KR20010020482A - 개량된 단백질 발현균주 - Google Patents

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Abstract

세포내의 플라스미드의 카피수를 조절하기 위하여 곰팡이 세포의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 변경시키는 수단을 사용하는 방법. 플라스미드에 의하여 코드화된 단백질의 카피수를 증가시키고 수율을 상승시키기 위하여, Ubc4p 또는 Ubc5p 활성의 수준이 저하/폐지 될 수 있다(예를들면 유전자 제거, 저활성 단백질의 제공을 위한 돌연변이유발, 안티센스 mRNA제조 또는 경쟁적 펩티드의 제조에 의하여).

Description

개량된 단백질 발현 균주 {Improved protein expression strains}
그간 20여년동안, 요망 외래 단백질은 미생물에서 생성되어왔다. 그러나, 필요한 코딩 서열을 도입하여 발현체를 제조하게 되었으나, 공업적 규모의 생산 공정을 최적화하기 위하여는 해결하여야 할 문제점이 여전히 남아있다. 이중 하나의 관심분야가 균주 개량인데, 즉 예를들면 보다 높은 수율과 양호한 순도로 단백질이 제조될 수 있는 숙주 미생물의 균주를 발견 또는 제조하는 것이다.
수율을 증진시키기 위하여, 한때 하나의 양호한 발현 시스템(예를들면 전사 프로모터)이 고안되었는데, 코딩 서열의 카피수를 증가시키려고 시도(이것은 DNA 전사가 제한 인자였던 경우에만 바람직한 효과가 있기는 하지만)하거나, 또는 mRNA의 안정성을 증가시키거나 단백질의 분해를 감소시키는 방향이었다. 즉 후자와 같은 시도의 일예로서, 요망 단백질을 생성하기 위하여, 특정 프로티아제에는 결핍되어있는 효모균주(예를들면 pep4-3)가 이용되었다. 다른 하나의 시도에 있어서는, 조절된 프로모터, 예를들면 GAL의 조정하에 FLP유전자를 게놈에 도입함으로써, 효모 사카로마이세스 세레비지에내의 2㎛-기준 플라스미드의 수가 증가되었다. 유일한 탄소공급원으로서 갈락토스를 함유하는 성장배지로 전환함으로써 플라스미드 카피수가 증가하나, GAL 프로모터가 REP1/REP2에 의하여 억제되지 않기 때문에 플라스미드 카피수는 조절되지 않는다. 이와같은 현상은 성장속도 및 따라서 원래의 cir+균주의 cir˚유도체의 클로날 섹션을 감소시키게 된다(11, 20).
본 발명자들은 랜덤하게 돌연변이체를 생성하기 위하여, 돌연변이원을 적용함으로써 효모균주를 돌연변이함으로써, 바라는대로 보다 양호한 수율로 이종 단백질을 생성하는 돌연변이체 균주를 발견한다(16, 21). 본 발명자들은 요망 단백질을 발현하는 플라스미드의 카피수를 보다 높게 유지한 이와같은 랜덤하게 생성된 돌연변이체를 특성화하여, 유비퀴틴 접합 효소, 소위 UBC4를 코드화하는 유전자중 하나에서 발생하는 돌연변이를 발견하였다. UBC4-코드화 효소(및 밀접하게 관련된 UBC5-코드화된 효소)는 발육이상 및 단명한 단백질의 분해에 연루되며, 이들중 어느 일방을 제거하면 제조하고자 하는 정상적인, 요망 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다고 가정할 아무런 이유가 없었다.
유비퀴틴 접합 효소(UBC)를 코드화하는 몇개의 유전자가 대량 단백질 분해 및 효모의 응력반응에 연루되었다. UBC1, UBC4 및 UBC5는 함께, 세포 성장 및 세포 생존도에 대한 중요한 요소를 매개하는 작용을 한다(2, 3). 단일 유전자에서 돌연변이 작용을 하는 효모균주는 생존가능하며, 모균주와 유사한 성장속도를 지니나, ubc4/ubc5 이중 돌연변이체는 성장속도를 저하시키며 아미노산 유사물질에 대하여 민감하며, 한편 3중 돌연변이체는 생존성이 없으며, 그들 활성이 중복되는 것으로 나타난다. UBC4 및 UBC5 유전자는 밀접한 관계가 있으며, 두 코딩 DNA 서열은 77%의 동일한 잔기를 공유하며, 두 단백질의 예상 아미노산 서열은 92% 동일 잔기를 나타낸다(3). Ubc4 및 Ubc5 단백질(이하 Ubc4p 및 Ubc5p라 한다)의 근접한 동일성 때문에, UBC4는 ubc5 돌연변이체 기능의 손실을 보충할 수 있으며, 그 역도 가능할 것으로 추정된다(3). 이와같은 사실은 성장속도의 극적인 저하현상이 왜 ubc4/ubc5 이중 돌연변이체에서만 관측되는가 하는 이유를 설명하게 된다. 파동추적실험 결과 Ubc4p 및 Ubc5p는 단명하고 비정상적인 단백질의 분해를 초래하나, 이들 단백질의 변화는 ubc4/ubc5 2중 돌연변이를 지닌 균주에서만 감소되었다는 것을 나타낸다. 수율은 단일 ubc4 또는 ubc5 돌연변이를 지닌 균주에서는 감소되지 않았다(3). 따라서, 이와같은 사실은 단일 ubc4 및 ubc5 돌연변이체 곰팡이 균주의 이용이 이롭지 않다는 것을 암시한다.
구조적으로, 모든 공지의 UBC 유전자는 보존된 접합 시스테인을 함유하는 약 16kDa의 보존 영역(UBC 영역으로 알려진)을 코드화한다(1, 22). 활성화된 유비퀴톤이 전이하면 티오 에스테르 결합을 통하여 유비퀴톤의 C-말단이 시스테인 잔기에 공유결합하게 된다. UBC 유전자는 상이한 종류로 분리된다(22에서 검토). 분류ⅠUBC 유전자는 거의 독점적으로, 보존된 UBC 영역으로 구성되고, 분류Ⅱ 및 분류Ⅲ UBC 유전자는 각각 C-말단 또는 N-말단 연장부를 가지는 반면에 분류Ⅳ UBC 유전자는 C- 및 N-말단 연장부 양방을 갖는다(22).
곰팡이 게놈은 염색체, 염색체 유전자의 염색체의 카피, 예를들면 뉴클레오솜, 및 때때로 안정한 염색체의 인자로 구성된다. 이들 염색체의 인자는 그들 숙주와 양호한 기생 관계를 개발하였는데, 여기서 그들은 인자의 복제 및 분리에 필요한 세포 지원의 절취에 성공적으로 균형을 이룬 반면에 숙주의 적합성과는 일치하지 않았다.
곰팡이 염색체외 인자에 관한 일반적인 검토는 참고문헌 5 및 6에 개시되어 있으며, 효모 사카로마이세스종의 DNA 플라스미드는 참고문헌 7 및 8에, 클루이베로마이세스종은 참고문헌 9에 있다.
사카로마이세스종의 2㎛ 플라스미드는, 어떤 관련된 표현형이 없이 장기간의 자율적 생존을 보증하기 위한 메카니즘을 진화시킨 염색체외 DNA종이다. 2㎛ 플라스미드는 세포핵내에 존재하며 염색질로 포장된다. 복제의 플라스미드 오리진은 자율적으로 복제하는 서열로서 작용하는 반면에, 다른 서열들은 조절된 높은 카피수의 유지를 보장하며, 유사분열시에 플라스미드가 딸세포로 균일하게 분리되도록 한다. 플라스미드는 정상적인 유사분열 성장에는 요구되지 않으며, cir°로 표시되는, 2㎛ 플라스미드가 결여된 사카로마이세스종은 그들 2㎛ 플라스미드 함유, 즉 cir+보다 약간 빨리 성장하기 때문에, 숙주에 어떤 선택적인 이점을 제공하지 않는다.
2㎛ 플라스미드는 약 6, 318bp의 2중사슬 환상 플라스미드로, 각각이 599bp길이인, 한쌍의 정확한 역반복 서열에 의하여 분리된 두개의 독특한 영역인 2, 774bp 및 2, 346bp를 포함한다(10). 생체내에서, 단량체 플라스미드는 두개의 역반복서열 사이에 후속부위 특이 재조합을 형성하는 2개의 역 이성체(A 및 B)의 동등한 혼합물로 존재한다. 2㎛ 플라스미드는 ELP(A로도 알려짐), REP1(B로도 공지), REP2(C로도 공지) 및 RAF(D로도 공지)로 알려진 4개의 오픈 리딩 프레임을 갖고 있다. 플라스미드는 또한 STB 또는 REP3로 불리우는, RAF 및 복제의 오리진 사이에 위치하는 영역을 함유하는데, 이 영역은 일련의 불완전한 62bp 반복인자로 구성된다. 이 인자는, 트란스 작용 인자와 함께 시스 REP1및 REP2에서 요구되어, 모세포 및 딸세포 사이에 플라스미드의 효율적인 분리를 가능케 한다.
2㎛ 플라스미드 카피수는 상이한 사카로마이세스 세레비지에 균주사이에서 변화하지 않는 것으로 알려져 있고, nib1으로 알려진 염색체 열성돌연변이가, 2㎛ 플라스미드 카피수의 조절되지 않은 증폭때문에 클론 치명성을 야기하기 때문에, 2㎛ 플라스미드 카피수도 염색체 유전자의 조절하에서 간접적인 영향을 받는다(39). nib1 돌연변이를 지니는 효모균주는 조작된 효모균주를 닮는데, 여기서 FLP유전자 발현은 갈락토오스 유도이다. 곰팡이 플라스미드 카피수의 조절에서 곰팡이 ATP-의존 유비퀴틴 단백질 분해 과정의 단백질의 연루는 당 분야에 개시되어 있지 않다. 또한 곰팡이 ATP-의존 유비퀴틴 단백질 분해 과정의 유전자가 조작되어 곰팡이 플라스미드 카피수를 조절할 수 있다는 것도 개시되어 있지 않다.
