JP4821012B2

JP4821012B2 - 遺伝子増幅法

Info

Publication number: JP4821012B2
Application number: JP2007546357A
Authority: JP
Inventors: 嵩堀内; 孝明渡邊
Original assignee: Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Current assignee: Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2026-07-18
Also published as: EP1967585A1; CN101313064B; US20130266988A1; JPWO2007060764A1; US9464307B2; WO2007060764A1; EP1967585B1; US20170037428A1; US20090148895A1; EP1967585A4; CN101313064A

Description

この発明は、遺伝子を高速で増幅する方法及び増幅された遺伝子を用いてタンパク質を製造する方法に関する。

遺伝子増幅を人為的に起こさせるために動物培養細胞を用いて行う場合（特許文献１等）、（i）時間が掛かる（半年〜１年）、（ii）増幅していないクローンも多い、（iii）増幅機構が未解明で経験に頼っている、等の問題点がある。一方、酵母を用いた遺伝子増幅の系は無く、通常そのためにはプラスミドが用いられるが、一定以上のコピー数の増加は困難である。
本発明のシステムは、BIR(Break-Induced-Rep1ication）と呼ばれる生物が有する能力により誘導されるDRCR(double rolling-circle replication)と呼ばれる複製反応に基礎を置いたものである（非特許文献１、２、特許文献２）。これは染色体が切断されると、その切られた染色体は自分と同じ配列を見つけ、その相同性を利用してそこに侵入し、複製点を構築し、複製を開始することで、自分を救済すると考えられる。生物はすべてこの能力を有すると考えられる。
なお、自然の環状DNAにおいて、組換えによってDRCRが起こることが報告されている（非特許文献３）。

特表平8-504585 (WO94/14968) WO2005/061703 PNAS, vol.98, no.15, 8255-8262 (July 17, 2001) Genes Dev 12, 3831-3842 (1998) Cell. 1986 Aug 15;46(4):541-550.

本発明は、高速で遺伝子を増幅するために特別に構成された２本鎖ＤＮＡ及びこれを用いた遺伝子増幅法並びにたんぱく質の合成法を提供する。本発明は、人為的に増幅系を完全に構築していること、同調して増幅できること、増幅期間が短い（恐らく１世代）こと、増幅機構が明らかなこと等の特徴を有している。

本発明の増幅系はdouble rolling-circle replication（DRCR）と呼ばれる複製反応を利用している。これは１回の細胞周期内に爆発的に増幅させることが可能で、組換え等により反応が終結して増幅産物が細胞内で維持されると考えられる。本発明者らは、このDRCRを効率よく誘導するためにCre-lox系などの部位特異的組換え酵素及びその標的配列を利用した。即ち、発明者らは、図３に示す構造の複製ユニットを酵母内に構築し、複製フォークが一対のlox配列間を進行する際に部位特異的組換え酵素Creリコンビナーゼ（以下「Cre」という。）により起こる組換えを利用して、DRCR誘導を起こすことに成功し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、ａ−ｂ−ｃ−ｄ又はａ−ｃ−ｂ−ｄ（式中、ａ及びｂの一方は部位特異的組換え酵素の第１の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第１の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｃ及びｄの一方は部位特異的組換え酵素の第２の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第２の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ａ−ｄ間のいずれかに複製開始点と少なくともひとつの増幅目的遺伝子が挿入される。但し、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。）で表される２本鎖ＤＮＡである。
本発明は、またこの２本鎖ＤＮＡを含む組換えベクターであり、更にこの２本鎖ＤＮＡが導入された形質転換体である。

また本発明は、ｅ−ａ−Ａ−ｂ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｃ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡから成る１セットの２本鎖ＤＮＡ（式中、ａ及びｂの一方は部位特異的組換え酵素の第１の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第１の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｃ及びｄの一方は部位特異的組換え酵素の第２の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第２の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｅ〜ｈは、それぞれ当該１セットの２本鎖ＤＮＡの導入を想定する細胞染色体又は染色体外因子上にｅ、ｆ、該細胞染色体又は染色体外因子の複製開始点、ｇ、ｈの順に並ぶような少なくとも５０ｂｐの塩基配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片（又は領域）を表し、Ａ及びＢの少なくとも一方が増幅目的遺伝子を表す。但し、該複製開始点又はその一部がｆ又はｇに含まれていてもよく、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。）である。
本発明は、この２種の２本鎖ＤＮＡをそれぞれ含む１セットの組換えベクターであり、さらに、この２種の２本鎖ＤＮＡが導入された形質転換体であって、前記複製開始点がその宿主の染色体又は染色体外因子上に存在する形質転換体である。

また、本発明は、これらのいずれかの形質転換体を用意する段階、及びこれに部位特異的組換え酵素を作用させる段階からなる、前記増幅目的遺伝子を増幅する遺伝子増幅法であり、さらに、この方法により得られた形質転換細胞を培養する段階から成る、増幅目的遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法である。

