JP2000262284A - シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法 - Google Patents
シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】遺伝子工学的手法でシゾサッカロミセス・ポン
ベ（Ｓ．ポンベ）に異種蛋白質を安定的かつ効率的に発
現させるため、その染色体に異種蛋白質構造遺伝子を組
込む。 【解決手段】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセット、相同的組換えを行わせる遺伝子部位お
よび大腸菌の複製開始領域を有する相同的組換えベクタ
ーを大腸菌を用いて構築し、該ベクターを大腸菌の複製
開始領域を除いてＳ．ポンベの染色体に組込む。
ベ（Ｓ．ポンベ）に異種蛋白質を安定的かつ効率的に発
現させるため、その染色体に異種蛋白質構造遺伝子を組
込む。 【解決手段】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセット、相同的組換えを行わせる遺伝子部位お
よび大腸菌の複製開始領域を有する相同的組換えベクタ
ーを大腸菌を用いて構築し、該ベクターを大腸菌の複製
開始領域を除いてＳ．ポンベの染色体に組込む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分裂酵母であるシ
ゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の形質転換方法、特にそ
の染色体中に相同的組換え法で異種蛋白質構造遺伝子を
導入する方法に関する。また本発明は、その形質転換方
法に使用されるベクター、その方法で形質転換されたシ
ゾサッカロミセス・ポンベ、およびその形質転換された
シゾサッカロミセス・ポンベを用いる異種蛋白質の製造
方法に関する。
ゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の形質転換方法、特にそ
の染色体中に相同的組換え法で異種蛋白質構造遺伝子を
導入する方法に関する。また本発明は、その形質転換方
法に使用されるベクター、その方法で形質転換されたシ
ゾサッカロミセス・ポンベ、およびその形質転換された
シゾサッカロミセス・ポンベを用いる異種蛋白質の製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術を応用した異種蛋白質
の生産は、様々な産業に用いられている。その宿主とし
て主に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、動物細胞などが広く用い
られている。あらゆる天然・人工の蛋白質を生産の対象
とすることが想定され、しかも近年は精製蛋白質のみな
らず、様々な化学物質の生産も試みられている。
の生産は、様々な産業に用いられている。その宿主とし
て主に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、動物細胞などが広く用い
られている。あらゆる天然・人工の蛋白質を生産の対象
とすることが想定され、しかも近年は精製蛋白質のみな
らず、様々な化学物質の生産も試みられている。
【０００３】しかしあらゆる蛋白質または化学物質を効
率良く生産できる「全能性宿主（ゼネラルホスト）」は
いまだ開発されておらず、目的とする蛋白質または化学
物質ごとに生産系を構築するという試行錯誤が続いてい
る。このため、個々の発現系においても、そのさらなる
技術革新が待たれている。
率良く生産できる「全能性宿主（ゼネラルホスト）」は
いまだ開発されておらず、目的とする蛋白質または化学
物質ごとに生産系を構築するという試行錯誤が続いてい
る。このため、個々の発現系においても、そのさらなる
技術革新が待たれている。
【０００４】異種蛋白質、特に真核生物由来の蛋白質を
生産するためには、真核生物である微生物を用いた生産
方法が最も良いと考えられている。酵母は人類史上長い
間、特に食料品として人間の生活に密接に関与している
ためなじみが深く、菌体の大量培養方法も確立してお
り、他の発現系に内在する、人体に悪影響を及ぼす物質
も含まない。これまでに種々の酵母を宿主とした発現系
が開発されてきた（Ｙｅａｓｔ，８，４２３（１９９
２））。
生産するためには、真核生物である微生物を用いた生産
方法が最も良いと考えられている。酵母は人類史上長い
間、特に食料品として人間の生活に密接に関与している
ためなじみが深く、菌体の大量培養方法も確立してお
り、他の発現系に内在する、人体に悪影響を及ぼす物質
も含まない。これまでに種々の酵母を宿主とした発現系
が開発されてきた（Ｙｅａｓｔ，８，４２３（１９９
２））。
【０００５】なかでも、分裂酵母であるシゾサッカロミ
セス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）は出芽酵母
であるサッカロミセス・セレビジエをはじめとする他の
酵母に比べ様々な性質、例えば細胞周期や染色体の構
造、ＲＮＡスプライシングなどが動物細胞により類似し
ているといわれ、生産されてくる蛋白質のアセチル化、
リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾も動物細胞
でのそれに近いと考えられている（Ｃｅｌｌ，４５，７
８１（１９８６）；Ｎａｔｕｒｅ，３１８，７８（１９
８５）；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０９，２６９３
（１９８９））。
セス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）は出芽酵母
であるサッカロミセス・セレビジエをはじめとする他の
酵母に比べ様々な性質、例えば細胞周期や染色体の構
造、ＲＮＡスプライシングなどが動物細胞により類似し
ているといわれ、生産されてくる蛋白質のアセチル化、
リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾も動物細胞
でのそれに近いと考えられている（Ｃｅｌｌ，４５，７
８１（１９８６）；Ｎａｔｕｒｅ，３１８，７８（１９