2㎛ 플라스미드가 사카로마이세스 세레비지에의 매우 일반적인 유전자 성분이기는 하나, 기타 효모균주는 확인 가능한 DNA 플라스미드, 특히 지고사카로마이세스 로욱시의 pSR1 및 pSB3 플라스미드(6, 251bp 및 6, 615bp), 지고사카로마이세스의 바일리의 pSB1 및 pSB2 플라스미드(6, 550bp 및 5, 415bp), 지고사카로마이세스 페르멘타티의 pSM1 플라스미드(5, 416bp) 및 클루이베로마이세스 드로소필라룸의 pKD1 플라스미드(4, 757bp)를 함유하는 것으로 알려져있다(9). 이들 모든 플라스미드의 가장 현저한 특징은 사카로마이세스 세레비지에 2㎛ 플라스미드에 대한 이들의 유사성이다. 각 플라스미드는 환형의 2중사슬 DNA이며 역반복 서열에 의하여 분리된 2개의 대략적으로 동일한 크기의 절반부로 구성된다. 각 플라스미드는 역반복 서열의 하나에 근접한 단일의 자율적 복제 서열(ARS; Autonomously Replicating Sequence) 및 3또 4개의 오픈 리딩 프레임을 함유하는데, 이들중 하나는 역반복 서열 사이의 재조합에 촉매작용을 하는 리콤비나제를 코드화한다.
사카로마이세스 세레비지에 플라스미드가 적어도 하나의 2㎛ 플라스미드 인자(ARS, 역반복 서열 또는 2㎛ 오픈 리딩 프레임), 특히 ARS를 함유할 경우, “2㎛-기준”으로 간주된다.
본 발명은 모균주보다 실제적으로 높은 수준으로 단백질을 발현하는 곰팡이 균주의 개발에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 관점은 곰팡이 세포 유도 생성물의 제조방법을 제공하는 것인데, 상기 방법은 (i) 단백질에 대한 기능성 코딩 서열을 포함하는 플라스미드를 갖는 곰팡이 세포에 있어서, 상기 세포가 변형된 수준의 Ubc4p 또는 Ubc5p(이하 유전학적으로 일반적으로 알려진 Ubcp 활성이라함)를 갖는 곰팡이 세포를 제공하는 단계 및 (ⅱ) 곰팡이 세포 유도 생성물을 제조하기 위하여 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 곰팡이 세포 유도 생성물은 상기 코딩 서열에 의하여 코드화된요망 단백질이며, 상기 변형된 수준의 Ubcp 활성은 세포에 대한 정상치보다 낮다. 이것은 비정상 단백질 전환의 속도를 분석함으로써 생체내에서 시험될 수 있다(3). Ubcp(Ubc4p 및/또는 Ubc5p) 활성의 수준은 와일등형 수준의 최대 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 1%로 저하될 수도 있다. 바람직하게는, 세포는 최소의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 갖는다. 그러나 세포는, 그 성장속도가 일반적으로 너무 낮아 유용하지 못하기 때문에, Ubc4p 및 Ubc5p 양방의 낮은 수준을 지닌다.
Ubcp 활성의 저하는 다양한 방법중 하나로 달성될 수 있다. 첫째, 세포는 UBC-코드화 생성물이 그 수용체에 결합하는 것을 방해하는 화합물을 생성할 수 있다. 따라서, Ubc4p 또는 Ubc5p가 그 표적에 결합하기 위하여 경쟁하는 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 세포내에 하나의 구조가 제공될 수도 있다. 이것은 유효한 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성의 저하를 용이하게 한다. 이것은 상술한 UBC4 또는 UBC5에 의하여 코드화된 UBC 영역을 과다 발현시킴으로써 수행될 수 있다. UBC4 또는 UBC5에 의하여 코드화된 과다 발현 UBC 영역은 그 자신은 어떤 고유한 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성도 갖지 않도록 보증하는 것이 중요한데, 그 까닭은 이것이 전체적인 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성에 사실상 기여할 수도 있기때문이다. 이것은 부위 지향 돌연변이유발에 의하여, UBC4(또는 5)의 UBC 영역내에서 유비퀴틴에 대한 수용체 부위로 작용하는 시스테인 또는 UBC 영역내에서 다른 보존 아미노산을 제거 또는 대체(예를들면 알라닌으로)함으로써 달성될 수도 있다. UBC4(또는 5)의 불활성 UBC 영역의 과다 발현은, 그 자신의 내생적 프로모터, 또는 임의의 기타 편리한프로모터로 부터 달성될 수있다. 그 구조는 염색체 또는 에피소말로 일체를 이룰 수 있다.
다른 방법으로, 저하된 수준의 Ubcp 활성을 달성하기 위하여, 사실상 단백질이 전혀 생성되지 않거나, 또는 생성된 단백질이 저하된 수준의 Ubcp 또는 Ubc5p 활성을 갖도록 내생적 UBC 유전자가 변형될 수도 있다. 즉, 예를들면, 플리펩티드가 전혀 생성되지 않거나 또는 돌연변이(불량) 폴리펩티드 생성물이 제조되도록, UBC 유전자가 제거될 수 있다(조정영역이나 코딩영역 또는 양영역에서). (본 발명자들은 “조정영역”에, 예를들면 UBC 유전자 활성제를 생성하는 유전자와 같은, UBC 유전자에 간접적으로 작용하는 게놈의 부분을 포함시킨다). UBC 오픈 리딩 프레임(14)은 Ubcp 활성을 저하시키거나 폐지시키고, 비복귀 돌연변이체 곰팡이 균주를 생성하기 때문에, 이들의 전부 또는 일부를 제거하는 것이 바람직하다. 선택적인 방법으로, 활성은 고전적인 돌연변이유발 방법에 의하여 저하 또는 폐지될 수 있는데, 이에 따라 Ubcp의 정상적인 아미노산 서열을 변형 및/또는 분열시키는 점돌연변이 또는 제거가 일어나도록, UBC 유전자의 DNA 서열이 돌연변이된다. 돌연변이체 Ubcp 폴리펩티드가 생성되면, 이것은 불안정(즉, 천연 단백질에 비하여 단백질의 변환이 증가)하거나; 또는 유비퀴틴을 변환시키는 것을 불가능하게 하거나, 또는 결합된 유비퀴틴을 그 기재로의 운송을 불가능하게 할 수도 있다.
예를들면, 경쟁적(그러나 불활성인) 폴리펩티드의 생성에 관한 문맥에서 지적한 바와같이, 시스테인으로 포위된 또는 그렇지않으면 시스테인과 상호작용하는 아미노산 잔기에서의 변경때문에, UBC 유전자는, 그로 부터 생성되는 임의의 단백질의 유비퀴틴 수용 시스테인이 결여되거나, 또는 유비퀴틴 수용 활성이 저하되도록 변형될 수도 있다. 선택적인 방법으로, UBC 유전자는, 그로 부터 생성된 임의의 돌연변이 단백질의 역량이 E1 유비퀴틴 공여체(UBA1 또는 UBA2 유전자)와의 상호작용이 불가능하거나 또는 상기 공여체에 대한 친화력이 감소되도록 변형될 수도 있다. 또 다른 방법으로, UBC 유전자는, 그로 부터 생성된 임의의 돌연변이 단백질이 최종 유비퀴톤 수용체 및/또는 유비퀴틴 리가제(E3)효소와 상호작용하는 역량이 결여되거나 감소되도록 변형될 수도 있다. 구체적으로, 1차 서열의 첫째 21 아미노산 및 Ubc4p 및 Ubc5p(29)의 첫째헬릭스(잔기 3 ∼ 13)내에서의 돌연변이(제거, 삽입 또는 치환)이 바람직한데, 그것은 후자가 Ubc2p, 관련 단백질의 유비퀴틴 단백질 리가제 Ubr1p로의 결합에 연루되기 때문이다(33). 특히 바람직한 것은 Ubc4p 및 Ubc5p의 1차 서열내의 위치 10(Glu-10)에 글루탐산을 작용시키는 돌연변이, 구체적으로 라이신(Glu10Lys)또는 아르기닌(Glu10Arg)에 의한 치환이 바람직하다.
선택적인 방법으로, UBC 유전자의 발현을 조절하기 위하여 상이한 프로모터가 사용될 수도 있는데; 이와같은 프로모터는 조절가능한 것일 수 있다. 예를들면, 갈락토오스 이용경로의 프로모터와 같이 상기 프로모터는 유도가능한 것일 수도 있으며, 산 포스파타제 그룹의 프로모터와 같이, 억제제의 제거에 의하여 활성화될 수도 있다.
참고문헌 23에 기재된 바와같이, 치환, 삽입, 제거 및 전위와 같은 단일 또는 다수의 돌연변이를 창출하기 위하여 부위지향 돌연변이유발 또는 기타 공지의 기술이 채택될 수 있다. 적절한 돌연변이에는, 사슬종결 돌연변이(분명히 3'단부 부근에 도입된 종지코돈은 유용하여야 할 유전자 산물에 대하여 불충분한 효과를 가지게되며; 당 분야의 숙련자는 말하자면 5' 3/4의 코딩 서열에 용이하게 돌연변이를 일으킬 수 있다). 리딩 프레임을 변경시키는 점돌연변이, 코딩 서열의 작은 제거에서 큰 제거, 유전자 발현에 작용하는 프로모터 또는 터미네이터에서의 돌연변이 및 mRNA를 탈안정화시키는 돌연변이가 내포된다. 유전자 변좌로 알려진 유전자 분열기술의 연장에 의하여 특정 돌연변이가 유발될 수 있다(24).
일반적으로 유전자 서열을 분열시키기 위하여 선택성 마이커가 사용되나, 분열사실을 표현형적으로 검출할 수 있을때에는, 그와같은 방법은 불필요한 경우가 된다. 많은 경우에 있어서, 개재 배열의 삽입은, 종지코돈이 UBC 서열과 함께 프레임에 존재하며 삽입된 코딩 서열은 번역되지 않는다. 선택적으로, 삽입된 서열은 UBC와 상이한 리딩 프레임에 존재할 수도 있다.
