CN101313064A - 基因扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供为了高速扩增基因而特别构建的双链DNA以及使用所述双链DNA的基因扩增方法以及蛋白质的合成方法。本发明的扩增体系为了有效地诱导被称为双滚环式复制(DRCR)的复制反应而利用了Cre－lox体系等的位点特异性重组酶及其靶序列。在动物细胞等细胞内构建图2(a)所示结构的复制单元，当复制叉在一对靶序列(lox序列)之间进行时通过位点特异性重组酶引起重组，利用该重组而引起DRCR诱导。

Description

基因扩增方法

技术区域

本发明涉及一种高速扩增基因的方法以及使用扩增后的基因来制造蛋白质的方法。

背景技术

在为了人为地引起基因扩增而使用动物培养细胞来进行时(专利文献1等)，有以下几个问题：(i)耗时(半年～一年)、(ii)未扩增的克隆也较多、(iii)扩增机制不明而依赖于经验等。另一方面，没有利用酵母进行基因扩增的体系，通常都是使用质粒来达到这一目的，但拷贝数达到一定程度以后就难以再增加。

本发明的体系是基于由生物所具有的被称为BIR(断裂诱导性复制，Break-Induced-Replication)的能力诱导的、被称为DRCR(双滚环式复制，double rolling-circle replication)的复制反应(非专利文献1、2)。这种复制反应被认为是当染色体被切断时，被切断的染色体会寻找与自身相同的序列，利用其同源性而侵入其中以构建复制点并开始复制，从而进行自身救济。所有生物都被认为具有这种能力。

另外，有报道在自然的环状DNA中，通过重组来引起DRCR(非专利文献3)。

专利文献1：日本特表平8-504585(WO94/14968)

专利文献2：WO2005/061703

非专利文献1：PNAS，vol.98，no.15，8255-8262(July 17，2001)

非专利文献2：Genes Dev 12，3831-3842(1998)

非专利文献3：Cell.1986 Aug 15；46(4)：541-50.

发明内容

本发明提供为了高速扩增基因而特别构建的双链DNA和使用了所述DNA的基因扩增方法以及蛋白质的合成方法。本发明的特征为：完全人为地构建扩增体系，能够同步地扩增，扩增时间短(大概1代)，以及扩增机制清楚等。

本发明的扩增体系利用了被称为双滚环式复制(DRCR)的复制反应。认为这样可以在一个细胞周期内使其爆发性地扩增，通过重组等来终止反应，从而将扩增产物维持在细胞内。本发明人等为了有效地诱导这种DRCR而利用了Cre-lox体系等的位点特异性重组酶及其靶序列。即，本发明人等在酵母菌内构建了图3所示结构的复制单元，利用当复制叉在一对lox序列之间行进时由位点特异性重组酶Cre重组酶(以下称“Cre”)所引起的重组，成功地引起DRCR诱导，从而完成了本发明。

即，本发明为一种用a-b-c-d或a-c-b-d表示的双链DNA(式中，a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示与该第一靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段，c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示与该第二靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段，在a-d之间的任何一处插入复制起始点和至少一个扩增目标基因。也可以在它们之间插入任意的DNA序列)。

本发明还是一种含有该双链DNA的重组载体，进而，还是一种导入了该双链DNA的转化体(transformant)。

另外，本发明为一种包含用e-a-A-b-f表示的双链DNA和用g-c-B-d-h表示的双链DNA的一组双链DNA(式中，a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示该第一靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段，c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示该第二靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段，e～h分别表示在设想导入所述的一组双链DNA的细胞染色体或染色体外因子上按照e、f、所述细胞染色体或染色体外因子的复制起始点、g、h的顺序排列的、包含至少50bp的碱基序列的双链DNA片段，A和B中的至少一个表示扩增目标基因。其中，该复制起始点或其一部分也可以包含在f或g中，在它们之间也可以插入任意的DNA序列)。

本发明为一种分别含有所述两种双链DNA的一组重组载体，进而，为一种导入了所述两种双链DNA的转化体，其是上述复制起始点存在于其宿主染色体或染色体外因子上的转化体。

另外，本发明为一种扩增上述扩增目标基因的基因扩增法，其包括准备上述任一转化体的步骤以及使位点特异性重组酶作用于该转化体的步骤，进而，本发明为一种制造扩增目标基因所编码的蛋白质的方法，其包括将利用上述方法得到的转化细胞进行培养的步骤。

本发明的扩增体系由于确立了高性能蛋白质生产体系而具有优异的特征。由于DRCR可以在一个细胞周期内实现高速扩增，且扩增机制明确，因而可以期待目标基因的可靠扩增。并且，虽然目前生物种类不同，但Cre-lox扩增体系可以以目前使用的动物细胞体系的10～100倍以上的频率形成高度扩增产物。进而，本扩增体系也可以适用于原本即使选择药剂也不引起扩增的原代培养的普通细胞，可以在以普通细胞为靶的基因治疗中应用基因扩增而使导入基因的表达强化并持续化。

附图说明

图1为表示DRCR反应的图。黑色箭头表示复制叉。

图2为表示使用位点特异性重组酶及其靶序列的扩增起始反应的图。三角箭头(a～d)表示位点特异性重组酶的靶序列(例如loxP序列)及其方向，X表示复制起始点(以下相同)。x～z和x’～z’表示扩增目标基因，黑色箭头表示复制叉。

图3为表示用于扩增的结构的图。CEN：着丝粒，TEL：端粒。

图4为表示用于Cre表达的质粒(pSH47)的图。

图5为表示菌落形成率的图。Glc：葡萄糖，Gal：半乳糖。

图6为表示Southern印迹分析的图。(a)表示使用leu2d探针、用PFGE分离的染色体DNA，(b)表示用SmaI消化后用FIGE分离的染色体DNA。#19～58表示由用半乳糖诱导Cre表达后、涂布在不含亮氨酸的筛选培养基上而出现的菌落制备得到的DNA，NS表示由在非筛选培养基上培养的对照菌落制备得到的DNA，P表示宿主细胞株。认为在本实验的PFGE条件下，约650kb以上的染色体集中存在于分离限。

图7为表示染色体上的扩增产物的图。(a)表示通过DRCR最初形成的结构。a～f表示限制性酶SmaI的剪切位点，数字表示其片段长度(kb)。但是，由于由d-e剪切产生的5.3kb的片段不含leu2d，因而用Southern印迹法检测不到。(b)表示在lox间的序列伴有反转(在反方向上重新排列)时的构造。a’～f’表示由于反转而变化的剪切部位，其数字表示可生成的片段长度(kb)。例如，通过a-b剪切而生成10.9kb的片段，但含有a的区域发生反转时，由a’-b剪切而生成16.8kb的片段。同样地，由a-b’剪切生成5.3kb的片段，由a’-b’剪切生成11.1kb的片段。但是，不含leu2d的5.3kb的片段用Southern印迹法检测不到。

