JP2018191551A - 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 - Google Patents
糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018191551A JP2018191551A JP2017097014A JP2017097014A JP2018191551A JP 2018191551 A JP2018191551 A JP 2018191551A JP 2017097014 A JP2017097014 A JP 2017097014A JP 2017097014 A JP2017097014 A JP 2017097014A JP 2018191551 A JP2018191551 A JP 2018191551A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- genome
- plasmid vector
- marker gene
- editing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 139
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 59
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 41
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 claims description 39
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- GUWSQVZFXHIGLN-UHFFFAOYSA-M 1-(4-amino-2-methylpyrimidin-5-ylmethyl)-3-(2-hydroxyethyl)-2-methylpyridinium bromide Chemical compound [Br-].NC1=NC(C)=NC=C1C[N+]1=CC=CC(CCO)=C1C GUWSQVZFXHIGLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 101150009288 amyB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 6
- 101100277447 Bacillus subtilis (strain 168) degQ gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 5
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 claims description 4
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 101150087358 melB gene Proteins 0.000 description 9
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 6
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 6
- 101150050677 melO gene Proteins 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 101150018082 U6 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150078331 ama-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 101100425074 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) thiA gene Proteins 0.000 description 3
- 240000001009 Aspergillus oryzae RIB40 Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000046038 Ehretia acuminata Species 0.000 description 3
- 235000009300 Ehretia acuminata Nutrition 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 3
- 101150060364 ptrA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 2
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 101150085005 ku70 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- DMVBWVASDWGFNH-UHFFFAOYSA-M 2-[1-[(4-amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-2-methylpyridin-1-ium-3-yl]ethanol;hydron;dibromide Chemical compound Br.[Br-].NC1=NC(C)=NC=C1C[N+]1=CC=CC(CCO)=C1C DMVBWVASDWGFNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101100101264 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) melO gene Proteins 0.000 description 1
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101710103942 Elongation factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 101150059802 KU80 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 1
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100342585 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-51 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074054 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-52 gene Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 101000619947 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) DNA repair polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 101100342589 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pku70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074057 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pku80 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150054979 ligD gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