Ubcp 활성의 저하를 달성하기 위한 세번째 주요 방법은 UBC 안티센스 mRNA를 생성하는 세포에 대한 것이다. 이것은 적절한 서열을 위한 발현구조를 세포내에 내포시키는, 종래의 방법으로 달성될 수도 있다. UBC 안티센스 mRNA는, 구성 또는 조절된 프로모터 시스템(예를들면 갈락토스 이화작용 경로의 프로모터)으로 부터 제조될 수도 있으며, 그에 따라 번역 가능한 UBC mRNA의 감소를 용이하게 한다. 조절된 UBC 안티센스 mRNA를 사용하면, 활성제의 첨가 또는 제거에 의하여 유비퀴틴 의존 단백질 분해 경로의 조절도 가능하게 된다.
본 발명의 방법에 유용한 곰팡이 세포에는 속, 피치아, 사카로마이세스, 지고사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토루롭시스, 한세눌라(현재 피치아로 재분류), 시조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파치솔렌, 데바로마이세스, 아스페르길레스, 메추니코위아, 로오도포리둠, 루코스포리둠, 보트리오아스커스, 엔도마이코피스, 트리코데르마, 세팔로스포리움, 후머콜라, 무코르, 뉴로스포라등이 포함된다. 바람직한 속은 피치아, 사카로마이세스, 지고사카로마이세스 및 클루이베로마이세스이다. 사카로마이세스종의 예에는 사카로마이세스 세레비지에, 사카로마이세스 이탈리쿠스, 사카로마이세스 디아스타티쿠스 및 지고사카로마이세스 로욱시가 있다. 클루이베로마이세스종의 예에는 클루이베로마이세스 프라길라스 및 클루이베로마이세스 락티스가 있다. 한세눌라종의 예에는 한세눌라 폴리모르파(현재 피치아 안구스타), 한세눌라 아노말라(현재 피치아 아노말라) 및 피치아 캡술라타가 있다. 피치아종의 예는 피치아 파스토리스이다. 아스페르길루스종의 예는 아스페르길루스 나이거 및 아스페르길루스 니두란스이다. 야로위아 리폴리티카는 적절한 야로위아종의 일례이다.
바람직한 것은 효모균주인데, 이들 사카로마이세스 세레비지에의 것은 특히 바람직한 숙주이다. 사용된 효모균주는 사카로마이세스 세레비지에의 임의의 일배체 또는 이배체일 수 있으나, 이배체 균주일 경우, UBC 유전자의 양방 카피로 부터의 Ubcp 효소의 활성이 저하 또는 폐지되는 것이 바람직하다.
다수의 종이 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 및 UBC5 유전자의 동족체를 갖는 것으로 나타났다. UBC4 및 UBC5 동족체는 호모 사피언스(34), 도로소필라 멜라노가스터(35), 카에노르하브디티스 엘레간스(36), 아라비돕시스 탈리아나(37), 시조사카로마이세스 폼베 및 칸디다 알비칸스(38)에 기재되어 있다. 드로소필라 멜라노가스터 및 카에노르하브디티스 엘레간스 동족체, UbcD1 및 ubc-2 각각도 Ubcp 활성을 갖는 것으로 나타났다. 동족체가 UBC4 또는 UBC5로 명명될 필요는 없으며, 마찬가지로 UBC4 또는 UBC5로 불리우는 유전자가 동족체일 필요가 없다는 것을 알 수 있다.
문헌에 공지된 UBC4/UBC5 동족체중에서, 1차 아미노산 서열을 정렬함으로써 다양한 단백질의 유사성이 계산될 수 있다. 적절한 프로그램은 메갈라인 프로그램(Megalign Program, Lasergene, DNASTAR Inc. (228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, USA)이다. 이와같은 프로그램을 사용하면 계산된 유사도 백분율은 75.7% ∼ 97.3%가 된다. 이들 수치는 매우 높은 값인데, Ubc 단백질의 성질이 고도로 보존된 것을 반영한다. 활성부위에서 고도로 보존된 시스테인 잔기는 일치 서열에서 위치 193에서 발생한다.
기타 Ubc 단백질중에서, 그들 사이 및 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 및 Ubc5p에 대하여 계산된 백분율 유사도는 24.2% ∼ 63.5%이다. 따라서 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 및 Ubc5p에 대하여 동족성인 단백질은 임의의 분류Ⅰ(젠트쉬(Jentsch), 1992, 참고문헌 22에 의하여 정의된 바와같은) 유비퀴틴 접합 효소로 규정 될 수 있는데, 상기 효소는 메갈라인 프로그램에 의하여 정의된 바와같이, 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 또는 Ubc5p에 대하여 66.7% 이상의 1차 아미노산 서열 유사성을 갖는다. 유전자가 이와같은 효소를 코드화하면 그 유전자는 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 또는 UBC5에 대하여 동족성인 것으로 여겨진다.
다수의 종도 Ubcp 활성을 지니는 것으로 나타났다. 전술한 바와같이, 사카로마이세스 세레비지에의 ubc4/ubc5 이중 돌연변이체는 배가시간을 증가, 아미노산 유사체에 대한 저항성을 감소 및 열충격에 대한 저항성을 저하시킨다. 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 및 Ubc5p에 대하여 각각 79.6% 및 80.3%의 유사성을 지니는, UbcD1 유전자에 의하여 코드화된 드로소필라 UBC1 단백질이, UBC4 프로모터의 하류에 위치할 때 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성이 없는 효모의 표현형을 전환시킬 수 있다는 것이 알려져있다(35). 마찬가지로, 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 및 Ubc5p에 대하여 각각 78.2% 및 78.9%의 유사성을 지니는, ubc-2 유전자에 의하여 코드화된 카에노르하브디티스 단백질 ubc-2가 동일한 특성을 지니고 있다는 것도 알려져있다(36). 따라서, 이것은 미지의 공급원으로 부터 제공된 단백질이 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 지니는지의 여부에 대한 기능적 시험이 된다. 배가시간 및 38℃에서 24시간 후의 생존율의 예로서, 수퍼트(Seufert) 및 젠트쉬에 의하여 기술된 단일 ubc4 또는 ubc5 돌연변이체 균주(3, 36)가 와일드형 균주에 대하여 유사한 특성을 지니고 있다는 것도 알 수 있다. 일단 미지의 또는 돌연변이체 ubc 단백질이, 바람직하게는 참고문헌에서 이미 기술한 바와같은 방법에 의하여 내생적 UBC4 또는 UBC5 위치에서의 단일 카피 일체로서, 내생적 UBC4 또는 UBC5 프로모터의 조절하에 사카로마이세스 세레비지에 게놈으로 일체화되면, 천연 사카로마이세스 세레비지에 Ubc4p 또는 Ubc5p에 대하여 상대적인 미지의 Ubc 단백질의 Ubcp 활성, 또는 공지의 Ubc 단백질의 돌연변이체 형태는, 배가시간 및 38℃에서 24시간 후의 생존율(참고문헌 3 또는 36에 기재된 바와같이)을 와일드형 또는 단일 ubc4 또는 ubc5 돌연변이체 사카로마이세스 세레비지에 균주에 대한 정상상태로 회복시킬 수 있는 이중 ubc4/ubc5 돌연변이체 균주의 상대적 능력에 의하여 결정될 수 있다(36).
본 발명의 바람직한 관점에서, Ubc4p 또는 Ubc5p 활성의 수준은 저하된다. 이것은 세포의 발현 플라스미드의 카피수를 증가시키고, 플라스미드로 부터 발현된 요망 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것으로 판명되었다. 반대로, Ubc4p 또는 Ubc5p의 활성의 수준을 증가시키면 단백질의 발현수준이 저하되는데, 이와같은 현상은, 예를들면 플라스미드 코드화 단백질이 요망 단백질의 생성을 억제하는 일부 경우에 있어서 바람직할 수 있다.
“요망 단백질”이라는 용어는 여기서, 곰팡이 세포가, 인간의 개입없이, 단백질을 생성하는 수준보다 높은 수준의, 소정의 공정에서 요구되는 임의의 단백질(또는 기타 폴리펩티드)를 의미하기 위하여 상식적으로 사용된다. 요망 단백질은 본 종에 대하여 내생적일 수 있는데, 예를들면 숙주세포에 의하여 정상적으로 생성되는 효모일 수도 있다. 그러나 통상적으로, 단백질은 숙주세포에 대하여 이종성이다. 단백질은 추출됨이 없이 숙주세포 또는 숙주세포 배양체에서 그 요구되는 목적을 수행할 수도 있다. 그러나 통상적으로, 단백질은 세포 배양체로 부터 추출되며 다른 용도를 위하여 일정한 정도로 정제된다. 단백질은 비루스, 미생물, 곰팡이, 식물 또는 포유동물 단백질과 같은 동물 단백질일 수도 있다. 바람직하게는, 그것은 인체 단백질인데, 예를들면 알부민, 면역글로불린 또는 그들 단편(Fab 단편 또는 단일 사슬 항체와 같은), (헤모)글로빈, 혈병화 인자(Ⅱ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ와 같은 인자), 인터페론, 인터루킨,-안티트립신, 인술린, 칼시토닌, 세포 표면 수용체, 피브로넥틴, 프로-유로키나제, (프레-프로)-키모신, 백신에 대한 항원, t-PA, 종양괴사인자, 적혈구생성소, G-CSF, GM-CSF 성장 호르몬, 혈소판 유도 내피세포 성장인자, 및 일반적으로 글루코오스 옥시다제 및 초과산화물 디스무타제와 같은 효소이다. 단백질은 물론 Ubc4p 또는 Ubc5p 그 자체가 아니며, Ubc4p 또는 Ubc5p가 그 본래의 기능을 수행하는, Ubc4p나 Ubc5p의 융합체도 아니다.
