CN117355607A - 非病毒同源性介导的末端连接 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于使用非病毒基因编辑技术产生在指定基因组基因座处具有盒插入的基因工程化细胞诸如T细胞的组合物和方法。还提供了使用所述基因工程化细胞治疗或预防受试者的疾病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月13日提交的美国临时申请第63/174,468号的权益，该美国临时申请据此以引用方式整体并入本文以用于所有目的。
背景技术
成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白的应用使基因组编辑成为可能，从而彻底改变了分子生物学。CRISPR介导的基因编辑是一种强大而实用的工具，具有创建新科学工具、纠正临床相关突变以及工程改造新的基于细胞的免疫疗法的潜力。病毒递送载体和电穿孔已成为免疫细胞中基于CRISPR的编辑的两种策略。然而，基因治疗领域一直存在着与病毒递送载体有关的复杂问题。
操纵T细胞、造血干细胞和诱导多能干细胞的能力为免疫工程化提供了科学工具和潜在的治疗途径。在人类细胞中发现CRISPR-Cas基因编辑之前，针对免疫系统的基因治疗几乎完全依赖于病毒载体诸如逆转录病毒和慢病毒，通过(半)随机基因组整合插入转基因。然而，由于插入到原癌基因中和对病毒载体致命的全身免疫反应，临床试验产生了意想不到的后果，例如白血病。尽管病毒载体得到了改进，可以最大限度地减少遗传损伤和免疫反应，但病毒插入(诸如临床上用于生成CAR-T细胞的慢病毒)可能会导致基因过表达，例如不受内源调控的基因的过表达，从而限制了该方法的临床应用。
已经描述了非病毒CRISPR-Cas基因编辑。然而，使用此类系统的编辑效率和/或可行性通常较低。例如，使用当前方法增加编辑效率是以降低细胞活力为代价的，反之亦然。需要改进的非病毒CRISPR-Cas基因编辑方法，诸如具有改进的编辑效率和活力的方法。
发明内容
本文提供了一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：(a)可靶向核酸酶蛋白；和(b)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割，并且其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
本文还提供了一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；(b)供体引导RNA(gRNA)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)，并且其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
本文还提供了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：(a)可靶向核酸酶蛋白；和(b)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。
本文还提供了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到细胞中，所述组合物包含：(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；(b)供体引导RNA(gRNA)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
本文还提供了一种用于修饰细胞的基因组靶序列的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；(b)供体引导RNA(gRNA)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板，其包含被同源臂侧接的用于插入的核酸；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)，其中供体gRNA包含与细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且其中同源臂与侧接细胞的基因组靶序列的核酸序列互补，其中用于插入的核酸被构造为插入到细胞的基因组靶序列中。
在一些方面，可靶向核酸酶蛋白是RNA引导的核酸酶。在一些方面，组合物还包含RNA，所述RNA包含与CDL靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。
在一些方面，所述组合物还包含被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的复合物的供体引导RNA(gRNA)，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。在一些方面，所述组合物还包含第一供体引导RNA(gRNA)、第二供体gRNA，所述第一供体gRNA包含与第一CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，所述第二供体gRNA包含与第二CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，其中每个供体gRNA被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的不同复合物，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。在一些方面，供体gRNA中的一者或多者包含与细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，HDR模板包含与侧接细胞的基因组靶序列的核酸序列互补的同源臂。在一些方面，同源臂的长度各自独立地选自以下长度：至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp的长度。
在一些方面：(a)可靶向核酸酶包括RNA引导的核酸酶，其中RNA引导的核酸酶包括CRISPR-CAS；(b)组合物还包含供体引导RNA(gRNA)，其被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的复合物；并且(c)其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
在一些方面，所述组合物还包含第二可靶向核酸酶蛋白，其中第二可靶向核酸酶蛋白或包含第二可靶向核酸酶蛋白的复合物能够切割细胞的基因组靶序列。在一些方面，第二可靶向核酸酶蛋白是RNA引导的核酸酶。在一些方面，组合物还包含第二RNA，其包含与基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。在一些方面，组合物还包含被构造成形成包含第二可靶向核酸酶蛋白的复合物的靶引导RNA(gRNA)，并且其中(1)靶gRNA包含与基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且(2)基因组靶序列可操作地连接至位于基因组靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
在一些方面，第一CDL靶序列、第二CDL靶序列和基因组靶序列包含相同的核酸序列。
在一些方面，基因组靶序列包含安全港核酸序列。在一些方面，安全港核酸序列包含核酸序列GAGCCATGCTTGGCTTACGA。在一些方面，PAM序列中的一个、两个在CDL靶序列和HDR模板之间编码或都不编码。
在一些方面，可靶向核酸酶和每种gRNA的摩尔比分别为1:10和2:1之间。在一些方面，可靶向核酸酶和供体模板的摩尔比分别为10:1和1000:1之间。
在一些方面，可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白包含转录激活因子样(TAL)效应子DNA结合蛋白和核酸酶。
在一些方面，可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白包含锌指DNA结合蛋白和核酸酶。
在一些方面，可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白与核定位信号(NLS)序列融合。
在一些方面，可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白是Cas9蛋白。
本文还提供了一种用于修饰细胞中的靶核酸的方法，其包括将本文所述的任何组合物引入或提前以非病毒方式引入到细胞中，其中HDR模板被整合到靶核酸中。在一些方面，引入包括电穿孔。在一些方面，细胞是原代细胞。在一些方面，原代细胞是原代T细胞。
本文还提供了一种用于修饰靶核酸的核糖核蛋白复合物，其包含本文所述的任何组合物。
本文还提供了一种用于修饰靶核酸的核糖核蛋白复合物，(a)CRISPR-CAS RNA引导核酸酶；和(b)供体引导RNA(gRNA)，其中供体gRNA包含与共递送线性化(CDL)靶序列互补的至少17个核苷酸，并且其中组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。在一些方面，组合物还包含质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
本文还提供了一种用于修饰细胞中的靶核酸的方法，其包括将本文所述的任何核糖核蛋白复合物引入到细胞中。在一些方面，引入包括电穿孔。在一些方面，细胞是原代细胞。在一些方面，原代细胞是原代T细胞。在一些方面，所述方法在体内进行、在体外进行或离体进行。
本文还提供了一种形成核糖核蛋白(RNP)复合物的方法，其包括温育或已温育(a)CRISPR-CAS RNA-引导核酸酶；和(b)供体引导RNA(gRNA)，其中供体gRNA包含与共递送线性化(CDL)靶序列互补的至少17个核苷酸。在一些方面，将Cas蛋白和gRNA一起在37℃下温育至少17分钟。在一些方面，gRNA:Cas蛋白的摩尔比在0.25:1至4:1之间。在一些方面，RNP复合物具有小于100nm的大小。在一些方面，RNP复合物具有20nm和90nm之间的大小。
本文还提供了一种组合物，其包含质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。在一些方面，组合物还包含供体引导RNA(gRNA)，其被构造为形成包含可靶向核酸酶蛋白的复合物。在一些方面，组合物包含可靶向核酸酶蛋白质。
在一些方面，供体模板包含5'至3'序列：P1a-N1-P2b-H-P3c-N2-P4d，其中：(1)P1、P2、P3和P4是PAM序列；(2)N1为第一CD L靶序列，并且N2为第二CDL靶序列；(3)H为HDR模板；(4)a为0并且b为1，或者a为1并且b为0；以及(5)c为0并且d为1；或者c为1并且d为0。
在某些方面，本文描述了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，并且将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到细胞中，所述组合物包含：(a)可靶向核酸酶蛋白；和(b)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。在某些方面，本文描述了一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到细胞中，所述组合物包含：(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；(b)供体引导RNA(gRNA)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。在某些方面，本文描述了一种用于修饰细胞的基因组靶序列的方法，所述方法包括：提供细胞，以及将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到细胞中，所述组合物包含：(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；(b)供体引导RNA(gRNA)；和(c)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板，其包含被同源臂侧接的用于插入的核酸；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中(1)供体gRNA包含与第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)，其中供体gRNA包含与细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且其中同源臂与侧接细胞的基因组靶序列的核酸序列互补，其中用于插入的核酸被构造为插入到细胞的基因组靶序列中。在某些实施方案中，细胞是人类细胞。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在某些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在某些实施方案中，引入配制用于以非病毒方式递送的组合物包括电穿孔。在某些实施方案中，供体模板的量为至少约80、10-120、10、20、30、40、50、60、70、90、100、110或120mg。在某些实施方案中，单个电穿孔反应的细胞数量为至少约5、1-10、1、2、3、4、6、7、8、9或10e7个。在某些实施方案中，所提供的细胞总数至少大于10e7并且进行多于一次电穿孔反应。在某些实施方案中，细胞悬液的总体积为约1mL。在某些实施方案中，相对于其他方面相同但缺乏CDL靶序列的对照组合物，所述方法导致细胞的基因组靶序列中的模板插入增加，任选地其中模板插入相对于对照增加至少约1-5、1、2、3、4或5倍。
定义
除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数引用。