[態様1]
糸状菌用のゲノム編集プラスミドベクターであって、
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNA、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)ネガティブ選択マーカー遺伝子、
を含む前記プラスミドベクター。
[態様2]
ポジティブ選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、態様1記載のプラスミドベクター。
[態様3]
ネガティブ選択マーカー遺伝子が転写因子をコードする遺伝子であって、該遺伝子の過剰発現によって該遺伝子を保持する形質転換体の生育が阻害される作用を有することを特徴とする、態様1又は2記載のプラスミドベクター。
[態様4]
ネガティブ選択マーカー遺伝子が誘導性プロモーターと作動可能に連結されている、態様3記載のベクター。
[態様5]
ネガティブ選択マーカー遺伝子がAoace2であり、誘導性プロモーターがamyBプロモーターである、態様4記載のベクター。
[態様6]
糸状菌が麹菌である、態様1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
[態様7]
麹菌が実用株である、態様6に記載のベクター。
[態様8]
糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法であって、
(A)態様1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAが含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法。
[態様9]
態様8に記載の糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法に於いて、一連の繰り返し工程(C)に於ける最後の工程(C−2)は実施されないことを特徴とする、前記製造方法。
[態様10]
前記繰り返し工程(C)の一連の繰り返しにおける最後の工程(C−1)に於いて、態様1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターを用いる、態様9記載の製造方法。
[態様11]
全ての工程を通じて、使用されるゲノム編集プラスミドベクターに含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子は夫々一種類である、態様8〜10のいずれか一項に記載の方法。
[態様12]
工程(A)及び工程(C−1)に於ける選択培地がピリチアミンを含む、態様8〜11のいずれか一項に記載の方法。
[態様13]
工程(B)及び工程(C−2)に於ける選択培地がデキストリンを含む、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNA、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)ネガティブ選択マーカー遺伝子。
(A)本発明のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAが含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法に係る。
即ち、該製造方法は、工程(A)→(B)→((C−1)→(C−2))n(nは1以上の整数)の順に実施される。
即ち、該製造方法は、工程(A)→(B)→((C−1)→(C−2))n →(C−1)(nは0以上の整数)の順に実施される。
1. 使用菌株、培地および形質転換
1-1使用菌株
大腸菌Escherichia coli
大腸菌組換えプラスミドの取得にはE. coli DH5α(F-, Φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK -, mK +), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1)を用いた。
麹菌Aspergillus oryzae
本発明で使用したA. oryzae菌株一覧を表1に示した。
E. coli DH5α用
LB培地: 1% Bacto tryptone、0.5% Yeast Extract、0.5% NaCl(プレート用寒天培地には2.0% Agarを含む。また必要に応じてampicillinを終濃度50 μg/mlとなるように添加した。)
形質転換体を選択するために、0.1 μg/mlのピリチアミン臭化水素酸塩を添加した。
CD(Glc)培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Glucose (pH 5.5)
CD(Dex)培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Dextrin (pH 5.5)
CD+Sorbitol培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Glucose, 1.2 M sorbitol (pH 5.5)
2-1 PCR反応
各DNA断片の増幅には、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR (TaKaRa)を用いた。また、A. oryzaeのコロニーPCRにはKOD FX Neo (TOYOBO)を用いた。反応液の組成は全て添付の説明書に従った。
98℃ 30 sec, {94℃ 15 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 1 kb/min; 30 cycle}, 16℃
KOD FX Neo温度条件
94℃ 2 min, {94℃ 15 sec, 68℃ 2 kb/min; 35 cycle}, 16℃
テンプレートには、20 μlスケールあたり50 μl TEに白金耳懸濁した溶液2 μlを用いた。
本発明で使用したプライマーは表2、プラスミドは表3に示した。
遺伝子をamyB遺伝子のプロモーター(PamyB)制御下で発現するためのベクターpUtNANは、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーpUC19-niaD3_FとniaD3-PaB_Rを用いて増幅したniaD遺伝子ORFの一部とその下流を含む1.8 kbのDNA断片、プライマーniaDd-TaB_FとpUC19nDAADnD_Rを用いて増幅したniaD遺伝子下流の1.6 kbのDNA断片、プライマーTaB-PaB_FとTaB-niaDd_Rを用いて増幅したamyB遺伝子のターミネーター(TamyB)からなる0.3 kbのDNA断片、pUNA (Wada et al., 2014)をテンプレートとしプライマーPaB-niaD3_FとPaB-TaB_Rを用いて増幅したPamyBからなる0.6 kbのDNA断片の4つのDNA断片をプライマーpUC19-niaD3_FとpUC19nDAADnD_Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit (Clontech)を用いてBamHI消化したpUC19 (TaKaRa)と連結することで作製した。