８５）；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０９，２６９３
（１９８９））。
【０００６】しかも、Ｓ．ポンベは、真核生物でありな
がら遺伝学・分子生物学・細胞生物学分野での応用がき
わめて容易な単細胞生物として広く研究されている（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆ
ｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８９））。また、Ｓ．ポンベについての組換
えＤＮＡ技術の研究もすでに行われている（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｆｉｓｓｉｏｎ Ｙｅａｓ
ｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。
がら遺伝学・分子生物学・細胞生物学分野での応用がき
わめて容易な単細胞生物として広く研究されている（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆ
ｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８９））。また、Ｓ．ポンベについての組換
えＤＮＡ技術の研究もすでに行われている（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｆｉｓｓｉｏｎ Ｙｅａｓ
ｔ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。
【０００７】このため、動物細胞由来の蛋白質を発現さ
せる宿主としてはＳ．ポンベが有利であると考えられ
る。Ｓ．ポンベを用いることによって、動物細胞の場合
と同様の、より天然体に近い遺伝子産物が得られると予
想される。しかし、Ｓ．ポンベを用いた遺伝子発現に関
する研究は、出芽酵母にくらべて遅れており、それを用
いた異種蛋白質の製造に関してはあまり多くの文献はな
い（特開昭６１−１８１３９７、特開平２−２８３２８
８、特開平４−６３５９６参照）。この原因は強力なプ
ロモータを持ち、菌体内に安定に存在し、かつ遺伝子を
導入するのに最適かつ簡便な発現プラスミドの開発が遅
れていたためである。
せる宿主としてはＳ．ポンベが有利であると考えられ
る。Ｓ．ポンベを用いることによって、動物細胞の場合
と同様の、より天然体に近い遺伝子産物が得られると予
想される。しかし、Ｓ．ポンベを用いた遺伝子発現に関
する研究は、出芽酵母にくらべて遅れており、それを用
いた異種蛋白質の製造に関してはあまり多くの文献はな
い（特開昭６１−１８１３９７、特開平２−２８３２８
８、特開平４−６３５９６参照）。この原因は強力なプ
ロモータを持ち、菌体内に安定に存在し、かつ遺伝子を
導入するのに最適かつ簡便な発現プラスミドの開発が遅
れていたためである。
【０００８】最近になって、ｎｍｔ１+ 遺伝子のプロモ
ータ領域を用いた誘導発現ベクター（ｐＲＥＰ１）や動
物細胞ウイルス由来のプロモータ領域をもつ、非常に発
現能の高い分裂酵母用ベクターが開発されたため、よう
やくＳ．ポンベを用いての異種蛋白質の大量生産への道
が開かれた（特開平５−１５３８０、特開平７−１６３
３７３、ＷＯ９６／２３８９０、特開平１０−２３４３
７５参照）。
ータ領域を用いた誘導発現ベクター（ｐＲＥＰ１）や動
物細胞ウイルス由来のプロモータ領域をもつ、非常に発
現能の高い分裂酵母用ベクターが開発されたため、よう
やくＳ．ポンベを用いての異種蛋白質の大量生産への道
が開かれた（特開平５−１５３８０、特開平７−１６３
３７３、ＷＯ９６／２３８９０、特開平１０−２３４３
７５参照）。
【０００９】これらの技術を用いることにより、多くの
細胞内蛋白質は容易に生産できるようになり、発現シス
テムとしての有用性は高い。実際すでに異種蛋白質遺伝
子発現の宿主として次第に広く用いられるようになり、
特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適してい
ることが知られている（Ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ（１９９７）参照）。またゴ
ルジ体や小胞体を含む膜構造の発達が知られており、こ
のことから膜蛋白質の発現にも用いられ、高い発現量を
示している。
細胞内蛋白質は容易に生産できるようになり、発現シス
テムとしての有用性は高い。実際すでに異種蛋白質遺伝
子発現の宿主として次第に広く用いられるようになり、
特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適してい
ることが知られている（Ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ（１９９７）参照）。またゴ
ルジ体や小胞体を含む膜構造の発達が知られており、こ
のことから膜蛋白質の発現にも用いられ、高い発現量を
示している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｓ．ポンベに発
現ベクターを導入して得られた形質転換体においては、
発現ベクターはＳ．ポンベの染色体外性遺伝体（プラス
ミド）として存在していた。しかし、染色体外性遺伝体
は時としてＳ．ポンベの培養中に細胞から脱落などによ
り消失することがあった。このため異種蛋白質構造遺伝
子を有するベクターを細胞中に安定的に存在させるため
には、そのベクターをＳ．ポンベの染色体中に組込むこ
とが好ましいと考えられる。通常、ベクターを染色体に
組込む方法としては相同的組換え方法が使用される。相
同的組換え方法により染色体に組込むことのできるベク
ターを以下組込み型ベクターという。
現ベクターを導入して得られた形質転換体においては、
発現ベクターはＳ．ポンベの染色体外性遺伝体（プラス
ミド）として存在していた。しかし、染色体外性遺伝体
は時としてＳ．ポンベの培養中に細胞から脱落などによ
り消失することがあった。このため異種蛋白質構造遺伝
子を有するベクターを細胞中に安定的に存在させるため
には、そのベクターをＳ．ポンベの染色体中に組込むこ
とが好ましいと考えられる。通常、ベクターを染色体に