요망 단백질이 곰팡이 세포 배양체로 부터 정제될 것이라면 단백질은 그 단백질에 적합한 임의의 기술에 의하여 제조될 수 있다. 예를들면, 알부민은 WO96/97515, EP-625 202 또는 EP-464590에 각각 개시된 기술에 따라 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 또는 피치아 세포 배양물로 부터 정제될 수 있다.
본 발명이 인체 헤모글로빈의 발현에도 유용하다는 것을 보이고 있기 때문에, 본 발명의 방법이 오직 알부민에만 적용할 수 있다고 가정할 이유는 전혀 없지만, 본 발명자들은 주로 인체 알부민을 포함하였다.
“인체 알부민”이라는 용어는 여기서, 인체 혈청 알부민과 구별할 수 없거나 또는 그 변이체 또는 단편인 물질을 가르키기 위하여 사용된다. “변이체”에는 보존적이거나 비보전적이거나 간에, 삽입체, 제거체 및 치환체가 포함되는데, 이와같은 변화는 알부민의 교질, 유용한 리간드 결합 또는 면역원성을 실질적으로 변경시키지 않는다. 예를들면, 본 발명자들은 EP-A-322 094에 개시된 바와같은 인체 알부민 또는 인체 알부민 유사체의 천연 발생 다형성 변이체를 포함한다. 일반적으로, 인체 알부민의 변이체 또는 단편은 50%이상(바람직하게는 80%, 90% 또는 95%이상)의 인체 혈청 알부민의 리간드 결합활성(예를들면 빌리두빈 결합) 및 50%이상(바람직하게는 80%, 90% 또는 95%이상)의 인체 혈청 알부민의 교질활성을 갖게된다.
요망 단백질 코딩 영역은 바람직하게는, 프로모터 서열, 프로모터의 전사조절하에 있는 DNA 코딩 서열, 단백질의 분비를 지시하는 리더 서열 및 진핵 전사종결시그널을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 플라스미드에 함유되며, 플라스미드는 다음에 염색체의 DNA 서열로서 유지되거나 또는 숙주기관의 하나 이상의 염색체로 통합된다.
단백질 발현을 위한 적절한 프로모터에는 포스포글리세레이트키나제(PGK1) 유전자, 갈락토키나제(GAL1) 및 유리딘 디포스포글루코오스4-에피머라제(GAL10) 유전자, 이소-1-사이토크롬 c(CYC1), 산 포스파타제(PHO5), 알코올 디히드로게나제 유전자(ADH1 및 ADH2) 및 MF-1와 결합된 것들이다. 바람직한 프로모터는 EP 424 117에 기재된, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제(GPD1) 및 EP-431 880 B1에 기재된 프로티아제 B(PRB1) 프로모터이다.
적절한 전사종결 서열은 곰팡이 숙주내에 전사종결 및 폴리아데닐화를 위한 적절한 시그날을 함유하는 진핵 유전자의 3'인접서열 또는 발현조절 서열에 자연적으로 연결된 유전자의 서열, 또는 포스포글리세레이트 키나제(PGK1) 또는 이소-1-사이토크롬 c (CYC1) 유전자와 결합된 서열이다. 바람직한 전사종결 서열은 알코올 디히드로게나제 유전자(ADH1)로 부터 나온 것이다.
적절한 분비리더 서열은, 예를들면 WO 90/01063에 기재된 바와같이, 천연 인체혈청 알부민 리더 서열, 사카로마이세스 세레비지에 MF-1 리더 서열로 부터의 리더 서열, 클루이베로마이세스 락티스 킬러 폭스리더, 천연 인체혈청 알부민 리더 및 사카로마이세스 세레비지에 MF-1 리더 서열간의 융합체 또는 클루이베로마이세스 락티스 킬러 독소리더 및 사카로마이세스 세레비지에 MF-1 리더 서열간의 융합체 또는 보전적으로 변행된 이들 서열의 변이체이다.
혼성 플라스미드도 사용될 수 있는데, 이것은 발현조절 서열, 이종 유전자 서열 및 전사종결 서열과는 달리, 프로모터의 기능, 즉 요망 폴리펩티드의 발현에는 필수적이 아니거나 중요하지 않은 추가의 서열을 함유하나, 예를들면 상기 혼성 플라스미드로 형질전환된 세포의 증식에 있어서 중요한 기능을 수행한다. 추가의 DNA 서열은 진핵 및/또는 원핵세포로 부터 유도될 수 있으며, 염색체 및/또는 염색체외 DNA 서열을 내포할 수 있다. 예를들면, 추가의 DNA 서열은 박테리아, 효모 또는 보다 높은 진핵 염색체 DNA와 같이, 플라스미드 DNA로 부터 유래(또는 구성)될 수 있다. 바람직한 혼성 플라스미드는, 박테리아 플라스미드, 구체적으로 에스체리치아 콜리 플라스미드 pBR 322 또는 관련 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 2μ플라스미드, 및/또는 효모 염색체 DNA로 부터 유도된 추가의 DNA 서열을 함유한다.
이종 폴리펩티드의 발현을 위한 바람직한 혼성 플라스미드에 있어서, 추가의 DNA 서열은 효모 복제 기원 및 효모에 대한 선택적 유전자 마아커를 운반한다. 예를들면 자율적 복제 세그먼트(ARS)와 같은 효모 복제 기원을 함유하는 혼성 플라스미드는 형질전환후에 효모세포와 함께 염색체외로 유지되며, 유사분열시에 자율적으로 복제된다. 효모 2㎛ 플라스미드 DNA와 동종인 서열을 함유하는 혼성 플라스미드도 물론 있을 수 있다. 이들 혼성 플라스미드는 재조합에 의하여 세포내에 이미 존재하는 효모 2㎛ 플라스미드와 일체를 이룰 수 있으며 또는 자율적으로 복제할 수 있다. EP-A-251 744의 통합 벡터 또는 EP-A-286 424의 “비통합” (disintegration)벡터가 사용될 수도 있다.
혼성 플라스미드에 존재하는 추가의 DNA 서열도, 복제 기원 및 박테리아 숙주, 구체적으로 에스체리치아 콜리에 대한 선택적 마아커, 및 최종 곰팡이 숙주에 대한 선택성 마아커를 내포한다. 효모 혼성 플라스미드내의 에스체리치아 콜리 복제 기원 및 에스체리치아 콜리 마아커의 존재와 관련하여 유용한 특징이 있다. 첫째, 에스체리치아 콜리에서의 성장 및 증폭에 의하여 다량의 혼성 플라스미드 DNA가 제조될 수 있으며, 둘째 혼성 플라스미드의 구성이, 에스체리치아 콜리를 기초로 한 클론닝 기술의 전 레퍼토리를 사용하게 하는 에스체리치아 콜리에서 편리하게 이루어진다. pBR 322등과 같은 에스체리치아 콜리 플라스미드는 테트라사이클린 및 암피실린과 같은 항체에 대하여 저항성을 부여하는 에스체리치아 콜리 유전자 마아커 및 에스체리치아 콜리 복제 기원 모두를 함유하며, 효모 혼성벡터의 부분으로서 편리하게 채택된다. 선택적 곰팡이 마아커는, 마아커의 표현형 발현때문에 형질전환체의 선별을 촉진하는 임의의 유전자일 수 있다. 적절한 마아커는 특히, 항체 저항성을 발현하는 것들, 또는 영양요구성 효모 돌연변이체의 경우에서와 같이, 숙주 병소를 보완하는 유전자이다. 해당 유전자들은 예를들면 항체 시클로헥시이미드에 대한 저항성을 제공하거나 또는 영양요구성 효모 돌연변이체, 예를들면 URA1, URA3, LEU2, HIS3, HIS4, TRP5, TRP1 및 LYS2 유전자에 원영양성을 제공한다.
속 피치아, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 야로위아 및 한세눌라의 곰팡이 세포가 세포벽의 효소소화에 의하여 형질전환되어 스페로플라스트를 제공하며, 스페로플라스트는 다음에 형질전환 DNA와 혼합되어, 칼슘이온 및 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 배양된 후 형질전환된 스페로플라스트는 재생 배지에서 재생된다는 것이 알려져 있다. 재생 배지는 형질전환된 세포가 동시에 재생 및 선별되도록 제조된다.
핵산 또는 아미노산 생합성 경로의 효소를 코딩하는 효모 유전자는 일반적으로 선별 마아커로서 사용되기 때문에, 재생은 바람직하게는 효모 최소배지에서 수행된다. 사카로마이세스 세레비지에의 형질전환 방법은 EP 251 744, EP 258 067, WO 90/01063 및 힌넨(Hinnen)등(4)에 의하여 알 수 있는데, 이들 모두가 여기서 참고로 인용된다.
따라서, 가장 넓은 의미에서, 본 발명은 세포내의 플라스미드의 카피수를 조절하기 위하여 곰팡이 세포의 UBC4 또는 UBC5 기능을 변경시키는 수단을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 비제한 구체예가 하기 실시예 및 첨부되는 도면을 참고로 하여 기재된다.
제 1도는 pDB2277의 플라스미드 지도이다.
제 2도는 ubc5 분열 효모의 증가된 rHA 생산성을 나타내는 로켓 면역전기영동법 겔의 사진이다. 균주는 다음과 같다: 샘플1, DS569 ura3［pAYE329/YCplac33］; 샘플 2 ∼ 17, DS569 ura3 ［pAYE329/pDB2276］형질전환체 1 ∼ 16; 샘플 18 ∼ 33, DS1101 ura3 ［pAYE329/pDB2276］형질전환체 1 ∼ 16; 샘플 34 ∼ 38 HSA 표준 100, 75, 50, 30 및 20㎍/㎖ HSA.
제 3도는 효모 사카로마이세스 세레비지에 유전자 UBC4의 게놈 DNA 서열이다; 2.066kb 서열은 UBC4 오픈 리딩 프레임의 개시점의 PstI 부위 0.95kb 상류로 부터 변역 종지 코돈의 PstI 부위 0.58kb 하류까지 연장된다.
