JP2024513967A - 非ウイルス相同性媒介末端結合 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、非ウイルス遺伝子編集技術を使用して、指定されたゲノム遺伝子座にカセットを挿入して、Ｔ細胞などの遺伝子操作された細胞を産生するための組成物及び方法が提供される。対象における疾患を治療または予防するために遺伝子操作された細胞を使用する方法も、提供される。TIFF2024513967000012.tif101153
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，４６８号の利益を主張するものであり、その全体が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，４６８号の利益を主張するものであり、その全体が、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
開示の背景
クラスター化され、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質の応用は、ゲノム編集を可能にすることにより分子生物学に革命をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、新しい科学的ツールを作り出し、臨床的に関連のある変異を修正し、新しい細胞ベースの免疫療法を開発する可能性を秘めた強力かつ実用的な潜在力のあるツールである。ウイルス送達ベクター及びエレクトロポレーションは、免疫細胞におけるＣＲＩＳＰＲベースの編集のための２つの戦略として浮び上がってきた。しかしながら、遺伝子治療の分野は、ウイルス送達ベクターの複雑さをはらんでいる。
クラスター化され、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質の応用は、ゲノム編集を可能にすることにより分子生物学に革命をもたらした。ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、新しい科学的ツールを作り出し、臨床的に関連のある変異を修正し、新しい細胞ベースの免疫療法を開発する可能性を秘めた強力かつ実用的な潜在力のあるツールである。ウイルス送達ベクター及びエレクトロポレーションは、免疫細胞におけるＣＲＩＳＰＲベースの編集のための２つの戦略として浮び上がってきた。しかしながら、遺伝子治療の分野は、ウイルス送達ベクターの複雑さをはらんでいる。
科学的ツール及び潜在的な治療手段の両方を免疫工学に提供してＴ細胞、造血幹細胞、及び人工多能性幹細胞の操作を可能にする。ヒト細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集が発見されるまで、免疫系を対象とした遺伝子治療は、ほとんど全くレトロウイルス及びレンチウイルスなどのウイルスベクターに依存して、遺伝子の（半）ランダム組込みにより導入遺伝子を挿入した。しかしながら、臨床試験では、癌原遺伝子への挿入及びウイルスベクターに対する致命的な全身免疫反応により、白血病などの予期せぬ結果がもたらされていた。遺伝子損傷及び免疫反応を最小限に抑えるようにウイルスベクターが改良されたにも関わらず、ウイルス挿入（ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するために臨床的に使用されるレンチウイルスなど）は、遺伝子の過剰発現、例えば、内因性調節を受けない遺伝子の過剰発現を引き起こし、この方法の臨床的有用性を制限する場合がある。
非ウイルスＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集に対して説明した。しかしながら、そのようなシステムを使用した編集効率及び／または生存率は一般に低い。例えば、現在の方法を使用して編集効率を高めると、細胞の生存率が低下するという代価を伴い、その逆の場合も同様である。編集効率及び生存率が改善された方法など、改善された非ウイルスＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集方法が必要とされている。
概要
本明細書では、標的核酸を修飾するための組成物であって、組成物が、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該組成物を提供する。
本明細書では、標的核酸を修飾するための組成物であって、組成物が、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該組成物を提供する。
本明細書ではまた、標的核酸を修飾するための組成物であって、組成物が、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該組成物を提供する。
本明細書では、細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、方法が、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、当該方法を提供する。
本明細書ではまた、細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、方法が、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、当該方法を提供する。
本明細書ではまた、細胞のゲノム標的配列を修飾するための方法であって、方法が、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）（ｉ）相同アームに挟まれた挿入のための核酸を含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含むプラスミドドナー鋳型とを含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、ドナーｇＲＮＡは、細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、相同アームは、細胞のゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的であり、挿入のための核酸は、細胞のゲノム標的配列に挿入されるように構成される、当該方法を提供する。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、組成物は、ＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含むＲＮＡをさらに含む。いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。
いくつかの態様において、組成物は、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される。いくつかの態様において、組成物は、第１のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第１のドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、第２のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のドナーｇＲＮＡとをさらに含み、各ドナーｇＲＮＡは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む別個の複合体を形成するように構成され、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される。いくつかの態様において、１つ以上のドナーｇＲＮＡは、細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＨＤＲ鋳型は、細胞のゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的な相同アームを含む。いくつかの態様において、相同アームは、それぞれ独立して、少なくとも４００ｂｐの長さ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐの長さから選択される。
いくつかの態様において、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、（ｂ）組成物は、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、かつ（ｃ）（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される。
いくつかの態様において、組成物は、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質をさらに含み、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体は、細胞のゲノム標的配列を切断することが可能である。いくつかの態様において、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、組成物は、ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のＲＮＡをさらに含む。いくつかの態様において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様において、組成物は、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成された標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）標的ｇＲＮＡは、ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）ゲノム標的配列は、ゲノム標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される。
いくつかの態様において、第１のＣＤＬ標的配列、第２のＣＤＬ標的配列、及びゲノム標的配列は、同じ核酸配列を含む。
いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、セーフハーバー（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）核酸配列を含む。いくつかの態様において、セーフハーバー核酸配列は、核酸配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡを含む。いくつかの態様において、ＰＡＭ配列の一方もしくは両方が、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間でコードされるか、または前記ＰＡＭ配列のどちらもが、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間でコードされない。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼ及び各ｇＲＮＡは、それぞれ、１：１０～２：１のモル比である。いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼ及びドナー鋳型は、それぞれ、１０：１～１０００：１のモル比である。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列に融合される。
いくつかの態様において、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
本明細書ではまた、細胞内の標的核酸を修飾するための方法であって、方法が、本明細書に記載の任意の組成物を細胞内に導入すること、または本明細書に記載の任意の組成物を細胞内に非ウイルス的に導入したことを含み、ＨＤＲ鋳型は標的核酸に組み込まれる、当該方法を提供する。いくつかの態様において、導入は、エレクトロポレーションを含む。いくつかの態様において、細胞は、初代細胞である。いくつかの態様において、初代細胞は、初代Ｔ細胞である。
本明細書ではまた、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む、標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体を提供する。
本明細書ではまた、標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体であって、リボヌクレオタンパク質複合体が、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含むドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、組成物が細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該リボヌクレオタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、組成物は、（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型をさらに含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される。
本明細書ではまた、細胞内の標的核酸を修飾するための方法であって、方法が、本明細書に記載のリボヌクレオタンパク質複合体のいずれかを細胞に導入することを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様において、導入は、エレクトロポレーションを含む。いくつかの態様において、細胞は、初代細胞である。いくつかの態様において、初代細胞は、初代Ｔ細胞である。いくつかの態様において、方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われる。
本明細書ではまた、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する方法であって、方法が、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをインキュベートすることまたはインキュベートしたことを含む、当該方法を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、３７℃で少なくとも１７分間一緒にインキュベートされる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質のモル比は、０．２５：１～４：１である。いくつかの態様において、ＲＮＰ複合体は、１００ｎｍ未満の大きさを有する。いくつかの態様において、ＲＮＰ複合体は、２０ｎｍ～９０ｎｍの大きさを有する。
本明細書ではまた、（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型を含む組成物であって、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、当該組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む。
いくつかの態様において、ドナー鋳型は、５’から３’に向かって、Ｐ１ａ－Ｎ１－Ｐ２ｂ－Ｈ－Ｐ３ｃ－Ｎ２－Ｐ４ｄの配列を含み、配列中、（１）Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ＰＡＭ配列であり、（２）Ｎ１は、第１のＣＤＬ標的配列であり、Ｎ２は、第２のＣＤＬ標的配列であり、（３）Ｈは、ＨＤＲ鋳型であり、（４）ａは０、ｂは１であるか、またはａは１、ｂは０であり、（５）ｃは０、ｄは１であるか、または、ｃは１、ｄは０である。
ある態様において、本明細書に記載されているのは、細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、当該方法である。ある態様において、本明細書に記載されているのは、細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型とを含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、当該方法である。ある態様において、本明細書に記載されているのは、細胞のゲノム標的配列を修飾するための方法であって、細胞を提供することと、非ウイルス送達のために製剤化された組成物を細胞内に導入することまたは導入したこととを含み、組成物は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）（ｉ）相同アームに挟まれた挿入のための核酸を含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型とを含み、（１）ドナーｇＲＮＡは、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、ドナーｇＲＮＡは、細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、相同アームは、細胞のゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的であり、挿入のための核酸は、細胞のゲノム標的配列に挿入されるように構成される、当該方法である。ある実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。ある実施形態において、細胞は、免疫細胞である。ある実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。ある実施形態において、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である。ある実施形態において、非ウイルス送達のために製剤化された組成物の導入には、エレクトロポレーションが含まれる。ある実施形態において、ドナー鋳型の量は、少なくとも約８０、１０～１２０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１００、１１０、または１２０μｇである。ある実施形態において、個々のエレクトロポレーション反応のための細胞の数は、少なくとも約５、１～１０、１、２、３、４、６、７、８、９、または１０ｅ７である。ある実施形態において、提供される細胞の総数は、少なくとも１０ｅ７よりも大きく、１回超のエレクトロポレーション反応が実施される。ある実施形態において、細胞懸濁液の総体積は、約１ｍＬである。ある実施形態において、当該方法により、ＣＤＬ標的配列を含まないがそれ以外は同一の対照組成物と比較して、細胞のゲノム標的配列における鋳型挿入が増加し、任意で、対照と比較して、少なくとも約１～５、１、２、３、４、または５倍に鋳型挿入が増加する。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形の参照対象を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形の参照対象を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」系は、外来核酸に対する防御のための細菌系の一種を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、広範囲の真正細菌及び古細菌生物で発見される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系には、タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブタイプが含まれる。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ガイドＲＮＡ及び活性化ＲＮＡ（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）と複合体を形成したＲＮＡ媒介性ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９タンパク質を利用して、外来核酸、例えば天然または修飾ヌクレオチドを含む外来核酸を認識し切断する。
本明細書で使用される場合、「標的化可能ヌクレアーゼ」という用語は、同種核酸配列（例えば、ゲノム内の標的遺伝子及び／またはＣＤＬ標的配列）の配列を認識し、該同種核酸配列に結合することが可能なタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列を修飾し得る。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓタンパク質であり得る。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列に結合し得るタンパク質（例えば、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質またはジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質）及び同種核酸配列を修飾し得るタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子、または抑制因子）を含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有する。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有しない。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、標的核酸を切断することによって、同種核酸配列を修飾し得る。切断された標的核酸は、次いで、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）などを通じて、隣接した相同性指向性修復鋳型との相同組換えを受けることが可能である。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、いずれのヌクレアーゼ活性もない標的化可能ヌクレアーゼ）は、同種核酸配列の発現を調節し得る。例えば、標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質及び転写活性化因子を含む融合タンパク質であり得る。
本明細書で使用される場合、「プラスミドドナー鋳型」という用語は、相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型及びＣＤＬ標的配列を含むポリヌクレオチドを指す。ＨＤＲ鋳型は、５’相同アーム、ヌクレオチドインサート（例えば、外因性配列及び／または異種タンパク質もしくはその断片をコードする配列）、及び３’相同アーム（例えば、図１を参照）を含み得る。本明細書にさらに記載されるように、エレクトロポレーション前の、標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）とドナーｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体及びプラスミドドナー鋳型のプレインキュベーションは、ノックイン効率の向上及び／または細胞毒性の低減など、ノックイン収量を向上させる。
本明細書で使用される場合、「共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列」という用語は、標的化可能ヌクレアーゼによって認識されて結合するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼ、例えば、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質またはジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ＣＤＬ標的配列を直接的に認識して結合することができる。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼ、例えばＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ドナーｇＲＮＡを介してＣＤＬ標的配列を間接的に認識して結合することができる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ドナーｇＲＮＡがＣＤＬ標的配列にハイブリダイズするうちに、ドナーｇＲＮＡに結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ゲノム標的核酸の一部である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」とは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合し、ｇＲＮＡを利用してＤＮＡポリヌクレオチド内の領域に選択的に結合するヌクレアーゼを指す。一般に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡに相補的なＤＮＡポリヌクレオチド内のほぼ全ての配列に選択的に結合することが可能である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有し、ＤＮＡポリヌクレオチド中のヌクレオチド間の結合（例えば、ホスホジエステル結合）を切断することができる。他の実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有さず、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに融合された他のタンパク質（例えば、転写活性化因子または抑制因子）を、ＤＮＡポリヌクレオチド内の関心領域に選択的に結合及び／または局在化するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、同種核酸配列にハイブリダイズすることによって、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を同種核酸配列に誘導することができるＤＮＡ標的化ＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、（１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを同種核酸配列に誘導するガイド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分）及び（２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと相互作用するスキャフォールド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分）を含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、（１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを同種核酸配列に誘導するガイド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分）及び（２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと相互作用するスキャフォールド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分）からなる２つの構成成分であり得る。ガイド配列の一部は、スキャフォールド配列の一部にハイブリダイズして、２つの成分ガイドＲＮＡを形成し得る。
本明細書で使用される場合、「標的ガイドＲＮＡ」または「標的ｇＲＮＡ」という用語は、例えば、Ｔ細胞のゲノム及び／またはゲノム上のセーフハーバー位置など、ＨＤＲ鋳型の組み込みが求められるＤＮＡポリヌクレオチド内の位置で、修飾される同種核酸配列にハイブリダイズすることができるｇＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ドナーガイドＲＮＡ」または「ドナーｇＲＮＡ」という用語は、プラスミドドナー鋳型内のＣＤＬ標的配列にハイブリダイズすることができるｇＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ドナーｇＲＮＡの配列のうちの長さが等しい部分に対して相補的（例えば、部分的に相補的または完全に相補的）であり得る。