PamyB制御下でAoace2を発現するためのプラスミドpUtNAa2Nは、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーpUNA′Aoace2ORF_FとpUNA′Aoace2ORF_Rを用いて増幅したAoace2のORFからなる2.3 kbのDNA断片を、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したpUtNANと連結することで作製した。
pPTRIIをテンプレートとしプライマー19IF-ptrA-Fと19IF-mAMA1-Rを用いてPCRにより増幅したプラスミドの自律複製を可能とするA. nidulans由来のDNA断片AMA1の約半分とピリチアミン耐性遺伝子ptrAを含む5.0 kbのDNA断片をIn-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてBamHI消化したpUC19と連結し、ppAsAを作製した。次に、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーIF-Ptef1FとPtef1Rを用いて増幅したtef1遺伝子のプロモーターからなる1.3 kbのDNA断片とpUNAFNcas9 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーPtef1-FNC9FとTamyBRで増幅したcas9とamyB遺伝子のターミネーターからなる4.4 kbのDNA断片をプライマーIF-Ptef1FとTamyBRを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いて連結したDNA断片をHindIII消化したppAsAと連結することでppAsATC9を作製した。さらに、pUtNAa2NをテンプレートとしプライマーsApAIF-PamyBとace2mRを用いて増幅したPamyBとAoace2の前半を含む1.8 kbのDNA断片とプライマーace2mFとsApAIF-TamyBRを用いて増幅したAoace2の後半とTamyBを含む1.3 kbのDNA断片をプライマーsApAIF-PamyBとsApAIF-TamyBRを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9と連結することでppAsATC9a2(図1)を作製した。
ゲノム編集によってmelB遺伝子(固体培養特異的に発現するチロシナーゼ遺伝子、尚、チロシナーゼはメラニン合成に関わる酵素であり、酒粕の褐変化の原因である)に変異を導入するためのプラスミドベクターppAsATC9a2gmB(図2)は、pUNAFNC9gwA1 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーSmaIIF1-PU6FとgmB-PU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のプロモーターからなる0.6 kbのDNA断片とプライマーgmB-TU6-FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のターミネーターからなる0.2 kbのDNA断片をプライマーSmaIIF1-PU6FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9a2と連結することで作製した。
ゲノム編集によってmelO遺伝子(液体培養特異的に発現するチロシナーゼ遺伝子)に変異を導入するためのプラスミドppAsATC9a2gmO(図5)は、pUNAFNC9gwA1 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーSmaIIF1-PU6FとgmO-PU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のプロモーターからなる0.6 kbのDNA断片とプライマーgmO-TU6-FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のターミネーターからなる0.2 kbのDNA断片をプライマーSmaIIF1-PU6FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9a2と連結することで作製した。
大腸菌プラスミドDNAの調製は、アルカリSDS法により行った。
ファスマック社による受注シークエンスを行った。
大腸菌の形質転換はInoueら(Inoue et al., 1990)の方法に従った。
A. oryzaeの形質転換はプロトプラストPEG法を用い、以下のように行った。
親株を20 mlのCD(Glc) 液体培地を用いて30℃で18〜20時間振盪培養し、ミラクロス(EMD Millipore)を用いて菌体を回収した。
回収した菌体を滅菌水で洗浄後、5 ml TF Solution 1 (1% Yatalase (TaKaRa), 0.6 M (NH4)2SO4, 50 mM Maleate buffer (pH 5.5))により30℃で3時間処理してプロトプラスト化した。
ミラクロスを用いてプロトプラストを回収して5 ml TF Solution 2 (1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl2, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、遠心して沈殿を回収する。同様の操作でプロトプラストをさらに2回洗い、1.0-5.0×107個/ mlとなるようにTF Solution 2 に懸濁した。
200 μlのプロトプラスト懸濁液に数ng/μlの形質転換用DNAを10 μl加えて、氷中に30分間静置する。
500、850 μlと2回に分けてTF Solution 3 (60% PEG4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、室温で25分間静置した。
懸濁液をあらかじめ45℃で保温しておいたTop agar (1.2 M Sorbitol, 0.8% Agar入り選択培地)と混和して下層培地 (1.2 M Sorbitol, 1.5% Agar入り選択培地)に重層する。30℃で3-7日間培養して形質転換体を取得し、選択培地で2回植え継ぐことにより、形質を安定させた。
対象とするA. oryzae株の全DNAを0.6%アガロースゲルで電気泳動を行った。必要に応じて全DNAは一晩制限酵素処理することにより断片化した。その後の操作は、AlkPhos Direct Labelling and Detection system(GEヘルスケア)及びを用いて、説明書に従って行った。また、バンドの検出には、ルミノイメージアナライザーLAS-4000mini (Fujiflim)を用いた。トランスファーは一晩、メンブレンの乾熱固定は80℃で 1時間、プレハイブリダイゼーション1時間そしてハイブリダイゼーション 8時間もしくは一晩で行った。