組込む方法としては相同的組換え方法が使用される。相
同的組換え方法により染色体に組込むことのできるベク
ターを以下組込み型ベクターという。
【００１１】Ｓ．ポンベの染色体に組込み型ベクターを
組込むことは公知である（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，４，４０９（１９８９）；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９，４５（１
９９８）参照）。しかし従来の組込み型ベクターを組込
む方法で得られた形質転換Ｓ．ポンベでは異種蛋白質の
発現が充分ではなかった。
組込むことは公知である（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，４，４０９（１９８９）；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９，４５（１
９９８）参照）。しかし従来の組込み型ベクターを組込
む方法で得られた形質転換Ｓ．ポンベでは異種蛋白質の
発現が充分ではなかった。
【００１２】本発明者はこの原因について検討した結
果、組込み型ベクターの多くが染色体に組込まれずに
Ｓ．ポンベ細胞内にプラスミドとして存在し、そのため
Ｓ．ポンベの染色体に組込み型ベクターが組込まれる効
率が低いことがその原因の１つであることを見出した。
また、一般的に組込み型ベクターは染色体の１つの遺伝
子部位に対し複数の組込み型ベクターが組込まれうるこ
とが知られており、１つの遺伝子部位に対して組込まれ
た組込み型ベクターの数が多いほど形質転換の異種蛋白
質の発現量が多くなると考えられている。しかし、本発
明者は、従来の方法で得られた形質転換Ｓ．ポンベでは
１つの染色体部位に対して組込まれた組込み型ベクター
の数が少ないことを見出し、これがまた異種蛋白質発現
量が少ない原因であると推測した。
果、組込み型ベクターの多くが染色体に組込まれずに
Ｓ．ポンベ細胞内にプラスミドとして存在し、そのため
Ｓ．ポンベの染色体に組込み型ベクターが組込まれる効
率が低いことがその原因の１つであることを見出した。
また、一般的に組込み型ベクターは染色体の１つの遺伝
子部位に対し複数の組込み型ベクターが組込まれうるこ
とが知られており、１つの遺伝子部位に対して組込まれ
た組込み型ベクターの数が多いほど形質転換の異種蛋白
質の発現量が多くなると考えられている。しかし、本発
明者は、従来の方法で得られた形質転換Ｓ．ポンベでは
１つの染色体部位に対して組込まれた組込み型ベクター
の数が少ないことを見出し、これがまた異種蛋白質発現
量が少ない原因であると推測した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記Ｓ．ポ
ンベの染色体に組込み型ベクターを組込む際の組込み効
率が低いこと、および、１つの遺伝子部位に組込まれる
組込み型ベクターの数が少ないことの原因を種々検討し
た結果、組込み型ベクター中に存在する「ベクター構築
の過程において必要とした、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で
機能する複製開始領域」がその原因となっていることを
見出した。
ンベの染色体に組込み型ベクターを組込む際の組込み効
率が低いこと、および、１つの遺伝子部位に組込まれる
組込み型ベクターの数が少ないことの原因を種々検討し
た結果、組込み型ベクター中に存在する「ベクター構築
の過程において必要とした、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で
機能する複製開始領域」がその原因となっていることを
見出した。
【００１４】組込み型ベクター等のベクター構築にあた
っては、遺伝子工学的に扱いやすい細胞を用いてベクタ
ーの複製を行うことが必須となっている。その細胞の代
表例は大腸菌であり、ほとんどの場合大腸菌を用いてベ
クターの構築が行われている。大腸菌中でベクターの複
製を行わせるためにベクター中に「ｏｒｉ」と呼ばれる
大腸菌の複製開始領域を存在させている。本発明者は、
この複製開始領域の存在がＳ．ポンベの染色体に組込み
型ベクターを組込む際の組込み効率の低下や組込み数の
減少の原因であることを見出した。
っては、遺伝子工学的に扱いやすい細胞を用いてベクタ
ーの複製を行うことが必須となっている。その細胞の代
表例は大腸菌であり、ほとんどの場合大腸菌を用いてベ
クターの構築が行われている。大腸菌中でベクターの複
製を行わせるためにベクター中に「ｏｒｉ」と呼ばれる
大腸菌の複製開始領域を存在させている。本発明者は、
この複製開始領域の存在がＳ．ポンベの染色体に組込み
型ベクターを組込む際の組込み効率の低下や組込み数の
減少の原因であることを見出した。
【００１５】上記知見に基づき本発明者は、Ｓ．ポンベ
の染色体に組込み型ベクターを組込む際に上記複製開始
領域を削除してから組込みを行うことにより上記問題を
解決しうることを見出した。すなわち、上記複製開始領
域を有しない組込み型ベクターを組込むことにより、組
込み効率を向上し、染色体の１つの遺伝子部位に組込ま
れる組込み型ベクターの数を増大させることができた。
の染色体に組込み型ベクターを組込む際に上記複製開始
領域を削除してから組込みを行うことにより上記問題を
解決しうることを見出した。すなわち、上記複製開始領
域を有しない組込み型ベクターを組込むことにより、組
込み効率を向上し、染色体の１つの遺伝子部位に組込ま
れる組込み型ベクターの数を増大させることができた。
【００１６】本発明は、以下の形質転換方法、ベクタ
ー、形質転換体、およびその形質転換体を用いた蛋白質
の製造方法である。
ー、形質転換体、およびその形質転換体を用いた蛋白質
の製造方法である。
【００１７】Ｓ．ポンベの染色体に、異種蛋白質構造遺
伝子とプロモータとを含む発現カセットおよび染色体に
対して相同的組換えを行わせる遺伝子部位を有するベク
ターであって、かつベクター構築の過程において必要と
した、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で機能する複製開始領域
を有しないベクターを、相同的組換え法で組込むことを
特徴とする、Ｓ．ポンベの形質転換方法。