如本文所用，“CRISPR-Cas”系统是指一类用于防御外来核酸的细菌系统。CRISPR-Cas系统广泛存在于真细菌和古细菌生物体中。CRISPR-Cas系统包括I型、II型和III型亚型。野生型II型CRISPR-Cas系统利用RNA介导的核酸酶，例如Cas9蛋白，与引导和活化RNA(例如单引导RNA或sgRNA)复合以识别和切割外源核酸，例如外源核酸，包括天然或修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“可靶向核酸酶”是指能够识别同源核酸序列(例如，基因组内的靶基因和/或CDL靶序列)并结合至同源核酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，可靶向核酸酶可以修饰同源核酸序列。在一些实施方案中，可靶向核酸酶可以是RNA引导的核酸酶，例如Cas蛋白。在其他实施方案中，可靶向核酸酶可以是融合蛋白，其包含可以结合至同源核酸序列的蛋白质(例如，转录激活因子样(TAL)效应子DNA-结合蛋白或锌指DNA结合蛋白)和可以修饰同源核酸序列的蛋白质(例如核酸酶、转录激活因子或阻遏物)。在一些实施方案中，可靶向核酸酶具有核酸酶活性。在其他实施方案中，可靶向核酸酶不具有核酸酶活性。在一些实施方案中，可靶向核酸酶可以通过切割靶核酸来修饰同源核酸序列。然后，切割的靶核酸可以与附近的同源定向修复(HDR)模板进行同源重组，诸如通过同源定向修复或同源介导的末端连接(HMEJ)。在其他实施方案中，可靶向核酸酶(例如，不具有任何核酸酶活性的可靶向核酸酶)可以调节同源核酸序列的表达。例如，可靶向核酸酶可以是含有TAL效应子DNA结合蛋白和转录激活因子的融合蛋白。
如本文所用，术语“质粒供体模板”是指包含同源定向修复(HDR)模板和CDL靶序列的多核苷酸。HDR模板可以包含5'同源臂、核苷酸插入物(例如，外源序列和/或编码异源蛋白或其片段的序列)和3'同源臂(例如，参见图1)。如本文进一步描述的，在电穿孔之前预温育含有可靶向核酸酶(例如，Cas蛋白)和供体gRNA的RNP复合物以及质粒供体模板可改善敲入产率，例如通过改善敲入效率和/或降低细胞毒性。
如本文所用，术语“共递送线性化(CDL)靶序列”是指被可靶向核酸酶识别并结合的核苷酸序列。在一些实施方案中，可靶向核酸酶(例如，转录激活因子样(TAL)效应子DNA结合蛋白或锌指DNA结合蛋白)可以直接识别并结合CDL靶序列。在其他实施方案中，可靶向核酸酶(例如RNA引导的核酸酶)可以通过供体gRNA间接识别并结合CDL靶序列。RNA引导的核酸酶与供体gRNA结合，而供体gRNA与CDL靶序列杂交。在一些实施方案中，CDL靶序列是基因组靶核酸的一部分。
如本文所用，“RNA引导的核酸酶”是指结合至引导RNA(gRNA)并利用gRNA来选择性地结合DNA多核苷酸内的区域的核酸酶。一般来说，RNA引导的核酸酶可以选择性地结合DNA多核苷酸内与gRNA互补的几乎任何序列。在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶具有核酸酶活性并且可以切割DNA多核苷酸中的核苷酸之间的键(例如，磷酸二酯键)。在其他实施方案中，RNA引导的核酸酶不具有核酸酶活性，并且可用于选择性结合与RNA引导核酸酶融合的其他蛋白质(例如，转录激活因子或阻遏物)和/或将其定位到DNA多核苷酸内的感兴趣区域。
如本文所用，术语“引导RNA”或“gRNA”是指可以通过与同源核酸序列杂交来将RNA引导的核酸酶(例如Cas蛋白)引导到同源核酸序列的DNA靶向RNA。在一些实施方案中，引导RNA可以是单引导RNA(sgRNA)，其含有(1)将RNA引导的核酸酶引导至同源核酸序列的引导序列(例如，单引导RNA的crRNA等效部分)和(2)与RNA引导的核酸酶相互作用的支架序列(例如，单引导RNA的tracrRNA等效部分)。在其他实施方案中，引导RNA可以含有两个组分：(1)将RNA引导的核酸酶引导到同源核酸序列的引导序列(例如，单引导RNA的crRNA等效部分)和(2)与RNA引导的核酸酶相互作用的支架序列(例如，单引导RNA的tracrRNA等效部分)。引导序列的一部分可以与支架序列的一部分杂交以形成双组分引导RNA。
如本文所用，术语“靶引导RNA”或“靶gRNA”是指能够与同源核酸序列杂交以例如在DNA多核苷酸中需要整合HDR模板的位置处，例如T细胞的基因组和/或安全港基因组位置处被修饰的gRNA。
如本文所用，术语“供体引导RNA”或“供体gRNA”是指可以与质粒供体模板内的CDL靶序列杂交的gRNA。在一些实施方案中，CDL靶序列可以与供体gRNA序列的等长部分互补(例如，部分互补或完全互补)。
如本文所用，术语“单引导RNA”或“sgRNA”是指包含以下的DNA靶向RNA：(1)将Cas蛋白靶向同源核酸序列的引导序列(例如，单引导RNA的crRNA等效部分)和(2)与Cas蛋白相互作用的支架序列(例如，单引导RNA的tracrRNA等效部分)。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”也是指核碱基、核苷或核苷酸之间的碱基配对的能力以及一个多核苷酸与另一多核苷酸之间碱基配对的能力。在一些实施方案中，一个多核苷酸可以与另一个多核苷酸具有“完全互补性”或是“完全互补”的，这意味着当两个多核苷酸任选地比对时，一个多核苷酸中的每个核苷酸可以与另一个多核苷酸中的相应核苷酸进行沃森-克里克碱基配对接合。在其他实施方案中，一个多核苷酸可以与另一个多核苷酸具有“部分互补性”或者是“部分互补”的，这意味着当两个多核苷酸任选地比对时，一个多核苷酸中至少60％(例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％)但少于100％的核苷酸可以与另一个多核苷酸中的核苷酸进行沃森-克里克碱基配对接合。换言之，当两个多核苷酸杂交时，存在至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)错配的核苷酸碱基对。参与沃森-克里克碱基配对的核苷酸对包括例如腺嘌呤和胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤以及腺嘌呤和尿嘧啶，它们全部通过形成氢键来配对。错配碱基的实例包括鸟嘌呤和尿嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以及腺嘌呤和胞嘧啶配对。
如本文所用，术语“Cas蛋白”是指成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白或核酸酶。Cas蛋白可以是野生型Cas蛋白或Cas蛋白变体。Cas9蛋白是属于II型CRISPR-Cas系统的Cas蛋白的实例(例如Rath等人，Biochimie 117:119，2015)。Cas蛋白的其他实例在本文中进一步详细描述。天然存在的II型Cas蛋白通常需要crRNA和tracrRNA来进行位点特异性DNA识别和切割。crRNA通过部分互补的区域与tracrRNA缔合，以将Cas蛋白引导到与靶DNA中的crRNA同源的区域，其被称为“原型间隔区”。天然存在的II型Cas蛋白可切割DNA，以在crRNA转录物内所含有的引导序列指定的位点的双链断裂处产生平末端。在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，Cas蛋白与靶gRNA或供体gRNA缔合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，Cas蛋白具有核酸酶活性。在其他实施方案中，Cas蛋白不具有核酸酶活性。
如本文所用，术语“Cas蛋白变体”是指相对于野生型Cas蛋白的序列具有至少一个氨基酸取代(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸取代)和/或为野生型Cas蛋白的截短版本或片段的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白变体与野生型Cas蛋白的序列具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)。在一些实施方案中，Cas蛋白变体是野生型Cas蛋白的片段并且相对于野生型Cas蛋白的序列具有至少一个氨基酸取代。Cas蛋白变体可以是Cas9蛋白变体。在一些实施方案中，Cas蛋白变体具有核酸酶活性。在其他实施方案中，Cas蛋白变体不具有核酸酶活性。
如本文所用，术语“核糖核蛋白复合物”或“RNP复合物”是指包含Cas蛋白或变体(例如Cas9蛋白或变体)和gRNA的复合物。
如本文所用，术语“修饰”在修饰细胞基因组中的靶核酸的上下文中是指诱导靶核酸中的改变(例如切割)。在一些实施方案中，改变可以是靶核酸序列的结构改变。例如，修饰可以采取将核苷酸序列插入到靶核酸中的形式。例如，可以将外源核苷酸序列插入到靶核酸中。还可以切除靶核酸并用外源核苷酸序列替换。在另一个实例中，修饰可以采取切割靶核酸而不将核苷酸序列插入到靶核酸中的形式。例如，可以切割和切除靶核酸。这种修饰可以例如通过在靶核酸内诱导双链断裂或在相对链上并在靶核酸侧翼诱导一对单链切口来进行。用于在靶核酸处或靶核酸内诱导单链或双链断裂的方法包括使用本文所述的针对靶核酸的可靶向核酸酶(例如，Cas蛋白)。在其他实施方案中，修饰靶核酸包括将另一种蛋白质靶向靶核酸并且不包括切割靶核酸。
附图说明
本申请包括以下附图。附图旨在说明组合物和方法的某些实施方案和/或特征，并补充组合物和方法的任何描述。附图不限制组合物和方法的范围，除非书面描述明确表明情况如此。
图1是说明用于介导盒的基因组插入的CDL(共递送线性化)质粒设计的示例性机制的概念图。如右侧所示，在侧接盒的同源臂外部添加CDL序列(与用于HDR整合的Cas9基因组靶标相同的Cas9靶序列)和3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)，除了允许Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)介导的基因组切割以外，还允许Cas9-sgRNA RNP介导的核酸内切酶活性从质粒中释放盒和同源臂。相反，对于标准质粒(如左图所示)，Cas9-sgRNA RNP仅切割基因组位点，但不切割质粒。
图2是显示用标准质粒或CDL质粒的CRISPR RNP和同源定向修复(HDR)模板电穿孔的T细胞的敲入(KI)效率和KI细胞产率的流式细胞术点图和图表。图2A显示了用CRISPRRNP和不同剂量(从左到右增加，范围在0-100mg/L之间)的编码MYC标记表面蛋白的标准质粒(上图)或CDL质粒(下图)的同源定向修复(HDR)模板电穿孔的T细胞的一系列流式细胞术点图。图2B是显示不同剂量的标准质粒或CDL质粒的KI％的图表。图2C是显示具有不同剂量的标准质粒或CDL质粒的每100万个起始细胞的KI+活细胞(活/死染色剂；ThermoFisher)细胞产率的图表。
图3是显示不同剂量的标准质粒或CDL质粒的CD8/CD4比率的图表。
图4是显示在电穿孔后第6天用3种含有CDL序列GAGCCATGCTTGGCTTACGA的质粒和3种含有非CDL序列的质粒电穿孔的T细胞的转基因表达的图表。
具体实施方式
以下描述列举了本发明的组合物和方法的各个方面和实施方案。没有特定实施方案旨在限定组合物和方法的范围。相反，实施方案仅提供至少包括在所公开的组合物和方法的范围内的各种组合物和方法的非限制性实例。该描述应当从本领域普通技术人员的角度来阅读；因此，不一定包括本领域技术人员熟知的信息。
I.简介
病毒修饰的T细胞被批准用于癌症免疫疗法，但更广泛的过继性细胞疗法需要更通用和更精确的基因组修饰(Yin等人，Nat Rev Clin Oncol，16(5):281-295，2019；Dunbar等人，Science 359:6372，2018；Cornu等人，Nat Med 23:415-423，2017；以及David和Doherty，Toxicol Sci 155:315-325，2017)。CRISPR(成簇规则间隔短回文重复)-Cas(CRISPR相关蛋白)核酸酶系统是基于可用于基因组工程化的细菌系统的工程化核酸酶系统。它基于许多细菌和古细菌的部分适应性免疫反应。当病毒或质粒入侵细菌时，入侵者的DNA片段会通过“免疫”反应转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，crRNA通过部分互补的区域与另一种类型的称为tracrRNA的RNA缔合，以将Cas(例如Cas9)核酸酶引导到与靶DNA中的crRNA同源的区域，其被称为“原型间隔区”。Cas(例如Cas9)核酸酶切割DNA，以在crRNA转录物中包含的20核苷酸引导序列指定的位点的双链断裂处产生平末端。Cas(例如Cas9)核酸酶可能需要crRNA和tracrRNA来进行位点特异性DNA识别和切割。该系统现已经过工程改造，使得crRNA和tracrRNA可以组合成一个分子(“单引导RNA”或“sgRNA”)，并且sgRNA的crRNA等效部分可以被工程化为引导Cas(例如，Cas9)核酸酶以靶向任何所需序列(参见例如，Jinek等人(2012)Science 337:816-821；Jinek等人(2013)eLife 2:e00471；Segal(2013)eLife 2:e00563)。因此，CRISPR-Cas系统可以被工程化为在细胞基因组中的所需靶标处形成双链断裂，并利用细胞的内源性机制以通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)来修复诱导的断裂。
如本文所述，本发明人发现核酸酶所靶向的序列，当添加到同源定向修复(HDR)模板的末端时，可以增强靶核酸修饰效率。将CRISPR-Cas系统递送到细胞中进行基因修饰的非病毒策略(诸如电穿孔)避免了与病毒递送相关的许多并发症，诸如对病毒载体的致命性全身免疫反应、低病毒递送效率以及病毒插入相关基因过表达。然而，在某些情况下，当采用CRISPR-Cas系统递送的非病毒策略时，可能需要大量HDR模板和剂量依赖性细胞毒性。
II.组合物
本公开提供了用于修饰靶核酸的组合物和方法，其包括：(a)可靶向核酸酶蛋白；和(b)质粒供体模板，其包含：(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3'，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列各自能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割，并且其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。如本文进一步详细描述的，在一些实施方案中，当可靶向核酸酶是转录激活因子样(TAL)效应子时，TAL效应子可以直接识别并结合至CDL靶序列。在一些实施方案中，当可靶向核酸酶是锌指时，锌指可以直接识别并结合至CDL靶序列。在其他实施方案中，当可靶向核酸酶是RNA引导的核酸酶(例如，Cas蛋白)时，RNA引导的核酸酶可以通过供体gRNA间接结合至CDL靶序列，所述供体gRNA可以与CDL靶序列杂交。不受任何理论约束，可靶向核酸酶用于切割CDL靶序列，从而从质粒供体模板切除HDR模板，进而允许HDR模板参与同源介导的末端连接(HMEJ)。通过本文所述的HMEJ定向过程，使用较少量的质粒供体模板可以维持甚至增加敲入效率，并且可以导致DNA诱导的细胞毒性降低。因此，CDL靶序列可以提高HDR模板插入到靶细胞中的效率，同时还降低毒性，增加编辑细胞的总体产率。
III.CRISPR/Cas
在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，可靶向核酸酶是RNA引导的核酸酶，并且供体模板还包含紧邻CDL靶序列的原型间隔区相邻基序(PAM)。组合物还可以进一步包含与待修饰的靶核酸(例如基因组靶序列，诸如转基因插入细胞(例如，T细胞)中的所需位点)互补的靶引导RNA(gRNA)。靶gRNA可以与第一RNA引导核酸酶形成第一RNP复合物并将第一RNA引导核酸酶(例如，Cas蛋白)引导至靶核酸。在一些实施方案中，靶gRNA的一部分(例如，靶gRNA的至少17个核苷酸的部分(例如，17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸))与靶核酸互补。
组合物还可包含与CDL靶序列互补的供体gRNA。供体gRNA可以与第二RNA引导核酸酶形成第二RNP。供体模板中的CDL靶序列可以与供体gRNA或其一部分杂交。因此，含有第二RNA引导核酸酶、供体gRNA和供体模板的复合物可以促进HDR模板的切除，并且不希望受理论约束，促进同源重组发生在被靶gRNA切割的靶核酸中的整合位点处。在一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA的序列是相同的。在一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA的序列是不同的。在一些实施方案中，第一RNA引导核酸酶和第二RNA引导核酸酶是相同的。在其他实施方案中，第一RNA引导核酸酶和第二RNA引导核酸酶是不同的。
组合物可以含有摩尔比为1:10至2:1之间(例如1:5和2:1之间、2:5和2:1之间、3:5和2:1之间、4:5和2:1之间，1:1和2:1之间、1:10和1:1之间、1:10和4:5之间、1:10和3:5之间、1:10和2:5之间或1:10和1:5之间)的可靶向核酸酶和靶gRNA和/或供体gRNA。组合物可以含有摩尔比分别为10:1至1000:1之间(例如50:1和1000:1之间、100:1和1000:1之间、200:1和1000:1之间、300:1和1000:1之间、400:1和1000:1之间、500:1和1000:1之间、600:1和1000:1之间、700:1和1000:1之间、800:1和1000:1之间、900:1和1000:1之间、10:1和900:1之间、10:1和800:1之间、10:1和700:1之间、10:1和600:1之间、10:1和500:1之间、10:1和400:1之间、10:1和300:1之间、10:1和200:1之间、10:1和100:1之间或10:1和50:1之间)的可靶向核酸酶和质粒供体模板。
RNA引导的核酸酶也可以与定位肽或蛋白质融合。例如，RNA引导的核酸酶可以与一种或多种核定位信号(NLS)序列融合，后者可以将核酸酶及其形成的RNP复合物引导至细胞核以修饰靶核酸。NL S序列的实例是本领域已知的，例如，如Lange等人，J BiolChem.282(8):5101-5，2007中所述，并且还包括但不限于AVKRPAATKKA GQAKKKKLD、MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK和PKKKRKV。可用于RNA引导核酸酶的其他肽或蛋白质的实例，例如细胞穿透肽和细胞靶向肽是本领域中可获得的并且描述于例如，Vivès等人，Biochim Biophys Acta.1786(2):126-38，2008。
IV.单引导RNA
Cas蛋白可以被引导至其相应的待被单引导RNA(sgRNA)切割的同源DNA(例如CDL靶序列和/或基因组靶序列)。sgRNA是天然存在的两段引导RNA(crRNA和tracrRNA)的一种版本，其被工程化为单个连续序列。sgRNA可以包含将Cas蛋白靶向同源核酸序列的引导序列(例如sgRNA的crRNA等效部分)以及与Cas蛋白相互作用的支架序列(例如，sgRNA的tracrRNA等效部分)。可以使用软件来选择sgRNA。作为非限制性实例，选择sgRNA的考虑因素可以包括例如待使用的Cas9蛋白的PAM序列以及用于最大程度地减少脱靶修饰的策略。诸如和CRISPR设计工具的工具可以提供用于制备sgRNA、用于评估靶标修饰效率和/或评估脱靶位点切割的序列。
引导序列
sgRNA中的引导序列可以与同源核酸序列内的特定序列(例如，CDL靶序列和/或基因组靶序列)互补。同源核酸序列的3'末端后面可以是PAM序列。引导序列通常与PAM序列上游的大约20个核苷酸互补。一般而言，Cas9蛋白或其变体切割PAM序列上游的约三个核苷酸。sgRNA中的引导序列可以与同源核酸序列的任一链互补。
在一些实施方案中，sgRNA的引导序列可以在sgRNA 5'末端包含约10至约2000个核酸，例如约10至约100个核酸、约10至约500个核酸、约10至约1000个核酸、约10至约1500个核酸、约10至约2000个核酸、约50至约100个核酸、约50至约500个核酸、约50至约1000个核酸、约50至约1500个核酸、约50至约2000个核酸、约100至约500个核酸、约100至约1000个核酸、约100至约1500个核酸、约100至约2000个核酸、约500至约1000个核酸、约500至约1500个核酸、约500至约2000个核酸、约1000至约1500个核酸、约1000至约2000个核酸或约1500至约2000个核酸，其可以利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas蛋白引导至同源核酸序列。在一些实施方案中，sgRNA的引导序列在sgRNA的5'端包含约100个核酸，其可以使用RNA-DNA互补碱基配对将Cas蛋白引导至同源核酸序列位点。在一些实施方案中，引导序列在sgRNA的5'端包含20个核酸，其可以利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas蛋白引导至同源核酸序列(例如CDL靶序列和/或基因组靶序列)位点。在其他实施方案中，引导序列包含少于20个，例如，19、18、17个或更少的与同源核酸序列互补的核酸。在一些情况下，sgRNA中的引导序列在同源核酸序列的互补区中含有至少一个核酸错配。在一些情况下，引导序列在同源核酸序列的互补区中含有约1至约10个核酸错配。
支架序列
sgRNA中的支架序列可以充当与Cas蛋白或其变体相互作用的蛋白结合序列。在一些实施方案中，sgRNA中的支架序列可包含彼此杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)的两个互补核苷酸段。支架序列可以具有诸如下茎、凸起、上茎、连接和/或发夹的结构。在一些实施方案中，sgRNA中的支架序列可以是约90个核酸至约120个核酸，例如约90个核酸至约115个核酸、约90个核酸约90个核酸至约110个核酸、约90个核酸至约105个核酸、约90个核酸至约100个核酸、约90个核酸至约95个核酸、约95个核酸至约120个核酸、约100个核酸约120个核酸至约120个核酸、约105个核酸至约120个核酸、约110个核酸至约120个核酸、或约115个核酸至约120个核酸。
V.引导RNA(gRNA)
引导RNA(gRNA)，包括本文所述的靶gRNA和供体gRNA，一般是指含有以下的DNA靶向RNA：(1)与同源核酸序列(例如，CDL靶序列和/或基因组靶序列)互补并将RNA引导核酸酶引导到同源核酸序列的引导序列，和(2)与RNA引导的核酸酶相互作用并结合的支架序列。在本公开的一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA具有相同的序列。在本公开的一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA包含相同序列，诸如共享能够与待修饰的靶序列和CDL靶序列两者杂交的核酸序列。在本公开的其他实施方案中，靶gRNA和供体gRNA具有不同序列。在本文描述的组合物和方法中，gRNA包含与同源核酸序列互补的部分。一旦gRNA与可靶向核酸酶(例如，第一RNA引导的核酸酶)形成RNP复合物，RNP复合物就可以通过gRNA和同源核酸序列之间的互补性被引导至同源核酸序列。在一些实施方案中，可靶向核酸酶是Cas9蛋白。Cas9蛋白通过首先识别位于同源核酸序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)来“识别”同源核酸序列。一旦PAM被识别，RNP复合物中的gRNA就会与PAM上游的同源核酸序列杂交。在一些实施方案中，gRNA包含与同源核酸序列中位于PAM序列上游约20个核苷酸的部分互补的核苷酸部分。一般而言，Cas9蛋白或其变体切割PAM序列上游的约三个核苷酸。可以使用软件选择gRNA。作为非限制性实例，选择gRNA的考虑因素可以包括例如待使用的RNA引导的核酸酶的PAM序列，以及用于最大程度地减少脱靶修饰的策略。诸如和CRISPR设计工具的工具可以提供用于制备gRNA、用于评估靶标修饰效率和/或评估脱靶位点切割的序列。
在一些实施方案中，gRNA包括与同源核酸序列互补的至少17个核苷酸(例如，17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸)的部分。在一些实施方案中，gRNA可以与同源核酸序列完全互补或部分互补。在一些实施方案中，同源核酸序列中至少60％(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％)的核苷酸可以与gRNA中的相应核苷酸进行沃森-克里克碱基配对接合。
如本文进一步详细描述的，CDL靶序列和HDR模板的一个或两个末端上的PAM可以被设计成具有不同构型。
在本公开的一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA具有相同序列(例如基因组靶序列和CDL靶序列是相同的)，并且各自与相同种类的可靶向核酸酶形成复合物(例如，两者具有相同序列，并与相同种类的Cas蛋白形成RNP复合物)。在这种情况下，gRNA可以与RNA引导的核酸酶形成第一RNP复合物。第一RNP复合物可以通过gRNA和靶核酸之间的杂交与靶核酸结合。gRNA也可以与RNA引导的核酸酶和供体模板形成第二RNP复合物。在该第二RNP复合物中，gRNA可以与供体模板中的DNA结合蛋白靶序列结合，从而将供体模板带到所需胞内位置(例如，细胞核)，以用于在切割的靶核酸处发生同源重组。在一些实施方案中，gRNA和DNA结合蛋白靶序列仅具有部分互补性。在本公开的一些实施方案中，靶gRNA和供体gRNA具有不同序列(例如基因组靶序列和CDL靶序列是不同的)。不同的靶gRNA和供体gRNA可以各自与相同种类的靶向核酸酶形成复合物(例如，各自与相同种类的Cas蛋白形成RNP复合物)。不同的靶gRNA和供体gRNA可以各自与不同种类的靶向核酸酶形成复合物(例如，各自与相同种类的Cas蛋白形成RNP复合物)。
VI.供体模板
HDR模板、CDL靶序列和相应PAM序列在质粒供体模板中可以具有几种不同的构型，以增强HDR模板和靶核酸之间的同源定向修复。通常，供体模板包含(i)同源定向修复(HDR)模板；(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中第一CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的5'；和(iii)第二CDL靶序列，其中第二CDL靶序列可操作地连接至HDR模板的3’，并且其中第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者能够被可靶向核酸酶蛋白或包含可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。在可靶向核酸酶为Cas蛋白(例如Cas9)的实施方案中，第一CDL靶序列和第二CDL靶序列中的每一者都可操作地连接至位于CDL靶序列3’的3碱基对PAM。可以对CDL靶序列和相应PAM进行定向，使得PAM位于CDL靶序列和HDR模板之间。可以对CDL靶序列和相应PAM进行定向，使得CDL靶序列位于PAM和HDR模板之间。可以对质粒供体模板中的每个CDL靶序列和相应PAM进行独立定向。对应于第一CDL靶序列的PAM可以位于CDL靶序列和HDR模板之间。第一CDL靶序列可以位于PAM和HDR模板之间。对应于第二CDL靶序列的PAM可以位于CDL靶序列和HDR模板之间。第二CDL靶序列可以位于PAM和HDR模板之间。在非限制性实例中，对应于第一CDL靶序列的PAM位于第一CDL靶序列和HDR模板之间，并且对应于第二CDL靶序列的PAM位于第二CDL靶序列和HDR模板之间。
在一些实施方案中，质粒供体模板的大小或长度大于约200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.1kb、7.2kb、7.3kb、7.4kb、7.5kb、7.6kb、7.7kb、7.8kb、7.9kb、8.0kb、8.1kb、8.2kb、8.3kb、8.4kb、8.5kb、8.6kb、8.7kb、8.8kb、8.9kb、9.0kb、9.1kb、9.2kb、9.3kb、9.4kb、9.5kb、9.6kb、9.7kb、9.8kb、9.9kb、10.0kb、这些大小之间的任何模板大小或大于10kb。例如，模板的大小可以是约200bp至约500bp、约200bp至约750bp、约200bp至约1kb、约200bp至约1.5kb、约200bp至约2.0kb、约200bp至约2.5kb、约200bp至约3.0kb、约200bp至约3.5kb、约200bp至约4.0kb、约200bp至约4.5kb、约200bp至约5.0kb。在某些情况下，模板的大小和数量足够大，足以像裸露DNA一样致命。
在一些实施方案中，供体模板编码异源蛋白或其片段。在一些实施方案中，供体模板包含调节序列，例如启动子序列和/或增强子序列，以例如在插入到细胞的基因组中后调节异源蛋白或其片段的表达。异源蛋白可以包括嵌合抗原受体(CAR)。异源蛋白可包括T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，质粒供体模板包含外源序列，例如外源核苷酸序列。外源序列可以包括编码的异源蛋白或其片段。外源序列可以包括基因或其部分。外源核苷酸序列可以是短序列，例如长度为3-100个核苷酸的短序列。感兴趣的外源核苷酸序列可以是单个核苷酸。另外，感兴趣的外源核苷酸序列可以是长序列，例如长度为500-3000个核苷酸的长序列。感兴趣的外源核苷酸序列可以编码或非编码多肽序列。此外，可以将感兴趣的外源核苷酸序列插入到细胞中，使得其在插入后形成嵌合基因。例如，外源受体部分可以插入内源受体编码序列的读框中，以产生嵌合受体编码序列，其在编辑后包含可操作地连接至内源性胞内部分(例如用于信号转导)的外源受体部分。
在一些实例中，基因或其部分可以是蛋白质编码核苷酸序列(即编码多肽序列的核苷酸序列)。一般而言，可以使用任何蛋白质编码核苷酸。在一些实例中，蛋白质编码核苷酸序列编码可用于自体细胞疗法(例如，自体T细胞疗法)的蛋白质。在一些实例中，蛋白质编码核苷酸序列可包括但不限于调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子或免疫检查点抑制剂。蛋白质编码核苷酸序列，特别是分泌蛋白质或膜结合蛋白质，可以包括编码信号肽的核苷酸序列。信号肽对于由蛋白质编码核苷酸序列编码的蛋白质而言可以是内源的。信号肽对于由蛋白质编码核苷酸序列编码的蛋白质而言可以是外源的。
在一些实例中，基因或其部分可以是非蛋白质编码核苷酸序列。一般而言，可以使用任何非蛋白质编码核苷酸。在一些情况下，非蛋白质编码核苷酸序列可以是可用于自体细胞疗法(例如，自体T细胞疗法)的核苷酸序列。在一些情况下，非蛋白质编码核苷酸序列可包括但不限于shRNA、siRNA、miRNA和lncRNA。
尽管编码基因的至少一部分的核苷酸序列(例如，感兴趣的外源基因)通常可以是任何大小，可以考虑实际考虑因素，诸如基因大小对总体模板大小和后续总体编辑效率的影响。因此，在一个具体方面，本文提供了修饰的细胞，其被基因组编辑或能够被基因组编辑，以表达长度大于或等于100个碱基的外源性基因，其HR效率大于先前描述的HR效率(例如，更大百分比的具有整合的多核苷酸序列的群体)，特别是当使用以非病毒方式递送方法时。提高的HR效率同样适于长度大于100个碱基的基因，诸如引入长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于500个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于750个碱基、长度大于或等于1000个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基、长度大于或等于3000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基的外源序列。基因的至少一部分的长度可以大于或等于800个碱基。基因的至少一部分的长度可以大于或等于1600个碱基。
外源序列可以长度在100-200个碱基之间、长度在100-300个碱基之间、长度在100-400个碱基之间、长度在100-500个碱基、长度在100-600个碱基之间、长度在100-700个碱基之间、长度在100-800个碱基之间、长度在100-900个碱基之间或者长度在100-1000个碱基之间。外源序列可以长度在100-2000个碱基之间、长度在100-3000个碱基之间、长度在100-4000个碱基之间、长度在100-5000个碱基之间、长度在100-6000个碱基之间、长度在100-7000个碱基之间、长度在100-8000个碱基之间，长度在100-9000个碱基之间或长度在100-10,000个碱基之间。外源序列可以长度在1000-2000个碱基之间、长度在1000-3000个碱基之间、长度在1000-4000个碱基之间、长度在1000-5000个碱基之间、长度在1000-6000个碱基之间、长度在1000-7000个碱基之间、长度在1000-8000个碱基之间，长度在1000-9000个碱基之间或长度在1000-10,000个碱基之间。
外源序列可以长度大于或等于10个碱基、长度大于或等于20个碱基、长度大于或等于30个碱基碱基、长度大于或等于40个碱基长度、长度大于或等于50个碱基长度、长度大于或等于60个碱基长度、长度大于或等于70个碱基、长度大于或等于80个碱基、长度大于或等于90个碱基长度或者长度大于或等于95个碱基。外源序列可以长度在1-100个碱基之间、长度在1-90个碱基之间、长度在1-80个碱基之间、长度在1-70个碱基之间、长度在1-60个碱基之间、长度在1-50个碱基之间、长度在1-40个碱基之间或者长度在1-30个碱基之间。外源序列可以长度在1-20个碱基之间、长度在2-20个碱基之间、长度在3-20个碱基之间、长度在5-20个碱基之间、长度在10-20个碱基之间或者长度在15-20个碱基之间。外源序列可以长度在1-10个碱基之间、长度在2-10个碱基之间、长度在3-10个碱基之间、长度在5-10个碱基之间、长度在1-5个碱基之间或者长度在1-15个碱基之间。外源序列的长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、115、120、125、150、175、200、225或250个碱基。外源序列的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碱基。外源序列可以大于约200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb或这些大小之间的任何模板大小。
在引入多个外源序列的实例中，多个外源序列可以具有不同的大小，例如第一外源序列可以大于或等于100个碱基并且第二外源序列可以大于或等于100个碱基，或者第一外源序列可以大于或等于100个碱基并且第二外源序列可以是少于100个碱基(例如长度在1-100个碱基之间)。
一般来说，质粒供体模板是环状DNA质粒。在一些情况下，质粒供体模板是双链质粒。在一些情况下，质粒供体模板是单链质粒。在一些情况下，质粒供体模板是微环。在一些情况下，质粒供体模板是纳米质粒。
可以将CDL靶序列和/或HDR模板组件(同源臂、感兴趣基因等)引入到任何格式的dsDNA模板中，包括通过PCR、限制酶消化或任何其他线性化方法产生的线性dsDNA序列，以及诸如质粒的环状dsDNA序列。在质粒的情况下，CDL靶序列可以克隆到质粒的同源臂和DNA插入区外部中，包括但不限于邻近同源臂的边缘。与线性dsDNA模板类似，DNA结合蛋白复合物(例如，由Cas9和gRNA制成的RNP)可以与质粒DNA模板短暂温育，以允许DNA质粒在引入到细胞中(例如，通过电穿孔)之前通过RNP结合。参见例如国际专利公开号WO2018232356的图1、2和10B以及国际专利公开号WO2019084552的第[0100]段。
质粒供体模板还可以在CDL靶序列和HDR模板之间含有一个或多个附加间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列可具有至少2个核苷酸，例如2和24个之间的核苷酸(例如2和22个之间、2和20个之间、2和18个之间、2和16个之间、2和14个之间、2和12个之间、2和10个之间、2和8个之间、2和6个之间、2和4个之间、4和24个之间、6和24个之间、8和24个之间、10和24个之间、12和24个之间、14和24个之间、16和24个之间、18和24个之间、20和24个之间或22和24个之间的核苷酸；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)。
VII.可靶向核酸酶
如上所述，在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，可靶向核酸酶是RNA引导的核酸酶(例如，Cas蛋白)。可靶向核酸酶可以识别同源核酸序列的序列(例如，基因组内的靶基因和/或CDL靶序列)，结合至同源核酸序列，并且修饰同源核酸序列。在其他实施方案中，可靶向核酸酶可以是融合蛋白，其包含可结合同源核酸序列的蛋白质和可修饰同源核酸序列的蛋白质(例如，核酸酶、转录激活因子或阻遏物)。
在一些实施方案中，可靶向核酸酶具有核酸酶活性。例如，可靶向核酸酶可以通过切割同源核酸序列来修饰同源核酸序列。然后，切割的同源核酸序列可以与附近的同源定向修复(HDR)模板(例如HDR模板提供了质粒供体模板)进行同源重组(例如经由HMEJ)。例如，Cas核酸酶可以在同源核酸序列中的某个位置处引导一条或两条链的切割。Cas核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、其同源物、其变体、其突变体、以及其衍生物。Cas核酸酶主要有3种类型(I型、II型和III型)和10个亚型，包括5种I型、3种II型和2种III型蛋白(参见例如Hochstrasser和Doudna，Trends Biochem Sci，2015:40(1):58-66)。II型Cas核酸酶包括Cas1、Cas2、Csn2、Cas9和Cfp1。这些Cas核酸酶是本领域技术人员已知的。例如，酿脓链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列阐述于例如NBCI参考序列编号NP_269215中，并且嗜热链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列阐述于例如NBCI参考序列编号WP 011681470。
Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶，可以来源于多种细菌物种，包括但不限于非典型韦荣菌(Veillonella atypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、莫雷梭菌(Solobacterium moorei)、灵巧粪球菌(Coprococcuscatus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、杜尔丹尼蛋白胨菌(Peptoniphilusduerdenii)、三冈粪链菌(Catenibacterium mitsuokai)、变形链球菌(Streptococcusmutans)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、假中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈欧氏菌(Olsenella uli)、北原酒球菌(Oenococcus kitaharae)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、移动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasma canis)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌芽孢菌亚种(Lactobacillus coryniformissubsp.Torquens)、营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、微小迷踪菌(Elusimicrobiumminutum)、嗜硝酸盐水杆菌(Nitratifractor salsuginis)、球形刺毛菌(Sphaerochaetaglobus)、产琥珀酸丝状杆菌产琥珀酸菌亚种(Fibrobacter succinogenessubsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、彩虹普雷沃菌(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、寡食氨基酸单胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、海洋古螺旋菌暂定种(Candidatus Puniceispirillummarinum)、蚯蚓肾寄生菌(Verminephrobacter eiseniae)、丁香罗尔斯通氏菌(Ralstoniasyzygii)、芝江沟鞭玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)、固氮螺菌属(Azospirillum)、汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、空肠弯曲杆菌弯曲杆菌亚种(Campylobacter jejunisubsp Jejuni)、雪貂螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、乌氏食酸菌(Acidovorax ebreus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、肠道罗斯菌(Roseburiaintestinalis)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴氏杆菌多杀菌亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterellawadsworthensis)、变形菌属(proteobacterium)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、人粪类萨特菌(Parsutterella excrementihominis)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinellasuccinogenes)和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)。
Cas9蛋白是指RNA引导的双链DNA结合核酸酶蛋白或切口酶蛋白。野生型Cas9核酸酶具有切割不同DNA链的两个功能域，例如RuvC和HNH。当两个功能域都具有活性时，Cas9可以诱导基因组DNA(靶DNA)中的双链断裂。Cas9酶可包含来源于属于由以下组成的组的细菌的Cas9蛋白的一个或多个催化结构域：棒状杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、支原体(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、黄维菌属(Flaviivola)、黄杆菌属(Flavobacterium)、单丝壳属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡萄糖醋杆菌(Gluconacetobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗斯氏菌属(Roseburia)、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)和弯曲杆菌属(Campylobacter)。在一些实施方案中，Cas9蛋白可以是融合蛋白，例如两个催化结构域来源于不同的细菌物种。
在一些实施方案中，Cas蛋白可以是Cas蛋白变体。例如，Cas9核酸酶的有用变体可以包括单个无活性催化结构域，诸如RuvC-或HNH-酶或切口酶。Cas9切口酶仅具有一个活性功能域，并且仅切割同源核酸序列的一条链，从而产生单链断裂或切口。在一些实施方案中，Cas9核酸酶可以是具有一个或多个氨基酸突变的突变Cas9核酸酶。例如，具有至少D10A突变的突变体Cas9是Cas9切口酶。在其他实施方案中，具有至少H840A突变的突变Cas9核酸酶是Cas9切口酶。Cas9切口酶中存在的突变的其他实例包括但不限于N854A和N863A。如果使用至少两个靶向相反DNA链的DNA靶向RNA，则可以使用Cas9切口酶引入双链断裂。双切口诱导的双链断裂可以通过NHEJ或HDR修复(Ran等人，2013，Cell，154:1380-1389)。Cas9核酸酶或切口酶的非限制性实例描述于例如美国专利号8,895,308；8,889,418；和8,865,406以及美国申请公开号2014/0356959、2014/0273226和2014/0186919中。Cas9核酸酶或切口酶可以针对靶细胞或靶生物体进行密码子优化。
在一些实施方案中，Cas蛋白变体缺乏切割(例如，完全切割或切口酶)活性。Cas蛋白变体可能含有一个或多个点突变，从而消除了该蛋白质的切口酶活性。在一些实施方案中，Cas蛋白变体可以与其他蛋白质融合并充当靶向结构域以将其他蛋白质引导至靶核酸。例如，不具有切割活性的Cas蛋白变体可以与转录激活或抑制结构域融合以控制基因表达(Ma等人，Protein and Cell，2(11):879-888，2011；Maeder等人，Nature Methods，10:977-979，2013；以及Konermann等人，Nature，517:583-588，2014)。缺乏切割活性的Cas蛋白变体可用于靶向基因组区域，从而实现RNA引导的转录控制。在一些实施方案中，不具有任何切割活性的Cas蛋白变体可用于将外源蛋白靶向靶核酸。外源蛋白可以与Cas蛋白变体融合。外源蛋白可以是效应蛋白结构域。外源蛋白可以是转录激活因子或阻遏物。外源蛋白的其他实例包括但不限于VP64-p65-Rta(VPR)、VP64、P65、Krab、十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶(TET)和DNA甲基转移酶(DNMT)。下文还描述了缺乏切割(例如切口酶)活性的特定Cas蛋白变体。
在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是高保真度或增强特异性的Cas9多肽变体，其具有减少的脱靶效应和稳健的中靶切割。具有提高的中靶特异性的Cas9多肽变体的非限制性实例包括SpCas9(K855A)、SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)(也称为eSpCas9(1.0))和描述于Slaymaker等人，Science，351(6268):84-8(2016)中的SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)(也称为eSpCas9(1.1))变体，以及描述于Kleinstiver等人，Nature，529(7587):490-5(2016)中的含有以下突变中的一个、两个、三个或四个的SpCas9变体：N497A、R661A、Q695A和Q926A(例如SpCas9-HF1包含所有四个突变)。
在一些实施方案中，可靶向核酸酶还可以是含有可以结合至同源核酸序列的蛋白质和可以切割同源核酸序列的蛋白质的融合蛋白。例如，能够识别并结合至同源核酸序列的蛋白质可以是不具有任何切割活性的Cas蛋白变体。不具有任何切割活性的Cas蛋白变体可以是含有RuvC1和HNH核酸酶结构域的两个沉默突变(D10A和H840A)的Cas9多肽，也称为dCas9(Jinek等人，Science，2012，337:816-821；Qi等人，Cell，152(5):1173-1183)。在一个实施方案中，来自化脓性链球菌的dCas9多肽包含位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987或其任何组合处的至少一个突变。此类dCas9多肽及其变体的描述提供于例如国际专利公开号WO 2013/176772中。dCas9酶可以包含D10、E762、H983或D986处的突变，以及H840或N863处的突变。在一些情况下，dCas9酶可以包含D10A或D10N突变。此外，dCas9酶可以包含H840A、H840Y或H840N。在一些实施方案中，dCas9酶可以含有D10A和H840A；D10A和H840Y；D10A和H840N；D10N和H840A；D10N和H840Y；或D10N和H840N取代。取代可以是保守性或非保守性取代，以使Cas9多肽为催化失活的，同时仍能够结合至同源核酸序列。
在其他实施方案中，能够识别并结合至同源核酸序列的蛋白质可以是转录激活因子样(TAL)效应子DNA结合蛋白质或锌指DNA结合蛋白。TAL效应子DNA结合蛋白具有DNA结合串联重复序列的中心结构域，其通常含有33-35个氨基酸长度，并且含有位置12和13处的两个高变氨基酸残基，可以识别一个或多个特定DNA碱基对。锌指DNA结合蛋白具有DNA结合基序，其特征通常是不存在或存在一个或多个锌离子，以便协调和稳定基序折叠。锌指DNA结合蛋白含有多个指状突起，可与其靶分子串联接触。一些锌指DNA结合蛋白也会形成盐桥来稳定指状折叠。它们首先被鉴定为非洲爪蟾(Xenopus laevis)(非洲爪蛙)转录因子TFIIIA中的DNA结合基序，但现在它们被认为可以结合DNA、RNA、蛋白质和/或脂质底物。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法中的可靶向核酸酶可以是含有TAL效应子DNA结合蛋白和可以切割同源核酸序列的蛋白质的融合蛋白(也称为“转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)”)。在其他实施方案中，本文所述的组合物和方法中的可靶向核酸酶可以是含有锌指DNA结合蛋白和可切割同源核酸序列的蛋白质的融合蛋白。例如，可以切割同源核酸序列的蛋白质可以是野生型或突变型FokI核酸内切酶或FokI的催化结构域。TALEN及其用于基因编辑的用途的详细描述可见于例如美国专利号8,440,431；8,440,432；8,450,471；8,586,363；和8,697,853；Scharenberg等人.，Curr Gene Ther，2013，13(4):291-303；Gaj等人.，Nat Methods，2012，9(8):805-7；Beurdeley等人.，Nat Commun，2013，4:1762；以及Joung和Sander，Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14(1):49-55。与可切割靶核酸的蛋白质融合的锌指DNA结合蛋白的实例在本领域中有描述，并且包括但不限于Urnov等人.，Nature Reviews Genetics，2010，11:636-646；Gaj等人.，Nat Methods，2012，9(8):805-7；美国专利号6,534,261；6,607,882；6,746,838；6,794,136；6,824,978；6,866,997；6,933,113；6,979,539；7,013,219；7,030,215；7,220,719；7,241,573；7,241,574；7,585,849；7,595,376；6,903,185；6,479,626；以及美国申请公开号2003/0232410和2009/0203140中描述的那些。
在一些实施方案中，可靶向核酸酶不具有核酸酶活性。例如，可靶向核酸酶(例如，没有任何核酸酶活性的可靶向核酸酶)可以调节同源核酸序列的表达。在一些实施方案中，可靶向核酸酶可以是融合蛋白，其包含可以结合至同源核酸序列的蛋白质，例如没有任何切割活性的Cas蛋白变体(例如，dCas9)、如上所述的TAL效应子DNA结合蛋白和锌指DNA结合蛋白以及可以修饰同源核酸序列的蛋白质，例如转录激活因子或阻遏物。
靶向核酸酶还可与定位肽或蛋白质融合。例如，可靶向核酸酶可与一个或多个核定位信号(NLS)序列融合，后者可将可靶向核酸酶及其形成的RNP复合物引导至细胞核以修饰同源核酸序列。NLS序列的实例是本领域已知的，例如如Lange等人，J Biol Chem.282(8):5101-5，2007中所述，并且还包括但不限于AVKRPAATKKAGQAKK KKLD、MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK和PKKKRKV。可用于可靶向核酸酶的其他肽或蛋白质的实例，诸如细胞穿透肽和细胞靶向肽在本领域中是可获得的并且描述于例如Vivès等人，Biochim Biophys Acta.1786(2):126-38，2008。
修饰靶核酸(例如，基因组靶序列，诸如T细胞基因组中)的核酸酶可以与能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶相同。在说明性非限制性实例中，修饰靶核酸的可靶向核酸酶和能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶都是Cas9蛋白。修饰靶核酸的可靶向核酸酶可不同于能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶。例如，修饰靶核酸的可靶向核酸酶可以是Cas9蛋白，并且能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是TALEN、ZFN或非Cas9蛋白。在另一个实例中，修饰靶核酸的可靶向核酸酶可以是TALEN、ZFN或非Cas9蛋白，并且能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是Cas9蛋白。
能够切割第一CDL靶序列的可靶向核酸酶可以与能够切割第二CDL靶序列的可靶向核酸酶相同。在说明性非限制性实例中，能够切割第一CDL靶序列的可靶向核酸酶和能够切割第二CDL靶序列的可靶向核酸酶都是Cas9蛋白。能够切割第一CDL靶序列的可靶向核酸酶可以不同于能够切割第二CDL靶序列的可靶向核酸酶。例如，能够切割第一CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是Cas9蛋白，并且能够切割第二CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是TALEN、ZFN或非Cas9蛋白。在另一个实例中，能够切割第一CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是TALEN、ZFN或非Cas9蛋白，并且能够切割第二CDL靶序列的可靶向核酸酶可以是Cas9蛋白。
VIII.CDL靶序列
共递送线性化(CDL)靶序列是被能够切割CDL靶序列的可靶向核酸酶识别并结合的核苷酸序列。在本文所述的组合物和方法中，CDL靶序列侧接HDR模板，使得HDR模板可以被线性化或从质粒供体模板中切除。不希望受理论约束，线性化/切除的HDR模板可以促进同源介导的末端连接(HMEJ)，而作为质粒递送可以降低细胞毒性。因此，CDL靶序列可以帮助提高敲入细胞产率，诸如通过提高同源性定向修复效率和/或降低细胞毒性。
在一些实施方案中，CDL靶序列可以被DNA结合蛋白直接，例如TAL效应子DNA结合蛋白或锌指DNA结合蛋白识别并结合。在其他实施方案中，CDL靶序列可以通过供体gRNA被DNA结合蛋白例如RNA引导的核酸酶间接识别并结合。在一些实施方案中，CDL靶序列中至少60％(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％)的核苷酸可以与供体gRNA中的相应核苷酸进行沃森-克里克碱基配对接合。在一些实施方案中，当CDL靶序列和供体gRNA杂交时，CDL靶序列可以具有至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)与供体gRNA中的相应核苷酸错配的核苷酸。错配碱基的实例包括鸟嘌呤和尿嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以及腺嘌呤和胞嘧啶配对。在一些实施方案中，CDL靶序列是靶核酸的一部分(例如，细胞的基因组靶)。
一般来说，如上所述，CDL靶序列存在于质粒供体模板中的HDR模板的两个末端。CDL靶序列以及当Cas系统时质粒供体模板中的相应PAM可以具有如上所述的不同构造。在一些实施方案中，CDL靶序列与供体gRNA序列的等长部分互补。在一些实施方案中，CDL靶序列具有至少17个核苷酸，例如17和20个之间的核苷酸(例如17和19个之间、17和18个之间、18和20个之间、18和19个之间、或17、18、19或20个核苷酸)。在一些实施方案中，与供体gRNA序列的等长部分相比，CDL靶序列是部分互补的，即包含核苷酸错配。例如，与供体gRNA序列的20个核苷酸部分相比，具有20个核苷酸的DNA结合蛋白靶序列可具有1至6个核苷酸错配(例如，1和5个之间、1和4个之间、1和3个之间、1和2个之间的核苷酸错配；1、2、3、4、5或6个核苷酸错配)。
IX.细胞中的基因靶向核酸
本文所述的组合物可用于修饰细胞中的靶核酸的方法，所述细胞例如真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞等。任选地，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。细胞可以是体外、离体或体内。细胞还可以是原代细胞、生殖细胞、干细胞或前体细胞。前体细胞可以是例如多能干细胞或造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是原代造血细胞、原代造血干细胞或原代T细胞。在一些实施方案中，原代造血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4-CD8-T细胞。在一些实施方案中，T细胞是αβT细胞，在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。还提供了通过本文描述的任何方法修饰的任何细胞的群体。在一些实施方案中，所述方法还包括扩增修饰的细胞群。
在一个特定方面，提供了细胞群(例如，T细胞群)。细胞群可以包含本文描述的任何修饰的细胞。修饰的细胞可以位于异质细胞群和/或不同细胞类型的异质群体内。就基因组编辑的细胞百分比而言，细胞群可能是异质的。细胞群可以具有大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的群体包含整合的核苷酸序列。在某个方面，细胞群包含整合的核苷酸序列，其中整合的核苷酸序列包含基因的至少一部分，整合的核苷酸序列整合在内源基因组靶基因座处，并且整合的核苷酸序列定向为使得基因的至少一部分能够被表达，其中细胞群基本上不含病毒介导的递送组分，并且其中群体中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的细胞包含整合的核苷酸序列。
细胞群可以具有大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、或大于97％、大于98％、大于99％、大于99.5％、或大于99.9％的群体包含整合的核苷酸序列。细胞群可以具有大于20％的细胞群包含整合的核苷酸序列。细胞群可以具有大于30％的细胞群包含整合的核苷酸序列。细胞群可以具有大于60％的细胞群包含整合的核苷酸序列。细胞群可以具有大于70％的细胞群包含整合的核苷酸序列。
细胞可以包括包含非病毒插入序列诸如外源序列的细胞。细胞可以是无病毒的。细胞可以基本上不含病毒。细胞可包含非病毒插入到至少一个靶区域中的至少一种核酸序列(例如，包含至少一个异源基因)。在某些方面，细胞不包含例如用于引入至少一种核酸序列诸如供体模板的病毒载体。
细胞可以包括一个或多个原代细胞，其包含大小为至少200个碱基对的非病毒插入的外源序列。原代细胞可以是原代造血细胞或原代造血干细胞。原代细胞可以是原代造血细胞，并且原代造血细胞可以是免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞。原代细胞可以是人细胞。在一些方面，原代细胞不包含病毒载体。外源序列的大小可以大于选自由以下组成的组的长度：200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb和5.0kb。外源序列的大小可以大于1.5kb。外源序列的大小可以是约200bp至约500bp、约200bp至约750bp、约200bp至约1kb、约200bp至约1.5kb、约200bp至约2.0kb、约200bp至约2.5kb、约200bp至约3.0kb、约200bp至约3.5kb、约200bp至约4.0kb、约200bp至约4.5kb、约200bp至约5.0kb。外源序列的大小可以大于约1kb。外源序列可以包括调节序列，任选地其中调节序列包括启动子序列和/或增强子序列。
外源序列可以编码异源蛋白或其片段。外源序列可以编码嵌合抗原受体(CAR)。外源序列可以编码T细胞受体(TCR)。
细胞可包括原代人T细胞，其包含大小大于1kb的非病毒插入的DNA模板。
细胞可以包括原代人T细胞，其包含：至少一种核酸序列，其包含非病毒插入到以下一者或两者的至少一个靶区域中的至少一个异源基因：内源性T细胞受体α亚基恒定基因(TRAC)和内源性T细胞受体β亚基恒定基因(TRBC)，所述至少一个异源基因包含以下至少一个：(1)异源T细胞受体α(TCR-α)链基因的可变区和(2)异源T细胞受体β的可变区(TCR-β)链基因。在一些方面，T细胞不包含用于将至少一种核酸序列引入到T细胞中的病毒载体。在一些方面，至少一种核酸序列的大小为至少1.5kb。在一些方面，至少一种核酸序列的大小为至少500bp。在一些方面，靶区域位于TRAC的外显子1、2或3中。在一些方面，靶区域位于TRBC的外显子1、2或3中。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些方面，至少一个异源基因包含以下至少一者：(1)异源T细胞受体α(TCR-α)链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区，以及(2)异源T细胞受体β(TCR-β)链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区。在一些方面，至少一个异源基因包含以下每一者：(1)异源T细胞受体α(TCR-α)链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区，以及(2)异源T细胞受体β(TCR-β)链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区。在一些方面，T细胞包含以下每一者：(1)异源TCR-α链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区，和(2)异源TCR-β链基因的a)可变区或b)可变区和恒定区。在一些方面，异源基因在表达后形成抗原特异性T细胞受体(TCR)。在一些方面，异源TCR-α链基因和异源TCR-β链基因通过接头序列可操作地连接，任选地，接头序列是可切割的接头序列或多顺反子元件。在一些方面，将异源TCR-α链基因和异源TCR-β链基因插入到TRAC中。在一些方面，至少一个异源基因的表达由内源启动子驱动。在一些方面，相对于对照T细胞，细胞中TRAC和TRBC之一者或两者的表达降低，其中对照T细胞是缺乏非病毒插入的原代人T细胞。
细胞可以包括原代人T细胞，其包含：至少一种核酸序列，其包含插入到以下一者或两者的至少一个靶区域中的至少一个异源基因：内源性T细胞受体α亚基恒定基因(TRAC)和内源性T细胞受体β亚基恒定基因(TRBC)，所述至少一个异源基因包含以下至少一者：(1)异源T细胞受体α(TCR-α)链基因的可变区和(2)异源T细胞受体β的可变区(TCR-β)链基因，并且其中T细胞不包含用于将至少一种核酸序列引入到T细胞中的病毒载体。
细胞可包括原代细胞，其包含：至少一种核酸序列，其包含非病毒插入到细胞基因组的至少一个靶区域中的至少一个异源基因。在一些方面，至少一个异源基因编码CAR或其他嵌合受体。在一些方面，至少一个异源基因包含以下至少一种或两种：(1)异源T细胞受体α(TCR-α)链基因的可变区和(2)异源T细胞受体β(TCR-β)链基因的可变区。在一些方面，原代细胞是T细胞。在一些方面，细胞不包含用于将至少一种核酸序列引入到细胞中的病毒载体。在一些方面，至少一种核酸序列的大小为至少1.5kb。在一些方面，至少一种核酸序列的大小为至少500bp。在一些方面，靶区域是在TRAC中，例如TRAC的外显子1、2或3。在一些方面，靶区域是在TRBC中，例如TRBC的外显子1、2或3。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些方面，至少一个异源基因的表达由内源启动子驱动。在一些方面，相对于对照T细胞，T细胞中TRAC和TRBC之一者或两者的表达降低，其中对照T细胞是缺乏非病毒插入的原代人T细胞。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供此类信号和共刺激信号的CAR，诸如包含来自共刺激受体诸如CD28或CD137的胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的胞外部分和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体并且胞内结构域含有ITAM。在一些方面，胞内信号传导结构域包括CD3的ζ链(CD3ζ链)的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接胞外结构域和胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜通过间隔区，诸如本文描述的任何间隔区连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域，诸如在跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。在一些实施方案中，CAR含有抗体，例如抗体片段、是或含有CD28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域以及含有CD28或其功能变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能变体的信号传导部分的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体，例如抗体片段、是或含有CD28或其功能变体的跨膜部分的跨膜结构域以及含有4-1BB或其功能变体的信号传导部分和CD3ζ或其功能变体的信号传导部分的胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(例如人Ig分子)的一部分的间隔区，例如Ig铰链，例如IgG4铰链，例如仅有铰链的间隔区。在一些实施方案中，受体例如CAR的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28的27个氨基酸跨膜结构域(登录号：P10747.1)。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含人CD28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号传导结构域，诸如其41个氨基酸结构域和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的此类结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含41BB或其功能变体或部分的胞内共刺激信号传导结构域，诸如人4-1BB(登录号Q07011.1)或其功能变体或部分的42个氨基酸的胞质结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，诸如人CD3ζ同种型3的112AA胞质结构域(登录号：P20963.2)或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。
用于修饰本文所述的细胞中的靶核酸的方法包括将本文所述的组合物引入到细胞中，其中将HDR模板被整合到靶核酸。如实施例中所示，在将组合物引入到细胞之前将可靶向核酸酶(例如，RNA引导核酸酶)和供体gRNA RNP复合物与供体模板(包含CDL靶序列修饰的HDR模板)预温育增强了敲入细胞产率。在一些实施方案中，本文描述的组合物通过电穿孔引入到细胞中。
在一些情况下，将细胞从受试者体内取出，使用本文所述的任何方法进行修饰并向受试者施用。在其他情况下，本文描述的组合物可以体内递送到受试者。参见例如美国专利号9737604以及Zhang等人.“Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery ofCRISPR/Cas9 for tumor therapy,”NPG Asia Materials第9卷，第e441页(2017)。
在具体实施方案中，本文描述的组合物可以用于修饰原代细胞中的靶核酸的方法中。本文描述的组合物可用于在原代细胞中诱导靶核酸的稳定基因修饰的方法中。在一些实施方案中，所述方法包括将包含Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)、一种或多种单引导RNA(sgRNA)和阴离子聚合物的组合物引入到原代细胞中。sgRNA可包含与靶核酸互补的第一核苷酸序列和与Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)相互作用的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，Cas蛋白(例如Cas9蛋白)和sgRNA可一起温育以形成RNP复合物，之后引入到原代细胞中。可以将包含Cas蛋白(例如Cas9蛋白)、一种或多种单引导RNA(sgRNA)和质粒供体模板的组合物电穿孔至原代细胞中。在一些实施方案中，原代细胞选自由以下组成的组：免疫细胞(例如，原代T细胞)、血细胞、其祖细胞或干细胞、间充质细胞及其组合。在一些情况下，免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、其前体及其组合。祖细胞或干细胞可以选自由以下组成的组：造血祖细胞、造血干细胞及其组合。在一些情况下，血细胞是血液干细胞。在一些情况下，间充质细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、间充质祖细胞、间充质前体细胞、分化的间充质细胞及其组合。分化的间充质细胞可以选自由以下组成的组：骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞、真皮细胞及其组合。在一些实施方案中，原代细胞可以构成原代细胞群。在一些情况下，原代细胞群包含异源原代细胞群。在其他情况下，原代细胞群包含同源原代细胞群。
