ変異体遺伝子の両端にＢｇｌＩＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を調製した。ここでＮ２０Ｑ変異体とは、配列番号１に示す野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列においてＮ２０がＱに置換された変異体を指す。以下同様に表す。

次に、この変異体遺伝子をテンプレートにして各変異体遺伝子を調製した。まず、以下の表１に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子の両端にＢｇｌＩＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を調製した。

上記で調製した変異エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。

これらの変異体は、配列番号１に示す野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列においてＮ２０Ｑ変異および、Ｎ３３、Ｓ３４、Ｔ３５のうちのいずれか１残基に変異が入った二重変異体となっている。
＜実施例２:変異エンドヌクレアーゼ発現ベクターの構築２＞
実施例１で構築したＭＦ配列が付与された変異エンドヌクレアーゼの一つ（ｍｕｔａｎｔ５）の発現ベクターをテンプレートに、以下の表２に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子の両端にＢｇｌＩＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を調製した。

上記で調製した変異エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。

これらの変異体は、配列番号１に示す野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列においてＴ３５Ｋ変異および、Ｎ２０、Ｖ２１、Ｓ２２のうちのいずれか１残基に変異が入った二重変異体となっている。
＜実施例３:変異エンドヌクレアーゼ発現ベクターの構築３＞
実施例１で構築したＭＦ配列が付与された変異エンドヌクレアーゼの一つ（ｍｕｔａｎｔ４）の発現ベクターをテンプレートに、以下の表３に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子の両端にＢｇｌＩＩ認識配列が付加されたＤＮＡ断片を調製した。

上記で調製した変異エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異エンドヌクレアーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。

これらの変異体は、配列番号１に示す野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列においてＳ３４Ｐ変異および、Ｎ２０残基の変異が入った二重変異体となっている。
＜実施例４：形質転換酵母の取得＞
実施例１～３で構築したＭＦ配列を付加した変異エンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いて、比較例２に示した方法と同様に、コマガタエラ・パストリスを形質転換した。

実施例１～３で構築した変異エンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍｌのアンピシリン含有２ＹＴ培地で培養し、得られた菌体からプラスミドを取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、直鎖状にした。

コンピテントセルの調製および形質転換および形質転換体の選択は比較例２に記載の方法で実施した。
＜実施例５：形質転換酵母の培養＞
実施例４で得られた変異エンドヌクレアーゼ発現酵母を、比較例３に記載の方法で培養し、培養上清を回収した。
＜実施例６：培養上清中のヌクレアーゼ活性の測定＞
実施例５で得られた変異エンドヌクレアーゼ発現酵母の培養上清中のヌクレアーゼ活性を以下の方法で測定した。

反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２）２ｍｌを３７℃にインキュベートし、そこにＳａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０μｌと、希釈した培養上清 １０μｌを加えて混合した後に、分光光度計（Ｕ－２９００、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）にて、２６０ｎｍの吸光度変化をタイムスキャンで測定した。

反応開始後１分間後の２６０ｎｍの吸光度変化から、培養液中のヌクレアーゼ活性を算出した。なお、ヌクレアーゼ活性のユニットの定義は、３０分間に２６０ｎｍの吸収を１．０向上させる活性を１ユニットとした。

各種変異エンドヌクレアーゼ発現株の培養上清中に、高いヌクレアーゼ活性があることを確認した。
＜実施例７：培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
実施例５で得られた培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。方法は、比較例４と同様の方法で実施した。

その結果、各種変異エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（図２－レーン１の枠内）と異なり、推定分子量に相当する位置に特異的なバンドが認められ（図２－レーン２、３、４の枠内。図２－レーン２、３、４は、それぞれｍｕｔａｎｔ ２９、３０、３１に相当する）、Ｎ型糖鎖修飾のない状態で分泌していることを確認した。
＜実施例８：培養上清中のヌクレアーゼ活性の測定＞
実施例３で構築したＭＦ配列が付与された変異エンドヌクレアーゼの一つ（ｍｕｔａｎｔ２９）の発現ベクターをテンプレートに、プライマー７とプライマー９９（配列番号１０６）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された変異エンドヌクレアーゼのＨｉｓタグ融合体遺伝子発現ベクターを構築した。

この変異体は、Ｎ２０ＧおよびＳ３４Ｐの変異に加え、Ｃ末にＨｉｓタグ（ヒスチジン６残基）が融合された変異体となっている。この発現ベクターを用いて、比較例２に示した方法と同様に、コマガタエラ・パストリスを形質転換した。そして、得られた変異エンドヌクレアーゼ発現酵母を、比較例３に記載の方法で培養し、培養上清を回収した。この培養上清中のヌクレアーゼ活性を実施例６に記載の方法で測定した結果、表５に示すように、Ｈｉｓタグ融合していないｍｕｔａｎｔ２９と同等の活性が得られることがわかった。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (4)

1. 以下の（ａ）及び（ｃ）の条件：
   （ａ）以下の（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列を含む、
   （ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列と９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
   （ａ２）配列番号１に示すアミノ酸配列において２～７個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列、
   （ｃ）エンドヌクレアーゼ活性を有する
   を全て満足し、
   前記（ａ１）又は（ａ２）のアミノ酸配列が、
   下記の条件（ｄ１）及び（ｅ１）：
   （ｄ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ２０に相当するアミノ酸残基がグルタミン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、バリン、ヒスチジン、アルギニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、システイン、チロシン又はフェニルアラニンである、
   （ｅ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ２２に相当するアミノ酸残基がバリン、アラニン又はリシンである、
   のうち少なくとも１つを満足し、且つ、
   下記の条件（ｆ）及び（ｇ１）：
   （ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＳ３４に相当するアミノ酸残基がプロリンである、
   （ｇ１）配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＴ３５に相当するアミノ酸残基がリシン、バリン、アルギニン又はロイシンである、
   のうち少なくとも１つを満足するアミノ酸配列であること
   を特徴とするポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター。
3. 請求項１に記載のポリペプチドと前記ポリペプチドの酵母からの分泌を可能にするシグナルペプチドとをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母。
4. 請求項３に記載の酵母を培養する培養工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。

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