本明細書で使用される場合、「一本鎖ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という用語は、（１）Ｃａｓを同種核酸配列に対して標的化するガイド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分）及び（２）Ｃａｓタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分）を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチド間の塩基対合の能力、ならびにあるポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとの塩基対合の能力を指す。いくつかの実施形態において、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドに対して「完全な相補性」を有し得るか、または「完全に相補的」であり得る。これは、２つのポリヌクレオチドが任意選択で整列される場合、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の対応するヌクレオチドとワトソンクリック塩基対合に関与できることを意味する。他の実施形態において、一方のポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドに対して「部分的な相補性」を有し得るか、または「部分的に相補的」であり得る。これは、２つのポリヌクレオチドが任意選択で整列される場合、一方のポリヌクレオチド中の少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％）であるが１００％未満のヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の対応するヌクレオチドとワトソンクリック塩基対合に関与できることを意味する。言い換えれば、２つのポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合、少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）のミスマッチヌクレオチド塩基対が存在する。ワトソンクリック塩基対合に関与するヌクレオチドの対としては、例えば、アデニンとチミン、シトシンとグアニン、及びアデニンとウラシルが挙げられ、これらの全ての対は、水素結合によって形成される。ミスマッチ塩基の例としては、グアニンとウラシル、グアニンとチミン、アデニンとシトシン対合が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質」という用語は、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返しタンパク質またはヌクレアーゼを指す。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質変異体であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に属するＣａｓタンパク質の一例である（例えば、Ｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ１１７：１１９，２０１５）。Ｃａｓタンパク質の他の例は、本明細書でさらに詳細に説明される。天然に存在するＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、一般に、部位特異的なＤＮＡ認識及び切断のため、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。ｃｒＲＮＡは、部分的な相補性領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと結合し、「プロトスペーサー」と称される標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同である領域にＣａｓタンパク質を誘導する。天然に存在するＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡを切断し、ｃｒＲＮＡ転写物内に含まれるガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断部に平滑末端を生成する。本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的ｇＲＮＡまたはドナーｇＲＮＡと結合して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有する。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しない。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓタンパク質変異体」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質の配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換）を有するＣａｓタンパク質、及び／または野生型Ｃａｓタンパク質の切断型バージョンもしくは断片である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、野生型Ｃａｓタンパク質の配列に対して、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性）を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、野生型Ｃａｓタンパク質の断片であり、野生型Ｃａｓタンパク質の配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。Ｃａｓタンパク質変異体は、Ｃａｓ９タンパク質変異体であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、ヌクレアーゼ活性を有する。他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、ヌクレアーゼ活性を有しない。
本明細書で使用される場合、「リボヌクレオタンパク質複合体」または「ＲＮＰ複合体」という用語は、Ｃａｓタンパク質またはその変異体（例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体）及びｇＲＮＡを含む複合体を指す。
本明細書で使用する場合、細胞のゲノム中の標的核酸を修飾するという文脈における「修飾する」という用語は、標的核酸に変化（例えば、切断）を誘導することを指す。いくつかの実施形態において、変化は、標的核酸の配列における構造変化であり得る。例えば、標的核酸にヌクレオチド配列を挿入する形態で修飾を実施し得る。例えば、外因性ヌクレオチド配列を標的核酸に挿入し得る。標的核酸を切除して外因性ヌクレオチド配列と置換することも可能である。他の例としては、標的核酸にヌクレオチド配列を挿入することなく、標的核酸を切断する形態で修飾を実施し得る。例えば、標的核酸を切断し、切除することが可能である。このような修飾は、例えば、標的核酸内に二本鎖切断部を誘導するか、または反対側の鎖に一対の一本鎖ニックを誘導し、標的核酸に隣接させて行うことが可能である。標的核酸においてまたは標的核酸内で一本鎖または二本鎖切断部を誘導する方法としては、標的核酸を対象とした本明細書に記載の標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を使用することが挙げられる。他の実施形態において、標的核酸を修飾することは、別のタンパク質を標的核酸に標的化することを含み、標的核酸を切断することは含まない。
本出願は、以下の図を含む。図面は、組成物及び方法のある実施形態及び／または特徴を例示すること、及び組成物及び方法の説明（複数可）を補足することを意図している。記載された説明がそのようなことが当てはまることを明示的に示さない限り、図面は組成物及び方法の範囲を限定しない。
カセットのゲノム挿入を媒介するためのＣＤＬ（共送達直鎖化）プラスミド設計の例示的なメカニズムを示す概念図である。右側に示すように、ＣＤＬ配列（ＨＤＲ組み込みのためのＣａｓ９ゲノム標的と同一性を有するＣａｓ９標的配列）と、３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを、カセットを挟む相同アームの外側に追加することにより、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）媒介エンドヌクレアーゼを活性化させて、ゲノム内のＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ媒介切断に加え、プラスミドからカセットと相同アームを放出する。これに対して、左側に示す標準プラスミドでは、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰがプラスミドは切断せず、ゲノム遺伝子座のみを切断する。
図２は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ及び標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞のノックイン（ＫＩ）効率及びＫＩ細胞収量を示すフローサイトメトリーのドットプロット及びグラフである。図２Ａは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＰと、標準プラスミド（上段パネル）またはＭＹＣタグ付き表面タンパク質をコードするＣＤＬプラスミド（下段パネル）のいずれかの、様々な用量（左から右に向けて増加、０～１００ｍｇ／Ｌの範囲）の相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞の一連のフローサイトメトリーのドットプロットを示す。図２Ｂは、標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合のＫＩ％を示すグラフである。図２Ｃは、標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合の、開始細胞１００万個当たりのＫＩ＋生存細胞（生／死染色；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）収量を示すグラフである。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合のＣＤ８／ＣＤ４比率を示すグラフである。
エレクトロポレーション後６日目において、ＣＤＬ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡを含む３つのプラスミド及びＣＤＬ配列を含まない３つのプラスミド用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞の導入遺伝子発現を示すグラフである。
開示の詳細な説明
以下に、本発明の組成物及び方法の様々な態様及び実施形態を挙げて説明する。特定の実施形態は、組成物及び方法の範囲を定義することを意図するものではない。むしろ、実施形態は、開示される組成物及び方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物及び方法の非限定的な例を提供するだけである。この説明は、当業者の観点から読まれるべきであり、したがって、当業者に周知の情報は必ずしも含まれているわけではない。
以下に、本発明の組成物及び方法の様々な態様及び実施形態を挙げて説明する。特定の実施形態は、組成物及び方法の範囲を定義することを意図するものではない。むしろ、実施形態は、開示される組成物及び方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物及び方法の非限定的な例を提供するだけである。この説明は、当業者の観点から読まれるべきであり、したがって、当業者に周知の情報は必ずしも含まれているわけではない。
Ｉ．序論
ウイルス修飾Ｔ細胞は、がん免疫療法のために承認されているが、より広範囲の養子細胞療法のための、より汎用的でありかつ正確なゲノム修飾が求められている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１６（５）：２８１－２９５，２０１９、Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：６３７２，２０１８、Ｃｏｒｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：４１５－４２３，２０１７、及びＤａｖｉｄ ａｎｄ Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ １５５：３１５－３２５，２０１７）。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼ系は、ゲノムを操作するために使用することができる細菌系に基づいた遺伝子操作ヌクレアーゼ系である。この系は、多くの細菌及び古細菌の適応免疫応答の一部に基づいている。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のＤＮＡセグメントは「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換する。ｃｒＲＮＡは、部分的な相補性領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと称される他のタイプのＲＮＡと結合し、「プロトスペーサー」と称される標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同である領域にＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを誘導する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、ｃｒＲＮＡ転写物内に含まれる２０個のヌクレオチドを有するガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断部に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、部位特異的なＤＮＡ認識と切断のためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする場合がある。この系は現在、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを１つの分子（「一本鎖ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）に組み合わせること、及びｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分を操作して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを誘導し、任意の所望の配列を標的化することができるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１、及びＳｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３を参照すること）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を操作することにより、細胞のゲノム内の所望の標的で二本鎖切断部を作製し、細胞の内因性メカニズムを利用して、相同性指向修復（ＨＤＲ）または非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘導された切断部を修復することができる。
ウイルス修飾Ｔ細胞は、がん免疫療法のために承認されているが、より広範囲の養子細胞療法のための、より汎用的でありかつ正確なゲノム修飾が求められている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１６（５）：２８１－２９５，２０１９、Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：６３７２，２０１８、Ｃｏｒｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３：４１５－４２３，２０１７、及びＤａｖｉｄ ａｎｄ Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ １５５：３１５－３２５，２０１７）。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼ系は、ゲノムを操作するために使用することができる細菌系に基づいた遺伝子操作ヌクレアーゼ系である。この系は、多くの細菌及び古細菌の適応免疫応答の一部に基づいている。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のＤＮＡセグメントは「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換する。ｃｒＲＮＡは、部分的な相補性領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと称される他のタイプのＲＮＡと結合し、「プロトスペーサー」と称される標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同である領域にＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを誘導する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断し、ｃｒＲＮＡ転写物内に含まれる２０個のヌクレオチドを有するガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断部に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、部位特異的なＤＮＡ認識と切断のためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする場合がある。この系は現在、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを１つの分子（「一本鎖ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」）に組み合わせること、及びｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分を操作して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼを誘導し、任意の所望の配列を標的化することができるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１、及びＳｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３を参照すること）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を操作することにより、細胞のゲノム内の所望の標的で二本鎖切断部を作製し、細胞の内因性メカニズムを利用して、相同性指向修復（ＨＤＲ）または非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘導された切断部を修復することができる。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型の末端に付加されると、ヌクレアーゼによって標的化される配列が、標的核酸の修飾効率を高めることができることを見出した。遺伝子修飾のためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を細胞に送達する、エレクトロポレーションなどの非ウイルス戦略により、ウイルスベクターに対する致命的な全身免疫応答、ウイルス送達の非効率性、及びウイルス挿入関連遺伝子過剰表現など、ウイルス送達に関連する多くの合併症が回避される。ただし、いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系送達に非ウイルス戦略を使用すると、大量のＨＤＲ鋳型が必要になり、用量依存性細胞毒性が発生する可能性がある。
ＩＩ．組成物
本開示では、標的核酸を修飾するための組成物及び方法であって、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該組成物及び方法が提供される。本明細書でさらに詳細に説明するように、いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼが転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである場合、ＴＡＬエフェクターは、ＣＤＬ標的配列を直接的に認識して結合することができる。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがジンクフィンガーである場合、ジンクフィンガーは、ＣＤＬ標的配列を直接的に認識して結合することができる。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）である場合、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列にハイブリダイズすることができるドナーｇＲＮＡを介して、ＣＤＬ標的配列に間接的に結合することができる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列を切断する役割を果たし、それによって、プラスミドドナー鋳型からＨＤＲ鋳型が切除され、ＨＤＲ鋳型は相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）に関与し得る。ノックイン効率は、ＤＮＡ誘導性細胞毒性を低減し得るだけでなく、本明細書に記載のＨＭＥＪ指向プロセスを介し、より少量のプラスミドドナー鋳型を使用して維持されるか、さらには増加され得る。したがって、ＣＤＬ標的配列は、標的細胞へのＨＤＲ鋳型の挿入効率を向上させると同時に、毒性を低減し、編集された細胞の全体的な収量を増加させることが可能である。
本開示では、標的核酸を修飾するための組成物及び方法であって、（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含む、プラスミドドナー鋳型とを含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、当該組成物及び方法が提供される。本明細書でさらに詳細に説明するように、いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼが転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである場合、ＴＡＬエフェクターは、ＣＤＬ標的配列を直接的に認識して結合することができる。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがジンクフィンガーである場合、ジンクフィンガーは、ＣＤＬ標的配列を直接的に認識して結合することができる。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）である場合、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列にハイブリダイズすることができるドナーｇＲＮＡを介して、ＣＤＬ標的配列に間接的に結合することができる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列を切断する役割を果たし、それによって、プラスミドドナー鋳型からＨＤＲ鋳型が切除され、ＨＤＲ鋳型は相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）に関与し得る。ノックイン効率は、ＤＮＡ誘導性細胞毒性を低減し得るだけでなく、本明細書に記載のＨＭＥＪ指向プロセスを介し、より少量のプラスミドドナー鋳型を使用して維持されるか、さらには増加され得る。したがって、ＣＤＬ標的配列は、標的細胞へのＨＤＲ鋳型の挿入効率を向上させると同時に、毒性を低減し、編集された細胞の全体的な収量を増加させることが可能である。
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ドナー鋳型は、ＣＤＬ標的配列に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をさらに含む。組成物はまた、修飾される標的核酸、例えば、細胞（例えば、Ｔ細胞）における導入遺伝子挿入のための所望の部位などのゲノム標的配列に相補的な標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み得る。標的ｇＲＮＡは、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと共に第１のＲＮＰ複合体を形成し、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を標的核酸に誘導し得る。いくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡの一部（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチド）である標的ｇＲＮＡの一部）は、標的核酸に相補的である。
本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ドナー鋳型は、ＣＤＬ標的配列に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）をさらに含む。組成物はまた、修飾される標的核酸、例えば、細胞（例えば、Ｔ細胞）における導入遺伝子挿入のための所望の部位などのゲノム標的配列に相補的な標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み得る。標的ｇＲＮＡは、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと共に第１のＲＮＰ複合体を形成し、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を標的核酸に誘導し得る。いくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡの一部（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチド）である標的ｇＲＮＡの一部）は、標的核酸に相補的である。
組成物はまた、ＣＤＬ標的配列に相補的であるドナーｇＲＮＡをさらに含み得る。ドナーｇＲＮＡは、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと共に第２のＲＮＰを形成し得る。ドナー鋳型内のＣＤＬ標的配列は、ドナーｇＲＮＡまたはその一部にハイブリダイズし得る。したがって、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ドナーｇＲＮＡ、及びドナー鋳型を含む複合体は、ＨＤＲ鋳型の切除を容易にし、理論に拘束されることを望むものではないが、標的ｇＲＮＡによって切断される標的核酸の組み込み部位で起こる相同組換えを促進し得る。いくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡの配列は同じである。いくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡの配列は相違する。いくつかの実施形態において、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは同じである。他の実施形態において、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは相違する。
組成物は、標的化可能ヌクレアーゼと標的ｇＲＮＡ及び／またはドナーｇＲＮＡとを、それぞれ１：１０～２：１（例えば、１：５～２：１、２：５～２：１、３：５～２：１、４：５～２：１、１：１～２：１、１：１０～１：１、１：１０～４：５、１：１０～３：５、１：１０～２：５、または１：１０～１：５）のモル比で含有し得る。組成物は、標的化可能ヌクレアーゼとプラスミドドナー鋳型とを、それぞれ１０：１～１０００：１（例えば、５０：１～１０００：１、１００：１～１０００：１、２００：１～１０００：１、３００：１～１０００：１、４００：１～１０００：１、５００：１～１０００：１、６００：１～１０００：１、７００：１～１０００：１、８００：１～１０００：１、９００：１～１０００：１、１０：１～９００：１、１０：１～８００：１、１０：１～７００：１、１０：１～６００：１、１０：１～５００：１、１０：１～４００：１、１０：１～３００：１、１０：１～２００：１、１０：１～１００：１、または１０：１～５０：１）のモル比で含有し得る。
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはまた、局在化ペプチドまたはタンパク質と融合し得る。例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列と融合することが可能であり、これによって、ヌクレアーゼ及びそれが形成するＲＮＰ複合体を核に導き、標的核酸を修飾することが可能である。ＮＬＳ配列の例としては、当該技術分野で周知のもの、例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５，２００７に記載されているものが挙げられ、また、ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ、及びＰＫＫＫＲＫＶが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過ペプチド及び細胞標的化ペプチドなどの、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに使用可能な他のペプチドまたはタンパク質の例としては、当該技術分野で入手可能であるもの、例えば、Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７８６（２）：１２６－３８，２００８に記載されているものが挙げられる。
