JP6696506B2 - クローニングベクター - Google Patents
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Description
[1] シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、または該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするクローニングベクター。
[2] シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするクローニングベクター。
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とする発現ベクター。
[4] 前記[1]または[2]のクローニングベクター中のクローニングサイトに、外来構造遺伝子を導入することを特徴とする発現ベクターの製造方法。
[5] シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子、および下記ターミネーター以外のターミネーターを有する発現ベクターの該ターミネーターを、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターに置換し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とする発現ベクターの製造方法。
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。
[7] 前記発現カセットを含む発現ベクターを染色体外に含む、前記[6]の形質転換体。
[8] 前記発現カセットを染色体に含む、前記[6]の形質転換体。
[9] 前記[6]の形質転換体を製造する方法であって、前記発現カセットを含む発現ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体外に保持させることを特徴とする形質転換体を製造する方法。
[10] 前記[6]の形質転換体を製造する方法であって、前記発現カセットを含む発現ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体に導入することを特徴とする形質転換体を製造する方法。
[11] 前記[6]〜[8]のいずれかの形質転換体を培養し、得られた菌体または培養液上清から、前記外来構造遺伝子がコードする蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
本発明の発現ベクターにより得られた形質転換体は、高い発現効率で該外来蛋白質を生産することができる。
本発明のクローニングベクターは、外来構造遺伝子由来の蛋白質(以下、外来蛋白質ということがある。)を発現させるためにシゾサッカロミセス属酵母に導入される発現ベクターを作製するためのクローニングベクターであり、外来構造遺伝子の発現を制御するターミネーターとしてシゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーター(以下、ihc2ターミネーター)を用いることを特徴とする。本発明のクローニングベクターは、外来構造遺伝子の発現をihc2ターミネーターで制御することにより、外来蛋白質発現に一般的に用いられているヒトリポコルチンI(hLPI)ターミネーター、SV40ターミネーター、nmt1ターミネーター等を用いた場合よりも高い発現効率でS.ポンベを宿主として外来蛋白質を発現させうる。
S.ポンベのihc2遺伝子は公知であり、European Bioinformatics Instituteが提供するウエブサイトのS.ポンベの遺伝子配列データベース(PomBase;http://www.pombase.org/)に登録されているihc2遺伝子の系統名はSPAC11D3.01cである。
発現効率の観点からは、S.ポンベのihc2ターミネーターは、ihc2遺伝子のORFの3’末端(終止コドンの3番目の塩基)の下流1〜525bpの領域を含むことが好ましく、1〜400bpの領域を含むことがより好ましく、1〜300bpの領域を含むことがさらに好ましく、1〜200bpの領域を含むことが特に好ましく、1〜175bpの領域を含むことが最も好ましい。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーターとしては、例えば、特開平5−15380号公報、特開平7−163373号公報および特開平10−234375号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、hCMVプロモーター、SV40プロモーターが好ましい。
例えば、後述の発現カセットがシゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、本発明のクローニングベクターは、線状DNAからなるベクターであってもよく、発現カセットを宿主へ導入する際に、線状DNAに切り開くための制限酵素部位を備える環状DNA構造のベクターであってもよい。本発明のクローニングベクターがARSを有する場合、ARS部分を削除して線状DNA構造の発現カセットとした後、またはARS部分を開裂させることによりARSの機能を失活させた線状DNA構造の発現カセットとした後、宿主へ導入できる。
本発明の発現ベクターは、シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有する。本発明の発現ベクターにおけるihc2ターミネーターは、発現ベクター内の外来構造遺伝子の発現を制御しうるターミネーターであり、前記本発明のクローニングベクターの説明で記載したターミネーター活性を有するものである。
また、本発明の発現ベクターは、プロモーター、外来構造遺伝子およびihc2ターミネーター以外に、前記の5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカー等を有していてもよい。
なお、発現ベクター中のプロモーター、外来構造遺伝子およびihc2ターミネーターを含む領域を、以下、発現カセットともいう。発現カセットは、前記の5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカー等を有していてもよい。
本発明の形質転換体は、本発明の前記発現ベクターに由来する前記プロモーター、前記外来構造遺伝子および前記ihc2遺伝子が有するターミネーターを含む発現カセットを有することを特徴とする。発現カセットは、前記のように、5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカー等を有していてもよい。
発現カセットを染色体外に有する形質転換体は、発現カセットを含む発現ベクターを染色体外に保持させる。該発現ベクターは、通常、前記ARSを有する環状DNA構造を有する。一方、発現カセットを染色体に有する形質転換体は、前記ARSを有しない、線状DNA構造の発現カセットを含む染色体を有する。
染色体に導入するための線状DNA構造の発現カセットは、たとえば、線状DNAに切り開くための制限酵素部位を備える環状DNA構造の本発明の発現ベクターを線状DNAに切り比較ことにより作成できる。また、本発明の発現ベクターがARSを有する場合は、ARS部分を削除または失活させて線状DNAとする。
本発明の形質転換体の宿主は、シゾサッカロミセス属酵母である。本発明に用いるシゾサッカロミセス属酵母は野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Latour法(Nucreic Acids Res、2006年、第34巻第e11号、および国際公開第2007/063919号等に記載)を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法(酵母分子遺伝学実験法、1996年、学会出版センター)や、PCRを利用したランダム変異法(PCR Methods Appl.、1992年、第2巻、p.28−33。)等により遺伝子の一部に変異を導入することにより、該遺伝子を失活させることができる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第2002/101038号、国際公開第2007/015470号等に記載されている。
たとえば、ura4遺伝子が欠失または失活してウラシル要求性となっているシゾサッカロミセス属酵母を宿主とし、ura4遺伝子を有する発現ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。
上記発現ベクターを用いて、宿主であるシゾサッカロミセス属酵母を形質転換する。形質転換方法は、公知のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換方法をいずれも用いることができる。そのような形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法[K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)]、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開2005−198612号公報記載の方法などを挙げることができる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
本発明の形質転換体は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養できる。
本発明の形質転換体の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
具体的には、YPD培地等の栄養培地(M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor LabolatoryPress(1990) )またはMB培地等の最少培地(K.Okazaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990))等を使用できる。
また、培養温度は、23〜37℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
本発明の蛋白質の生産方法は、前記のクローニングベクター中のクローニングサイトに、外来構造遺伝子が導入されている発現ベクターを含む形質転換体を培養し、得られた菌体または培養液上清から、前記外来構造遺伝子がコードする蛋白質を取得することを特徴とする。
EGFPをモデル蛋白質として、S.ポンベ由来ターミネーターの違いによるEGFP発現量の差を比較した。
(pSL6EGFP−LPIt)
公知の単座組込み用ベクターpSL6(Alimjan et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, vol.85, pp.667−677)のマルチクローニングサイトに、EGFPをコードする構造遺伝子を挿入したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−LPItを製造した。pSL6ベクターは、hCMVプロモーターおよびLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。
具体的には、まずEGFPをコードする人工合成遺伝子(配列番号1)を鋳型とし、5’末端にNcoIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号2)および5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号3)とを用いたPCRによって、EGFP遺伝子のORF全長の5’末端にNcoIの制限酵素認識部位を、3’末端にPstIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(EGFPフラグメント)を得た。
該EGFPフラグメントを制限酵素NcoIおよびPstIで二重消化し、またpSL6を制限酵素AarIおよびPstIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−LPItとした。
前記で製造したpSL6EGFP−LPItベクター内にあるLPIターミネーターを、公知の単座組込み用ベクターpSL9(国際公開第2014/030644号)に備わるinv1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−inv1tを製造した。pSL9ベクターは、S.ポンベ由来のinv1プロモーターおよびinv1ターミネーター(inv1遺伝子(SPCC191.11)のORFの下流1bpから548bpの領域、配列番号4)の間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。
具体的には、pSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、一方でpSL9を制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してinv1ターミネーター部分を回収し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−inv1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のnmt1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−nmt1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株、ATCC38366、972h−相当)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号5)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号6)を用いたPCRによって、nmt1遺伝子(SPCC1223.02)のORFの下流1bpから573bpの領域(配列番号7)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(nmt1tフラグメント)を得た。
該nmt1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−nmt1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のhsp9ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−hsp9tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号8)および5’末端にSpeIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号9)を用いたPCRによって、hsp9遺伝子(SPAP8A3.04c)のORFの下流1bpから545bpの領域(配列番号10)の5’末端にPstI、3’末端にSpeIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(hsp9tフラグメント)を得た。
該hsp9tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−hsp9tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のhsp16ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−hsp16tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号11)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号12)を用いたPCRによって、hsp16遺伝子(SPBC3E7.02c)のORFの下流1bpから527bpの領域(配列番号13)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(hsp16tフラグメント)を得た。
該hsp16tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−hsp16tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のihc1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ihc1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号14)および5’末端にSpeIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号15)を用いたPCRによって、ihc1遺伝子(SPAC22G7.11c)のORFの下流1bpから520bpの領域(配列番号16)の5’末端にPstI、3’末端にSpeIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ihc1tフラグメント)を得た。
該ihc1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ihc1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のihc2ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ihc2tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号17)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号18)を用いたPCRによって、ihc2遺伝子(SPAC11D3.01c)のORFの下流1bpから625bpの領域(配列番号19)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ihc2tフラグメント)を得た。
該ihc2tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ihc2tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のadh1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−adh1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号20)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号21)を用いたPCRによって、adh1遺伝子(SPCC13B11.01)のORFの下流1bpから528bpの領域(配列番号22)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(adh1tフラグメント)を得た。