제 4도는 pAYE399의 플라스미드 지도이다.
제 5도는 pAYE400의 플라스미드 지도이다.
제 6도는 pUBT1의 플라스미드 지도이다.
제 7도는 pUBT2의 플라스미드 지도이다.
제 8도는 pHbD2-1의 플라스미드 지도이다.
제 9도는 pAYE792의 플라스미드 지도이다.
제 10도는 pBST+의 플라스미드 지도이다.
제 11도는 pDB2258의 플라스미드 지도이다.
제 12도는 pDB2259의 플라스미드 지도이다.
제 13도는 pDB2260의 플라스미드 지도이다.
제 14도는 pDB2261의 플라스미드 지도이다.
제 15도는 사카로마이세스 세레비지에 UBC5 유전자의 게놈 DNA 서열이다; 1.2kb 서열은 UBC5 오픈 리딩 프레임의 개지점의 BgⅠⅡ부위 0.55kb 상류로 부터 번역종지코돈의 BclI 부위 0.12kb 하류로 연장된다.
제 16도는 pDB2262의 플라스미드 지도이다.
제 17도는 pDB2264의 플라스미드 지도이다.
제 18도는 pDB2275의 플라스미드 지도이다; 및
제 19도는 pDB2276의 플라스미드 지도이다.
별도의 언급이 없는 한 모든 표준 재조합 DNA 공정은 참고문헌 13에 기재된 바와 같다.
실시예 1: 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 분열.
사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자가 염색체Ⅱ상에 위치한다. UBC4 유전자의 DNA 서열은 제 3도에 도시된다.
UBC4 유전자가 유전자 분열방법(14)에 의하여 돌연변이 되었는데, 여기서 모든 UBC4 오픈 리딩 프레임이 제거되어 활성 Ubc4 단백질의 생성이 방해된다. 이것은, 우선 UBC4 오픈 리딩 프레임에 대한 영역 5'및 3'와 동일한 DNA 서열을 내포하도록, URA3 유전자의 5'및 3'단부를 변형시킨 돌연변이유발 단일사슬 DNA 프라이머를 지닌 적절한 마아커 유전자(URA3)를 PCR에 의하여 증폭시킨 후 ura3 영양요구성 효모균주를 유라실 원영양성으로 형질전환시킴으로써 달성된다.
극단에 UBC4 서열이 첨합되어 있고, URA3 유전자의 5'및 3'단부의 PCR 증폭에 적절한 2개의 단일사슬 올리고뉴클레오티드 프라이머(UBC4URA1 및 UBC4URA2)는 ABI 380B DNA 합성장치를 이용하여 합성되었다.
PCR 반응은 플라스미드 YEp24로 부터 URA3 유전자를 증폭시키기 위하여 수행된다(15). 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 1㎍/㎖ 플라스미드 YEp24 DNA, 2μΜ의 각 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 45℃로 40초간 아닐, 72℃에서 120초간 20회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕, 선택적인 조건은, 제조자의 지시에 따라, 2ng/㎖ 플라스미드 YEp24 DNA, 0.1μΜ의 각 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 40초간 55℃로 아닐, 72℃에서 120초간 30회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕. 생성물, 5'-UBC4-URA3-UBC4-3'는 겔 전기영동법으로 분석되어, 예상크기인 약 1.2kb로 판명되었다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 지시에 따라 프로메가 위자드(Promega Wizard) PCR DNA 정제 키드를 이용하여 정제되었다.
사카로마이세스 세레비지에 균주 DS569 cir°(16)는 재조합 인체 알부민(rHA) 분비 플라스미드 pAYE329로, 루이신 원영양성으로 형질전환 되었다(19). 이 플라스미드내의 프로모터 서열은, 원래 기술된 바와 같이, FAD-연결 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(GUT2) 유전자보다는, 사카로마이세스 세레비지에 NAD-연결 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제(GPD1) 유전자의 것에 해당한다(19).
URA3 코딩 서열의 부분을 제거한 유전자분열의 방법(14)에 의하여 URA3 유전자를 돌연변이시키고, 그로 인하여 활성 Ura3 단백질의 생성을 방지함으로써 사카로마이세스 세레비지에 균주 DS569［pAYE329］의 ura3 영양요구성 유도체가 창출되었다. 플라스미드 YEp24(15)는 HindⅢ로 소화되어 완성되고 생성물은 겔 전기영동법으로 분석되었다. 1.17kb HindⅢ URA3 유전자 단편이 유리되고 pAYC184의 특이적 HindⅢ 부위(17)에 결찰되어 플라스미드 pAYE399를 창출하였다(제 4도). 플라스미드 pAYE399는 PstI으로 소화되어 완성되며 NocI로 부분적으로 소화되고, 생성물은 겔 전기영동법으로 분석되었으며, URA3 유전자의 중앙부가 결여된 5.4kb NcoI-PstI DNA 단편이 유리되어, 무딘-단부가 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편으로 충전되어 재결찰되었다. 생성된 플라스미드 pAYE400(제 5도)은 URA3 오픈 리딩 프레임내에 제거부분 및 제거부위에 NcoI 부위를 소유한다. URA3 유전자의 제거 유도체(URA3)가 플라스미드 pAYE400으로 부터 0.94kb HindⅢ 단편으로서 유리되었다.URA3 0.94kb HindⅢ 단편으로 DS569 ［pAYE329］를 형질전환시키고 5-플루오로-오로트산에 대한 저항성에 의하여 Ura-효모를 선별함으로써, DS569 ［pAYE329］의 ura3 영양요구성 돌연변이체가 창출되었다(18). 이배지에서 성장 가능한 군집이 정제되어, 그들이 유라실 보충없이는 성장이 불가능하며, 그 결핍은 형질전환에 의한 URA3 유전자의 도입에 의하여 보완될 수 있다는 것을 입증하기 위한 시험을 하였다.
이와같은 하나의 균주, DS569 ura3［pAYE329］가 5'-UBC4-URA3-UBC4-3' PCR 생성물로, 유라실 원영양성으로 형질전환되었다. 다수의 형질전환체의 분해된 게놈 DNA의 사우턴 블롯트가, 2.07kb PstI DNA 단편으로서 UBC4 유전자로 프로우브 검사되어 UBC4 유전자의 분열을 확인하였다. 새로운 균주는 UBO5［pAYE329］로 명명되었다.
이들 방법은 임의의 일배체 사카로에세스 세레비지에 균주의 분열에 동일하게 적용가능하다. 요망 숙주가 이미 ura3 영양요구성 돌연변이를 지니고 있으면, UBC4의 분열은, 상술한 5'-UBC4-URA3-UBC4-3' PCR 생성물로 수행될 수 있다. 요망 일배체 숙주가 ura3 영양요구성 돌연변이를 지니고 있지 않다면, 일단 pAYE400으로 부터URA3 0.94kb HindⅢ 단편으로 형질전환에 의하여 균주가 제조되고, 상술한 바와같이 5-플루오로-오로트산에 대한 저항성에 의하여 Ura-효모가 선택되면, UBC4의 분열은 수행될 수 있다. 2배체 숙주의 경우에 있어서, UBC4 유전자 양방을 분열시킬 필요가 있다. 이것은 2배체화 전에 먼저 2개의 모일배체 균주의 각각에 있는 UBC4 유전자를 분열시킴으로써 달성될 수 있다.
실시예 2: 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 분열은 재조합 인체 알 부민의 생성을 강화시킨다.
효모균주 DS569［pAYE329］(이것은 UBC4 분열을 갖지 않는다) 및 UBO5-1［pAYE329］및 UBO5-6［pAYE329］(이들 양방은 UBC4 분열을 갖는다)라 불리우는, UBO5［pAYE329］의 2개의 독립된 유리체의 rHA 생산성이 10㎖ 진동 플라스크 배양물에서 평가되었다. 효모는 YNB(디프코) 최소 배지에 접종되고, 2% w/v 글루코오스를 함유하는 인산/시트르산 나트륨 pH 6.0 으로 완층작용처리, 30℃에서 200rpm으로 3일간 배양하였다. HSA 표준(25 ∼ 150㎍/㎕)에 대한 로켓 면역전기영동법에 의하여, rHA 생산성이 계산되었다. 이들 조건하에서 DS569 ［pAYE329］의 rHA 생산성이 45㎎/ℓ로 계산되었는데, 동일조건하에서 측정된 2개의 UBO5 ［pAYE329］유리체의 rHA 생산성은 각각 77 및 75㎎/ℓ로 계산되었다.
실시예 3: 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 분열은 혼성 2㎛ 플라스미드 카피수를 증가시킨다.
효모균주 DS569［pAYE329］및 UBO5-1［pAYE329］및 UBO5-6［pAYE329］로 불리우는, UBO5［pAYE329］의 2개의 독립된 유리체의 혼성 2㎛ 플라스미드의 플라스미드 카피수가 100㎖ 진동 플라스크 배양물에서 평가되었다. 효모는 YNB 최소배지에 접종되고, 2%w/v 글루코오스를 함유하는 인산/시트르산 나트륨, pH 6.0으로 완충작용처리되고, 30℃에서 200rpm으로 충분한 시간, 통상적으로 1 ∼ 2일간 배양되어, 배양물 밀도가 중간 대수증식기와 동일한, 5AU/㎖을 초과하도록 하였다. 효모세포의 유리분열, 다음에는 용매추출, 투석 및 에탄올 침전에 의하여 총 게놈 DNA가 추출되었다. 총 게놈 DNA는 HindⅢ로 소화되어 완성되고 생성물은 겔 전기영동법으로 분석되었다. 플라스미드 특이적 DNA 밴드의 에티디움 브로마이드 착색은 리보솜 DNA(rDNA)의 에티디움 브로마이드 착색에 비하여 상대적으로 증가되었는데. 이것은 혼성 2㎛ 플라스미드의 플라스미드 카피수가 증가되었다는 것을 나타낸다. rDNA의 카피수에 상대적인 혼성 2㎛ 플라스미드 카피수의 정량은, rDNA/HSA cDNA 프로우브와 연결된 사우턴 블롯트 분석법에 의하여 수행되었다. 이 결과는 혼성 2㎛ 플라스미드 pAYE329의 플라스미드 카피수가, DS569［pAYE329］의 일배체 게놈당 48.9 ± 9.2 카피에서, UBO5-1［pAYE329］및 UBO5-6［pAYE329］의 일배체 게놈당 각각 83.1 ± 12.5 및 116.8 ± 29.0 카피로 증가하였다는 것을 나타내었다.