ＩＶ．一本鎖ガイドＲＮＡ
Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって、切断されるそれぞれの同種ＤＮＡ（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）に誘導され得る。ｓｇＲＮＡは、天然に存在する２つの部分からなるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）を単一の連続配列に操作したものである。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を同種核酸配列に対して標的化するガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分）及びＣａｓタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（例えば、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ソフトウェアを使用して選択し得る。非限定的な例として、ｓｇＲＮＡを選択するための考慮事項には、例えば、使用されるＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列、及びオフターゲット修飾を最小限に抑えるための戦略が含まれ得る。ＮＵＰＡＣＫ（登録商標）及びＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールを用いて、ｓｇＲＮＡの調製、標的修飾効率の評価、及び／またはオフターゲット部位での切断の評価のための配列を提供することができる。
Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって、切断されるそれぞれの同種ＤＮＡ（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）に誘導され得る。ｓｇＲＮＡは、天然に存在する２つの部分からなるガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）を単一の連続配列に操作したものである。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を同種核酸配列に対して標的化するガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分）及びＣａｓタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（例えば、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ相当部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ソフトウェアを使用して選択し得る。非限定的な例として、ｓｇＲＮＡを選択するための考慮事項には、例えば、使用されるＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列、及びオフターゲット修飾を最小限に抑えるための戦略が含まれ得る。ＮＵＰＡＣＫ（登録商標）及びＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールを用いて、ｓｇＲＮＡの調製、標的修飾効率の評価、及び／またはオフターゲット部位での切断の評価のための配列を提供することができる。
ガイド配列
ｓｇＲＮＡ中のガイド配列は、同種核酸配列（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）内の特定の配列に相補的であり得る。同種核酸配列の３’末端の次にＰＡＭ配列が続くことが可能である。ガイド配列は一般に、ＰＡＭ配列の上流の約２０個のヌクレオチドに相補的である。一般に、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、ＰＡＭ配列の上流の約３個のヌクレオチドを切断する。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、同種核酸配列のいずれかの鎖に相補的であり得る。
ｓｇＲＮＡ中のガイド配列は、同種核酸配列（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）内の特定の配列に相補的であり得る。同種核酸配列の３’末端の次にＰＡＭ配列が続くことが可能である。ガイド配列は一般に、ＰＡＭ配列の上流の約２０個のヌクレオチドに相補的である。一般に、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、ＰＡＭ配列の上流の約３個のヌクレオチドを切断する。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、同種核酸配列のいずれかの鎖に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補性塩基対合を用いてＣａｓタンパク質を同種核酸配列に導くことが可能なｓｇＲＮＡの５’末端に、約１０～約２０００個の核酸、例えば、約１０～約１００個の核酸、約１０～約５００個の核酸、約１０～約１０００個の核酸、約１０～約１５００個の核酸、約１０～約２０００個の核酸、約５０～約１００個の核酸、約５０～約５００個の核酸、約５０～約１０００個の核酸、約５０～約１５００個の核酸、約５０～約２０００個の核酸、約１００～約５００個の核酸、約１００～約１０００個の核酸、約１００～約１５００個の核酸、約１００～約２０００個の核酸、約５００～約１０００個の核酸、約５００～約１５００個の核酸、約５００～約２０００個の核酸、約１０００～約１５００個の核酸、約１０００～約２０００個の核酸、または約１５００～約２０００個の核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補性塩基対合を用いてＣａｓタンパク質を同種核酸配列部位に導くことが可能なｓｇＲＮＡの５’末端に、約１００個の核酸を含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、ＲＮＡ－ＤＮＡ相補性塩基対合を用いてＣａｓタンパク質を同種核酸配列（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）部位に導くことが可能なｓｇＲＮＡの５’末端に、２０個の核酸を含む。他の実施形態において、ガイド配列は、同種核酸配列に相補的な２０個未満、例えば、１９、１８、または１７個以下の核酸を含む。いくつかの事例において、ｓｇＲＮＡ内のガイド配列は、同種核酸配列の相補性領域に少なくとも１個の核酸ミスマッチを含む。いくつかの事例において、ガイド配列は、同種核酸配列の相補性領域に約１～約１０個の核酸ミスマッチを含む。
スキャフォールド配列
ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、Ｃａｓタンパク質またはその変異体と相互作用するタンパク質結合配列としての役割を果たす。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する２つの相補的なヌクレオチドストレッチを含み得る。スキャフォールド配列は、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、及び／またはヘアピンなどの構造を有し得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、約９０個の核酸～約１２０個の核酸、例えば、約９０個の核酸～約１１５個の核酸、約９０個の核酸～約１１０個の核酸、約９０個の核酸～約１０５個の核酸、約９０個の核酸～約１００個の核酸、約９０個の核酸～約９５個の核酸、約９５個の核酸～約１２０個の核酸、約１００個の核酸～約１２０個の核酸、約１０５個の核酸～約１２０個の核酸、約１１０個の核酸～約１２０個の核酸、または約１１５個の核酸～約１２０個の核酸であり得る。
ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、Ｃａｓタンパク質またはその変異体と相互作用するタンパク質結合配列としての役割を果たす。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する２つの相補的なヌクレオチドストレッチを含み得る。スキャフォールド配列は、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、及び／またはヘアピンなどの構造を有し得る。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ中のスキャフォールド配列は、約９０個の核酸～約１２０個の核酸、例えば、約９０個の核酸～約１１５個の核酸、約９０個の核酸～約１１０個の核酸、約９０個の核酸～約１０５個の核酸、約９０個の核酸～約１００個の核酸、約９０個の核酸～約９５個の核酸、約９５個の核酸～約１２０個の核酸、約１００個の核酸～約１２０個の核酸、約１０５個の核酸～約１２０個の核酸、約１１０個の核酸～約１２０個の核酸、または約１１５個の核酸～約１２０個の核酸であり得る。
Ｖ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書に記載の標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、一般に、（１）同種核酸配列（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）に相補的であり、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを同種核酸配列に誘導するガイド配列、及び（２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと相互作用して結合するスキャフォールド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡを指す。本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、同じ配列を有する。本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、修飾される標的配列及びＣＤＬ標的配列の両方にハイブリダイズできる核酸配列を共有するなど、同じ配列を含む。本開示の他の実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、異なる配列を有する。本明細書に記載の組成物及び方法において、ｇＲＮＡは、同種核酸配列に相補的な部分を含む。ｇＲＮＡが標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）と共にＲＮＰ複合体を形成する場合、ＲＮＰ複合体は、ｇＲＮＡと同種核酸配列と間の相補性によって同種核酸配列に誘導され得る。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、まず同種核酸配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別することによって、同種核酸配列を「識別」する。ＰＡＭが識別されると、ＲＮＰ複合体のｇＲＮＡはＰＡＭの上流の同種核酸配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の約２０個のヌクレオチド上流の同種核酸配列部分に相補的なヌクレオチドの一部を含む。一般に、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、ＰＡＭ配列の上流の約３個のヌクレオチドを切断する。ｇＲＮＡは、ソフトウェアを使用して選択し得る。非限定的な例として、ｇＲＮＡを選択するための考慮事項には、例えば、使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列、及びオフターゲット修飾を最小限に抑えるための戦略が含まれ得る。ＮＵＰＡＣＫ（登録商標）及びＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールを用いて、ｇＲＮＡの調製、標的修飾効率の評価、及び／またはオフターゲット部位での切断の評価のための配列を提供することができる。
本明細書に記載の標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、一般に、（１）同種核酸配列（例えば、ＣＤＬ標的配列及び／またはゲノム標的配列）に相補的であり、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを同種核酸配列に誘導するガイド配列、及び（２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと相互作用して結合するスキャフォールド配列を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡを指す。本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、同じ配列を有する。本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、修飾される標的配列及びＣＤＬ標的配列の両方にハイブリダイズできる核酸配列を共有するなど、同じ配列を含む。本開示の他の実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、異なる配列を有する。本明細書に記載の組成物及び方法において、ｇＲＮＡは、同種核酸配列に相補的な部分を含む。ｇＲＮＡが標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）と共にＲＮＰ複合体を形成する場合、ＲＮＰ複合体は、ｇＲＮＡと同種核酸配列と間の相補性によって同種核酸配列に誘導され得る。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、まず同種核酸配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別することによって、同種核酸配列を「識別」する。ＰＡＭが識別されると、ＲＮＰ複合体のｇＲＮＡはＰＡＭの上流の同種核酸配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列の約２０個のヌクレオチド上流の同種核酸配列部分に相補的なヌクレオチドの一部を含む。一般に、Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体は、ＰＡＭ配列の上流の約３個のヌクレオチドを切断する。ｇＲＮＡは、ソフトウェアを使用して選択し得る。非限定的な例として、ｇＲＮＡを選択するための考慮事項には、例えば、使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列、及びオフターゲット修飾を最小限に抑えるための戦略が含まれ得る。ＮＵＰＡＣＫ（登録商標）及びＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌなどのツールを用いて、ｇＲＮＡの調製、標的修飾効率の評価、及び／またはオフターゲット部位での切断の評価のための配列を提供することができる。
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、同種核酸配列部分に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチド（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチド）の一部を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、同種核酸配列に対して完全に相補的または部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、同種核酸配列中の少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％）のヌクレオチドが、ｇＲＮＡの対応するヌクレオチドとのワトソンクリック塩基対合に関与し得る。
本明細書でさらに詳細に説明するように、ＨＤＲ鋳型の一方または両方の末端上のＣＤＬ標的配列及びＰＡＭは、異なる構成で設計することができる。
本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、同じ配列を有し（例えば、ゲノム標的配列及びＣＤＬ標的配列は同じである）、それぞれが同種の標的化可能ヌクレアーゼと共に複合体を形成する（例えば、両方とも同じ配列を有し、同種のＣａｓタンパク質と共にＲＮＰ複合体を形成する）。この場合、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと共に第１のＲＮＰ複合体を形成し得る。第１のＲＮＰ複合体は、ｇＲＮＡと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを介して標的核酸に結合し得る。ｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとドナー鋳型と共に第２のＲＮＰ複合体を形成し得る。この第２のＲＮＰ複合体において、ｇＲＮＡは、ドナー鋳型内のＤＮＡ結合タンパク質標的配列に結合して、切断された標的核酸で相同組換えが起こるようにドナー鋳型を所望の細胞内位置（例えば、核）に運ぶことができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ及びＤＮＡ結合タンパク質標的配列は、部分的な相補性のみを有する。本開示のいくつかの実施形態において、標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡは、異なる配列を有する（例えば、ゲノム標的配列とＣＤＬ標的配列は別個である）。別個の標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡのそれぞれは、同種の標的化可能ヌクレアーゼと共に複合体を形成し得る（例えば、それぞれが同種のＣａｓタンパク質と共にＲＮＰ複合体を形成する）。別個の標的ｇＲＮＡ及びドナーｇＲＮＡのそれぞれは、別種の標的化可能ヌクレアーゼと共に複合体を形成し得る（例えば、それぞれが同種のＣａｓタンパク質と共にＲＮＰ複合体を形成する）。
ＶＩ．ドナー鋳型
ＨＤＲ鋳型、ＣＤＬ標的配列、及び対応するＰＡＭ配列は、ＨＤＲ鋳型及び標的核酸の間の相同性指向修復を強化するために、プラスミドドナー鋳型内にあらゆる異なる構成を有することができる。一般に、ドナー鋳型は、（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である。実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である場合、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のＰＡＭに機能的に連結される。ＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、ＰＡＭがＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置するように配向され得る。ＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列がＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置するように配向され得る。プラスミドドナー鋳型内のＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、それぞれ独立して配向され得る。第１のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第１のＣＤＬ標的配列は、ＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第２のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第２のＣＤＬ標的配列は、ＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。非限定的な例において、第１のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、第１のＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し、第２のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、第２のＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置する。
ＨＤＲ鋳型、ＣＤＬ標的配列、及び対応するＰＡＭ配列は、ＨＤＲ鋳型及び標的核酸の間の相同性指向修復を強化するために、プラスミドドナー鋳型内にあらゆる異なる構成を有することができる。一般に、ドナー鋳型は、（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、（ｉｉ）ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び（ｉｉｉ）ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される第２のＣＤＬ標的配列を含み、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である。実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である場合、第１のＣＤＬ標的配列及び第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のＰＡＭに機能的に連結される。ＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、ＰＡＭがＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置するように配向され得る。ＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列がＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置するように配向され得る。プラスミドドナー鋳型内のＣＤＬ標的配列及び対応するＰＡＭは、それぞれ独立して配向され得る。第１のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第１のＣＤＬ標的配列は、ＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第２のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。第２のＣＤＬ標的配列は、ＰＡＭとＨＤＲ鋳型との間に位置し得る。非限定的な例において、第１のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、第１のＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置し、第２のＣＤＬ標的配列に対応するＰＡＭは、第２のＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に位置する。
いくつかの実施形態において、プラスミドドナー鋳型の大きさまたは長さは、約２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂ、７．１ｋｂ、７．２ｋｂ、７．３ｋｂ、７．４ｋｂ、７．５ｋｂ、７．６ｋｂ、７．７ｋｂ、７．８ｋｂ、７．９ｋｂ、８．０ｋｂ、８．１ｋｂ、８．２ｋｂ、８．３ｋｂ、８．４ｋｂ、８．５ｋｂ、８．６ｋｂ、８．７ｋｂ、８．８ｋｂ、８．９ｋｂ、９．０ｋｂ、９．１ｋｂ、９．２ｋｂ、９．３ｋｂ、９．４ｋｂ、９．５ｋｂ、９．６ｋｂ、９．７ｋｂ、９．８ｋｂ、９．９ｋｂ、１０．０ｋｂを超えるか、これらの大きさの間の任意の大きさであるか、または１０ｋｂを超える。例えば、鋳型の大きさは、約２００ｂｐ～約５００ｂｐ、約２００ｂｐ～約７５０ｂｐ、約２００ｂｐ～約１ｋｂ、約２００ｂｐ～約１．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約２．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約２．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約３．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約３．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約４．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約４．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約５．０ｋｂであり得る。いくつかの場合において、鋳型の大きさは、裸のＤＮＡとして致死的であるのに十分な大きさかつ十分な量である。
いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、異種タンパク質またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、例えば細胞のゲノムへの挿入後の異種タンパク質またはその断片の発現を制御するための制御配列、例えば、プロモータ配列及び／またはエンハンサー配列を含む。異種タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。異種タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み得る。
いくつかの実施形態において、プラスミドドナー鋳型は、外因性ヌクレオチド配列などの外因性配列を含む。外因性配列は、コードされた異種タンパク質またはその断片を含み得る。外因性配列は、遺伝子またはその一部を含み得る。外因性ヌクレオチド配列は、短い配列、例えば長さが３～１００個のヌクレオチドであり得る。対象となる外因性ヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチドであり得る。また、外因性ヌクレオチド配列は、長い配列、例えば長さが５００～３０００個のヌクレオチドであり得る。対象となる外因性ヌクレオチド配列は、ポリペプチド配列をコードするかまたはコードしないかであり得る。さらに、対象となる外因性ヌクレオチド配列は、それが挿入されるとキメラ遺伝子を形成するように、細胞に挿入され得る。例えば、外因性受容体部分は、編集後に、内因性細胞内部分（例えば、シグナル伝達のための）に機能的に連結された外因性受容体部分を含むキメラ受容体コード配列を産生するために、内因性受容体コード配列にインフレームで挿入され得る。
いくつかの例において、遺伝子またはその一部は、タンパク質コードヌクレオチド配列（すなわち、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列）であり得る。一般に、任意のタンパク質コードヌクレオチドを使用し得る。いくつかの例において、タンパク質コードヌクレオチド配列は、自己細胞療法（例えば、自己Ｔ細胞療法）に有用なタンパク質をコードする。いくつかの例において、タンパク質コードヌクレオチド配列には、免疫系を調節する因子、サイトカイン、Ｔ細胞機能を調節する因子、Ｔ細胞の生存を促進する因子、Ｔ細胞の機能を促進する因子、または免疫チェックポイント阻害剤が含まれ得るが、これらに限定されない。タンパク質コードヌクレオチド配列、特に分泌タンパク質または膜結合タンパク質には、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ得る。シグナルペプチドは、タンパク質コードヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して内因性であり得る。シグナルペプチドは、タンパク質コードヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して外因性であり得る。
いくつかの例において、遺伝子またはその一部は、非タンパク質コードヌクレオチド配列であり得る。一般に、任意の非タンパク質をコードするヌクレオチドを使用し得る。いくつかの場合において、非タンパク質コードヌクレオチド配列は、自己細胞療法（例えば、自己Ｔ細胞療法）に有用なヌクレオチド配列であり得る。いくつかの場合において、非タンパク質コードヌクレオチド配列には、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡが含まれ得るが、これらに限定されない。