伝子とプロモータとを含む発現カセットおよび染色体に
対して相同的組換えを行わせる遺伝子部位を有するベク
ターであって、かつベクター構築の過程において必要と
した、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で機能する複製開始領域
を有しないベクターを、相同的組換え法で組込むことを
特徴とする、Ｓ．ポンベの形質転換方法。
【００１８】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセット、Ｓ．ポンベの染色体に対して相同的組
換えを行わせる遺伝子部位および大腸菌の複製開始領域
を有する相同的組換えベクターを大腸菌を使用して構築
し、次いでそのベクターを大腸菌の複製開始領域を除い
てＳ．ポンベの染色体に組込むことを特徴とする、Ｓ．
ポンベの形質転換方法。
む発現カセット、Ｓ．ポンベの染色体に対して相同的組
換えを行わせる遺伝子部位および大腸菌の複製開始領域
を有する相同的組換えベクターを大腸菌を使用して構築
し、次いでそのベクターを大腸菌の複製開始領域を除い
てＳ．ポンベの染色体に組込むことを特徴とする、Ｓ．
ポンベの形質転換方法。
【００１９】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセットおよびＳ．ポンベの染色体に対して相同
的組換えを行わせる遺伝子部位を有するベクターであっ
て、かつベクター構築の過程において必要とした、Ｓ．
ポンベ以外の細胞中で機能する複製開始領域を有しない
ベクターであることを特徴とする、相同的組換え法で
Ｓ．ポンベの染色体に異種蛋白質構造遺伝子を導入する
ためのベクター。上記の方法で得られた形質転換された
Ｓ．ポンベ。上記の形質転換されたＳ．ポンベを培養
し、産生された異種蛋白質を取得することを特徴とする
異種蛋白質の製造方法。
む発現カセットおよびＳ．ポンベの染色体に対して相同
的組換えを行わせる遺伝子部位を有するベクターであっ
て、かつベクター構築の過程において必要とした、Ｓ．
ポンベ以外の細胞中で機能する複製開始領域を有しない
ベクターであることを特徴とする、相同的組換え法で
Ｓ．ポンベの染色体に異種蛋白質構造遺伝子を導入する
ためのベクター。上記の方法で得られた形質転換された
Ｓ．ポンベ。上記の形質転換されたＳ．ポンベを培養
し、産生された異種蛋白質を取得することを特徴とする
異種蛋白質の製造方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明において「発現カセット」
とは、Ｓ．ポンベの染色体に組込まれた場合その異種蛋
白質構造遺伝子がコードする異種蛋白質が発現されるた
めに必要なＤＮＡのセットをいう。この発現カセットは
異種蛋白質構造遺伝子とその遺伝子の発現を促進するプ
ロモータを含む。通常はさらに、ターミネータ、５’−
非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１以上を含
み、好ましくは異種蛋白質構造遺伝子、プロモータ、タ
ーミネータ、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のす
べてを含む。また、異種蛋白質構造遺伝子に結合した分
泌シグナル遺伝子を含んでいてもよい。
とは、Ｓ．ポンベの染色体に組込まれた場合その異種蛋
白質構造遺伝子がコードする異種蛋白質が発現されるた
めに必要なＤＮＡのセットをいう。この発現カセットは
異種蛋白質構造遺伝子とその遺伝子の発現を促進するプ
ロモータを含む。通常はさらに、ターミネータ、５’−
非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１以上を含
み、好ましくは異種蛋白質構造遺伝子、プロモータ、タ
ーミネータ、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のす
べてを含む。また、異種蛋白質構造遺伝子に結合した分
泌シグナル遺伝子を含んでいてもよい。
【００２１】なお、「異種蛋白質」とは、Ｓ．ポンベが
本来産生しない（その蛋白質をコードする遺伝子を有し
ない）蛋白質をいい、産業的価値から見てそのような蛋
白質としてはヒトや他の哺乳動物が産生する蛋白質が好
ましい。本発明は最終的にはこの異種蛋白質の製造を目
的とする。
本来産生しない（その蛋白質をコードする遺伝子を有し
ない）蛋白質をいい、産業的価値から見てそのような蛋
白質としてはヒトや他の哺乳動物が産生する蛋白質が好
ましい。本発明は最終的にはこの異種蛋白質の製造を目
的とする。
【００２２】本発明において「Ｓ．ポンベの染色体に対
して相同的組換えを行わせる遺伝子部位」とは、Ｓ．ポ
ンベの染色体中に存在する遺伝子と相同な遺伝子をい
う。相同的組換えは、Ｓ．ポンベの染色体中に存在する
遺伝子とベクター中の相同な遺伝子部位との対合に基づ
く遺伝子交換によって起こる。ベクター中のこの遺伝子
部位がターゲットとするＳ．ポンベの染色体中の遺伝子
は染色体に１個存在すればよいが、複数個存在していて
もよい。ターゲットとなる遺伝子が多いほど多数のベク
ターが組込まれると考えられるが、１個であっても組込
み効率が高くかつそこに多数のベクターが組込まれるも
のであれば充分である。
して相同的組換えを行わせる遺伝子部位」とは、Ｓ．ポ
ンベの染色体中に存在する遺伝子と相同な遺伝子をい
う。相同的組換えは、Ｓ．ポンベの染色体中に存在する
遺伝子とベクター中の相同な遺伝子部位との対合に基づ
く遺伝子交換によって起こる。ベクター中のこの遺伝子
部位がターゲットとするＳ．ポンベの染色体中の遺伝子
は染色体に１個存在すればよいが、複数個存在していて
もよい。ターゲットとなる遺伝子が多いほど多数のベク
ターが組込まれると考えられるが、１個であっても組込
み効率が高くかつそこに多数のベクターが組込まれるも
のであれば充分である。
【００２３】ターゲットとなる遺伝子としては、Ｓ．ポ
ンベの栄養要求性マーカーとなる遺伝子が好ましい。そ
のような遺伝子としては、特に限定されないが、例え
ば、Ｓ．ポンベの、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝
子、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ遺