(1)ゲノム編集ベクターの構築
条件依存的に菌体からの脱落が可能なベクターppAsATC9a2を構築した(図1)。CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集に必要とされるCas9ヌクレアーゼは、A. oryzaeの翻訳伸長因子EF-1-alphaをコードするtef1のプロモーター制御下で発現させた。Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子はA. oryzaeで発現させるためにコドンを改変した。さらに、Cas9ヌクレアーゼを核に局在させるためにcas9遺伝子の5′-、3′-両末端にシミアンウイルス40に由来する核局在シグナル(SV40NLS)をコードする配列を付加したものを用いた。また、条件依存的にプラスミドを脱落させるため、その高発現により生育が著しく悪化するAoace2遺伝子を炭素源の違いにより誘導、抑制が可能なamyBプロモーターの制御下で発現させた。さらに形質転換用の選択マーカーにはピリチアミン耐性遺伝子ptrAを用い、プラスミドの自律複製を可能とするA. nidulans由来のDNA断片AMA1の約半分をプラスミドに挿入した。
melB遺伝子に変異を導入するため、melB遺伝子のコード領域内から21塩基の標的配列(配列番号1:GCATGGACACGACAATACCCA)を選択し、この配列にCas9ヌクレアーゼを標的配列に誘導するためのガイドRNAを、核内低分子RNAをコードするU6遺伝子のプロモーターとターミネーターの制御下で発現するゲノム編集プラスミドベクターppAsATC9a2gmBを設計した(図2)。
A. oryzae RIB128株にppAsATC9a2gmBを形質転換によって導入した。得られた形質転換体を、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地で2回植え継ぐことによって形質を安定させた。コロニーPCRによって標的配列を含むDNA断片を増幅し、シークエンス解析することによって、得られた形質転換体2株のいずれのmelB遺伝子にも変異(塩基配列の欠損)が確認された。更に、それら変異株の一つについてはmelB遺伝子中に22塩基の欠損を持つ株(RIB128mBC9)であることを確認した(図3)。
RIB128mBC9株をCD(Dex)培地で培養することでAoace2の発現を誘導し、ppAsATC9a2gmBが脱落した株を選択した。CD(Dex)培地での培養は植え継ぎにより2回行った。CD(Dex)培地で生育した株を単離し、RIB128mBと命名した。RIB128mB株ではRIB128mBC9株の持つmelB遺伝子内の変異が保持されていることもシークエンス解析によって確認された(図3)。RIB128mB株ではサザン解析によりプラスミド由来のDNA断片のバンドが検出されないこと(図4b)、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地では生育できないことを確認した(図4c)。これらの結果から、RIB128mB株ではゲノム編集プラスミドベクターppAsATC9a2mBが脱落していることが示された。
melO遺伝子に変異を導入するため、melO遺伝子のコード領域内から21塩基の標的配列(配列番号2:GATTCAAGACCCCGCGAGAAC)を選択し、この配列にCas9ヌクレアーゼを標的配列に誘導するためのガイドRNAをU6プロモーターとターミネーターの制御下で発現するゲノム編集プラスミドppAsATC9a2gmOを設計した(図5)。
RIB128mB株にppAsATC9a2gmOを形質転換によって導入した。得られた形質転換体を、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地で2回植え継ぐことによって形質を安定させた。コロニーPCRによって標的配列を含むDNA断片を増幅し、シークエンス解析することによって、得られた形質転換体6株のいずれのmelO遺伝子にも変異(塩基配列の欠損)確認された。更に、それら変異株の一つがmelO遺伝子中に2塩基の欠損を持つ株(RIB128mBmOC9)であることを確認した(図6)。又、RIB128mBmOC9株はmelB遺伝子内の変異も保持されている多重変異株であることもシークエンス解析によって確認された(図3)。
Arazoe T, Miyoshi K, Yamato T, Ogawa T, Ohsato S, Arie T, & Kuwata S (2015) Tailor-made CRISPR/Cas system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnol Bioeng 112: 2543-2549
Barbesgaard P, Heldt-Hansen HP, & Diderichsen B (1992) On the safety of Aspergillus oryzae: a review. Appl Microbiol Biotechnol 36: 569-572
Doudna JA & Charpentier E (2014) The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346: 1258096-1-1258096-9
Escano CS, Juvvadi PR, Jin FJ, Takahashi T, Koyama Y, Yamashita S, Maruyama J, & Kitamoto K (2009) Disruption of the Aopex11-1 gene involved in peroxisome proliferation leads to impaired Woronin body formation in Aspergillus oryzae. Eukaryot Cell 8: 296-305
Fuller KK, Chen S, Loros JJ, & Dunlap JC (2015) Development of the CRISPR/Cas9 System for Targeted Gene Disruption in Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell 14: 1073-1080
Gomi K, Iimura Y, & Hara S (1987) Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene. Agric Biol Chem 51: 2549-2555
Inoue H, Nojima H, & Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28
Ito K, Asakura T, Morita Y, Nakajima K, Koizumi A, Shimizu-Ibuka A, Masuda K, Ishiguro M, Terada T, Maruyama J, Kitamoto K, Misaka T, & Abe K (2007) Microbial production of sensory-active miraculin. Biochem Biophys Res Commun 360: 407-411