遺伝子（例えば、対象となる外因性遺伝子）の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、一般に任意の大きさであり得るが、全体的な鋳型の大きさ及びその後の全体的な編集効率に及ぼす遺伝子の大きさの影響など、実施上の考慮がなされ得る。したがって、特定の態様において、本明細書では、ゲノム編集された、またはゲノム編集可能な修飾細胞であって、特に非ウイルス送達方法を使用する場合、以前に説明したものよりも高いＨＲ効率率（例えば、組み込まれたポリヌクレオチド配列を有する集団のより高い割合）で、１００塩基以上の長さを有する外因性遺伝子を発現する、当該修飾細胞が提供される。改善されたＨＲ効率率は、長さが２００塩基以上、長さが４００塩基以上、長さが５００塩基以上、長さが６００塩基以上、長さが７５０塩基以上、長さが１０００塩基以上、長さが１５００塩基以上、長さが２０００塩基以上、長さが３０００塩基以上、または長さが４０００塩基以上の外因性配列を導入するなど、長さが１００塩基以上の遺伝子に同様に適用される。遺伝子の少なくとも一部は、長さが８００塩基以上であり得る。遺伝子の少なくとも一部は、長さが１６００塩基以上であり得る。
外因性配列は、長さが１００～２００塩基、長さが１００～３００塩基、長さが１００～４００塩基、長さが１００～５００塩基、長さが１００～６００塩基、長さが１００～７００塩基、長さが１００～８００塩基、長さが１００～９００塩基、または長さが１００～１０００塩基であり得る。外因性配列は、長さが１００～２０００塩基、長さが１００～３０００塩基、長さが１００～４０００塩基、長さが１００～５０００塩基、長さが１００～６０００塩基、長さが１００～７０００塩基、長さが１００～８０００塩基、長さが１００～９０００塩基、または長さが１００～１００００塩基であり得る。外因性配列は、長さが１０００～２０００塩基、長さが１０００～３０００塩基、長さが１０００～４０００塩基、長さが１０００～５０００塩基、長さが１０００～６０００塩基、長さが１０００～７０００塩基、長さが１０００～８０００塩基、長さが１０００～９０００塩基、または長さが１０００～１００００塩基であり得る。
外因性配列は、長さが１０塩基以上、長さが２０塩基以上、長さが３０塩基以上、長さが４０塩基以上、長さが５０塩基以上、長さが６０塩基以上、長さが７０塩基以上、長さが８０塩基以上、長さが９０塩基以上、または長さが９５塩基以上であり得る。外因性配列は、長さが１～１００塩基、長さが１～９０塩基、長さが１～８０塩基、長さが１～７０塩基、長さが１～６０塩基、長さが１～５０塩基、長さが１～４０塩基、または長さが１～３０塩基であり得る。外因性配列は、長さが１～２０塩基、長さが２～２０塩基、長さが３～２０塩基、長さが５～２０塩基、長さが１０～２０塩基、または長さが１５～２０塩基であり得る。外因性配列は、長さが１～１０塩基、長さが２～１０塩基、長さが３～１０塩基、長さが５～１０塩基、長さが１～５塩基、または長さが１～１５塩基であり得る。外因性配列は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０塩基であり得る。外因性配列は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４塩基であり得る。外因性配列は、約２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５．０ｋｂ、５．１ｋｂ、５．２ｋｂ、５．３ｋｂ、５．４ｋｂ、５．５ｋｂ、５．６ｋｂ、５．７ｋｂ、５．８ｋｂ、５．９ｋｂ、６．０ｋｂ、６．１ｋｂ、６．２ｋｂ、６．３ｋｂ、６．４ｋｂ、６．５ｋｂ、６．６ｋｂ、６．７ｋｂ、６．８ｋｂ、６．９ｋｂ、７．０ｋｂを超えるか、またはこれらの大きさの間の任意の大きさの鋳型であり得る。
複数の外因性配列が導入される例において、複数の外因性配列は、異なる大きさを有し得る。例えば、第１の外因性配列が１００塩基以上かつ第２の外因性配列が１００塩基以上であり得るか、または第１の外来配列が１００塩基以上かつ第２の外来配列が１００塩基以下（例えば、長さが１～１００塩基）であり得る。
一般に、プラスミドドナー鋳型は、環状ＤＮＡプラスミドである。いくつかの場合において、プラスミドドナー鋳型は、二本鎖プラスミドである。いくつかの場合において、プラスミドドナー鋳型は、一本鎖プラスミドである。いくつかの場合において、プラスミドドナー鋳型は、ミニサークルである。いくつかの場合において、プラスミドドナー鋳型は、ナノプラスミドである。
ＣＤＬ標的配列及び／またはＨＤＲ鋳型成分（相同アーム、対象となる遺伝子など）は、ＰＣＲ、制限酵素消化、または任意の他の直鎖化方法によって産生される直鎖状ｄｓＤＮＡ配列、ならびにプラスミドなどの環状ｄｓＤＮＡ配列を含む、任意の形態のｄｓＤＮＡ鋳型に導入され得る。プラスミドの場合、ＣＤＬ標的配列は、相同アーム及びＤＮＡ挿入領域の外側のプラスミド（相同アーム（複数可）の端（複数可）に隣接する領域を含むがこれに限定されない）にクローニングされ得る。直鎖状ｄｓＤＮＡ鋳型と同様に、ＤＮＡ結合タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡから作製されたＲＮＰ）をプラスミドＤＮＡ鋳型を用いて短時間インキュベートし、細胞への導入（例えば、エレクトロポレーション）前にＲＮＰによるＤＮＡプラスミドの結合を可能にする。例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１８２３２３５６号の図１、２、及び１０Ｂ、ならびに国際特許出願第ＷＯ２０１９０８４５５２号の段落［０１００］を参照されたい。
プラスミドドナー鋳型は、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間に１つ以上の追加のスペーサー配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも２個のヌクレオチド、例えば、２～２４個のヌクレオチド（例えば、２～２２個、２～２０個、２～１８個、２～１６個、２～１４個、２～１２個、２～１０個、２～８個、２～６個、２～４個、４～２４個、６～２４個、８～２４個、１０～２４個、１２～２４個、１４～２４個、１６～２４個、１８～２４個、２０～２４個、または２２～２４個のヌクレオチド；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個のヌクレオチド）を有し得る。
ＶＩＩ．標的化可能ヌクレアーゼ
上述したように、本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）である。標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列（例えば、ゲノム内の標的遺伝子及び／またはＣＤＬ標的配列）の配列を認識し、同種核酸配列に結合して当該同種核酸配列を修飾し得る。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列に結合し得るタンパク質及び同種核酸配列を修飾し得るタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子、または抑制因子）を含む融合タンパク質であり得る。
上述したように、本明細書に記載の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）である。標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列（例えば、ゲノム内の標的遺伝子及び／またはＣＤＬ標的配列）の配列を認識し、同種核酸配列に結合して当該同種核酸配列を修飾し得る。他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列に結合し得るタンパク質及び同種核酸配列を修飾し得るタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子、または抑制因子）を含む融合タンパク質であり得る。
いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有する。例えば、標的化可能ヌクレアーゼは、同種核酸配列を切断することによって、当該同種核酸配列を修飾し得る。次いで、切断された同種核酸配列には、近くの相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型（例えば、プラスミドドナー鋳型を提供するＨＤＲ鋳型）との相同組換え（例えば、ＨＭＥＪを介して）が実施され得る。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、同種核酸配列のある位置で一方または両方の鎖の切断を導くことができる。Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、これらの相同体、これらの変異体、これらの突然変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。Ｃａｓヌクレアーゼには３つの主要なタイプ（Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型）があり、５個のＩ型、３個のＩＩ型、及び２個のＩＩＩ型のタンパク質を含む１０個のサブタイプが存在する（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２０１５：４０（１）：５８－６６を参照すること）。ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ９、及びＣｆｐ１が挙げられる。これらのＣａｓヌクレアーゼは当業者に周知である。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばＮＢＣＩ参照配列番号ＮＰ＿２６９２１５に記載されており、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばＮＢＣＩ参照配列番号ＷＰ＿０１１６８１４７０に記載されている。
Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼは、ベイロネラ・アティピカル（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、ソロバクテリウム・ムーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、アシダミノコッカス・インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、オルセネラ・ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）、オエノコッカス・キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ガッセリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、マイコプラズマ・モービレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・オビニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、ユウバクテリウム・ユウバクテリウム・レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、イリオバクター・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エルシミクロビウム・ミヌツム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、スフェロケタ・クロブス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター・スクシノゲネス亜種スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、カプノシトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、プレボテラ・ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）、プレボテラ・ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、フラボバクテリウム・コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドスピリルム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、カンジダタス・プニセイスピリルム・マリナム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア・シジギイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ジノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． Ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アシドボラクス・エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロゼブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ． Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ステレラ・ワズワースエンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、パラステレラ・エクスクレメンチホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）を含む様々な細菌種に由来し得るが、これらに限定されない。
Ｃａｓ９タンパク質は、ＲＮＡ誘導型二本鎖ＤＮＡ結合ヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能ドメイン、例えばＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、両方の機能ドメインが活性化している場合、ゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）中に二本鎖切断部を誘導し得る。Ｃａｓ９酵素は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スピロヘータ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の１つ以上の触媒ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、融合タンパク質であり、例えば、２つの触媒ドメインは異なる細菌種に由来する。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質変異体であり得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの有用な変異体は、ＲｕｖＣ－もしくはＨＮＨ－酵素またはニッカーゼなどの単一の不活性触媒ドメインを含み得る。Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つだけの活性機能ドメインを有し、同種核酸配列の一鎖のみを切断することによって一本鎖切断部またはニックを作製することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１つ以上のアミノ酸突然変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。例えば、少なくともＤ１０Ａ突然変異を有する変異型Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態において、少なくともＨ８４０Ａ突然変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼ中に存在する突然変異の他の例としては、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが挙げられるが、これらに限定されない。反対のＤＮＡ鎖を標的化する少なくとも２つのＤＮＡ標的化ＲＮＡが使用される場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して二本鎖切断部を導入することができる。二重ニックを誘導した二本鎖切断部は、ＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復され得る（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ，１５４：１３８０－１３８９）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば、米国特許第８，８９５，３０８号、同第８，８８９，４１８号、及び同第８，８６５，４０６号、ならびに米国出願公開第２０１４／０３５６９５９号、同第２０１４／０２７３２２６号、及び同第２０１４／０１８６９１９号に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物体のためにコドンが最適化されている場合がある。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、切断（例えば、完全な切断またはニッカーゼ）活性が欠如されている。Ｃａｓタンパク質変異体は、タンパク質のニッカーゼ活性を除去する１つ以上の点変異が含まれ得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質変異体は、他のタンパク質に融合され、他のタンパク質を標的核酸に導く標的化ドメインとして機能し得る。例えば、切断活性がないＣａｓタンパク質変異体は、遺伝子発現を制御する転写活性または抑制ドメインに融合され得る（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ，２（１１）：８７９－８８８，２０１１、Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０：９７７－９７９，２０１３、及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１７：５８３－５８８，２０１４）。切断活性が欠如しているＣａｓタンパク質変異体は、ゲノム領域を標的化するために使用され、ＲＮＡによる転写制御を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、切断活性が全くないＣａｓタンパク質変異体を使用して、外因性タンパク質を標的核酸に標的化し得る。外因性タンパク質は、Ｃａｓタンパク質変異体に融合され得る。外因性タンパク質は、エフェクタータンパク質ドメインであり得る。外因性タンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子であり得る。外因性タンパク質の他の例としては、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）、ＶＰ６４、Ｐ６５、Ｋｒａｂ、テンイレブントランスロケーション（ＴＥＴ）メチルシトシンジオキシゲナーゼ、及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。切断（例えば、ニッカーゼ）活性が欠如されている特定のＣａｓタンパク質変異体も以下で説明する。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、低減されたオフターゲット効果及び強力なオンターゲット切断を有する、高忠実度のまたは特異性が増進したＣａｓ９ポリペプチド変異体であり得る。オンターゲットの特異性が向上したＣａｓ９ポリペプチド変異体の非限定的な例としては、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５１（６２６８）：８４－８（２０１６）に記載のＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（ｅＳｐＣａｓ９（１．０）とも称する）、及びＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（ｅＳｐＣａｓ９（１．１）とも称する）変異体、ならびにＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及びＱ９２６Ａ突然変異を１、２、３、または４個含有する、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２９（７５８７）：４９０－５（２０１６）に記載のＳｐＣａｓ９変異体（例えば、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は４個の全ての突然変異を含む）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼはまた、同種核酸配列に結合し得るタンパク質及び同種核酸配列を切断し得るタンパク質を含む融合タンパク質でもあり得る。例えば、同種核酸配列を認識して結合し得るタンパク質は、いずれの切断活性もないＣａｓタンパク質変異体であり得る。いずれの切断活性もないＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ１及びＨＮＨヌクレアーゼドメインの２つの抑制化突然変異（Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）を含むＣａｓ９ポリペプチドであり得、これはｄＣａｓ９とも称される（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６－８２１、及びＱｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５２（５）：１１７３－１１８３）。一実施形態において、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７、または任意のこれらの組合せの位置において少なくとも１つの突然変異を含む。そのようなｄＣａｓ９ポリペプチド及びその変異体の説明は、例えば国際特許出願第ＷＯ２０１３／１７６７７２号に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０またはＮ８６３における突然変異に加えて、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３、またはＤ９８６における突然変異を含み得る。いくつかの事例において、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ突然変異を含み得る。ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎも含み得る。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ｙ、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ｎ、Ｄ１０Ｎ及びＨ８４０Ａ、Ｄ１０Ｎ及びＨ８４０Ｙ、またはＤ１０Ｎ及びＨ８４０Ｎの置換を含む。置換は、保存的な置換であるか、またはＣａｓ９ポリペプチドを触媒活性がなくかつ同種核酸配列に結合できるようにする非保存的な置換であり得る。
他の実施形態において、同種核酸配列を認識して結合できるタンパク質は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質またはジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質であり得る。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質は、通常、３３～３５個のアミノ酸の長さと、１つ以上の特定のＤＮＡ塩基対を認識することができる１２位及び１３位での２つの超可変アミノ酸残基を含むＤＮＡ結合縦列反復配列を含む中央ドメインを有する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、モチーフの折り畳みを調整して安定化させるための１つ以上の亜鉛イオンが存在するか否かによって特徴付けられるＤＮＡ結合モチーフを有する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、標的分子とタンデム接触する複数の指状突起を含む。いくつかのジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質も塩橋を形成して指状折り畳みを安定化する。それらは最初にアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）からの転写因子ＴＦＩＩＩＡのＤＮＡ結合モチーフとして同定されたが、現在は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び／または脂質基質に結合することが認識されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法における標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質と、同種核酸配列を切断し得るタンパク質（「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」とも称する）とを含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法における標的化可能ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質と、同種核酸配列を切断し得るタンパク質とを含む融合タンパク質であり得る。例えば、同種核酸配列を切断し得るタンパク質は、野生型または変異したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたはＦｏｋＩの触媒ドメインであり得る。ＴＡＬＥＮ及び遺伝子編集のためのその使用についての詳細な説明は、例えば、米国特許第８，４４０，４３１号、同第８，４４０，４３２号、同第８，４５０，４７１号、同第８，５８６，３６３号、及び同第８，６９７，８５３号、ならびにＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１３，１３（４）：２９１－３０３、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９（８）：８０５－７、Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，４：１７６２、及びＪｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１３，１４（１）：４９－５５に見出される。標的核酸を切断し得るタンパク質に融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質の例は、当該技術分野で説明されており、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，１１：６３６－６４６及びＧａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９（８）：８０５－７、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号、同第６，４７９，６２６号、ならびに米国出願公開第２００３／０２３２４１０号及び同第２００９／０２０３１４０号に記載されているものが挙げられるが、それらに限定されない。
他の実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を有しない。例えば、標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、いずれのヌクレアーゼ活性もない標的化可能ヌクレアーゼ）は、同種核酸配列の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、標的化可能ヌクレアーゼは、上述したいずれの切断活性もないＣａｓタンパク質変異体（例えばｄＣａｓ９）、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質、及びジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質など、同種核酸配列に結合し得るタンパク質、及び転写活性化因子または抑制因子など、同種核酸配列を修飾し得るタンパク質を含む融合タンパク質であり得る。
