WO2013099881A1 - シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株 - Google Patents

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WO2013099881A1
WO2013099881A1 PCT/JP2012/083521 JP2012083521W WO2013099881A1 WO 2013099881 A1 WO2013099881 A1 WO 2013099881A1 JP 2012083521 W JP2012083521 W JP 2012083521W WO 2013099881 A1 WO2013099881 A1 WO 2013099881A1
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chromosome
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locus
deleted
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PCT/JP2012/083521
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真弓 小林
英毅 東田
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旭硝子株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to an S. cerevisiae that has been extensively deleted from the chromosome of Schizosaccharomycespombe (hereinafter, S. pombe).
  • S. pombe Schizosaccharomycespombe
  • Pombe genome reduced strain the S. Method for producing a Pombe genome reduced strain
  • S. for protein expression Pombe genome reduced strain S.
  • the present invention relates to a protein production method using a Pombe genome-reduced strain.
  • fission yeast S. Pombe is a phylogenetically very different yeast from budding yeast, and has similar properties to animal cells with complex properties such as cell growth mechanism, chromosome structure, RNA splicing mechanism, and addition of galactose residues to glycoprotein sugar chains.
  • S. Pombe is one of useful protein production host strains that can complement gene functions of higher animals well and can be used for the production of proteins derived from humans.
  • the cells can be produced, for example, by deleting a region containing a non-essential gene for survival in a chromosome on a large scale. S.
  • Pombe there has been a demand for a substance-producing host strain in which non-essential genes have been deleted on a large scale and waste of unnecessary metabolic energy has been suppressed, but it has not been obtained yet.
  • the pombe chromosome is composed of three linear DNAs of 5.7 Mbp, 4.6 Mbp, and 3.5 Mbp in length, and the entire genome sequence is stored in a database (http://www.generatedb.org/generatedb/ pombe /). Recently, Kim et al. Information on essential genes (genes essential for growth maintenance) obtained by constructing a Pombe single gene disruption library has been disclosed (for example, see Non-Patent Document 1). S. There are about 4900 genes in Pombe, and about 21.6% are essential genes for survival. According to the information, S.I. In Pombe, essential genes are evenly scattered on the chromosome, and there are few large non-essential gene cluster regions.
  • S.M It is an object of the present invention to provide a strain in which the pombe chromosome has been deleted on a large scale, and a method for producing a protein using the strain.
  • S. of the present invention Pombe genome-reduced strains, production methods thereof and the like are the following [1] to [14].
  • [1] S.M. A region (a) in the chromosome of Pombe that is at least a part other than the telomere on the left arm distal side of the trs33 locus of the first chromosome, at least a part other than the telomere on the right arm distal side of the sec16 locus of the first chromosome A region (b) that is at least a portion other than the telomere on the left arm distal side of the zas1 locus of the second chromosome, and a region other than the telomere on the right arm distal side of the usp109 locus of the second chromosome
  • One or more regions selected from the group consisting of the region (d) which is at least a part of the region are deleted, and the length of the entire deleted region is 0.9% or more of the genome of the wild strain S.
  • Pombe genome reduced strain [2] The S. of [1] above, wherein the region (a) is a region from the tlh1 locus to the gpi7 locus on the left arm of chromosome 1. Pombe genome reduced strain. [3] The S. of [1], wherein the region (a) is a region from the tlh1 locus to the gmh2 locus on the left arm of chromosome 1. Pombe genome reduced strain. [4] The S. of any one of [1] to [3], wherein the region (b) is a region from the SPAC29B12.08 locus on the right arm of chromosome 1 to the estimated tlh locus. Pombe genome reduced strain. [5] The S.
  • Pombe Pombe genome reduced strain [11] The S. cerevisiae of [10] above, wherein the pdc2 gene is inserted into the ura4 locus of chromosome 3. Pombe Pombe genome reduced strain. [12] The S.I. of any one of [1] to [11]. A Shizo Saccharomyces pombe genome-reduced strain for protein expression, wherein an expression cassette for expressing a structural gene is introduced into the Pombe-pombe genome-reduced strain. [13] The protein expression S.
  • a method for producing a protein comprising obtaining a protein expressed from the structural gene from a bacterial cell or a culture supernatant obtained by culturing a Pombe-Pombe genome-reduced strain.
  • S.M. In the pombe-pombe chromosome, a region (a) that is at least a part other than the telomere on the left arm distal side of the trs33 locus of the first chromosome; A region (b) which is at least a part, a region (c) which is at least a part other than the telomere on the left arm distal side of the zas1 locus of the second chromosome, and a right arm distal side of the usp109 locus of the second chromosome One or more regions selected from the group consisting of regions (d) that are at least a portion other than telomeres are deleted, and the length of all deleted regions is 0.9% or more of the genome of the wild strain, S.
  • a non-essential gene has been deleted on a large scale.
  • a Pombe genome-reduced strain can be provided.
  • the S.P. The Pombe genome-reduced strain has high production efficiency of foreign proteins and is suitable as a host for foreign protein expression systems. Therefore, the S.P.
  • a foreign protein can be produced more efficiently by the protein production method of the present invention using a Pombe genome-reduced strain as a host.
  • FIG. It is a schematic diagram of three chromosomes of pombe. 2 is based on the information disclosed in Non-Patent Document 1. It is the figure which showed typically the estimated distribution of the essential gene and non-essential gene of pombe.
  • FIG. It is a schematic diagram of a chromosome of a preferred embodiment of a Pombe genome-reduced strain.
  • FIG. 4 shows the S.E. It is the figure which showed typically the terminal area
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing the state of large-scale deletion of chromosomes in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each one-region deleted strain with respect to the parent strain ARC010 strain in Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each one-region deleted strain with respect to the parent strain ARC010 strain in Example 1.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of the chromosomes of deleted strains ALT-1 to ALT-6 in which the region in the vicinity of the trs33 locus of the first chromosome was deleted in Example 1.
  • FIG. 9 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each one-region deleted strain with respect to the ARC010 strain, which is the parent strain, in Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of the restored strain of each gene relative to the parent strain ARC010 in Example 1.
  • FIG. 11 shows the S.I. It is the figure which showed the UMP biosynthesis pathway of Pombe.
  • FIG. 12 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of the restored strain of each gene relative to the ARC010 strain in Example 1.
  • FIG. 13 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each deleted strain with respect to the ARC001 strain in Example 1.
  • FIG. 14 is a diagram showing the final turbidity (OD 660 ) of each deleted strain in Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each deleted strain with respect to the ARC001 strain in Example 1.
  • FIG. 16 is a diagram showing the final turbidity (OD 660 ) of each deleted strain in Example 1.
  • FIG. 17 is a differential interference image (DIC) and a DAPI-stained image of each strain in Example 1.
  • FIG. 18 is a tilted-light image of a plate medium after cultivating a deletion strain requiring leucine in Example 1.
  • FIG. 19 is a tilted-light image of a plate medium after cultivating a leucine non-required deletion strain in various plate media in Example 1.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of Southern plot analysis performed in Example 1 using the telomeric repeat sequence as a probe on the genomic DNA of IGF742 strain and ARC001 strain after about 100 generations of culture.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of Southern plot analysis performed in Example 1 using the telomeric repeat sequence as a probe on the genomic DNA of IGF742 strain and ARC001 strain after about 100 generations of culture.
  • FIG. 21 is a diagram showing the measurement results of the EGFP fluorescence value of each deleted strain together with the results of the ARC001 strain in Example 2.
  • FIG. 22 is a diagram showing the hGH content of the culture supernatant of each strain in Example 2.
  • FIG. 23 is a diagram showing the hTF content of the culture supernatant of each strain in Example 2.
  • FIG. 24 is a diagram showing the protein production efficiency of each genome-reduced strain in Example 2 as a relative value with respect to the parent strain.
  • FIG. 1 The schematic diagram of three chromosomes of Pombe is shown.
  • the filled regions at both ends of each chromosome show telomeres, and the filled regions near the center show centromeres, respectively.
  • “ALT” is a non-essential gene cluster region distal to the left arm of chromosome 1
  • “ART” is a non-essential gene cluster region distal to the right arm of chromosome 1
  • “BLT” is distal of the left arm of chromosome 2.
  • the non-essential gene cluster region and “BRT” indicate the non-essential gene cluster region distal to the right arm of chromosome 2 respectively.
  • the present inventors have described S.A. In producing a Pombe genome-reduced strain, S. cerevisiae essential gene information from a single gene disruption library, Referring to homologous gene information of pombe and budding yeast The distribution of essential genes on the pombe chromosome was estimated. As a result, the most essential genes at the end of chromosome 1 and chromosome 2 are trs33 on the left arm of chromosome 1, sec16 on the right arm of chromosome 1, secas on the left arm of chromosome 2, and usp109 on the right arm of chromosome 2. I guessed that.
  • the zas1 locus of the left arm of chromosome 2 and the distal side of the trs33 locus of the left arm of chromosome 1 telomere side
  • the distal side of the sec16 locus of the right arm of chromosome 1 and the left arm of chromosome 2 were deleted by the Latour method
  • S. cerevisiae was deleted.
  • a Pombe genome reduced strain could be produced.
  • Non-Patent Document 1 S.
  • the estimated distribution of the essential and non-essential genes of Pombe is shown schematically.
  • the upper stage of each chromosome is an essential gene, and the middle stage is a non-essential gene.
  • the gene surrounded by a square is a gene that the present inventors presumed to be the essential gene at the end of each chromosome, and the filled region at the bottom of each chromosome is the S. of the present invention. This is a region that can be deleted in the method for producing a Pombe genome-reduced strain.
  • the pdc2 (SPAC1F8.07c) gene in the painted region of the left arm of chromosome 1 and the SPBC1348.06c gene, the alr2 (SPBC3599.02) gene and the dea2 (SPBC1198.02) gene in the painted region of the left chromosome 2 are Although it was annotated as an essential gene in Non-Patent Document 1, the present inventors confirmed that it is a non-essential gene. That is, the present inventors obtained for the first time that the essential gene at the extreme end of the left arm of chromosome 1 is the trs33 gene and the essential gene at the extreme end of the left arm of chromosome 2 is the zas1 gene.
  • Non-Patent Document 1 the reason why it was determined to be an essential gene in the one-gene disruption library in Non-Patent Document 1 is that a deletion strain is obtained because the growth ability was remarkably reduced by the deletion of the gene. It is presumed that it was difficult to obtain deleted strains due to the low homologous recombination efficiency depending on the chromosomal site.
  • Pombe genome-reduced strains are At least a part of the non-essential gene cluster region at both ends of the first and second chromosomes of Pombe is deleted, and the length of the entire deleted region is 0.9% or more of the genome of the wild strain, To do.
  • the length of the total deletion region is preferably 1% or more of the genome of the wild strain, more preferably 2% or more, further preferably 3% or more, and 3.5% or more. Is more preferable and 4% or more is particularly preferable.
  • a region (b) that is at least a portion other than the telomere on the left arm distal side of the zas1 locus of the second chromosome, and a region other than the telomere on the right arm distal side of the usp109 locus of the second chromosome Is a strain from which one or more regions selected from the group consisting of the region (d), which is at least a part of, are deleted.
  • the region is a non-essential gene cluster region, and even when part or all of the region is deleted, the region has the same form as the wild type strain and can stably grow.
  • a Pombe genome-reduced strain can be obtained.
  • the Pombe genome-reduced strain is suitable as a host for the foreign protein expression system because the non-essential gene cluster region is deleted.
  • chromosome 1 of the Pombe genome-reduced strain On the left arm side of chromosome 1 of the Pombe genome-reduced strain, at least a part of the region other than the telomere distal to the trs33 locus is deleted.
  • the length of the deletion region (region (a)) on the left arm side of the first chromosome is not particularly limited as long as the entire deletion region of the entire chromosome is 0.9% or more of the genome of the wild strain.