伝子、ホスホリボシルＡＭＰシクロヒドラーゼ遺伝子が
好ましい。ベクターが組込まれるＳ．ポンベ中のこれら
遺伝子は栄養要求性マーカーとなっていること、すなわ
ちその機能が失われていること、が好ましい。一方、ベ
クター中のこれら遺伝子に対して相同な遺伝子部位の遺
伝子は、Ｓ．ポンベの栄養要求性を回復する（機能を回
復する）遺伝子であることが好ましい。
ンベの栄養要求性マーカーとなる遺伝子が好ましい。そ
のような遺伝子としては、特に限定されないが、例え
ば、Ｓ．ポンベの、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝
子、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ遺
伝子、ホスホリボシルＡＭＰシクロヒドラーゼ遺伝子が
好ましい。ベクターが組込まれるＳ．ポンベ中のこれら
遺伝子は栄養要求性マーカーとなっていること、すなわ
ちその機能が失われていること、が好ましい。一方、ベ
クター中のこれら遺伝子に対して相同な遺伝子部位の遺
伝子は、Ｓ．ポンベの栄養要求性を回復する（機能を回
復する）遺伝子であることが好ましい。
【００２４】ベクター中の上記遺伝子部位における遺伝
子としては、特に、Ｓ．ポンベの野生型遺伝子である、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ
１+）、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
（ｕｒａ４+ ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランス
フェラーゼ遺伝子（ｈｉｓ３+ ）、ホスホリボシルＡＭ
Ｐシクロヒドラーゼ遺伝子（ｈｉｓ７+ ）が好ましい。
本発明における（および本発明の）ベクターにおけるこ
の遺伝子部位を以下「相同遺伝子部位」ともいう。
子としては、特に、Ｓ．ポンベの野生型遺伝子である、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ
１+）、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
（ｕｒａ４+ ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランス
フェラーゼ遺伝子（ｈｉｓ３+ ）、ホスホリボシルＡＭ
Ｐシクロヒドラーゼ遺伝子（ｈｉｓ７+ ）が好ましい。
本発明における（および本発明の）ベクターにおけるこ
の遺伝子部位を以下「相同遺伝子部位」ともいう。
【００２５】本発明における「ベクター構築の過程にお
いて必要とした、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で機能する複
製開始領域」とは、前記のような複製開始領域をいう。
すなわち、Ｓ．ポンベ以外の細胞とは大腸菌などの遺伝
子工学的に扱いやすい細胞をいい、その細胞中で組込み
型ベクターの構築を行う際に必須である複製開始領域を
いう。ベクター構築のために実際的に遺伝子工学におい
て使用されている細胞としては大腸菌がほぼ唯一であ
り、かつ大腸菌中での複製のためにベクターに存在させ
る複製開始領域は「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が
ほぼ唯一と認められる。以下の説明では、この大腸菌の
複製開始領域を例として本発明を説明する。また、この
複製開始領域を以下単に「複製開始領域」ともいう。
いて必要とした、Ｓ．ポンベ以外の細胞中で機能する複
製開始領域」とは、前記のような複製開始領域をいう。
すなわち、Ｓ．ポンベ以外の細胞とは大腸菌などの遺伝
子工学的に扱いやすい細胞をいい、その細胞中で組込み
型ベクターの構築を行う際に必須である複製開始領域を
いう。ベクター構築のために実際的に遺伝子工学におい
て使用されている細胞としては大腸菌がほぼ唯一であ
り、かつ大腸菌中での複製のためにベクターに存在させ
る複製開始領域は「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が
ほぼ唯一と認められる。以下の説明では、この大腸菌の
複製開始領域を例として本発明を説明する。また、この
複製開始領域を以下単に「複製開始領域」ともいう。
【００２６】上記発現カセットおよび相同遺伝子部位を
有しかつ複製開始領域を有しない、本発明における（お
よび本発明の）ベクターを以下「本組込み型ベクター」
という。本組込み型ベクターは上記発現カセット、相同
遺伝子部位および複製開始領域を有するベクターから複
製開始領域を除くことにより得られる。以下この複製開
始領域を有するベクターを「本前駆ベクター」という。
本前駆ベクターは染色体組込み型ではない（Ｓ．ポンベ
の染色体外に導入する）発現ベクターと同様の方法で構
築しうる。そのような発現ベクターが相同遺伝子部位を
有しないものである場合は発現ベクターの構築過程で相
同遺伝子部位を導入して本前駆ベクターを構築すること
ができる。
有しかつ複製開始領域を有しない、本発明における（お
よび本発明の）ベクターを以下「本組込み型ベクター」
という。本組込み型ベクターは上記発現カセット、相同
遺伝子部位および複製開始領域を有するベクターから複
製開始領域を除くことにより得られる。以下この複製開
始領域を有するベクターを「本前駆ベクター」という。
本前駆ベクターは染色体組込み型ではない（Ｓ．ポンベ
の染色体外に導入する）発現ベクターと同様の方法で構
築しうる。そのような発現ベクターが相同遺伝子部位を
有しないものである場合は発現ベクターの構築過程で相
同遺伝子部位を導入して本前駆ベクターを構築すること
ができる。
【００２７】本前駆ベクターの構築に適用しうる発現ベ
クターやその構築方法としては、特に限定されないが、
Ｓ．ポンベの形質転換に使用されるものが適当である。
特に、前記特開平５−１５３８０、特開平７−１６３３
７３、ＷＯ９６／２３８９０、特開平１０−２３４３７
５などに記載された発現ベクターやその構築方法を適用
して本前駆ベクターを構築することが好ましい。本前駆
ベクターを構築後そこから通常の遺伝子工学的手法で複