Jin FJ, Maruyama J, Juvvadi PR, Arioka M, Kitamoto K (2004) Development of a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB gene disruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillus oryzae. FEMS Microbiol Lett 239: 79-85
Katayama T, Tanaka Y, Okabe T, Nakamura H, Fujii W, Kitamoto K, & Maruyama J (2016) Development of a genome editing technique using the CRISPR/Cas9 system in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae. Biotechnol Lett 38: 637-642
Kitamoto K (2002) Molecular biology of the Koji molds. Adv Appl Microbiol 51: 129-153
Kubodera T, Yamashita N, & Nishimura A (2000) Pyrithiamine resistance gene (ptrA) of Aspergillus oryzae: cloning, characterization and application as a dominant selectable marker for transformation. Biosci Biotechnol Biochem 64: 1416-1421
Liu Q, Gao R, Li J, Lin L, Zhao J, Sun W, & Tian C (2017) Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnol Biofuels 10:1
Liu R, Chen L, Jiang Y, Zhou Z, & Zou G (2015) Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discov 1: 15007
Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Arima T, Akita O, Kashiwagi Y, Abe K, Gomi K, Horiuchi H, Kitamoto K, Kobayashi T, Takeuchi M, DenningDW, Galagan JE, Nierman WC, Yu J et al. (2005) Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. Nature 438: 1157-1161
Maruyama J & Kitamoto K (2008) Multiple gene disruptions by marker recycling with highly efficient gene-targeting background (DeltaligD) in Aspergillus oryzae. Biotechnol Lett 30: 1811-1817
Mattern IE, Unkles S, Kinghorn JR, Pouwels PH, & van den Hondel CA (1987) Transformation of Aspergillus oryzae using the A. niger pyrG gene. Mol Gen Genet 210: 460-461
Mizutani O, Kudo Y, Saito A, Matsuura T, Inoue H, Abe K, & Gomi K (2008) A defect of LigD (human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fungal Genet Biol 45: 878-889
Nakajima K, Asakura T, Maruyama J, Morita Y, Oike H, Shimizu-Ibuka A, Misaka T, Sorimachi H, Arai S, Kitamoto K, & Abe K (2006) Extracellular production of neoculin, a sweet-tasting heterodimeric protein with taste-modifying activity, by Aspergillus oryzae. Appl Environ Microbiol 72: 3716-3723
Nodvig CS, Nielsen JB, Kogle ME, & Mortensen UH (2015) A CRISPR-Cas9 System for Genetic Engineering of Filamentous Fungi. PLoS One 10: e0133085
Pohl C, Kiel JA, Driessen AJ, Bovenberg RA, & Nygard Y (2016) CRISPR/Cas9 Based Genome Editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synth Biol 15: 754-764
Takahashi T, Masuda T, & Koyama Y (2006) Enhanced gene targeting frequency in ku70 and ku80 disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae. Mol Genet Genomics 275: 460-470
Tsuchiya K, Nagashima T, Yamamoto Y, Gomi K, Kitamoto K, Kumagai C, & Tamura G (1994) High level secretion of calf chymosin using a glucoamylase-prochymosin fusion gene in Aspergillus oryzae. Biosci Biotechnol Biochem 58: 895-899
Tsuchiya K, Tada S, Gomi K, Kitamoto K, Kumagai C, Jigami Y, & Tamura G (1992) High level expression of the synthetic human lysozyme gene in Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 38: 109-114
Ul Ain Q, Chung JY, & Kim YH (2015) Current and future delivery systems for engineered nucleases: ZFN, TALEN and RGEN. J Control Release 205: 120-127
Wada R, Jin FJ, Koyama Y, Maruyama J, & Kitamoto K (2014) Efficient formation of heterokaryotic sclerotia in the filamentous fungus Aspergillus oryzae. Appl Microbiol Biotechnol 98: 325-334