실시예 4: 안티센스 UBC4 mRNA 발현.
UBC4 유전자의 발현을 중단시키기 위한 하나의 방법은 안티센스 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 조치를 하는 것이다.
안티센스 전사체는 염색체(들)에 집적되어 있는 안티센스 발현 카세트의 카피 또는 카피들로 부터 발현될 수 있거나, 또는 낮은 플라스미드 카피수 벡터, 예를들면 YCp50(25) 또는 YCplac 1111, YCplac 33, YCplac 22(26) 또는 GALI, GALL 또는 GALS 프로모터를 함유하는 플라스미드 p413 ∼ p416과 같은 동원체 벡터로 부터 발현될 수 있다. 안티센스 전사체는 또한 pJDB207(12), YEp13 또는 YEp24(15)와 같은 높은 카피수 벡터로 부터도 발현될 수 있다. 이들 모든 발현 플라스미드 또는 집적 카세트는, 적절한 영양요구성 마아커(들)을 함유하는 효모의 형질전환 동안에 선별을 촉진하기 위하여 URA3, HIS3 또는 TRP1과 같은 효모 선택성 마아커를 필요로 한다.
안티센스 UBC4 또는 안티센스 UBC5의 발현을 유도하기 위하여 사용된 프로모터는 천연 프로모터 또는 관련된 프로모터 일 수 있다. 이것은 센스 전사체의 출현과 동시에 안티센스 전사체의 발현을 촉진할 수 있는 장점이 있다. 특히 바람직한 하나의 구체예에서, 안티센스 발현 카세트가 높은 플라스미드 카피수의 플라스미드상에 마련되어 센스 전사체 보다도 과잉의 안티센스 전사체를 보증하게 된다. 대안으로서의 프로모터에는 PGK1, PYK1, TDH2/TDH3 및 ENO1/ENO2등의 해당 프로모터와 같은 강력한 보전적 프로모터가 포함된다. 강력한 조절된 프로모터를 이용하면 플라스미드 카피수가 작동자의 의지대로 조절될 수 있다는 장점을 갖게된다. 이와같은 프로모터의 예로는 GAL1, GALL 및 GALS 프로모터가 있다(뭄베르그(Mumberg)등, 27). 이들 갈락토오스 유도 프로모터는 다중 클론닝 부위에 의하여 CYC1 터미네이터로 부터 분리된, 고저 플라스미드 카피수 벡터에 첨합된다. 하기 실시예는 p426 GAL1이라고 하는 플라스미드를 이용한다(뭄베르그등, 27). 안티센스 전사체는, 숙주 곰팡이 균주가 익숙한 UBC4 유전자를 함유하는 경우에만 UBC4 센스 전사체를 불활성화시키는데 유효할 수 있다. 그러나, ubc4 곰팡이 균주에서의 UBC4 안티센스 전사체의 발현은 다른 UBC4형 전사체를 처리하는데 유리할 수 있다.
UBC4 오픈 리딩 프레임의 PCR 증폭에 적절한 2개의 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 프라이머(UBC43 및 UBC44)가 ABI 380B DNA 합성장치를 사용하여 합성되었다.
PCR 반응은 효모균주 S288C로 부터 제조된 게놈 DNA로 부터 UBC4 유전자를 증폭시키기 위하여 수행되었다. 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 5㎍/㎖ S288C 게놈 DNA, 각 프라이머 2μM, 94℃에서 30초간 변성, 40초간 45℃로 아닐, 72℃에서 120초간 35회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총반응 용적 50㎕. 생성물, 5'-(HindⅢ)-UBC4-(HindⅢ)-3'는 겔 전기영동법으로 분석되어, 예상크기인 약 0.58kb로 판명되었다. 증폭된 PCR 생성물은, 제조자의 지시에 따라 프로메가 위자드 PCR DNA 정제 키트를 이용하여 정제되었다. 이들 2개의 프라이머, UBC43 및 UBC44를 이용하여 HindⅢ부위 5'및 3'를 UBC4 오픈 리딩 프레임에 도입하였다.
정제된 생성물, 5'-(HindⅢ)-UBC4-(HindⅢ)-3'는 HindⅢ로 소화되어 완성되었으며, 2개의 플라스미드 pUBT1 및 pUBT2를 생성시키는 플라스미드 p426 GAL1(뭄베르그등, 27)의 CYC1 터미네이터 및 GAL1 프로모터 사이에 위치한 특이적 HindⅢ 부위에 결찰되었다(제 6도 및 7도). 플라스미드 pUBT1은 GAL1 프로모터로 부터 안티센스 UBC4 전사체를 생성하도록 배열된 UBC4 오픈 리딩 프레임을 함유한 반면에, 플라스미드 pUBT2는 GAL1 프로모터로 부터 센스 UBC4 전사체를 생성하도록 배열된 UBC4 오픈 리딩 프레임을 함유하였다.
DS569 ura3［pAYE329］(실시예 1)와 같은, 비기능성 ura3 유전자의 존재 때문에 유라실 생합성이 결여된 효모균주가, 플라스미드 pUBT1으로, 유라실 원영양성으로 형질전환되었다. UBC4 안티센스 전사체 생성은, 유일한 탄소원으로서 글루코오스를 함유하는 효모성장 배지로 부터, 유일한 탄소공급원으로서 갈락토오스를 함유하는 배지로 전환함으로써 유도되었다. 반대로, UBC4 안티센스 전사체의 생성은, 유일한 탄소공급원으로서 갈락토오스를 함유하는 효모성장 배지로 부터, 유일한 탄소공급원으로서 글루코오스를 함유하는 배지로 전환함으로써 억제되었다.
실시예 5: GAL1 프로모터로 부터 센스 UBC4 mRNA 발현.
플라스미드 pUBT2(제 7도)는 UBC4 전사체의 과다 발현을 허용한다. 탄소공급원이 글루코오스로 부터 갈락토오스로 전환될때, 플라스미드 pUBT2로 형질전환된 ubc4 결여 곰팡이 균주에서, UBC4 mRNA 발현은 증가하게 되며, 플라스미드 카피수를 감소시키게 된다. 억제 및 활성화 탄소공급원 사이를 전환시킴으로써 과잉 플라스미드 카피수의 조절을 촉진한다는 것은 또 다른 하나의 방법이다. 다시, 이것은 ubc4 또는 UBC4 배경에서 수행될 수 있다.
DS569 ura3［pAYE329］(16) 또는 UBO5［pAYE329］의 ura3 유도체(실시예 1)와 같은 비기능성 ura3 유전자의 존재때문에 유라실 생합성 기능이 결핍된 효모균주가 플라스미드 pUBT2로 유라실 원영양성으로 형질전환되었다. 유일한 탄소공급원으로서 글루코오스를 함유하는 효모성장배지로 부터 유일한 탄소공급원으로서 갈락토오스를 함유하는 배지로 전환함으로써 UBC4 센스 전사체 생성이 유도되었다. 반대로 유일한 탄소공급원으로서 갈락토오스를 함유하는 효모성장배지로 부터 유일한 탄소공급원으로서 글루코오스를 함유하는 배지로 전환시킴으로써 pUBT2로 부터 UBC4 센스 전사체의 생성이 억제되었다.
실시예 6: 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 분열은 기타 재조합 인체 단백질의 생성을 강화시킨다.
ubc4 유전자를 제거하면 다른 이종 단백질의 발현을 증가시키게 된다. 이것은 UBC 오픈 리딩 프레임내에 돌연변이를 지니는 DS1101 및 DS569(하기 실시예 7에 기재)의 재조합 인체 헤모글로빈의 발현 수준을 분석함으로써 예시되었다. pHbD2-1(제 8도)로 불리우는 인체 헤모글로빈 발현 플라스미드는 총 2㎛ 비통합 벡터(disintegration vector) pSAC35를 기초로 하였다(16). 인체-글로빈 사슬의 전사는 GPDI 프로모터(19)에 의하여 지시되었으며 PGKI 터미네이터에 의하여 종결되었다. 인체-글로빈 사슬의 전사는 PRB1 프로모터로 부터 지시되었으며 ADH1 터미네이터에 의하여 종결되었다(16).
pHbD2-1로, 루이신 원영양성으로 형질전환된 효모균주 DS569 및 DS1101의 rHb 생산성이 10㎖ 진동 플라스크 배양액에서 평가되었다. 효모가 YNB 최소배지에 접종되고 2%(w/v) 글루코오스를 함유하는 인산/시트르산 나트륨 pH6.0으로 완충작용처리 및 30℃에서 200rpm으로 3일간 배양되었다. 효모 가용성 세포 추출물의 rHb 생산성이, 공지 농도의 표준 HbA와 비교함으로써, 제 2 유도체 스펙트럼의 소렛(Soret) 피크의 높이로 부터 분광광도법 분석법에 의하여 정량화되었다(28). 총 가용성 단백질 농도는 제조자의 지시(피어스(Pierce))에 따라 쿠마시 단백질 검정시약에 의하여 정량화되었다. DS569［pHbD2-1］의 가용성 rHb의 발현수준은 0.4%(w/v) 총 가용성 단백질에 상당하는 것으로 계산되었다. 가용성 rHb의 발현수준은 ubc4 제거부분을 지니는 균주 DS1101［pHbD2-1］에서 0.8%(w/v)로 증가하였다.