標的化可能ヌクレアーゼはまた、局在化ペプチドまたはタンパク質と融合し得る。例えば、標的化可能ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列と融合することが可能であり、これによって、標的化可能ヌクレアーゼ及びそれが形成するＲＮＰ複合体を核に導き、同種核酸配列を修飾することが可能である。ＮＬＳ配列の例としては、当該技術分野で周知のもの、例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５，２００７に記載されているものが挙げられ、また、ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ、及びＰＫＫＫＲＫＶが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過ペプチド及び細胞標的化ペプチドなどの、標的化可能ヌクレアーゼに使用可能な他のペプチドまたはタンパク質の例としては、当該技術分野で入手可能であるもの、例えば、Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７８６（２）：１２６－３８，２００８に記載されているものが挙げられる。
標的核酸（例えば、Ｔ細胞ゲノムなどのゲノム標的配列）を修飾する標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼと同じものであり得る。例示的な非限定的な例において、標的核酸を修飾する標的化可能ヌクレアーゼ及びＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、両方ともＣａｓ９タンパク質である。標的核酸を修飾する標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼとは別個であり得る。例えば、標的核酸を修飾する標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり得、ＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、または非Ｃａｓ９タンパク質であり得る。他の例において、標的核酸を修飾する標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、または非Ｃａｓ９タンパク質であり得、ＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
第１のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、第２のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼと同じものであり得る。例示的な非限定的な例において、第１のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼ及び第２のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、両方ともＣａｓ９タンパク質である。第１のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、第２のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼと別個のものであり得る。例えば、第１のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり得、第２のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、または非Ｃａｓ９タンパク質であり得る。他の例において、第１のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、または非Ｃａｓ９タンパク質であり得、第２のＣＤＬ標的配列を切断し得る標的化可能ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
ＶＩＩＩ．ＣＤＬ標的配列
共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列は、ＣＤＬ標的配列を切断することができる標的化可能ヌクレアーゼによって認識されて結合するヌクレオチド配列である。本明細書に記載の組成物及び方法において、ＣＤＬ標的配列がＨＤＲ鋳型を挟むことで、ＨＤＲ鋳型はプラスミドドナー鋳型から直鎖化または切除され得る。理論に束縛されるものではないが、直鎖化／切除されたＨＤＲ鋳型は、相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）を促進することが可能である一方、プラスミドとしての送達により、細胞毒性を低減することができる。したがって、ＣＤＬ標的配列は、相同性指向修復効率の向上及び／または細胞毒性の低減などを通じて、ノックイン細胞収量が向上されるように手伝う。
共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列は、ＣＤＬ標的配列を切断することができる標的化可能ヌクレアーゼによって認識されて結合するヌクレオチド配列である。本明細書に記載の組成物及び方法において、ＣＤＬ標的配列がＨＤＲ鋳型を挟むことで、ＨＤＲ鋳型はプラスミドドナー鋳型から直鎖化または切除され得る。理論に束縛されるものではないが、直鎖化／切除されたＨＤＲ鋳型は、相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）を促進することが可能である一方、プラスミドとしての送達により、細胞毒性を低減することができる。したがって、ＣＤＬ標的配列は、相同性指向修復効率の向上及び／または細胞毒性の低減などを通じて、ノックイン細胞収量が向上されるように手伝う。
いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えばＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合タンパク質またはジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質によって、直接的に認識されて結合することができる。他の実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えばＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって、ドナーｇＲＮＡを介して間接的に認識されて結合することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列中の少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％）のヌクレオチドが、ドナーｇＲＮＡの対応するヌクレオチドとのワトソンクリック塩基対合に関与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ＣＤＬ標的配列とドナーｇＲＮＡとがハイブリダイズすると、ドナーｇＲＮＡ中の対応するヌクレオチドに対して少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）のミスマッチヌクレオチドを有し得る。ミスマッチ塩基の例としては、グアニンとウラシル、グアニンとチミン、アデニンとシトシン対合が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、標的核酸（例えば、細胞のゲノム標的）の一部である。
一般に、ＣＤＬ標的配列は、上記のようにプラスミドドナー鋳型内のＨＤＲ鋳型の両末端に存在する。ＣＤＬ標的配列、及びＣａｓ系の場合のプラスミドドナー鋳型内の対応するＰＡＭは、上記のように異なる構成を有し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、ドナーｇＲＮＡの配列のうちの長さが等しい部分に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、少なくとも１７個のヌクレオチド、例えば、１７～２０個のヌクレオチド（例えば、１７～１９個、１７～１８個、１８～２０個、１８～１９個、または１７、１８、１９、もしくは２０個のヌクレオチド）を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤＬ標的配列は、部分的に相補的であり、すなわち、ドナーｇＲＮＡの配列のうちの長さが等しい部分に対してヌクレオチドミスマッチを含む。例えば、２０個のヌクレオチドを有するＤＮＡ結合タンパク質標的配列は、ドナーｇＲＮＡの配列のうちの２０個のヌクレオチド部分に対して、１～６個のヌクレオチドミスマッチ（例えば、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個；１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドミスマッチ）を有し得る。
ＩＸ．細胞内の遺伝子標的化核酸
本明細書に記載の組成物は、例えば、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの細胞における標的核酸を修飾する方法に使用され得る。任意で、細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。細胞はまた、初代細胞、生殖細胞、幹細胞、または前駆細胞であり得る。前駆細胞は、例えば、多能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、初代造血細胞、初代造血幹細胞、または初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、初代造血細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、またはナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞であり、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はγδＴ細胞である。本明細書に記載の方法のいずれかによって修飾されたいずれの細胞の集団も提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、修飾細胞の集団を増大することをさらに含む。
本明細書に記載の組成物は、例えば、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などの細胞における標的核酸を修飾する方法に使用され得る。任意で、細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。細胞はまた、初代細胞、生殖細胞、幹細胞、または前駆細胞であり得る。前駆細胞は、例えば、多能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、初代造血細胞、初代造血幹細胞、または初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、初代造血細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、またはナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞であり、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はγδＴ細胞である。本明細書に記載の方法のいずれかによって修飾されたいずれの細胞の集団も提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、修飾細胞の集団を増大することをさらに含む。
特定の態様において、細胞の集団（例えば、Ｔ細胞の集団）が提供される。細胞の集団は、本明細書に記載の修飾細胞のいずれかを含み得る。修飾された細胞は、細胞の異種集団及び／または種々の細胞型の異種集団内にあり得る。細胞の集団は、ゲノム編集された細胞の割合に関して不均一であり得る。細胞の集団は、集団の１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超）、７０％超、８０％超、または９０％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。特定の態様では、細胞の集団は、組み込まれたヌクレオチド配列であって、遺伝子の少なくとも一部を含み、内因性ゲノム標的遺伝子座で組み込まれ、遺伝子の少なくとも一部を発現することができるように配向される当該組み込まれたヌクレオチド配列を含み、当該細胞の集団は、ウイルス媒介送達成分を実質的に含まず、集団中の細胞の１０％超）、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超）、７０％超、８０％超、または９０％超は、組み込まれたヌクレオチド配列を含む。
細胞の集団は、集団の９１％超、９２％超、９３％超）、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超）、９９％超、９９．５％超、または９９．９％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。細胞の集団は、集団の２０％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。細胞の集団は、集団の３０％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。細胞の集団は、集団の６０％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。細胞の集団は、集団の７０％超が組み込まれたヌクレオチド配列を含み得る。
細胞は、外因性配列などの非ウイルス的に挿入された配列を含む細胞を含み得る。細胞は、ウイルスを含まない可能性がある。細胞は、実質的にウイルスを含まない可能性がある。細胞は、少なくとも１つの標的領域に非ウイルス的に挿入された少なくとも１つの核酸配列（例えば、少なくとも１つの異種遺伝子を含む）を含み得る。ある態様において、細胞は、例えばドナー鋳型などの少なくとも１つの核酸配列を導入するためのウイルスベクターを含まない。
細胞は、少なくとも２００塩基対の大きさを有する非ウイルス的に挿入された外因性配列を含む１つ以上の初代細胞を含み得る。初代細胞は、初代造血細胞または初代造血幹細胞であり得る。初代細胞は初代造血細胞であり得、初代造血細胞は免疫細胞であり得る。免疫細胞は、Ｔ細胞であり得る。初代細胞は、ヒト細胞であり得る。いくつかの態様において、初代細胞はウイルスベクターを含まない。外因性配列の大きさは、約２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、及び５．０ｋｂからなる群から選択される長さを超えることが可能である。外因性配列の大きさは、１．５ｋｂを超える場合がある。外因性配列の大きさは、約２００ｂｐ～約５００ｂｐ、約２００ｂｐ～約７５０ｂｐ、約２００ｂｐ～約１ｋｂ、約２００ｂｐ～約１．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約２．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約２．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約３．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約３．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約４．０ｋｂ、約２００ｂｐ～約４．５ｋｂ、約２００ｂｐ～約５．０ｋｂであり得る。外因性配列の大きさは、約１ｋｂを超える場合がある。外因性配列は、調節配列を含み得、任意で、調節配列はプロモータ配列及び／またはエンハンサー配列を含む。
外因性配列は、異種タンパク質またはその断片をコードし得る。外因性配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。外因性配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得る。
細胞は、１ｋｂを超える大きさを有する非ウイルス的に挿入されたＤＮＡ鋳型を含む初代ヒトＴ細胞を含み得る。
細胞は、内因性Ｔ細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子（ＴＲＡＣ）及び内因性Ｔ細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子（ＴＲＢＣ）の一方または両方の少なくとも１つの標的領域に非ウイルス的に挿入された少なくとも１つの異種遺伝子を含む少なくとも１つの核酸配列を含む初代ヒトＴ細胞を含むことができ、少なくとも１つの異種遺伝子は、（１）異種Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲ－α）鎖遺伝子の可変領域、及び（２）異種Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲ－β）鎖遺伝子の可変領域の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、少なくとも１つの核酸配列をＴ細胞に導入するためのウイルスベクターを含まない。いくつかの態様において、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１．５ｋｂの大きさを有する。いくつかの態様において、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも５００ｂｐの大きさを有する。いくつかの態様において、標的領域は、ＴＲＡＣのエクソン１、２、または３にある。いくつかの態様において、標的領域は、ＴＲＢＣのエクソン１、２、または３にある。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子は、（１）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲ－α）鎖遺伝子の定常領域、及び（２）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲ－β）鎖遺伝子の定常領域の少なくとも一方を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子は、（１）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲ－α）鎖遺伝子の定常領域、及び（２）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲ－β）鎖遺伝子の定常領域のそれぞれを含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、（１）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種ＴＣＲ－α鎖遺伝子の定常領域、及び（２）ａ）可変領域またはｂ）可変領域及び異種ＴＣＲ－β鎖遺伝子の定常領域のそれぞれを含む。いくつかの態様において、異種遺伝子は、発現時に抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を形成する。いくつかの態様において、異種ＴＣＲ－α鎖遺伝子及び異種ＴＣＲ－β鎖遺伝子は、リンカー配列によって機能的に連結されており、任意で、リンカー配列は、切断可能なリンカー配列またはマルチシストロン性エレメントである。いくつかの態様において、異種ＴＣＲ－α鎖遺伝子及び異種ＴＣＲ－β鎖遺伝子はＴＲＡＣに挿入される。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子の発現は、内因性プロモータにより駆動される。いくつかの態様において、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣの一方または両方の発現は、対照Ｔ細胞と比較して細胞内で減少しており、対照Ｔ細胞は、非ウイルス挿入を欠く初代ヒトＴ細胞である。
細胞は、内因性Ｔ細胞受容体アルファサブユニット定常遺伝子（ＴＲＡＣ）及び内因性Ｔ細胞受容体ベータサブユニット定常遺伝子（ＴＲＢＣ）の一方または両方の少なくとも１つの標的領域に挿入された少なくとも１つの異種遺伝子を含む少なくとも１つの核酸配列を含む初代ヒトＴ細胞を含むことができ、少なくとも１つの異種遺伝子は、（１）異種Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲ－α）鎖遺伝子の可変領域、及び（２）異種Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲ－β）鎖遺伝子の可変領域の少なくとも１つを含み、Ｔ細胞は、少なくとも１つの核酸配列をＴ細胞に導入するためのウイルスベクターを含まない。
細胞は、細胞のゲノムの少なくとも１つの標的領域に非ウイルス的に挿入された少なくとも１つの異種遺伝子を含む少なくとも１つの核酸配列を含む初代細胞を含み得る。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子は、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体をコードする。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子は、（１）異種Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲ－α）鎖遺伝子の可変領域、及び（２）異種Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＣＲ－β）鎖遺伝子の可変領域の少なくとも一方または両方を含む。いくつかの態様において、初代細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、少なくとも１つの核酸配列を細胞に導入するためのウイルスベクターを含まない。いくつかの態様において、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１．５ｋｂの大きさを有する。いくつかの態様において、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも５００ｂｐの大きさを有する。いくつかの態様において、標的領域は、ＴＲＡＣ、例えばＴＲＡＣのエクソン１、２、または３にある。いくつかの態様において、標的領域は、ＴＲＢＣ、例えばＴＲＢＣのエクソン１、２、または３にある。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、少なくとも１つの異種遺伝子の発現は、内因性プロモータにより駆動される。いくつかの態様において、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣの一方または両方の発現は、対照Ｔ細胞と比較してＴ細胞内で減少しており、対照Ｔ細胞は、非ウイルス挿入を欠く初代ヒトＴ細胞である。
いくつかの場合において、ＣＡＲは、第１世代、第２世代、及び／または第３世代のＣＡＲと称される。いくつかの態様において、第１世代のＣＡＲは、抗原が結合するとＣＤ３鎖誘導シグナルのみを提供するＣＡＲである。いくつかの態様において、第２世代のＣＡＲは、そのようなシグナル及び共刺激シグナルを提供するもの、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７などの共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むものである。いくつかの態様において、いくつかの態様の第３世代のＣＡＲは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片を含む細胞外部分と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗体または断片は、ｓｃＦｖまたは単一ドメインＶＨ抗体を含み、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３のζ鎖（ＣＤ３ζ鎖）のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む。細胞外ドメイン及び膜貫通は、直接的にまたは間接的に連結し得る。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン及び膜貫通は、本明細書に記載のスペーサーによって連結されている。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間などに、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４１ＢＢである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体、例えば抗体断片、ＣＤ２８もしくはその機能的変異体の膜貫通部分であるかまたはその膜貫通部分を含む膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８もしくはその機能的変異体のシグナル伝達部分とＣＤ３ゼータもしくはその機能的変異体のシグナル伝達部分とを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗体、例えば抗体断片、ＣＤ２８もしくはその機能的変異体の膜貫通部分であるかまたはその膜貫通部分を含む膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢもしくはその機能的変異体のシグナル伝達部分とＣＤ３ゼータもしくはその機能的変異体のシグナル伝達部分とを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかのそのような実施形態において、受容体は、ヒンジのみのスペーサーなどのＩｇ分子、例えばＩｇＧ４ヒンジなどのＩｇヒンジのようなヒトＩｇ分子などの一部を含むスペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態において、受容体の膜貫通ドメイン、例えばＣＡＲは、ヒトＣＤ２８またはその変異体の膜貫通ドメイン、例えばヒトＣＤ２８（受託番号：Ｐ１０７４７．１）の２７アミノ酸の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８または４１ＢＢである。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、その４１アミノ酸ドメイン、及び／または天然ＣＤ２８タンパク質の１８６～１８７位にＬＬからＧＧへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、４１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、ヒト４－１ＢＢ（受託番号：Ｑ０７０１１．１）の４２アミノ酸細胞質ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、米国特許第７，４４６，１９０号または米国特許第８，９１１，９９３号に記載されるような、ヒトＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、例えば、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ＡＡ細胞質ドメイン（受託番号：Ｐ２０９６３．２）またはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
本明細書に記載の細胞内の標的核酸を修飾するための方法は、本明細書に記載の組成物を細胞内に導入することを含み、ＨＤＲ鋳型は、標的核酸に組み込まれる。実施例で実証されるように、組成物を細胞内に導入する前に、標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）及びドナーｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体をドナー鋳型（ＣＤＬ標的配列修飾ＨＤＲ鋳型を含む）と共にプレインキュベートすると、ノックアウトセルの収量が高まる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。
いくつかの場合において、細胞は、対象から採取され、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して修飾され、対象に投与される。他の場合において、本明細書に記載の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで対象に送達され得る。例えば、米国特許第９７３７６０４号及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ”，ＮＰＧ Ａｓｉａ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐａｇｅ ｅ４４１（２０１７）を参照されたい。