製開始領域を削除することにより本組込み型ベクターを
得ることができる。
クターやその構築方法としては、特に限定されないが、
Ｓ．ポンベの形質転換に使用されるものが適当である。
特に、前記特開平５−１５３８０、特開平７−１６３３
７３、ＷＯ９６／２３８９０、特開平１０−２３４３７
５などに記載された発現ベクターやその構築方法を適用
して本前駆ベクターを構築することが好ましい。本前駆
ベクターを構築後そこから通常の遺伝子工学的手法で複
製開始領域を削除することにより本組込み型ベクターを
得ることができる。
【００２８】本発明において本組込み型ベクターとは環
状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するものをい
う。組込み型ベクターを染色体に組込むためには線状Ｄ
ＮＡ構造を有するベクターを細胞に導入するする必要が
ある。また、上記構築方法で得られる組込み型ベクター
は通常環状ＤＮＡ構造を有するベクターである。したが
って、通常は環状の本組込み型ベクターを得た後線状に
切り開き、線状の本組込み型ベクターをＳ．ポンベの細
胞に導入する。この際、環状の本組込み型ベクターを切
り開く切断箇所は相同遺伝子部位内である必要がある。
すなわち、切り開かれた線状の本組込み型ベクターの一
端には相同遺伝子部位の一部が存在し、他端には相同遺
伝子部位の他の一部が存在する必要がある。線状の本組
込み型ベクターがこのような構造を有するものであるか
ぎり、線状の本組込み型ベクターは環状の本組込み型ベ
クターの切り開き以外の手段で構築することもできる。
状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するものをい
う。組込み型ベクターを染色体に組込むためには線状Ｄ
ＮＡ構造を有するベクターを細胞に導入するする必要が
ある。また、上記構築方法で得られる組込み型ベクター
は通常環状ＤＮＡ構造を有するベクターである。したが
って、通常は環状の本組込み型ベクターを得た後線状に
切り開き、線状の本組込み型ベクターをＳ．ポンベの細
胞に導入する。この際、環状の本組込み型ベクターを切
り開く切断箇所は相同遺伝子部位内である必要がある。
すなわち、切り開かれた線状の本組込み型ベクターの一
端には相同遺伝子部位の一部が存在し、他端には相同遺
伝子部位の他の一部が存在する必要がある。線状の本組
込み型ベクターがこのような構造を有するものであるか
ぎり、線状の本組込み型ベクターは環状の本組込み型ベ
クターの切り開き以外の手段で構築することもできる。
【００２９】本発明者は上記構造の線状の本組込み型ベ
クターを容易に得る方法も見出した。通常の方法では環
状の本前駆ベクターから複製開始領域を除去して環状の
本組込み型ベクターを製造し、その後環状の本組込み型
ベクターを上記のように切り開く方法が用いられる。し
かし、環状の本前駆ベクターから複製開始領域を除去し
て環状の本組込み型ベクターとする操作は繁雑である。
クターを容易に得る方法も見出した。通常の方法では環
状の本前駆ベクターから複製開始領域を除去して環状の
本組込み型ベクターを製造し、その後環状の本組込み型
ベクターを上記のように切り開く方法が用いられる。し
かし、環状の本前駆ベクターから複製開始領域を除去し
て環状の本組込み型ベクターとする操作は繁雑である。
【００３０】本発明者は本前駆ベクターからの複製開始
領域を除去と線状の本組込み型ベクターの製造を１工程
で行う方法を見出した。この方法は、相同遺伝子部位の
切断箇所に（すなわち線状の本組込み型ベクターの両端
となる部分の間に）複製開始領域を存在させた環状の本
前駆ベクターを構築し、この環状の本前駆ベクターから
複製開始領域を切り取ることにより線状の本組込み型ベ
クターを得る方法である。本前駆ベクターの構築の際に
は相同遺伝子部位の遺伝子は通常機能させる必要がない
ことより、このような本前駆ベクターを容易に構築する
ことができる。
領域を除去と線状の本組込み型ベクターの製造を１工程
で行う方法を見出した。この方法は、相同遺伝子部位の
切断箇所に（すなわち線状の本組込み型ベクターの両端
となる部分の間に）複製開始領域を存在させた環状の本
前駆ベクターを構築し、この環状の本前駆ベクターから
複製開始領域を切り取ることにより線状の本組込み型ベ
クターを得る方法である。本前駆ベクターの構築の際に
は相同遺伝子部位の遺伝子は通常機能させる必要がない
ことより、このような本前駆ベクターを容易に構築する
ことができる。
【００３１】本組込み型ベクターは上記したような発現
カセットと相同遺伝子部位以外にさらに複製開始領域以
外の遺伝子を有していてもよい。例えば、複製開始領域
以外のベクター構築に使用された遺伝子を有していても
よい。そのような遺伝子としては例えばベクター選択マ
ーカーである抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺
伝子等）がある。逆に、このようなベクター構築に使用
された遺伝子を染色体組込み前に複製開始領域と同様に
除去してもよい。
カセットと相同遺伝子部位以外にさらに複製開始領域以
外の遺伝子を有していてもよい。例えば、複製開始領域
以外のベクター構築に使用された遺伝子を有していても
よい。そのような遺伝子としては例えばベクター選択マ
ーカーである抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺
伝子等）がある。逆に、このようなベクター構築に使用
された遺伝子を染色体組込み前に複製開始領域と同様に
除去してもよい。
【００３２】発現カセットにおけるプロモータとして
は、特に限定されない。しかし異種蛋白質構造遺伝子の
発現を促進する活性の高いプロモータが好ましく、その
ようなプロモータとしては前記特開平５−１５３８０、
特開平７−１６３３７３、特開平１０−２３４３７５に
記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモータがあ
る。特にＣＭＶプロモータやＳＶ４０プロモータが好ま
しい。また、異種蛋白質構造遺伝子の上流側にはＳ．ポ
ンベにおいて機能する分泌シグナル遺伝子を存在させる
こともできる。そのような分泌シグナル遺伝子として
は、前記ＷＯ９６／２３８９０に記載された分泌シグナ
ル遺伝子が好ましい。