  • the region (a) is preferably a region that is distal to the trs33 locus and includes a region that is located proximal to the pdc2 locus or the pdc2 locus, and includes the gpi7 gene from the tlh1 locus. More preferred is the region up to the locus, or the region from the tlh1 locus to the gmh2 locus.
  • the deleted strain in which the region from the tlh1 locus to the gpi7 locus is deleted, the growth ability tends to be lower than in the wild strain, but the deleted region is the region from the tlh1 locus to the gmh2 locus (the entire chromosome). 1.2%) is preferable because a decrease in the growth ability of the obtained deleted strain can be suppressed.
  • the region (b) on the right arm side of the first chromosome is not particularly limited as long as the length of the entire deletion region of the entire chromosome is 0.9% or more of the genome of the wild strain.
  • a region of 155.4 kbp (1.1% of the entire chromosome) can be deleted. Therefore, the region (b) is preferably a region from the SPAC29B12.08 locus to the estimated tlh locus.
  • the region (c) On the left arm side of chromosome 2 of the Pombe genome-reduced strain, at least a part of the region other than the telomere distal to the zas1 locus is deleted.
  • the length of the deletion region (region (c)) on the left arm side of the second chromosome is not particularly limited as long as the length of the entire deletion region of the entire chromosome is 0.9% or more of the genome of the wild strain.
  • the region (c) is preferably a region including a region that is more distal to the zas1 locus and more proximal to the SPBC134.06c locus or SPBC1348.06c locus.
  • the region (c) is preferably a region from the estimated tlh locus to the SPBC1198.03 locus.
  • the region other than the telomere distal to the usp109 locus is deleted.
  • the length of the deletion region on the right arm side of the second chromosome is not particularly limited as long as the length of the entire deletion region of the entire chromosome is 0.9% or more of the genome of the wild strain.
  • a region of 121.6 kbp (0.9% of the entire chromosome) can be deleted, and therefore the region (d) is preferably a region from the SPBC1289.13c locus to the tlh2 locus.
  • the Pombe genome-reduced strain may be a strain in which one of the four regions (a) to (d) is deleted, and a strain in which two or more of the four regions are deleted It may be. S. of the present invention.
  • a strain in which at least one of the region (a) or the region (c) is deleted among the four regions is preferable, and at least two or more regions including the region (a) or the region (c) are included. More preferred is a strain in which the region has been deleted.
  • a strain in which two or more regions including the region (b) are deleted is also preferable, and a strain in which three or more regions including the region (b) are deleted is more preferable.
  • S. of the present invention As a Pombe genome-reduced strain, all four regions have been deleted. Pombe genome reduced strains are particularly preferred. Among them, S.M.
  • the region from the tlh1 locus to the gpi7 locus on the left arm of chromosome 1, the region from the SPAC29B12.08 locus on the right arm of chromosome 1 to the estimated tlh locus, and the estimated thl gene on the left arm of chromosome 2 The region from the locus to the SPBC1198.03c locus and the region from the SPBC1289.13c locus to the tlh2 locus on the right arm of chromosome 2 are preferably deleted. By deleting this area, 665.6 kbp is deleted.
  • S. of the present invention As a Pombe genome-reduced strain, S. In the Pombe chromosome, the region from the tlh1 locus to the gmh2 locus on the left arm of Chromosome 1, the region from the SPAC29B12.08 locus on the right arm of Chromosome 1 to the estimated tlh locus, and the estimated thl gene on the left arm of Chromosome 2 It is particularly preferred that the region from the locus to the SPBC1198.03c locus and the region from the SPBC1289.13c locus to the tlh2 locus on the right arm of chromosome 2 are deleted.
  • the pdc2 gene has the region (a), the region (b ), The region (c), and a region other than the region (d), preferably the region from the trs33 locus to the sec16 locus of the first chromosome, the usp109 from the zas1 locus of the second chromosome More preferably, it is inserted into a region up to the locus or a region other than the essential gene in the third chromosome.
  • Proliferation ability can be increased as compared with the Pombe genome-reduced strain.
  • the pdc2 gene can be inserted, for example, at the ura4 locus of chromosome 3, particularly between the ura4 gene and the SPCC330.06c gene.
  • SPBC1683 .05 gene is preferably inserted in a region other than the region (a), the region (b), the region (c), and the region (d) in the chromosome, and the trs33 gene of the first chromosome More preferably, it is inserted into a region from the locus to the sec16 locus, a region from the zas1 locus of the second chromosome to the usp109 locus, or a region other than the essential gene in the third chromosome.
  • the yeast growth rate tends to decrease, but by leaving the SPBC1683.05 gene in other regions in the chromosome, the ura4 gene The growth rate is restored even if it has been deleted.
  • the SPBC1683.05 gene can be inserted into the leu1 locus of chromosome 2, for example.
  • FIG. 3 shows the S.E.
  • a schematic diagram of a particularly preferred embodiment of the chromosome is shown. That is, the region from the tlh1 locus on the left arm of chromosome 1 to the gmh2 locus, the region from the SPAC29B12.08 locus on the right arm of chromosome 1 to the estimated tlh locus, and the established tlh locus on the left arm of chromosome 2 from SPBC1198.
  • the region up to the .03c locus and the region from the SPBC1289.13c locus to the tlh2 locus on the right arm of chromosome 2 have been deleted, and the pdc2 gene has been inserted into the ura4 locus of chromosome 3. Further, if necessary, the SPBC1683.05 gene is inserted into the leu1-32 locus, which is an inactivated mutant of leu1 (SPBC1A4.02c) of the second chromosome.
  • the Pombe genome-reduced strain is, for example, S. pneumoniae. It can be produced by deleting the regions at both ends of chromosome 1 and chromosome 2 in the chromosome of the pombe wild strain.
  • the method for deleting a chromosomal region is not particularly limited, and any known method such as a telomere truncation method may be used.
  • the Latour method (Nucleic Acids Res., 2006, 34, e11) , Described in International Publication No. 2007/063919).
  • the Latour method is a method in which a gene sequence at one end of a region to be deleted is inserted into the other end, and an internal region is looped out by homologous recombination. Can be deleted.
  • the pdc2 gene or the SPBC1683.05 gene may be inserted into the chromosome using any known technique.
  • each gene can be inserted into a desired site in the chromosome using a transformation method used for inserting a foreign gene into an appropriate target site in the chromosome by homologous recombination.
  • Pombe genome-reduced strains are Like the wild pombe strain, it can be used for the production of various useful substances such as proteins, and for the functional analysis of biomolecules such as genes. Further, one or more bases may be substituted, deleted, or added to the wild-type strain in a region other than the region where the essential gene in the remaining chromosome is encoded.
  • the Pombe genome-reduced strain has an increased substance production capacity than the wild strain. Therefore, S. of the present invention.
  • the Pombe genome-reduced strain is suitable as a host for introducing a foreign structural gene in order to express a foreign protein. Specifically, the S. for protein expression of the present invention.
  • the Pombe genome-reduced strain is a strain of the present invention.
  • An expression cassette for expressing a structural gene is introduced into a Pombe genome-reduced strain.
  • the expression cassette is the S. of the present invention. It may be inserted into the chromosome of the Pombe genome-reduced strain or may exist as an extrachromosomal gene.
  • An expression cassette is a combination of DNAs necessary for expressing a protein.
  • a promoter that functions in Pombe Includes a terminator that functions within the pombe. Further, any one or more of a 5'-untranslated region and a 3'-untranslated region may be included. Furthermore, an auxotrophic complementary marker may be included.
  • a preferred expression cassette is an expression cassette comprising a structural gene, a promoter, a terminator, a 5'-untranslated region, a 3'-untranslated region, and an auxotrophic complementary marker. A plurality of structural genes may be present in the expression cassette.
  • promoters that function in pombe include S. cerevisiae. Pombe's inherent promoter (preferably having high transcription initiation activity) or S. A promoter (eg, a virus-derived promoter) that Pombe does not originally have can be used. Two or more promoters may be present in the vector.
  • promoters inherent to Pombe include alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter involved in thiamine metabolism, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter involved in glucose metabolism, and invertase gene involved in catabolite repression. Examples include promoters (see International Publication No. 99/23223) and heat shock protein gene promoters (see International Publication No.
  • the nmt1 gene promoter with good expression efficiency and its modified promoters eg, nmt1 + , nmt41
  • hCMV promoter e.g., SV40 promoter
  • the foreign structural gene introduced into the Pombe genome-reduced strain is not particularly limited as long as it is a structural gene encoding a protein. It may be the same gene as the gene originally possessed by Pombe, or may be a structural gene derived from a different organism.
  • the endogenous protein can be produced in a larger amount from a transformant obtained by an expression vector containing a structural gene encoding the pombe endogenous protein.
  • a large amount of heterologous protein (protein originally not possessed by the host S. pombe) can be produced from a transformant obtained by an expression vector containing a structural gene derived from a heterologous organism.
  • the protein encoded by the foreign structural gene is preferably a heterologous protein, more preferably a protein produced by an animal or plant that is a multicellular organism, and even more preferably a protein produced by a mammal (including a human).
  • the foreign structural gene may be a wild-type structural gene, a gene obtained by modifying a wild-type structural gene, or an artificially synthesized gene as long as it encodes a protein. May be.
  • Examples of the structural gene other than the wild type include a gene encoding a chimeric protein in which a plurality of wild type proteins are fused, and a protein in which other peptides are bound to the N-terminal or C-terminal of the wild-type protein. Genes and the like.
  • the other peptides include signals such as secretion signals, signals for transfer to specific organelles, tags such as His tags, FLAG tags, and the like. The various signals It must be a signal that functions in Pombe yeast.
  • a secretion signal is a peptide having a function of secreting an expressed protein outside the host cell by being present at the N-terminus. S.
  • the P3 signal described in WO 1996/23890 is particularly preferable.
  • a method for introducing the expression cassette into the chromosome of the Pombe genome-reduced strain a known method can be used.
  • a vector having an expression cassette and a recombination site is designated as A method of introducing the strain into a Pombe genome reduced strain is mentioned.
  • plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, and pUC19 can be preferably used.
  • the expression cassette was transformed into S. cerevisiae by homologous recombination.
  • the plasmid vector used for homologous recombination preferably has a replication initiation region called “ori” that is necessary for replication in E. coli. .
  • ori replication initiation region
  • the method for constructing the vector from which the replication initiation region has been removed is not particularly limited, but the method described in JP-A-2000-262284 is preferably used. That is, a method is preferred in which a precursor vector in which a replication initiation region is inserted at the cleavage site in the recombination site is constructed so that the replication initiation region is excised at the same time as the linear DNA structure as described above. Thereby, a vector from which the replication initiation region has been easily removed can be obtained. Further, expression vectors described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, International Publication No. 96/23890, JP-A-10-234375, and the construction method thereof are applied for expression. A method may be used in which a precursor vector having a cassette and a recombination site is constructed, and a vector used for homologous recombination is obtained by further removing the replication initiation region from the precursor vector by an ordinary genetic engineering technique.
  • the recombination site of the vector is S. cerevisiae. It is a site having a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site of homologous recombination in the pombe chromosome.
  • the target site is S. pneumoniae. This is a target site for integrating the expression cassette in the pombe chromosome.
  • the target site can be freely set by setting the recombination site of the vector to a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site needs to be 70% or more.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more from the viewpoint that homologous recombination is likely to occur.
  • the expression cassette is incorporated into the target site by homologous recombination.
  • the length (number of bases) of the recombination site is preferably 20 to 2000 bp. If the length of the recombination site is 20 bp or more, homologous recombination is likely to occur.
  • the length of the recombination site is 2000 bp or less, it is easy to prevent the vector from becoming too long and causing homologous recombination to hardly occur.
  • the length of the recombination site is more preferably 100 bp or more, and further preferably 200 bp or more. Further, the length of the recombination site is more preferably 800 bp or less, and further preferably 400 bp or less.