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、初代細胞内の標的核酸を修飾する方法に使用され得る。本明細書に記載の組成物は、初代細胞内の標的核酸の安定な遺伝子修飾を誘導する方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、当該方法は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、１つ以上の一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びアニオン性ポリマーを含む組成物を初代細胞に導入することを含む。ｓｇＲＮＡは、標的核酸に相補的な第１のヌクレオチド配列、及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）と相互作用する第２のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）及びｓｇＲＮＡを一緒にインキュベートして、初代細胞に導入する前にＲＮＰ複合体を形成してもよい。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、１つ以上の一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びプラスミドドナー鋳型を含む組成物を初代細胞にエレクトロポレーションしてもよい。いくつかの実施形態において、初代細胞は、免疫細胞（例えば、初代Ｔ細胞）、血液細胞、その前駆細胞または幹細胞、間葉細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの事例において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、それらの前駆体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前駆細胞または幹細胞は、造血前駆細胞、造血幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの場合において、血液細胞は、血液幹細胞である。いくつかの事例において、間葉細胞は、間葉幹細胞、間葉前駆細胞、間葉前駆体細胞、分化した間葉細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。分化した間葉細胞は、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞、真皮細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、初代細胞の集団を含み得る。いくつかの場合において、初代細胞の集団は、初代細胞の異種集団を含む。他の場合において、初代細胞の集団は、初代細胞の同種集団を含む。
いくつかの実施形態において、初代細胞は、本明細書に記載の組成物を初代細胞に導入する前に、哺乳動物から単離される。例えば、初代細胞は、ヒト対象から採取することができる。いくつかの事例において、本明細書に記載の組成物を初代細胞に導入した後、初代細胞またはその子孫を哺乳動物に戻す。換言すれば、遺伝子修飾された初代細胞は、自家移植を受ける。他の事例において、遺伝子修飾された初代細胞は、同種移植を受ける。例えば、安定な遺伝子修飾を受けていない初代細胞がドナー対象から単離され、次いで遺伝子修飾された初代細胞が上記ドナー対象とは異なるレシピエント対象に移植される。
本明細書に記載の組成物は、当該技術分野で利用可能な方法及び手法を使用して、細胞（例えば、初代細胞）に導入され得る。好適な方法の非限定的な例としては、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、及び直接マイクロインジェクションが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物を細胞に導入するステップは、組成物を細胞にエレクトロポレーションすることを含む。
いくつかの実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子修飾は、細胞集団（例えば、初代細胞集団）の約５％超、例えば、細胞集団の約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１４％、約１６％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、または約３０％において誘導される。いくつかの実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子修飾は、細胞集団（例えば、初代細胞集団）の約５０％超、例えば、細胞集団の約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％において誘導される。他の実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子修飾は、細胞集団の約７０％超、例えば、細胞集団の約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％において誘導される。さらに他の実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子修飾は、細胞集団の約９０％超、例えば、細胞集団の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％において誘導される。
他の実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子修飾は、標的核酸における遺伝子変異の置換（例えば、疾患に関連する標的核酸における点変異または一塩基多型（ＳＮＰ）を修正すること）、または標的核酸の正常コピーを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の挿入（例えば、疾患に関連する標的核酸の野生型ｃＤＮＡをノックインすること）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかはまた、標的核酸の安定な遺伝子修飾を有する細胞（例えば、初代細胞）を精製することも含み得る。いくつかの場合において、精製ステップによって単離された組成物は、少なくとも約８０％の標的核酸の安定な遺伝子修飾を有する細胞、例えば約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の標的核酸の安定な遺伝子修飾を有する細胞を含む。
開示される材料、組成物、及び成分は、開示される方法及び組成物に用いられ得るか、それらと組み合わせて用いられ得るか、それらの調製において用いられ得るか、またはそれらの産物である。これら及び他の材料は、本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の様々な個別的及び集合的組合せならびに順列のそれぞれに関する具体的な参照を明らかに開示することはできないが、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されることを理解されたい。例えば、方法が開示及び議論され、この方法を含む多数の分子に対して行われ得る多数の修飾が論じられる場合、この方法のそれぞれ及び全ての組み合わせ及び順列、ならびに可能な修飾は、それとは反対のことが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせはまた、具体的に企図され、開示される。この概念は、開示される組成物を用いる方法におけるステップを含む、本開示の全態様に適用されるが、これらに限定されない。よって、多様な追加のステップが実施され得る場合、これら追加のステップのそれぞれが、任意の具体的な方法ステップまたは開示される方法における方法ステップの組み合わせで実施され得、そのような組み合わせまたは組み合わせの部分集合のそれぞれは、具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることが理解される。
本明細書に引用される出版物及びそれらが引用される資料は、参照によりそれら全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、単に例として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。当業者であれば、本質的に同一または類似の結果をもたらすために変更または修正ができるであろう様々な重要性の低いパラメーターがあることを容易に認識するであろう。
実施例１－実験方法
Ｔ細胞の培養
Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、正常ドナーロイコパック（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得られるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から濃縮された。続いて、３％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）及び１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、プレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０－１９７－１９６）中に、ビーズ対細胞比が１：１であるＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、エレクトロポレーション前に３７℃、５％のＣＯ２で４８時間増殖させた。
Ｔ細胞の培養
Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、正常ドナーロイコパック（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得られるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から濃縮された。続いて、３％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）及び１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、プレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ１３０－１９７－１９６）中に、ビーズ対細胞比が１：１であるＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、エレクトロポレーション前に３７℃、５％のＣＯ２で４８時間増殖させた。
ＲＮＰの調製及びＴ細胞エレクトロポレーション
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、ＤＮＡ配列ＡＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号：１）を標的とする１２０μＭのｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）、６２．５μＭのｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ｓＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、及びＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を５：１：３：６の比率で組み合わせて調製した。ある範囲の質量（最終濃度が０～１００ｍｇ／ｌの範囲）のプラスミドＤＮＡ（ＨＤＲ相同アームを挟むＣＤＬ配列の有無にかかわらず、ＨＤＲ鋳型［Ｍｙｃエピトープタグ及び４５０ｂｐの隣接相同アームを有する導入遺伝子をコードする、約５．７ｋｂのインサート］を有するプラスミド）を３．５μｌのＲＮＰと混合した。Ｔ細胞を計数し、９０×Ｇで１０分間遠心分離し、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）を加え、１０＾６細胞／１４．５μｌのＰ３で再懸濁した。１４．５μｌのＴ細胞懸濁液をＤＮＡ／ＲＮＰ混合物に添加し、Ｌｏｎｚａ ３８４ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレート上のウェルに移し、コードＥＨ－１１５を有するＬｏｎｚａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍでパルスした。細胞を室温で１５分間静置した後、１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、プレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地中の９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰは、ＤＮＡ配列ＡＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号：１）を標的とする１２０μＭのｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）、６２．５μＭのｓＮＬＳ－ＳｐＣａｓ９－ｓＮＬＳタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、及びＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）を５：１：３：６の比率で組み合わせて調製した。ある範囲の質量（最終濃度が０～１００ｍｇ／ｌの範囲）のプラスミドＤＮＡ（ＨＤＲ相同アームを挟むＣＤＬ配列の有無にかかわらず、ＨＤＲ鋳型［Ｍｙｃエピトープタグ及び４５０ｂｐの隣接相同アームを有する導入遺伝子をコードする、約５．７ｋｂのインサート］を有するプラスミド）を３．５μｌのＲＮＰと混合した。Ｔ細胞を計数し、９０×Ｇで１０分間遠心分離し、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）を加え、１０＾６細胞／１４．５μｌのＰ３で再懸濁した。１４．５μｌのＴ細胞懸濁液をＤＮＡ／ＲＮＰ混合物に添加し、Ｌｏｎｚａ ３８４ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレート上のウェルに移し、コードＥＨ－１１５を有するＬｏｎｚａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍでパルスした。細胞を室温で１５分間静置した後、１２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７及びＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、プレミアムグレード）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地中の９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。
フローサイトメトリー分析
導入遺伝子発現（Ｍｙｃエピトープタグを有する対象となる遺伝子）は、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン９Ｂ１１）で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで分析することによって検出した。使用した他の抗体は、ＴＣＲアルファ／ベータ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＩＰ２６）、ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＳＫ１）であった。
導入遺伝子発現（Ｍｙｃエピトープタグを有する対象となる遺伝子）は、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン９Ｂ１１）で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターで分析することによって検出した。使用した他の抗体は、ＴＣＲアルファ／ベータ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＩＰ２６）、ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＳＫ１）であった。
配列
ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー（例えば、ＣＤＬ標的配列）：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ
ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー（例えば、ＣＤＬ標的配列）：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ
ＣＲＩＳＰＲ全体部位、プロトスペーサー、及び例示的なＰＡＭ：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧ
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧ
使用した標準プラスミドドナーバックボーン配列（Ｘは、長さが５６９６ｂｐの導入遺伝子インサートがあった場所を示す。標準の大文字は、相同アームを示す）：
使用したＣＤＬプラスミドドナーバックボーン配列（Ｘは、長さが５６９６ｂｐの導入遺伝子インサートがあった場所を示す。太字は、プロトスペーサー（ＣＤＬ標的配列）を示す。小文字の斜体は、ＰＡＭを示す。標準の大文字は、相同アームを示す）：
実施例２－Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集のための共送達直鎖化（ＣＤＬ）設計
ＲＮＰエレクトロポレーションを用いたＴ細胞の遺伝子操作を、プラスミドドナー鋳型と、（１）相同性アームで単に挟まれる導入遺伝子の標準ＨＤＲＴ設計を特徴とする相同性指向修復鋳型カセット（ＨＤＲＴ）（図１－左パネル）、または（２）ＨＤＲＴが、ＣＤＬ標的配列（Ｔ細胞ゲノムを標的とするために使用されるＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡのプロトスペーサーと一致するＣＲＩＳＰＲ標的部位）及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）でさらに挟まれる、共送達直鎖化（ＣＤＬ）設計（図１－右パネル）と比較して検討した。
ＲＮＰエレクトロポレーションを用いたＴ細胞の遺伝子操作を、プラスミドドナー鋳型と、（１）相同性アームで単に挟まれる導入遺伝子の標準ＨＤＲＴ設計を特徴とする相同性指向修復鋳型カセット（ＨＤＲＴ）（図１－左パネル）、または（２）ＨＤＲＴが、ＣＤＬ標的配列（Ｔ細胞ゲノムを標的とするために使用されるＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡのプロトスペーサーと一致するＣＲＩＳＰＲ標的部位）及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）でさらに挟まれる、共送達直鎖化（ＣＤＬ）設計（図１－右パネル）と比較して検討した。
図２に示すように、標準またはＣＤＬプラスミドドナー鋳型の量を変化させたＲＮＰ複合体を用いてＴ細胞をエレクトロポレーションし、その後、フローサイトメトリーによって導入遺伝子の組み込みについて評価した（図２Ａ、表１で定量化）。ＣＤＬ設計は、ＣＤＬ配列修飾のない標準ＨＤＲＴプラスミドよりも低用量のＨＤＲＴ ＤＮＡの場合、より高いＫＩ％を示した（図２Ｂ、表２で定量化）。さらに、全体的なＴ細胞収量は、標準ＨＤＲＴプラスミドと比較して、これらの低ＤＮＡ用量の場合に増加した（図２Ｃ、表３で定量化）。したがって、ＣＤＬドナープラスミド設計は、標準プラスミド設計と比較して、遺伝子操作されたＴ細胞の収量が大幅に増加（Ｐ＜０．０００１）することを示した。さらに、標準ＨＤＲＴプラスミドとは対照的に、試験した全ての濃度のＣＤＬ ＨＤＲＴ鋳型を使用する場合、ＣＤ８対ＣＤ４Ｔ細胞の比率は、約０．５未満であった（図３、表４で定量化）。４人の個々のドナーに由来するＴ細胞全体のノックイン細胞収量のばらつきも、標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドを様々な用量で使用して、変動係数パーセント（％ＣＶ）及び最大対最小の比（最大／最小倍数）で評価した。注目すべきことに、０．５以下の用量では標準プラスミド設計と比較してＣＤＬ設計では収量の差が明らかに低かった（表５）。データは、ＣＤＬドナープラスミド設計がエレクトロポレーション媒介Ｃａｓ９Ｔ細胞編集におけるドナー間での収量の向上及び収量の一貫性の向上をもたらし、細胞工学プロセスにおいて大きな利点となることを実証した。
（表１）ノックインパーセンテージの定量化に対する代表的なフロー画像（Ｍｙｃ－タグ％）
（表２）ノックインパーセンテージの定量化（Ｍｙｃ－タグ％）
（表３）ノックイン細胞収量の定量化
（表４）ＣＤ８／ＣＤ４比率の定量化
（表５）複数のドナーにわたるノックイン細胞収量のばらつき
実施例３－臨床スケールプラットフォームでのパフォーマンス及び臨床スケールのトランスフェクション後のＣＤＬ配列のＨＤＲカセットへの組み入れによる細胞への導入遺伝子の組み込みの割合増加
材料及び方法
初代ヒトＴ細胞の単離及び活性化：健康なドナーからアフェレーシスによって収集された新鮮な細胞集団は、ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＭｉｌｔｅｎｙｉのＣＤ４ ＣＤ８単離のための陽性単離キット及びＭｉｌｔｅｎｙｉのＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを使用して、ドナー細胞集団からＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を単離した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を使用して単離した後、単離したＣＤ４／８Ｔ細胞を活性化した。３％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）とＩＬ７及びＩＬ１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを補充したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＴｅｘＭＡＣＳ培地中に細胞を活性化した。活性化培地の添加後、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。
材料及び方法
初代ヒトＴ細胞の単離及び活性化：健康なドナーからアフェレーシスによって収集された新鮮な細胞集団は、ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＭｉｌｔｅｎｙｉのＣＤ４ ＣＤ８単離のための陽性単離キット及びＭｉｌｔｅｎｙｉのＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを使用して、ドナー細胞集団からＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を単離した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８を使用して単離した後、単離したＣＤ４／８Ｔ細胞を活性化した。３％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）とＩＬ７及びＩＬ１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを補充したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＴｅｘＭＡＣＳ培地中に細胞を活性化した。活性化培地の添加後、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。
エレクトロポレーションのための初代ヒトＴ細胞の調製：活性化後、Ｔ細胞を活性化容器から取り出し、５０ｍＬの円錐形の管に移した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈが提供するビーズ除去プロトコールに従って、ビーズを含まない活性化細胞集団を得た。
エレクトロポレーションのためのリボ核タンパク質複合体の調製：ＧＳ９４遺伝子座を標的とする一本鎖ガイドＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手し、ＴＥ／水中に使用濃度まで再懸濁した。 カスパーゼタンパク質ｓｐＣａｓ９は、Ａｌｄｅｖｒｏｎから入手した。ガイドＲＮＡ及びカスパーゼタンパク質は、室温で複合化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。
プラスミドＤＮＡ：ＣＤＬ配列を含むプラスミドＤＮＡは、社内で設計され、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏによって調製された。
エレクトロポレーションを介した初代Ｔ細胞のトランスフェクション：上記のように調製した活性化Ｔ細胞を計数し、エレクトロポレーション反応ごとに５ｅ７細胞を５０ｍＬの円錐形の管に移した。細胞を３００×ｇで５分間ペレット化し、次いでＤＰＢＳで洗浄し、３００×ｇで５分間ペレット化した。次いで、細胞をＬｏｎｚａ Ｐ３緩衝液に再懸濁した。バッファーの体積は、ＲＮＰ及びＤＮＡを添加した後の細胞懸濁液の総体積が１ｍＬになるように計算された。複数のＤＮＡ構築物全体のパフォーマンスを評価するために、導入遺伝子「Ｘ」を含む３つのＣＤＬ構築物と３つの非ＣＤＬ構築物を試験用に選択した。各構築物について、トランスフェクションごとに２０μｇのＤＮＡを使用した。ＤＮＡをＲＮＰ溶液と混合し、次に細胞懸濁液と完全に混合した。次に、細胞、ＲＮＰ、及びＤＮＡ懸濁液をＬｏｎｚａ ＬＶカートリッジに移した。細胞をＬｏｎｚａ ＬＶ装置上でエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションの後に室温で１０分間回復させた。次いで、細胞混合物を、３５０ｍＬの培地を含むＧ－ｒｅｘ１００（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）に移し、３７℃でインキュベートした。
フローサイトメトリーによる結果の分析：結果は、トランスフェクション後６日目または活性化後８日目にフローサイトメトリーによって収集した。分析用の細胞を準備するために、対照ウェルを混合して均一溶液を得、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｋ２ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用してＡＯＰＩ染色を行って計数し、生細胞と死細胞とを区別した。得られた値を使用し、各ウェルから２ｅ５細胞を取り出し、９６ウェルのＶ底プレートに移した。細胞をペレット化し、次いでＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１回洗浄し、４００×ｇで５分間ペレット化した。遠心分離中に染色液を調製した。フローパネルには、Ｍｙｃ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＺｏｍｂｉｅ Ｌ／Ｄ染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が含まれる。細胞を染色溶液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒをウェルに添加し、細胞を４００×ｇで５分間ペレット化した。次いで、細胞をＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、計数ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。フロー分析は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅサイトメーターで行い、結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
結果
臨床スケールプラットフォームでのパフォーマンス：５’ＨＤＲアームのすぐ上流及び３’ＨＤＲアームの下流にＣＤＬ配列を含むように相同性指向修復鋳型を含むプラスミドの核酸配列を修飾する効果を、前述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の状況で、細胞治療製品の臨床製造に関連するプラットフォーム及びスケール上で評価した。この研究の目的は、臨床状況におけるＣＤＬ配列の有用性を実証し、細胞療法製品を製造する技術の適用可能性を明らかにすることであった。
臨床スケールプラットフォームでのパフォーマンス：５’ＨＤＲアームのすぐ上流及び３’ＨＤＲアームの下流にＣＤＬ配列を含むように相同性指向修復鋳型を含むプラスミドの核酸配列を修飾する効果を、前述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の状況で、細胞治療製品の臨床製造に関連するプラットフォーム及びスケール上で評価した。この研究の目的は、臨床状況におけるＣＤＬ配列の有用性を実証し、細胞療法製品を製造する技術の適用可能性を明らかにすることであった。