本発明の増幅系は、高性能タンパク質生産系を確立するために優れた特徴を備えている。DRCRは１回の細胞周期において高速に増幅可能であり、増幅機構が明解であるため目的遺伝子の確実な増幅が期待できる。また現時点では生物種が異なるものの、Cre-lox増幅系は、現行の動物細胞の系の10〜100倍以上の頻度で高度な増幅産物を形成できる。さらに本増幅系は本来薬剤選択しても増幅が起きない初代培養の通常細胞にも適用可能性であり、通常細胞を標的とした遺伝子治療に遺伝子増幅を応用し導入遺伝子の発現を強化・持続化できる。

本発明の遺伝子増幅法は、増幅機構として、出芽酵母と動物細胞の両方で機能すると考えられ、高速な増幅が可能なdouble rolling-circle replication (DRCR)を利用している。この増幅系は、図１に示すように、２つの複製フォークが環状のＤＮＡを連続的に複製する反応である。まずフォーク（１）がｗを、フォーク（２）がｙを複製し((a),(b),(c))、続いてフォーク（１）がｘを、フォーク（２）がｚを複製する((c),(d),(e))。こうして一方のフォークのための鋳型が他方のフォークによって次々と合成されるので、複製は延々と続く。増幅が進行した後、組換え反応等によって中央のサークル構造が除かれて、反応が終結すると考えられる(f)。

本発明の増幅系では、DRCRを誘導するために、動物細胞でも効率よく機能することが知られている部位特異的組換え反応を利用した系を考案した。これは複製フォークが１組の標的配列間を通過中に組換えがおこるとフォークの逆進行が起こる反応を２つ組合わせて利用している。
即ち、本発明の増幅系では、図２(a)のように構成された増幅ユニットにおいて複製が開始された後、黒い矢印で表す複製フォークが２組の部位特異的組換え酵素の標的配列（lox配列）間を通過する際に、親DNA鎖xと新生DNA鎖yに位置する標的配列（例えば、loxP配列）間、及び親DNA鎖x'と新生DNA鎖y'に位置する標的配列（例えば、loxP配列）間で部位特異的組換え酵素(例えば、Cre)による組換えを起こす(ｂ)。組換えによってxとy鎖が入れ替わりx'とy'鎖も入れ替わると、一方のフォークはx鎖からy、z鎖を合成し、さらにもう一方のフォークはx'鎖からy'、z'鎖を合成する(ｃ)。これによりフォークは逆進行し、複製済みのDNA鎖を再度複製する(ｄ)。これら２つの反応によりDRCRが誘導される。

本発明で用いる２本鎖ＤＮＡは、ａ−ｂ−ｃ−ｄ又はａ−ｃ−ｂ−ｄ、好ましくはａ−ｂ−ｃ−ｄで表される。
ａ及びｂの一方は部位特異的組換え酵素の第１の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第１の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表す。
ｃ及びｄの一方は部位特異的組換え酵素の第２の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第２の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表す。
第１の標的配列と第２の標的配列は同じであってもよいが、異なることが好ましい。
また、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。

このｂがｃを兼ね、ａ−ｂ−ｄ（この場合、ｄはａと同方向の同一標的配列を表す。）で表されてもよい。
また、この配列は、ａ−ｂ−Ｘ−ｃ−ｄ又はａ−ｃ−Ｘ−ｂ−ｄ、好ましくはａ−ｂ−Ｘ−ｃ−ｄで表されてもよい。
ここで、Ｘは複製開始点を表す。複製開始点は、Dihydrofolate reductase (DHFR)遺伝子の3'下流域に存在するOri beta、EBVのlatent origin (OriP)、c-myc遺伝子付近のorigin等が候補となるが、動物細胞での複製開始活性があれば何でもよい。
更に、この配列は、ａ−Ａ−ｂ−Ｘ−ｃ−Ｂ−ｄ又はａ−Ａ−ｃ−Ｘ−ｂ−Ｂ−ｄ、好ましくはａ−Ａ−ｂ−Ｘ−ｃ−Ｂ−ｄで表されてもよい。
ここで、Ａ及びＢの少なくとも一方は増幅目的遺伝子を表す。増幅遺伝子を複数用いる場合には、それらは同じであっても異なってもよい。
これらにおいても、上記（図２）で説明したDRCRが同様に誘導される。

部位特異的組換え酵素は二つの短かなコンセンサスＤＮＡ配列（標的配列）間の組換えを触媒する。この部位特異的組換え酵素は、標的配列の間に部位特異的組換えを引き起こし、それらの標的部位を更に変更させたり、組み込まれた迫伝子に変更を加えることが出来る。
本発明では以下の部位特異的組換え酵素及びこの酵素に特異的な標的配列を用いることができる（例えば、Developmental Cell, Vol.6, 7-28, January, 2004等参照のこと）。

（１）Ｃｒｅ組換え酵素（リコンビナーゼ）又はその誘導体
細菌ウイルスＰ１のＣｒｅ組換え酵素は、マウスにおける遺伝子導入や遺伝子破壌に最も広く用いられている。Ｃｒｅタンパクは二つの３４塩基の長さの１ｏｘＰ認識サイト間の組換えを触媒する。この１ｏｘＰの配列は、８塩基の核となる配列を二つの１３塩基のパリンドローム配列が挟んだユニークな構造を取っている。この８塩基の非対象陸の配列は、１ｏｘＰサイトに方向性を与えている。Ｃｒｅ酵素による１ｏｘＰサイト間のＤＮＡ鎖の切断と組換えは、核配列の８塩基の最初の塩基の後と最後の塩基の前で起こる。
このＣｒｅ酵素にはアミノ酸置換による誘導体が作られている。誘導体とは、野生型Creリコンビナーゼにアミノ酸置換を導入し機能・性質を変化させた部位特異的組換え酵素や、野生型Creリコンビナーゼ遺伝子の塩基配列に変異を導入してCpG含量、翻訳開始効率に関わるKozak配列、codon-usageを宿主細胞に最適化して発現の効率・量を高めた部位特異的組換え酵素とその遺伝子をいう。Cre酵素には少なくとも29種類の誘導体が今まで作られている。これらは活性が違ったり、異なる標的配列を認識できるようになったりする。またＣｒｅ酵素の認識する標的配列loxについても同様に多数の変異配列が作られている。本発明に於てはこれら全てを用いることができる。
このような標的配列としては、loxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2(m2ともいう。)、loxFAS、lox71及びlox66が挙げられる。
組換え効率は、一般にＬｏｘ配列のどんな変更にも極めて敏感であるが、機能保持の変異が見出されてきた。その場合、同じ配列同士の１ｏｘＰ間では細胞内で効率よく組換えが起こるが、異なる配列同士の間では、組換えの効率は顕著に低下する。

（２）Ｆ１ｐ組み換え酵素（リコンビナーゼ）又はその誘導体
この組み換え酵素は、出芽酵母から取られたＦｌｐ組み換え酵素である。この酵素の活性は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰと同様又は若干劣る。しかし、最近開発された活性型Ｆｌｐ（Ｆ１ｐｅ）はこの酵素の効率が改良され、Ｃｒｅの効率と同等である。３４塩基のコンセンサス組み換え配列はＦＲＴと呼ばれる。ＦＲＴは１ｏｘＰと同じ椿造を有するが、配列は異なる。
誘導体とは、野生型Flpリコンビナーゼにアミノ酸置換を導入し機能・性質を変化させた部位特異的組換え酵素や、野生型Flpリコンビナーゼ遺伝子の塩基配列に変異を導入してCpG含量、翻訳開始効率に関わるKozak配列、codon-usageを宿主細胞に最適化して発現の効率・量を高めた部位特異的組換え酵素とその遺伝子をいう。Flp酵素には少なくとも28種類の誘導体が今まで作られている。
このＦｌｐ酵素とその認識配列にも多くの誘導体が作られている。標的配列としては、FRT、F3、F5、FRT mutant -10及びFRT mutant +10が挙げられる。
Ｆｌｐ酵素は、Ｃｒｅと同じように、ＦＲＴサイトの配列の変化に非常に敏感である。しかし幾つかの変異ＦＲＴサイトは同じ配列のペアであれば、効率よく組換えが起こるものが同定されている。しかし異なる変異ＦＲＴサイト同士や野生型サイトと変異サイト間の組換えは殆ど起こらない。

（３）PhiC31インテグラーゼ又はその誘導体
PhiC31 インテグラーゼはストレストマイセス菌の細菌ウイルス由来でヒトの細胞内で機能する。
この標的配列としては、attP及びattBが挙げられる。
この系は、attPP'とattBB'の間のttgの３塩基で組換えを起こす酵素である。このttgの組換え配列の両側はユニークな配列であるため、組換えの後には、最初の認識配列とは違った配列となる。そのため、もはやこの酵素の認識配列は無くなってしまう。そのためこの酵素の組換えは一回切りである。
PhiC31 インテグラーゼ系の誘導体とは、野生型PhiC31インテグラーゼにアミノ酸置換を導入し機能・性質を変化させた部位特異的組換え酵素や、野生型PhiC31インテグラーゼ遺伝子の塩基配列に変異を導入してCpG含量、翻訳開始効率に関わるKozak配列、codon-usageを宿主細胞に最適化して発現の効率・量を高めた部位特異的組換え酵素とその遺伝子をいう。
これらの部位特異的組換え酵素とその標的配列の中で、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系が好ましい。

さらにこの構造内の任意の位置に、発現させたい目的の遺伝子、本構造が染色体又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子(Geneticin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin、Blasticidin等に対する薬剤耐性遺伝子等)、遺伝子増幅を起こした細胞を選択するためのマーカー遺伝子(Dihydrofolate reductase (DHFR)、Glutamine synthetase (GS)、Aspartate transcarbamylase (CAD)、Metallothionein (MT)、Adenosine deaminase (ADA)、Adenylate deaminase (AMPD1,2)、UMP synthetase、P-glycoprotein (P-gp)、Asparagine synthetase (AS)、Ornithine decarboxylase (ODC)等)を挿入してもよい。動物細胞での増幅に重要であると考えられている核マトリックス付着領域(nuclear matrix attachment region,MAR)も挿入されることが望ましい。
なお、これら各断片の間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。

これらの断片を適宜通常の遺伝子工学の常法に従って結合する。
このようにして得た２本鎖ＤＮＡ断片をウイルス、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等の方法で適当な細胞に導入する。さらに本構造が染色体又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子(Geneticin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin、Blasticidin等に対する薬剤耐性遺伝子等)に対応する薬剤で選択し、細胞株を樹立することが好ましい。この宿主としては、酵母細胞や動物細胞などが挙げられるが、医薬品としてのタンパク質を生産する場合には、ヒト型に類似した糖鎖をタンパク質に付加することができ、不要な免疫反応を誘起する危険性が低いという理由で、動物細胞が望ましい。動物細胞としては、タンパク質生産に汎用されているCHO (Chinese Hamster Ovary)細胞をはじめ、ヒト、マウス、ラット、その他の動物に由来するあらゆる細胞を使用することができる。

また本発明の２本鎖ＤＮＡは、上記のいずれかの２本鎖ＤＮＡを少なくとも２つ、好ましくは２〜５、より好ましくは２に分割してなる１セットの２本鎖ＤＮＡ断片であって、該断片はその両端にそれぞれ、宿主の染色体又は染色体外因子の部分配列から成る少なくとも５０ｂｐ、好ましくは５００〜１Ｋｂｐの塩基配列から成る相同的組換え用２本鎖ＤＮＡ断片（又は領域）を有するものであってもよい。この相同的組換え用２本鎖ＤＮＡ断片（又は領域）は、その相同的組換えによって、宿主の染色体又は染色体外因子上に上記２本鎖ＤＮＡを形成することができる。
この複製開始点は該宿主の染色体又は染色体外因子の複製開始点でもよいし外来のものでもよい。
また、染色体外因子とは、宿主細胞内で複製可能なプラスミド、ウイルス由来配列、宿主染色体部分断片、人工染色体をいう。

このような１セットの２本鎖ＤＮＡ断片として、例えば以下のような例が挙げられる。
（１）ｅ−ａ−Ａ−ｂ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｃ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（２）ｅ−ａ−Ａ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｂ−ｃ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（３）ｅ−ａ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−Ａ−ｂ−ｃ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（４）ｅ−ａ−Ａ−ｂ−ｃ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（５）ｅ−ａ−Ａ−ｂ−ｃ−Ｂ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（６）ｅ−ａ−Ａ−ｂ−Ｂ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（７）ｅ−ａ−Ａ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
（８）ｅ−ａ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−Ａ−ｂ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡ
などでもよい。

これらにおいて、ａ〜ｄ、Ａ、Ｂは上記と同様である。但し、（６）〜（８）についてはｄはａと同方向の同一標的配列を表す。
ｅ〜ｈは、それぞれ細胞染色体又は染色体外因子上にｅ、ｆ、複製開始点、ｇ、ｈの順に（これらの間に任意に配列が挿入されていてもよい。また複製開始点又はその一部がｆ又はｇに含まれていてもよい。）並ぶような少なくとも５０ｂｐ、好ましくは５００〜１Ｋｂｐの塩基配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片（又は領域）を表す。
これらの断片を上記と同様に結合する。

このようにして得た少なくとも２つの２本鎖ＤＮＡ断片をウイルス、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等の方法で適当な細胞に導入する。さらに本構造が染色体又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子(Geneticin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin、Blasticidin等に対する薬剤耐性遺伝子等)に対応する薬剤で選択し、細胞株を樹立することが好ましい。この宿主としては、酵母細胞や動物細胞などが挙げられるが、医薬品としてのタンパク質を生産する場合には、ヒト型に類似した糖鎖をタンパク質に付加することができ、不要な免疫反応を誘起する危険性が低いという理由で、動物細胞が望ましい。
ｅ〜ｈがその順に並ぶことにより、これらが宿主の染色体又は染色体外因子の相当する部分と相同的組換えを起こすことにより、宿主の染色体又は染色体外因子上に上記と同様の構造が配置される。

以上のようにして得られた形質転換細胞に部位特異的組換え酵素を作用させる。このとき、細胞周期が複製期(S期)にある細胞の割合が多いことが望ましいため、盛んに増殖し細胞周期が進行している状態の細胞か、又はS期に進入する時期に細胞周期を同調させた細胞に部位特異的組換え酵素を作用させることが望ましい。

前記部位特異的組換え酵素を作用させる方法として例えば、以下の方法が挙げられる。
（１）部位特異的組換え酵素を発現させるよう構成したプラスミドを導入する
宿主細胞で機能するプロモーター配列の下流に、部位特異的組換え酵素をコードした遺伝子を接続した構造を各種発現ベクターに挿入する。これをリポフェクション法、エレクトロポレーション法等の方法で上述の形質転換細胞に導入する。ここで複製が活発に行われている状態で部位特異的組換え酵素を作用させることを可能にするために、誘導発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。

（２）前記形質転換体をさらに部位特異的組換え酵素を発現させるように形質転換する
宿主細胞で機能するプロモーター配列の下流に、部位特異的組換え酵素をコードした遺伝子を接続した断片、本構造が染色体又は染色体外因子上に組み込まれた細胞を選択するための遺伝子（Geneticin、Neomycin、Hygromycin、Zeocin、Blasticidin等に対する薬剤耐性遺伝子等のいずれか）を含む構造を構築し、これをリポフェクション法、エレクトロポレーション法等の方法で上述の形質転換細胞に導入する。このとき染色体又は染色体外因子への組込み効率を高めるため、導入する構造は線状化しておくことが望ましい。またここで複製が活発に行われている状態で部位特異的組換え酵素を作用させることを可能にするために、誘導発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。

（３）直接部位特異的組換え酵素のたんぱく質を導入する
部位特異的組換え酵素を大量発現させて精製したものを準備し、これを市販のタンパク質導入試薬(例、Targeting System社、Profect、Genlantis社、BioPORTER Protein Delivery Regient)等を用いて上述の形質転換細胞に導入する。ここで複製が活発に行われている状態で部位特異的組換え酵素を作用させるために、盛んに増殖し細胞周期が進行している状態の細胞か、又はS期に進入する時期に細胞周期を同調させた細胞に部位特異的組換え酵素を導入することが望ましい

部位特異的組換え酵素を作用させる時期は、複製が開始されて一方の複製フォークが２つの第１の標的配列の間にあり、かつもう一方の複製フォークが２つの第２の標的配列の間にある必要がある（図２（ｂ））。しかし用意した細胞で全てこのように厳密な時期に部位特異的組換え酵素を作用させる必要はない。というのは、実際多くの細胞において複製は様々な時間で行われているため、このような状態にあるのがその中の一部の細胞であればよいからである。たまたま複製フォークが上記のような条件にある細胞のみ遺伝子が爆発的に複製されることになるが、それが用意した細胞の一部であったとしても増幅のためにはそれで十分であるからである。

以上のようにして増幅を誘導するが、増幅マーカー遺伝子（Dihydrofolate reductase (DHFR)、Glutamine synthetase (GS)、Aspartate transcarbamylase (CAD)、Metallothionein (MT)、Adenosine deaminase (ADA)、Adenylate deaminase (AMPD1,2)、UMP synthetase、P-glycoprotein (P-gp)、Asparagine synthetase (AS)、Ornithine decarboxylase (ODC)等）に対応する薬剤で選択を行うことが好ましい。このようにして目的遺伝子の発現量が高い細胞株を選別し、この細胞を培養し、その培地若しくはその上清から、又はこれらを精製することにより、目的の増幅遺伝子がコードするタンパク質を大量に製造することができる。

以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。

本実施例では、増幅のための構造(図３)を構成した。
まず、互いに逆方向の一対のloxP配列、増幅選択マーカー遺伝子leu2d、TRP１遺伝子を含むDNA断片構造１（テロメア側の構造）（配列番号１、この1-34はloxP配列、36-1988は増幅マーカー遺伝子leu2d、1993-2845(相補鎖)はTRP1遺伝子、5699-5732は逆方向のloxP配列である。)を構成した。

このDNA断片構造１の上流側に第VI染色体(Genebank Accession No. NC_001138)の塩基配列263177-264016（配列番号３）のPCR断片を、下流側に同じく264017-264685（配列番号４）のPCR断片を接続した断片を作成し、この断片によりFrozen-EZ Yeast Transformation II(ZYMO RESEARCH社)を用いて宿主酵母細胞株の形質転換を行った。TRP１マーカー遺伝子の働きにより、トリプトファンを含まない寒天培地上でコロニーを形成できる細胞を選択し、その染色体構造を解析して、loxP対で挟まれた構造が挿入された細胞株を確立した。

次に、互いに逆方向の一対のloxm2配列、増幅選択マーカー遺伝子leu2d、LYS5遺伝子を含むDNA断片構造２（セントロメア側の構造）（配列番号２、この1-34はloxm2配列、3936-5888(相補鎖)は増幅マーカー遺伝子leu2d、2891-3930はLYS5遺伝子、5890 -5923は逆方向のloxm2配列である。)を構成した。

このDNA断片構造２の上流側に塩基配列257941-258821（配列番号５）のPCR断片を、下流側に258822-259719（配列番号６）のPCR断片を接続した断片を作成し、この断片により上記のDNA断片構造１（loxP対で挟まれた構造）をもつ細胞に同様に形質転換を行った。LYS5マーカー遺伝子の働きにより、リジンを含まない寒天培地上でコロニーを形成できる細胞を選択し、その染色体構造を解析して、loxP対で挟まれた構造とloxm2対で挟まれた構造とが挿入された細胞株を確立した。
なお、増幅選択マーカー遺伝子leu2dは、プロモーター配列の大部分を欠くため発現量が非常に低く、これは多コピーに増幅した時のみ、ロイシン要求性を相補することができる。

以上の２つの構造の間に位置する領域(塩基配列258822-264016)には複製開始に関わるタンパク質Orc1が結合することが観察されており（Nature, 424: 1078, 2003）、複製開始点として機能していると考えられる。またこの領域には出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでの複製開始点のコンセンサス配列であるWTTTAYRTTTWB（配列番号７)が含まれている(塩基配列258889-258900)。

本実施例では、実施例１で得た構造(図３)を出芽酵母第VI染色体に挿入し、Cre遺伝子を発現させてdouble rolling-circle replication (DRCR)を誘導した。
実施例１で得られた出芽酵母細胞株に、Cre遺伝子（配列番号８）がGALプロモーター下流に接続されたプラスミド（図４、pSH47、Genebank Accession No. AF298782、University of Washington、Yeast Resource Centerより授受）をFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH社）を用いて導入した。さらにURA3マーカー遺伝子の働きにより、ウラシルを含まない寒天培地上でコロニーを形成できる細胞を選択した。

上記で得られたプラスミドが導入されたUra⁺細胞の液体培養に、Cre発現を誘導するガラクトース又は対照としてCre発現を抑制するグルコースを添加し、３時間培養した。ロイシンを欠くグルコース寒天培地にこれらの細胞を塗布し、出現したLeu⁺コロニーを計数した。得られたLeu⁺コロニーの細胞をさらに培養し、低融点アガロース内で染色体DNAを調整した。
この染色体DNAをPulsed-field gel electrophoresis (PFGE、BIO-RAD社、CHEF Mapper XA、Auto Algorithm、range: 220-500kb)により分離し、又は制限酵素Sma Iによって消化されたDNAをField-inversion gel electrophoresis (FIGE、BIO-RAD社、CHEF Mapper XA、Auto Algorithm、range: 3-50kb)により分離し、サザンブロット法にて解析した。

結果とその解釈
出現したLeu⁺コロニーを計数した結果、対照実験（グルコース添加）に比較して、Cre発現を誘導した場合、図５に示すように、約７倍に及ぶ大幅なコロニー形成率の上昇が見られた。これはCreによる組換えが増幅に寄与していることを強く示唆している。

続いて、PFGEで分離した染色体DNAを、leu2dプローブを用いてサザンブロット法により構造解析した結果を図６（ａ）に示す。
図６（ａ）から、増幅のための構造を挿入した第VI染色体が長くなった増幅産物（i）と多コピー化したミニ染色体上（ii）が検出された。さらに345kbにはleu2断片を含む宿主細胞株の第III染色体（*）、290〜320kbには増幅のための構造をもつ第VI染色体（NS）と僅かに増幅した染色体が見出された。
次に、上記染色体ＤＮＡを制限酵素(SmaI)で消化し、SmaI断片をFIGEで分離した染色体DNA断片を、leu2dプローブを用いてサザンブロット法により構造解析した結果を図６（ｂ）に示す。

これらの結果から増幅産物の構造が明らかになった。
染色体上の増幅産物（i）のうち大きな分子サイズの強いシグナルを示したクローン（図６(a)(i) #32, 48, 52, 53: 黒のレーン）からは約11Kb(10.9, 11.1Kb)と17kb(16.8Kb)のSmaI断片が検出された。これらは、図７に示すように、計画したDRCR増幅にlox配列間の逆位（逆方向に再配置）が伴った構造に由来するものであり、少なくとも数十コピー以上のleu2dを含む高度な反復配列を有していると考えられる。

一方、大半のクローン（グレーのレーン）に見られたミニ染色体（図６(ii)）は約6.3kbのSmaI増幅断片を形成した。これは、図８に示すように、増幅のための構造よりテロメア側からの複製とCre-loxP組換えによる副反応により形成されたもので、多コピーで存在していると考えられる。

これら以外には逆位を伴わない染色体上の増幅産物（図７(a)、#34, 41, 47）や上記と類似の副反応による別のミニ染色体（図９、#29-31, 49, 56）も見られ、また染色体上の増幅産物とミニ染色体の両方をもつクローンも多数存在した（#22, 31, 34, 41, 47, 58）。なお増幅していない構造からは、宿主細胞株に由来する２つのSmaI断片（図６(b)の*）以外に、４つの断片が弱いシグナルを示すことが確認できている（図６(b)のNS、図１０）。

以上のように、想定した分子機構が関与すると考えられる高度な増幅反応が観察された（#32, 48, 52, 53）。これは解析したクローンの１割に見られたことから、全体のコロニー形成率4.4％の1/10、即ち0.44％の高頻度で起きていた。

DRCR反応を示す図である。黒い矢印は複製フォークを表す。部位特異的組換え酵素とその標的配列を用いた増幅開始反応を示す図である。三角矢印（ａ〜ｄ）は部位特異的組換え酵素の標的配列（例えば、loxP配列）とその方向を表し、Ｘは複製開始点を表す（以下同様）。ｘ〜ｚ及びｘ’〜ｚ’は増幅目的遺伝子を表し、黒い矢印は複製フォークを表す。増幅のための構造を示す図である。CEN:セントロメア、TEL:テロメア Cre発現のためのプラスミド(pSH47)を示す図である。コロニー形成率を示す図である。Glc:グルコース、Gal:ガラクトースサザンブロット解析を示す図である。（ａ）は、leu2dプローブを用いて、PFGEで分離した染色体DNAを示し、（ｂ）は、SmaIで消化後FIGEで分離した染色体DNAを示す。#19〜58は、ガラクトースによるCre発現誘導後、ロイシンを欠く選択培地に塗布され出現したコロニーから調整したDNAを示し、NSは、非選択培地上で培養した対照コロニーから調整したDNAを示し、Pは宿主細胞株を示す。本実験のPFGE条件では約650kb以上の染色体は分離限界に集中して存在していると思われる。染色体上の増幅産物を示す図である。（a）は、DRCRにより最初に形成される構造を示す。a〜fは制限酵素SmaIの切断部位を表し、数字はその断片長（kb）を示す。但し、d-e切断で生じる5.3kbの断片はleu2dを含まないため、サザンブロットでは検出されない。（b）は、lox間の配列が逆位（逆方向に再配置）を伴う場合の構造を示す。a'〜f'は、逆位により変化した切断部位を表し、その数字は生じ得る断片長（kb）を示す。例えば、a-b切断によって10.9kbの断片が生じるが、aを含む領域が逆位を起こした場合、a'-b切断で16.8kbの断片が生じる。同様にしてa-b'切断から5.3kb、a'-b'切断から11.1kbの断片が生じる。但し、leu2dを含まない5.3kbの断片はサザンブロットでは検出されない。ミニ染色体（図６(ii)）上の増幅産物を示す図である。テロメア側からの複製がloxP間の組換えにより逆進行して、両端にテロメアをもつミニ染色体(約18kb)を形成する。SmaI切断部位g〜i、及び逆位により変化しうる切断部位h'によりleu2dを含む断片長は6.3kbとなる（g-h'またはh-iの断片に由来する。逆位によって位置は変わってもhまたはh'のいずれかは切れるのでg-iという断片はありえない。)。ミニ染色体（図６(ii)）上の増幅産物を示す図である。テロメア側からの複製がloxm2間の組換えにより逆進行して、ミニ染色体(約40kb)を形成する。j〜nはSmaI切断部位、k'-m'は逆位により変化しうる切断部位を示し、数字は生じ得る断片長（kb）を示す。但し、leu2dを含まない5.3kbの断片はサザンブロットでは検出されない。増幅していない構造でのCre組換えの影響を示す図である。各々のlox間の配列は高頻度に逆位を生じる。o〜rはSmaI切断部位、p'、q'は逆位により変化しうる切断部位を示し、数字は生じ得る断片長（kb）を示す。但し、leu2dを含まない5.3kbの断片はサザンブロットでは検出されない。

Claims

ａ−ｂ−ｃ−ｄ又はａ−ｃ−ｂ−ｄ（式中、ａ及びｂの一方は部位特異的組換え酵素の第１の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第１の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｃ及びｄの一方は部位特異的組換え酵素の第２の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第２の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ａ−ｄ間のいずれかに複製開始点と少なくともひとつの増幅目的遺伝子が挿入される。但し、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。）で表される２本鎖ＤＮＡ。
前記ｂがｃを兼ね、ａ−ｂ−ｄ（式中、ｄはａと同方向の同一標的配列であり、その他は上記定義と同様を表す。）で表される請求項１に記載の２本鎖ＤＮＡ。
ａ−ｂ−Ｘ−ｃ−ｄ又はａ−ｃ−Ｘ−ｂ−ｄ（式中、Ｘが複製開始点を表し、その他は上記定義と同様を表す。）で表される請求項１に記載の２本鎖ＤＮＡ。
ａ−Ａ−ｂ−Ｘ−ｃ−Ｂ−ｄ又はａ−Ａ−ｃ−Ｘ−ｂ−Ｂ−ｄ（式中、Ａ及びＢの少なくとも一方が増幅目的遺伝子を表し、ａ、ｂ、Ｘ、ｃ及びｄは前記と同様を表す。但し、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。）で表される請求項３に記載の２本鎖ＤＮＡ。
前記部位特異的組換え酵素の第１の標的配列と第２の標的配列とが異なる請求項１、３又は４に記載の２本鎖ＤＮＡ。
前記部位特異的組換え酵素がCreリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれloxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2、loxFAS、lox71及びlox66から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素がFlpリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれFRT、F3、F5、FRT mutant -10及びFRT mutant +10から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素がphiC31インテグラーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれattB及びattPから成る群から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の２本鎖ＤＮＡ。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の２本鎖ＤＮＡを含む組換えベクター。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の２本鎖ＤＮＡが導入された形質転換体。
宿主が動物細胞である請求項８に記載の形質転換体。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の２本鎖ＤＮＡを少なくとも２つに分割してなる１セットの２本鎖ＤＮＡ断片であって、該断片はその両端にそれぞれ少なくとも５０ｂｐの塩基配列から成る相同的組換え用２本鎖ＤＮＡ領域を有し、この相同的組換え用２本鎖ＤＮＡ領域は、その相同的組換えによって、宿主の染色体又は染色体外因子上にこの２本鎖ＤＮＡを形成することのできる該宿主の染色体又は染色体外因子の部分配列から成ることを特徴とする１セットの２本鎖ＤＮＡ断片（但し、前記複製開始点は該宿主の複製開始点でもよいし外来のものでもよい。）。
ｅ−ａ−Ａ−ｂ−ｆで表される２本鎖ＤＮＡ、及びｇ−ｃ−Ｂ−ｄ−ｈで表される２本鎖ＤＮＡから成る請求項１０に記載の１セットの２本鎖ＤＮＡ（式中、ａ及びｂの一方は部位特異的組換え酵素の第１の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第１の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｃ及びｄの一方は部位特異的組換え酵素の第２の標的配列から成る２本鎖ＤＮＡ断片、他方は該第２の標的配列を逆方向に配列させた２本鎖ＤＮＡ断片を表し、ｅ〜ｈは、それぞれ当該１セットの２本鎖ＤＮＡの導入を想定する細胞染色体又は染色体外因子上にｅ、ｆ、該細胞染色体又は染色体外因子の複製開始点、ｇ、ｈの順に並ぶような少なくとも５０ｂｐの塩基配列から成る２本鎖ＤＮＡ領域を表し、Ａ及びＢの少なくとも一方が増幅目的遺伝子を表す。但し、該複製開始点又はその一部がｆ又はｇに含まれていてもよく、これらの間に任意のＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。）。
該部位特異的組換え酵素の第１の標的配列と第２の標的配列とが異なる請求項１０又は１１に記載の２本鎖ＤＮＡ。
前記部位特異的組換え酵素がCreリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれloxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2、loxFAS、lox71及びlox66から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素がFlpリコンビナーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれFRT、F3、F5、FRT mutant -10及びFRT mutant +10から成る群から選択され、前記部位特異的組換え酵素がphiC31インテグラーゼ又はその誘導体の場合、前記第１の標的配列及び第２の標的配列がそれぞれattB及びattPから成る群から選択される請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の２本鎖ＤＮＡ。
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の２種の２本鎖ＤＮＡをそれぞれ含む１セットの組換えベクター。
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の２種の２本鎖ＤＮＡが導入された形質転換体であって、前記複製開始点がその宿主の染色体又は染色体外因子上に存在する形質転換体。
宿主が動物細胞である請求項１５に記載の形質転換体。
請求項８、９，１５又は１６に記載の形質転換体を用意する段階、及びこれに部位特異的組換え酵素を作用させる段階からなる、前記増幅目的遺伝子を増幅する遺伝子増幅法。
前記部位特異的組換え酵素を作用させる方法が下記のいずれかである請求項１７に記載の方法。
（１）部位特異的組換え酵素を発現させるよう構成したプラスミドを導入する
（２）前記形質転換体をさらに部位特異的組換え酵素を発現させるように形質転換する
（３）直接部位特異的組換え酵素のたんぱく質を導入する
請求項１７又は１８に記載の方法により得られた形質転換細胞を培養する段階から成る、増幅目的遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。