실시예 7: 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 돌연변이.
상술한 바와같이, 랜덤화학약품 돌연변이유발에 의하여 최초의 돌연변이가 이루어졌다. 이 공정에 있어서의 출발 균주는 DS569［pAYE329］였다(16). DS569［pAYE329］는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)에 의하여 화학약품 돌연변이유발 처리 되고, 잠재적 rHA 과잉 발현 돌연변이 균주는, EP431880에 기재된 플레이트 스크린닝 방법에 의하여 선별되었다. 이와같은 하나의 돌연변이 균주를 DS1101［pAYE329］라 한다. DS569 ［pAYE329］ 및 DS1101［pAYE329］의 rHA 생산성의 분석이 실시예 2에 기재된 바와같이, 10㎖ 진동 플라스크 배양액에서 수행되었다. rHA 생산성이 HSA 표준(25 ∼ 150㎍/㎖)에 대한 로켓 면역전기영동법에 의하여 계산되었다. 이들 조건하에서 DS569［pAYE329］의 rHA 생산성은 약 45㎎/ℓ로 계산된 반면에, 동일한 조건하에서 측정된 DS1101［pAYE329］의 rHA 생산성은 78㎎/ℓ로 계산되었다.
실시예 3에 기재된 바와같이, 효모균주 DS569［pAYE329］및 DS1101［pAYE329］의 혼성 2㎛ 플라스미드의 플라스미드 카피수가 100㎖ 진동 플라스크에서 평가되었다. rDNA의 카피수에 비교한 2㎛ 플라스미드 카피수의 정량을 rDNA/HSA cDNA 프로우브와 결합한 사우턴 블롯트 분석법에 의하여 수행되었다. 이 결과는, 혼성 2㎛ 플라스미드 pAYE329의 플라스미드 카피수가 DS569［pAYE329］의 일배체 게놈당 48.9 ± 9.2 카피에서 DS1101 ［pAYE329］의 일배체 게놈당 70.5 ± 15.9 카피로 증가되었다는 것을 나타내었다.
DS1101［pAYE329］에서 관측되는 rHA 생산성 및 증가된 플라스미드 카피수를 초래하는 원래 돌연변이의 성질의 식별을 가능케하기 위하여, 동심체 벡터 YCp50에서 DS569 고분자 게놈 DNA로 부터 부분적 Sau3A 게놈 DNA 라이브러리가 제조되었다(30). 실시예 1에 기재된 방법에 의하여, DS1101［pAYE329］로 부터 새로운 효모균주 DS1101 ura3［pAYE329］가 제조되었다. DS1101 ura3［pAYE329］는 DNA로, DS569 YCp50 게놈 라이브러리로 부터 유라실 원영양성으로 형질전환되었다. 형질전환체는, EP 431 880에 기재된 항-HSA 항체의존 플레이트 스크린닝 방법에 의하여, 감소된 rHA 발현이 분석되었다. 10㎖의 진동 플라스크 배양액에서 평가되었을 때 rHA 생산성을 저하시킨 하나의 유리체, DS1101 ura3［pAYE329/pAYE792］가 확인되었다. 효모는 YNB(디프코) 최소배지로 접종되고, 2% w/v 글루코오스를 함유하는 pH 6.0 인산/시트르산 나트륨으로 완충작용처리되고 30℃에서 200rpm으로 3일간 배양되었다. HSA 표준에 대한 로켓 면역전기영동법에 의하여 rHA 생산성이 측정되었는데, DS1101 ura3［pAYE329/YCp50］대조체에 비하여 감소되었으나, DS569 ura3［pAYE329/YCp50］대조체와는 유사한 것으로 나타났다. 효모균주 DS569 ura3［pAYE329/YCp50］, DS569 ura3［pAYE329/pAYE792］, DS1101 ura3［pAYE329/YCp50］및 DS1101 ura3 ［pAYE329/pAYE792］의 혼성 2㎛ 플라스미드의 플라스미드 카피수가, 실시예 3에 기재된 바와같이 100㎖ 진동 플라스크 배약액에서 평가되었다. 결합 rDNA/HSA cDNA 프로우브를 지닌 사우턴 블롯트 분석방법으로, rDNA의 카피수에 대하여 상대적인 혼성 2㎛ 플라스미드 카피수의 정량화가 수행되었다. 이 결과, 혼성 2㎛ 플라스미드 pAYE329의 플라스미드 카피수가 DS1101 ura3［pAYE329/YCp50］의 일배체 게놈당 59.4 ± 6.0 카피에서, DS1101 ura3［pAYE329/pAYE792］의 일배체 게놈당 38.3 ± 1.3 카피로 감소하였으나, DS569 ura3［pAYE329/YCp50］및 DS569 ura3［pAYE329/pAYE792］에서는 일배체 게놈당 각각 33.0 ± 5.3 및 27.5 ± 4.5카피로 불변인 것으로 나타났다.
pAYE792 동심원체 플라스미드 DNA가, 균주 DS1101 ura3［pAYE329/pAYE792］ (31)로 부터 대장균으로 유리되어 DNA 배열결정되었다(제 9도). 이 결과, 플라스미드 pAYE792는 UBC4, TEC1 및 MIS1 유전자를 첨합하고 있는 영역을 걸치는 사카로마이세스 세레비지에(32)의 염색체Ⅱ로 부터 연속 9.05kb 게놈 삽입체를 함유한 것으로 나타났다. 3개의 개별 유전자를 후속적으로 서브클론닝한 결과, UBC4 유전자는 균주 DS1101 ura3［pAYE329/pAYE792］의 pAYE792와 관련된 플라스미드 카피수의 감소 및 rHA 생산성의 감소를 초래하는 것으로 나타났다.
DS569의 NTG 돌연변이유발에 의하여 DS1101로 도입된 돌연변이의 특성을 정립하기 위하여, PCR에 의하여 DS1101로 부터 UBC4 유전자가 유리되었다. 2.1kb UBC4 게놈 PstI 단편(제 3도)의 PCR 증폭에 적합한 2개의 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 프라이머(UBC4A 및 UBC4B)가 ABI 380B DNA 합성장치를 이용하여 제조되었다.
참고문헌(30)에 의하여 DS1101로 부터 제조된 고분자 게놈 DNA로 부터 UBC4 유전자를 증폭시키기 위하여 PCR 반응이 수행되었다. 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 50ng/㎖ ∼ 0.5ng/㎖ DS110 게놈 DNA, 2μM의 각 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 50℃로 40초간 아닐, 72℃에서 120초간 40회전 연장, 600초간 72℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머- 세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러 (Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕. 증폭된 2.1kb DNA 생성물은 게네클린(Geneclean)Ⅲ DNA 추출 키트(바이오101 인크, 1070 조슈아 웨이, 비스타, CA 92083, USA)에 의한 TAE 아가로오스 겔 전기영동법으로 정제되었으며, PstI로 소화되어 완결되었다. 플라스미드 pBST+ (제 10도)는 EcoRI 및 HindⅢ로, pBS+로 소화하여 파아지미드 pBS+ (스트라타진, 11011 노스 토레이 파인스 로드, 라졸라, CA 92037, USA)로 부터 제조되었다. 유리된 선형화 벡터는 다음 서열을 지닌 2중 사슬 올리고뉴클레오티드 링커로 결찰되었다.
플라스미드 pBST+는 PstI로 선형화되었으며, 4개의 별도 플라스미드 유리체, pDB2258, pDB2259, pDB2260 및 pDB2261을 생성하기 위하여 PstI 소화 PCR 증폭 2.1kb UBC4 DNA 생성물로 결찰되었다(제 11 ∼ 14도). pAYE792 (DS569유도)로 부터 유리된 UBC4 유전자 및 4개의 모든 플라스미드(DS1101 유도)의 PstI 삽입부가 DNA 서열 결정되었다. DNA 서열분석결과는 DS1101 UBC4 유전자내에 돌연변이를 나타내었다. 이 돌연변이, A를 G로 치환, 는 10번째 코돈에 위치하였으며 다음과 같은 DNA 서열을 갖는다:
돌연변이는 글루탐산으로 부터 10번째 아미노산을 Glu10Lys로 표시되는 라이신으로 변화시키는 것이다.
UBC4 유전자의 이 돌연변이체 형태, 또는 사실상 임의의 돌연변이체 형태는, 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegams) ubc-2 유전자에 의한 내생적 사카로마이세스 세레비지에 UBC4 유전자의 치환을 위한 문헌에 이미 기재된 바와 유사한 방법에 의하여, 실시예 1에 이미 기재된 바와같이, UBC4 유전자가 이미 분열된 임의의 균주에 도입될 수 있다(36). 효모균주 UBO5(실시예 1)는, 플라스미드 pDB2258, pDB2259, pDB2260 또는 pDB2261(제 11 ∼ 14도)중 어느 것으로 부터의 2.1kb PstI 단편으로, ura3(Ura-)으로 형질전환되있고, 5-플루오로-오로트산(18)에 대한 저항성에 의하여 Ura-효모가 선별되었다. 이 배지에서 성장 가능한 군집이 정제되고, 시험에 의하여 그들은 유라실 보충없이는 성장이 불가능하며, 유라실의 결핍은 형질전환에 의한 URA3 유전자의 도입에 의하여 보충될 수 있다는 것이 증명되었다. 사우턴블롯트에 의하여, UBO5내의 UBC4 위치로 부터 URA3 유전자의 제거 및 UBC4 유전자의 Glu10Lys 돌연변이 형태에 의한 그 치환이 확인되었다.
실시예 8: 사카로마이세스 세레비지에 UBC5 유전자의 분열.
사카로마이세스 세레비지에 UBC5 유전자는 염색체Ⅳ상에 위치한다. UBC5 유전자의 DNA 서열은 제 15도에 도시된다.