在一些实施方案中，从哺乳动物分离原代细胞，之后将本文所述的组合物引入到原代细胞中。例如，原代细胞可以从人受试者中收获。在一些情况下，在将本文所述的组合物引入到原代细胞后，将原代细胞或其子代返回至哺乳动物。换句话说，对基因改造的原代细胞进行自体移植。在其他情况下，对基因改造的原代细胞进行同种异体移植。例如，从供体受试者中分离出未经过稳定基因改造的原代细胞，然后将经过基因改造的原代细胞移植到与供体受试者不同的受体受试者中。
可以使用本领域中可用的方法和技术将本文所述的组合物引入到细胞(例如原代细胞)中。合适方法的非限制性实例包括电穿孔、粒子枪技术和直接显微注射。在一些实施方案中，将本文所述的组合物引入到细胞中的步骤包括将组合物电穿孔至细胞中。
在一些实施方案中，在大于约5％的细胞群(例如，原代细胞群)，例如约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约12％、约14％、约16％、约18％、约20％、约22％、约24％、约26％、约28％或约30％的细胞群中诱导靶核酸的稳定基因修饰。在一些实施方案中，在大于约50％的细胞群(例如，原代细胞群)，例如约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的细胞群中诱导靶核酸的稳定基因修饰。在其他实施方案中，在大于约70％的细胞群，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的细胞群中诱导靶核酸的稳定基因修饰。在其他实施方案中，在大于约90％的细胞群，例如约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的细胞群中诱导靶核酸的稳定基因修饰。
在其他实施方案中，靶核酸的稳定基因修饰包括靶核酸中基因突变的替换(例如，纠正与疾病相关的靶核酸中的点突变或单核苷酸多态性(SNP))或插入包含正常拷贝的靶核酸的开放阅读框(ORF)(例如，敲入与疾病相关的靶核酸的野生型cDNA)。
在一些实施方案中，本文描述的任何方法还可以包括纯化具有靶核酸的稳定基因修饰的细胞(例如，原代细胞)。在一些情况下，通过纯化步骤分离的组合物包含至少约80％具有靶核酸的稳定基因修饰的细胞，例如约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多具有靶核酸的稳定基因修饰的细胞。
公开了材料、组合物和组分，其可用于所公开的方法和组合物、可与所公开的方法和组合物结合使用、可用于制备所公开的方法和组合物或为所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确地公开这些化合物的各个单独和集合的组合和排列的具体参考，但是每一者都应在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且讨论了可以对在所述方法中包括的一个或多个分子进行的许多修改，则具体考虑了所述方法的每一种组合和排列以及可能的修改，除非特别指出相反情况。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑并公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多个可以执行的附加步骤，应当理解，每个附加步骤可以所公开的方法中任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合的子集被具体考虑并应考虑公开。
本文引用的出版物以及它们所引用的材料特此以引用的方式整体并入。
实施例
以下实施例仅以说明的方式提供，而非以限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相同或相似的结果的各种非关键参数。
实施例1-实验方法
T细胞培养
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)在使用Lymphoprep(STEMCELL Technologies)从正常供体Leukopaks(STEMCELL Technologies)制备的外周血单核细胞(PBMC)中富集T细胞。随后在补充有3％人AB血清(Gemini Bio)和12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基(Miltenyi 130-197-196)中用1:1珠与细胞比率的CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher，40203D)活化T细胞，并使其在电穿孔前在37℃、5％ CO2下生长48小时。
RNP制备及T细胞电穿孔
通过将120μM sgRNA(Synthego)靶向DNA序列AAGTCTCT CAGCTGGTACA(SEQ ID NO:1)、62.5μM sNLS-SpCas9-sNLS蛋白质(Aldevron)和P3缓冲液(Lonza)以5:1:3:6的比率组合来制备CRI SPR RNP。将一系列质量范围(终浓度范围在0-100mg/l之间)的质粒DNA(具有HDR模板的质粒[编码具有Myc表位标签和450bp侧翼同源臂的转基因的约5.7kb插入物]，其具有或没有CDL-HDR同源臂侧翼序列)与3.5μl RNP混合。对T细胞进行计数，在90X G下离心10分钟，并以10^6个细胞/14.5μl添加补充物(Lonza)的P3重悬。将14.5μl T细胞悬液添加到DNA/RNP混合物中，转移到Lo nza 384孔Nucleocutte板上的孔中，并在代码为EH-115的Lonza HT Nucleofector系统中进行脉冲。将细胞在室温下静置15分钟，然后转移至96孔板(Sarstedt)中的TexMACS培养基中，所述培养基补充有12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)。
流式细胞术分析
通过用抗Myc抗体(Cell Signaling Technology克隆9B11)染色来检测转基因表达(带有Myc表位标签的感兴趣基因)，并在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。所用的其他抗体是TCRα/β抗体(BioLegend克隆IP26)、CD4抗体(BioLegend克隆RPA-T4)、CD8抗体(BioLegend克隆SK1)。
序列
CRISPR原型间隔区(例如，CDL靶序列)：GAGCCATGCTTGGCTTACGA
完整CRISPR位点、原型间隔区和示例性PAM：GAGCCATGCTTGGCTTACGAGGG
所用的标准质粒供体主链序列(X表示长度为5696bp的转基因插入位置为；标准大写表示同源臂)：
所用的CDL质粒供体主链序列(X表示长度为5696bp的转基因插入位置为；粗体表示原型间隔区(CDL靶序列)；小写斜体表示PAM；标准大写表示同源臂)：
实施例2-用于对T细胞进行CRISPR介导的基因编辑的共递送线性化(CDL)设计
探索了使用RNP电穿孔对T细胞进行基因工程化，将质粒供体模板与以下项比较：(1)同源定向修复模板盒(HDRT)，所述盒的特征在于仅被同源臂侧接的标准HDRT设计的转基因(图1–左图)，或者(2)共传递线性化(CDL)设计，其中HDRT另外侧接有CDL靶序列(与用于靶向T细胞基因组的CRISPRgRNA的原型间隔区相匹配的CRISPR靶位点)和原型间隔区相邻基序(PAM)(图1–右图)。
如图2中所示，用具有不同量的标准或CDL质粒供体模板的RNP复合物电穿孔T细胞，然后通过流式细胞术评估转基因整合(图2A，在表1中量化)。CDL设计在较低剂量的HDRTDNA下表现出比没有CDL序列修饰的标准HDRT质粒更高的KI％(图2B，在表2中量化)。此外，与标准HDRT质粒相比，在这些低DNA剂量下，总体T细胞产率增加(图2C，在表3中量化)。因此，与标准质粒设计相比，CDL供体质粒设计证明基因工程化T细胞的产率显着增加(P＜0.0001)。另外，当使用所有测试浓度的CDL HDRT模板时，CD8与CD4 T细胞的比率小于约0.5，与标准HDRT质粒相反(图3，在表4中量化)。还使用不同剂量的标准质粒或CDL质粒，通过变异系数百分比(％CV)和最大与最小比率(最大/最小倍数)评估来自4个单个供体的T细胞的敲入细胞产率的变异性。值得注意的是，与剂量≤0.5的标准质粒设计相比，CDL设计的产率之间的差异明显更低(表5)。数据表明，对于电穿孔介导的Cas9 T细胞编辑，CDL供体质粒设计在供体之间产生了更大的产率和更大的产率一致性，并且是细胞工程化过程中的主要优点。
表1-敲入百分比代表性流式图的量化(Myc-Tag％)
表2-敲入百分比的量化(Myc-Tag％)
表3-敲入细胞产率的量化
表4-CD8/CD4比率的量化
表5-多个供体的敲入细胞产率的变异性
实施例3-临床规模平台上的性能以及将CDL序列包含在HDR盒中增加了临床规模转染后具有转基因整合的细胞的百分比
材料和方法
原代人T细胞的分离和活化。通过单采术从健康供体收集的新鲜细胞群获自HemaCare Corporation。使用Miltenyi CD4 CD8分离阳性分离试剂盒和MiltenyiAutoMACS Pro分离器从供体细胞群中分离CD4和CD8 T细胞。使用ThermoFisher Dynabeads人T-活化因子CD3/CD28分离后，活化分离的CD4/8T细胞。在补充有3％人AB血清(GeminiBio)以及IL7和IL15(Miltenyi Biotech)的Miltenyi TexMACS培养基中活化细胞。添加活化培养基后，将细胞在37℃下温育48小时。
用于电穿孔的原代人T细胞的制备：活化后，将T细胞从活化容器中取出并转移至50mL锥形管中。遵循Miltenyi Biotech提供的去除珠粒的方案，获得无珠粒的、活化的细胞群。
用于电穿孔的核糖核蛋白复合物制备：靶向GS94基因座的单引导RNA获自Synthego Corporation，并在TE/水中重悬至工作浓度。半胱天冬酶蛋白spCas9获自Aldevron。使引导RNA和半胱天冬酶蛋白在室温下复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
质粒DNA。含有CDL序列的质粒DNA是由Elim Bio自行设计和制备的。
电穿孔介导的原代T细胞转染。对如上所述制备的活化的T细胞进行计数，并将每个电穿孔反应的5e7个细胞转移至50mL锥形管中。将细胞在300x g下沉淀5分钟，然后用DPBS洗涤并在300x g下沉淀5分钟。然后将细胞重悬于Lonza P3缓冲液中。计算缓冲液的体积，使得添加RNP和DNA后细胞悬液的总体积为1mL。为了评估多个DNA构建体的性能，选择包含转基因“X”的三个CDL和三个非CDL构建体进行测试。对于每个构建体，每次转染使用20ugDNA。将DNA与RNP溶液混合，然后与细胞悬液充分混合。然后将细胞、RNP和DNA悬液转移至Lonza LV盒中。将细胞在Lonza LV装置上进行电穿孔，并在电穿孔后在室温下恢复10分钟。然后将细胞混合物转移至含有350mL培养基的G-rex 100(Wilson Wolf Manufacturing)并在37℃下温育。
分析流式细胞术结果。在转染后第6天或活化后第8天通过流式细胞术收集结果。为了准备用于分析的细胞，将对照孔混合以获得均质溶液，并使用Nexcelom K2Cellometer使用AOPI染色进行计数，以区分活细胞和死细胞。使用所获得的值，从每个孔中取出2e5细胞并将其转移至96孔V形底板。将细胞沉淀，然后在染色缓冲液(BDBiosciences)中洗涤一次，并在400x g下沉淀5分钟。在离心期间，制备染色溶液。流程包括以下：Myc PE(BioLegend)和Zombie L/D染色剂(BioLegend)。将细胞重悬于染色溶液中并在4℃下温育30分钟。温育后，将染色缓冲液添加到孔中，并将细胞以400x g沉淀5分钟。然后将细胞用染色缓冲液洗涤一次并重悬于补充有计数珠粒(ThermoFisher)的染色缓冲液中。在ThermoFisher Attune细胞仪上进行流式分析，并使用FlowJo软件分析结果。
结果
临床规模平台上的性能。在先前描述的平台上的CRISPR-Cas9系统的背景和与细胞治疗产品的临床制造相关的规模的下评估了修饰含有同源定向修复模板的质粒的核酸序列以包括紧邻5’HDR臂上游和3′HDR臂下游的CDL序列的效果。本研究的目的是证明CDL序列在临床环境中的实用性，并强调该技术在制造细胞治疗产品方面的适用性。
在HDR盒中包含CDL序列可增加在临床规模转染后具有转基因整合的细胞百分比。在电穿孔后第6天评估用含有CDL序列GAGCCATGCTTGGCTTACGA和编码转基因的序列的质粒或包含编码不含CDL序列的转基因的序列的对照质粒电穿孔的T细胞的细胞数量和转基因表达。编码转基因的多核苷酸序列的长度为：6533个碱基对的长度(对于质粒pS3798)、7042个碱基对的长度(对于质粒pS3631)和6236个碱基对的长度(对于质粒pS3797)。图4所示的结果表明，与接受含有对照、非CDL位点的质粒的条件相比，在接受含有CDL序列的质粒的条件下，转基因表达显着(p＜0.05)增加。携带整合转基因的细胞百分比的差异很明显。平均而言，在20ug DNA条件下，通过流式细胞术评估的转基因表达从非CDL条件下的3.35％增加到CDL条件下的9.76％。总之，这些数据证明了包含CDL序列对基因编辑过程的增强作用。
参考文献
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Claims (60)