臨床スケールのトランスフェクション後に、ＣＤＬ配列をＨＤＲカセットに組み入れることにより、細胞への導入遺伝子の組み込みの割合が増加する。ＣＤＬ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ及び導入遺伝子をコードする配列を含むプラスミド、またはＣＤＬ配列を有しない導入遺伝子をコードする配列を含む対照プラスミドを用いてエレクトロポレーションしたＴ細胞を、エレクトロポレーション後６日目に細胞数及び導入遺伝子発現の両方について評価した。導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の長さは、６５３３塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３７９８の場合）、７０４２塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３６３１の場合）、及び６２３６塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３７９７の場合）であった。図４に示す結果には、対照の非ＣＤＬ部位含有プラスミドを受けた条件と比較して、ＣＤＬ配列を含むプラスミドを受けた条件における導入遺伝子の発現に有意な（ｐ＜０．０５）増加が示される。違いは、組み込まれた導入遺伝子を保有する細胞の割合で明らかである。フローサイトメトリーによって評価した導入遺伝子発現は、平均して、２０ｕｇＤＮＡで非ＣＤＬ条件の３．３５％からＣＤＬ条件の９．７６％に増加した。全体として、これらのデータは、ＣＤＬ配列の組み入れが遺伝子編集プロセスに及ぼす影響の強化することを示している。
参考文献
いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、セーフハーバー（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）核酸配列を含む。いくつかの態様において、セーフハーバー核酸配列は、核酸配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（配列番号：２）を含む。いくつかの態様において、ＰＡＭ配列の一方もしくは両方が、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間でコードされるか、または前記ＰＡＭ配列のどちらもが、ＣＤＬ標的配列とＨＤＲ鋳型との間でコードされない。
本明細書で使用する場合、細胞のゲノム中の標的核酸を修飾するという文脈における「修飾する」という用語は、標的核酸に変化（例えば、切断）を誘導することを指す。いくつかの実施形態において、変化は、標的核酸の配列における構造変化であり得る。例えば、標的核酸にヌクレオチド配列を挿入する形態で修飾を実施し得る。例えば、外因性ヌクレオチド配列を標的核酸に挿入し得る。標的核酸を切除して外因性ヌクレオチド配列と置換することも可能である。他の例としては、標的核酸にヌクレオチド配列を挿入することなく、標的核酸を切断する形態で修飾を実施し得る。例えば、標的核酸を切断し、切除することが可能である。このような修飾は、例えば、標的核酸内に二本鎖切断部を誘導するか、または反対側の鎖に一対の一本鎖ニックを誘導し、標的核酸に隣接させて行うことが可能である。標的核酸においてまたは標的核酸内で一本鎖または二本鎖切断部を誘導する方法としては、標的核酸を対象とした本明細書に記載の標的化可能ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を使用することが挙げられる。他の実施形態において、標的核酸を修飾することは、別のタンパク質を標的核酸に標的化することを含み、標的核酸を切断することは含まない。
[本発明１００１]
標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。
[本発明１００２]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、本発明１００１の組成物。
[本発明１００３]
前記ＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含むＲＮＡをさらに含む、本発明１００２の組成物。
[本発明１００４]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、本発明１００２または１００３の組成物。
[本発明１００５]
前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１００４の組成物。
[本発明１００６]
前記組成物は、前記第１のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第１のドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、前記第２のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のドナーｇＲＮＡとをさらに含み、各ドナーｇＲＮＡは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む別個の複合体を形成するように構成され、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１００４の組成物。
[本発明１００７]
１つ以上の前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、本発明１００５または１００６の組成物。
[本発明１００８]
前記ＨＤＲ鋳型は、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的な相同アームを含む、本発明１００７の組成物。
[本発明１００９]
前記相同アームは、それぞれ独立して、少なくとも４００ｂｐの長さ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐの長さから選択される、本発明１００８の組成物。
[本発明１０１０]
（ａ）前記標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、
（ｂ）前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、かつ
（ｃ）（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
本発明１００１の組成物。
[本発明１０１１]
標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。
[本発明１０１２]
前記組成物は、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質をさらに含み、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体は、前記細胞のゲノム標的配列を切断することが可能である、本発明１００１～１０１１のいずれかの組成物。
[本発明１０１３]
前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、本発明１０１２の組成物。
[本発明１０１４]
前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のＲＮＡをさらに含む、本発明１０１３の組成物。
[本発明１０１５]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、本発明１０１３または１０１４の組成物。
[本発明１０１６]
前記組成物は、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成された標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記標的ｇＲＮＡは、前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記ゲノム標的配列は、前記ゲノム標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１０１５の組成物。
[本発明１０１７]
前記第１のＣＤＬ標的配列、前記第２のＣＤＬ標的配列、及び前記ゲノム標的配列は、同じ核酸配列を含む、本発明１０１２～１０１６のいずれかの組成物。
[本発明１０１８]
前記ゲノム標的配列は、セーフハーバー（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）核酸配列を含む、本発明１０１２～１０１７のいずれかの組成物。
[本発明１０１９]
前記セーフハーバー核酸配列は、核酸配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡを含む、本発明１０１８の組成物。
[本発明１０２０]
前記ＰＡＭ配列の一方もしくは両方が、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされるか、または前記ＰＡＭ配列のどちらもが、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされない、本発明１００５～１０１９のいずれかの組成物。
[本発明１０２１]
前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記各ｇＲＮＡは、それぞれ、１：１０～２：１のモル比である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２２]
前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記ドナー鋳型は、それぞれ、１０：１～１０００：１のモル比である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２３]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、本発明１００１または１０１２の組成物。
[本発明１０２４]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、本発明１００１または１０１２の組成物。
[本発明１０２５]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列に融合される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２６]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２７]
本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を前記細胞内に導入すること、または本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を前記細胞内に非ウイルス的に導入したことを含む、前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、
前記ＨＤＲ鋳型は、前記標的核酸に組み込まれる、前記方法。
[本発明１０２８]
前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０２７の方法。
[本発明１０２９]
前記細胞は、初代細胞である、本発明１０２７または１０２８の方法。
[本発明１０３０]
前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０２９の方法。
[本発明１０３１]
本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を含む、標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体。
[本発明１０３２]
標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、前記リボヌクレオタンパク質複合体。
[本発明１０３３]
前記組成物は、
（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
をさらに含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１０３２の組成物。
[本発明１０３４]
前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、本発明１０３２または１０３３の組成物を前記細胞内に導入することを含む、前記方法。
[本発明１０３５]
前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０３４の方法。
[本発明１０３６]
前記細胞は、初代細胞である、本発明１０３２～１０３５の方法。
[本発明１０３７]
前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０３６の方法。
[本発明１０３８]
前記方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われる、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明１０３９]
リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する方法であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と
をインキュベートすることまたはインキュベートしたことを含む、前記方法。
[本発明１０４０]
前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡは、３７℃で少なくとも１７分間一緒にインキュベートされる、本発明１０３９の方法。
[本発明１０４１]
ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質のモル比は、０．２５：１～４：１である、本発明１０３９または１０４０の方法。
[本発明１０４２]
前記ＲＮＰ複合体は、１００ｎｍ未満の大きさを有する、本発明１０３９～１０４１のいずれかの方法。
[本発明１０４３]
前記ＲＮＰ複合体は、２０ｎｍ～９０ｎｍの大きさを有する、本発明１０４２の方法。
[本発明１０４４]
（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
を含む、組成物であって、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、前記組成物。
[本発明１０４５]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む、本発明１０４４の組成物。
[本発明１０４６]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む、本発明１０４４または１０４５の組成物。
[本発明１０４７]
前記ドナー鋳型は、５’から３’に向かって、Ｐ１ａ－Ｎ１－Ｐ２ｂ－Ｈ－Ｐ３ｃ－Ｎ２－Ｐ４ｄの配列を含み、前記配列中、
（１）Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ＰＡＭ配列であり、
（２）Ｎ１は、前記第１のＣＤＬ標的配列であり、Ｎ２は、前記第２のＣＤＬ標的配列であり、
（３）Ｈは、前記ＨＤＲ鋳型であり、
（４）ａは０、ｂは１であるか、またはａは１、ｂは０であり、
（５）ｃは０、ｄは１であるか、または、ｃは１、ｄは０である、
本発明１０４４～１０４６のいずれかの組成物。
[本発明１０４８]
細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、
前記方法。
[本発明１０４９]
細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
前記方法。
[本発明１０５０]
細胞のゲノム標的配列を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同アームに挟まれた挿入のための核酸を含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞の前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、
前記相同アームは、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的であり、前記挿入のための核酸は、前記細胞の前記ゲノム標的配列に挿入されるように構成される、
前記方法。
[本発明１０５１]
前記細胞は、ヒト細胞である、本発明１０４８～１０５０のいずれかの方法。
[本発明１０５２]
前記細胞は、免疫細胞である、本発明１０４８～１０５１のいずれかの方法。
[本発明１０５３]
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、本発明１０５２の方法。
[本発明１０５４]
前記Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０５３の方法。
[本発明１０５５]
非ウイルス送達のために製剤化された前記組成物の前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０４８～１０５４のいずれかの方法。
[本発明１０５６]
ドナー鋳型の量は、少なくとも約８０、１０～１２０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１００、１１０、または１２０μｇである、本発明１０４８～１０５５のいずれかの方法。
[本発明１０５７]
個々のエレクトロポレーション反応のための細胞の数は、少なくとも約５、１～１０、１、２、３、４、６、７、８、９、または１０ｅ７である、本発明１０５５のいずれかの方法。
[本発明１０５８]
提供される細胞の総数は、少なくとも１０ｅ７よりも大きく、１回超のエレクトロポレーション反応が実施される、本発明１０５７の方法。
[本発明１０５９]
細胞懸濁液の総体積は、約１ｍＬである、本発明１０４８～１０５８のいずれかの方法。
[本発明１０６０]
前記ＣＤＬ標的配列を含まないがそれ以外は同一の対照組成物と比較して、前記細胞の前記ゲノム標的配列における鋳型挿入が増加し、任意で、前記対照と比較して、少なくとも約１～５、１、２、３、４、または５倍に前記鋳型挿入が増加する、本発明１０４８～１０５９のいずれかの方法。
[本発明１００１]
標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。
[本発明１００２]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、本発明１００１の組成物。
[本発明１００３]
前記ＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含むＲＮＡをさらに含む、本発明１００２の組成物。
[本発明１００４]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、本発明１００２または１００３の組成物。
[本発明１００５]
前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１００４の組成物。
[本発明１００６]
前記組成物は、前記第１のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第１のドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、前記第２のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のドナーｇＲＮＡとをさらに含み、各ドナーｇＲＮＡは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む別個の複合体を形成するように構成され、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１００４の組成物。
[本発明１００７]
１つ以上の前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、本発明１００５または１００６の組成物。
[本発明１００８]
前記ＨＤＲ鋳型は、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的な相同アームを含む、本発明１００７の組成物。
[本発明１００９]
前記相同アームは、それぞれ独立して、少なくとも４００ｂｐの長さ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐの長さから選択される、本発明１００８の組成物。
[本発明１０１０]
（ａ）前記標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、
（ｂ）前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、かつ
（ｃ）（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
本発明１００１の組成物。
[本発明１０１１]
標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。
[本発明１０１２]
前記組成物は、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質をさらに含み、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体は、前記細胞のゲノム標的配列を切断することが可能である、本発明１００１～１０１１のいずれかの組成物。
[本発明１０１３]
前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、本発明１０１２の組成物。
[本発明１０１４]
前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のＲＮＡをさらに含む、本発明１０１３の組成物。
[本発明１０１５]
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、本発明１０１３または１０１４の組成物。
[本発明１０１６]
前記組成物は、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成された標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記標的ｇＲＮＡは、前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記ゲノム標的配列は、前記ゲノム標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１０１５の組成物。
[本発明１０１７]
前記第１のＣＤＬ標的配列、前記第２のＣＤＬ標的配列、及び前記ゲノム標的配列は、同じ核酸配列を含む、本発明１０１２～１０１６のいずれかの組成物。
[本発明１０１８]
前記ゲノム標的配列は、セーフハーバー（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）核酸配列を含む、本発明１０１２～１０１７のいずれかの組成物。
[本発明１０１９]
前記セーフハーバー核酸配列は、核酸配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡを含む、本発明１０１８の組成物。
[本発明１０２０]
前記ＰＡＭ配列の一方もしくは両方が、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされるか、または前記ＰＡＭ配列のどちらもが、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされない、本発明１００５～１０１９のいずれかの組成物。
[本発明１０２１]
前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記各ｇＲＮＡは、それぞれ、１：１０～２：１のモル比である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２２]
前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記ドナー鋳型は、それぞれ、１０：１～１０００：１のモル比である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２３]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、本発明１００１または１０１２の組成物。
[本発明１０２４]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、本発明１００１または１０１２の組成物。
[本発明１０２５]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列に融合される、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２６]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、先行本発明のいずれかの組成物。
[本発明１０２７]
本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を前記細胞内に導入すること、または本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を前記細胞内に非ウイルス的に導入したことを含む、前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、
前記ＨＤＲ鋳型は、前記標的核酸に組み込まれる、前記方法。
[本発明１０２８]
前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０２７の方法。
[本発明１０２９]
前記細胞は、初代細胞である、本発明１０２７または１０２８の方法。
[本発明１０３０]
前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０２９の方法。
[本発明１０３１]
本発明１００１～１０２６のいずれかの組成物を含む、標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体。
[本発明１０３２]
標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、前記リボヌクレオタンパク質複合体。
[本発明１０３３]
前記組成物は、
（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
をさらに含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、本発明１０３２の組成物。
[本発明１０３４]
前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、本発明１０３２または１０３３の組成物を前記細胞内に導入することを含む、前記方法。
[本発明１０３５]
前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０３４の方法。
[本発明１０３６]
前記細胞は、初代細胞である、本発明１０３２～１０３５の方法。
[本発明１０３７]
前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０３６の方法。
[本発明１０３８]
前記方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われる、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明１０３９]
リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する方法であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と
をインキュベートすることまたはインキュベートしたことを含む、前記方法。
[本発明１０４０]
前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡは、３７℃で少なくとも１７分間一緒にインキュベートされる、本発明１０３９の方法。
[本発明１０４１]
ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質のモル比は、０．２５：１～４：１である、本発明１０３９または１０４０の方法。
[本発明１０４２]
前記ＲＮＰ複合体は、１００ｎｍ未満の大きさを有する、本発明１０３９～１０４１のいずれかの方法。
[本発明１０４３]
前記ＲＮＰ複合体は、２０ｎｍ～９０ｎｍの大きさを有する、本発明１０４２の方法。
[本発明１０４４]
（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
を含む、組成物であって、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、前記組成物。
