WO2007060764A1 - 遺伝子増幅法 - Google Patents

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WO2007060764A1
WO2007060764A1 PCT/JP2006/314168 JP2006314168W WO2007060764A1 WO 2007060764 A1 WO2007060764 A1 WO 2007060764A1 JP 2006314168 W JP2006314168 W JP 2006314168W WO 2007060764 A1 WO2007060764 A1 WO 2007060764A1
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target sequence
sequence
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Takashi Horiuchi
Takaaki Watanabe
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Inter-University Research Institute Corporation National Institutes Of Natural Sciences
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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a gene at high speed and a method for producing a protein using the amplified gene.
  • the system of the present invention is based on a replication reaction called DRCR (double rolling-circle replication) induced by the ability of an organism called BIR (Break-Induced-Replication) (non-patent literature). 1, 2). This is because when a chromosome is cut, the cut chromosome finds the same sequence as itself, uses that homology to invade it, builds a replication point, and rescues itself by starting replication. It is thought that. All living organisms are considered to have this ability.
  • DRCR double rolling-circle replication
  • BIR Bit-Induced-Replication
  • Non-patent Document 3 It has been reported that DRCR occurs in natural circular DNA by thread replacement.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication 8-504585 (W094 / 14968)
  • Patent Document 2 WO2005 / 061703
  • Non-Patent Document 1 PNAS, vol.98, no.15, 8255-8262 (July 17, 2001)
  • Non-Patent Document 2 Genes Dev 12, 3831-3842 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Cell. 1986 Aug 15; 46 (4): 541-50.
  • the present invention relates to a double-stranded DNA specially constructed for amplifying a gene at high speed, and this.
  • a gene amplification method using the same and a protein synthesis method are provided.
  • the present invention has features such as that an amplification system is completely constructed artificially, that amplification can be performed synchronously, that the amplification period is short (perhaps one generation), and that the amplification mechanism is clear.
  • the amplification system of the present invention uses a replication reaction called double rolling-circle replication (DRCR).
  • DRCR double rolling-circle replication
  • the present inventors used a site-specific recombinase such as Cre-lox system and its target sequence in order to efficiently induce this DRCR. That is, the inventors constructed a replication unit having the structure shown in FIG. 3 in yeast, and the site-specific recombinant enzyme Cre recombinase (hereinafter referred to as ⁇ Cre '') when the replication fork proceeds between a pair of lox sequences.
  • ⁇ Cre '' the site-specific recombinant enzyme Cre recombinase
  • the present invention relates to a-b-c-d or a-c-b-d (wherein one of a and b comprises two first target sequences of site-specific recombinase).
  • Double-stranded DNA fragment, the other is a double-stranded DNA fragment in which the second target sequence is arranged in the reverse direction, and a replication origin and at least one target gene for amplification are inserted between a and d.
  • any DNA sequence may be inserted between them, and this is a double-stranded DNA represented by ().
  • the present invention is also a recombinant vector containing this double-stranded DNA, and further a transformant into which this double-stranded DNA has been introduced.
  • the present invention provides a set of 2 consisting of a double-stranded DNA represented by e-a-A-b-f and a double-stranded DNA force represented by g-c-B-d-h.
  • Double-stranded DNA (wherein one of a and b is a double-stranded DNA fragment consisting of the first target sequence of the site-specific recombinase, and the other is the first target sequence arranged in the opposite direction 2
  • one of c and d is a double-stranded DNA fragment consisting of the second target sequence of the site-specific recombinase
  • the other is a double-stranded DNA fragment in which the second target sequence is arranged in the opposite direction
  • Each of which represents a strand DNA fragment, and e to h are e, f, and the cell chromosome on a cell chromosome or extrachromosomal factor that is assumed to introduce the set of double-
  • it represents a double-stranded DNA fragment consisting of a base sequence of at least 50 bp arranged in the order of the replication origin of extrachromosomal factors, g and h, and at least one of A and B represents the target gene for amplification.
  • a and B represents the target gene for amplification.
  • an arbitrary DNA sequence may be inserted between these replication start points or a partial strength or g thereof, or they may be included! ).
  • the present invention is a set of recombinant vectors each containing the two types of double-stranded DNA, and further, a transformant into which the two types of double-stranded DNA have been introduced, wherein the replication origin is A transformant present on the host chromosome or extrachromosomal factor.
  • the present invention is a gene amplification method for amplifying the gene of interest for amplification, which has a step of preparing any of these transformants and a step force of allowing a site-specific recombinant enzyme to act on the transformant. Furthermore, it is a method for producing a protein encoded by a target gene for amplification, which also has a step force for culturing transformed cells obtained by this method.
  • the amplification system of the present invention has excellent characteristics for establishing a high-performance protein production system.
  • DRCR can be amplified at high speed in one cell cycle, and since the amplification mechanism is clear, the target gene can be reliably amplified.
  • the Cre-lox amplification system can form highly amplified products at a frequency 10 to 100 times higher than that of current animal cell systems.
  • this amplification system can be applied to primary cells in primary culture where amplification does not occur even if the drug is originally selected, and gene amplification is applied to gene therapy targeting normal cells to enhance transgene expression. It can be sustained.
  • the gene amplification method of the present invention is considered to function in both budding yeast and animal cells as an amplification mechanism, and utilizes double rolling-circle replication (DRCR) capable of high-speed amplification.
  • This amplification system is a reaction in which two replication forks continuously replicate circular DNA, as shown in FIG. First, fork (1) replicates w and fork (2) force ((a), (b) 's c >>, then fork (1) replicates X and fork (2) replicates z (( c) d), () In this way, since the saddle shape for one fork is synthesized by the other fork one after another, replication continues endlessly. The structure is removed and the reaction is thought to end (£).
  • the replication fork represented by the black arrow is the target sequence of two sets of site-specific recombinase.
  • Target sequences located between the parental DNA strand X and the nascent DNA strand y for example, loxP sequence
  • Target sequences located between the parental DNA strand x and the nascent DNA strand y for example, loxP sequence
  • Recombination occurs between site-specific recombinases (eg, Cre) (eg, loxP sequence) (b).
  • the double-stranded DNA used in the present invention is represented by a-b-cd or a-cbd, preferably a-b-cd.
  • One of a and b represents a double-stranded DNA fragment having the first target sequence ability of the site-specific recombinase, and the other represents a double-stranded DNA fragment in which the first target sequence is arranged in the reverse direction.
  • One of c and d represents a double-stranded DNA fragment constituting the second target sequence of the site-specific recombinase, and the other represents a double-stranded DNA fragment in which the second target sequence is arranged in the reverse direction.
  • the first target sequence and the second target sequence may be the same, but are preferably different. Also, any DNA sequence may be inserted between them.
  • This b also serves as c, and may be represented by a—b d (in this case, d represents the same target sequence in the same direction as a).
  • This sequence may also be represented by a-b-X-c-d or a-c-X-b-d, preferably a-b-X-cd.
  • X represents the replication start point.
  • the origin of replication is the potential for the origin of ori beta, the latent origin (OriP) of EBV, the origin near c-myc gene, etc. present in the 3 'downstream region of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene. Anything that is active!
  • this arrangement is a—A—b—X—c—B—d or a—A—c—X—b—B—d, preferably a—A—b—X—c—B—. It may be represented by d.
  • At least one of A and B represents an amplification target gene.
  • they may be the same or different.
  • Site-specific recombinase catalyzes recombination between two short consensus DNA sequences (target sequences). This site-specific recombinase can cause site-specific recombination between target sequences, further altering their target sites or making changes to the incorporated genes.
  • the following site-specific recombination enzyme and a target sequence specific to this enzyme can be used (for example, see Developmental Cell, Vol. 6, 7-28, January, 2004, etc.).
  • Cre thread recombination enzyme recombinase or a derivative thereof
  • Bacterial virus P 1 Cre recombinase is most widely used for gene transfer and gene disruption in mice. Cre protein catalyzes recombination between two 34 base long loxP recognition sites.
  • the loxP sequence has a unique structure in which an 8-base core sequence is sandwiched between two 13-base nordromic sequences. This 8-base non-target land sequence gives direction to the loxP site.
  • DNA strand breaks and recombination between loxP sites by the Cre enzyme occur after the first base of the base 8 and before the last base. This Cre enzyme has a derivative by amino acid substitution.
  • Derivatives are site-specific recombination enzymes that have been modified by introducing amino acid substitutions into wild-type Cre recombinase, and mutations in the base sequence of wild-type Cre recombinase gene, resulting in CpG content and translation initiation efficiency.
  • This refers to a site-specific recombinase and its gene in which the Kozak sequence and codon-usage involved in the protein are optimized for host cells to increase the efficiency and amount of expression.
  • At least 29 different derivatives of the Cre enzyme have been made so far. They may have different activities or be able to recognize different target sequences. Similarly, many mutant sequences have been created for the target sequence lox recognized by the Cre enzyme. All of these can be used in the present invention.
  • target sequences include 1 ⁇ , 1 ⁇ 511, 1 ⁇ 5171, 1 ⁇ 2272, 1 ⁇ 2372, loxm2 (also referred to as m2), loxFAS, 1 ⁇ 71, 1 ⁇ 66, and variants thereof.
  • a mutant is a target sequence of site-specific recombination reaction in which a mutation is introduced at one or more bases with respect to a wild-type ⁇ sequence or the like.
  • Recombination efficiency is generally very sensitive to any changes in the Lox sequence, but mutations that retain function have been found. In that case, recombination occurs efficiently in the cell between ⁇ ⁇ ⁇ of the same sequence, but the efficiency of recombination significantly decreases between different sequences.
  • Flp recombinant enzyme recombinase or a derivative thereof
  • This recombinant enzyme is a Flp recombinant enzyme taken from budding yeast.
  • the activity of this enzyme is similar to or slightly inferior to CreZloxP.
  • Flp Flpe
  • the 34 base consensus recombination sequence is called FRT.
  • FRT has the same structure as ⁇ but has a different force array.
  • Derivatives include site-specific recombination enzymes that have been altered in function and properties by introducing amino acid substitutions into wild-type Flp recombinase, and mutations in the base sequence of wild-type Flp recombinase gene, resulting in CpG content and translation initiation efficiency.
  • the site-specific recombination enzyme and its gene which are optimized for the host cell by optimizing the Kozak sequence and codon-usage involved in the gene, are expressed. There have been at least 28 different derivatives of the F lp enzyme.
  • target sequences include FRT, F3, F5, FRT mutant-10, FRT mutant +10, and mutants thereof.
  • a mutant is a target sequence for site-specific recombination reaction in which a mutation is introduced at one or more bases relative to a wild-type FRT sequence or the like.
  • the Flp enzyme like Cre, is very sensitive to sequence changes at the FRT site. However, several mutated FRT sites have been identified that can efficiently undergo thread recombination if they have the same sequence pair. However, recombination hardly occurs between different mutant FRT sites or between wild-type sites and mutant sites.
  • PWC31 integrase is derived from a bacterial virus of Stress Myces and functions in human cells.
  • the target sequence include attP, attB, and mutants thereof.
  • a mutant is a target sequence of site-specific recombination reaction in which a mutation is introduced at one or more bases with respect to a wild-type attP sequence or the like.
  • This system is an enzyme that recombines with 3 bases of ttg between attPP and attBB. Since both sides of the recombination sequence of ttg are unique sequences, after the thread change, the sequence is different from the original recognition sequence. Therefore, the recognition sequence for this enzyme is no longer present. Therefore, recombination of this enzyme is cut once.
  • PWC31 integrase derivatives are site-specific recombination enzymes that have been modified by introducing amino acid substitutions into wild-type PWC31 integrase, or mutations in the base sequence of the wild-type PWC31 intterase gene.
  • the site-specific recombination enzyme and its gene are optimized by optimizing the host cell for the Kozak sequence and codon-usage related to CpG content and translation initiation efficiency.
  • CreZLox system is preferred.
  • the gene of interest to be expressed and a gene for selecting a cell in which this structure is integrated on a chromosome or an extrachromosomal factor (Genetidn, Neo mycin, Hygromycin, Zeocin, Pharmacometabolic genes for Blasticidin, etc.), marker genes for selecting cells that have undergone gene amplification (Dihydrofolate reductase (DHFR), Glutamine synthetase (S), Aspartate trans carbamyias e (and AD) ⁇ Metallothionein, MT) ⁇ Adenosine deaminase (ADA), Adenylate deaminase (AMPD1,2), UMP synthetase, P-glycoprotein (P-gp) ⁇ Asparagine synthetase (AS) ⁇ Ornithine decarboxylase (ODC), etc.) may be inserted.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • S Glut
  • the double-stranded DNA fragment thus obtained is introduced into an appropriate cell by a method such as a virus, a lipofusion method, or an electoral position method.
  • a method such as a virus, a lipofusion method, or an electoral position method.
  • select with a drug corresponding to a gene for selecting a cell in which this structure has been incorporated into a chromosome or an extrachromosomal factor such as a drug resistance gene for Geneticin, Neomycin, Hygromycin, Zeocin, Blasticidin, etc.
  • a cell line examples of this host include yeast cells and animal cells.
  • Animal cells are preferred because of their low risk of exposure. Examples of animal cells include CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, which are widely used for protein production, as well as all Italian vesicles derived from humans, mice, rats, and other animals.
  • the double-stranded DNA of the present invention is a set of double-stranded DNAs obtained by dividing any of the double-stranded DNAs described above into at least two, preferably 2 to 5, more preferably 2.
  • Each fragment has a double-stranded DNA fragment for homologous recombination consisting of a partial sequence of the host chromosome or extrachromosomal factor at least 50 bp, preferably 500 to 1 Kbp, in both ends. It may be a thing.
  • This double-stranded DNA fragment for homologous recombination can form the double-stranded DNA on the chromosome or extrachromosomal factor of the host by homologous recombination.
  • This origin of replication may be the origin of replication of the host chromosome or extrachromosomal factor, or may be an exogenous one.
  • Extrachromosomal factors refer to plasmids, virus-derived sequences, host chromosome partial fragments, and artificial chromosomes that can replicate in host cells.
  • Examples of such a set of double-stranded DNA fragments include the following.
  • Double-stranded DNA represented by eaAbcB-f and double-stranded DNA represented by g—d—h (6) Double-stranded DNA represented by e—a—A—b—B—f and Double-stranded DNA represented by g—d—h
  • a to d, A, and B are the same as described above.
  • d represents the same target sequence in the same direction as a.
  • e to h are in the order of e, f, origin of replication, g, h on the cell chromosome or extrachromosomal factor, respectively (arbitrary sequence may be inserted between them. It may be contained in a partial force or g.)
  • At least two double-stranded DNA fragments obtained as described above are introduced into appropriate cells by a method such as a virus, a lipofusion method, or an electoral position method.
  • the cell line is selected with a drug corresponding to a gene for selecting a cell in which this structure is integrated on a chromosome or an extrachromosomal factor (eg, a drug metagene for Genetidn, Neomycin, Hygromycin, Zeocin, Blasticidin, etc.)
  • a drug metagene for Genetidn, Neomycin, Hygromycin, Zeocin, Blasticidin, etc. eg, a drug metagene for Genetidn, Neomycin, Hygromycin, Zeocin, Blasticidin, etc.
  • yeast cells When producing proteins as pharmaceuticals, sugar chains similar to humans can be added to proteins, inducing unnecessary immune reactions. Animal cells are preferred because of their low risk.
  • a site-specific recombinant enzyme is allowed to act on the transformed cells obtained as described above.
  • the proportion of cells in the cell cycle is in the replication phase (S phase)
  • it is a cell in a state where the cell cycle is actively proliferating and the cell cycle is progressing, or when it enters the S phase.
  • Examples of the method for causing the site-specific recombinant enzyme to act include the following methods.
  • the transformant is further transformed to express a site-specific recombinant enzyme.
  • a fragment that connects a gene encoding a site-specific recombinase downstream of a promoter sequence that functions in the host cell, a gene for selecting a cell in which this structure is integrated on a chromosome or extrachromosomal factor (Geneticin, Neomycin) , Hygromycin, Zeocin, Blasticidin, etc.) is constructed, and this is introduced into the above-mentioned transformed cells by a method such as the ribofetasion method or the electopore position method.
  • a method such as the ribofetasion method or the electopore position method.
  • the structure to be introduced should be linear.
  • site-specific recombinant enzyme Prepare a large amount of site-specific recombinant enzyme and purify it using a commercially available protein transfer reagent (e.g. Targeting System, Profect, Genlantis, BioPORTER Protein Delivery Regient). It introduce
  • the site-specific recombinant enzyme in order for the site-specific recombinant enzyme to act in a state where replication is actively carried out, the cell is actively proliferating and the cell cycle is advancing, or the cell enters the S phase. It is desirable to introduce site-specific recombinase into cells with synchronized cycles
  • Amplification is induced as described above, but amplification marker genes (Dihydrofolate reductase (DHFR), Glutamine synthetase (GS), Aspartate transcarbamylase (AD), Metallot hionein (MT), Adenosine deaminase (ADA), It is preferable to select with a drug corresponding to Adenylate deaminase (AMPD1,2), UMP synthetase ⁇ P-glycoprotein (P-gp) ⁇ Asparagine synthetase (AS), Ornithine decarboxylase (ODC), etc.).
  • amplification marker genes Dihydrofolate reductase (DHFR), Glutamine synthetase (GS), Aspartate transcarbamylase (AD), Metallot hionein (MT), Adenosine deaminase (ADA), It is preferable to select with a drug corresponding to Adenylate deaminase (AMPD1,
  • a cell line with a high expression level of the target gene is selected, the cell is cultured, and the protein encoded by the target amplification gene is purified from the medium or the supernatant thereof or by purifying them. Can be manufactured in large quantities.
  • FIG. 3 a structure for amplification
  • the PCR fragment of the nucleotide sequence 263177-264016 (SEQ ID NO: 3) of chromosome VI (Genebank Accession No. NC—001138) is located on the downstream side, and 264017-264 685 (sequence) A fragment to which the PCR fragment of No. 4) was connected was prepared, and the host yeast cell line was transformed with this fragment using Frozen-EZ East Transformation II (ZYMO RESEARCH).
  • the TRP1 marker gene works to select cells that can form a mouth on agar medium that does not contain tributophan, analyze its chromosomal structure, and construct a structure sandwiched between ⁇ pairs. A cell line into which the structure was inserted was established.
  • DNA fragment structure 2 (centromeric structure) containing a pair of loxm2 sequences in opposite directions, amplification selection marker gene leu2d, and LYS5 gene (SEQ ID NO: 2, this 1-34 is loxm 2 sequence, 3936 -5888 (complementary strand) constituted the amplification marker gene leu2d, 2891-3930 the LYS5 gene, and 5890-5923 the loxm2 sequence in the reverse direction.
  • a fragment was prepared by connecting the PCR fragment of base sequence 257941-258821 (SEQ ID NO: 5) to the upstream side of this DNA fragment structure 2 and the PCR fragment of 258822-259719 (SEQ ID NO: 6) to the downstream side.
  • Cells were transformed in the same way with the above DNA fragment structure 1 (structure sandwiched between ⁇ pairs).
  • a cell that can form a mouth-one on an agar medium that does not contain lysine was selected by the action of the LYS5 marker gene, and its chromosomal structure was analyzed, and a structure sandwiched between ⁇ pairs and loxm2 pairs. A cell line with the structure inserted was established.
  • the amplification selectable marker gene leu2d lacks most of the promoter sequence, and thus the expression level is very low. This is because the leucine requirement can be complemented only when amplified to multiple copies.
  • Example 3 the structure obtained in Example 1 (FIG. 3) was inserted into Saccharomyces cerevisiae chromosome VI to express the Cre gene to induce double rolling-circle replication (DRCR).
  • DRCR double rolling-circle replication
  • This chromosomal DNA was separated by Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE, BIO-RAD, CHEF Mapper XA, Auto Algorithm, range: 220-500 kb), or the DNA digested with the restriction enzyme Sma I was They were separated by inversion gel electrophoresis (FIGE, BIO-RAD, CHEF Mapper XA, Auto Algorithm, range: 3-50 kb) and analyzed by Southern blotting.
  • PFGE Pulsed-field gel electrophoresis
  • BIO-RAD BIO-RAD
  • CHEF Mapper XA Auto Algorithm, range: 220-500 kb
  • FIGE inversion gel electrophoresis
  • FIG. 6 (a) shows the result of structural analysis of the chromosomal DNA separated by PFGE by Southern blotting using the leu2d probe.
  • amplification product (i) with a long chromosome VI inserted with an amplification structure and a multi-copy minichromosome (ii) were detected.
  • chromosome III (*) of the host cell line containing the leu2 fragment was found at 345 kb
  • chromosome VI (NS) having a structure for amplification was found at 290 to 320 kb
  • a slightly amplified chromosome was found.
  • Fig. 6 (b) shows the result of structural analysis of the chromosomal DNA fragment obtained by digesting the above chromosomal DNA with a restriction enzyme (Smal) and separating the Smal fragment with FIGE by the Southern plot method using the leu2d probe. .
  • Smal restriction enzyme
  • the minichromosome found in most clones (gray lane) formed an approximately 6.3 kb Smal amplified fragment. As shown in Fig. 8, this was formed by replication from the telomer side of the structure for amplification and side reaction by Cre-loxP recombination, and is considered to exist in multiple copies.
  • FIG. 1 is a diagram showing a DRCR reaction. Black arrows represent duplicate forks.
  • FIG. 2 is a diagram showing an amplification initiation reaction using a site-specific recombinase and its target sequence.
  • Triangular arrows (a to d) represent the target sequence of the site-specific recombinase (eg, ⁇ sequence) and its direction, and X represents the replication origin (the same applies hereinafter).
  • x to z and x ′ to ⁇ ′ represent genes for amplification, and black arrows represent replication forks.
  • FIG. 3 is a diagram showing a structure for amplification.
  • CEN Centromere
  • TEL Telomere
  • FIG. 4 shows a plasmid (pSH47) for expression of Cre.
  • FIG. 5 is a graph showing a colony formation rate.
  • G1 Glucose, Gal Galactose
  • FIG. 6 shows Southern blot analysis.
  • A shows chromosomal DNA isolated by PFGE using leu2d probe
  • b shows chromosomal DNA digested by Smal and isolated by FIGE
  • . # 19 to 58 show the DNA prepared by colony colonies that appeared after application of galactose to Cre expression and was applied to a selection medium lacking leucine.
  • NS is a control colony cultured on a non-selection medium. Knee strength indicates the adjusted DNA, and P indicates the host cell line. Under the PFGE conditions in this experiment, chromosomes of approximately 650 kb or more appear to be concentrated at the separation limit.
  • FIG. 7 is a diagram showing amplification products on chromosomes.
  • A shows the structure first formed by DRCR.
  • a to f represent cleavage sites of the restriction enzyme Smal, and the numbers indicate the fragment length (kb).
  • the 5.3 kb fragment produced by the cleavage of d-e does not contain leu2d and is not detected by Southern blot.
  • B shows a structure in the case where the sequence between lox involves inversion (rearrangement in the reverse direction).
  • a ' ⁇ ! ⁇ Represents the cleavage site changed by inversion, and the number indicates the possible fragment length (kb).
  • the region containing a force a causes a 10.9 kb fragment by a-b cleavage
  • the 16.8 kb fragment is produced by a'-b cleavage.
  • a fragment of 5.3 kb is obtained from the ab 'cut and a 11. Ikb fragment is obtained from the a'_b cut.
  • the 5.3 kb fragment that does not contain leu2d is not detected by Southern blot.
  • FIG. 8 is a diagram showing an amplification product on the minichromosome (FIG. 6G0). Replication from the telomere side proceeds in reverse by thread exchange between lox Ps to form a minichromosome (approximately 18 kb) with telomeres at both ends.
  • the fragment length containing leu2d is 6.3 kb due to the Smal cleavage site g to i and the cleavage site h 'which can be changed by inversion (derived from the g-h' or hi fragment. h or h '! /, the gap is broken, so gi and!
  • FIG. 9 is a diagram showing an amplification product on the minichromosome (FIG. 6G0). Replication from the telomere side reverses by recombination between lox m2 to form a minichromosome (about 40 kb). j to n represent Smal cleavage sites, k′-m ′ represents cleavage sites that can be changed by inversion, and numbers represent possible fragment lengths (kb). However, a 5.3 kb fragment that does not contain leu2d is not detected by Southern blot.
  • FIG. 10 shows the effect of Cre recombination on the structure after amplification!
  • the sequence between each lox is frequently inverted.
  • o to r are Smal cleavage sites
  • p ′ and q ′ are cleavage sites that can be changed by inversion
  • the numbers indicate the possible fragment lengths (kb).
  • a 5.3 kb fragment that does not contain leu2d is not detected by Southern blot.

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Abstract

【課題】　　高速で遺伝子を増幅するために特別に構成された２本鎖ＤＮＡ及びこれを用いた遺伝子増幅法並びにたんぱく質の合成法を提供する。 　【解決手段】　　 　本発明の増幅系はdouble rolling-circle replication（DRCR）と呼ばれる複製反応を効率よく誘導するためにCre-lox系などの部位特異的組換え酵素及びその標的配列を利用した。図２（ａ）に示す構造の複製ユニットを動物細胞等の細胞内に構築し、複製フォークが一対の標的配列(lox配列)間を進行する際に部位特異的組換え酵素(Cre)により起こる組換えを利用して、DRCR誘導を起こす。 　

Description

明 細 書
遺伝子増幅法
技術分野
[0001] この発明は、遺伝子を高速で増幅する方法及び増幅された遺伝子を用いてタンパ ク質を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子増幅を人為的に起こさせるために動物培養細胞を用いて行う場合 (特許文 献 1等)、（i)時間が掛かる（半年〜 i年)、（ii)増幅していないクローンも多い、（iii)増 幅機構が未解明で経験に頼っている、等の問題点がある。一方、酵母を用いた遺伝 子増幅の系は無ぐ通常そのためにはプラスミドが用いられる力 一定以上のコピー 数の増加は困難である。
本発明のシステムは、 BIR(Break-Induced-Replication)と呼ばれる生物が有する能 力により誘導される DRCR(double rolling-circle replication)と呼ばれる複製反応に基 礎を置いたものである（非特許文献 1、 2)。これは染色体が切断されると、その切られ た染色体は自分と同じ配列を見つけ、その相同性を利用してそこに侵入し、複製点 を構築し、複製を開始することで、自分を救済すると考えられる。生物はすべてこの 能力を有すると考えられる。
なお、自然の環状 DNAにおいて、糸且換えによって DRCRが起こることが報告されて いる (非特許文献 3)。
[0003] 特許文献 1：特表平 8-504585 (W094/14968)
特許文献 2： WO2005/061703
非特許文献 1 : PNAS, vol.98, no.15, 8255-8262 (July 17, 2001)
非特許文献 2 : Genes Dev 12, 3831-3842 (1998)
非特許文献 3 : Cell. 1986 Aug 15;46(4):541- 50.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、高速で遺伝子を増幅するために特別に構成された 2本鎖 DNA及びこ れを用いた遺伝子増幅法並びにたんぱく質の合成法を提供する。本発明は、人為 的に増幅系を完全に構築していること、同調して増幅できること、増幅期間が短い（ 恐らく 1世代)こと、増幅機構が明らかなこと等の特徴を有している。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明の増幅系は double rolling-circle replication (DRCR)と呼ばれる複製反応を 利用している。これは 1回の細胞周期内に爆発的に増幅させることが可能で、組換え 等により反応が終結して増幅産物が細胞内で維持されると考えられる。本発明者らは 、この DRCRを効率よく誘導するために Cre-lox系などの部位特異的組換え酵素及び その標的配列を利用した。即ち、発明者らは、図 3に示す構造の複製ユニットを酵母 内に構築し、複製フォークが一対の lox配列間を進行する際に部位特異的組換え酵 素 Creリコンビナーゼ (以下「Cre」という。）により起こる組換えを利用して、 DRCR誘導 を起こすことに成功し、本発明を完成させるに至った。
[0006] 即ち、本発明は、 a— b— c— d又は a— c— b— d (式中、 a及び bの一方は部位特異 的組換え酵素の第 1の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 1の標的配 列を逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 c及び dの一方は部位特異的組換 え酵素の第 2の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 2の標的配列を逆 方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 a— d間のいずれかに複製開始点と少な くともひとつの増幅目的遺伝子が挿入される。但し、これらの間に任意の DNA配列 が挿入されて 、てもよ 、。 )で表される 2本鎖 DN Aである。
本発明は、またこの 2本鎖 DNAを含む組換えベクターであり、更にこの 2本鎖 DNA が導入された形質転換体である。
[0007] また本発明は、 e— a—A—b—fで表される 2本鎖 DNA、及び g— c— B— d—hで 表される 2本鎖 DNA力 成る 1セットの 2本鎖 DNA (式中、 a及び bの一方は部位特 異的組換え酵素の第 1の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 1の標的 配列を逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 c及び dの一方は部位特異的組 換え酵素の第 2の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 2の標的配列を 逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 e〜hは、それぞれ当該 1セットの 2本 鎖 DNAの導入を想定する細胞染色体又は染色体外因子上に e、 f、該細胞染色体 又は染色体外因子の複製開始点、 g、 hの順に並ぶような少なくとも 50bpの塩基配 列から成る 2本鎖 DNA断片を表し、 A及び Bの少なくとも一方が増幅目的遺伝子を 表す。但し、該複製開始点又はその一部力 ¾又は gに含まれていてもよぐこれらの間 に任意の DNA配列が挿入されて!、てもよ!/、。 )である。
本発明は、この 2種の 2本鎖 DNAをそれぞれ含む 1セットの組換えベクターであり、 さらに、この 2種の 2本鎖 DNAが導入された形質転換体であって、前記複製開始点 がその宿主の染色体又は染色体外因子上に存在する形質転換体である。
[0008] また、本発明は、これらのいずれかの形質転換体を用意する段階、及びこれに部 位特異的組換え酵素を作用させる段階力もなる、前記増幅目的遺伝子を増幅する 遺伝子増幅法であり、さらに、この方法により得られた形質転換細胞を培養する段階 力も成る、増幅目的遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法である。
発明の効果
[0009] 本発明の増幅系は、高性能タンパク質生産系を確立するために優れた特徴を備え ている。 DRCRは 1回の細胞周期において高速に増幅可能であり、増幅機構が明解 であるため目的遺伝子の確実な増幅が期待できる。また現時点では生物種が異なる ものの、 Cre-lox増幅系は、現行の動物細胞の系の 10〜100倍以上の頻度で高度な 増幅産物を形成できる。さらに本増幅系は本来薬剤選択しても増幅が起きない初代 培養の通常細胞にも適用可能性であり、通常細胞を標的とした遺伝子治療に遺伝 子増幅を応用し導入遺伝子の発現を強化 ·持続化できる。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の遺伝子増幅法は、増幅機構として、出芽酵母と動物細胞の両方で機能す ると考えられ、高速な増幅が可能な double rolling-circle replication (DRCR)を利用し ている。この増幅系は、図 1に示すように、 2つの複製フォークが環状の DNAを連続 的に複製する反応である。まずフォーク（1)が wを、フォーク（2)力 を複製し ((a),(b)ズ c》、続いてフォーク（1)が Xを、フォーク（2)が zを複製する ((c)ズ d), ( )。こうして一方の フォークのための铸型が他方のフォークによって次々と合成されるので、複製は延々 と続く。増幅が進行した後、組換え反応等によって中央のサークル構造が除かれて、 反応が終結すると考えられる (£)。 [0011] 本発明の増幅系では、 DRCRを誘導するために、動物細胞でも効率よく機能するこ とが知られている部位特異的組換え反応を利用した系を考案した。これは複製フォ ークが 1組の標的配列間を通過中に組換えがおこるとフォークの逆進行が起こる反 応を 2つ組合わせて利用して!/、る。
即ち、本発明の増幅系では、図 2(a)のように構成された増幅ユニットにおいて複製 が開始された後、黒い矢印で表す複製フォークが 2組の部位特異的組換え酵素の標 的配列 (lox配列）間を通過する際に、親 DNA鎖 Xと新生 DNA鎖 yに位置する標的配列 (例えば、 loxP配列）間、及び親 DNA鎖 x'と新生 DNA鎖 y'に位置する標的配列（例え ば、 loxP配列）間で部位特異的組換え酵素 (例えば、 Cre)による組換えを起こす (b)。 組換えによって Xと y鎖が入れ替わり x'と y鎖も入れ替わると、一方のフォークは X鎖か ら 、 z鎖を合成し、さらにもう一方のフォークは x'鎖から/、 z'鎖を合成する (c)。これに よりフォークは逆進行し、複製済みの DNA鎖を再度複製する (d)。これら 2つの反応に より DRCRが誘導される。
[0012] 本発明で用いる 2本鎖 DNAは、 a— b— c d又は a— c b d、好ましくは a— b— c dで表される。
a及び bの一方は部位特異的組換え酵素の第 1の標的配列力 成る 2本鎖 DNA断 片、他方は該第 1の標的配列を逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表す。
c及び dの一方は部位特異的組換え酵素の第 2の標的配列力 成る 2本鎖 DNA断 片、他方は該第 2の標的配列を逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表す。
第 1の標的配列と第 2の標的配列は同じであってもよいが、異なることが好ましい。 また、これらの間に任意の DNA配列が挿入されて 、てもよ 、。
[0013] この bが cを兼ね、 a— b d (この場合、 dは aと同方向の同一標的配列を表す。）で 表されてもよい。
また、この配列は、 a— b— X— c— d又は a— c— X— b— d、好ましくは a— b— X— c dで表されてもよい。
ここで、 Xは複製開始点を表す。複製開始点は、 Dihydrofolate reductase (DHFR) 遺伝子の 3'下流域に存在する Ori beta, EBVの latent origin (OriP)、 c-myc遺伝子付 近の origin等が候補となる力 動物細胞での複製開始活性があれば何でもよ!/、。 更に、この配列は、 a— A— b— X— c— B— d又は a— A— c— X— b— B— d、好まし くは a— A— b— X— c— B— dで表されてもよい。
ここで、 A及び Bの少なくとも一方は増幅目的遺伝子を表す。増幅遺伝子を複数用 V、る場合には、それらは同じであっても異なってもよ 、。
これらにおいても、上記（図 2)で説明した DRCRが同様に誘導される。
[0014] 部位特異的組換え酵素は二つの短かなコンセンサス DNA配列 (標的配列）間の組 換えを触媒する。この部位特異的組換え酵素は、標的配列の間に部位特異的組換 えを引き起こし、それらの標的部位を更に変更させたり、組み込まれた迫伝子に変更 を加えることが出来る。
本発明では以下の部位特異的組換え酵素及びこの酵素に特異的な標的配列を用 いることができる（例えば、 Developmental Cell, Vol.6, 7-28, January, 2004等参照の こと)。
[0015] (1) Cre糸且換え酵素（リコンビナーゼ)又はその誘導体
細菌ウィルス P 1の Cre組換え酵素は、マウスにおける遺伝子導入や遺伝子破壌に 最も広く用いられている。 Creタンパクは二つの 34塩基の長さの loxP認識サイト間 の組換えを触媒する。この loxPの配列は、 8塩基の核となる配列を二つの 13塩基の ノリンドローム配列が挟んだユニークな構造を取っている。この 8塩基の非対象陸の 配列は、 loxPサイトに方向性を与えている。 Cre酵素による loxPサイト間の DNA鎖 の切断と組換えは、核配列の 8塩基の最初の塩基の後と最後の塩基の前で起こる。 この Cre酵素にはアミノ酸置換による誘導体が作られている。誘導体とは、野生型 C reリコンビナーゼにアミノ酸置換を導入し機能'性質を変化させた部位特異的組換え 酵素や、野生型 Creリコンビナーゼ遺伝子の塩基配列に変異を導入して CpG含量、 翻訳開始効率に関わる Kozak配列、 codon-usageを宿主細胞に最適化して発現の効 率 ·量を高めた部位特異的組換え酵素とその遺伝子をいう。 Cre酵素には少なくとも 2 9種類の誘導体が今まで作られている。これらは活性が違ったり、異なる標的配列を 認識できるようになったりする。また Cre酵素の認識する標的配列 loxについても同様 に多数の変異配列が作られて 、る。本発明に於てはこれら全てを用いることができる このような標的配列としては、 1οχΡ、 1οχ511、 1οχ5171、 1οχ2272, 1οχ2372、 loxm2(m2と もいう。 ), loxFAS、 1οχ71、 1οχ66、及びこれらの変異体が挙げられる。変異体とは、野 生型の ΙοχΡ配列等に対して 1ケ所以上の塩基に変異が導入された部位特異的組換 え反応の標的配列をいう。
組換え効率は、一般に Lox配列のどんな変更にも極めて敏感であるが、機能保持 の変異が見出されてきた。その場合、同じ配列同士の ΙοχΡ間では細胞内で効率よく 組換えが起こるが、異なる配列同士の間では、組換えの効率は顕著に低下する。
[0016] (2) Flp組み換え酵素（リコンビナーゼ)又はその誘導体
この組み換え酵素は、出芽酵母から取られた Flp組み換え酵素である。この酵素の 活性は、 CreZloxPと同様又は若干劣る。しかし、最近開発された活性型 Flp (Flpe )はこの酵素の効率が改良され、 Creの効率と同等である。 34塩基のコンセンサス組 み換え配列は FRTと呼ばれる。 FRTは ΙοχΡと同じ椿造を有する力 配列は異なる。 誘導体とは、野生型 Flpリコンビナーゼにアミノ酸置換を導入し機能 ·性質を変化さ せた部位特異的組換え酵素や、野生型 Flpリコンビナーゼ遺伝子の塩基配列に変異 を導入して CpG含量、翻訳開始効率に関わる Kozak配列、 codon-usageを宿主細胞 に最適化して発現の効率 ·量を高めた部位特異的組換え酵素とその遺伝子を 、う。 F lp酵素には少なくとも 28種類の誘導体が今まで作られている。
この Flp酵素とその認識配列にも多くの誘導体が作られている。標的配列としては、 FRT、 F3、 F5、 FRT mutant -10、 FRT mutant +10、及びこれらの変異体が挙げられる 。変異体とは、野生型の FRT配列等に対して 1ケ所以上の塩基に変異が導入された 部位特異的組換え反応の標的配列を!、う。
Flp酵素は、 Creと同じように、 FRTサイトの配列の変化に非常に敏感である。しか し幾つかの変異 FRTサイトは同じ配列のペアであれば、効率よく糸且換えが起こるもの が同定されている。しかし異なる変異 FRTサイト同士や野生型サイトと変異サイト間の 組換えは殆ど起こらない。
[0017] (3) PWC31インテグラーゼ又はその誘導体
PWC31インテグラーゼはストレストマイセス菌の細菌ウィルス由来でヒトの細胞内で 機能する。 この標的配列としては、 attP、 attB及びこれらの変異体が挙げられる。変異体とは、 野生型の attP配列等に対して 1ケ所以上の塩基に変異が導入された部位特異的組 換え反応の標的配列を 、う。
この系は、 attPP，と attBB，の間の ttgの 3塩基で組換えを起こす酵素である。この ttg の組換え配列の両側はユニークな配列であるため、糸且換えの後には、最初の認識配 列とは違った配列となる。そのため、もはやこの酵素の認識配列は無くなってしまう。 そのためこの酵素の組換えは一回切りである。
PWC31インテグラーゼ系の誘導体とは、野生型 PWC31インテグラーゼにアミノ酸置 換を導入し機能'性質を変化させた部位特異的組換え酵素や、野生型 PWC31インテ ダラーゼ遺伝子の塩基配列に変異を導入して CpG含量、翻訳開始効率に関わる Koz ak配列、 codon-usageを宿主細胞に最適化して発現の効率 ·量を高めた部位特異的 組換え酵素とその遺伝子を 、う。
これらの部位特異的組換え酵素とその標的配列の中で、 CreZLox系が好ましい。
[0018] さらにこの構造内の任意の位置に、発現させたい目的の遺伝子、本構造が染色体 又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子 (Genetidn、 Neo mycin、 Hygromycin, Zeocin、 Blasticidin等に対する薬剤而性遺伝子等)、遺伝子増 幅を起こした細胞を選択するためのマーカー遺伝子 (Dihydrofolate reductase (DHFR )、 Glutamine synthetase ( S)、 Aspartate trans carbamyias e (し AD)ゝ Metallothionein、 MT)ゝ Adenosine deaminase (ADA)、 Adenylate deaminase (AMPD1,2)、 UMP syntheta se、 P- glycoprotein (P- gp)ゝ Asparagine synthetase (AS)ゝ Ornithine decarboxylase (O DC)等)を挿入してもよ 、。動物細胞での増幅に重要であると考えられて!/、る核マトリ ックス付着領域 (nuclear matrix attachment region,MAR)も挿入されることが望ましい。 なお、これら各断片の間に任意の DNA配列が挿入されていてもよい。
[0019] これらの断片を適宜通常の遺伝子工学の常法に従って結合する。
このようにして得た 2本鎖 DNA断片をウィルス、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレー シヨン法等の方法で適当な細胞に導入する。さらに本構造が染色体又は染色体外因 子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子 (Geneticin、 Neomycin, Hygromyc in, Zeocin, Blasticidin等に対する薬剤耐性遺伝子等)に対応する薬剤で選択し、細 胞株を榭立することが好ましい。この宿主としては、酵母細胞や動物細胞などが挙げ られる力 医薬品としてのタンパク質を生産する場合には、ヒト型に類似した糖鎖をタ ンパク質に付加することができ、不要な免疫反応を誘起する危険性が低いという理由 で、動物細胞が望ましい。動物細胞としては、タンパク質生産に汎用されている CHO (Chinese Hamster Ovary)細胞をはじめ、ヒト、マウス、ラット、その他の動物に由来す るあらゆる糸田胞を使用することができる。
[0020] また本発明の 2本鎖 DNAは、上記のいずれかの 2本鎖 DNAを少なくとも 2つ、好ま しくは 2〜5、より好ましくは 2に分割してなる 1セットの 2本鎖 DNA断片であって、該 断片はその両端にそれぞれ、宿主の染色体又は染色体外因子の部分配列から成る 少なくとも 50bp、好ましくは 500〜 lKbpの塩基配列力も成る相同的組換え用 2本鎖 DNA断片を有するものであってもよい。この相同的組換え用 2本鎖 DNA断片は、そ の相同的組換えによって、宿主の染色体又は染色体外因子上に上記 2本鎖 DNAを 形成することができる。
この複製開始点は該宿主の染色体又は染色体外因子の複製開始点でもよいし外 来のものでもよい。
また、染色体外因子とは、宿主細胞内で複製可能なプラスミド、ウィルス由来配列、 宿主染色体部分断片、人工染色体をいう。
[0021] このような 1セットの 2本鎖 DNA断片として、例えば以下のような例が挙げられる。
(1) e-a-A-b- fで表される 2本鎖 DNA、及び g— c— B—d— hで表される 2本鎖 DNA
( 2) e— a— A— fで表される 2本鎖 DNA、及び g—b— c— B—d— hで表される 2本鎖 DNA
( 3) e— a— fで表される 2本鎖 DNA、及び g—A—b— c— B—d— hで表される 2本鎖 DNA
(4) e-a-A-b-c- fで表される 2本鎖 DNA、及び g— B— d— hで表される 2本鎖 DNA
(5) e-a-A-b-c-B- fで表される 2本鎖 DNA、及び g— d— hで表される 2本鎖 DNA (6) e— a— A— b— B— fで表される 2本鎖 DNA、及び g— d— hで表される 2本鎖 DN A
( 7) e— a— A— fで表される 2本鎖 DN A、及び g— B— d— hで表される 2本鎖 DNA
(8) e— a— fで表される 2本鎖 DNA、及び g—A—b— B— d— hで表される 2本鎖 DN A
などでもよい。
[0022] これらにおいて、 a〜d、 A、 Bは上記と同様である。但し、（6)〜（9)については dは aと同方向の同一標的配列を表す。
e〜hは、それぞれ細胞染色体又は染色体外因子上に e、 f、複製開始点、 g、 hの順 に（これらの間に任意に配列が挿入されていてもよい。また複製開始点又はその一 部力 又は gに含まれていてもよい。）並ぶような少なくとも 50bp、好ましくは 500〜： LK bpの塩基配列から成る 2本鎖 DNA断片を表す。
これらの断片を上記と同様に結合する。
[0023] このようにして得た少なくとも 2つの 2本鎖 DNA断片をウィルス、リポフエクシヨン法、 エレクト口ポレーシヨン法等の方法で適当な細胞に導入する。さらに本構造が染色体 又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子 (Genetidn、 Neo mycin、 Hygromycin, Zeocin、 Blasticidin等に対する薬剤而性遺伝子等)に対応する 薬剤で選択し、細胞株を榭立することが好ましい。この宿主としては、酵母細胞や動 物細胞などが挙げられる力 医薬品としてのタンパク質を生産する場合には、ヒト型に 類似した糖鎖をタンパク質に付加することができ、不要な免疫反応を誘起する危険 性が低いという理由で、動物細胞が望ましい。
e〜hがその順に並ぶことにより、これらが宿主の染色体又は染色体外因子の相当 する部分と相同的糸且換えを起こすことにより、宿主の染色体又は染色体外因子上に 上記と同様の構造が配置される。
[0024] 以上のようにして得られた形質転換細胞に部位特異的組換え酵素を作用させる。
このとき、細胞周期が複製期 (S期)にある細胞の割合が多いことが望ましいため、盛ん に増殖し細胞周期が進行している状態の細胞か、又は S期に進入する時期に細胞周 期を同調させた細胞に部位特異的組換え酵素を作用させることが望ましい。 [0025] 前記部位特異的組換え酵素を作用させる方法として例えば、以下の方法が挙げら れる。
(1)部位特異的組換え酵素を発現させるよう構成したプラスミドを導入する 宿主細胞で機能するプロモーター配列の下流に、部位特異的組換え酵素をコード した遺伝子を接続した構造を各種発現ベクターに挿入する。これをリボフヱクシヨン法 、エレクト口ポレーシヨン法等の方法で上述の形質転換細胞に導入する。ここで複製 が活発に行われている状態で部位特異的組換え酵素を作用させることを可能にする ために、誘導発現可能なプロモーターを用いることが好ま 、。
[0026] (2)前記形質転換体をさらに部位特異的組換え酵素を発現させるように形質転換す る
宿主細胞で機能するプロモーター配列の下流に、部位特異的組換え酵素をコード した遺伝子を接続した断片、本構造が染色体又は染色体外因子上に組み込まれた 細胞を選択するための遺伝子（Geneticin、 Neomycin, Hygromycin, Zeocin、 Blasticid in等に対する薬剤耐性遺伝子等の ヽずれか)を含む構造を構築し、これをリボフエタ シヨン法、エレクト口ポレーシヨン法等の方法で上述の形質転換細胞に導入する。こ のとき染色体又は染色体外因子への組込み効率を高めるため、導入する構造は線 状ィ匕しておくことが望まし 、。またここで複製が活発に行われて 、る状態で部位特異 的組換え酵素を作用させることを可能にするために、誘導発現可能なプロモーター を用いることが好ましい。
[0027] (3)直接部位特異的組換え酵素のたんぱく質を導入する
部位特異的組換え酵素を大量発現させて精製したものを準備し、これを市販のタン ノ ク質導入試薬 (例、 Targeting System社、 Profect、 Genlantis社、 BioPORTER Protei n Delivery Regient)等を用いて上述の形質転換細胞に導入する。ここで複製が活発 に行われている状態で部位特異的組換え酵素を作用させるために、盛んに増殖し細 胞周期が進行している状態の細胞か、又は S期に進入する時期に細胞周期を同調さ せた細胞に部位特異的組換え酵素を導入することが望ましい
[0028] 部位特異的組換え酵素を作用させる時期は、複製が開始されて一方の複製フォー クが 2つの第 1の標的配列の間にあり、かつもう一方の複製フォークが 2つの第 1の標 的配列の間にある必要がある（図 2 (b) )。しかし用意した細胞で全てこのように厳密 な時期に部位特異的組換え酵素を作用させる必要はない。というのは、実際多くの 細胞において複製は様々な時間で行われているため、このような状態にあるのがそ の中の一部の細胞であればょ 、からである。たまたま複製フォークが上記のような条 件にある細胞のみ遺伝子が爆発的に複製されることになるが、それが用意した細胞 の一部であったとしても増幅のためにはそれで十分である力 である。
[0029] 以上のようにして増幅を誘導するが、増幅マーカー遺伝子（Dihydrofolate reductas e (DHFR)、 Glutamine synthetase (GS)、 Aspartate transcarbamylase (し AD)、 Metallot hionein (MT)、 Adenosine deaminase (ADA)、 Adenylate deaminase (AMPD1,2)、 UMP synthetase^ P- glycoprotein (P- gp)ゝ Asparagine synthetase (AS)、 Ornithine decarbox ylase (ODC)等）に対応する薬剤で選択を行うことが好ましい。このようにして目的遺 伝子の発現量が高い細胞株を選別し、この細胞を培養し、その培地若しくはその上 清から、又はこれらを精製することにより、目的の増幅遺伝子がコードするタンパク質 を大量に製造することができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
実施例 1
[0030] 本実施例では、増幅のための構造 (図 3)を構成した。
まず、互いに逆方向の一対の ΙοχΡ配列、増幅選択マーカー遺伝子 leu2d、 TRP1遺 伝子を含む DNA断片構造 1 (テロメァ側の構造）（配列番号 1、この 1-34は ΙοχΡ配列、 36- 1988は増幅マーカー遺伝子 leu2d、 1993- 2845(相補鎖)は TRP1遺伝子、 5699-57 32は逆方向の ΙοχΡ配列である。）を構成した。
[0031] この DNA断片構造 1の上流側に第 VI染色体 (Genebank Accession No. NC— 001138) の塩基配列 263177-264016 (配列番号 3)の PCR断片を、下流側に同じく 264017-264 685 (配列番号 4)の PCR断片を接続した断片を作成し、この断片により Frozen- EZ Ye ast Transformation II(ZYMO RESEARCH社)を用いて宿主酵母細胞株の形質転換を 行った。 TRP1マーカー遺伝子の働きにより、トリブトファンを含まない寒天培地上でコ 口-一を形成できる細胞を選択し、その染色体構造を解析して、 ΙοχΡ対で挟まれた構 造が挿入された細胞株を確立した。
[0032] 次に、互いに逆方向の一対の loxm2配列、増幅選択マーカー遺伝子 leu2d、 LYS5 遺伝子を含む DNA断片構造 2 (セントロメァ側の構造）（配列番号 2、この 1-34は loxm 2配列、 3936-5888(相補鎖)は増幅マーカー遺伝子 leu2d、 2891-3930は LYS5遺伝子 、 5890 -5923は逆方向の loxm2配列である。）を構成した。
[0033] この DNA断片構造 2の上流側に塩基配列 257941-258821 (配列番号 5)の PCR断片 を、下流側に 258822-259719 (配列番号 6)の PCR断片を接続した断片を作成し、この 断片により上記の DNA断片構造 1 (ΙοχΡ対で挟まれた構造)をもつ細胞に同様に形質 転換を行った。 LYS5マーカー遺伝子の働きにより、リジンを含まない寒天培地上でコ 口-一を形成できる細胞を選択し、その染色体構造を解析して、 ΙοχΡ対で挟まれた構 造と loxm2対で挟まれた構造とが挿入された細胞株を確立した。
なお、増幅選択マーカー遺伝子 leu2dは、プロモーター配列の大部分を欠くため発 現量が非常に低ぐこれは多コピーに増幅した時のみ、ロイシン要求性を相補するこ とがでさる。
[0034] 以上の 2つの構造の間に位置する領域 (塩基配列 258822-264016)には複製開始に 関わるタンパク質 Orelが結合することが観察されており（Nature, 424: 1078, 2003)、 複製開始点として機能して 、ると考えられる。またこの領域には出芽酵母 Saccharomy ces cerevisiaeでの複製開始点のコンセンサス配列である WTTTAYRTTTWB (配列番 号 7)が含まれている (塩基配列 258889-258900)。
実施例 2
[0035] 本実施例では、実施例 1で得た構造 (図 3)を出芽酵母第 VI染色体に挿入し、 Cre遺 伝子を発現させて double rolling-circle replication (DRCR)を誘導した。
実施例 1で得られた出芽酵母細胞株に、 Cre遺伝子 (配列番号 8)が GALプロモー ター下流に接続されたプラスミド（図 4、 pSH47、 Genebank Accession No. AF298782, University of Wasmngton、 Yeast Resource Centerより授 を Frozen- EZ Yeast Tran sformation II (ZYMO RESEARCH社）を用いて導入した。さらに URA3マーカー遺伝 子の働きにより、ゥラシルを含まない寒天培地上でコロニーを形成できる細胞を選択 した。 [0036] 上記で得られたプラスミドが導入された Ura+細胞の液体培養に、 Cre発現を誘導す るガラクトース又は対照として Cre発現を抑制するグルコースを添加し、 3時間培養し た。ロイシンを欠くグルコース寒天培地にこれらの細胞を塗布し、出現した Leu+コ口- 一を計数した。得られた Leu+コロニーの細胞をさらに培養し、低融点ァガロース内で 染色体 DNAを調整した。
この染色体 DNAを Pulsed- field gel electrophoresis (PFGE、 BIO- RAD社、 CHEF Ma pper XA、 Auto Algorithm, range: 220-500kb)により分離し、又は制限酵素 Sma Iによ つて消化された DNAを Field- inversion gel electrophoresis (FIGE、 BIO- RAD社、 CHE F Mapper XA、 Auto Algorithm, range: 3- 50kb)により分離し、サザンブロット法にて 解析した。
[0037] 結 その解釈
出現した Leu+コロニーを計数した結果、対照実験 (グルコース添加）に比較して、 Cr e発現を誘導した場合、図 5に示すように、約 7倍に及ぶ大幅なコロニー形成率の上 昇が見られた。これは Creによる糸且換えが増幅に寄与していることを強く示唆している
[0038] 続!、て、 PFGEで分離した染色体 DNAを、 leu2dプローブを用いてサザンブロット法 により構造解析した結果を図 6 (a)に示す。
図 6 (a)から、増幅のための構造を挿入した第 VI染色体が長くなつた増幅産物 (i)と 多コピー化したミニ染色体上 (ii)が検出された。さらに 345kbには leu2断片を含む宿 主細胞株の第 III染色体 (*)、 290〜320kbには増幅のための構造をもつ第 VI染色体（ NS)と僅かに増幅した染色体が見出された。
次に、上記染色体 DNAを制限酵素 (Smal)で消化し、 Smal断片を FIGEで分離した 染色体 DNA断片を、 leu2dプローブを用いてサザンプロット法により構造解析した結 果を図 6 (b)に示す。
[0039] これらの結果力 増幅産物の構造が明らかになった。
染色体上の増幅産物 (i)のうち大きな分子サイズの強 、シグナルを示したクローン（ 図 6(a)(i) #32, 48, 52, 53:黒のレーン）からは約 llKb(10.9, ll.lKb)i:17kb(16.8Kb) の Smal断片が検出された。これらは、図 7に示すように、計画した DRCR増幅に lox配 列間の逆位 (逆方向に再配置)が伴った構造に由来するものであり、少なくとも数十 コピー以上の leu2dを含む高度な反復配列を有していると考えられる。
[0040] 一方、大半のクローン（グレーのレーン）に見られたミニ染色体（図 6G0)は約 6.3kb の Smal増幅断片を形成した。これは、図 8に示すように、増幅のための構造よりテロメ ァ側からの複製と Cre-loxP組換えによる副反応により形成されたもので、多コピーで 存在していると考えられる。
[0041] これら以外には逆位を伴わない染色体上の増幅産物（図 7(a)、 #34, 41, 47)や上記 と類似の副反応による別のミニ染色体（図 9、 #29-31, 49, 56)も見られ、また染色体 上の増幅産物とミニ染色体の両方をもつクローンも多数存在した（#22, 31, 34, 41, 4 7, 58)。なお増幅していない構造からは、宿主細胞株に由来する 2つの Smal断片（図 6(b)の *)以外に、 4つの断片が弱いシグナルを示すことが確認できている（図 6(b)の NSゝ図 10)。
[0042] 以上のように、想定した分子機構が関与すると考えられる高度な増幅反応が観察さ れた（#32, 48, 52, 53)。これは解析したクローンの 1割に見られたことから、全体のコ 口-一形成率 4.4%の 1/10、即ち 0.44%の高頻度で起きていた。
図面の簡単な説明
[0043] [図 1]DRCR反応を示す図である。黒い矢印は複製フォークを表す。
[図 2]部位特異的組換え酵素とその標的配列を用いた増幅開始反応を示す図である 。三角矢印（a〜d)は部位特異的組換え酵素の標的配列（例えば、 ΙοχΡ配列）とその 方向を表し、 Xは複製開始点を表す (以下同様)。 x〜z及び x'〜ζ'は増幅目的遺伝 子を表し、黒い矢印は複製フォークを表す。
[図 3]増幅のための構造を示す図である。 CEN:セントロメァ、 TEL:テロメァ
[図 4]Cre発現のためのプラスミド (pSH47)を示す図である。
[図 5]コロニー形成率を示す図である。 G1 グルコース、 Gal:ガラクトース
[図 6]サザンブロット解析を示す図である。（a)は、 leu2dプローブを用いて、 PFGEで分 離した染色体 DNAを示し、 (b)は、 Smalで消化後 FIGEで分離した染色体 DNAを示す
。 #19〜58は、ガラクトースによる Cre発現誘導後、ロイシンを欠く選択培地に塗布され 出現したコロニーカゝら調整した DNAを示し、 NSは、非選択培地上で培養した対照コロ ニー力 調整した DNAを示し、 Pは宿主細胞株を示す。本実験の PFGE条件では約 6 50kb以上の染色体は分離限界に集中して存在していると思われる。
[図 7]染色体上の増幅産物を示す図である。（a)は、 DRCRにより最初に形成される構 造を示す。 a〜fは制限酵素 Smalの切断部位を表し、数字はその断片長 (kb)を示す。 但し、 d-e切断で生じる 5.3kbの断片は leu2dを含まないため、サザンブロットでは検出 されない。（b)は、 lox間の配列が逆位 (逆方向に再配置)を伴う場合の構造を示す。 a '〜！ ^は、逆位により変化した切断部位を表し、その数字は生じ得る断片長 (kb)を示 す。例えば、 a-b切断によって 10.9kbの断片が生じる力 aを含む領域が逆位を起こし た場合、 a'-b切断で 16.8kbの断片が生じる。同様にして a-b'切断から 5.3kb、 a'_b，切 断から 11. Ikbの断片が生じる。但し、 leu2dを含まない 5.3kbの断片はサザンブロットで は検出されない。
圆 8]ミニ染色体（図 6G0)上の増幅産物を示す図である。テロメァ側からの複製が lox P間の糸且換えにより逆進行して、両端にテロメァをもつミニ染色体 (約 18kb)を形成する 。 Smal切断部位 g〜i、及び逆位により変化しうる切断部位 h'により leu2dを含む断片長 は 6.3kbとなる（g-h'または h-iの断片に由来する。逆位によって位置は変わっても hま たは h 'の!/、ずれかは切れるので g-iと!、う断片はありえな!、。 )o
圆 9]ミニ染色体（図 6G0)上の増幅産物を示す図である。テロメァ側からの複製が lox m2間の組換えにより逆進行して、ミニ染色体 (約 40kb)を形成する。 j〜nは Smal切断部 位、 k'-m'は逆位により変化しうる切断部位を示し、数字は生じ得る断片長 (kb)を示 す。但し、 leu2dを含まない 5.3kbの断片はサザンブロットでは検出されない。
[図 10]増幅して!/ヽな 、構造での Cre組換えの影響を示す図である。各々の lox間の配 列は高頻度に逆位を生じる。 o〜rは Smal切断部位、 p'、 q'は逆位により変化しうる切 断部位を示し、数字は生じ得る断片長 (kb)を示す。但し、 leu2dを含まない 5.3kbの断 片はサザンブロットでは検出されない。

Claims

請求の範囲
[1] a— b— c d又は a— c b d (式中、 a及び bの一方は部位特異的組換え酵素の第 1の標的配列力 成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 1の標的配列を逆方向に配列さ せた 2本鎖 DNA断片を表し、 c及び dの一方は部位特異的組換え酵素の第 2の標的 配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 2の標的配列を逆方向に配列させた 2本 鎖 DNA断片を表し、 a d間のいずれかに複製開始点と少なくともひとつの増幅目 的遺伝子が挿入される。但し、これらの間に任意の DNA配列が挿入されていてもよ い。）で表される 2本鎖 DNA。
[2] 前記 bが cを兼ね、 a b— d (式中、 dは aと同方向の同一標的配列であり、その他は 上記定義と同様を表す。 )で表される請求項 1に記載の 2本鎖 DNA。
[3] a— b— X— c d又は a— c— X— b d (式中、 Xが複製開始点を表し、その他は上記 定義と同様を表す。 )で表される請求項 1に記載の 2本鎖 DNA。
[4] a— A— b— X— c— B d又は a— A— c— X— b— B d (式中、 A及び Bの少なくとも 一方が増幅目的遺伝子を表し、 a、 b、 X、 c及び dは前記と同様を表す。但し、これら の間に任意の DNA配列が挿入されていてもよい。）で表される請求項 3に記載の 2 本鎖 DNA。
[5] 前記部位特異的組換え酵素の第 1の標的配列と第 2の標的配列とが異なる請求項 1 、 3又は 4に記載の 2本鎖 DNA。
[6] 前記部位特異的組換え酵素が Creリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1 の標的配列及び第 2の標的配列がそれぞれ 1οχΡ、 1οχ511、 1οχ5171、 1οχ2272, 1οχ237 2、 loxm2、 loxFAS, 1οχ71、 lox66、及びこれらの変異体から成る群から選択され、前記 部位特異的組換え酵素が Hpリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1の標 的配列及び第 2の標的配列がそれぞれ FRT、 F3、 F5、 FRT mutant -10、 FRT mutant +10、及びこれらの変異体から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素が p WC31インテグラーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1の標的配列及び第 2の標的 配列がそれぞれ attB、 attP及びこれらの変異体力も選択される請求項 1〜5の 、ずれ か一項に記載の 2本鎖 DNA。
[7] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の 2本鎖 DNAを含む組換えベクター。
[8] 請求項 1〜6の ヽずれか一項に記載の 2本鎖 DNAが導入された形質転換体。
[9] 宿主が動物細胞である請求項 8に記載の形質転換体。
[10] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の 2本鎖 DNAを少なくとも 2つに分割してなる 1 セットの 2本鎖 DNA断片であって、該断片はその両端にそれぞれ少なくとも 50bpの 塩基配列から成る相同的組換え用 2本鎖 DNA断片を有し、この相同的組換え用 2 本鎖 DNA断片は、その相同的組換えによって、宿主の染色体又は染色体外因子上 に請求項 1〜6のいずれか一項に記載の 2本鎖 DNAを形成することのできる該宿主 の染色体又は染色体外因子の部分配列力 成ることを特徴とする 1セットの 2本鎖 D NA断片 (但し、前記複製開始点は該宿主の複製開始点でもよ!/、し外来のものでもよ い。）。
[11] e— a— A— b— fで表される 2本鎖 DNA、及び g— c B d hで表される 2本鎖 DN A力も成る請求項 10に記載の 1セットの 2本鎖 DNA (式中、 a及び bの一方は部位特 異的組換え酵素の第 1の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 1の標的 配列を逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 c及び dの一方は部位特異的組 換え酵素の第 2の標的配列から成る 2本鎖 DNA断片、他方は該第 2の標的配列を 逆方向に配列させた 2本鎖 DNA断片を表し、 e〜hは、それぞれ当該 1セットの 2本 鎖 DNAの導入を想定する細胞染色体又は染色体外因子上に e、 f、該細胞染色体 又は染色体外因子の複製開始点、 g、 hの順に並ぶような少なくとも 50bpの塩基配 列から成る 2本鎖 DNA断片を表し、 A及び Bの少なくとも一方が増幅目的遺伝子を 表す。但し、該複製開始点又はその一部力 ¾又は gに含まれていてもよぐこれらの間 に任意の DNA配列が挿入されていてもよい。 ) o
[12] 該部位特異的組換え酵素の第 1の標的配列と第 2の標的配列とが異なる請求項 10 又は 11に記載の 2本鎖 DNA。
[13] 前記部位特異的組換え酵素が Creリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1 の標的配列及び第 2の標的配列がそれぞれ 1οχΡ、 1οχ511、 1οχ5171、 1οχ2272, 1οχ237 2、 loxm2、 loxFAS, 1οχ71、 lox66、及びこれらの変異体から成る群から選択され、前記 部位特異的組換え酵素が Hpリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1の標 的配列及び第 2の標的配列がそれぞれ FRT、 F3、 F5、 FRT mutant -10、 FRT mutant +10、及びこれらの変異体から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素が p WC31インテグラーゼ又はその誘導体の場合、前記第 1の標的配列及び第 2の標的 配列がそれぞれ attB、 attP及びこれらの変異体力 選択される請求項 10〜 12の!ヽ ずれか一項に記載の 2本鎖 DNA。
[14] 請求項 10〜13のいずれか一項に記載の 2種の 2本鎖 DNAをそれぞれ含む 1セット の組換えベクター。
[15] 請求項 10〜13のいずれか一項に記載の 2種の 2本鎖 DNAが導入された形質転換 体であって、前記複製開始点がその宿主の染色体又は染色体外因子上に存在する 形質転換体。
[16] 宿主が動物細胞である請求項 15に記載の形質転換体。
[17] 請求項 8、 9, 15又は 16に記載の形質転換体を用意する段階、及びこれに部位特異 的組換え酵素を作用させる段階からなる、前記増幅目的遺伝子を増幅する遺伝子 増幅法。
[18] 前記部位特異的組換え酵素を作用させる方法が下記の!/ヽずれかである請求項 17に 記載の方法。
(1)部位特異的組換え酵素を発現させるよう構成したプラスミドを導入する
(2)前記形質転換体をさらに部位特異的組換え酵素を発現させるように形質転換す る
(3)直接部位特異的組換え酵素のたんぱく質を導入する
[19] 請求項 17又は 18に記載の方法により得られた形質転換細胞を培養する段階から成 る、増幅目的遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
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