Yamada O, Lee BR, & Gomi K (1997) Transformation system for Aspergillus oryzae with double auxotrophic mutations, niaD and sC. Biosci Biotechnol Biochem 61: 1367-1368
Claims (13)
- 糸状菌用のゲノム編集プラスミドベクターであって、
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNA、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)ネガティブ選択マーカー遺伝子、
を含む前記プラスミドベクター。 - ポジティブ選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項1記載のプラスミドベクター。
- ネガティブ選択マーカー遺伝子が転写因子をコードする遺伝子であって、該遺伝子の過剰発現によって該遺伝子を保持する形質転換体の生育が阻害される作用を有することを特徴とする、請求項1又は2記載のプラスミドベクター。
- ネガティブ選択マーカー遺伝子が誘導性プロモーターと作動可能に連結されている、請求項3記載のベクター。
- ネガティブ選択マーカー遺伝子がAoace2であり、誘導性プロモーターがamyBプロモーターである、請求項4記載のベクター。
- 糸状菌が麹菌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
- 麹菌が実用株である、請求項6に記載のベクター。
- 糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法であって、
(A)請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAが含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法。 - 請求項8に記載の糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法に於いて、一連の繰り返し工程(C)に於ける最後の工程(C−2)は実施されないことを特徴とする、前記製造方法。
- 前記繰り返し工程(C)の一連の繰り返しにおける最後の工程(C−1)に於いて、請求項1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターを用いる、請求項9記載の製造方法。
- 全ての工程を通じて、使用されるゲノム編集プラスミドベクターに含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子は夫々一種類である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(A)及び工程(C−1)に於ける選択培地がピリチアミンを含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(B)及び工程(C−2)に於ける選択培地がデキストリンを含む、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017097014A JP6944697B2 (ja) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017097014A JP6944697B2 (ja) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018191551A true JP2018191551A (ja) | 2018-12-06 |
JP6944697B2 JP6944697B2 (ja) | 2021-10-06 |
Family
ID=64568727
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017097014A Active JP6944697B2 (ja) | 2017-05-16 | 2017-05-16 | 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6944697B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110592073A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-20 | 江西科技师范大学 | 一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017500038A (ja) * | 2013-12-19 | 2017-01-05 | アミリス, インコーポレイテッド | ゲノム組込みのための方法 |
-
2017
- 2017-05-16 JP JP2017097014A patent/JP6944697B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017500038A (ja) * | 2013-12-19 | 2017-01-05 | アミリス, インコーポレイテッド | ゲノム組込みのための方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
KATAYAMA, T. ET AL.: ""Development of a genome editing technique using the CRISPR/Cas9 system in the industrial filamentou", BIOTECHNOL. LETT., vol. 38, JPN6021017513, 2016, pages 637 - 642, ISSN: 0004566338 * |
NAKAMURA, H. ET AL.: ""Highly efficient gene targeting in Aspergillus oryzae industrial strains under ligD mutation introd", J. GEN. APPL. MICROBIOL., vol. 63, JPN6021017518, 2 May 2017 (2017-05-02), pages 172 - 178, ISSN: 0004566341 * |
中村英淳 ほか: ""麹菌Aspergillus oryzaeの菌核形成に関与する転写因子の探索と解析"", 日本生物工学会大会講演要旨集, vol. p. 89, JPN6021017516, 2015, pages 1 - 004, ISSN: 0004566340 * |