は、特に限定されない。しかし異種蛋白質構造遺伝子の
発現を促進する活性の高いプロモータが好ましく、その
ようなプロモータとしては前記特開平５−１５３８０、
特開平７−１６３３７３、特開平１０−２３４３７５に
記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモータがあ
る。特にＣＭＶプロモータやＳＶ４０プロモータが好ま
しい。また、異種蛋白質構造遺伝子の上流側にはＳ．ポ
ンベにおいて機能する分泌シグナル遺伝子を存在させる
こともできる。そのような分泌シグナル遺伝子として
は、前記ＷＯ９６／２３８９０に記載された分泌シグナ
ル遺伝子が好ましい。
【００３３】本発明において、本組込み型ベクター中の
発現カセットの数は２個以上であってもよい。Ｓ．ポン
ベ染色体中の本組込み型ベクターが組込まれる部位が１
箇所であっても、その位置に２個以上の本組込み型ベク
ターが組込まれることがある。したがって、この場合本
組込み型ベクターが発現カセットを１個有していても染
色体に複数の発現カセットが組込まれる。本組込み型ベ
クターが発現カセットを複数有している場合はさらに多
数の発現カセットが組込まれる。また、染色体中に２以
上のベクター組込み位置がある場合にはさらに多数の発
現カセットが組込まれる。染色体中の発現カセットの数
が多いほど異種蛋白質の発現はより効率的である。
発現カセットの数は２個以上であってもよい。Ｓ．ポン
ベ染色体中の本組込み型ベクターが組込まれる部位が１
箇所であっても、その位置に２個以上の本組込み型ベク
ターが組込まれることがある。したがって、この場合本
組込み型ベクターが発現カセットを１個有していても染
色体に複数の発現カセットが組込まれる。本組込み型ベ
クターが発現カセットを複数有している場合はさらに多
数の発現カセットが組込まれる。また、染色体中に２以
上のベクター組込み位置がある場合にはさらに多数の発
現カセットが組込まれる。染色体中の発現カセットの数
が多いほど異種蛋白質の発現はより効率的である。
【００３４】本組込み型ベクター中の発現カセットの数
は、特に限定されない。しかし、あまりに多数の場合は
本組込み型ベクターが大きくなりすぎて組込み効率が低
下するおそれが予想され、本組込み型ベクター中の発現
カセットの数は２０個以下が好ましく１０個以下が特に
好ましい。また、Ｓ．ポンベ染色体中に組込まれる全発
現カセットの数も特に限定されない。しかしあまりに多
すぎると発現効率の低下も予想されることより、５０個
以下が好ましく、特に３０個以下が好ましい。
は、特に限定されない。しかし、あまりに多数の場合は
本組込み型ベクターが大きくなりすぎて組込み効率が低
下するおそれが予想され、本組込み型ベクター中の発現
カセットの数は２０個以下が好ましく１０個以下が特に
好ましい。また、Ｓ．ポンベ染色体中に組込まれる全発
現カセットの数も特に限定されない。しかしあまりに多
すぎると発現効率の低下も予想されることより、５０個
以下が好ましく、特に３０個以下が好ましい。
【００３５】相同遺伝子部位の遺伝子としては、特に
Ｓ．ポンベの野生型遺伝子である、イソプロピルリンゴ
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１+ ）と相同の遺伝
子が好ましい。このイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子はＳ．ポンベの染色体中に１箇所存在する。
しかし、本組込み型ベクターはこの部位に多数組込まれ
得るため、異種蛋白質の発現効率の高い形質転換Ｓ．ポ
ンベを得ることができる。形質転換されるＳ．ポンベと
しては形質転換体選択のために栄養要求性マーカーを有
するＳ．ポンベが好ましい。例えば、イソプロピルリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能が失われたロイシン
要求性のＳ．ポンベ株（例えばｌｅｕ１−３２変異株）
に上記野生型イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子（ｌｅｕ１+ ）を相同遺伝子部位とする組込み型ベ
クターを導入することによりロイシン要求性が消失する
ことから、この栄養要求性の変化を利用して形質転換体
を選択することができる。
Ｓ．ポンベの野生型遺伝子である、イソプロピルリンゴ
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１+ ）と相同の遺伝
子が好ましい。このイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子はＳ．ポンベの染色体中に１箇所存在する。
しかし、本組込み型ベクターはこの部位に多数組込まれ
得るため、異種蛋白質の発現効率の高い形質転換Ｓ．ポ
ンベを得ることができる。形質転換されるＳ．ポンベと
しては形質転換体選択のために栄養要求性マーカーを有
するＳ．ポンベが好ましい。例えば、イソプロピルリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の機能が失われたロイシン
要求性のＳ．ポンベ株（例えばｌｅｕ１−３２変異株）
に上記野生型イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子（ｌｅｕ１+ ）を相同遺伝子部位とする組込み型ベ
クターを導入することによりロイシン要求性が消失する
ことから、この栄養要求性の変化を利用して形質転換体
を選択することができる。
【００３６】以下に後述の例に記載した本発明の実施例
等の概略を説明する。まず、公知のｌｅｕ１+ 遺伝子を
入手し、既存の発現ベクター（前記複製開始領域「ｏｒ
ｉ」を有するベクター）に組込んだ。得られた組込み型
ベクターを用い、Ｓ．ポンベのｌｅｕ１−３２変異株
（ロイシン要求性株）を形質転換し、ロイシン非要求性
の株をスクリーニングすることによって目的異種蛋白質
構造遺伝子を含む発現カセットを組込んだ形質転換体を
取得した。その結果、安定な組込み体が得られたが、目
的異種蛋白質の生産レベルは低かった。同時に、導入し
た組込み型ベクターがプラスミドの形で存在する株が多
数得られ、染色体に多くの発現カセットを持った株の取
得は比較的困難であった（例１、例２参照）。