图8为表示迷你染色体(图6(ii))上的扩增产物的图。由端粒侧开始的复制通过loxP间的重组而反方向进行，从而形成两端具有端粒的迷你染色体(约18kb)。由于SamI剪切位点g～i、以及可通过反转而改变的剪切位点h’，含有leu2d的片段长度变为6.3kb(来源于g-h’或h-i的片段。即使因反转而位置改变，h或h’的任一个也可以被剪切，因此不会有g-i片段。)。

图9为表示迷你染色体(图6(ii))上的扩增产物的图。由端粒侧开始的复制通过loxm2间的重组而反方向进行，从而形成迷你染色体(约40kb)。j～n表示SamI剪切部位，k’～m’表示可通过反转而改变的剪切部位，数字表示可生成的片段长度(kb)。但是，不含leu2d的5.3kb的片段用Southern印迹法检测不到。

图10为表示Cre重组对未扩增结构的影响的图。各个lox间的序列高频率地发生反转。o～r表示SamI剪切位点，p’和q’表示可通过反转而变化的剪切位点，数字表示可生成的片段长度(kb)。但是，不含leu2d的5.3kb的片段用Southern印迹法检测不到。

具体实施方式

对于本发明的基因扩增法，作为扩增机制，利用的是被认为对出芽酵母和动物细胞两者都能发挥作用的、可以高速扩增的双滚环式复制(DRCR)。如图1所示，该扩增体系是两个复制叉连续地复制环状DNA的反应。首先，复制叉(1)复制w，复制叉(2)复制y((a)、(b)、(c))，接着，复制叉(1)复制x，复制叉(2)复制z((c)、(d)、(e))。这样，用于一个复制叉的模板由另一个复制叉依次合成，因此复制持续地继续下去。扩增进行后，认为可以通过重组反应等来除去中央的环状构造，从而反应结束(f)。

在本发明的扩增体系中，为了诱导DRCR，设计了利用已知在动物细胞中也能有效发挥作用的位点特异性重组反应的体系。其是将在复制叉通过一组靶序列时发生重组的反应和发生复制叉反方向进行的反应两者组合来利用。

即，在本发明的扩增体系中，在图2(a)所示构成的扩增单元中开始复制之后，在黑色箭头表示的复制叉通过两组位点特异性重组酶的靶序列(lox序列)之间时，在位于亲本DNA链x和新生DNA链y的靶序列(例如loxP序列)间、以及位于亲本DNA链x’和新生DNA链y’的靶序列(例如loxP序列)间引起利用位点特异性重组酶(例如Cre)进行的重组(b)。通过重组x和y链替换，x’和y’链也替换，则一个复制叉由x链合成y、z链，另一个复制叉由x’链合成y’、z’链(c)。由此，叉反方向进行，将已经复制过的DNA链再次复制(d)。通过这两个反应来诱导DRCR。

本发明中使用的双链DNA可以用a-b-c-d或a-c-b-d表示，优选用a-b-c-d表示。

a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示该第一靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段。

c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示该第二靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段。

第一靶序列和第二靶序列可以相同，但优选不同。

并且，也可以在它们之间插入任意的DNA序列。

也可以所述b兼作c，用a-b-d(这种情况下，d表示与a方向相同的同一靶序列)表示。

并且，该序列也可以用a-b-X-c-d或a-c-X-b-d表示，优选用a-b-X-c-d表示。

此处，X表示复制起始点。对于复制起始点，存在于二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的3’下游区域的Ori beta、EBV的latent origin(OriP)、c-myc基因附近的origin等可以作为候补，但只要在动物细胞内具有复制起始活性就可以是任意位置。

进而，该序列也可以用a-A-b-X-c-B-d或a-A-c-X-b-B-d表示，优选用a-A-b-X-c-B-d表示。

此处，A和B中的至少一个表示扩增目标基因。使用多个扩增基因的情况下，它们可以相同或不同。

对于这些，上述(图2)说明的DRCR也可以同样被诱导。

位点特异性重组酶对两个短的共有(consensus)DNA序列(靶序列)之间的重组进行催化。该位点特异性重组酶在靶序列之间引起位点特异性重组，可以进一步改变这些靶位点或对插入的基因加以变化。

本发明中，可以使用以下的位点特异性重组酶以及对该酶特异性的靶序列(例如参照Developmental Cell，Vol.6，7-28，January，2004等)。

(1)Cre重组酶或其衍生物

细菌病毒P1的Cre重组酶被最广泛地用于小鼠的基因导入或基因破坏。Cre蛋白对两个长度为34个碱基的loxP识别位点之间的重组进行催化。所述loxP的序列采取了用两个13个碱基的回文序列夹住成为8个碱基的核的序列而形成的独特的构造。这8个碱基的非对称序列对loxP位点赋予方向性。利用Cre酶进行的loxP位点之间的DNA链的剪切和重组发生在核序列的8个碱基中的第一个碱基之后和最后一个碱基之前。

对该Cre酶利用氨基酸取代而制备衍生物。所谓衍生物是指，在野生型Cre重组酶中导入氨基酸取代而使功能、性质发生了改变的位点特异性重组酶，以及在野生型Cre重组酶基因的碱基序列中导入突变而使与CpG含量、翻译起始效率相关的Kozak序列、密码子使用(codon-usage)在宿主细胞中最优化、从而提高了表达效率和表达量的位点特异性重组酶及其基因。至今为止，对Cre酶已经制备了至少29种衍生物。这些衍生物有的活性不同，有的可以识别不同的靶序列。并且，对Cre酶识别的靶序列lox也同样制备了很多突变序列。本发明中，这些全部可以使用。

作为这样的靶序列，可以列举出loxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2(也称m2)、loxFAS、lox71、lox66以及它们的突变体。所谓突变体是指，在野生型的loxP序列等的一处以上的碱基中导入了突变的位点特异性重组反应的靶序列。

一般来说，无论Lox序列如何改变，重组效率也都非常敏感，但发现了保持功能的突变。在这种情况下，相同序列彼此的loxP之间可以在细胞内有效地发生重组，但在不同序列彼此之间，重组效率显著降低。

(2)Flp重组酶或其衍生物

该重组酶是取自出芽酵母的Flp重组酶。该酶的活性与Cre/loxP相同或差一些。但是，最近开发出的活性型Flp(Flpe)使这种酶的效率得到改良，与Cre的效率相同。34个碱基的共有性重组序列被称为FRT。FRT与loxP具有相同的构造，但序列不同。