五味勝也: ""清酒用麹菌の遺伝子操作技術"", 醸協, vol. 95, JPN6021017520, 2000, pages 494 - 502, ISSN: 0004566339 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110592073A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-20 | 江西科技师范大学 | 一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6944697B2 (ja) | 2021-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Juergens et al. | Genome editing in Kluyveromyces and Ogataea yeasts using a broad-host-range Cas9/gRNA co-expression plasmid | |
Niu et al. | Expanding the potential of CRISPR-Cpf1-based genome editing technology in the cyanobacterium Anabaena PCC 7120 | |
US10351877B2 (en) | CRISPR enabled multiplexed genome engineering | |
Liang et al. | A CRISPR/Cas9-based genome editing system for Rhodococcus ruber TH | |
Peterbauer et al. | Food‐grade gene expression in lactic acid bacteria | |
CN105695485B (zh) | 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用 | |
Cassier-Chauvat et al. | Comparative genomics of DNA recombination and repair in cyanobacteria: biotechnological implications | |
Choi et al. | Genetic tools for select-agent-compliant manipulation of Burkholderia pseudomallei | |
EP3199632A1 (en) | Temperature-inducible crispr/cas system | |
CN109072207A (zh) | 用于修饰靶核酸的改进方法 | |
CN102703424B (zh) | 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 | |
JP6473510B2 (ja) | ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターおよびその利用 | |
Zhang et al. | Efficient gene deletion and replacement in Aspergillus niger by modified in vivo CRISPR/Cas9 systems | |
WO2019185751A1 (en) | Inhibitors of crispr-cas associated activity | |
JP2019500036A (ja) | 原核生物におけるdna末端修復経路の再構築 | |
Katayama et al. | CRISPR/Cpf1-mediated mutagenesis and gene deletion in industrial filamentous fungi Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae | |
Son et al. | Development of a high-copy plasmid for enhanced production of recombinant proteins in Leuconostoc citreum | |
Rothstein et al. | Towards high-throughput genome engineering in lactic acid bacteria | |
JP6944697B2 (ja) | 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 | |
Yoshioka et al. | Rapid and marker-free gene replacement in citric acid-producing Aspergillus tubingensis (A. niger) WU-2223L by the CRISPR/Cas9 system-based genome editing technique using DNA fragments encoding sgRNAs | |
KR101765255B1 (ko) | rnpA 유전자 발현감소를 통한 재조합단백질의 제조방법 | |
Nan et al. | In vitro CRISPR/Cas9 system for genome editing of Aspergillus niger based on removable bidirectional selection marker AmdS | |
Srinivas et al. | Escherichia coli vectors having stringently repressible replication origins allow a streamlining of Crispr/Cas9 gene editing | |
Papagianni et al. | Cloning and functional expression of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) of Aspergillus niger in Lactococcus lactis and its induction by oxidizing conditions | |
Bott et al. | Novel technologies for optimal strain breeding |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20170531 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200407 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210518 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210703 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210810 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210811 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210831 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210906 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6944697 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |