JP6515502B2 - 形質転換体の製造方法、形質転換体、および単座組込み用ベクターキット - Google Patents

Description

本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（以下、Ｓ．ポンベともいう）の染色体中の特定の遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むことにより形質転換体を製造する方法、該方法により製造された形質転換体、およびＳ．ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットに関する。

Ｓ．ポンベをはじめとするシゾサッカロミセス属酵母は、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造、ゲノム複製機構、ＲＮＡスプライシング機構、転写機構、翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物のモデルとして広く用いられている（非特許文献１参照）。特にＳ．ポンベはその様々な特徴から、より高等動物細胞に近い単細胞真核生物であると位置づけられ、外来遺伝子、特に高等動物由来遺伝子の発現用宿主として非常に有用な酵母であると考えられる。特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている。

相同組換えを利用して外来遺伝子を染色体に組込むことにより、該外来遺伝子を安定的に発現する形質転換体を製造できる。一般的に、Ｓ．ポンベを宿主とする場合には、ｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍を標的部位とする相同組換えにより外来遺伝子が挿入されている。その他、特許文献１では、Ｓ．ポンベにマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子等の外来遺伝子を組込んで３−ヒドロキシプロピオン酸を発酵産生させる酵母を製造しており、その際に外来遺伝子を、Ｓ．ポンベのｇｐｄ１遺伝子座に組込んでいる。

国際公開第２０１３／１３７２７７号

Giga-Hama and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verlag, (1997).

相同組換えを利用して染色体に外来遺伝子をコードするＤＮＡ断片を挿入する場合、組込むＤＮＡ断片が長くなりすぎると相同組換えの効率が低下し、かつ組込まれたＤＮＡ断片が脱落するおそれがある。特に、同種のプロモーターやターミネーターを用いた２以上の発現カセットを含むＤＮＡ断片を組込んだ場合には、該ＤＮＡ断片中のプロモーター同士またはターミネーター同士で相同組換えが生じ、いずれかの発現カセットが脱落しやすい。

このため、一般的には、一の標的部位に一の発現カセットを組込む。したがって、一の宿主細胞に多数の外来遺伝子を導入するためには、染色体中に外来遺伝子を組込むことが可能な箇所が多数存在することが好ましい。

一方で、染色体に外来遺伝子を組込んだ場合、細胞の生存性や増殖性が損なわれたり、外来遺伝子が充分に発現しない場合がある。このため、外来遺伝子を安定的に発現させ得る形質転換体を製造するためには、外来遺伝子の挿入によって細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれず、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現可能な領域を標的として外来遺伝子を組込む必要がある。

そこで本発明の目的は、Ｓ．ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に相同組換えを利用して外来遺伝子を組込む形質転換体の製造方法、該製造方法により製造された形質転換体、および、該遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットを提供することにある。

本発明に係る形質転換体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むことが好ましい。
該形質転換体の製造方法としては、さらに、染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される１以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする。
また、該形質転換体の製造方法において、染色体中に複数の外来遺伝子を組込み、該複数の外来遺伝子が、互いに同種のプロモーターによって支配されていることが好ましい。

本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍に、外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする。
該形質転換体としては、さらに、染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される１以上に、外来遺伝子が組み込まれていることが好ましい。
該形質転換体としては、染色体中に複数の外来遺伝子が組込まれており、該複数の外来遺伝子が、互いに同種のプロモーターによって支配されていることが好ましい。

本発明に係る単座組込み用ベクターキットは、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクターを含むことを特徴とする。
該単座組込み用ベクターキットとしては、さらに、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｌｅｕ１遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される１種以上のベクターを含むことが好ましい。
また、該単座組込み用ベクターキットに含まれる２以上のベクター中のシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターが、互いに同種のプロモーターであることが好ましい。

本発明において外来遺伝子の組込みに用いられるＳ．ポンベの染色体中の１１個の遺伝子組込み座は、外来遺伝子の挿入によって細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれず、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現し得る。このため、本発明は、特に、Ｓ．ポンベに安定的に複数の外来遺伝子を発現させるための形質転換体の製造に好適である。

図１は、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクターｐＳＥの構造の模式図である。 図２は、ｇｐｍ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＭの構造の模式図である。 図３は、ｅｎｏ１０１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮの構造の模式図である。 図４は、ｇｐｄ３遺伝子座組込み用ベクターｐＳＤの構造の模式図である。 図５は、ｈｈｔ２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＨの構造の模式図である。 図６は、ｕｂｉ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵｂの構造の模式図である。 図７は、ｕｒａ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵの構造の模式図である。 図８は、クローニングベクターｐＳＸｘｘの構造の模式図である。 図９は、ｅｎｏ１０２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮ２の構造の模式図である。 図１０は、ｆｂａ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＦの構造の模式図である。 図１１は、ｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＧの構造の模式図である。 図１２は、ｐｇｋ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＰの構造の模式図である。 図１３は、ｔｐｉ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＴの構造の模式図である。 図１４は、実施例２において、各形質転換体の相対ＧＦＰ／ＯＤ_６６０（ＳＬ−ＥＧＦＰ株のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図１５は、実施例３において、各形質転換体のＥＧＦＰの相対分泌量（ＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ株のＥＧＦＰ分泌量を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図１６は、実施例４において、各形質転換体のＤ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））の（ＳＬ−ＤＬＤＨ株のＤ−乳酸生産速度を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図１７は、実施例５において、各形質転換体のＬ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））の（ＳＬ−ＬＬＤＨ株のＬ−乳酸生産速度を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図１８は、実施例６において、各形質転換体の変異型ｈＴＦの相対分泌量（ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株の変異型ｈＴＦ分泌量を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図１９は、実施例６において、各形質転換体の変異型ｈＴＦ遺伝子の相対ｍＲＮＡ転写量（ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株の変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写量を１とした場合の相対値）の算出結果を示した図である。 図２０は、単座組込み用ベクターｐＳＬｈの構造の模式図である。 図２１は、単座組込型組換えベクターｐＳＭｈの構造の模式図である。 図２２は、野生株のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図２３は、ＡＳＰ４９６４株（Δｐｄｃ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時的変化を示した図である。 図２４は、ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターの構造の模式図である。 図２５は、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターの構造の模式図である。

本発明に係る形質転換体の製造方法は、Ｓ．ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０２遺伝子座およびその近傍、ｆｂａ１遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍、ｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍、ｐｇｋ１遺伝子座およびその近傍、ｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍、ｕｂｉ４遺伝子座およびその近傍、ならびにｕｒａ４遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される１以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする。ｅｆ１ａ−ａ遺伝子等の１１個の遺伝子は、いずれも発現量の高い遺伝子である。該１１個の遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むことにより、細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれることなく、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現できる形質転換体を製造できる。本発明に係る形質転換体の製造方法において外来遺伝子を組込む遺伝子組込み座としては、形質転換効率が比較的高いことから、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍、ｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍、ｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍、またはｕｒａ４遺伝子座およびその近傍が好ましく、外来遺伝子の発現効率が高い形質転換体が得られやすいことから、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍、ｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍、またはｕｒａ４遺伝子座およびその近傍がより好ましい。

＜宿主＞
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法（Nucleic Acids Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR Methods Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。

さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、ｕｒａ４遺伝子が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。

＜遺伝子組込み座＞
本発明および本願明細書において、「Ｘ遺伝子座」は、染色体中のＸ遺伝子の転写領域を意味する。また、「Ｘ遺伝子座およびその近傍」とは、染色体中のＸ遺伝子のＯＲＦの上流端（すなわち、開始コドンの１文字目の塩基）から上流１０ｋｂｐ（１００００ｂｐ）から、該ＯＲＦの下流端（すなわち、終止コドンの３文字目の塩基）から下流１０ｋｂｐまでの範囲内である領域を意味する。

なお、「ＯＲＦの上流端から上流Ｙｂｐ」とは、ＯＲＦの上流側の塩基であって、開始コドンの１文字目（Ａ）から数えてＹ塩基目の塩基を意味し、「ＯＲＦの上流Ｙｂｐ」と略することがある。また、「ＯＲＦの下流端から下流Ｚｂｐ」とは、ＯＲＦの下流側の塩基であって、終止コドンの３文字目から数えてＺ塩基目の塩基を意味し、「ＯＲＦの下流Ｚｂｐ」と略することがある。

本発明に係る形質転換体の製造方法では、外来遺伝子を含むＤＮＡ断片（組換え用ＤＮＡ断片）を宿主とするＳ．ポンベに導入し、該ＤＮＡ断片と染色体との間で相同組換えを起こすことにより、該ＤＮＡ断片を染色体中に組込むことにより行う。「Ｘ遺伝子座およびその近傍」に外来遺伝子を組込む場合、該ＤＮＡ断片と相同組換えを起こすための染色体中の標的部位のうち、染色体中の位置が上流側のもの（上流側標的部位）と染色体中の位置が下流側のもの（下流側標的部位）は、染色体中で隣接していてもよく、離れていてもよい。標的部位の設定は、相同組換えによる遺伝子導入技術において公知の手法により適宜行うことができる。また、上流側標的部位と下流側標的部位は、両標的部位で挟まれた領域に、Ｘ遺伝子座のみを含んでいてもよく、Ｘ遺伝子座に隣接する他の遺伝子座の一部又は全部を含んでいてもよい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｅｎｏ１０２遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｅｎｏ１０２遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの下流端から該ＯＲＦの下流７ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｆｂａ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｆｂａ１遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｇｐｄ３遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｇｐｍ１遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｈｈｔ２遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｐｇｋ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｐｇｋ１遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｔｐｉ１遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｕｂｉ４遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｕｂｉ４遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流端から該ＯＲＦの下流２ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましい。

Ｓ．ポンベの染色体中のｕｒａ４遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のｕｒａ４遺伝子のＯＲＦの上流１０ｋｂｐから該ＯＲＦの下流１０ｋｂｐまでの範囲内に設計され、該ＯＲＦの上流５ｋｂｐから該ＯＲＦの下流５ｋｂｐまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ＯＲＦの上流３ｋｂから該ＯＲＦの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

＜組換え用ＤＮＡ断片＞
本発明に係る形質転換体の製造方法においては、外来遺伝子を含む組換え用ＤＮＡ断片を宿主とするＳ．ポンベに導入し、染色体と相同組換えさせる。該組換え用ＤＮＡ断片の両端には、Ｓ．ポンベの染色体中の遺伝子組込み座に設定した標的部位と相同組換えを起こすための組換え部位を設ける。該組換え用ＤＮＡ断片の一方の端には、染色体中の上流側標的部位との組換え部位（上流側組換え部位）を設け、該組換え用ＤＮＡ断片の他方の端には、染色体中の下流側標的部位との組換え部位（下流側組換え部位）を設ける。

該組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。

上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さ（塩基数）は、それぞれ、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、組換え用ＤＮＡ断片が長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さは、１００ｂｐ以上であることがより好ましく、３００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さは、１５００ｂｐ以下であることがより好ましく、８００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。

＜発現カセット＞
外来遺伝子が蛋白質をコードする構造遺伝子の場合には、該組換え用ＤＮＡ断片は、外来遺伝子を発現させるための発現カセットを含む。発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明において用いられる発現カセットは、外来遺伝子と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。１の発現カセットには、１の外来遺伝子が存在していてもよく、複数の外来遺伝子が存在していてもよく、１または複数の外来遺伝子と、栄養要求性相補マーカー遺伝子（たとえば、ｌｅｕ１遺伝子）や選抜マーカー遺伝子とが存在していてもよい。

発現カセットに含める外来遺伝子の遺伝子配列としては、天然型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよく、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、天然型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。

Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターまたはターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはターミネーターや、Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターまたはターミネーター（ウイルス由来のプロモーターまたはターミネーター等）を使用できる。なお、プロモーターまたはターミネーターは、Ｓ．ポンベの染色体に組込まれる組換え用ＤＮＡ断片中に２種以上存在していてもよい。

Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）等が挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。

＜ベクター＞
該組換え用ＤＮＡ断片は、ベクターに組込んだ状態でＳ．ポンベに導入できる。該ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該組換え用ＤＮＡ断片を組込むことにより製造できる。該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。

該ベクターが通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造であり、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入する場合には、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。

該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、栄養要求性相補マーカーである、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。

該ベクターは、前記組換え用ＤＮＡ断片以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組込む際には除去されることが好ましい。

ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組込む際に、その組込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。

＜形質転換方法＞
Ｓ．ポンベ宿主に該組換え用ＤＮＡ断片または該単座組込み用ベクターを導入して相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法等の従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。

形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、該外来遺伝子が構造遺伝子の場合には、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における該外来遺伝子がコードする蛋白質の発現量を調べ、該蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組込まれるベクターの数は組込み条件等を調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組込み効率や組込み数も変化すると考えられる。

＜複数の外来遺伝子を導入した形質転換体の製造＞
本発明に係る形質転換体の製造方法では、一のＳ．ポンベ宿主に、１種類の外来遺伝子を組込んでもよく、複数種類の外来遺伝子を組込んでもよい。複数種類の外来遺伝子を組込む際には、外来遺伝子ごとに染色体中の異なる遺伝子組込み座に組込める。これにより、組み込んだ発現カセットが脱落する危険性を抑えつつ、同種のプロモーターで制御された外来遺伝子を複数個染色体に組込んだ形質転換体を製造できる。

また、本発明に係る形質転換体の製造方法では、前記の１１個の遺伝子組込み座のうちの１以上に加えて、１または複数の公知の遺伝子組込み座にも外来遺伝子が組込まれた形質転換体を製造してもよい。該の公知の遺伝子組込み座としては、Ｓ．ポンベの染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍が挙げられる。

本発明に係る形質転換体の製造方法においては、複数の遺伝子組込み座に、同種の外来遺伝子を組込んでもよい。たとえば、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０２遺伝子座およびその近傍、ｆｂａ１遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍、ｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍、ｐｇｋ１遺伝子座およびその近傍、ｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍、ｕｂｉ４遺伝子座およびその近傍、ｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ｕｒａ４遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍の合計１３の遺伝子組込み座の中から適宜選択して同一の発現カセットを組込むことにより、１〜１３の間でコピー数を制御した形質転換体を製造できる。

＜形質転換体の培養方法＞
本発明に係る形質転換体の製造方法により製造された形質転換体は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養できる。
該形質転換体の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。

炭素源としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
具体的には、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor LabolatoryPress(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Okazaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）等を使用できる。

培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。

＜組込み用ベクター＞
特定の遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込んだ形質転換体を製造するために用いられる、外来遺伝子を含む組換え用ＤＮＡ断片を組込んだベクターは、Ｓ．ポンベの染色体中の標的部位（標的の遺伝子座およびその近傍の部位）と相同組換えを行わせる組換え部位と、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトとを有する組込み用ベクターに、外来遺伝子を組込むことにより容易に製造できる。該組込み用ベクターとしては、該組換え部位と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターと、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトと、Ｓ．ポンベ内で機能し得るターミネーターとを有するものが好ましい。該ベクター、該プロモーター、該ターミネーター、該組換え部位としては、前記と同様のものが挙げられる。

該組込み用ベクターが備えるクローニングサイトは、組込み用ベクター中、該クローニングサイトにのみ存在する制限酵素部位である。該組込み用ベクターが備えるクローニングサイトは制限酵素部位を１のみ有していてもよく、２以上の制限酵素部位を有するマルチクローニングサイトであってもよい。該マルチクローニングサイトとしては、公知のクローニングベクターや組込み用ベクターが備えるマルチクローニングサイトをそのまま使用でき、また、公知のマルチクローニングサイトを適宜改変したものを使用できる。その他、該組込み用ベクターは、クローニングサイト内の下流端側領域、若しくは該クローニングサイトの下流に、終始コドンを備えていてもよい。

該組込み用ベクターのうち、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクターといい、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｅｎｏ１０１遺伝子座組込み用ベクターといい、ｅｎｏ１０２遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｅｎｏ１０２遺伝子座組込み用ベクターといい、ｆｂａ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｆｂａ１遺伝子座組込み用ベクターといい、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｇｐｄ３遺伝子座組込み用ベクターといい、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｇｐｍ１遺伝子座組込み用ベクターといい、ｈｈｔ２遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｈｈｔ２遺伝子座組込み用ベクターといい、ｐｇｋ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｐｇｋ１遺伝子座組込み用ベクターといい、ｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｔｐｉ１遺伝子座組込み用ベクターといい、ｕｂｉ４遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｕｂｉ４遺伝子座組込み用ベクターといい、ｕｒａ４遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをｕｒａ４遺伝子座組込み用ベクターという。

本発明に係る単座組込み用ベクターキットは、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクター、ｅｎｏ１０１遺伝子座組込み用ベクター、ｅｎｏ１０２遺伝子座組込み用ベクター、ｆｂａ１遺伝子座組込み用ベクター、ｇｐｄ３遺伝子座組込み用ベクター、ｇｐｍ１遺伝子座組込み用ベクター、ｈｈｔ２遺伝子座組込み用ベクター、ｐｇｋ１遺伝子座組込み用ベクター、ｔｐｉ１遺伝子座組込み用ベクター、ｕｂｉ４遺伝子座組込み用ベクター、およびｕｒａ４遺伝子座組込み用ベクターからなる群より選択される１種以上のベクターを含む。該単座組込み用ベクターキットを用いることにより、Ｓ．ポンベの染色体の複数個所に外来遺伝子が組込まれた形質転換体の製造が容易になる。該単座組込み用ベクターキットには、さらに、ｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むためのｌｅｕ１遺伝子座組込み用ベクター、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むためのｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターからなる群より選択される１種以上のベクターを含んでいてもよい。

本発明に係る単座組込み用ベクターキットが２以上の組込み用ベクターを含む場合、該単座組込み用ベクターキットに含まれる２以上の組込み用ベクターが、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとして同種のプロモーターを有することが好ましい。該単座組込み用ベクターキットを用いることによって、Ｓ．ポンベに同種のプロモーターにより制御された複数の外来遺伝子を組込んだ形質転換体を製造できる。

ｌｅｕ１遺伝子座組込み用ベクターおよびｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターとしては、それぞれの遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む際に従来使用されている標的部位に対して相同組換えが起こるように設計したものを用いることができる。

以下、実施例等を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。

［実施例１］
新規なＳ．ポンベ染色体単座組込みベクターｐＳＥ、ｐＳＭ、ｐＳＮ、ｐＳＤ、ｐＳＨ、ｐＳＵｂ、ｐＳＵ、ｐＳＮ２、ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰ、およびｐＳＴを製造した。

＜ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクターｐＳＥの製造＞
Ｓ．ポンベの染色体中の上流側標的部位と相同組換えを行う上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、Ｓ．ポンベ由来ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、およびＳ．ポンベの染色体中の下流側標的部位と相同組換えを行う下流側組換え部位を備えるｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクターｐＳＥベクター（７１８０ｂｐ、配列番号１）を製造した。図１に、ｐＳＥベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図１中、「ｅｆ１ｕｐ」）は、ｆ１ａ−ａ遺伝子の開始コドン１文字目より１０４８ｂｐから１４４７ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図１中、「ｅｆ１ｄｗ」）は、ｆ１ａ−ａ遺伝子のＯＲＦの下流４４ｂｐから４８２ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

ｐＳＥベクターは、大腸菌内での増殖・維持に必要となるｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子配列を有するｏｒｉ−Ａｍｐ含有ＤＮＡ断片（３６２０ｂｐ、配列番号２）と、Ｓ．ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座に組込まれるｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片（３５９９ｂｐ、配列番号３）とをライゲーション反応により連結することにより製造できる。ｏｒｉ−Ａｍｐ含有ＤＮＡ断片とｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片は、それぞれＤＮＡ合成によりＤＮＡ断片として製造できる。

具体的には、ｏｒｉ−Ａｍｐ含有ＤＮＡ断片を制限酵素ＰｍｅＩで消化した後に、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔ（ＣＩＡＰ）により脱リン酸化を行い、ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片を制限酵素ＰｍｅＩで消化し、両者をライゲーション反応により連結することにより、ｐＳＥベクターが製造できる。

＜ｇｐｍ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＭの製造＞
ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片に代えて、ｐＳＭ導入部位含有ＤＮＡ断片（３５８２ｂｐ、配列番号４）を用いた以外はｐＳＥベクターの製造と同様にして、ｇｐｍ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＭ（７１６２ｂｐ、配列番号５）を製造できる。図２に、ｐＳＭベクターの構造を示す。
ｐＳＭ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図２中、「ｇｐｍ１ｕｐ」）は、ｇｐｍ１遺伝子の開始コドン１文字目より５３５ｂｐから９３８ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図２中、「ｇｐｍ１ｄｗ」）は、ｇｐｍ１遺伝子のＯＲＦの下流２８２ｂｐから７００ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

＜ｅｎｏ１０１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮの製造＞
ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片に代えて、ｐＳＮ導入部位含有ＤＮＡ断片（３５７１ｂｐ、配列番号６）を用いた以外はｐＳＥベクターの製造と同様にして、ｅｎｏ１０１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮ（７１５１ｂｐ、配列番号７）を製造できる。図３に、ｐＳＮベクターの構造を示す。
ｐＳＮ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図３中、「ｅｎｏ１０１ｕｐ」）は、ｅｎｏ１０１遺伝子の開始コドン１文字目より１２２１ｂｐから１６２０ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図３中、「ｅｎｏ１０１ｄｗ」）は、ｅｎｏ１０１遺伝子のＯＲＦの下流２８２ｂｐから６８８ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

＜ｇｐｄ３遺伝子座組込み用ベクターｐＳＤの製造＞
ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片に代えて、ｐＳＤ導入部位含有ＤＮＡ断片（３５８８ｂｐ、配列番号８）を用いた以外はｐＳＥベクターの製造と同様にして、ｇｐｄ３遺伝子座組込み用ベクターｐＳＤ（７１６８ｂｐ、配列番号９）を製造できる。図４に、ｐＳＤベクターの構造を示す。
ｐＳＤ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図４中、「ｇｐｄ３ｕｐ」）は、ｇｐｄ３遺伝子の開始コドン１文字目より８０７ｂｐから１２０８ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図４中、「ｇｐｄ３ｄｗ」）は、ｇｐｄ３遺伝子のＯＲＦの下流１８１ｂｐから６０６ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

＜ｈｈｔ２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＨの製造＞
ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片に代えて、ｐＳＨ導入部位含有ＤＮＡ断片（３５９６ｂｐ、配列番号１０）を用いた以外はｐＳＥベクターの製造と同様にして、ｈｈｔ２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＨ（７１７７ｂｐ、配列番号１１）を製造できる。図５に、ｐＳＨベクターの構造を示す。
ｐＳＨ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図５中、「ｈｈｔ２ｕｐ」）は、ｈｈｔ２遺伝子の開始コドン１文字目より３２７ｂｐから７４６ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図５中、「ｈｈｔ２ｄｗ」）は、ｈｈｔ２遺伝子のＯＲＦの下流３１７ｂｐから７３０ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

＜ｕｂｉ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵｂの製造＞
ｐＳＥ導入部位含有ＤＮＡ断片に代えて、ｐＳＵｂ導入部位含有ＤＮＡ断片（３６０８ｂｐ、配列番号１２）を用いた以外はｐＳＥベクターの製造と同様にして、ｕｂｉ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵｂ（７１８８ｂｐ、配列番号１３）を製造できる。図６に、ｐＳＵｂベクターの構造を示す。
ｐＳＵｂ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図６中、「ｕｂｉ４ｕｐ」）は、ｕｂｉ４遺伝子の開始コドン１文字目より９３１ｂｐから１３５５ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図６中、「ｕｂｉ４ｄｗ」）は、ｕｂｉ４遺伝子のＯＲＦの下流１８８ｂｐから６０５ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

＜ｕｒａ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵの製造＞
大腸菌内での増殖・維持に必要となるｏｒｉおよびカナマイシン耐性遺伝子配列を有するｏｒｉ−Ｋａｎ含有ＤＮＡ断片（１７９５ｂｐ、配列番号１４）と、Ｓ．ポンベの染色体中のｕｒａ４遺伝子座に組込まれるｐＳＵ導入部位含有ＤＮＡ断片（６０７３ｂｐ、配列番号１５）とをライゲーション反応により連結することにより、ｕｒａ４遺伝子座組込み用ベクターｐＳＵ（７８３２ｂｐ、配列番号１６）を製造できる。図７に、ｐＳＵベクターの構造を示す。

ｐＳＵ導入部位含有ＤＮＡ断片は、上流側組換え部位、ｈＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ＬＰＩターミネーター、ｕｒａ４プロモーター、ｕｒａ４遺伝子、ｕｒａ４ターミネーター、および下流側組換え部位を備えるＤＮＡ断片であり、ＤＮＡ合成により製造できる。該上流側組換え部位（図７中、「ｕｒａ４ｕｐ」）は、ｕｒａ４遺伝子のＯＲＦの上流２１８６ｂｐから１１２８ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図７中、「ｕｒａ４ｄｗ」）は、ｕｒａ４遺伝子のＯＲＦの上流１０７８ｂｐから５７２ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、ｏｒｉ−Ｋａｎ含有ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化した後に、ＣＩＡＰにより脱リン酸化を行い、またｐＳＵ導入部位含有ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し、両者をライゲーション反応により連結することにより製造できる。

＜クローニングベクターｐＳＸｘｘの製造＞
クローニングベクターｐＳＸｘｘは、ｕｒａ４マーカー、ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を有しており、アンピシリン耐性遺伝子とｈＣＭＶプロモーター間およびｕｒａ４遺伝子と複製起点間にマルチクローニングサイトを備えるクローニングベクターである。
具体的には、ｐＳＥベクターを鋳型とし、５’末端にＢｇｌＩＩの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号１７）と５’末端にＳｍａＩおよびＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号１８）との組み合わせ、ならびに５’末端にＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＰｍｅＩ，ＰｍａＣＩおよびＮｏｔＩの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号１９）と５’末端にＢｇｌＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｍｅＩ、およびＮｏｔＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２０）との組み合わせによりそれぞれＰＣＲを行い、ｈＣＭＶプロモーターおよびｕｒａ４遺伝子を含む配列の５’末端にＢｇｌＩＩの制限酵素認識部位を、３’末端にＳｍａＩおよびＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物と、複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む配列の５’末端にＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＰｍｅＩ，ＰｍａＣＩおよびＮｏｔＩの制限酵素認識部位を、３’末端にＢｇｌＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｍｅＩ、およびＮｏｔＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物を得た。両ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌIＩおよびＳｍａＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをクローニングベクターｐＳＸｘｘ（配列番号２１）とした。ｐＳＸｘｘベクターの構造を図８に示す。

＜ｅｎｏ１０２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮ２の製造＞
ｐＳＸｘｘベクターのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ間およびＳｍａＩ−ＸｂａＩ間のそれぞれに、Ｓ．ポンベの染色体のｅｎｏ１０２遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、ｅｎｏ１０２遺伝子座組込み用ベクターｐＳＮ２（４５０４ｂｐ、配列番号２２）を製造した。図９に、ｐＳＮ２ベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図９中、「ｅｎｏ１０２ｕｐ」）は、ｅｎｏ１０２遺伝子のＯＲＦの下流３９６３ｂｐから４３６７ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図９中、「ｅｎｏ１０２ｄｗ」）は、ｅｎｏ１０２遺伝子のＯＲＦの下流４３６８ｂｐから４８０７ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株、ＡＴＣＣ３８３６６、９７２ｈ⁻相当）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２３）および５’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２４）を用いたＰＣＲによって、ｅｎｏ１０２遺伝子のＯＲＦの下流３９６３ｂｐから４３６７ｂｐの領域の３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｅｎｏ１０２ｕｐフラグメント）を得、フォワードプライマー（配列番号２５）および５’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２６）を用いたＰＣＲによって、ｅｎｏ１０２遺伝子のＯＲＦの下流４３６８ｂｐから４８０７ｂｐの領域の３’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｅｎｏ１０２ｄｗフラグメント）を得た。
該ｅｎｏ１０２ｕｐフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、またｐＳＸｘｘを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂａＩで二重消化し、またｅｎｏ１０２ｄｗフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＳＮ２ベクターとした。

＜ｆｂａ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＦの製造＞
ｐＳＸｘｘベクターのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ間およびＳｍａＩ−ＸｂａＩ間のそれぞれに、Ｓ．ポンベの染色体のｆｂａ１遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、ｆｂａ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＦ（４４５１ｂｐ、配列番号２７）を製造した。図１０に、ｐＳＦベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図１０中、「ｆｂａ１ｕｐ」）は、ｆｂａ１遺伝子のＯＲＦの上流３３３９ｂｐから３７３５ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図１０中、「ｆｂａ１ｄｗ」）は、ｆｂａ１遺伝子のＯＲＦの上流３７３６ｂｐから４１３０ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号２８）および５’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号２９）を用いたＰＣＲによって、ｆｂａ１遺伝子のＯＲＦの上流３３３９ｂｐから３７３５ｂｐの領域の３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｆｂａ１ｕｐフラグメント）を得、フォワードプライマー（配列番号３０）および５’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３１）を用いたＰＣＲによって、ｆｂａ１遺伝子のＯＲＦの上流３７３６ｂｐから４１３０ｂｐの領域の３’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｆｂａ１ｄｗフラグメント）を得た。
該ｆｂａ１ｕｐフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、またｐＳＸｘｘを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂａＩで二重消化し、またｆｂａ１ｄｗフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＳＦベクターとした。

＜ｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＧの製造＞
ｐＳＸｘｘベクターのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ間およびＳｍａＩ−ＸｂａＩ間のそれぞれに、Ｓ．ポンベの染色体のｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、ｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＧ（４５５３ｂｐ、配列番号３２）を製造した。図１１に、ｐＳＧベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図１１中、「ｇｐｄ１ｕｐ」）は、ｇｐｄ１遺伝子のＯＲＦの上流２７０４ｂｐから２３００ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図１１中、「ｇｐｄ１ｄｗ」）は、ｇｐｄ１遺伝子のＯＲＦの上流２２９９ｂｐから１８１１ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３３）および５’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３４）を用いたＰＣＲによって、ｇｐｄ１遺伝子のＯＲＦの上流２７０４ｂｐから２３００ｂｐの領域の３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｇｐｄ１ｕｐフラグメント）を得、フォワードプライマー（配列番号３５）および５’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３６）を用いたＰＣＲによって、ｇｐｄ１遺伝子のＯＲＦの上流２２９９ｂｐから１８１１ｂｐの領域の３’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｇｐｄ１ｄｗフラグメント）を得た。
該ｇｐｄ１ｄｗフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩで消化し、またｐＳＸｘｘを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂａＩで二重消化し、両者をライゲーションンし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで二重消化し、またｇｐｄ１ｕｐフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＳＧベクターとした。

＜ｐｇｋ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＰの製造＞
ｐＳＸｘｘベクターのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ間およびＳｍａＩ−ＸｂａＩ間のそれぞれに、Ｓ．ポンベの染色体のｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、ｐｇｋ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＰ（４４７５ｂｐ、配列番号３７）を製造した。図１２に、ｐＳＰベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図１２中、「ｐｇｋ１ｕｐ」）は、ｐｇｋ１遺伝子のＯＲＦの上流２３０７ｂｐから１９３５ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図１２中、「ｐｇｋ１ｄｗ」）は、ｐｇｋ１遺伝子のＯＲＦの上流１９３４ｂｐから１４９２ｂの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号３８）および５’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号３９）を用いたＰＣＲによって、ｐｇｋ１遺伝子のＯＲＦの上流２３０７ｂｐから１９３５ｂｐの領域の３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｐｇｋ１ｕｐフラグメント）を得、フォワードプライマー（配列番号４０）および５’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号４１）を用いたＰＣＲによって、ｐｇｋ１遺伝子のＯＲＦの上流１９３４ｂｐから１４９２ｂｐの領域の３’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｐｇｋ１ｄｗフラグメント）を得た。
該ｐｇｋ１ｕｐフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、またｐＳＸｘｘを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂａＩで二重消化し、またｐｇｋ１ｄｗフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＳＰベクターとした。

＜ｔｐｉ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＴの製造＞
ｐＳＸｘｘベクターのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ間およびＳｍａＩ−ＸｂａＩ間のそれぞれに、Ｓ．ポンベの染色体のｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、ｔｐｉ１遺伝子座組込み用ベクターｐＳＴ（４５３５ｂｐ、配列番号４２）を製造した。図１３に、ｐＳＴベクターの構造を示す。該上流側組換え部位（図１３中、「ｔｐｉ１ｕｐ」）は、ｔｐｉ１遺伝子のＯＲＦの上流１６１８ｂｐから１１７３ｂｐの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位（図１３中、「ｔｐｉ１ｄｗ」）は、ｔｐｉ１遺伝子のＯＲＦの上流１１７２ｂｐから７４３ｂｐの領域を下流側標的部位とした。

具体的には、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマー（配列番号４３）および５’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号４４）を用いたＰＣＲによって、ｔｐｉ１遺伝子のＯＲＦの上流１６１８ｂｐから１１７３ｂｐの領域の３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｔｐｉ１ｕｐフラグメント）を得、フォワードプライマー（配列番号４５）および５’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号４６）を用いたＰＣＲによって、ｔｐｉ１遺伝子のＯＲＦの上流１１７２ｂｐから７４３ｂｐの領域の３’末端にＮｈｅＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ｔｐｉ１ｄｗフラグメント）を得た。
該ｔｐｉ１ｕｐフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、またｐＳＸｘｘを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂａＩで二重消化し、またｔｐｉ１ｄｗフラグメントを制限酵素ＮｈｅＩで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｐＳＴベクターとした。

［実施例２］
＜ＥＧＦＰ発現ベクターの製造＞
実施例１で製造した単座組込み用ベクターのうち、ｐＳＥ、ｐＳＭ、ｐＳＮ、ｐＳＤ、ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰ、ｐＳＴ、ｐＳＵ、および公知の単座組込み用ベクターｐＳＬ６（Alimjan et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, vol.85, pp.667−677）にそれぞれＥＧＦＰ遺伝子を組込み、ＥＧＦＰ発現ベクターを製造した。ｐＳＬ６ベクターは、ｈＣＭＶプロモーターおよびＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、Ｓ．ポンベのｌｅｕ１遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。

（ｐＳＬ−ＥＧＦＰ、ｐＳＵ−ＥＧＦＰ、およびｐＳＥ−ＥＧＦＰ）
単座組込み用ベクターｐＳＬ６、ｐＳＵ、およびｐＳＥの各マルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰをコードする構造遺伝子を挿入したＧＦＰ発現ベクターｐＳＬ−ＥＧＦＰ、ｐＳＵ−ＥＧＦＰ、およびｐＳＥ−ＥＧＦＰをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、ＥＧＦＰをコードする人工合成遺伝子（配列番号４７）を鋳型とし、５’末端にＮｃｏＩの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー（配列番号４８）および５’末端にＰｓｔＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号４９）とを用いたＰＣＲによって、ＥＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にＮｃｏＩの制限酵素認識部位を、３’末端にＰｓｔＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（ＥＧＦＰフラグメント）を得た。
該ＥＧＦＰフラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで二重消化した。ｐＳＬ６およびｐＳＵをそれぞれ制限酵素ＡａｒＩおよびＰｓｔＩで、ｐＳＥを制限酵素ＰｃｉＩおよびＳｂｆＩで二重消化し、それぞれ二重消化したＥＧＦＰフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、ＧＦＰ発現ベクターｐＳＬ−ＥＧＦＰ、ｐＳＵ−ＥＧＦＰ、およびｐＳＥ−ＥＧＦＰとした。

（ｐＳＭ−ＥＧＦＰ、ｐＳＮ−ＥＧＦＰ、およびｐＳＤ−ＥＧＦＰ）
単座組込みベクターｐＳＭ、ｐＳＮおよびｐＳＤの各マルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰの構造遺伝子および該遺伝子上流にｈＣＭＶプロモーターを配したｈＣＭＶ＋ＥＧＦＰフラグメントを挿入したＧＦＰ発現ベクターｐＳＭ−ＥＧＦＰ、ｐＳＮ−ＥＧＦＰおよびｐＳＤ−ＥＧＦＰをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、ｐＳＥ−ＥＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩで二重消化してｈＣＭＶ＋ＥＧＦＰフラグメントを得た。ｐＳＭ、ｐＳＮおよびｐＳＤそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩで二重消化し、それぞれ二重消化したｈＣＭＶ＋ＥＧＦＰフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、ＧＦＰ発現ベクターｐＳＭ−ＥＧＦＰ、ｐＳＮ−ＥＧＦＰおよびｐＳＤ−ＥＧＦＰとした。

（ｐＳＦ−ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−ＥＧＦＰ）
単座組込みベクターｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰおよびｐＳＴの各マルチクローニングサイトに、ＥＧＦＰの構造遺伝子および該遺伝子上流にｈＣＭＶプロモーターを、下流にＬＰＩターミネーターを配したＥＧＦＰ発現カセットを挿入したＧＦＰ発現ベクターｐＳＦ−ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−ＥＧＦＰをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、ｐＳＬ−ＥＧＦＰを制限酵素ＳｐｅＩで消化した後に平滑化処理を行い、更に制限酵素ＢｌｎＩで消化してＥＧＦＰ発現カセットフラグメントを回収した。ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰおよびｐＳＴそれぞれを制限酵素ＢｌｎＩおよびＳｍａＩで二重消化し、それぞれ消化したＥＧＦＰ発現カセットフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、ＧＦＰ発現ベクターｐＳＦ−ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−ＥＧＦＰとした。

＜宿主＞
宿主として、Ｓ．ポンベのロイシン要求株ＡＲＣ００１（遺伝子型：ｈ⁻、ｌｅｕ１−３２）およびウラシル要求株ＡＲＣ１３６（遺伝子型：ｈ⁻、ｕｒａ４−Ｄ１８）を用いた。

＜形質転換体の製造＞
ＡＲＣ００１株およびＡＲＣ１３６株をＹＥＳ(０．５％酵母エキス、３％グルコース、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＳＰサプリメント)培地でそれぞれ１．０〜２．０×１０^７細胞数／ｍＬになるまで生育させた。生育させた菌体を集菌して洗浄した後、２．０×１０^９細胞数／ｍＬになるように０．１Ｍ 酢酸リチウム（ｐＨ５．０）にそれぞれ懸濁した。その後、ＡＲＣ００１株の懸濁液１００μＬにＥＧＦＰ発現ベクターｐＳＬ−ＥＧＦＰを制限酵素ＮｏｔＩで消化したもの約１μｇを、ＡＲＣ１３６株の懸濁液１００μＬにＧＦＰ発現ベクターｐＳＵ−ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−ＥＧＦＰまたはｐＳＴ−ＥＧＦＰを制限酵素ＮｏｔＩで消化したもの、ｐＳＥ−ＥＧＦＰ、ｐＳＭ−ＥＧＦＰ、ｐＳＮ−ＥＧＦＰまたはｐＳＤ−ＥＧＦＰを制限酵素ＰｍｅＩで消化したもの約１μｇをそれぞれ加え、更に５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００)水溶液をそれぞれに２６０μＬ加えてよく撹拌した後、３０℃で３０分間インキュベートし、４３μＬのＤＭＳＯを添加した後に更に４２℃で５分間インキュベートした。遠心分離処理によりＰＥＧ４０００を除去し、洗浄した後の菌体を１５０μＬの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。各菌体を塗布した寒天培地を３〜５日培養した後、形質転換体を得た。

ｐＳＬ−ＥＧＦＰ、ｐＳＵ−ＥＧＦＰ、ｐＳＥ−ＥＧＦＰ、ｐＳＭ−ＥＧＦＰ、ｐＳＮ−ＥＧＦＰ、ｐＳＤ−ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をそれぞれ、ＳＬ−ＥＧＦＰ株、ＳＵ−ＥＧＦＰ株、ＳＥ−ＥＧＦＰ株、ＳＭ−ＥＧＦＰ株、ＳＮ−ＥＧＦＰ株、ＳＤ−ＥＧＦＰ株、ＳＦ−ＥＧＦＰ株、ＳＧ−ＥＧＦＰ株、ＳＰ−ＥＧＦＰ株およびＳＴ−ＥＧＦＰ株とした。

＜培養菌体のＧＦＰ蛍光強度測定＞
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＥＭＭ培地（ＭＰ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社製、米国）に植菌し、３２℃で３日間培養した。培養後の各培養液の菌体密度（ＯＤ_６６０）およびＧＦＰ蛍光強度（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）をＭＴＰ−８１０Ｌａｂ（コロナ電気社製、日本）により測定して、各形質転換体のＯＤ_６６０当りのＧＦＰ蛍光強度（ＧＦＰ／ＯＤ_６６０、細胞当りのＥＧＦＰ生産量を反映）を算出し、ＳＬ−ＥＧＦＰ株のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を１として各形質転換体のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を相対比較した。

培養後の各培養液は、どの形質転換体もＧＦＰの蛍光を示しており、ＥＧＦＰを生産していることがうかがえた。各形質転換体の相対ＧＦＰ／ＯＤ_６６０の算出結果を図１４に示す。染色体に組込まれた発現カセットは同じであったにもかかわらず、各株のＧＦＰ／ＯＤ_６６０は異なっており、発現カセットを組込む部位によってＧＦＰ／ＯＤ_６６０が変動することがわかった。ＳＬ−ＥＧＦＰ株が最も高いＧＦＰ／ＯＤ_６６０を示し、ＳＵ−ＥＧＦＰ株はＳＬ−ＥＧＦＰ株の約８０％のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を、ＳＥ−ＥＧＦＰ株、ＳＭ−ＥＧＦＰ株、ＳＮ−ＥＧＦＰ株およびＳＤ−ＥＧＦＰ株はＳＬ−ＥＧＦＰ株の約５０％のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を、ＳＦ−ＥＧＦＰ株、ＳＧ−ＥＧＦＰ株、ＳＰ−ＥＧＦＰ株およびＳＴ−ＥＧＦＰ株はＳＬ−ＥＧＦＰ株の約２５％のＧＦＰ／ＯＤ_６６０を示した。該結果から、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座およびその近傍、ｆｂａ１遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ３遺伝子座およびその近傍、ｇｐｍ１遺伝子座およびその近傍、ｐｇｋ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｔｐｉ１遺伝子座およびその近傍は、ｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ｕｒａ４遺伝子座およびその近傍、ｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍と同様に遺伝子組込み座として適しており、外来遺伝子を含む発現カセットを組込むことにより、外来遺伝子を発現させられることがわかった。また、いずれの形質転換体の発現量も、ｇｐｄ１遺伝子座近傍に外来遺伝子を組込んだＳＧ−ＥＧＦＰ株の発現量よりも多いことから、ｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍等は、従来公知の遺伝子組込み座と同様に外来遺伝子を充分な発現量で発現させられることがわかった。

［実施例３］
＜ＥＧＦＰ分泌発現ベクターの製造＞
実施例１で製造した単座組込み用ベクターのうち、ｐＳＮ２、ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰ、およびｐＳＴにそれぞれ、Ｎ末端にＰ３分泌シグナルペプチドを付加したＥＧＦＰ遺伝子を組込み、ＥＧＦＰ分泌発現ベクターを製造した。合わせて、公知の単座組込みベクターｐＳＬ６Ｐ３中のマルチクローニングサイトにＥＧＦＰ遺伝子を組込み、ＥＧＦＰ分泌発現ベクターを製造した。ｐＳＬ６Ｐ３ベクターは、ｈＣＭＶプロモーターの下流にＰ３分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子を配し、該遺伝子とＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、Ｓ．ポンベのｌｅｕ１遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。

（ｐＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ）
まず、ＥＧＦＰをコードする人工合成遺伝子（配列番号４７）を鋳型とし、５’末端にＡｆｌＩＩの制限酵素認識部位およびＫＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号５０）および５’末端にＫｐｎＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号５１）とを用いたＰＣＲによって、ＥＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にＡｆｌＩＩの制限酵素認識部位とＫＫＲペプチド配列をコードするコドンを、３’末端にＫｐｎＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（分泌用ＥＧＦＰフラグメント）を得た。
該分泌用ＥＧＦＰフラグメントおよびｐＳＬ６Ｐ３それぞれを制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをＥＧＦＰ分泌発現ベクターｐＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰとした。

（ｐＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰ、およびｐＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰ）
単座組込みベクターｐＳＮ２、ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰおよびｐＳＴの各マルチクローニングサイトに、Ｐ３分泌シグナルをＮ末端に付加させたＥＧＦＰの構造遺伝子および該遺伝子上流にｈＣＭＶプロモーターを、下流にＬＰＩターミネーターを配したＰ３ＥＧＦＰ発現カセットを挿入したＥＧＦＰ分泌発現ベクターｐＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰをそれぞれ製造した。
具体的には、ｐＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰを制限酵素ＳｐｅＩで消化した後に平滑化処理を行い、更に制限酵素ＢｌｎＩで消化してＥＧＦＰ発現カセットフラグメントを回収した。ｐＳＮ２、ｐＳＦ、ｐＳＧ、ｐＳＰおよびｐＳＴを制限酵素ＢｌｎＩおよびＳｍａＩで二重消化し、それぞれＰ３ＥＧＦＰ発現カセットフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれＥＧＦＰ分泌発現ベクターｐＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰとした。

＜宿主＞
宿主として、Ｓ．ポンベＡＲＣ００１株の８つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたＡ８株（遺伝子型：ｈ⁻、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８、△ｐｓｐ３、△ｉｓｐ６、△ｏｍａ１、△ｐｐｐ１６、△ｆｍａ２、△ｓｘａ２、△ａｔｇ４、△ｐｐｐ２０）を用いた。Ａ８株は、遺伝子カセットを用いた標的ＯＲＦの遺伝子置換により予め構築された株である（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）。

＜形質転換体の製造＞
宿主としてＡ８株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として制限酵素ＮｏｔＩで消化した前記で得られた各ＥＧＦＰ分泌発現ベクター約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。
ｐＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ、ｐＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰおよびｐＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰを用いて得た形質転換体をそれぞれ、ＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰ株およびＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰ株とした。

＜ＥＧＦＰの分泌生産量の測定＞
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＹＰＤ＋ＭＥＳ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコース、０．３Ｍ ２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物）培地（ｐＨ６．０）に植菌し、３２℃で３日間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収された培養上清４ｍＬにＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を終濃度１０％（ｗ／ｗ）になるよう添加して冷却し、得られた沈殿物を回収した。該沈殿物に４０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、９５℃で５分間インキュベートし、ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。該ＰＡＧＥ用サンプルのうち１０μＬ（培養上清１ｍＬ相当）をアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色して、染色像をＧｅｌ Ｄｏｃ（登録商標） ＸＲ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａd Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、米国）で検出した。検出されたＥＧＦＰの分泌バンドを定量化し、ＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ株のＥＧＦＰ分泌量を１とした場合の各形質転換体のＥＧＦＰの相対分泌量を算出した。

各形質転換体のＥＧＦＰの相対分泌量の算出結果を図１５に示す。図１５に示すように、全ての形質転換体においてＥＧＦＰの分泌が確認された。実施例２と同様に、染色体中の組込み場所によってＥＧＦＰの分泌量が変動していたものの、相対量は実施例２とは異なっていた。即ち、ＳＴ−Ｐ３ＥＧＦＰ株はＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰと同等の分泌量を、ＳＮ２−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＦ−Ｐ３ＥＧＦＰ株、ＳＧ−Ｐ３ＥＧＦＰ株およびＳＰ−Ｐ３ＥＧＦＰ株はＳＬ−Ｐ３ＥＧＦＰ株の約５０％のＥＧＦＰ分泌量を示した。該結果から、同じ蛋白質であっても、発現様式により、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

［実施例４］
＜ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素遺伝子）発現ベクターの製造＞
実施例１で製造した単座組込み用ベクターのうちのｐＳＵ、ｐＳＥ、ｐＳＨおよびｐＳＵｂベクターとｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、ラクトバシラス由来のＤ−乳酸脱水素酵素（ＬｃＤＬＤＨ）をコードする構造遺伝子（配列番号５２）を挿入したＬｃＤＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＤＬＤＨ、ｐＳＵ−ＤＬＤＨ、ｐＳＥ−ＤＬＤＨ、ｐＳＨ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵｂ−ＤＬＤＨを作製した。

（ｐＳＬ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵ−ＤＬＤＨ）
ｐＳＬ６およびｐＳＵそれぞれを制限酵素ＡａｒＩおよびＰｓｔＩで二重消化した。ＤＮＡ合成により作製したＬｃＤＬＤＨの構造遺伝子を含む塩基配列（配列番号５３）からなるＤＮＡ断片を、二重消化したｐＳＬ６およびｐＳＵそれぞれに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて挿入し、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれＬｃＤＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵ−ＤＬＤＨとした。

（ｐＳＥ−ＤＬＤＨ、ｐＳＨ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵｂ−ＤＬＤＨ）
ｐＳＥ、ｐＳＨおよびｐＳＵｂそれぞれを制限酵素ＰｃｉＩで消化した。ＤＮＡ合成により作製したＬｃＤＬＤＨの構造遺伝子を含む塩基配列（配列番号５４）からなるＤＮＡ断片を、消化したｐＳＥ、ｐＳＨおよびｐＳＵｂそれぞれに、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて挿入し、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれＬｃＤＬＤＨ発現ベクターｐＳＥ−ＤＬＤＨ、ｐＳＨ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵｂ−ＤＬＤＨとした。

＜宿主＞
宿主として、Ｓ．ポンベのピルビン酸でカルボキシラーゼ遺伝子２（ｐｄｃ２）を欠損させた公知のＩＧＦ５４３株（遺伝子型：ｈ⁻、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８、ｐｄｃ２−Ｄ２３）を用いた（国際公開第２０１１／０２１６２９号パンフレット参照。）。

＜形質転換体の製造＞
宿主としてＩＧＦ５４３株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＮｏｔＩで消化したＬｃＤＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵ−ＤＬＤＨと制限酵素ＰｍｅＩで消化したＬｃＤＬＤＨ発現ベクターｐＳＥ−ＤＬＤＨ、ｐＳＨ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵｂ−ＤＬＤＨとをそれぞれ約１μｇ用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。
ｐＳＬ−ＤＬＤＨ、ｐＳＵ−ＤＬＤＨ、ｐＳＥ−ＤＬＤＨ、ｐＳＨ−ＤＬＤＨおよびｐＳＵｂ−ＤＬＤＨを用いて得た形質転換体をそれぞれ、ＳＬ−ＤＬＤＨ株、ＳＵ−ＤＬＤＨ株、ＳＥ−ＤＬＤＨ株、ＳＨ−ＤＬＤＨ株およびＳＵｂ−ＤＬＤＨ株とした。

＜Ｄ−乳酸の発酵生産試験＞
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＹＰＤ６（１％酵母エキス、１％ペプトン、６％グルコース）培地に植菌し、３２℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収した菌体を、４．５ｍＬの１１．１％グルコース溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体重量）／Ｌになるように接種した。３２℃、振盪速度１００ｒｐｍで３時間乳酸発酵を行い、発酵終了後の培養液中のＤ−乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。測定結果を元に、ＳＬ−ＤＬＤＨ株のＤ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））を１とした場合の各形質転換体のＤ−乳酸の相対生産速度を算出した。

培養液中のＤ−乳酸濃度を測定したところ、全ての形質転換体においてＤ−乳酸の生産が確認され、各株はＬｃＤＬＤＨを発現していた。各形質転換体のＤ−乳酸の相対生産速度の算出結果を図１６に示す。染色体中の組込み場所によってＤ−乳酸の生産速度は異なっており、ＳＵ−ＤＬＤＨ株、ＳＨ−ＤＬＤＨ株およびＳＵｂ−ＤＬＤＨ株はＳＬ−ＤＬＤＨ株の８０〜９０％の生産速度を、また、ＳＥ−ＤＬＤＨ株はＳＬ−ＤＬＤＨ株の約３０％の生産速度を示した。Ｄ−乳酸の生産速度は、各株のＬｃＤＬＤＨの菌体内発現量を反映すると考えられることから、実施例２の結果と比較して、発現させる蛋白質によって、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

［実施例５］
＜ＬＤＨ発現ベクターの製造＞
実施例１で製造した単座組込み用ベクターのうちのｐＳＭ、ｐＳＮおよびｐＳＤベクターとｐＳＬ６のマルチクローニングサイトに、ヒト由来のＬ−乳酸脱水素酵素（ＨｓＬＬＤＨ）をコードする構造遺伝子（配列番号５５）を挿入したＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＬＬＤＨ、ｐＳＭ−ＬＬＤＨ、ｐＳＮ−ＬＬＤＨおよびｐＳＤ−ＬＬＤＨを作製した。

（ｐＳＬ−ＬＬＤＨ）
ｐＳＬ６を制限酵素ＡａｒＩおよびＰｓｔＩで二重消化した。ＤＮＡ合成により作製したＨｓＬＬＤＨの構造遺伝子を含む塩基配列（配列番号５６）からなるＤＮＡ断片を、二重消化したｐＳＬ６にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて挿入し、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをＨｓＬＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＬＬＤＨとした。

（ｐＳＭ−ＬＬＤＨ）
ｐＳＭを制限酵素ＰｃｉＩで消化した。ＤＮＡ合成により作製したＨｓＬＬＤＨの構造遺伝子を含む塩基配列（配列番号５７）からなるＤＮＡ断片を、消化したｐＳＭにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて挿入し、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをＨｓＬＬＤＨ発現ベクターｐＳＭ−ＬＬＤＨとした。

（ｐＳＮ−ＬＬＤＨおよびｐＳＤ−ＬＬＤＨ）
ｐＳＭ−ＬＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩで二重消化してｈＣＭＶ＋ＨｓＬＬＤＨフラグメントを回収した。ｐＳＮおよびｐＳＤそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩで二重消化し、二重消化したｈＣＭＶ＋ＨｓＬＬＤＨフラグメントとそれぞれライゲーションし、続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれＨｓＬＬＤＨ発現ベクターｐＳＮ−ＬＬＤＨおよびｐＳＤ−ＬＬＤＨとした。

＜形質転換体の製造＞
宿主としてＩＧＦ５４３株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＮｏｔＩで消化したＨｓＬＬＤＨ発現ベクターｐＳＬ−ＬＬＤＨと制限酵素ＰｍｅＩで消化したＨｓＬＬＤＨ発現ベクターｐＳＭ−ＬＬＤＨ、ｐＳＮ−ＬＬＤＨおよびｐＳＤ−ＬＬＤＨとをそれぞれ約１μｇ用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。
ｐＳＬ−ＬＬＤＨ、ｐＳＭ−ＬＬＤＨ、ｐＳＮ−ＬＬＤＨおよびｐＳＤ−ＬＬＤＨを用いて得た形質転換体をそれぞれ、ＳＬ−ＬＬＤＨ株、ＳＭ−ＬＬＤＨ株、ＳＮ−ＬＬＤＨ株、およびＳＤ−ＬＬＤＨ株とした。

＜Ｌ−乳酸の発酵生産試験＞
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＹＰＤ６培地に植菌し、３２℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収した菌体を、４．５ｍＬの１１．１％グルコース溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体重量）／Ｌになるように接種した。３２℃、振盪速度１００ｒｐｍで３時間乳酸発酵を行い、発酵終了後の培養液中のＬ−乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。測定結果を元に、ＳＬ−ＬＬＤＨ株のＬ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））を１とした場合の各形質転換体のＬ−乳酸の相対生産速度を算出した。

培養液中のＬ−乳酸濃度を測定したところ、全ての形質転換体においてＬ−乳酸の生産が確認され、各株はＨｓＬＬＤＨを発現していた。各形質転換体のＬ−乳酸の相対生産速度の算出結果を図１７に示す。染色体中の組込み場所によってＬ−乳酸の生産速度は異なっており、ＳＤ−ＬＬＤＨ株はＳＬ−ＬＬＤＨ株の約８０％の生産速度を、また、ＳＭ−ＬＬＤＨ株およびＳＮ−ＬＬＤＨ株はＳＬ−ＤＬＤＨ株の３．５倍以上の生産速度を示した。Ｌ−乳酸の生産速度は、各株のＨｓＬＬＤＨの菌体内発現量を反映すると考えられることから、実施例４の結果と同様に、発現させる蛋白質によって、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

［実施例６］
＜ｈＴＦ分泌発現ベクターの製造＞
実施例１で製造した単座組込み用ベクターのうちのｐＳＵ、ｐＳＭ、ｐＳＮおよびｐＳＤベクターと公知の単座組込みベクターｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩのマルチクローニングサイトに、Ｎ結合型糖鎖付加部位に変異を導入したヒトトランスフェリン（変異型ｈＴＦ）をコードする構造遺伝子を挿入したｈＴＦ分泌発現ベクターを作製した。ｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩはｐＳＬ６ベクターと類似の基本構造を有し、ｈＣＭＶプロモーター下流に、Ｓ．ポンベ由来ＰＤＩ１のシグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒト由来ＰＤＩ1のａｂｘドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子（ヒトＰＤＩ（ａｂｘ）分泌キャリア遺伝子）を配し、該融合遺伝子とＬＰＩターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、Ｓ．ポンベのｌｅｕ１遺伝子座に外来遺伝子を組込むキャリア型分泌発現ベクターである（国際公開第２０１３／１１１７５４号パンフレット参照。）。

（ｐＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ）
変異型ｈＴＦをコードする人工合成遺伝子（配列番号５８）を鋳型とし、５’末端にＡｆｌＩＩの制限酵素認識部位およびＫＫＲペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー（配列番号５９）および５’末端にＸｂａＩの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー（配列番号６０）を用いたＰＣＲによって、変異型ｈＴＦ遺伝子のＯＲＦ全長の５’末端にＡｆｌＩＩの制限酵素認識部位とＫＫＲペプチド配列をコードするコドンを、３’末端にＸｂａＩの制限酵素認識部位を有するＰＣＲ産物（変異型ｈＴＦフラグメント）を得た。該変異型ｈＴＦフラグメントおよびｐＰＤＩ１（ＳＰ）−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）−ＡｆｌＩＩそれぞれを制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＸｂａＩで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦとした。

（ｐＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ）
ｐＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦを制限酵素ＳｎａＢＩおよびＳａｌＩで二重消化してヒトＰＤＩ（ａｂｘ）分泌キャリア＋変異型ｈＴＦフラグメントを回収した。ｐＳＵを制限酵素ＳｎａＢＩおよびＳａｌＩで二重消化し、ヒトＰＤＩ（ａｂｘ）分泌キャリア＋変異型ｈＴＦフラグメントとライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦとした。

（ｐＳＥ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ）
ｐＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦを制限酵素ＢｌｎＩおよびＳｐｅＩで二重消化してｈＴＦ分泌発現カセットフラグメントを回収した。ｐＳＥを制限酵素ＢｌｎIで消化し、ｈＴＦ分泌発現カセットフラグメントとライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＥ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦとした。

（ｐＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ、ｐＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦおよびｐＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ）
ｐＳＥ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで二重消化してｈＣＭＶ＋ヒトＰＤＩ（ａｂｘ）分泌キャリア＋変異型ｈＴＦフラグメントを回収した。一方、ｐＳＮ、ｐＳＤおよびｐＳＭそれぞれを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩで二重消化した。二重消化したｐＳＮ、ｐＳＤおよびｐＳＭをそれぞれ、ｈＣＭＶ＋ヒトＰＤＩ（ａｂｘ）分泌キャリア＋変異型ｈＴＦフラグメントとライゲーションして続く大腸菌ＤＨ５αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ、ｐＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦおよびｐＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦとした。

＜形質転換体の製造＞
まず、宿主としてＡ８株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＮｏｔＩで消化したｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＵ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株とした。

次いで、ＳＵ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、ウラシルおよびロイシンを含有する最少寒天培地上で生育させる（ＦＯＡ処理）ことによって、ウラシル要求性を示すＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＰｍｅＩで消化した前記で得られたｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をＳＵ／ＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株とした。

次いで、ＳＵ／ＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株にＦＯＡ処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＰｍｅＩで消化した前記で得られたｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をＳＵ／ＳＭ／ＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株とした。

次いで、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株にＦＯＡ処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ／ＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ／ＳＮ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＰｍｅＩで消化した前記で得られたｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株とした。

次いで、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株にＦＯＡ処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株を用いたこと、および宿主に導入するＤＮＡ断片として、制限酵素ＮｏｔＩで消化した前記で得られたｈＴＦ分泌発現ベクターｐＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ約１μｇを用いた以外は、実施例２と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ／ＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株とした。

ＳＵ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株、ＳＵ／ＳＭ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株およびＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ／ＳＬ-ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株は、染色体中に変異型ｈＴＦ発現カセットをそれぞれ、１、２、３、４および５コピー有する。

＜変異型ｈＴＦの分泌生産＞
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の５ｍＬのＹＰＤ＋ＭＥＳ培地（ｐＨ６．０）に植菌し、３２℃で４日間培養した。培養液を遠心分離処理して培養上清と培養菌体とに分離し、培養上清中に含まれる変異型ｈＴＦをＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ, Ｈｕｍａｎ, ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、米国）により検出し定量した。定量結果を元に、ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株の変異型ｈＴＦ分泌量を１とした場合の各形質転換体の変異型ｈＴＦの相対分泌量を算出した。算出結果を図１８に示す。

＜変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写量＞
前記で得られた各形質転換体の培養菌体よりＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりａｃｔ１遺伝子および変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡをそれぞれ検出し、各形質転換体の変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写量を比較した。
具体的には、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を用いて、各形質転換体の培養菌体から抽出した各ＲＮＡサンプルよりｃＤＮＡを調製した。ａｃｔ１遺伝子の検出には配列番号６１で表されるフォワードプライマーおよび配列番号６２で表されるリバースプライマーを、変異型ｈＴＦ遺伝子の検出には配列番号６３で表されるフォワードプライマーおよび配列番号６４で表されるリバースプライマーを用い、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社製、日本）とＭｘ３０００Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を用いて各ｃＤＮＡサンプルを鋳型とした定量ＰＣＲを実施した。Ｍｘ３０００Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍに付属のソフトウェアに従ってａｃｔ１遺伝子のｍＲＮＡ転写量を内部標準とした変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ相対転写量を算出し、ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株の変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写量を１として各形質転換体の変異型ｈＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写量を相対比較した。各形質転換体の変異型ｈＴＦ遺伝子の相対転写量の算出結果を図１９に示す。

分泌生産試験の結果、図１８に示すように、全ての形質転換体において変異型ｈＴＦの分泌が確認され、変異型ｈＴＦ発現カセットの染色体への導入数が４までは、発現カセットコピー数の増加に伴い、変異型ｈＴＦの分泌量が向上した。しかし、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ／ＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株では、発現カセットのコピー数が最も多いにもかかわらず、ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株よりも変異型ｈＴＦの分泌量が減少してしまった。

同様に、図１９に示すように、変異型ｈＴＦ遺伝子の転写量においては、変異型ｈＴＦ発現カセットのゲノムへの導入数が４までは、発現カセットコピー数の増加に応じて、変異型ｈＴＦ遺伝子の転写量が上昇していた。ただし、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ／ＳＬ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株では、ＳＵ／ＳＭ／ＳＮ／ＳＤ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株よりも転写量がやや減少するものの、ＳＵ−ｈＰＤＩ（ａｂｘ）ｈＴＦ株の約４倍を示していた。

全体的に転写量の結果が分泌量と相関しない結果となった理由としては、タンパク質の分泌生産は、遺伝子の転写以降様々な段階を経ることで至っており、変異型ｈＴＦの分泌に関しては、遺伝子の転写以降に分泌生産の律速段階が恐らく存在するため、転写量と分泌量に相関が見られなかったと考えられる。また、律速段階がそのまま宿主細胞に対するストレスとなり得るため、発現カセットのコピー数が５コピーになることで、宿主細胞の生命活動を阻害し、転写量や分泌量の減少が観察されたものと推測される。一方で、４コピーまでの発現カセットの導入は、変異型ｈＴＦの分泌生産量向上をもたらすことに成功した。

［実施例７］
＜Ｄ−ＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の作製＞
ＩＧＦ５４３株の染色体中の２箇所に、異種の生物由来のＤＬＤＨ遺伝子を導入した形質転換体を作製し、乳酸産生能を調べた。ウラシル要求性およびロイシン要求性を回復させた株であって、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＰａＤＬＤＨ）（GenBank accession number：CAA50275.1）とラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＬｐＤＬＤＨ）（GenBank accession number：BAA14352.1）が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４１５６株とした。

具体的には、まず、ＩＧＦ５４３株を、ＰａＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＥ−ＰａＤＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換し、ＰａＤＬＤＨ遺伝子が１コピー導入されたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株（ＡＳＰ３４７２株）を作製した。

ｐＳＥ−ＰａＤＬＤＨは、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＰａＤＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＳＥに組み込むことにより作製した。

単座組込型組換えベクターｐＳＬｈは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ＤＮＡ全合成により作製された配列番号６５に示す配列Ｙ１を含むベクターを鋳型とし、配列番号６６、６７に示すプライマーセットによるＰＣＲ反応を行い、増幅したＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎIとＳｎａＢＩで二重消化してＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と、ｐＳＬ１ベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し得られた断片と、ｐＳＬ６ベクターを鋳型とし配列番号６８、６９に示すプライマーセットによるＰＣＲ反応により得たＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し再び制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩで二重消化して得られたＤＮＡ断片をライゲーションし、配列番号７０にその配列（５’→３’、環状）を示すｐＳＬｈ（５９３６ｂｐ、図２０）を作製した。

ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ペディオコッカス・アシディラクティシＮＢＲＣ３０７６株（ＮＢＲＣ（Biological Resource Center, NITE）より入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＰａＤＬＤＨ−Ｆ、ＰａＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＰａＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＰａＤＬＤＨ（配列番号７３）をコードしていた。

得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨを作製した。

ＬｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ペントーサスＮＢＲＣ１０６４６７株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙによって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｐＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｐＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈを用いたＰＣＲ法によって、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｐＤＬＤＨ（配列番号７６）をコードしていた。

得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨを作製した。

得られたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株（ＡＳＰ３４７２株）に対して、ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）処理を行ってｕｒａ４遺伝子を除去した後、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨを用い、岡崎らの方法（Ｏｋａｚａｋｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、１９９０年、１８巻、６４８５−６４８９頁）により形質転換し、ｌｅｕ１座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＬｐＤＬＤＨ遺伝子をさらに１コピー導入したＳ．ポンベＤ−ＬＤＨ遺伝子２コピー導入株を作製した。

得られたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子２コピー導入株に対して、ＦＯＡ処理を行ってｕｒａ４遺伝子を除去した後、ｌｅｕ１遺伝子断片（配列番号７７）およびｕｒａ４遺伝子断片（配列番号７８）を用いて形質転換を行い、ウラシル要求性およびロイシン要求性を回復させた株（ＡＳＰ４１５６株）を作製した。

＜培養試験＞
ＡＳＰ４１５６株およびＡＳＰ３４７２株をそれぞれＹＰＤ６液体培地に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で３または８時間培養を行い、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。また、乳酸の光学純度を、配位子交換型カラムを用いて光学異性体を分離し測定した。光学純度は、各光学異性体のピークエリア面積から、下記式（［Ｄ体］：Ｄ−乳酸のピークエリア面積、［Ｌ体］：Ｌ−乳酸のピークエリア面積）により算出して求めた。発酵（培養）時間、測定結果ならびに該測定結果より計算した、Ｄ−乳酸の対糖収率（選択率、％）およびＤ−乳酸の光学純度（％ｅｅ）を表３に示す。
式：［光学純度（％ｅｅ）］＝（［Ｄ体］−［Ｌ体］）／（［Ｄ体］＋［Ｌ体］）×１００

［実施例８］
＜Ｓ．ポンベｐｄｃ２遺伝子削除株の作製＞
Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１９株（遺伝子型：ｈ⁻ 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８、Ａｄｅ６−Ｍ２１６）（Strain name: JY741, NBRPID: FY7512）をＬａｔｏｕｒ法に従って形質転換し、ｐｄｃ２遺伝子（系統名：ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）を削除した削除株（ＩＧＦ８３６株）を作製した。
削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株からＤＮｅａｓｙによって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。

具体的には、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ−Ｄａｓｈを用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表５に示す塩基配列を有する２種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したＳ．ポンベのウラシル要求性マーカーｕｒａ４（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＣＣ３３０．０５ｃ、オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素遺伝子）領域断片も鋳型として合わせて使用した。

＜外来遺伝子を導入したＳ．ポンベ形質転換株の作製＞
得られたＳ．ポンベｐｄｃ２遺伝子削除株（ＩＧＦ８３６株、ｈ⁻ ｌｅｕ１−３２ ｕｒａ４−Ｄ１８ ａｄｅ６−Ｍ２１６ ｐｄｃ２−Ｄ２３）に、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰＹＣ（ＳｃｅＰＹＣ）およびデルフチア・アシドボランス由来のＭＤＨ（ＤａｃＭＤＨ）を導入したＳ．ポンベ形質転換株（ＡＳＰ４４９１株）を作製した。

具体的には、作製したＩＧＦ８３６株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＳｃｅＰＹＣ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＳｃｅＰＹＣとＤａｃＭＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ−ＤａｃＭＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法に従い形質転換した。

単座組込型組換えベクターｐＳＭｈは、以下に示す工程で作製することができる。まず、ＤＮＡ全合成により作製された配列番号８９に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片（Ｆｒ．１）を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し得られた断片と、ｐＳＥベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し再び制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩで二重消化して得られたＤＮＡ断片をライゲーションし、配列番号９０に示す塩基配列（５’→３’、環状）からなるｐＳＭｈ（８８４９ｂｐ、図２１）を作製した。

ｐＳＬｈ−ＳｃｅＰＹＣは、以下に示す工程で作製した。まず、サッカロミセス・セレビジエの培養物からＤＮｅａｓｙによって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＳｃｅＰＹＣ−Ｆ、ＳｃｅＰＹＣ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈを用いたＰＣＲ法によって、ＳｃｅＰＹＣ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＳｃｅＰＹＣ（配列番号９３）をコードしていた。

得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、ｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＳｃｅＰＹＣを作製した。

同様の手法で単座組込型組換えベクターｐＳＭｈ−ＤａｃＭＤＨを作製した。用いたプライマーセットを表７に示す。

＜ｍａｅ２削除株の作製＞
ＳｃeＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４４９１株のｍａｅ２遺伝子を削除した削除株（ＡＳＰ４９６４株）を作製した。ｍａｅ２の削除断片の作製方法は、ｐｄｃ２削除の削除断片と同様の作製方法で行った。
Ｓ．ポンベのＡＳＰ４４９１株（遺伝子型：ｈ⁻ 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８、Ａｄｅ６−Ｍ２１６、Δｐｄｃ２、＋ＳｃｅＰＹＣ、＋ＤａｃＭＤＨ）をＬａｔｏｕｒ法に従って形質転換し、ｍａｅ２遺伝子（系統名：ＳＰＣＣ７９４．１２ｃ）を削除したＡＳＰ４９６４株を作製した。
削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株からＤＮｅａｓｙによって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。

＜リンゴ酸生産能の確認＞
Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０１０株）と、ｐｄｃ２遺伝子とｍａｅ２遺伝子を削除し、ＳｃeＰＹＣ遺伝子とＤａｃＭＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４９６４株（Δｐｄｃ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のリンゴ酸生産速度を調べた。

具体的には、菌体をＹＥＳプレートに播種し、３０℃で９６時間培養しコロニーを得た。得られたコロニーを５ｍＬのＹＥＳ培地（試験管）に植継ぎ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた菌液を１００ｍＬのＹＰＤ６培地（坂口フラスコ）に植継ぎ、３０℃で４４時間振とう培養した。
得られた菌体を集菌し、試験管内の３ｍＬの発酵培地（１００ｇ／Ｌ グルコース、１１１ｇ／Ｌ 炭酸カルシウム）に３６ｇ乾燥菌体重量／Ｌとなるように加え、３０℃、振とう条件で発酵させた。発酵液から適時サンプリングを行った。
得られたサンプルについて、酵素電極法バイオセンサＢＦ−７（王子計測機器社製）を用いてグルコース濃度とエタノール濃度を測定し、ＨＰＬＣによりリンゴ酸濃度を測定した。ＨＰＬＣ測定では、高速液体クロマトグラフProminence（島津製作所製）を用い、カラムはＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ―８７Ｈ ３００×７．８ｍｍ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）を用い、インジェクション容量を１０μＬとし、溶媒に１０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４を用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとし、測定時間は３５分間とし、測定温度は６０℃とし、検出にはダイオードアレイ検出（２１０ｎｍ）と示差屈折率検出を用いた。各濃度は、培養液または発酵液当たりの濃度である。

グルコース濃度（ｇ／Ｌ）、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）、およびリンゴ酸の濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を、図２２および２３に示す。この結果、ＡＳＰ４９６４株（Δｐｄｃ２，Δｍａｅ２，＋ＳｃｅＰＹＣ，＋ＤａｃＭＤＨ）のみが、リンゴ酸の産生が確認された。

［実施例９］
＜Ｓ．ポンベＨｓＬＬＤＨ遺伝子１コピー導入株の作製＞
Ｓ．ポンベの染色体のｇｐｍ１遺伝子座近傍に、ヒト由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（ＨｓＬＬＤＨ遺伝子）を組込むための発現ベクターｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクター（４５６２ｂｐ、図２４）を作製した。ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１０５に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。

次いで、ＩＧＦ５４３株を、ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｇｐｍ１遺伝子座近傍に組込まれた。該形質転換株（ＨｓＬＬＤＨ遺伝子１コピー導入株）をＡＳＰ３４９４株とした。

＜Ｓ．ポンベＨｓＬＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の作製＞
ＡＳＰ３４９４株を、ＨｓＬＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持し、ｉｈｃ１プロモーターを有する発現ベクターｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨ（国際公開第２０１４／０３０６５５号参照。）の制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法に従い形質転換した。該操作により、該発現カセットがゲノム上のｌｅｕ１遺伝子座近傍に組込まれ、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＬＤＨ遺伝子を１コピーと、ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃ１プロモーターによって制御されたＨｓＬＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計２コピーのＨｓＬＬＤＨ遺伝子が組込まれた形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＬＤＨ遺伝子２コピー導入株）をＡＳＰ４１２１株とした。

＜ウラシル要求性の復帰＞
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに組込まれたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。

＜Ｓ．ポンベＨｓＬＬＤＨ遺伝子３コピー導入株の作製＞
まず、ＨｓＬＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持し、Ｓ．ポンベの染色体のｅｎｏ１０１遺伝子座近傍にＨｓＬＬＤＨ遺伝子を組込むための発現ベクターｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクター（４５３５ｂｐ、図２５）を作製した。ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１０６に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。

次いで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｅｎｏ１０１遺伝子座近傍に組込まれ、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＬＤＨ遺伝子を１コピーと、ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃ１プロモーターによって制御されたＨｓＬＬＤＨ遺伝子を１コピーと、ｅｎｏ１０１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計３コピーのＨｓＬＬＤＨ遺伝子が組込まれた形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＬＤＨ遺伝子３コピー導入株）をＡＳＰ４９５６株とした。

＜ウラシル要求性の復帰＞
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによる場合と同様に、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに組込まれたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。

＜ウラシル要求性の補完＞
ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｕｒａ４遺伝子を含むＤＮＡ断片（３２７７ｂｐ、配列番号１０７）で形質転換し、ウラシル要求性が補完された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＬＤＨ遺伝子３コピー導入栄養要求補完株）をＡＳＰ５０１９株とした。

＜培養試験＞
ＡＳＰ５０１９株の増殖能と乳酸産生能を調べた。具体的には、形質転換株をＹＰＤ６液体培地に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で３または２０時間培養を行い、終了後、培養液のＯＤ_６６０および培養液中の乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。この結果、ＡＳＰ５０１９株の２０時間培養後の培養液のＯＤ_６６０は２２．５であり、３時間培養（発酵）後の乳酸濃度は９１．０ｇ／Ｌであった。

Claims (9)

1. シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。
2. さらに、染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される１以上に外来遺伝子を組込む、請求項１に記載の形質転換体の製造方法。
3. 染色体中に複数の外来遺伝子を組込み、
   該複数の外来遺伝子が、互いに同種のプロモーターによって支配されている、請求項１または２に記載の形質転換体の製造方法。
4. シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍に、外来遺伝子が組込まれていることを特徴とする、形質転換体。
5. さらに、染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍、ならびにｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される１以上に、外来遺伝子が組込まれている、請求項４に記載の形質転換体。
6. 染色体中に複数の外来遺伝子が組込まれており、
   該複数の外来遺伝子が、互いに同種のプロモーターによって支配されている、請求項４または５に記載の形質転換体。
7. シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｆ１ａ−ａ遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｅｆ１ａ−ａ遺伝子座組込み用ベクター
   を含むことを特徴とする、単座組込み用ベクターキット。
8. さらに、
   シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｌｅｕ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｌｅｕ１遺伝子座組込み用ベクターと、
   シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｇｐｄ１遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するｇｐｄ１遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される１種以上のベクターを含む、請求項７に記載の単座組込み用ベクターキット。
9. ２以上のベクター中のシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターが、互いに同種のプロモーターである、請求項７または８に記載の単座組込み用ベクターキット。