所谓衍生物是指，在野生型Flp重组酶中导入氨基酸取代而使功能、形质发生了改变的位点特异性重组酶，以及在野生型Flp重组酶基因的碱基序列中导入突变而使与CpG含量、翻译起始效率相关的Kozak序列、密码子使用在宿主细胞中最优化、从而提高了表达效率和表达量的位点特异性重组酶及其基因。至今为止，对Flp酶已经制备了至少28种衍生物。

对该Flp酶及其识别序列也制备了很多衍生物。作为靶序列，可以列举出FRT、F3、F5、FRT突变体-10、FRT突变体+10以及它们的突变体。所谓突变体是指，在野生型的FRT序列等的一处以上的碱基中导入了突变的位点特异性重组反应的靶序列。

与Cre相同，Flp酶对FRT位点的序列变化非常敏感。但是，若几个突变FRT位点是相同的序列对，就能有效地鉴定发生重组的序列对。但是，不同的突变FRT位点之间或野生型位点和突变位点之间几乎不发生重组。

(3)PhiC31整合酶或其衍生物

PhiC31整合酶来源于链霉菌的细菌病毒，并在人的细胞内发挥作用。

作为该靶序列，可以列举出attP、attB及它们的突变体。所谓突变体是指，在野生型的attP序列等的一处以上的碱基中导入了突变的位点特异性重组反应的靶序列。

该体系是在attPP’和attBB’之间的ttg三个碱基引起重组的酶。由于该ttg的重组序列的两侧是独特的序列，因此在重组之后形成了与最初的识别序列不同的序列。由此，该酶的识别序列已经没有了。因此，该酶的重组只能进行一次。

所谓PhiC31整合酶体系的衍生物是指，在野生型PhiC31整合酶中导入氨基酸取代而使功能、性质发生了改变的位点特异性重组酶，以及在野生型PhiC31整合酶基因的碱基序列中导入突变而使与CpG含量、翻译起始效率相关的Kozak序列、密码子使用在宿主细胞中最优化、从而提高了表达效率和表达量的位点特异性重组酶及其基因。

在这些位点特异性重组酶及其靶序列中，优选Cre/Lox体系。

另外，也可以在这些构造内的任意位置插入想要使其表达的目标基因、用于筛选染色体或染色体外因子上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌素等的耐药性基因等)、用于筛选发生了基因扩增的细胞的标记基因(二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬氨酸转氨甲酰酶(CAD)、金属硫蛋白(MT)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷酸脱氨酶(AMPD1，2)、UMP合成酶、P-糖蛋白(P-gp)、天冬酰胺合成酶(AS)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)等)。优选也能插入被认为对于动物细胞的扩增很重要的核基质附着区域(nuclear matrix attachmentregion，MAR)。

另外，在这些各片段之间也可以插入任意的DNA序列。

适当依照常用的基因工程学的方法来结合这些片段。

用病毒、脂质体法、电穿孔法等方法将这样得到的双链DNA片段导入适宜的细胞内。进而，优选用与用于筛选染色体或染色体外因子上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌素等的耐药性基因等)相对应的药物来进行筛选以建立细胞株。作为其宿主，可以列举出酵母细胞或动物细胞等，但在生产作为药品的蛋白质时，优选动物细胞，这是出于可以对蛋白质附加与人型类似的糖链、且诱发不需要的免疫反应的危险性较低的理由。作为动物细胞，可以使用以蛋白质生产中常用的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞为代表的人、小鼠、大鼠和其他动物来源的所有细胞。

并且，本发明的双链DNA也可以是将上述的任何一个双链DNA分割为至少2个、优选2～5个、更优选2个而成的一组双链DNA片段，该片段在其两端分别具有包含宿主的染色体或染色体外因子的部分序列、且具有至少50bp、优选500～1Kbp的碱基序列的同源性重组用双链DNA片段。所述的同源性重组用双链DNA片段可以通过其同源性重组而在宿主的染色体或染色体外因子上形成上述双链DNA。

该复制起始点可以是该宿主的染色体或染色体外因子的复制起始点，也可以是外来的复制起始点。

另外，所谓染色体外因子是指可以在宿主细胞内复制的质粒、病毒来源的序列、宿主染色体部分片段以及人工染色体。

作为这样的一组双链DNA片段，例如可以列举出以下例子。

(1)用e-a-A-b-f表示的双链DNA，以及用g-c-B-d-h表示的双链DNA

(2)用e-a-A-f表示的双链DNA，以及用g-b-c-B-d-h表示的双链DNA

(3)用e-a-f表示的双链DNA，以及用g-A-b-c-B-d-h表示的双链DNA

(4)用e-a-A-b-c-f表示的双链DNA，以及用g-B-d-h表示的双链DNA

(5)用e-a-A-b-c-B-f表示的双链DNA，以及用g-d-h表示的双链DNA

(6)用e-a-A-b-B-f表示的双链DNA，以及用g-d-h表示的双链DNA

(7)用e-a-A-f表示的双链DNA，以及用g-B-d-h表示的双链DNA

(8)用e-a-f表示的双链DNA，以及用g-A-b-B-d-h表示的双链DNA等。

其中，a～d、A、B与上述相同。但是，(6)～(9)中的d表示与a方向相同的同一靶序列。

e～h分别表示在细胞染色体或染色体外因子上按照e、f、复制起始点、g、h的顺序(中间也可以插入任意的序列。另外，复制起始点或其一部分也可以包含在f或g中。)排列的、包含至少50bp、优选500～1Kbp的碱基序列的双链DNA片段。

这些片段按照上述相同方法结合。

将如此得到的至少2个双链DNA片段用病毒、脂质体法、电穿孔法等方法导入适宜的细胞内。进而，优选用与用于筛选染色体或染色体外因子上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌素等的耐药性基因等)相对应的药物来进行筛选以建立细胞株。作为其宿主，可以列举出酵母细胞或动物细胞等，但在生产作为药品的蛋白质时，优选动物细胞，这是出于可以对蛋白质附加与人型类似的糖链、且诱发不需要的免疫反应的危险性较低的理由。

通过e～h按照该顺序排列，它们与宿主染色体或染色体外因子的相当的部分进行同源性重组，从而与上述相同的结构被配置在宿主的染色体或染色体外因子上。

使位点特异性重组酶作用于如上所述得到的转化细胞。此时，由于优选细胞周期处于复制期(S期)的细胞的比例较多，因此优选使位点特异性重组酶作用于处于旺盛增殖、细胞周期正在进行中的状态的细胞，或者作用于进入S期时与细胞周期同步的细胞。

作为使上述位点特异性重组酶作用的方法，例如可以列举出以下方法。

(1)将以使位点特异性重组酶表达的方式而构建的质粒导入

在宿主细胞内发挥作用的启动子序列的下游，在各种表达载体中插入连接了编码位点特异性重组酶的基因的结构。将其通过脂质体法、电穿孔法等方法导入至上述的转化细胞中。此处，为了能在复制活跃进行的状态下使位点特异性重组酶发挥作用，优选使用能够诱导表达的启动子。

(2)将上述转化体进一步进行转化以使位点特异性酶表达。

在宿主细胞内发挥作用的启动子序列的下游，构建含有连接连编码位点特异性重组酶的基因的片段、用于筛选在染色体或染色体外因子上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌素等的耐药性基因等的任一种)的结构，将其通过脂质体法、电穿孔法等方法导入至上述的转化细胞中。此时，为了提高在染色体或染色体外因子中的插入效率，导入的结构优选为线状。另外，此处，为了能在复制活跃进行的状态下使位点特异性重组酶发挥作用，优选使用能够诱导表达的启动子。

(3)直接导入位点特异性重组酶的蛋白质

准备使位点特异性重组酶大量表达并精制而得到的产物，将其用市售的蛋白质导入试剂(例如Targeting system公司、Profect、Genlantis公司、BioPORTER Protein Delivery Regient)等导入上述的转化细胞中。此处，为了能在复制活跃进行的状态下使位点特异性重组酶发挥作用，优选将位点特异性重组酶导入处于旺盛增殖、细胞周期正在进行中的细胞，或者导入进入S期时与细胞周期同步的细胞。

使位点特异性重组酶发挥作用的时期需要处于复制开始后一个复制叉在两个第一靶序列之间、且另一个复制叉在两个第一靶序列之间(图2(b))。但是，不需要在准备的细胞全部处于这个严密的时期下才使位点特异性重组酶起作用。这是由于，实际上在大部分细胞中，复制进行的时间各不相同，只要其中的一部分细胞处于这样的状态即可。虽然偶尔只有复制叉满足上述条件的细胞才爆发性地进行基因复制，但即使准备的细胞中的一部分是这样，为了扩增也是足够的。

如上所述诱导扩增，优选使用与扩增标记基因(二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬氨酸转氨甲酰酶(CAD)、金属硫蛋白(MT)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷酸脱氨酶(AMPD1，2)、UMP合成酶、P-糖蛋白(P-gp)、天冬酰胺合成酶(AS)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)等)相对应的药物来进行筛选。这样可以筛选目标基因的表达量高的细胞株，通过培养该细胞、并由其培养基或其上清液、或者将它们进行精制来大量制造扩增目标基因所编码的蛋白质。

以下，用实施例举例证明本发明，但并不用于限制本发明。

实施例1

在本实施例中构建用于扩增的结构(图3)。

首先，构建含有相互反方向的一对loxP序列、扩增筛选标记基因leu2d以及TRP1基因的DNA片段结构1(端粒侧的构造)(序列号1，其1-34为loxP序列，36-1988为扩增标记基因leu2d，1993-2845(互补链)为TRP1基因，5699-5732为反方向的loxP序列。)。

制备在该DNA片段结构1的上游侧连接第VI染色体(GenebankAccession No.NC 001138)的碱基序列263177-264016(序列号3)的PCR片段、在下游侧同样连接264017-264685(序列号4)的PCR片段而成的片段，通过该片段，使用Frozen-EZ酵母转化II(Yeast Transformation II，ZYMORESEARCH公司)进行宿主酵母细胞株的转化。通过TRP1标记基因的作用，筛选能够在不含色氨酸的琼脂培养基上形成菌落的细胞，分析其染色体结构，确立插入了被loxP对夹住的结构的细胞株。

接着，构建含有相互反方向的一对loxm2序列、扩增筛选标记基因leu2d以及LYS5基因的DNA片段结构2(着丝粒侧的构造)(序列号2，其1-34为loxm2序列，3936-5888(互补链)为扩增标记基因leu2d，2891-3930为LYS5基因，5890-5923为反方向的loxm2序列。)。

制备在该DNA片段结构2的上游侧连接有碱基序列257941-258821(序列号5)的PCR片段、在下游侧连接有258822-259719(序列号6)的PCR片段而成的片段，通过该片段，与具有上述DNA片段结构1(用loxP对夹住的构造)的细胞同样地进行转化。通过LYS5标记基因的作用，筛选能够在不含赖氨酸的琼脂培养基上形成菌落的细胞，分析其染色体结构，建立插入了被loxP对夹住的结构和被loxm2对夹住的结构的细胞株。

另外，扩增筛选标记基因leu2d由于缺少启动子序列的大部分，因而表达量非常低，它只在扩增为多拷贝时才能够与亮氨酸需求性相互补。

在位于以上两个构造之间的区域(碱基序列258822-264016)中曾观察到与复制起始相关的蛋白质Orc1发生结合(Nature，424：1078，2003)，认为其作为复制起始点发挥作用。另外，在该区域中含有出芽酵母酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)内的复制起始点的共有序列WTTTAYRTTTWB(序列号7)(碱基序列258889-258900)。

实施例2

在本实施例中，将实施例1中得到的结构(图3)插入出芽酵母第VI染色体中，使Cre基因表达，从而诱导双滚环式复制(DRCR)。使用Frozen-EZ酵母转化II(Yeast Transformation II，ZYMORESEARCH公司)，将Cre基因(序列号8)连接到GAL启动子下游而形成的质粒(图4，pSH47，Genebank Accession No.AF298782，由华盛顿大学Yeast Resource Center提供)导入实施例1中得到的出芽酵母细胞株中。然后，通过URA3标记基因的作用，筛选能够在不含尿嘧啶的琼脂培养基上形成菌落的细胞。

在如上所述得到的导入了质粒的Ura⁺细胞的液体培养基中添加诱导Cre表达的半乳糖或作为对照的抑制Cre表达的葡萄糖，培养3小时。将这些细胞涂布在不含亮氨酸的葡萄糖琼脂培养基上，计数出现的Leu⁺菌落。继续培养得到的Leu⁺菌落的细胞，在低熔点琼脂糖内制备染色体DNA。

通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE、BIO-RAD公司，CHEF Mapper XA，Auto Algorithm，范围：220-500kb)分离该染色体DNA，或者通过电场转换凝胶电泳(FIGE、BIO-RAD公司，CHEF Mapper XA，Auto Algorithm，范围：3-50kb)分离被限制性酶SmaI消化了的DNA，并通过Southern印迹法进行分析。

结果及其解释

计数出现的Leu⁺菌落，结果可见，与对照实验(添加葡萄糖)比较，诱导了Cre表达时，如图5所示，菌落形成率大幅度上升至约7倍。这强烈表明利用Cre的重组有助于扩增。

接着，使用leu2d探针、通过Southern印迹法对由PFGE分离的染色体DNA进行结构解析，结果如图6(a)所示。

由图6(a)可知，插入了用于扩增的结构的第VI染色体增长而成的扩增产物(i)和多拷贝化而成的迷你染色体(ii)被检测到。进而，在345kb中发现了含有leu2片段的宿主细胞株的第III染色体(*)、在290～320kb中发现了具有用于扩增的结构的第VI染色体(NS)微量扩增而成的染色体。

接着，用限制性酶(SmaI)消化上述染色体DNA，用FIGE分离SmaI片段，将得到的染色体DNA片段用leu2d探针、通过Southern印迹法进行结构解析，结果如图6(b)所示。

由这些结果可以明确扩增产物的结构。

从染色体上的扩增产物(i)中显示了大分子尺寸的强信号的菌落(图6(a)(i)#32、48、52、53：黑道)检测到了约11Kb(10.9、11.1Kb)和17Kb(16.8Kb)的SmaI片段。如图7所示，这些是来源于计划的DRCR扩增中伴随了lox序列间的反转(在反方向上重新排列)的结构的片段，认为其具有含有至少数十拷贝以上的leu2d的高度重复序列。

另一方面，在超过半数的菌落(灰道)中发现的迷你染色体(图6(ii))形成了约6.3kb的SmaI扩增片段。如图8所示，认为这是通过由用于扩增的结构引起的自端粒侧开始的复制和利用Cre-loxP重组引起的副反应而形成的片段，在多拷贝中存在。

除此之外，还发现了不伴有反转的染色体上的扩增产物(图7(a)，#34、41、47)以及通过与上述类似的副反应生成的其它迷你染色体(图9，#29-31，49，56)，并且还有很多菌落都同时具有染色体上的扩增产物和迷你染色体(#22，31，34，41，47，58)。另外，由未扩增的构造可以确认，除了来源于宿主细胞株的两个SmaI片段(图6(b)的*)以外，有4个片段显示了较弱的信号(图6(b)的NS，图10)。

如上所述，观察到了被认为与设想的分子机制相关的高度扩增反应(#32，48，52，53)。由于在10％的分析菌落中可见该高度扩增反应，因此该反应以整体的菌落形成率4.4％的1/10、即0.44％的高频率发生。

序列表

<110>大学共同利用机关法人自然科学研究机构

<120>基因扩增方法

<130>FS06-459PCT

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5732

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>replication unit

<400>1

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatggatct agaggttaac taagcgaatt    60

tcttatgatt tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat    120

tttaaagtga ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcttatt cttgagtaac tctttcctgt    180

aggtcaggtt gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac atctctaccg    240

gcatgccgag caaatgcctg caaatcgctc cccatttcac ccaattgtag atatgctaac    300

tccagcaatg agttgatgaa tctcggtgtg tattttatgt cctcagagga caacacctgt    360

tgtaatcgtt cttccacacg gatcttatat atatttcaag gatataccat tctaatgtct    420

gcccctaaga agatcgtcgt tttgccaggt gaccacgttg gtcaagaaat cacagccgaa    480

gccattaagg ttcttaaagc tatttctgat gttcgttcca atgtcaagtt cgatttcgaa    540

aatcatttaa ttggtggtgc tgctatcgat gctacaggtg tcccacttcc agatgaggcg    600

ctggaagcct ccaagaaggt tgatgccgtt ttgttaggtg ctgtgggtgg tcctaaatgg    660

ggtaccggta gtgttagacc tgaacaaggt ttactaaaaa tccgtaaaga acttcaattg    720

tacgccaact taagaccatg taactttgca tccgactctc ttttagactt atctccaatc    780

aagccacaat ttgctaaagg tactgacttc gttgttgtca gagaattagt gggaggtatt    840

tactttggta agagaaagga agacgatggt gatggtgtcg cttgggatag tgaacaatac    900

accgttccag aagtgcaaag aatcacaaga atggccgctt tcatggccct acaacatgag    960

ccaccattgc ctatttggtc cttggataaa gctaatgttt tggcctcttc aagattatgg    1020

agaaaaactg tggaggaaac catcaagaac gaattcccta cattgaaggt tcaacatcaa    1080

ttgattgatt ctgccgccat gatcctagtt aagaacccaa cccacctaaa tggtattata    1140

atcaccagca acatgtttgg tgatatcatc tccgatgaag cctccgttat cccaggttcc    1200

ttgggtttgt tgccatctgc gtccttggcc tctttgccag acaagaacac cgcatttggt    1260

ttgtacgaac catgccacgg ttctgctcca gatttgccaa agaataaggt caaccctatc    1320

gccactatct tgtctgctgc aatgatgttg aaattgtcat tgaacttgcc tgaagaaggt    1380

aaggccattg aagatgcagt taaaaaggtt ttggatgcag gtatcagaac tggtgattta    1440

ggtggttcca acagtaccac ggaagtcggt gatgctgtcg ccgaagaagt taagaaaatc    1500

cttgcttaaa aagattctct ttttttatga tatttgtaca taaactttat aaatgaaatt    1560

cataatagaa acgacacgaa attacaaaat ggaatatgtt catagggtag acgaaactat    1620

atacgcaatc tacatacatt tatcaagaag gagaaaaagg aggatgtaaa ggaatacagg    1680

taagcaaatt gatactaatg gctcaacgtg ataaggaaaa agaattgcac tttaacatta    1740

atattgacaa ggaggagggc accacacaaa aagttaggtg taacagaaaa tcatgaaact    1800

atgattccta atttatatat tggaggattt tctctaaaaa aaaaaaaata caacaaataa    1860

aaaacactca atgacctgac catttgatgg agtttaagtc aataccttct tgaaccattt    1920

cccataatgg tgaaagttcc ctcaagaatt ttactctgtc agaaacggcc ttaacgacgt    1980

agtcgacgga tcgatctttt atgcttgctt ttcaaaaggc ctgcaggcaa gtgcacaaac    2040

aatacttaaa taaatactac tcagtaataa cctatttctt agcatttttg acgaaatttg    2100

ctattttgtt agagtctttt acaccatttg tctccacacc tccgcttaca tcaacaccaa    2160

taacgccatt taatctaagc gcatcaccaa cattttctgg cgtcagtcca ccagctaaca    2220

taaaatgtaa gctttcgggg ctctcttgcc ttccaaccca gtcagaaatc gagttccaat    2280

ccaaaagttc acctgtccca cctgcttctg aatcaaacaa gggaataaac gaatgaggtt    2340

tctgtgaagc tgcactgagt agtatgttgc agtcttttgg aaatacgagt cttttaataa    2400

ctggcaaacc gaggaactct tggtattctt gccacgactc atctccatgc agttggacga    2460

tatcaatgcc gtaatcattg accagagcca aaacatcctc cttaggttga ttacgaaaca    2520

cgccaaccaa gtatttcgga gtgcctgaac tatttttata tgcttttaca agacttgaaa    2580

ttttccttgc aataaccggg tcaattgttc tctttctatt gggcacacat ataataccca    2640

gcaagtcagc atcggaatct agagcacatt ctgcggcctc tgtgctctgc aagccgcaaa    2700

ctttcaccaa tggaccagaa ctacctgtga aattaataac agacatactc caagctgcct    2760

ttgtgtgctt aatcacgtat actcacgtgc tcaatagtca ccaatgccct ccctcttggc    2820

cctctccttt tcttttttcg accgatccgt cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca    2880

gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc    2940

tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga    3000

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat    3060

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca    3120

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc    3180

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata    3240

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc    3300

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc    3360

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga    3420

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc    3480

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag    3540

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag    3600

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag    3660

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca    3720

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga    3780

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat    3840

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga    3900

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg    3960

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga    4020

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc    4080

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac    4140

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc    4200

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc    4260

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc    4320

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt    4380

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc    4440

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg    4500

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag    4560

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat    4620

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc    4680

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa    4740

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta    4800

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa    4860

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg    4920

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc    4980

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg    5040

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg    5100

gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg    5160

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt    5220

ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt    5280

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt    5340

taacaaaata ttaacgctta caatttgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga    5400

agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagccc aagctaccat gataagtaag    5460

taatattaag gtacgggagg tacttggagc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta    5520

catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac    5580

aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga    5640

acatttctct atcgataggt accgagctct tacgcgtgct agcccgggct cgagatctat    5700

aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt at                                  5732

<210>2

<211>5923

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>replication unit

<400>2

ataacttcgt ataagaaacc atatacgaag ttatagatct cgagcccggg ctagcacgcg    60

taagagctcg gtacctatcg atagagaaat gttctggcac ctgcacttgc actggggaca    120

gcctattttg ctagtttgtt ttgtttcgtt ttgttttgat ggagagcgta tgttagtact    180

atcgattcac acaaaaaacc aacacacaga tgtaatgaaa ataaagatat tttattgcgg    240

ccgctccaag tacctcccgt accttaatat tacttactta tcatggtagc ttgggctggc    300

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg    360

aatggcaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca    420

gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga    480

ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg    540

actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat    600

caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag    660

ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga    720

agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa    780

ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg    840

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc    900

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta    960

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg    1020

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg    1080

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac    1140

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg    1200

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt    1260

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg    1320

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac    1380

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt    1440

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag    1500

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc    1560

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc    1620

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta    1680

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg    1740

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga    1800

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac    1860

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa    1920

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat    1980

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc    2040

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg    2100

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc    2160

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg    2220

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg    2280

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa    2340

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg    2400

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga    2460

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct    2520

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca    2580

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc    2640

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg    2700

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgct    2760

gccggcacct gtcctacgag ttgcatgata aagaagacag tcataagtgc ggcgacgata    2820

gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt    2880

cgacggatcc tacataaatg tgagcaagcg aaaaaaaaaa attggcatta taaaccatca    2940

ttttcgatga aataatcaat caacgtagat aagctgatat tatataattt tggtctgttc    3000

gtgttgattt tatcactgat ggactttggc atacagatag tgacaatttc gttattgaac    3060

cattgagaat ggaaaatcaa tggaacttca tccagagtta tgcacataga agctccctca    3120

gccggaaaaa agctgatagc gccaaaatct attagtgaca agtctgtgtt aaggccagtt    3180

ccagtaaatt ttgtatacga ctccttcaag gaccataagt aagtaaatat tgtgcatgga    3240

tcagacgctt tcagtaaacc gttaaattct ctttcactaa aaacttcttt aaatagctcc    3300

aactcttccc tcccgccata attgcacgga gaagcgatat caattccgac atcctggtat    3360

tcatctgtac ttacacattt tacgaggaac atagctacat attgttcacc gatggtcatg    3420

ctaaatggaa gaaaacgatt gttgtctaag aatggcttac cgaagctgcc cttgtcaaat    3480

ttcagctctt gaaaatttaa gcccgttact atagagcagc caaacaactg cagcagctgg    3540

ctgcatagat ttgaacatct atcgtgaaac gattttttat tgaggattct ggcttgagac    3600

gccaatggca aagttctcat taatgcctcg aacgtaaact catccgcgag tatatcctct    3660

tgaatttcaa caacgaatat acctgcccat ggtcttacac ctgccacctt tgaaacttcg    3720

cttactactt cagtcgtttt aaccatccac ggtttttttg ctgagtgatt ctctttctcc    3780

tcattctcat tttagtcata gcggttttaa taagcgcccg aaagataatt gtaaaacata    3840

tattcaatgc ttaaaaatat aagaaattgc ccatcaattt gaaaactcaa gtaaaacaga    3900

gaagttgtaa ggtgaataag gaatgagtga ggatccgtcg actacgtcgt taaggccgtt    3960

tctgacagag taaaattctt gagggaactt tcaccattat gggaaatggt tcaagaaggt    4020

attgacttaa actccatcaa atggtcaggt cattgagtgt tttttatttg ttgtattttt    4080

ttttttttag agaaaatcct ccaatatata aattaggaat catagtttca tgattttctg    4140

ttacacctaa ctttttgtgt ggtgccctcc tccttgtcaa tattaatgtt aaagtgcaat    4200

tctttttcct tatcacgttg agccattagt atcaatttgc ttacctgtat tcctttacat    4260

cctccttttt ctccttcttg ataaatgtat gtagattgcg tatatagttt cgtctaccct    4320

atgaacatat tccattttgt aatttcgtgt cgtttctatt atgaatttca tttataaagt    4380

ttatgtacaa atatcataaa aaaagagaat ctttttaagc aaggattttc ttaacttctt    4440

cggcgacagc atcaccgact tccgtggtac tgttggaacc acctaaatca ccagttctga    4500

tacctgcatc caaaaccttt ttaactgcat cttcaatggc cttaccttct tcaggcaagt    4560

tcaatgacaa tttcaacatc attgcagcag acaagatagt ggcgataggg ttgaccttat    4620

tctttggcaa atctggagca gaaccgtggc atggttcgta caaaccaaat gcggtgttct    4680

tgtctggcaa agaggccaag gacgcagatg gcaacaaacc caaggaacct gggataacgg    4740

aggcttcatc ggagatgata tcaccaaaca tgttgctggt gattataata ccatttaggt    4800

gggttgggtt cttaactagg atcatggcgg cagaatcaat caattgatgt tgaaccttca    4860

atgtagggaa ctcgttcttg atggtttcct ccacagtttt tctccataat cttgaagagg    4920

ccaaaacatt agctttatcc aaggaccaaa taggcaatgg tggctcatgt tgtagggcca    4980

tgaaagcggc cattcttgtg attctttgca cttctggaac ggtgtattgt tcactatccc    5040

aagcgacacc atcaccatcg tcttcctttc tcttaccaaa gtaaatacct cccactaatt    5100

ctctgacaac aacgaagtca gtacctttag caaattgtgg cttgattgga gataagtcta    5160

aaagagagtc ggatgcaaag ttacatggtc ttaagttggc gtacaattga agttctttac    5220

ggatttttag taaaccttgt tcaggtctaa cactaccggt accccattta ggaccaccca    5280

cagcacctaa caaaacggca tcaaccttct tggaggcttc cagcgcctca tctggaagtg    5340

ggacacctgt agcatcgata gcagcaccac caattaaatg attttcgaaa tcgaacttga    5400

cattggaacg aacatcagaa atagctttaa gaaccttaat ggcttcggct gtgatttctt    5460

gaccaacgtg gtcacctggc aaaacgacga tcttcttagg ggcagacatt agaatggtat    5520

atccttgaaa tatatataag atccgtgtgg aagaacgatt acaacaggtg ttgtcctctg    5580

aggacataaa atacacaccg agattcatca actcattgct ggagttagca tatctacaat    5640

tgggtgaaat ggggagcgat ttgcaggcat ttgctcggca tgccggtaga gatgtggtca    5700

ataagagcga cctcatgcta tacctgagaa agcaacctga cctacaggaa agagttactc    5760

aagaataaga attttcgttt taaaacctaa gagtcacttt aaaatttgta tacacttatt    5820

ttttttataa cttatttaat aataaaaatc ataaatcata agaaattcgc ttagttaacc    5880

tctagatcca taacttcgta tatggtttct tatacgaagt tat                      5923

<210>3

<211>840

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<400>3

aggtggagcg caggtcatag gtatgccggc tcattgtttt ctattttaaa aagtaaaaaa    60

tatgctgcta aaggaacacg tgagaaatta cattctccct aggtctgcga taacgcggta    120

atattacact gccgccgcct tccatgcctt tggaaagcag acaatgatgc taggcggcgc    180

ccagcagtat aaacttttct tgcttataac cagaacctct atcacaaaat tagaaactgc    240

gatactatgg gtcagatcga cacataggga gcactattag gcgcaaggcg tatacatagg    300

cattgcgtgt tcaaaaattg tcgtatgaga aaagttccaa actttccacc attactcacc    360

aacaacttac accagcccgg atttaagatt tagcttccga gaatattgtg actcagccac    420

tggtctcttg aatgttgcgt gtagcttgat taagattatg gcataaccgt tttttttact    480

tggcaagagt gaacgtcctt ttactccaaa aggctcctga tgaaactgga gagtctcttt    540

gttctgaaat ttttaaagtt tagcacacca tattcacgct cgaggtgaac ccaagttttc    600

ctgaaaaatg tgccatgaac ctgaaaaaaa gaattattct cgaaaataaa aaaggcaatc    660

aagatcggaa agataagcat tttttttcaa tccgtatcta acattcataa agtgataaaa    720

aaattgataa cgattttatt gtcgcctctt gttttgagta tattttttta acgttctttt    780

tcggcattca aattccgtat aatcaactca attgtaaggc gccgtagcat ccaaataatg    840

<210>4

<211>669

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<400>4

ttgaaagtgc caatttgctc atcagtgcta aatattcctt gataaaaata tagaagacaa    60

ggacatataa aaagaaagac tgctctagtg ttgggacacc acaatgaaaa aatacttaac    120

gtgtttcgaa actgtgaata taaaattcca gcaaaaacca aaatattcac tacaatgatt    180

gatcgtaccg agttatcgaa gtttggtatt actacgcaac tgtctgttat tggacgtaat    240

ccagatgaac aaagtggctt tgttaatcca cctttgtata aggggtcaac catcattctt    300

aaaaaactta gtgatttaga acaaaggaaa ggaagatttt acgggacagc aggttctcca    360

actattgaca atttagaaaa tgcctggacg catttaaccg gcggtgctgg gacagtgcta    420

tcagcttctg ggcttggttc tatctctttg gcgctattgg ccctttcgaa agctggtgat    480

catatcttga tgactgatag tgtctacgtg ccaacacgta tgctatgtga tggtttattg    540

gccaagttcg gtgttgaaac ggattattat gacccatcaa tagggaagga tatagaaaaa    600

ctagttaagc caaatacaac cgtcattttc ctcgaaagcc cgggttctgg gaccatggaa    660

gtacaggat                                                            669

<210>5

<211>881

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<400>5

gcaactaaaa cgcccgtgga ttgaggttca gatttgctac tgtcgctttc gaagaagcta    60

gatgaaccac gggtaaagta ttctgcatct aatgtgttca ataaatattg agtgacgtta    120

tcgtaatgtt acagtactaa caccgctaga aaatgctggt gtgaatgtga atgacgatag    180

acggactgat gcacttttcc attgtacgat aacattactt acaagattgg gagaagcatg    240

attgaaaatt tgactggaag aaccacttat attaggagtg gcggtattag tagaaaattg    300

actaaacgca tccgaaaatt aaatagaatt taaagtttcc ttgggtgcac tgttttgggc    360

tgcagtgcta aaatccagaa gtgttggagt caggttactt gtttgcatac agacattact    420

gaagttttca gaaggccttt gaatcgagaa cgagataagg aagtgtcctc taaatgcaat    480

tttagagctc aaagtgagga tagtggcact gaaacttgat ttagttaatg gcctttagat    540

ttgctgctgt ctgaaaagct catcatcgag aagctcacaa aatggagttc tagttgccct    600

ttcactatac aatcgatgta aagatggctt ataagtattt gaattgtaag ttttgtgcta    660

gctgaggaat caaaaaatgt atttagtgct tccttactgg tcaattgtgt attatttcca    720

gatgaaacag aaaatatgta ttttatggat tgactaatca agtcacttgc tgattgtgta    780

atagtggtgg ttaaagaaag tacagtaagt ttgcttgaaa tacaggcagg attcctggaa    840

tactgcctac tactgcttat tgaatagagt gtaatctcgc c                        881

<210>6

<211>898

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<400>6

aaacccagta atagcatcgt ttaagaaatg gtgcttactt gtaggtaaaa cttctgaagg    60

atactgagta aatgtaaaat tatatgagtt aaggcagaat gactgtaaac ttttgtgacg    120

aatctggaag atgcattcgt cgattggcct tcattaagtg aagattggta acctattgca    180

tccaaaccag aagtaataca accagaatgt ggagatgagg agccaacagg tgtgtatcca    240

gaaggttcag ccacaggttg gtcatcaata ccactggggg agcatgcaat ataatcagat    300

ggttgcgagg aatagctagt agagctaaaa ctgaacacat tagttaagat tagactagcc    360

atgctcaaag aaacaattag agaggcacct acatgttcgt tatccatttt tgaggaaaaa    420

atagaagtga taataataat tttgctcgaa ctactcgtaa agctacttga aaaacggctc    480

gagattacgg aagagtcggt agtaaaccga ctctcagtgt cacggaatgg aagcgccttg    540

aaactactaa tatcaggtat gcattgaggg gcaaggcaac ctgaatatgc aaagagcata    600

gtcttaactt tcgtagtacg taatacttcg gcattaattt ggcctaccgc tttgccacag    660

ttgagtggtc actggagtat tagccatgaa aaaatgatcc cttgtatatc caggcccaaa    720

gtctaaaatg tacttcctgc caatggttgt cacagctaat attccatttt gaattgactt    780

gatttttaga ttattatcat ggaaccaagt tgatgtcttg caatttctga tttttaacga    840

tgtactggag gttgacgact aggcaaatct gcgaaacatc ctagtacaat ggcatttg      898

<210>7

<211>12

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(12)

<223>w means a or t，y means c or t，r means a or g，and b means c，g

or t.

<400>7

wtttayrttt wb                                                      12

<210>8

<211>1032

<212>DNA

<213>bacteriophage P1

<400>8

atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcattaccggtcga tgcaacgagt    60

gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat    120

acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac    180

cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg    240

cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt    300

cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc    360

cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact    420

gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat    480

ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc    540

agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg    600

aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg    660

gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc    720

cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc    780

ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt    840

cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc    900

cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt    960

gtcatgaact atatccgtac cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa    1020

gatggcgatt ag                                                        1032

Claims (19)

1.一种以a-b-c-d或a-c-b-d表示的双链DNA，式中，a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第一靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第二靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；在a-d之间的任一处插入复制起始点和至少一个扩增目标基因；并且，在所述片段之间也可以插入任意的DNA序列。

2.权利要求1中记载的双链DNA，其中，所述b兼作c，所述双链DNA以a-b-d表示，式中，d为与a相同方向的同一靶序列，其余字母的定义与所述权利要求1中的定义相同。

3.权利要求1中记载的双链DNA，其以a-b-X-c-d或a-c-X-b-d表示，式中，X表示复制起始点，其余字母的定义与所述权利要求1中的定义相同。

4.权利要求3中记载的双链DNA，其以a-A-b-X-c-B-d或a-A-c-X-b-B-d表示，式中，A和B中的至少一个表示扩增目标基因，a、b、X、c以及d的定义与所述权利要求1中的定义相同，并且，在所述片段之间也可以插入任意的DNA序列。

5.权利要求1、3或4中记载的双链DNA，其中，所述位点特异性重组酶的第一靶序列与第二靶序列不同。

6.权利要求1～5任意一项中记载的双链DNA，其中，当所述位点特异性重组酶为Cre重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自loxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2、loxFAS、lox71、lox66以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为Flp重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自FRT、F3、F5、FRT突变体-10、FRT突变体+10以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为phiC31整合酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自attB、attP以及它们的突变体。

7.一种重组载体，其含有权利要求1～6任意一项中记载的双链DNA。

8.一种转化体，其导入了权利要求1～6任意一项中记载的双链DNA。

9.权利要求8中记载的转化体，其中，宿主为动物细胞。

10.一组双链DNA片段，其是将权利要求1～6任意一项中记载的双链DNA分割成至少2个而形成的一组双链DNA片段，其特征在于，所述片段在其两端分别具有包含至少50bp的碱基序列的同源重组用双链DNA片段，该同源重组用双链DNA片段包含宿主的染色体或染色体外因子的部分序列，且通过其同源重组，能够在所述宿主的染色体或染色体外因子上形成权利要求1～6任意一项中记载的双链DNA；其中，所述复制起始点可以是所述宿主的复制起始点，也可以是外来的复制起始点。

11.权利要求10中记载的一组双链DNA，其包含以e-a-A-b-f表示的双链DNA和以g-c-B-d-h表示的双链DNA，式中，a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第一靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第二靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；e～h分别表示在设想导入所述的一组双链DNA的细胞染色体或染色体外因子上按照e、f、所述细胞染色体或染色体外因子的复制起始点、g、h的顺序排列的、包含至少50bp的碱基序列的双链DNA片段；A和B中的至少一个表示扩增目标基因；并且，所述复制起始点或其一部分也可以包含在f或g中；在所述片段中也可以插入任意的DNA序列。

12.权利要求10或11中记载的双链DNA，其中，所述位点特异性重组酶的第一靶序列和第二靶序列不同。

13.权利要求10～12任意一项中记载的双链DNA，其中，当所述位点特异性重组酶为Cre重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自loxP、lox511、lox5171、lox2272、lox2372、loxm2、loxFAS、lox71、lox66以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为Flp重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自FRT、F3、F5、FRT突变体-10、FRT突变体+10以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为phiC31整合酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自attB、attP以及它们的突变体。

14.一组重组载体，其分别含有权利要求10～13任意一项中记载的2种双链DNA。

15.一种转化体，其导入了权利要求10～13任意一项中记载的2种双链DNA，其中，所述复制起始点存在于其宿主的染色体或染色体外因子上。

16.权利要求15中记载的转化体，其中，宿主为动物细胞。

17.一种基因扩增方法，其用于扩增所述扩增目标基因，其包括：准备权利要求8、9、15或16中记载的转化体的步骤；和使位点特异性重组酶作用于所述转化体的步骤。

18.权利要求17中记载的方法，其中，使所述位点特异性重组酶发生作用的方法是下述的任一种：

(1)导入按照使位点特异性重组酶表达的方式而构建的质粒；

(2)将所述转化体进一步进行转化，以使位点特异性重组酶表达；

(3)直接导入位点特异性重组酶的蛋白质。

19.一种制造扩增目标基因所编码的蛋白质的方法，其包括将通过权利要求17或18中记载的方法而得到的转化细胞进行培养的步骤。

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