  • the target site into which the vector is incorporated is S. of the present invention. It may exist in only one place in the chromosome of the Pombe genome-reduced strain, or may exist in two or more places. When two or more target sites exist, S.P. Two or more vectors can be integrated into the chromosome of the Pombe genome-reduced strain. Furthermore, an expression cassette can be incorporated into two or more target sites using two or more vectors having recombination sites corresponding to the respective target sites. S. of the present invention. In the Pombe genome-reduced strain, for example, it can be inserted into the leu1 locus of the second chromosome.
  • the vector may have other DNA regions in addition to the expression cassette and the recombination site.
  • a replication initiation region called “ori” necessary for replication in E. coli, an antibiotic resistance gene (neomycin resistance gene, etc.) and the like can be mentioned. These are genes usually required when constructing a vector using Escherichia coli.
  • the replication initiation region is preferably removed when the vector is integrated into the host chromosome as described later.
  • the vector is a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure. When introducing into a pombe cell, it is preferable to introduce it in a linear DNA structure. That is, in the case of a vector having a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA, S.
  • the position for opening the vector having a circular DNA structure is within the recombination site.
  • the recombination sites partially exist at both ends of the opened vector, and the entire vector is integrated into the target site of the chromosome by homologous recombination.
  • the vector may be constructed by a method other than the method of cutting a vector having a circular DNA structure, as long as it can have a linear DNA structure in which a part of the recombination site exists at each end.
  • S. of the present invention as a host.
  • S. of the present invention By transforming a Pombe genome-reduced strain, the S. A Pombe genome-reduced strain is obtained.
  • the transformation method is known in the art. Any method for transforming Pombe yeast can be used.
  • the transformation method for example, lithium acetate method [K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)], electroporation method, spheroplast method, glass bead method, etc.
  • a known method and the method described in JP-A-2005-198612 can be exemplified.
  • a commercially available yeast transformation kit may also be used.
  • the obtained transformant is usually selected.
  • the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected.
  • the number of vectors integrated into the chromosome and the number of expression cassettes can be examined by performing genome analysis by pulse field gel electrophoresis on the selected transformants.
  • the Pombe genome-reduced strain is a natural S. pneumoniae strain. It can be cultured in the same manner as Pombe yeast.
  • a well-known yeast culture medium can be used for the culture solution for culture
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as the culture solution.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, and ammonium acetate, ammonium salts of inorganic acids, peptone, and casamino acids.
  • examples of inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • nutrient medium such as YPD medium (MDRose et al., “Methods In Yeast Genetics”, Cold Spring Harbor Labolatory Press (1990)) or minimal medium such as MB medium (K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res. 18, 6485-6489 (1990)).
  • a well-known yeast culture method can be used for culture
  • the culture temperature is preferably 23 to 37 ° C.
  • the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • the method for producing the protein of the present invention comprises the S. for protein expression of the present invention.
  • a Pombe genome-reduced strain is cultured, and the S. cerevisiae for protein expression is obtained from the obtained bacterial cells or culture supernatant.
  • a protein encoded by a foreign structural gene introduced into a Pombe genome-reduced strain is obtained.
  • Culture conditions can be appropriately set in consideration of the type of foreign protein to be produced. For example, it is carried out at 16 to 42 ° C., preferably 25 to 37 ° C., for 8 to 168 hours, preferably 48 to 96 hours. Either shaking culture or stationary culture is possible, but stirring or aeration may be added as necessary.
  • a cell extract containing the desired foreign protein can be prepared from the cells by ultrasonic disruption or mechanical disruption, and the foreign protein can be isolated and purified from the cell extract.
  • the foreign protein when the foreign protein is secreted outside the cell, the foreign protein can be isolated and purified from the culture supernatant. Isolation / purification methods for obtaining these produced proteins include known methods such as salting-out or solvent precipitation, such as methods utilizing the difference in solubility, dialysis, ultrafiltration, gel electrophoresis, etc.
  • a method utilizing a difference in molecular weight a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography, a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, Examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • the structure of the purified protein can be clarified by amino acid analysis, amino-terminal analysis, primary structure analysis, or the like.
  • Example 1 Production of Pombe genome-reduced strain
  • S. Chromosome 1 or 2 in the chromosome of pombe's uracil auxotrophic strain ARC010, genotype: h - leu1-32 ura4-D18, provided by Prof. Yuichi Iino, University of Tokyo graduate School of Science
  • ARC010 genotype: h - leu1-32 ura4-D18, provided by Prof. Yuichi Iino, University of Tokyo graduate School of Science
  • a one-region deleted strain in which the left arm end side or the right arm end side was deleted was prepared.
  • the estimated tlh locus 155.4 kbp, ART region
  • the chromosome 1 right arm strain ( ⁇ ART) has been deleted
  • BLT region deleted chromosome 2 left arm strain ( ⁇ BLT)
  • the region from the right end of chromosome 2 to the telomere at the end of the chromosome was the region where sequencing by the genome project was not completed. Therefore, the present inventors speculated that the homology of the base sequence in the vicinity of the undecoded region at the end of each chromosome is very high, so the homology of the undecoded region is also high, as shown in FIG.
  • the filled boxes represent gene loci, the genes shown in the upward direction are 5 ′ ⁇ 3 ′, and the genes shown in the downward direction are 3 ′ ⁇ 5 ′.
  • regions connected by hatched zones indicate regions having a homology of 98% or more at the base sequence level.
  • the hatched box indicates a gene inferred from the right arm of chromosome 2 whose base sequence has been determined up to telomeres.
  • a DNA fragment for homologous recombination was prepared, and a one-region deleted strain was prepared by the Latour method using the DNA fragment.
  • the region from the tlh1 locus to the SPAC977.09c locus was deleted.
  • the first chromosome left arm strain ( ⁇ thl1-SPAC977.09c) and the first chromosome left arm strain ( ⁇ SPAC977.11-gpi7) from which the region from the SPAC977.11 locus to the gpi7 locus (121.8 kbp) was deleted were prepared.
  • the Latour fragment (fragment for deletion used for large-scale deletion of chromosomes) used for preparing the one-region deleted strain was prepared as follows.
  • the Latour fragment is a homologous region consisting of about 500 bp necessary for insertion on two chromosomes (UP region on the left side and DN region on the right side), on the side opposite to the site where the deletion fragment is inserted in the target deletion region. It was composed of a total of four DNA fragments, an adjacent DNA region consisting of about 200 bp (OL region) and a ura4 gene region (ura4 region) serving as a marker gene.
  • OL region an adjacent DNA region consisting of about 200 bp
  • ura4 region ura4 gene region
  • the DNA fragment of each region is S. cerevisiae.
  • the whole genome DNA prepared by DNeasy (manufactured by Qiagen) from ARC032 strain (genotype: h ⁇ , the University of Tokyo graduate School of Science, Gene Experiment Facility, Prof. Yuichi Iino), which is a wild strain of pombe, Cloning was performed by PCR using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) (98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 68 ° C. at 1 kb / minute for 30 cycles).
  • KOD-Plus Toyobo Co., Ltd.
  • the primers used for amplification of each DNA fragment are shown in Tables 1-3.
  • primers were removed from the PCR reaction solution containing each amplified fragment using a Microcon YM-100 column (Millipore), and the two DNA fragments were ligated by the PCR method.
  • ligation two pairs of DNA fragments having a homologous region of about 20 bp and two pairs of primers for amplifying the ligated fragments are mixed in the reaction solution, and step-down PCR is performed using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.). Reaction (98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 3 minutes for 2 cycles, then the annealing temperature is lowered by 2 ° C., followed by 2 cycles of reaction. Cycle reaction).
  • DMSO was mixed with the PCR reaction solution so that the final concentration was 5%
  • betaine was mixed so that the final concentration was 1M.
  • the UP region and the OL region (or ura4 region), the ura4 region (or OL region) and the DN region are first linked, and finally the fragment including the UP region and the fragment including the DN region are combined.
  • Latour fragment When amplification efficiency was poor, DMSO was mixed with the PCR reaction solution so that the final concentration was 5%, and betaine was mixed so that the final concentration was 1M.
  • Latour fragment latent strain S. Pombe ARC010 strain (genotype: h - leu1-32 ura4-D18) was transformed. Transformation was performed based on the method of Bahler et al. (Bahler, J, et.al., Yeast, vol. 14, p943-951 (1998)). Transformants in which the Latour fragment was integrated on the chromosome (Latour fragment latent strain) were selected on a minimal medium containing leucine (250 mg / L).
  • the Latour fragment latent strain is grown to the stationary phase in a nutrient medium, and 100 ⁇ l of the culture solution is a minimal medium containing uracil (100 mg / L), leucine (250 mg / L), 5-fluoroorotic acid (FOA, 500 mg / L). (FOA medium) was spread.
  • the FOA-treated strain selected in the FOA medium is a strain (genome-reduced strain) in which the chromosomal region is deleted together with the ura4 region by homologous recombination between the OL region on the chromosome and the OL region of the deleted fragment, or ura4 A strain in which a mutation has occurred in a gene.
  • an amplified fragment of about 1 kb is obtained.
  • An amplified fragment of about 1 kb generated after large-scale deletion of chromosome was confirmed by PCR using the chromosomal DNA of the FOA-treated strain as a template, and this was used as a large-scale deletion chromosome chromosome in each region.
  • the operation of transforming using the Latour fragment of the region to be deleted next and performing the FOA treatment was repeated.
  • FIG. 5 schematically shows the state of large-scale deletion of chromosomes.
  • the figure shows chromosomes and squares represent genes.
  • the direction of the gene indicated by the upper square is 5 ' ⁇ 3', and the direction of the gene indicated by the lower square is 3 ' ⁇ 5'.
  • a fragment composed of the UP region, OL region, ura4 region, and DN region is a Latour fragment, and a broken line extending from the Latour fragment to the chromosome indicates a position where the Latour fragment is inserted on the chromosome.
  • the arrow shown below the schematic diagram of the chromosome indicates a primer for confirming the Latour fragment inserted on the chromosome or a primer for confirming that the chromosome has been deleted.
  • each primer is shown in Tables 1 to 3.
  • FIG. 5A is a schematic diagram when deleting the chromosome left arm end
  • FIG. 5B is a schematic diagram when deleting the chromosome right arm end. Since the deletion direction is different between the chromosome left arm end and the right arm end, the OL region and the ura4 region are reversed.
  • the maximum growth rate of the obtained one-region deleted strain was measured. Specifically, each deleted strain is cultured in a YES medium (pH 5.0), the maximum growth rate ( ⁇ max ) is calculated from the absorbance (OD 660 ) of the culture solution at 660 nm, and the maximum growth of the parent strain ARC010 strain is calculated. The relative ratio to the speed (hereinafter, the maximum specific growth rate) was determined. The calculated result is shown in FIG. As a result, the IGF522 strain ( ⁇ tlh1-SPAC977.09c), IGF524 strain ( ⁇ ART), and IGF526 strain ( ⁇ BRT) maintained substantially the same growth rate as the parent strain ARC010.
  • the IGF523 strain ( ⁇ SPAC977.11-gpi7) was about 0.4 compared with the parent strain, and was significantly reduced.
  • the IGF525 strain ( ⁇ BLT) maintained a growth rate of about 80% of that of the parent strain. Therefore, it was suggested that a gene that affects the growth rate exists in the deleted region of the two strains.
  • IGF719 in which the pdc2 gene in the region from the SPAC977.11 gene to the gpi7 gene is inserted into the ura4 locus on the third chromosome and then the entire region from the tlh1 locus to the tim8 locus on the left arm of the first chromosome is deleted.
  • IGF719 strain was cultured in a YES medium (pH 5.0), and the maximum specific growth rate was calculated by measuring the OD 660 of the culture solution. The calculation results are shown in FIG. As a result, the growth rate of the IGF719 strain was improved to 0.83 times that of the parent strain.
  • Deleted strains in which regions of various lengths were deleted from the region near the trs33 locus of chromosome 1 were constructed, and the maximum specific growth rate of each deleted strain was calculated.
  • the deletion area of each deleted strain is shown in FIG. 8, and the maximum specific growth rate of each deleted strain is shown in FIG. In FIG. 8, the black line connecting the black circles at both ends indicates the deletion area of each deleted strain.
  • the deletion strain ALT-1 and the deletion strain ALT-2 maintained almost the same growth rate as that of the parent strain, but the other deletion strains were confirmed to have decreased growth rates.
  • the gmh1 (SPAC5H10.11) gene, the SPAC5H10.12c gene, and the gmh2 gene do not affect the growth rate, and any of the rad8 (SPAC13G6.01c) gene, the rps101 gene, the gpi7 gene, or the tim8 gene has a growth rate. It was suggested that it was necessary for maintenance.
  • the rad8 gene, the rps101 gene, or the gpi7 gene was inserted into the leu1 locus of the second chromosome of the IGF622 strain ( ⁇ ALT_LONG, pdc2 gene reverted to the ura locus) to prepare a reversion strain of each gene.
  • the obtained returning strain was cultured in a YES medium (pH 5.0), and the maximum specific growth rate was calculated by measuring OD 660 of the culture solution. The calculation results are shown in FIG.
  • the growth rate was improved in the rps101 / IGF622 strain ( ⁇ ALT_LONG, pdc2 gene reversion to ura locus, rps101 gene reversion to leu1 locus) in which rps101 gene was reverted.
  • ALT_short region the region from the tlh1 locus to the gmh2 locus (ALT_short region) is deleted in the left arm of chromosome 1, and the deleted pdc2 gene is restored to the ura4 locus on chromosome 3. It was to be.
  • the IGF629 strain ( ⁇ BLT) which has become non-uracil-required by restoring the ura4 gene to the IGF525 strain, has a significantly improved growth rate than the IGF525 strain and is almost the same as the ARC001 strain, which is a non-uracil-requiring wild strain. It was a moderate growth rate (see FIG. 12).
  • the ura4 gene encodes orotidine 5'-phosphate decarboxylase that catalyzes the final step of the de novo synthesis pathway in the process of UMP biosynthesis, which is a material for pyrimidine bases.
  • the de novo synthesis pathway was There is a gene involved in the salvage synthesis pathway that takes up uracil or uridine from outside the cell and synthesizes UMP, and the AMP biosynthesis was not performed sufficiently and the growth rate decreased It was speculated.
  • FIG. 11 shows the UMP biosynthesis pathway. Reverted strains were prepared by inserting the two genes into the leu1 locus of chromosome 2 of the IGF525 strain ( ⁇ BLT), respectively. The obtained returning strain was cultured in a YES medium (pH 5.0), and the maximum specific growth rate was calculated by measuring OD 660 of the culture solution. The calculation results are shown in FIG.
  • the essential genes at the end of the chromosome of Pombe are trs33 gene on the left arm of chromosome 1, sec16 gene on the right arm of chromosome 1, zas1 gene on the left arm of chromosome 2, usp109 on the right arm of chromosome 2, It was found that the non-essential gene cluster region of 100 to 200 kbp up to the essential gene can be deleted. Furthermore, in order to maintain the growth rate at the same level as that of the strain before deletion, the pdc2 gene and the rps101 gene located at the distal end of the left chromosome 1 are required, and the left arm of the second chromosome is present in the strain lacking the ura4 gene. It was found that the distal SPBC1683.05c gene is required.
  • ⁇ Preparation of a multi-region non-essential gene cluster deletion strain Two or more large deletion regions at both ends of chromosome 1 and chromosome 2 were integrated, and the pdc2 gene (and SPBC1688.35c gene as necessary) was returned to the ura4 locus.
  • a Pombe genome reduced strain was prepared. Specifically, non-essential gene cluster regions at other chromosomal ends were prepared by the Latour method in the same manner as described above for the one-region non-essential gene cluster deleted strain prepared above.
  • Table 4 shows the name of each deleted strain and the deleted region. In Table 4, “ura4-D18” is a deletion strain of ura4 gene, and “ura4 + ” is a strain having ura4 gene.
  • Each deleted strain is cultured in a YES medium (pH 5.0), and the OD 660 of the culture solution is measured.
  • the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) and final turbidity (turbidity of the culture solution at the end of the culture) ( OD 660 ) was measured.
  • S. In Pombe since the growth of the strain having the ura4 gene is more stable than that of the strain lacking the ura4 gene, the ura4 + strain was used for analysis of the growth efficiency, and the non-uracil-requiring ARC001 strain was used as a control.
  • FIG. 13 shows the calculation result of the maximum specific growth rate ( ⁇ max ) of each deleted strain
  • FIG. 14 shows the measurement result of the final ultimate turbidity (OD 660 ) of each deleted strain.
  • the maximum specific growth is greater than in the deletion strain in which the deletion region of the left chromosome 1 is from the tlh1 locus to the gpi7 locus.
  • speed and final turbidity were improved.
  • the maximum specific growth rate of the IGF637 strain ( ⁇ ALT_LONG) was 0.79 compared to the parent strain and the final turbidity (OD 660 ) was 20, whereas the maximum specific growth rate of the IGF724 strain ( ⁇ ALT_short) was higher than that of the parent strain.
  • each deleted strain is cultured in a YES medium (pH 5.0) at 32 ° C., and a part of the culture solution is collected at a time point when the OD 660 of the culture solution is about 5.0 (mid-logarithmic growth phase)
  • the yeast chromosomes contained were stained with DAPI and then observed with a microscope.
  • a differential interference image (DIC) and a DAPI-stained image of each strain are shown in FIG. No abnormalities were observed in the cell morphology and chromosome distribution of any strain. However, in the IGF742 strain, the cell size tended to be slightly smaller.
  • FIG. 18 shows an oblique light image of the plate medium after the culture.
  • the ART region that is the deleted region of the IGF628 strain contains the amino acid transporters isp5 (SPAC1039.09) and put4 (SPAC869.10), which are presumed to be involved in the uptake of leucine.
  • each strain was added to an EMM plate medium, an EMM plate medium (EMM + Canavanine) supplemented with an arginine analog canavanine at 60 mg / L, and a lysine analog thiaridine at 200 mg / L.
  • EMM plate medium EMM + Thionine
  • methionine analog ethionine added at 30 mg / L were spotted and cultured at 32 ° C. for 4 days.
  • canavanine resistance was higher in the IGF742 strain than in the IGF628 strain, it was suggested that an amino acid transporter having an ability to incorporate arginine was present in addition to the ART region.
  • the IGF742 strain also has ethionine resistance, there are a plurality of amino acid transporters having the ability to incorporate methionine within the deleted region of the IGF742 strain, and the ethionine resistance of the IGF742 strain includes the amino acid transporter. It was suggested that it was a phenotype that emerged due to multiple deletions.
  • telomere length of IGF742 strain All of the chromosomes of the IGF742 strain have telomeres, but the deletion region of the IGF742 strain contains a binding site with a protein necessary for the formation of heterochromatin of telomeres. Therefore, the effect of deleting the binding site with the heterochromatin-forming protein on the stability of telomeres in the deleted strain was examined. Specifically, the IGF742 strain and the parent ARC001 strain were cultured for about 100 generations at 32 ° C. in a YES medium (pH 5.0), respectively, and then genomic DNA was extracted and purified from the resulting cells.
  • Genomic DNA obtained by completely digesting the obtained DNA with the restriction enzyme EcoRI was electrophoresed, and Southern hybridization was performed using telomeric repeat sequences as probes.
  • the result of Southern hybridization is shown in FIG.
  • the telomere length of the IGF742 strain was almost the same as that of the ARC001 strain, and it was confirmed that deletion of the ends of the first and second chromosomes hardly affected the telomere length.
  • Example 2 A foreign gene expression cassette was introduced into the deleted strain prepared in Example 1, the protein encoded by the foreign gene was expressed, and the production efficiency of the protein was examined.
  • the foreign protein green fluorescent protein (GFP), human growth hormone (hGH, extracellular secreted protein), and human transferrin (hTF, glycosylated / extracellular secreted protein) were used.
  • IGF724 strain ( ⁇ ALT_short), IGF628 strain ( ⁇ ART), IGF629 strain ( ⁇ BLT), IGF630 strain ( ⁇ BRT), IGF631 strain ( ⁇ BLT, ⁇ BRT), IGF632 strain ( ⁇ ART, ⁇ BRT), IGF633 strain ( [Delta] ART, [Delta] BLT), IGF647 strain ([Delta] ALT_LONG, [Delta] ART), IGF648 strain ([Delta] ALT_LONG, [Delta] BLT), IGF649 strain ([Delta] ALT_LONG, [Delta] BRT), IGF755 strain ([Delta] ALT_short, [Delta] ART, [Delta] ALT6T strain, [Delta] ALT6T or [Delta] ALT6T] ⁇ BLT, ⁇ BRT), IGF658 strain
  • Each foreign protein is designated as S. cerevisiae.
  • an expression cassette in which a gene encoding each foreign protein was placed between an hCMV (human cytomegalovirus) promoter and a lipocortin terminator was used.
  • FIG. 21 is a diagram showing the measurement results of the EGFP fluorescence value of each deleted strain together with the results of the ARC001 strain.
  • the fluorescence values of EGFP in the IGF724 strain, IGF628 strain, IGF629 strain, and IGF630 strain were almost the same as that of the parent strain ARC001 strain, and improvement in protein production efficiency was not observed in the one-region deleted strain.
  • the fluorescence value of EGFP became higher than that of the ARC001 strain, and an increase in EGFP expression efficiency was observed.
  • the IGF742 strain from which 4 regions were deleted showed the highest EGFP expression efficiency.
  • FIG. 22 is a diagram showing the hGH content of the culture supernatant of each strain.
  • FIG. 23 shows the hTF content of the culture supernatant of each strain.
  • both the hTF secretion expression and the one-region deletion strain showed improved hGH secretion expression efficiency, and the strain with the highest increase in secretion expression efficiency per cell turbidity was IGF728 strain ( ⁇ ALT_short, ⁇ ART, ⁇ BLT). .
  • FIG. 24 shows the protein production efficiency of each genome-reduced strain as a relative value with respect to the parent strain.
  • the 4-region deleted strain IGF742 strain
  • IGF658 strain ⁇ ALT_LONG, ⁇ ART, ⁇ BLT
  • IGF728 strain ⁇ ALT_short, ⁇ ART, ⁇ BLT
  • the Pombe genome-reduced strain can express foreign proteins more efficiently than the wild strain, it can be suitably used particularly as an expression system host using yeast.
  • the entire contents of the specification, claims, drawings, and abstract of Japanese Patent Application No. 2011-285668 filed on Dec. 27, 2011 are cited here as disclosure of the specification of the present invention. Incorporated.

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Abstract

　染色体を大規模に削除したＳ．ポンベゲノム縮小化株、蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株、該蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を用いた蛋白質の生産方法を提供する。　シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。

Description

シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株
　本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、以下、Ｓ．ポンベ）の染色体を大規模に削除したＳ．ポンベゲノム縮小化株、該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株の製造方法、蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株、該蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を用いた蛋白質の生産方法に関する。
　酵母を宿主とした発現系を利用して、蛋白質および有機酸等の有用成分を製造する技術が開発されている。中でも分裂酵母Ｓ．ポンベは、出芽酵母とは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、ＲＮＡスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため、Ｓ．ポンベは高等動物の遺伝子機能をよく相補し、特にヒトに由来する蛋白質の生産に利用することができる有用な蛋白質生産宿主株の一つである。
　また一方で近年、様々なツールを導入するための宿主細胞として、物質生産に不要な代謝エネルギーの浪費を削減したシンプルな細胞の構築が望まれている。該細胞は、たとえば、染色体中の生存に非必須遺伝子を含む領域を大規模に削除することにより、製造することができる。Ｓ．ポンベについても、非必須遺伝子が大規模に削除され、不要な代謝エネルギーの浪費が抑えられた物質生産宿主株が求められているが、未だ得られていない。
　Ｓ．ポンベの染色体は、長さが５．７Ｍｂｐ、４．６Ｍｂｐ、３．５Ｍｂｐの３本の線状ＤＮＡで構成されており、全ゲノム配列はデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）に公開されている。近年、Ｋｉｍらによって、Ｓ．ポンベの一遺伝子破壊ライブラリーの構築によって得られた必須遺伝子（生育維持に必須な遺伝子）の情報が開示された（たとえば、非特許文献１参照。）。Ｓ．ポンベには約４９００個の遺伝子があり、約２１．６％が生存のための必須遺伝子である。該情報によれば、Ｓ．ポンベでは必須遺伝子が染色体上に満遍なく散在しており、大規模な非必須遺伝子クラスター領域はほとんどない。ただ、第１染色体と第２染色体の末端領域には、比較的大きな非必須遺伝子クラスター領域が存在しており、第１染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はｐｄｃ２（ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）であり、第１染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はｓｅｃ１６（ＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０７）であり、第２染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はＳＰＢＣ１３４８．０６ｃであり、第２染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はｕｓｐ１０９（ＳＰＢＣ１２８９．１２）であるとされていた。
Ｋｉｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（２０１０）ｖｏｌ．２８，ｐ６１７～６２３．
　そこで本発明では、Ｓ．ポンベの染色体を大規模に削除した株、および該株を用いて蛋白質を生産する方法の提供を目的とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｓ．ポンベの第１染色体右腕の最も端にある必須遺伝子および第２染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はＫｉｍらの報告と一致するが、第１染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はｔｒｓ３３（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０５ｃ）であり、第２染色体左腕の最も端にある必須遺伝子がｚａｓ１（ＳＰＢＣ１１９８．０４ｃ）であることを見出し、さらに、最末端の遺伝子からこれらの遺伝子までの非必須遺伝子クラスター領域を全て削除したとしても合成致死が生じないことを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株、およびその製造方法等は下記［１］～［１４］である。
［１］　Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［２］　前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域である前記［１］のＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［３］　前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域である前記［１］のＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［４］　前記領域（ｂ）が第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域である前記［１］～［３］のいずれかのＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［５］　前記領域（ｃ）が第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域である前記［１］～［４］のいずれかのＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株。
［６］　前記領域（ｄ）が第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域である前記［１］～［５］のいずれかのＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［７］　前記領域（ａ）および前記領域（ｃ）からなる群より選択される１以上の領域が少なくとも削除されている前記［１］～［６］のいずれかのＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［８］　前記領域（ｂ）と、前記領域（ａ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域とが削除されている前記［１］～［６］のいずれかのＳ．ポンベゲノム縮小化株。
［９］　前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）、および前記領域（ｄ）が削除されている前記［１］～［６］のいずれかのＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株。
［１０］　少なくとも前記領域（ａ）が削除されており、かつ該削除された領域（ａ）にはｐｄｃ２遺伝子座が含まれ、ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）以外の領域に挿入されている前記［１］～［９］のいずれかのＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株。
［１１］　第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ｐｄｃ２遺伝子が挿入されている前記［１０］のＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株。
［１２］　前記［１］～［１１］のいずれかのＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株に、構造遺伝子を発現させるための発現カセットが導入されていることを特徴とする蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［１３］　前記［１２］の蛋白質発現用Ｓ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株を培養して得られる菌体または培養液上清から、前記構造遺伝子から発現させた蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
［１４］　Ｓ．ポンベ・ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域を削除し、全削除領域の長さを、野生株のゲノムの０．９％以上にすることを特徴とするＳ．ポンベ・ポンベゲノム縮小化株の製造方法。
　本発明により、非必須遺伝子が大規模に削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株を提供することができる。
　また、該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質の生産効率が高く、外来蛋白質発現系の宿主として好適である。よって、該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を宿主として用いる本発明の蛋白質の生産方法により、外来蛋白質をより効率よく生産することができる。
図１は、Ｓ．ポンベの３本の染色体の模式図である。 図２は、非特許文献１に開示された情報に基づき、Ｓ．ポンベの必須遺伝子と非必須遺伝子の推測された分布を模式的に示した図である。 図３は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の好ましい一態様の染色体の模式図である。 図４は、本発明者らによって推測されたＳ．ポンベの第１染色体および第２染色体の末端領域を模式的に示した図である。 図５は、実施例１における染色体大規模削除の様子を模式的に示した図である。 図６は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図７は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図８は、実施例１において、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座の近傍の領域を削除した削除株ＡＬＴ－１～ＡＬＴ－６の染色体の模式図である。 図９は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図１０は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各遺伝子の復帰株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図１１は、実施例１において、Ｓ．ポンベのＵＭＰ生合成経路を示した図である。 図１２は、実施例１において、ＡＲＣ０１０株に対する、各遺伝子の復帰株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図１３は、実施例１において、ＡＲＣ００１株に対する、各削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図１４は、実施例１において、各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）を示した図である。 図１５は、実施例１において、ＡＲＣ００１株に対する、各削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）を示した図である。 図１６は、実施例１において、各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）を示した図である。 図１７は、実施例１において、各株の微分干渉像（ＤＩＣ）およびＤＡＰＩ染色像である。 図１８は、実施例１において、ロイシン要求性の削除株を培養した後の平板培地の落斜光画像である。 図１９は、実施例１において、ロイシン非要求性の削除株を各種平板培地で培養した後の平板培地の落斜光画像である。 図２０は、実施例１において、約１００世代培養後のＩＧＦ７４２株およびＡＲＣ００１株のゲノムＤＮＡに対してテロメア反復配列をプローブに用いて行ったサザンプロット解析の結果を示した図である。 図２１は、実施例２において、各削除株のＥＧＦＰの蛍光値の測定結果を、ＡＲＣ００１株の結果とともに示した図である。 図２２は、実施例２において、各株の培養液上清のｈＧＨ含有量を示した図である。 図２３は、実施例２において、各株の培養液上清のｈＴＦ含有量を示した図である。 図２４は、実施例２において、各ゲノム縮小化株の蛋白質生産効率を、親株に対する相対値として示した図である。
［Ｓ．ポンベゲノム縮小化株］
　図１に、Ｓ．ポンベの３本の染色体の模式図を示す。図１中、各染色体の両端の塗潰し領域はテロメアを、中央付近の塗潰し領域はセントロメアを、それぞれ示す。また、図１中、「ＡＬＴ」は第１染色体左腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、「ＡＲＴ」は第１染色体右腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、「ＢＬＴ」は第２染色体左腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、および「ＢＲＴ」は第２染色体右腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域を、それぞれ示す。また、第２染色体中のｌｅｕ１遺伝子座、第３染色体中のｕｒａ４遺伝子座もそれぞれ示した。
　本発明者らは、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を製造するにあたり、出芽酵母の一遺伝子破壊ライブラリーによる必須遺伝子情報と、Ｓ．ポンベと出芽酵母の相同遺伝子情報とを参考に、Ｓ．ポンベの染色体上の必須遺伝子の分布を推測した。この結果、第１染色体および第２染色体の最末端の必須遺伝子は、第１染色体左腕がｔｒｓ３３であり、第１染色体右腕ｓｅｃ１６であり、第２染色体左腕がｚａｓ１であり、第２染色体右腕がｕｓｐ１０９であると推察した。そこで、後記実施例に示すように、第１染色体左腕のｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側（テロメア側）、第１染色体右腕のｓｅｃ１６遺伝子座よりも遠位側、第２染色体左腕のｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側、および第２染色体右腕のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも遠位側をＬａｔｏｕｒ法により削除したところ、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を製造することができた。
　図２に、非特許文献１に開示された情報に基づき、Ｓ．ポンベの必須遺伝子と非必須遺伝子の推測された分布を模式的に示した。各染色体の上段が必須遺伝子であり、中段が非必須遺伝子である。図中、四角で囲った遺伝子が、本発明者らが各染色体の最末端の必須遺伝子と推定した遺伝子であり、各染色体の下段の塗潰し領域が本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の製造方法において削除可能な領域である。第１染色体左腕の塗潰し領域中のｐｄｃ２（ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）遺伝子、並びに第２染色体左腕の塗潰し領域中のＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子、ａｌｒ２（ＳＰＢＣ３５９．０２）遺伝子およびｄｅａ２（ＳＰＢＣ１１９８．０２）遺伝子は、非特許文献１では必須遺伝子とアノテーションされていたが、本発明者らにより非必須遺伝子であることが確認された。つまり、第１染色体左腕の最末端の必須遺伝子がｔｒｓ３３遺伝子であり、第２染色体左腕の最末端の必須遺伝子がｚａｓ１遺伝子であることは、本発明者らにより初めて得られた知見である。なお、実際には非必須遺伝子であるにもかかわらず、非特許文献１における一遺伝子破壊ライブラリーにおいて必須遺伝子と判定された理由として、該遺伝子の削除により増殖能が著しく低下したため削除株を得ることが困難であったこと、および染色体の部位により相同組換え効率が低いため削除株を得ることが困難であったこと等が推測される。
　すなわち、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、Ｓ．ポンベの第１染色体および第２染色体の両端の非必須遺伝子クラスター領域の少なくとも一部分が削除されており、全削除領域の長さが、野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とする。全削除領域の長さは、野生株のゲノムの１％以上であることが好ましく、２％以上であることがより好ましく、３％以上であることがさらに好ましく、３．５％以上であることがよりさらに好ましく、４％以上であることが特に好ましい。
　具体的には、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されている株である。該領域は非必須遺伝子クラスター領域であり、該領域の一部分または全部を削除した場合でも、野生株と同様の形態を有し、安定して増殖可能なＳ．ポンベゲノム縮小化株を得ることができる。また、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、非必須遺伝子クラスター領域が削除されていることにより、外来蛋白質発現系の宿主として好適である。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第１染色体の左腕側では、ｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第１染色体の左腕側の削除領域（領域（ａ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上となればよく、特に限定されない。本発明においては、領域（ａ）は、ｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側であり、かつｐｄｃ２遺伝子座またはｐｄｃ２遺伝子座よりも近位側にある領域を含む領域が好ましく、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域、またはｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域がより好ましい。ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域を削除することにより、１６８．６ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．３％）を削除することができる。一方で、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域を削除した削除株では、野生株よりも増殖能が低下する傾向があるが、削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域（染色体全体の１．２％）にすることで、得られた削除株の増殖能の低下を抑制できるため好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第１染色体の右腕側では、ｓｅｃ１６遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第１染色体の右腕側の削除領域（領域（ｂ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上となればよく、特に限定されない。本発明においては、１５５．４ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．１％）を削除することができるため、領域（ｂ）は、ＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域が好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第２染色体の左腕側では、ｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第２染色体の左腕側の削除領域（領域（ｃ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であればよく、特に限定されない。本発明においては、領域（ｃ）は、ｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側であり、かつＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子座またはＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子座よりも近位側にある領域を含む領域が好ましい。特に、２１１．７ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．５％）を削除することができるため、領域（ｃ）は、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域が好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第２染色体の右腕側では、ｕｓｐ１０９遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第２染色体の右腕側の削除領域の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であればよく、特に限定されない。本発明においては、１２１．６ｋｂｐもの領域（染色体全体の０．９％）を削除することができるため、領域（ｄ）は、ＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域が好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、領域（ａ）～領域（ｄ）の４領域のうちの１領域が削除されている株であってもよく、該４領域中の２以上の領域が削除されている株であってもよい。本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、該４領域のうち、領域（ａ）または領域（ｃ）の少なくとも１領域が削除されている株が好ましく、少なくとも領域（ａ）または領域（ｃ）を含む２以上の領域が削除されている株がより好ましい。また、該４領域のうち、領域（ｂ）を含む２以上の領域が削除されている株も好ましく、領域（ｂ）を含む３以上の領域が削除されている株もより好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、該４領域全てが削除されているＳ．ポンベゲノム縮小化株が特に好ましい。中でも、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されていることが好ましい。該領域を削除することによって、６６５．６ｋｂｐが削除される。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されていることが特に好ましい。該領域を削除することによって、６５７．３ｋｂｐ（野生株のゲノムの４．７％）が削除される。該株は、第１染色体左腕のｒｐｓ１０１（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０２ｃ）遺伝子が残存しているため、該遺伝子が削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株よりも増殖能が高い。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株が、少なくとも領域（ａ）が削除されており、かつ該領域（ａ）がｐｄｃ２遺伝子座を含む場合には、ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の該領域（ａ）、該領域（ｂ）、該領域（ｃ）、および該領域（ｄ）以外の領域に挿入されていることが好ましく、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座からｓｅｃ１６遺伝子座までの領域、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座からｕｓｐ１０９遺伝子座までの領域、または第３染色体中の必須遺伝子以外の領域に挿入されていることがより好ましい。ｐｄｃ２遺伝子を染色体中に残すことにより、該遺伝子が削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株よりも、増殖能を高めることができる。ｐｄｃ２遺伝子は、たとえば、第３染色体のｕｒａ４遺伝子座、特にｕｒａ４遺伝子とＳＰＣＣ３３０．０６ｃ遺伝子の間に挿入することができる。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株が、少なくとも領域（ｃ）が削除されており、かつ該領域（ｃ）がＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子座を含む場合であって、さらにｕｒａ４遺伝子を欠失している場合には、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子が、染色体中の該領域（ａ）、該領域（ｂ）、該領域（ｃ）、および該領域（ｄ）以外の領域に挿入されていることが好ましく、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座からｓｅｃ１６遺伝子座までの領域、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座からｕｓｐ１０９遺伝子座までの領域、または第３染色体中の必須遺伝子以外の領域に挿入されていることがより好ましい。ｕｒａ４遺伝子とＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子の両方が欠失している場合には、酵母の増殖速度が低下する傾向にあるが、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子を染色体中の他の領域に残すことにより、ｕｒａ４遺伝子が欠失していた場合でも増殖速度が回復される。ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子は、たとえば、第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入することができる。
　図３に、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株のなかでも、特に好ましい一態様の染色体の模式図を示す。すなわち、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されており、ｐｄｃ２遺伝子が、第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に挿入されている。また、必要に応じて、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子が、第２染色体のｌｅｕ１（ＳＰＢＣ１Ａ４．０２ｃ）の不活化変異体であるｌｅｕ１－３２遺伝子座に挿入される。該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、染色体が大規模に削除されている上に、野生株と同等の増殖速度が維持されている。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、たとえば、Ｓ．ポンベ野生株の染色体中の第１染色体および第２染色体の両端の領域を削除することにより製造できる。染色体領域を削除する方法は特に限定されず、テロメアトランケ―ション法等の公知の手法のいずれを用いて行ってもよいが、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）で行うことが好ましい。Ｌａｔｏｕｒ法は、削除する領域の一方の端の遺伝子配列をもう一方の端に挿入し、相同組換えにより内部の領域をループアウトさせる方法であり、外来の塩基配列を残存させずに染色体領域を削除できる。
　また、ｐｄｃ２遺伝子またはＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子の染色体への挿入は、公知の手法のいずれを用いて行ってもよい。たとえば、染色体中の適当な標的部位に相同組換えにより外来遺伝子挿入する際に用いられる形質転換法を用い、各遺伝子を染色体中の所望の部位に挿入できる。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、Ｓ．ポンベ野生株と同様に、蛋白質等の各種有用物質の生産、遺伝子等の生体分子の機能解析等に使用できる。また、残存している染色体中の必須遺伝子がコードされている領域以外の領域に、野生株に対して１以上の塩基が置換、欠損、または付加されていてもよい。
［蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株］
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、物質生産能力が野生株よりも増大している。よって本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質を発現させるために外来構造遺伝子を導入する宿主として好適である。具体的には、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株に、構造遺伝子を発現させるための発現カセットが導入されていることを特徴とする。該発現カセットは、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中に挿入されていてもよく、染色体外遺伝子として存在していてもよい。
　発現カセットとは、蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、蛋白質をコードする構造遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。さらに、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、構造遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。発現カセットには複数の構造遺伝子が存在していてもよい。
　Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーター等）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）等が挙げられる。Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーター等が挙げられる。該プロモーターのうち、発現効率が良好なｎｍｔ１遺伝子プロモーターおよびその改変プロモーター（たとえば、ｎｍｔ１＋、ｎｍｔ４１）、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株に導入される外来構造遺伝子は、蛋白質をコードする構造遺伝子であれば特に限定されず、Ｓ．ポンベが元々有している遺伝子と同種のものであってもよく、異種生物由来の構造遺伝子であってもよい。Ｓ．ポンベの内在性蛋白質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターにより得られた形質転換体から、より大量に該内在性蛋白質を生産することができる。また、異種生物由来の構造遺伝子を含む発現ベクターにより得られた形質転換体から、大量の異種蛋白質（宿主であるＳ．ポンベが本来有していない蛋白質）を生産することができる。該外来構造遺伝子がコードする蛋白質は、異種蛋白質が好ましく、多細胞生物である動物や植物が産生する蛋白質がより好ましく、哺乳動物（ヒトを含む）の産生する蛋白質がさらに好ましい。
　該外来構造遺伝子は、蛋白質をコードするものである限り、野生型の構造遺伝子であってもよく、野生型の構造遺伝子を改変した遺伝子であってもよく、人工的に合成された遺伝子であってもよい。野生型以外の構造遺伝子としては、たとえば、野生型の複数の蛋白質を融合させたキメラ蛋白質をコードする遺伝子、野生型の蛋白質のＮ末端またはＣ末端にその他のペプチド等が結合した蛋白質をコードする遺伝子等が挙げられる。該その他のペプチドとしては、分泌シグナル、特定の細胞内小器官への移行シグナル等のシグナル、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ等が挙げられる。各種シグナルは、Ｓ．ポンベ属酵母内で機能するシグナルであることが必要である。分泌シグナルは、Ｎ末端に存在することにより、発現した蛋白質を宿主細胞外に分泌させる機能を有するペプチドである。Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナルとしては、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のＰ３シグナルが特に好ましい。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中へ前記発現カセットを導入する方法としては公知の方法を使用できる。たとえば、発現カセットと組換え部位とを有するベクターをＳ．ポンベゲノム縮小化株に導入する方法が挙げられる。
　ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
　該発現カセットを相同組換え法によりＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中に組み込む場合には、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
　複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００－２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
　また、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０－２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
　ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせられる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
　前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
　組換え部位の長さ（塩基数）は、２０～２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　ベクターを組み込む標的部位は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株の染色体に組み込まれるベクターを２箇所以上にできる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株においては、たとえば、第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入することができる。
　ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）等が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
　ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
　この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
　ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
　上記ベクターを用いて、宿主である本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株を形質転換することで、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株が得られる。形質転換方法は、公知のＳ．ポンベ属酵母の形質転換方法をいずれも用いることができる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法［K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)］、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５－１９８６１２号公報記載の方法などを挙げることができる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
　形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。その他、それら選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べることができる。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株および本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、天然のＳ．ポンベ属酵母と同様に培養することができる。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株等の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、Ｓ．ポンベ属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベ属酵母の培養を効率良く行えればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　炭素源としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
　窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
　無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
　具体的には、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor LabolatoryPress(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Okazaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）等を使用できる。
　培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
　また、培養温度は、２３～３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
［蛋白質の生産方法］
　本発明の蛋白質の生産方法は、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を培養し、得られた菌体または培養液上清から、該蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株中に導入された外来構造遺伝子がコードする蛋白質を取得することを特徴とする。
　培養条件は、生産させる目的の外来蛋白質の種類等を考慮して適宜設定することができる。たとえば、１６～４２℃、好ましくは２５～３７℃で、８～１６８時間、好ましくは４８～９６時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
　培養終了後、超音波破砕や機械的破砕により、菌体から目的の外来蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該細胞抽出液から外来蛋白質を単離・精製法できる。また、外来蛋白質が細胞外に分泌される場合は、培養液上清から外来蛋白質を単離・精製法できる。これらの生産された蛋白質を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
　単離・精製した蛋白質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定法等が挙げられる。精製された蛋白質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。
　以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］Ｓ．ポンベゲノム縮小化株の作製
＜一領域非必須遺伝子クラスター削除株の作製＞
　発明者らはまず、Ｌａｔｏｕｒ法により、Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０、遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）の染色体中、第１染色体または第２染色体の左腕端側または右腕端側が削除された一領域削除株を作製した。具体的には、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域（１７６．８ｋｂｐ、ＡＬＴ＿ｌｏｎｇ領域）を削除した第１染色体左腕株（ΔＡＬＴ＿ｌｏｎｇ）、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域（１５５．４ｋｂｐ、ＡＲＴ領域）を削除した第１染色体右腕株（ΔＡＲＴ）、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域（２１１．７ｋｂｐ、ＢＬＴ領域）を削除した第２染色体左腕株（ΔＢＬＴ）、および第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域（１２１．６ｋｂｐ、ＢＲＴ領域）を削除した第２染色体右腕株（ΔＢＲＴ）を作製した。
　第２染色体右腕を除く３箇所の染色体末端のテロメアまでの領域は、ゲノムプロジェクトによる配列決定が完了していない領域であった。そこで、本発明者らは、各染色体末端の未解読領域近傍の塩基配列の相同性が非常に高いため、未解読領域の相同性も高く、図４に示すようになっていると推測した。図４中、塗潰した箱は遺伝子座を表しており、上向きに示した遺伝子は５’→３’の向きであり、下向きに示した遺伝子は３’→５’の向きである。各染色体中、ハッチングされたゾーンで繋がれた領域は、塩基配列レベルの相同性が９８％以上の領域を示している。さらに、ハッチングされた箱は、テロメアまで塩基配列が決定されている第２染色体右腕より推測された遺伝子を示す。
　第２染色体右腕の塩基配列に基づいて、相同組換え用のＤＮＡ断片を作製し、該ＤＮＡ断片を用いてＬａｔｏｕｒ法により、一領域削除株を作製した。ただし、第１染色体左腕では、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの全領域を削除することが非常に困難であったため、ｔｌｈ１遺伝子座からＳＰＡＣ９７７．０９ｃ遺伝子座までの領域（４６．８ｋｂｐ）を削除した第１染色体左腕株（Δｔｌｈ１－ＳＰＡＣ９７７．０９ｃ）およびＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域（１２１．８ｋｂｐ）を削除した第１染色体左腕株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１－ｇｐｉ７）を作製した。
　一領域削除株を作製する際に用いたＬａｔｏｕｒ断片（染色体大規模削除に用いる削除用断片）は、次のようにして作製した。Ｌａｔｏｕｒ断片は、２つの染色体上へ挿入するために必要な約５００ｂｐから成る相同領域（左側をＵＰ領域、右側をＤＮ領域）、ターゲットとなる削除領域において削除断片を挿入する部位とは反対側に隣接する約２００ｂｐから成るＤＮＡ領域（ＯＬ領域）、およびマーカー遺伝子となるｕｒａ４遺伝子領域（ｕｒａ４領域）の合計４つのＤＮＡ断片から構成された。ただし、染色体左腕末端削除と染色体右腕末端削除では、Ｌａｔｏｕｒ断片の構成において、ＯＬ領域とｕｒａ４領域の順番は逆にした。
　各領域のＤＮＡ断片は、Ｓ．ポンベの野生株であるＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ－、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）よりＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法（９８℃で１０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１ｋｂ／分間を３０サイクル）によりクローニングした。各ＤＮＡ断片の増幅に用いたプライマーを表１～３に示す。続いて、それぞれの増幅断片を含むＰＣＲ反応溶液からＭｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ－１００カラム（ミリポア社製）を用いてプライマーを除去し、ＰＣＲ法により２つのＤＮＡ断片の連結反応を行った。連結には、約２０ｂｐの相同領域を持つ２対のＤＮＡ断片と、連結後の断片を増幅する２対のプライマーを反応液に混合し、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてステップダウンＰＣＲ反応（９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で３分間を２サイクル、次いで、順次アニール温度を２℃ずつ下げて２サイクルずつ反応させ、最後のサイクルではアニール温度５５℃で５サイクル反応させた。）を行った。増幅効率が悪い場合は、ＰＣＲ反応液に、終濃度で５％となるようにＤＭＳＯを、終濃度で１Ｍとなるようにベタインを、それぞれ混合させた。連結の組合せは、まずＵＰ領域とＯＬ領域（もしくはｕｒａ４領域）、ｕｒａ４領域（もしくはＯＬ領域）とＤＮ領域を連結させ、最後にＵＰ領域を含む断片とＤＮ領域を含む断片を結合させたものを、Ｌａｔｏｕｒ断片とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　構築したＬａｔｏｕｒ断片を用いてＳ．ポンベＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ－　ｌｅｕ１－３２　ｕｒａ４－Ｄ１８）を形質転換した。形質転換は、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Bahler, J, et.al., Yeast, vol.14, p943-951 (1998)）に基づき行った。Ｌａｔｏｕｒ断片が染色体上に組込まれた形質転換体（Ｌａｔｏｕｒ断片潜在株）は、ロイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む最少培地で選択した。Ｌａｔｏｕｒ断片がターゲット部位に挿入された形質転換体であることを、挿入したＬａｔｏｕｒ断片の外側の染色体ＤＮＡ配列を持つプライマー（表１～３中、ｃｈｅｃｋ－１、ｃｈｅｃｋ－２）を用いたＰＣＲ法により、Ｌａｔｏｕｒ断片を含むターゲット領域を増幅して確認した。続いてＬａｔｏｕｒ断片潜在株を栄養培地で定常期まで増殖させ、培養液１００μｌをウラシル（１００ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）、５－フルオロオロト酸（ＦＯＡ、５００ｍｇ／Ｌ）を含む最少培地（ＦＯＡ培地）に塗り拡げた。ＦＯＡ培地で選択されたＦＯＡ処理株は、染色体上のＯＬ領域と削除断片のＯＬ領域の相同組換えにより、その間の染色体領域がｕｒａ４領域と共に欠失した株（ゲノム縮小化株）か、もしくはｕｒａ４遺伝子中に変異が生じた株である。ＦＯＡ処理株の染色体が削除されているか確認するため、削除領域を挟んだプライマー対（表１～３中、ｃｈｅｃｋ－３とｃｈｅｃｋ－２、もしくはｃｈｅｃｋ－２とｃｈｅｃｋ－３）を用いてＰＣＲ反応を行った。削除領域は１２０ｋｂ以上であるため、削除が生じていなければＰＣＲ法による増幅断片は得られない。反対に想定通りに削除されていれば、約１ｋｂ前後の増幅断片が得られる。ＦＯＡ処理株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法により、染色体大規模削除後に生じる約１ｋｂの増幅断片を確認し、これを各領域の染色体大規模削除株とした。複数の領域の削除株を構築する際は、次に削除する領域のＬａｔｏｕｒ断片を用いて形質転換しＦＯＡ処理をする操作を繰り返した。
　図５に、染色体大規模削除の様子を模式的に示した。図は染色体を示しており、四角は遺伝子を表している。上側の四角で示した遺伝子の向きは５’→３’、下側の四角で示した遺伝子の向きは３’←５’である。ＵＰ領域、ＯＬ領域、ｕｒａ４領域、ＤＮ領域から成る断片はＬａｔｏｕｒ断片であり、Ｌａｔｏｕｒ断片から染色体へ伸びる破線は、染色体上へＬａｔｏｕｒ断片を挿入した位置を示している。染色体模式図の下に示した矢印は、染色体上に挿入されたＬａｔｏｕｒ断片を確認するプライマー、または染色体が削除されたことを確認するプライマーを示しており、各プライマーの名称は表１～３中の名称と共通する。図５（Ａ）は染色体左腕末端を削除する際の模式図であり、図５（Ｂ）は染色体右腕末端を削除する際の模式図である。染色体左腕末端と右腕末端では削除する方向が違うため、ＯＬ領域とｕｒａ４領域が逆になる。
　得られた一領域削除株の最大増殖速度を測定した。具体的には、各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液の６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）から最大増殖速度（μｍａｘ）を算出し、親株であるＡＲＣ０１０株の最大増殖速度に対する相対比（以下、最大比増殖速度）を求めた。算出された結果を図６に示す。この結果、ＩＧＦ５２２株（Δｔｌｈ１－ＳＰＡＣ９７７．０９ｃ）、ＩＧＦ５２４株（ΔＡＲＴ）、およびＩＧＦ５２６株（ΔＢＲＴ）では、親株ＡＲＣ０１０株とほぼ同等の増殖速度を維持していた。一方、ＩＧＦ５２３株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１－ｇｐｉ７）は親株比０．４程度であり顕著に低下していた。また、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）は、親株の８割程度の増殖速度を維持していた。よって該２株の削除領域中に、増殖速度に影響する遺伝子が存在していることが示唆された。
　増殖速度が親株と同程度まで回復した削除株を作製するため、まず、ＩＧＦ５２３株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１－ｇｐｉ７）の削除領域中に存在する増殖速度に影響する遺伝子の探索を試みた。
　第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子からｇｐｉ７遺伝子までの領域内にあるｐｄｃ２遺伝子を挿入した上で、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｔｉｍ８遺伝子座までの全領域を削除したＩＧＦ７１９株（Δｔｌｈ１－ｔｉｍ８、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）および第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの全領域を削除したＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）を作製した。ＩＧＦ７１９株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図７に示す。この結果、ＩＧＦ７１９株の増殖速度は、親株比０．８３倍まで改善された。
　さらに第１染色体左腕削除株の増殖速度を改善するため、ｐｄｃ２遺伝子以外の増殖速度維持に必要な遺伝子を探索した。第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座の近傍の領域中、様々な長さの領域を削除した削除株を構築し、各削除株の最大比増殖速度を算出した。各削除株の削除領域を図８に、各削除株の最大比増殖速度を図９に示す。図８中、両端の黒丸を結ぶ黒線は、各削除株の削除領域を示す。この結果、削除株ＡＬＴ－１および削除株ＡＬＴ－２では親株とほぼ同等の増殖速度を維持していたが、その他の削除株では増殖速度の低下が確認された。よって、ｇｍｈ１（ＳＰＡＣ５Ｈ１０．１１）遺伝子、ＳＰＡＣ５Ｈ１０．１２ｃ遺伝子、およびｇｍｈ２遺伝子は増殖速度に影響せず、ｒａｄ８（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０１ｃ）遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、ｇｐｉ７遺伝子、またはｔｉｍ８遺伝子のいずれかが増殖速度の維持に必要なことが示唆された。
　続いて、ｒａｄ８遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、またはｇｐｉ７遺伝子を復帰させることで、増殖速度が改善されるかどうかを調べた。まず、ＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）の第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に、ｒａｄ８遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、またはｇｐｉ７遺伝子を挿入し、各遺伝子の復帰株を作製した。得られた復帰株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図１０に示す。この結果、ｒｐｓ１０１遺伝子を復帰させたｒｐｓ１０１／ＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰、ｌｅｕ１遺伝子座へｒｐｓ１０１遺伝子復帰）で増殖速度の改善がみられた。
　これらの結果から、増殖速度を野生株と同程度に維持したＳ．ポンベゲノム縮小化株を得るためには、ｐｄｃ２遺伝子およびｒｐｓ１０１遺伝子を染色体中に残存させたほうがよいことがわかった。実際に、ＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域を削除し、かつｕｒａ４遺伝子座にｐｄｃ２遺伝子を挿入した削除株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１－ｇｍｈ２、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）の最大比増殖速度は、親株と同程度にまで回復した（図７参照。）。そこで、本実施例においては、増殖速度を親株と同程度に維持したＳ．ポンベゲノム縮小化株を得るために、第１染色体左腕ではｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域（ＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ領域）を削除し、かつ、削除されたｐｄｃ２遺伝子を第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に復帰させることにした。
　続いて、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中に存在する増殖速度に影響する遺伝子の探索を行った。ＩＧＦ５２５株にｕｒａ４遺伝子を復帰させてウラシル非要求性になったＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）は、ＩＧＦ５２５株よりも大幅に増殖速度が改善され、てウラシル非要求性の野生株であるＡＲＣ００１株とほぼ同程度の増殖速度であった（図１２参照。）。ｕｒａ４遺伝子はピリミジン塩基の材料となるＵＭＰ生合成過程において、ｄｅ　ｎｏｖｏ合成経路の最終段階を触媒するオロチジン５’－リン酸脱炭酸酵素をコードしている。第２染色体左腕削除株ではｕｒａ４遺伝子を復帰させてｄｅ　ｎｏｖｏ合成経路を正常化することで増殖速度が回復したと考えられたため、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中には、ｄｅ　ｎｏｖｏ合成経路を補完する経路、すなわち細胞外からウラシルまたはウリジンを取り込み、ＵＭＰを合成するｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与する遺伝子があり、該遺伝子を削除したことでＵＭＰの生合成が充分に行われず、増殖速度が低下したと推測された。
　ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中の遺伝子を調べたところ、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子およびＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子がｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与していることが推測された。図１１に、ＵＭＰ生合成経路を示す。該２遺伝子をそれぞれＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入した復帰株を作製した。得られた復帰株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図１２に示す。この結果、ＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子を復帰させたＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ／ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ、ｌｅｕ１遺伝子座へＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子復帰）ではＩＧＦ５２５株と同程度の増殖測定であったが、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子遺伝子を復帰させたＳＰＢＣ１６８３．０５／ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ、ｌｅｕ１遺伝子座へＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子復帰）では親株であるＡＲＣ０１０株とほぼ同等の増殖速度にまで回復した。
　これらの結果から、Ｓ．ポンベの染色体の最末端の必須遺伝子は、第１染色体左腕でｔｒｓ３３遺伝子、第１染色体右腕でｓｅｃ１６遺伝子、第２染色体左腕でｚａｓ１遺伝子、第２染色体右腕でｕｓｐ１０９であること、最末端遺伝子から該必須遺伝子までの１００～２００ｋｂｐの非必須遺伝子クラスター領域を削除できることがわかった。さらに、増殖速度が削除前の株と同程度に維持されるためには、第１染色体左腕遠位にあるｐｄｃ２遺伝子およびｒｐｓ１０１遺伝子が必要であること、ｕｒａ４遺伝子が欠失株では第２染色体左腕遠位にあるＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子が必要なことがわかった。
＜複数領域の非必須遺伝子クラスター削除株の作製＞
　第１染色体および第２染色体の両末端の大規模削除領域の２以上の領域を統合し、さらにｕｒａ４遺伝子座にｐｄｃ２遺伝子（必要によってはＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子も）を復帰させたＳ．ポンベゲノム縮小化株を作製した。
　具体的には、前記で作製した一領域非必須遺伝子クラスター削除株に対して、前記と同様にＬａｔｏｕｒ法により他の染色体末端の非必須遺伝子クラスター領域を作製した。作製された各削除株の株名および削除された領域を表４に示す。表４中、「ｕｒａ４－Ｄ１８」はｕｒａ４遺伝子の欠失株であり、「ｕｒａ４＋」はｕｒａ４遺伝子を有する株である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して、最大比増殖速度（μｍａｘ）および最終到達濁度（培養終了時の培養液の濁度）（ＯＤ６６０）を測定した。なお、Ｓ．ポンベでは、ｕｒａ４遺伝子の欠失株よりもｕｒａ４遺伝子を有する株のほうがより増殖が安定するため、増殖効率の解析にはｕｒａ４＋株を用い、対照としてウラシル非要求性のＡＲＣ００１株を用いた。図１３に各削除株の最大比増殖速度（μｍａｘ）の算出結果を、図１４に各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）の測定結果を示す。この結果、染色体削除領域の統合を進めるにつれて、最大比増殖速度および最終到達濁度のいずれも低下する傾向が観察された。中でも、第１染色体左腕を削除した場合に、該傾向が強かった。４領域を全て削除したＩＧＦ６９３株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、およびΔＢＲＴ）では、最大比増殖速度が親株比０．７８であり、最終到達濁度（ＯＤ６６０）は親株が２３であったのに対してＩＧＦ６９３株は１９まで低下していた。
　また、第１染色体左腕の削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までとした削除株では、第１染色体左腕の削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までとした削除株よりも、最大比増殖速度および最終到達濁度がいずれも改善された。たとえば、ＩＧＦ６３７株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ）の最大比増殖速度が親株比０．７９、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２０であったのに対して、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）は最大比増殖速度が親株比０．９６、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２７であり、いずれも改善された（図１５および１６参照。）。また、４領域削除株でも、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、およびΔＢＲＴ）の最大比増殖速度が親株比０．８２、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２２であり、いずれもＩＧＦ６９３株よりも改善されていた（図１５および１６参照。）。
＜各削除株の形態および細胞分裂の観察＞
　次いで、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、および親株であるＡＲＣ００１株の顕微鏡観察を行い、細胞分裂および染色体分配が正常に行われているか否かを調べた。まず、各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）、３２℃で培養し、培養液のＯＤ６６０が約５．０の時点（対数増殖期中期）に該培養液の一部を分取し、含まれている酵母の染色体をＤＡＰＩで染色した後、顕微鏡で観察した。各株の微分干渉像（ＤＩＣ）およびＤＡＰＩ染色像を図１７に示す。どの株も細胞形態および染色体分配の様子に異常は観察されなかった。ただし、ＩＧＦ７４２株では、細胞の大きさが若干小さい傾向があった。
＜各削除株のアミノ酸取り込み能＞
　Ｓ．ポンベでは、培地中の窒素源が少ないことによる栄養飢餓ストレスで細胞が小さくなるという報告がある。そこで、前記で得られたロイシン要求性を備える削除株のロイシン取り込み能を調べた。具体的には、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、およびＡＲＣ００１株を、ロイシンを２５０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｌｅｕ）またはＹＥＳ平板培地にスポットし、３２℃で４日間培養した。
　培養後の平板培地の落斜光画像を図１８に示す。この結果、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、およびＩＧＦ７４２株で増殖の遅延が観察された。ＩＧＦ６２８株の削除領域であるＡＲＴ領域には、アミノ酸トランスポーターであるｉｓｐ５（ＳＰＡＣ１０３９．０９）とｐｕｔ４（ＳＰＡＣ８６９．１０）が含まれており、該蛋白質はロイシンの取り込みに関与していると推測される。ＡＲＴ領域を削除した削除株では、ＥＭＭ＋Ｌｅｕ平板培地中のロイシンの取り込み効率が低下し増殖が遅延したと推察された。また、ＩＧＦ７２４株の削除領域であるＡＬＴ領域には、ロイシン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターであると報告されている遺伝子はなく、ｉｓｐ５またはｐｕｔ４の相同遺伝子も存在していないが、ロイシン取り込み能を有する蛋白質をコードする遺伝子が存在していると推測された。
　一方で、ＹＥＳ平板培地では、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、およびＩＧＦ７４２株は、いずれも目立った増殖遅延は観察されなかった。
　２００８年に公開されたＳ．ポンベのゲノムワイドなトランスクリプトーム解析によると、ｉｓｐ５およびｐｕｔ４はＹＥ培地よりも主に最小培地や窒素飢餓状態で発現が誘導されている。よって、窒素源が豊富な栄養培地では、他のロイシン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが機能していることが推測された。
　次に、各株を、ＥＭＭ平板培地、アルギニン類似体であるカナバニンを６０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ）、およびリシン類似体であるチアリジンを２００ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｔｈｉａｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン類似体であるエチオニンを３０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）にスポットし、３２℃で４日間培養した。これらのアミノ酸類似体が細胞内に取り込まれると、正常な蛋白質合成が阻害されるため、細胞は増殖できなくなる。つまり、アミノ酸取り込み能が低下している株では、培地中のアミノ酸類似体の取り込みも抑制されるため、該アミノ酸類似体に対する耐性を示す。
　培養後の平板培地の落斜光画像を図１９に示す。この結果、ＩＧＦ６２８株およびＩＧＦ７４２株が、カナバニン耐性およびチアリジン耐性を有することが確認された。また、ＩＧＦ７４２株のみがエチオニン耐性を有することが確認された。
　ＩＧＦ６２８株の削除領域であるＡＲＴ領域には、アルギニンおよびリシン等の主要な塩基性アミノ酸トランスポーターであるｃａｔ１が存在している。このため、ＩＧＦ６２８株およびＩＧＦ７４２株では、アルギニンおよびリシンの取り込み能が低下し、カナバニン耐性およびチアリジン耐性を示したと推測された。また、カナバニン耐性は、ＩＧＦ６２８株よりもＩＧＦ７４２株のほうが高かったため、ＡＲＴ領域以外にもアルギニン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが存在していることが示唆された。
　さらに、ＩＧＦ７４２株はエチオニン耐性をも有していることから、ＩＧＦ７４２株の削除領域内にメチオニン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが複数存在しており、ＩＧＦ７４２株のエチオニン耐性は、該アミノ酸トランスポーターを多重に削除したことによって現れた表現型であると示唆された。
＜ＩＧＦ７４２株のテロメア長さの確認＞
　ＩＧＦ７４２株の染色体はいずれもテロメアを有しているが、ＩＧＦ７４２株の削除領域中にはテロメアのヘテロクロマチン形成に必要な蛋白質との結合部位が含まれている。そこで、ヘテロクロマチン形成蛋白質との結合部位が削除されたことにより、削除株中のテロメアの安定性に与える影響について調べた。具体的には、ＩＧＦ７４２株および親株であるＡＲＣ００１株を、それぞれＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）、３２℃で約１００世代培養した後、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化したゲノムＤＮＡを電気泳動し、テロメア反復配列をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの結果を図２０に示す。この結果、ＩＧＦ７４２株のテロメアの長さはＡＲＣ００１株とほとんど同じであり、第１染色体および第２染色体の末端を削除することは、テロメア長にほとんど影響していないことが確認された。
［実施例２］
　実施例１で作製した削除株に外来遺伝子発現カセットを導入し、該外来遺伝子がコードする蛋白質を発現させ、該蛋白質の生産効率を調べた。外来蛋白質として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、細胞外分泌蛋白質）、ヒトトランスフェリン（ｈＴＦ、糖鎖付加・細胞外分泌蛋白質）を用いた。
　具体的には、まず、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３１株（ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３２株（ΔＡＲＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３３株（ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６４７株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６４８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６４９株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７５５株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ７５６株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３４株（ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６５９株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６６０株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、およびＡＲＣ００１株の第２染色体のＬｅｕ１遺伝子座に、各外来蛋白質をコードする遺伝子を含む発現カセットを挿入し、蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を得た。各外来蛋白質をＳ．ポンベで構成的に発現させるため、各外来蛋白質をコードする遺伝子を、ｈＣＭＶ（ヒトサイトメガロウィルス）プロモーターおよびリポコルチンターミネーターの間に配置した発現カセットを用いた。
　ＥＧＦＰ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＥＭＭ培地、３２℃で培養し、蛋白質生産が盛んな対数増殖期に、各培地のＥＧＦＰの蛍光値を経時的に測定した。図２１は、各削除株のＥＧＦＰの蛍光値の測定結果を、ＡＲＣ００１株の結果とともに示した図である。この結果、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、ＩＧＦ６２９株、およびＩＧＦ６３０株のＥＧＦＰの蛍光値は、親株であるＡＲＣ００１株とほぼ同等であり、一領域削除株では蛋白質生産効率の改善は観察されなかった。削除領域が増大するに従い、ＥＧＦＰの蛍光値はＡＲＣ００１株よりも高くなり、ＥＧＦＰ発現効率の上昇が観察された。４領域が削除されたＩＧＦ７４２株が最も高いＥＧＦＰ発現効率を示した。
　次に、ｈＧＨ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＹＰＤ培地、３２℃で培養し、培養開始から２～６日経過した定常期の培養液上清を回収した。各培養液上清をＴＣＡ濃縮し、得られた濃縮液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した後、ＣＢＢ染色を行い、画像解析によりバンドの濃度勾配からｈＧＨの含有量を算出した。算出されたｈＧＨ含有量を、培養液上清が回収された時点の細胞密度（ＯＤ６６０＝２０に換算）により補正し、該培養液上清に含まれていたｈＧＨ含有量を算出した。図２２は、各株の培養液上清のｈＧＨ含有量を示した図である。この結果、ＩＧＦ７２４株等の一領域削除株でもｈＧＨの分泌発現効率が向上しており、菌体濁度あたりの分泌発現効率が最も上昇した株はＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）であった。
　さらに、ｈＴＦ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＹＰＤ培地、３２℃で培養し、培養開始から２～１０日経過した定常期の培養液上清を回収した。各培養液上清中のｈＴＦをＥＬＩＳＡ法により定量した。各測定値を、培養液上清が回収された時点の細胞密度（ＯＤ６６０＝２０に換算）により補正した。図２３は、各株の培養液上清のｈＴＦ含有量を示した図である。この結果、ｈＴＦ分泌発現でも一領域削除株でもｈＧＨの分泌発現効率が向上しており、菌体濁度あたりの分泌発現効率が最も上昇した株はＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）であった。
　図２４に、各ゲノム縮小化株の蛋白質生産効率を、親株に対する相対値として示した。ＥＧＦＰ発現では、４領域削除株（ＩＧＦ７４２株）で親株の１．８倍、ｈＧＨ分泌発現ではＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）で親株の３．３倍、ｈＴＦ分泌発現ではＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）で親株の２．０倍であった。つまり、蛋白質の種類に関わらず、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株を宿主として用いることにより、外来蛋白質の発現効率を削除前の親株よりも上昇させられることが明らかである。
　本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質を野生株よりも効率よく発現できるため、特に、酵母を利用した発現系の宿主として好適に用いることができる。
　なお、２０１１年１２月２７日に出願された日本特許出願２０１１－２８５６６８号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (14)

  1. 　シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  2. 　前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域である請求項１に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  3. 　前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域である請求項１に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  4. 　前記領域（ｂ）が第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座までの領域である請求項１～３のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  5. 　前記領域（ｃ）が第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域である請求項１～４のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  6. 　前記領域（ｄ）が第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域である請求項１～５のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  7. 　前記領域（ａ）および前記領域（ｃ）からなる群より選択される１以上の領域が少なくとも削除されている請求項１～６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  8. 　前記領域（ｂ）と、前記領域（ａ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域とが削除されている請求項１～６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  9. 　前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）、および前記領域（ｄ）が削除されている請求項１～６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  10. 　少なくとも前記領域（ａ）が削除されており、かつ該削除された領域（ａ）にはｐｄｃ２遺伝子座が含まれ、ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）以外の領域に挿入されている請求項１～９のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  11. 　第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ｐｄｃ２遺伝子が挿入されている請求項１０に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株に、構造遺伝子を発現させるための発現カセットが導入されていることを特徴とする蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
  13. 　請求項１２に記載の蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株を培養して得られる菌体または培養液上清から、前記構造遺伝子から発現させた蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
  14. 　シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中、
    第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域を削除し、全削除領域の長さを、野生株のゲノムの０．９％以上にすることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株の製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAORU TAKEGAWA ET AL.: "Production of heterologous proteins using the fission-yeast expression system", BIOTECHNOLOGY, vol. 89, no. 9, 25 September 2011 (2011-09-25), pages 521 - 523 *
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MAYUMI SASAKI ET AL.: "Improvement of recombinant protein expression system using fission yeast minimum genome factory", ABSTRACTS OF THE ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY, JAPAN, 25 August 2011 (2011-08-25), pages 45 *

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