1.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
(a)可靶向核酸酶蛋白；和
(b)质粒供体模板，其包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者均能够被所述可靶向核酸酶蛋白或包含所述可靶向核酸酶蛋白的复合物切割，并且
其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白是RNA引导的核酸酶。
3.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含RNA，所述RNA包含与所述CDL靶序列互补的至少17个核苷酸。
4.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。
5.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的所述复合物的供体引导RNA(gRNA)，并且其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
6.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第一供体引导RNA(gRNA)、第二供体gRNA，所述第一供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，所述第二供体gRNA包含与所述第二CDL靶序列互补的至少17个核苷酸，其中每个供体gRNA被构造成形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的不同复合物，并且其中所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
7.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述供体gRNA中的一者或多者包含与所述细胞的基因组靶序列互补的至少17个核苷酸细胞。
8.如如权利要求0所述的组合物，其中所述HDR模板包含与侧接所述细胞的所述基因组靶序列的核酸序列互补的同源臂。
9.如权利要求0的组合物，其中所述同源臂的长度各自独立地选自以下长度：至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp或至少2000bp。
10.如权利要求1所述的组合物，其中：
(a)所述可靶向核酸酶包括RNA引导的核酸酶，其中所述RNA引导的核酸酶包括CRISPR-CAS；
(b)所述组合物还包含供体引导RNA(gRNA)，其被构造为形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的所述复合物；和
(c)其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
11.一种用于修饰靶核酸的组合物，其包含：
(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；
(b)供体引导RNA(gRNA)；和
(c)质粒供体模板，其包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)，并且
其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
12.如权利要求1至0中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第二可靶向核酸酶蛋白，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白或包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物能够切割所述细胞的基因组靶序列。
13.如权利要求0所述的组合物，其中所述第二可靶向核酸酶蛋白质是RNA引导的核酸酶。
14.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含第二RNA，所述第二RNA包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸。
15.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas蛋白。
16.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述第二可靶向核酸酶蛋白的复合物的靶引导RNA(gRNA)，并且其中(1)所述靶gRNA包含与所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述基因组靶序列可操作地连接至位于所述基因组靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
17.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述第一CDL靶序列、所述第二CDL靶序列和所述基因组靶序列序列包含相同的核酸序列。
18.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述基因组靶序列包含安全港核酸序列。
19.如权利要求0所述的组合物，其中所述安全港核酸序列包含核酸序列GAGCCATGCTTGGCTTACGA。
20.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述PAM序列中的一个、两个在所述CDL靶序列和所述HDR模板之间编码或都不编码。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶和每种所述gRNA的摩尔比分别为1:10和2:1之间。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶向核酸酶和所述供体模板的摩尔比分别为10:1至1000:1。
23.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白包含转录激活因子样(TAL)效应子DNA结合蛋白和核酸酶。
24.如权利要求1或0所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或第二可靶向核酸酶蛋白包含锌指DNA结合蛋白和核酸酶。
25.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白与核定位信号(NLS)序列融合。
26.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述可靶向核酸酶蛋白和/或所述第二可靶向核酸酶蛋白是Cas9蛋白。
27.一种用于修饰细胞中的靶核酸的方法，其包括将如权利要求1至0中任一项所述的组合物引入或提前以非病毒方式引入到所述细胞中，其中所述HDR模板被整合到所述靶核酸中。
28.如权利要求0所述的方法，其中所述引入包括电穿孔。
29.如权利要求0或0所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
30.如权利要求0所述的方法，其中所述原代细胞是原代T细胞。
31.一种用于修饰靶核酸的核糖核蛋白复合物，其包含如权利要求1至0中任一项所述的组合物。
32.一种用于修饰靶核酸的核糖核蛋白复合物，其包含
(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；和
(b)供体引导RNA(gRNA)，其中所述供体gRNA包含与共递送线性化(CDL)靶序列互补的至少17个核苷酸，并且
其中所述组合物被配制用于以非病毒方式递送到细胞中。
33.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含质粒供体模板，所述质粒供体模板包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
34.一种用于修饰细胞中的靶核酸的方法，其包括将如权利要求0或0中任一项所述的组合物引入到所述细胞中。
35.如权利要求0所述的方法，其中所述引入包括电穿孔。
36.如权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
37.如权利要求0所述的方法，其中所述原代细胞是原代T细胞。
38.上述方法权利要求中的任一项，其中所述方法在体内进行、在体外进行或离体进行。
39.一种形成核糖核蛋白(RNP)复合物的方法，其包括温育或提前温育(a)CRISPR-CASRNA引导的核酸酶；和(b)供体引导RNA(gRNA)，其中所述供体gRNA包含与共递送线性化(CDL)靶序列互补的至少17个核苷酸。
40.如权利要求0所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述gRNA一起在37℃下温育至少17分钟。
41.如权利要求0或0所述的方法，其中gRNA:Cas蛋白的摩尔比在0.25:1至4:1之间。
42.如权利要求0至0中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物具有小于100nm的大小。
43.如如权利要求0所述的方法，其中所述RNP复合物具有在20nm和90nm之间的大小。
44.一种组合物，其包含质粒供体模板，所述质粒供体模板包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者均能够被可靶向核酸酶蛋白或包含所述可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。
45.如权利要求0所述的组合物，其中所述组合物还包含被构造为形成包含所述可靶向核酸酶蛋白的复合物的供体引导RNA(gRNA)。
46.如权利要求0或0所述的组合物，其中所述组合物包含所述可靶向核酸酶蛋白。
47.如权利要求0至0中任一项所述的组合物，其中所述供体模板包含5'至3'序列：P1a-N1-P2b-H-P3c-N2-P4d，并且其中：
(1)P1、P2、P3、P4为PAM序列；
(2)N1为所述第一CDL靶序列，并且N2为所述第二CDL靶序列；
(3)H为所述HDR模板；
(4)a为0并且b为1，或者a为1并且b为0；并且
(5)c为0并且d为1；或者c为1并且d为0。
48.一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：
-提供所述细胞，以及
-将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：
(a)可靶向核酸酶蛋白；和
(b)质粒供体模板，其包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列各自能够被所述可靶向核酸酶蛋白或包含所述可靶向核酸酶蛋白的复合物切割。
49.一种用于修饰细胞的靶核酸的方法，所述方法包括：
-提供所述细胞，以及
-将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：
(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；
(b)供体引导RNA(gRNA)；和
(c)质粒供体模板，其包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)。
50.一种用于修饰细胞的基因组靶序列的方法，所述方法包括：
-提供所述细胞，以及
-将配制用于以非病毒方式递送的组合物引入或提前引入到所述细胞中，所述组合物包含：
(a)CRISPR-CAS RNA引导的核酸酶；
(b)供体引导RNA(gRNA)；和
(c)质粒供体模板，其包含：
(i)同源定向修复(HDR)模板，其包含被同源臂侧接的用于插入的核酸；
(ii)第一共递送线性化(CDL)靶序列，其中所述第一CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的5'；和
(iii)第二CDL靶序列，其中所述第二CDL靶序列可操作地连接至所述HDR模板的3’，并且
其中(1)所述供体gRNA包含与所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者互补的至少17个核苷酸，并且(2)所述第一CDL靶序列和所述第二CDL靶序列中的每一者可操作地连接至位于所述CDL靶序列3'的3碱基对原型间隔区相邻基序(PAM)
其中所述供体gRNA包含与所述细胞的所述基因组靶序列互补的至少17个核苷酸，并且
其中所述同源臂与侧接所述细胞的所述基因组靶序列的核酸序列互补，其中所述用于插入的核酸被构造用于插入到所述细胞的所述基因组靶序列中。
51.如权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
52.如权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述T细胞是原代T细胞。
55.如权利要求48至54中任一项所述的方法，其中所述引入配制用于以非病毒方式递送的所述组合物包括电穿孔。
56.如权利要求48至55中任一项所述的方法，其中供体模板的量为至少约80、10-120、10、20、30、40、50、60、70、90、100、110或120mg。
57.如权利要求55所述的方法，其中用于单个电穿孔反应的细胞数量为至少约5、1-10、1、2、3、4、6、7、8、9或10e7个。
58.如权利要求57所述的方法，其中所提供的细胞总数至少大于10e7并且进行多于一次电穿孔反应。
59.如权利要求48至58中任一项所述的方法，其中细胞悬液的总体积为约1mL。
60.如权利要求48至59中任一项所述的方法，其中相对于其他方面相同但缺乏所述CDL靶序列的对照组合物，所述方法导致所述细胞的所述基因组靶序列中的模板插入增加，任选地其中所述模板插入相对于对照增加至少约1-5、1、2、3、4或5倍。
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