該adh1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−adh1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のact1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−act1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号23)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号24)を用いたPCRによって、act1遺伝子(SPBC32H8.12c)のORFの下流1bpから783bpの領域(配列番号25)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(act1tフラグメント)を得た。
該act1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−act1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のbip1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−bip1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号26)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号27)を用いたPCRによって、bip1遺伝子(SPAC22A12.15c)のORFの下流1bpから719bpの領域(配列番号28)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(bip1tフラグメント)を得た。
該bip1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−bip1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のbip1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ura4tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号29)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号30)を用いたPCRによって、ura4遺伝子(SPCC330.05c)のORFの下流1bpから529bpの領域(配列番号31)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ura4tフラグメント)を得た。
該ura4tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ura4tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のleu1ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−leu1tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号32)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号33)を用いたPCRによって、leu1遺伝子(SPBC1A4.02c)のORFの下流1bpから516bpの領域(配列番号34)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(leu1tフラグメント)を得た。
該leu1tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−leu1tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のade6ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ade6tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号35)およびEcoRIの制限酵素認識部位を含むリバースプライマー(配列番号36)を用いたPCRによって、ade6遺伝子(SPCC1322.13)のORFの下流1bpから416bpの領域(配列番号37)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ade6tフラグメント)を得た。
該ade6tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ade6tとした。
pSL6EGFP−LPItベクターのLPIターミネーターを、S.ポンベ由来のptr3ターミネーターと置換したEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ptr3tを製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号38)および5’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号39)を用いたPCRによって、ptr3遺伝子(SPBC1604.21c)のORFの下流1bpから538bpの領域(配列番号40)の5’末端にPstI、3’末端にEcoRIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ptr3tフラグメント)を得た。
該ptr3tフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化し、またpSL6EGFP−LPItを制限酵素PstIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP発現ベクターpSL6EGFP−ptr3tとした。
宿主として、S.ポンベのロイシン要求株ARC001(遺伝子型:h−、leu1−32)を用いた。
ARC001株をYES(0.5%酵母エキス、3%グルコース、0.25mg/mL SPサプリメント)培地で1.0〜2.0×107細胞数/mLになるまで生育させた。生育させた菌体を集菌して洗浄した後、2.0×109細胞数/mLになるように0.1M 酢酸リチウム(pH5.0)に懸濁した。その後、ARC001株の懸濁液100μLにEGFP発現ベクターpSL6EGFP−LPIt、pSL6EGFP−nmt1t、pSL6EGFP−inv1t、pSL6EGFP−hsp9t、pSL6EGFP−hsp16t、pSL6EGFP−ihc1t、pSL6EGFP−ihc2t、pSL6EGFP−adh1t、pSL6EGFP−act1t、pSL6EGFP−bip1t、pSL6EGFP−ura4t、pSL6EGFP−leu1t、pSL6EGFP−ade6tまたはpSL6EGFP−ptr3tを制限酵素NotIで消化したもの約1μgをそれぞれ加え、更に50%(w/v)ポリエチレングリコール(PEG4000)水溶液をそれぞれに260μL加えてよく撹拌した後、32℃で30分間インキュベートし、43μLのDMSOを添加した後に更に42℃で5分間インキュベートした。遠心分離処理によりPEG4000を除去し、洗浄した後の菌体を150μLの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。各菌体を塗布した寒天培地を3〜5日培養した後、形質転換体を得た。