UBC5 유전자는, 총 UBC 오픈 리딩 프레임을 제거한 유전자 분열의 방법(14)에 의하여 돌연변이되어, 활성 Ubc5 단백질의 생성을 방지하게 된다. 이것은 우선 UBC5 오픈 리딩 프레임의 5'및 3'영역과 동일한 DNA 서열을 내포하도록 URA3 유전자의 5'및 3'단부를 변형시킨 돌연변이유발 단일 사슬 DNA 프라이머로 적절한 마아커 유전자(URA3)를 PCR에 의하여 증폭시킨 후 ura3 영양요구성 효모균주를 유라실 원영양성으로 형질전환시킴으로써 달성된다.
극단부에 UBC5 서열을 첨합하고 있는, URA3 유전자의 5'및 3'단부의 PCR 증폭에 적합한 2개의 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 프라이머(UBC5URA1 및 UBC5URA2)가 ABI 380B DNA 합성장치에 의하여 합성되었다:
PCR 반응은 플라스미드 YEp24로 부터 URA3 유전자를 증폭시키기 위하여 수행된다(15). 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 1㎍/㎖ 플라스미드 YEp24 DNA, 2μΜ의 각 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 45℃로 40초간 아닐, 72℃에서 120초간 20회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕, 선택적인 조건은, 제조자의 지시에 따라, 2ng/㎖ 플라스미드 YEp24 DNA, 0.1μΜ의 각 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 40초간 55℃로 아닐, 72℃에서 120초간 30회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕. 생성물, 5'-UBC5-URA3-UBC5-3'는 겔 전기영동법으로 분석되어, 예상크기인 약 1.2kb로 판명되었다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 지시에 따라 프로메가 위자드(Promega Wizard) PCR DNA 정제 키드를 이용하여 정제되었다.
DS569 ura3［pAYE329］는 5'- UBC5-URA-UBC5-3' PCR 생성물로, 유라실 원영양성으로 형질전환되었다. O.5kb MluI-Asp 718 DNA 단편으로서의 UBC5 유전자로, 다수의 형질전환체의 소화된 게놈 DNA의 사우턴 블롯트가 프로우브로 검사되어 UBC5 유전자의 분열을 확인하였다. 새로운 균주는 UB1［pAYE329］로 명명되었다.
UBC5 유전자를 분열시키기 위한 별도의 방법에 있어서, UBC5 유전자의 5'및 3'단부에 해당하는 부분이 PCR에 의하여 클론화되었다. UBC5 유전자(DS101 및 DS102)의 5'단부 및 UBC5 유전자(DS103 및 DS104)의 3'단부의 PCR 증폭에 적합한 두쌍의 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 프라이머가, ABI 380B DNA 합성장치에 의하여 합성되었다.
PCR 반응은 UBC5 유전자의 5'단부를 증폭시키기 위하여 수행된다. 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 1000 ∼ 10ng/㎖ S288C 게놈 DNA, 2μΜ의 DS102 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 37℃로 30초간 아닐, 72℃에서 60초간 30회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕. 생성물, 5'-UBC5는 겔 전기영동법으로 분석되어, 예상크기인 229bp로 판명되었다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 지시에 따라 프로메가 위자드(Promega Wizard) PCR DNA 정제 키드를 이용하여 정제되었다.
PCR 반응은 UBC5 유전자의 3'단부를 증폭시키기 위하여 수행된다. 조건은 다음과 같다: 제조자의 지시에 따라, 1000 ∼ 10ng/㎖ S288C 게놈 DNA, 2μΜ의 DS103 프라이머, 2μM의 DS104 프라이머, 94℃에서 30초간 변성, 37℃로 30초간 아닐, 72℃에서 60초간 30회전 연장, 600초간 72℃ 침적, 4℃ 침적, AmpliTag 열안정 DNA 폴리머라제를 채택하는 페르킨-엘머-세투스(Perkin-Elmer-Cetus) PCR 키트 및 페르킨-엘머-세투스 서말 사이클러(Thermal Cycler)를 이용, 총 반응 용적 50㎕. 생성물, 3'-UBC5는 겔 전기영동법으로 분석되어, 예상크기인 327bp로 판명되었다.
5'-UBC5 DNA 단편은 NotI 및 SalI로 소화되어 완결되고, 페놀/클로로포름 추출되고 NotI/SalI 선형화 및 탈인산가수분해화 처리된 pBST+로 클론화되어 플라스미드 pDB2262를 생성하였다(제 16도). 3'-UBC5 DNA 단편은 NheI 및 HindⅢ로 소화되어 완결되고, 페놀/클로로포름 추출되고 NheI/HindⅢ 선형화 및 탈인산가수분해화 처리된 pBST+로 클론화되어 플라스미드 pDB2264를 생성하였다(제 17도). pDB2262 및 pDB2264의 DNA 삽입체가 서열결정되어 그들의 실체가 확인되었다. 플라스미드 pDB2264는 HindⅢ/NheI로 소화되어 완결되고, UBC5의 3'단부에 해당하는 327bp 단편이 유리되어, pDB2262로 클론화, HindⅢ/NheI로 선형화 및 탈인산가수 분해효소 처리되었다. pDB2275로 불리우는 얻어진 플라스미드는, 특이적 HindⅢ 부위로 분리된, UBC5 유전자의 5'및 3'단부를 함유하였다(제 18도). 1.2kb HindⅢ 단편으로서 유리된 총 게놈 URA3 유전자는 HindⅢ로, 선형화된 pDB2275로 클론화되고, 탈인산가수분해효소처리되어, 단지 서로 URA3 마아커 유전자의 배열만이 상이한 플라스미드 pDB2276 (제 19도) 및 pDB2277(제 1도)를 생성하였다.
DS569 ura3 ［pAYE329］는 5'-UBC5-URA3-UBC5-3'로, 유라실 원영양원성으로 형질전환되고, 1.7kb MluI-XbaI 단편으로서 pDB2276이나 pDB2277로 부터 유리된 단편을 분열시킨다. 이들 효모 형질전환체의 rHA 생산성이 10㎖ 진동 플라스크 배양액에서 평가되었다. 효모는 YNB(디프코) 최소배지로 접종되고, 2% w/v 글루코오스를 함유하는 pH 6.0 인산/시트르산 나트륨으로 완층작용처리되고, 30℃에서 200rpm으로 3일간 배양되었다. HSA 표준(25 ∼ 150㎍/㎖)에 대한 로켓 면역전기영동법으로 rHA의 생산성이 측정되었다. 이들 조건하에서 DS569［pAYE329］의 rHA 생산성이, 약 40㎎/ℓ로 계산된 반면에, 일부 pDB2276 또는 pDB2277 형질전환체의 rHA 생산성은 동시에, DS569［pAYE329］보다 높은 수준으로 증가되어, 약 60㎎/ℓ로 계산되었다(제 2도).
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Claims (21)

  1. 하기 (i) 및 (ⅱ) 단계를 포함하는 곰팡이 세포 유도 생성물의 제조방법.
    (ⅰ) 플라스미드가 단백질에 대한 기능적 코딩 서열을 포함하며, 곰팡이 세포가 변형된 수준의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 지니는, 상기 플라스미드를 지니는 상기 곰팡이 세포를 제공; 및
    (ⅱ) 곰팡이 세포 유도 생성물을 제조하기 위하여 세포를 배양.
  2. 제 1항에 있어서, 곰팡이 세포 유도 생성물이 상기 코딩 서열에 의하여 코드화된 요망 단백질이며, 상기 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성의 변형된 수준이 세포에 대한 정상적인 수준보다 낮으며, 플라스미드의 카피수가 감소되는 제조 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 세포의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성이 제로인 제조 방법.
  4. 제 2항 또는 3항에 있어서, Ubc4p 또는 Ubc5p 코드화 생성물이 그 표적 단백질에 결합하는 것을 차단시키는 화합물을 세포가 생성하는 제조 방법.
  5. 제 2항 또는 3항에 있어서, UBC 유전자로 부터 단백질이 전혀 생성되지 않거나, 또는 그들로 부터 생성된 임의의 단백질이 저하된 수준의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 지니도록 UBC 유전자가 변형되는 제조 방법.
  6. 제 5항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자의 일부가 제거되는 제조 방법
  7. 제 5항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질내의 유비퀴틴 수용 시스테인이 결여되거나 또는 유비퀴틴 수용 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  8. 제 5항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질의 유비퀴틴 공여 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  9. 제 5항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질이, 단백질의 N-말단에 있는 첫번째의 21 아미노산중 하나 이상의 돌연변이 결과 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질이, 단백질의 첫번째-헬릭스(잔기 3 ∼ 13)에서의 돌연변이 결과 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  11. 제 9항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질이, 1차 서열의 위치 10에서 글루탐산에 대한 돌연변이 결과 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  12. 제 11항에 있어서, UBC4 또는 UBC5 유전자로 부터 생성된 임의의 단백질이, 1차 서열의 위치 10에서 라이신 또는 아르기닌 아미노산 치환의 결과 활성이 저하되도록, UBC4 또는 UBC5 유전자가 변형되는 제조 방법.
  13. 제 2항 또는 3항에 있어서, 세포가 UBC4 또는 UBC5 안티센스 mRNA를 생성하는 제조 방법.
  14. 제 2항내지 13항중 임의의 한항에 있어서, 요망 단백질이, 세포가 속하는 종에 대하여 내생적이 아닌 제조 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 단백질이 세포 배양액으로 부터 유리되는 제조 방법.
  16. 제 14항 또는 15항에 있어서, 요망 단백질이 식물 또는 동물 단백질인 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 요망 단백질이 인체 단백질인 제조 방법.
  18. 제 1항 내지 17항중 임의의 한항에 있어서, 곰팡이 세포가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 제조 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 플라스미드가 2㎛-기준 플라스미드인 제조 방법.
  20. 제 2항내지 19항중 임의의 한항의 방법에 의하여 제조된 요망 단백질.
  21. 세포내의 플라스미드의 카피수를 조절하기 위하여 곰팡이 세포의 Ubc4p 또는 Ubc5p 활성을 변경시키는 수단을 사용하는 방법.
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