[本発明１０４５]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む、本発明１０４４の組成物。
[本発明１０４６]
前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む、本発明１０４４または１０４５の組成物。
[本発明１０４７]
前記ドナー鋳型は、５’から３’に向かって、Ｐ１ａ－Ｎ１－Ｐ２ｂ－Ｈ－Ｐ３ｃ－Ｎ２－Ｐ４ｄの配列を含み、前記配列中、
（１）Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ＰＡＭ配列であり、
（２）Ｎ１は、前記第１のＣＤＬ標的配列であり、Ｎ２は、前記第２のＣＤＬ標的配列であり、
（３）Ｈは、前記ＨＤＲ鋳型であり、
（４）ａは０、ｂは１であるか、またはａは１、ｂは０であり、
（５）ｃは０、ｄは１であるか、または、ｃは１、ｄは０である、
本発明１０４４～１０４６のいずれかの組成物。
[本発明１０４８]
細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、
前記方法。
[本発明１０４９]
細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
前記方法。
[本発明１０５０]
細胞のゲノム標的配列を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同アームに挟まれた挿入のための核酸を含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞の前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、
前記相同アームは、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的であり、前記挿入のための核酸は、前記細胞の前記ゲノム標的配列に挿入されるように構成される、
前記方法。
[本発明１０５１]
前記細胞は、ヒト細胞である、本発明１０４８～１０５０のいずれかの方法。
[本発明１０５２]
前記細胞は、免疫細胞である、本発明１０４８～１０５１のいずれかの方法。
[本発明１０５３]
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、本発明１０５２の方法。
[本発明１０５４]
前記Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である、本発明１０５３の方法。
[本発明１０５５]
非ウイルス送達のために製剤化された前記組成物の前記導入は、エレクトロポレーションを含む、本発明１０４８～１０５４のいずれかの方法。
[本発明１０５６]
ドナー鋳型の量は、少なくとも約８０、１０～１２０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１００、１１０、または１２０μｇである、本発明１０４８～１０５５のいずれかの方法。
[本発明１０５７]
個々のエレクトロポレーション反応のための細胞の数は、少なくとも約５、１～１０、１、２、３、４、６、７、８、９、または１０ｅ７である、本発明１０５５のいずれかの方法。
[本発明１０５８]
提供される細胞の総数は、少なくとも１０ｅ７よりも大きく、１回超のエレクトロポレーション反応が実施される、本発明１０５７の方法。
[本発明１０５９]
細胞懸濁液の総体積は、約１ｍＬである、本発明１０４８～１０５８のいずれかの方法。
[本発明１０６０]
前記ＣＤＬ標的配列を含まないがそれ以外は同一の対照組成物と比較して、前記細胞の前記ゲノム標的配列における鋳型挿入が増加し、任意で、前記対照と比較して、少なくとも約１～５、１、２、３、４、または５倍に前記鋳型挿入が増加する、本発明１０４８～１０５９のいずれかの方法。
本出願は、以下の図を含む。図面は、組成物及び方法のある実施形態及び／または特徴を例示すること、及び組成物及び方法の説明（複数可）を補足することを意図している。記載された説明がそのようなことが当てはまることを明示的に示さない限り、図面は組成物及び方法の範囲を限定しない。
カセットのゲノム挿入を媒介するためのＣＤＬ（共送達直鎖化）プラスミド設計の例示的なメカニズムを示す概念図である。右側に示すように、ＣＤＬ配列（ＨＤＲ組み込みのためのＣａｓ９ゲノム標的と同一性を有するＣａｓ９標的配列）と、３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを、カセットを挟む相同アームの外側に追加することにより、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）媒介エンドヌクレアーゼを活性化させて、ゲノム内のＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ媒介切断に加え、プラスミドからカセットと相同アームを放出する。これに対して、左側に示す標準プラスミドでは、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰがプラスミドは切断せず、ゲノム遺伝子座のみを切断する。
図２は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ及び標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞のノックイン（ＫＩ）効率及びＫＩ細胞収量を示すフローサイトメトリーのドットプロット及びグラフである。図２Ａは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＰと、標準プラスミド（上段パネル）またはＭＹＣタグ付き表面タンパク質をコードするＣＤＬプラスミド（下段パネル）のいずれかの、様々な用量（左から右に向けて増加、０～１００ｍｇ／Ｌの範囲）の相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型を用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞の一連のフローサイトメトリーのドットプロットを示す。図２Ｂは、標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合のＫＩ％を示すグラフである。図２Ｃは、標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合の、開始細胞１００万個当たりのＫＩ＋生存細胞（生／死染色；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）収量を示すグラフである。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
図２Ａ－１の説明を参照のこと。
標準プラスミドまたはＣＤＬプラスミドのいずれかの用量を変化させた場合のＣＤ８／ＣＤ４比率を示すグラフである。
エレクトロポレーション後６日目において、ＣＤＬ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（配列番号：２）を含む３つのプラスミド及びＣＤＬ配列を含まない３つのプラスミド用いてエレクトロポレーションを行ったＴ細胞の導入遺伝子発現を示すグラフである。
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはまた、局在化ペプチドまたはタンパク質と融合し得る。例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列と融合することが可能であり、これによって、ヌクレアーゼ及びそれが形成するＲＮＰ複合体を核に導き、標的核酸を修飾することが可能である。ＮＬＳ配列の例としては、当該技術分野で周知のもの、例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５，２００７に記載されているものが挙げられ、また、ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号：３）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号：４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号：５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号：６）、及びＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：７）が含まれるが、これらに限定されない。細胞透過ペプチド及び細胞標的化ペプチドなどの、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに使用可能な他のペプチドまたはタンパク質の例としては、当該技術分野で入手可能であるもの、例えば、Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７８６（２）：１２６－３８，２００８に記載されているものが挙げられる。
標的化可能ヌクレアーゼはまた、局在化ペプチドまたはタンパク質と融合し得る。例えば、標的化可能ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列と融合することが可能であり、これによって、標的化可能ヌクレアーゼ及びそれが形成するＲＮＰ複合体を核に導き、同種核酸配列を修飾することが可能である。ＮＬＳ配列の例としては、当該技術分野で周知のもの、例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５，２００７に記載されているものが挙げられ、また、ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号：３）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号：４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号：５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号：６）、及びＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：７）が含まれるが、これらに限定されない。細胞透過ペプチド及び細胞標的化ペプチドなどの、標的化可能ヌクレアーゼに使用可能な他のペプチドまたはタンパク質の例としては、当該技術分野で入手可能であるもの、例えば、Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１７８６（２）：１２６－３８，２００８に記載されているものが挙げられる。
配列
ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー（例えば、ＣＤＬ標的配列）：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（配列番号：２）
ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー（例えば、ＣＤＬ標的配列）：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（配列番号：２）
ＣＲＩＳＰＲ全体部位、プロトスペーサー、及び例示的なＰＡＭ：
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧ（配列番号：８）
ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧ（配列番号：８）
使用した標準プラスミドドナーバックボーン配列（Ｘは、長さが５６９６ｂｐの導入遺伝子インサートがあった場所を示す。標準の大文字は、相同アームを示す）：
使用したＣＤＬプラスミドドナーバックボーン配列（Ｘは、長さが５６９６ｂｐの導入遺伝子インサートがあった場所を示す。太字は、プロトスペーサー（ＣＤＬ標的配列）を示す。小文字の斜体は、ＰＡＭを示す。標準の大文字は、相同アームを示す）：
臨床スケールのトランスフェクション後に、ＣＤＬ配列をＨＤＲカセットに組み入れることにより、細胞への導入遺伝子の組み込みの割合が増加する。ＣＤＬ配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡ（配列番号：２）及び導入遺伝子をコードする配列を含むプラスミド、またはＣＤＬ配列を有しない導入遺伝子をコードする配列を含む対照プラスミドを用いてエレクトロポレーションしたＴ細胞を、エレクトロポレーション後６日目に細胞数及び導入遺伝子発現の両方について評価した。導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の長さは、６５３３塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３７９８の場合）、７０４２塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３６３１の場合）、及び６２３６塩基対の長さ（プラスミドｐＳ３７９７の場合）であった。図４に示す結果には、対照の非ＣＤＬ部位含有プラスミドを受けた条件と比較して、ＣＤＬ配列を含むプラスミドを受けた条件における導入遺伝子の発現に有意な（ｐ＜０．０５）増加が示される。違いは、組み込まれた導入遺伝子を保有する細胞の割合で明らかである。フローサイトメトリーによって評価した導入遺伝子発現は、平均して、２０ｕｇＤＮＡで非ＣＤＬ条件の３．３５％からＣＤＬ条件の９．７６％に増加した。全体として、これらのデータは、ＣＤＬ配列の組み入れが遺伝子編集プロセスに及ぼす影響の強化することを示している。
Claims (60)
- 標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能であり、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。 - 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１に記載の組成物。
- 前記ＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含むＲＮＡをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、請求項２または３に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、請求項４に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記第１のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第１のドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、前記第２のＣＤＬ標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のドナーｇＲＮＡとをさらに含み、各ドナーｇＲＮＡは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む別個の複合体を形成するように構成され、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、請求項４に記載の組成物。
- １つ以上の前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞のゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、請求項５または６に記載の組成物。
- 前記ＨＤＲ鋳型は、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的な相同アームを含む、請求項７に記載の組成物。
- 前記相同アームは、それぞれ独立して、少なくとも４００ｂｐの長さ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、または少なくとも２０００ｂｐの長さから選択される、請求項８に記載の組成物。
- （ａ）前記標的化可能ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、
（ｂ）前記組成物は、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、かつ
（ｃ）（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
請求項１に記載の組成物。 - 標的核酸を修飾するための組成物であって、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、
前記組成物。 - 前記組成物は、第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質をさらに含み、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体は、前記細胞のゲノム標的配列を切断することが可能である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである、請求項１２に記載の組成物。
- 前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含む第２のＲＮＡをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
- 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である、請求項１３または１４に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成された標的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、（１）前記標的ｇＲＮＡは、前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記ゲノム標的配列は、前記ゲノム標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、請求項１５に記載の組成物。
- 前記第１のＣＤＬ標的配列、前記第２のＣＤＬ標的配列、及び前記ゲノム標的配列は、同じ核酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ゲノム標的配列は、セーフハーバー（ｓａｆｅ－ｈａｒｂｏｒ）核酸配列を含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記セーフハーバー核酸配列は、核酸配列ＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡを含む、請求項１８に記載の組成物。
- 前記ＰＡＭ配列の一方もしくは両方が、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされるか、または前記ＰＡＭ配列のどちらもが、前記ＣＤＬ標的配列と前記ＨＤＲ鋳型との間でコードされない、請求項５～１９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記各ｇＲＮＡは、それぞれ、１：１０～２：１のモル比である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼ及び前記ドナー鋳型は、それぞれ、１０：１～１０００：１のモル比である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、請求項１または１２に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質及びヌクレアーゼを含む、請求項１または１２に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列に融合される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質及び／または前記第２の標的化可能ヌクレアーゼタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
- 請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記細胞内に導入すること、または請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を前記細胞内に非ウイルス的に導入したことを含む、前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、
前記ＨＤＲ鋳型は、前記標的核酸に組み込まれる、前記方法。 - 前記導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項２７に記載の方法。
- 前記細胞は、初代細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
- 前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、請求項２９に記載の方法。
- 請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物を含む、標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体。
- 標的核酸を修飾するためのリボヌクレオタンパク質複合体であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
組成物は、細胞への非ウイルス送達のために製剤化される、前記リボヌクレオタンパク質複合体。 - 前記組成物は、
（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
をさらに含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、請求項３２に記載の組成物。 - 前記細胞内の前記標的核酸を修飾するための方法であって、請求項３２または３３に記載の組成物を前記細胞内に導入することを含む、前記方法。
- 前記導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記細胞は、初代細胞である、請求項３２～３５に記載の方法。
- 前記初代細胞は、初代Ｔ細胞である、請求項３６に記載の方法。
- 前記方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する方法であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列に相補的である少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と
をインキュベートすることまたはインキュベートしたことを含む、前記方法。 - 前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡは、３７℃で少なくとも１７分間一緒にインキュベートされる、請求項３９に記載の方法。
- ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質のモル比は、０．２５：１～４：１である、請求項３９または４０に記載の方法。
- 前記ＲＮＰ複合体は、１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＰ複合体は、２０ｎｍ～９０ｎｍの大きさを有する、請求項４２に記載の方法。
- （ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型
を含む、組成物であって、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、前記組成物。 - 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体を形成するように構成されたドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
- 前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項４４または４５に記載の組成物。
- 前記ドナー鋳型は、５’から３’に向かって、Ｐ１ａ－Ｎ１－Ｐ２ｂ－Ｈ－Ｐ３ｃ－Ｎ２－Ｐ４ｄの配列を含み、前記配列中、
（１）Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４は、ＰＡＭ配列であり、
（２）Ｎ１は、前記第１のＣＤＬ標的配列であり、Ｎ２は、前記第２のＣＤＬ標的配列であり、
（３）Ｈは、前記ＨＤＲ鋳型であり、
（４）ａは０、ｂは１であるか、またはａは１、ｂは０であり、
（５）ｃは０、ｄは１であるか、または、ｃは１、ｄは０である、
請求項４４～４６のいずれか１項に記載の組成物。 - 細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）標的化可能ヌクレアーゼタンパク質と、
（ｂ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質または前記標的化可能ヌクレアーゼタンパク質を含む複合体によって切断可能である、
前記方法。 - 細胞の標的核酸を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結される、
前記方法。 - 細胞のゲノム標的配列を修飾するための方法であって、
前記方法は、
・前記細胞を提供することと、
・非ウイルス送達のために製剤化された組成物を前記細胞内に導入することまたは導入したことと
を含み、
前記組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、
（ｂ）ドナーガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
（ｃ）（ｉ）相同アームに挟まれた挿入のための核酸を含む相同性指向修復（ＨＤＲ）鋳型、
（ｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の５’に機能的に連結される、第１の共送達直鎖化（ＣＤＬ）標的配列、及び
（ｉｉｉ）前記ＨＤＲ鋳型の３’に機能的に連結される、第２のＣＤＬ標的配列
を含む、プラスミドドナー鋳型と
を含み、
（１）前記ドナーｇＲＮＡは、前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれに相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、（２）前記第１のＣＤＬ標的配列及び前記第２のＣＤＬ標的配列のそれぞれは、前記ＣＤＬ標的配列の３’に位置する３塩基対のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に機能的に連結され、
前記ドナーｇＲＮＡは、前記細胞の前記ゲノム標的配列に相補的な少なくとも１７個のヌクレオチドを含み、
前記相同アームは、前記細胞の前記ゲノム標的配列を挟む核酸配列に相補的であり、前記挿入のための核酸は、前記細胞の前記ゲノム標的配列に挿入されるように構成される、
前記方法。 - 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞は、免疫細胞である、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項５２に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である、請求項５３に記載の方法。
- 非ウイルス送達のために製剤化された前記組成物の前記導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の方法。
- ドナー鋳型の量は、少なくとも約８０、１０～１２０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１００、１１０、または１２０μｇである、請求項４８～５５のいずれか１項に記載の方法。
- 個々のエレクトロポレーション反応のための細胞の数は、少なくとも約５、１～１０、１、２、３、４、６、７、８、９、または１０ｅ７である、請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
- 提供される細胞の総数は、少なくとも１０ｅ７よりも大きく、１回超のエレクトロポレーション反応が実施される、請求項５７に記載の方法。
- 細胞懸濁液の総体積は、約１ｍＬである、請求項４８～５８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＤＬ標的配列を含まないがそれ以外は同一の対照組成物と比較して、前記細胞の前記ゲノム標的配列における鋳型挿入が増加し、任意で、前記対照と比較して、少なくとも約１～５、１、２、３、４、または５倍に前記鋳型挿入が増加する、請求項４８～５９のいずれか１項に記載の方法。
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