前記で得られた各形質転換体および非EGFP生産株であるS.ポンベの野生株(ARC032株)をそれぞれ試験管内の5mLのEMM培地(MP BIOMEDICALS社製、米国)に植菌し、32℃で4日間培養した。培養2日目から4日目の各培養液の菌体密度(OD660)およびGFP蛍光強度(励起波長490nm、蛍光波長530nm)をMTP−810Lab(コロナ電気社製、日本)により測定して、各形質転換体およびARC032株のOD660当りのGFP蛍光強度(GFP/OD660、細胞当りのEGFP生産量を反映)を算出した。
CMVp/nmt1t株、CMVp/inv1t株、CMVp/hsp9t株、CMVp/ihc1t株およびCMVp/ihc2t株はどれも、培養2日目以降はCMVp/LPIt株よりも高いGFP/OD660値を示しており、EGFPの生産量が向上していることが窺える。その中でもCMVp/ihc2t株は特に高いGFP/OD660値を示し、CMVp/LPIt株の4〜5倍程度を示していた。GFP/OD660は菌体内でのEGFP生産量に概ね比例すると考えられるので、EGFP発現カセット中のEGFP遺伝子下流にあるターミネーターを、LPIターミネーターからihc2ターミネーターに変更することにより、EGFPの生産量を4倍以上向上させうることが示された。また、CMVp/ihc2t株は、従来S.ポンベの発現系で使用されているターミネーターを用いたCMVp/nmt1t株やCMVp/inv1t株よりも高いGFP/OD660値も示しているので、従来公知のターミネーターに代えてihc2ターミネーターを使用することで、外来遺伝子の生産量を向上させ得ることが示唆された。データには示していないが、CMVp/hsp16t株、CMVp/adh1t株、CMVp/act1t株、CMVp/bip1t株、CMVp/ura4t株、CMVp/leu1t株、CMVp/ade6t株およびCMVp/ptr3t株は、CMVp/nmt1t株やCMVp/hsp9t株と同等のGFP/OD660値を示していた。つまり、今回作製したEGFP生産株の中でCMVp/LPIt株が最も低いGFP/OD660値を示したことになるが、今回用いたターミネーター中LPIターミネーターのみがヒト由来の配列であり、LPIターミネーター配列が、S.ポンベ細胞内で正常に機能しにくい可能性が考えられる。
S.ポンベの培養で頻繁に使用するYES培地およびYPD培地を用いて、培地が遺伝子発現に与える影響を観察した。
実施例1で得られた形質転換体であるCMVp/LPIt株、CMVp/nmt1t株、CMVp/inv1t株、CMVp/ihc2t株、およびS.ポンベの野生株(ARC032株)をそれぞれ試験管内の5mLのEMM培地、YES培地またはYPD培地(1%酵母エキス、1%ペプトン、2%グルコース)に植菌し、32℃で3日間培養した。培養後の各培養液の菌体密度(OD660)およびGFP蛍光強度(励起波長490nm、蛍光波長530nm)をMTP−810Labにより測定して、各形質転換体およびARC032株のOD660当りのGFP蛍光強度(GFP/OD660)を算出した。
EMM培地においては、実施例1と同様にCMVp/ihc2t株が最も高いGFP/OD660値を示し、その値はCMVp/LPIt株の5倍以上であった。YPD培地においては、どの形質転換体も高いGFP/OD660値を示していたものの、CMVp/ihc2t株で比較的高いGFP/OD660値を示す傾向は変わらず、また、YES培地においても、CMVp/ihc2t株はCMVp/LPIt株やCMVp/nmt1t株よりも高いGFP/OD660値を示した。YES培地やYPD培地における、ihc2ターミネーターを使用することによるEGFP生産量の向上効果は、EMM培地で観察された程には顕著に表れなかったものの、充分に高く、ihc2ターミネーターを用いることによる発現効率改善効果は、培地に依らず発揮されることを示唆する結果が得られた。
S.ポンベ由来のプロモーターであるihc1プロモーターおよびhsp9プロモーターを用いて、プロモーターの強度が遺伝子発現に与える影響について調べた。
公知の単座組込み用ベクターpSL12(国際公開第2014/030644号)内にあるLPIターミネーターをinv1ターミネーターと置換したleu1遺伝子座組込み用ベクターpSL12inv1tベクター(5998bp、配列番号41)を製造した。pSL12ベクターは、ihc1プロモーターおよびLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。
具体的には、pSL12を制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、一方で、実施例1で構築したpSL6EGFP−inv1tを制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してinv1ターミネーター部分を回収し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSL12inv1tとした。図3に、pSL12inv1tベクターの構造を示す。
単座組込み用ベクターpSL12内にあるLPIターミネーターをihc2ターミネーターと置換したleu1遺伝子座組込み用ベクターpSL12ihc2tベクター(6057bp、配列番号42)を製造した。
具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号17)および5’末端にSpeIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号43)を用いたPCRによって、ihc2遺伝子のORFの下流1bpから625bpの領域の5’末端にPstI、3’末端にSpeIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(ihc2t−Speフラグメント)を得た。
該ihc2t−Speフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、またpSL12を制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSL12ihc2tとした。図4に、pSL12ihc2tベクターの構造を示す。
公知の単座組込み用ベクターpSL14lacZ(国際公開第2014/030644号)内にあるinv1ターミネーターをLPIターミネーターと置換し、lacZ’をコードする構造遺伝子を除去したleu1遺伝子座組込み用ベクターpSL14LPItベクター(5778bp、配列番号44)を製造した。pSL14lacZベクターは、hsp9プロモーターおよびinv1ターミネーターの間にlacZ’をコードする構造遺伝子およびマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。
具体的には、pSL14lacZを制限酵素AarIおよびPvuIで二重消化してhsp9プロモーターおよびleu1相同組換え領域を含むDNA断片を回収し、一方でpSL6を制限酵素AarIおよびPvuIで二重消化してLPIターミネーターおよびtop2相同組換え領域を含むDNA断片を回収し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSL14LPItとした。図5に、pSL14LPItベクターの構造を示す。
単座組込み用ベクターpSL14LPIt内にあるLPIターミネーターをihc2ターミネーターと置換したleu1遺伝子座組込み用ベクターpSL14ihc2tベクター(5988bp、配列番号45)を製造した。
具体的には、上記で調製したihc2t−Speフラグメントを制限酵素制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、また上記で構築したpSL14LPItを制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSL14ihc2tとした。図6に、pSL14ihc2tベクターの構造を示す。
(pSL12EGFP−LPIt、pSL12EGFP−inv1t、pSL12EGFP−ihc2t、pSL14EGFP−LPIt、pSL14EGFP−inv1t、pSL14EGFP−ihc2t)
上記で製造した単座組込み用ベクターpSL12inv1t、pSL12ihc2t、pSL14LPI1t、pSL14ihc2t、および公知の単座組込み用ベクターpSL12、pSL14lacZの各マルチクローニングサイトに、EGFPをコードする構造遺伝子を挿入したEGFP発現ベクターpSL12EGFP−inv1t、pSL12EGFP−ihc2t、pSL14EGFP−LPIt、pSL14EGFP−ihc2t、pSL12EGFP−LPItおよびpSL14EGFP−inv1tをそれぞれ製造した。
具体的には、実施例1で調製したEGFPフラグメントを制限酵素NcoIおよびPstIで二重消化し、またpSL12、pSL12inv1t、pSL12ihc2t、pSL14LPI1t、pSL14lacZおよびpSL14ihc2tを制限酵素AarIおよびPstIで二重消化した。二重消化したEGFPフラグメントと二重消化した各単座組込み用ベクターとをそれぞれライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、EGFP発現ベクターpSL12EGFP−LPIt、pSL12EGFP−inv1t、pSL12EGFP−ihc2t、pSL14EGFP−LPIt、pSL14EGFP−inv1tおよびpSL14EGFP−ihc2tとした。
作製した各発現ベクターを用いて、実施例1と同様にしてARC001株を宿主とした形質転換体を作製した。
EGFP発現ベクターpSL12EGFP−LPIt、pSL12EGFP−inv1t、pSL12EGFP−ihc2t、pSL14EGFP−LPIt、pSL14EGFP−inv1tおよびpSL14EGFP−ihc2tを用いて得た形質転換体をそれぞれ、ihc1p/LPIt株、ihc1p/inv1t株、ihc1p/ihc2t株、hsp9p/LPIt株、hsp9p/inv1t株およびhsp9p/ihc2t株とした。
実施例1で得られた形質転換体であるCMVp/LPIt株、CMVp/inv1t株、CMVp/ihc2t株、前記で得られた各形質転換体およびS.ポンベの野生株(ARC032株)をそれぞれ試験管内の5mLのEMM培地に植菌し、32℃で3日間培養した。培養後の各培養液の菌体密度(OD660)およびGFP蛍光強度(励起波長490nm、蛍光波長530nm)をMTP−810Labにより測定して、各形質転換体およびARC032株のOD660当りのGFP蛍光強度(GFP/OD660)を算出した。
EGFPに代わってモデル分泌蛋白質としてhPDI(abx)を用い、蛋白質の違いがihc2ターミネーターを用いることによる発現効率改善効果に及ぼす影響について調べた。hPDI(abx)は、ヒト由来PDIのaドメインとbドメインとxドメインとから構成されるヒト由来PDIの部分蛋白質である。
(pPDI1(SP)−hPDI(abx)−inv1t、pPDI1(SP)−hPDI(abx)−ihc2t、pPDI1(SP)−hPDI(abx)−nmt1t)
公知のhPDI1(abx)分泌発現ベクターpPDI1(SP)−hPDI(abx)(国際公開第2013/111754号)を元に、各hPDI1(abx)分泌発現ベクターを作製した。pPDI1(SP)−hPDI(abx)は、hPDI(abx)の分泌発現カセット内にCMVプロモーター、S.ポンベPDI1シグナルペプチド部分をコードする遺伝子、およびLPIターミネーターを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に該発現カセットを組込む単座組込み用ベクターである。
pPDI1(SP)−hPDI(abx)−inv1tは次のように作製した。pPDI1(SP)−hPDI(abx)を制限酵素XbaIおよびEcoRIで二重消化してLPIターミネーター部分を取り除き、一方で実施例3で構築したpSL12inv1tを制限酵素XbaIおよびEcoRIで二重消化してinv1ターミネーター部分を回収し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpPDI1(SP)−hPDI(abx)−inv1tとした。
pPDI1(SP)−hPDI(abx)−ihc2tは次のように作製した。実施例3で構築したpSL12ihc2tを制限酵素XbaIおよびEcoRIで二重消化してihc2ターミネーター部分を回収し、先ほど制限酵素XbaIおよびEcoRIで二重消化したpPDI1(SP)−hPDI(abx)とライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドpPDI1(SP)−hPDI(abx)−ihc2tとした。
pPDI1(SP)−hPDI(abx)−nmt1tは次のように作製した。pPDI1(SP)−hPDI(abx)を制限酵素SbfIおよびPvuIで二重消化してLPIターミネーターおよびtop2相同組換え領域を含むDNA断片を取り除き、一方で実施例1で構築したpSL6EGFP−nmt1tを制限酵素SbfIおよびPvuIで二重消化してnmt1ターミネーターおよびtop2相同組換え領域を含むDNA断片を回収し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpPDI1(SP)−hPDI(abx)−nmt1tとした。
宿主として、S.ポンベARC001株の8つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたA8株(遺伝子型:h−、leu1−32、ura4−D18、△psp3、△isp6、△oma1、△ppp16、△fma2、△sxa2、△atg4、△ppp20)を用いた。A8株は、遺伝子カセットを用いた標的ORFの遺伝子置換により予め構築された株である(国際公開第2007/015470号参照。)。
作製した各発現ベクターを用いて、実施例1と同様にしてA8株を宿主とした形質転換体を作製した。
hPDI1(abx)分泌発現ベクターpPDI1(SP)−hPDI(abx)、pPDI1(SP)−hPDI(abx)−nmt1t、pPDI1(SP)−hPDI(abx)−inv1t、pPDI1(SP)−hPDI(abx)−ihc2tを用いて得た形質転換体をそれぞれ、hPDI(abx)/LPIt株、hPDI(abx)/nmt1t株、hPDI(abx)/inv1t株およびhPDI(abx)/ihc2t株とした。
前記で得られた各形質転換体および非発現株であるA8株それぞれを試験管内の5mLのYPD+MES(1%酵母エキス、1%ペプトン、2%グルコース、0.3M 2−モルホリノエタンスルホン酸一水和物)培地(pH6.0)に植菌し、32℃で3日間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収された培養上清4mLにTCA(トリクロロ酢酸)溶液を終濃度10%(w/w)になるよう添加して冷却し、得られた沈殿物を回収した。該沈殿物に40μLのSDS−PAGE用サンプルバッファーを添加し、95℃で5分間インキュベートし、PAGE用サンプルを調製した。該PAGE用サンプルのうち10μL(培養上清1mL相当)をアクリルアミドゲルにアプライし、SDS−PAGE後にCBB染色して、染色像をGel Doc(登録商標) XR+システム(Bio−Rad Laboratories社製、米国)で検出した。検出されたhPDI1(abx)の分泌バンドを定量化し、hPDI(abx)/LPIt株のhPDI(abx)分泌量を1とした場合の各形質転換体のhPDI(abx)の相対分泌量を算出した。
ihc2遺伝子のORFの下流側の領域の範囲を段階的に短くすることにより、ihc2遺伝子のターミネーター領域を検討した。
EGFP遺伝子をコードする構造遺伝子下流に、種々の長さのihc2遺伝子由来のターミネーターを配したEGFP発現カセットをギャップリペアクローニング法を応用してS.ポンベのleu1遺伝子座に組込んだ。ギャップリペアクローニング法とは、酵母が有する組換え修復機構を利用し、末端に20〜30bpの相同領域を有するDNA断片間での相同組換えを酵母細胞内で引き起こして、DNA断片を連結する方法である。
一方、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、5’末端にleu1+hCMVp+EGFPフラグメントの3’末端との相同領域24bpを備えるフォワードプライマーおよび5’末端にtop2フラグメントの5’末端との相同領域24bpを備えるリバースプライマーを用いたPCRによって、5’末端にleu1+hCMVp+EGFPフラグメントの3’末端との相同領域24bp、3’末端にtop2フラグメントの5’末端との相同領域24bpを有するihc2遺伝子の下流領域の各PCR産物を、次のようなプライマーの組合せで得た。具体的には、ihc2遺伝子の下流領域長が525bp(ORFの3’末端の下流1〜525bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜525番目の領域)のPCR産物(ihc2t(525)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号51の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、400bp(ORFの3’末端の下流1〜400bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜400番目の領域)のPCR産物(ihc2t(400)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号52の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、300bp(ORFの3’末端の下流1〜300bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜300番目の領域)のPCR産物(ihc2t(300)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号53の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、200bp(ORFの3’末端の下流1〜200bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜200番目の領域)のPCR産物(ihc2t(200)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号54の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、175bp(ORFの3’末端の下流1〜175bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜175番目の領域)のPCR産物(ihc2t(175)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号55の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、150bp(ORFの3’末端の下流1〜150bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜150番目の領域)のPCR産物(ihc2t(150)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号56の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、125bp(ORFの3’末端の下流1〜125bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜125番目の領域)のPCR産物(ihc2t(125)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号57の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、525bp(ORFの3’末端の下流1〜100bpの領域、すなわち、配列番号19中、1〜100番目の領域)のPCR産物(ihc2t(100)フラグメント)を配列番号50の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号58の塩基配列からなるリバースプライマーの組合せで、それぞれPCRを行い、各PCR産物を得た。
実施例1で得られた形質転換体であるCMVp/ihc2t株および前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのEMM培地に植菌し、32℃で4日間培養した。ちなみに、CMVp/ihc2t株の保持するEGFP発現カセット中のihc2遺伝子の下流領域長は625bpである。各形質転換体の培養2日目から4日目の各培養液の菌体密度(OD660)およびGFP蛍光強度(励起波長490nm、蛍光波長530nm)をMTP−810Labにより測定して、各形質転換体のOD660当りのGFP蛍光強度(GFP/OD660)を算出した。結果を図10に示す。ihc2遺伝子の下流領域長が175〜625bpにおいては、GFPの蛍光強度に大きな差は見られず、各下流領域は同等のターミネーター活性を示していた。一方、ihc2遺伝子の下流領域長が175bpより短くなるにつれてGFPの蛍光強度が低下していった。これらの結果は、ihc2遺伝子の下流領域長が175bpより短くなるにつれて、徐々にターミネーター活性が失われていくことを示している。
なお、2015年7月2日に出願された日本特許出願2015−133781号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (11)
- シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、または該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするクローニングベクター。 - シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイト、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするクローニングベクター。 - シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子、および、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とする発現ベクター。 - 請求項1または2に記載のクローニングベクター中のクローニングサイトに、外来構造遺伝子を導入することを特徴とする発現ベクターの製造方法。
- シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子、および下記ターミネーター以外のターミネーターを有する発現ベクターの該ターミネーターを、シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターに置換し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とする発現ベクターの製造方法。 - シゾサッカロミセス属酵母内で機能しうるプロモーター、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来構造遺伝子、およびシゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターを含む発現カセットを有し、
前記シゾサッカロミセス属酵母のihc2遺伝子が有するターミネーターが、配列番号19で表される塩基配列、該塩基配列中の1以上の塩基を置換、欠失、もしくは付加された塩基配列、または配列番号19で表される塩基配列と90%以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、かつターミネーター活性を有することを特徴とするシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。 - 前記発現カセットを含む発現ベクターを染色体外に含む、請求項6に記載の形質転換体。
- 前記発現カセットを染色体に含む、請求項6に記載の形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を製造する方法であって、前記発現カセットを含む発現ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体外に保持させることを特徴とする形質転換体を製造する方法。
- 請求項6に記載の形質転換体を製造する方法であって、前記発現カセットを含む発現ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体に導入することを特徴とする形質転換体を製造する方法。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、得られた菌体または培養液上清から、前記外来構造遺伝子がコードする蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
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