等の概略を説明する。まず、公知のｌｅｕ１+ 遺伝子を
入手し、既存の発現ベクター（前記複製開始領域「ｏｒ
ｉ」を有するベクター）に組込んだ。得られた組込み型
ベクターを用い、Ｓ．ポンベのｌｅｕ１−３２変異株
（ロイシン要求性株）を形質転換し、ロイシン非要求性
の株をスクリーニングすることによって目的異種蛋白質
構造遺伝子を含む発現カセットを組込んだ形質転換体を
取得した。その結果、安定な組込み体が得られたが、目
的異種蛋白質の生産レベルは低かった。同時に、導入し
た組込み型ベクターがプラスミドの形で存在する株が多
数得られ、染色体に多くの発現カセットを持った株の取
得は比較的困難であった（例１、例２参照）。
【００３７】次に、大腸菌の複製開始領域を含まない組
込み型ベクターを構築した。すなわち、ｌｅｕ１+ 遺伝
子内の制限酵素ＳｐｌＩ消化部位に複製開始領域を移動
させた組込み型ベクターを作製した。得られた組込み型
ベクターを用い、その複製開始領域を切り取って線状の
組込み型ベクターを製造し、そのベクターでＳ．ポンベ
のｌｅｕ１−３２変異株を形質転換し、ロイシン非要求
性の株をスクリーニングすることによって目的異種蛋白
質構造遺伝子の発現カセットを組込んだ形質転換体を取
得した。その結果、安定な組込み体でありかつ、目的異
種蛋白質の生産レベルが高い株、すなわち染色体外型発
現ベクターを用いた生産時のレベルと同等またはそれを
凌駕する生産レベルを示す株が得られた（例３〜６参
照）。
込み型ベクターを構築した。すなわち、ｌｅｕ１+ 遺伝
子内の制限酵素ＳｐｌＩ消化部位に複製開始領域を移動
させた組込み型ベクターを作製した。得られた組込み型
ベクターを用い、その複製開始領域を切り取って線状の
組込み型ベクターを製造し、そのベクターでＳ．ポンベ
のｌｅｕ１−３２変異株を形質転換し、ロイシン非要求
性の株をスクリーニングすることによって目的異種蛋白
質構造遺伝子の発現カセットを組込んだ形質転換体を取
得した。その結果、安定な組込み体でありかつ、目的異
種蛋白質の生産レベルが高い株、すなわち染色体外型発
現ベクターを用いた生産時のレベルと同等またはそれを
凌駕する生産レベルを示す株が得られた（例３〜６参
照）。
【００３８】
【実施例】以下本発明を例をもって具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されない。なお、例１、
２は参考例であり、例３〜６は実施例である。また、各
例において、構築したベクターを増幅する段階は大腸菌
ＤＨ５株（東洋紡社製）を用いた（例３に具体的に記
載、他の例では省略）。
が、本発明はこれらの例に限定されない。なお、例１、
２は参考例であり、例３〜６は実施例である。また、各
例において、構築したベクターを増幅する段階は大腸菌
ＤＨ５株（東洋紡社製）を用いた（例３に具体的に記
載、他の例では省略）。
【００３９】［例１］（プラスミド型生産系の構築） クロンテック社より購入したオワンクラゲ由来緑色蛍光
蛋白質変異体（以下、ＥＧＦＰという）遺伝子を含むベ
クターｐＥＧＦＰ−１をテンプレートとして、開始コド
ンから終止コドンまでの７２０ｂｐの領域をＰＣＲ増幅
した。得られた断片の末端を５’−末端側のプライマに
付加したＮｃｏＩ−タグ、３’−末端側のプライマに付
加したＨｉｎｄＩＩＩ−タグを用いてトリミングし、マ
ルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ５（特開平７−１
６３３７３記載のマルチクローニングベクターｐＴＬ２
Ｍから、３’−ＵＴＲ下流に存在したポリｄＡ配列なら
びにＳＶ４０ターミネータ領域を除いたもので、大腸菌
の複製領域を含む。４６５７ｂｐ）のＡｆｌＩＩＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ間に挿入し、組換えベクターｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰを得た。
蛋白質変異体（以下、ＥＧＦＰという）遺伝子を含むベ
クターｐＥＧＦＰ−１をテンプレートとして、開始コド
ンから終止コドンまでの７２０ｂｐの領域をＰＣＲ増幅
した。得られた断片の末端を５’−末端側のプライマに
付加したＮｃｏＩ−タグ、３’−末端側のプライマに付
加したＨｉｎｄＩＩＩ−タグを用いてトリミングし、マ
ルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ５（特開平７−１
６３３７３記載のマルチクローニングベクターｐＴＬ２
Ｍから、３’−ＵＴＲ下流に存在したポリｄＡ配列なら
びにＳＶ４０ターミネータ領域を除いたもので、大腸菌
の複製領域を含む。４６５７ｂｐ）のＡｆｌＩＩＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ間に挿入し、組換えベクターｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰを得た。
【００４０】得られたｐＴＬ２ＥＧＦＰを用いて特開平
７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換体
ＡＳＰ１７０株を作製し、ＹＰＤ１００培地（バクトイ
ーストエキス（ディフコ社製）１ｗｔ％、バクトペプト
ン（ディフコ社製）２ｗｔ％、グルコース（和光純薬社
製）２ｗｔ％をそれぞれ含み、かつ１００μｇ／Ｌのジ
ェネティシン（ライフテクノロジー社製）を含有する液
体培地）で培養し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換体
ＡＳＰ１７０株を作製し、ＹＰＤ１００培地（バクトイ
ーストエキス（ディフコ社製）１ｗｔ％、バクトペプト
ン（ディフコ社製）２ｗｔ％、グルコース（和光純薬社
製）２ｗｔ％をそれぞれ含み、かつ１００μｇ／Ｌのジ
ェネティシン（ライフテクノロジー社製）を含有する液
体培地）で培養し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
【００４１】その結果、１００μＬ培養物あたり１４３
ＣＵ（コロナユニット、コロナ電気社製マイクロプレー
トリーダーＭＴＰ−３２で測定した５９０ｎｍ励起光に
よる６３０ｎｍの蛍光値）の生産量、２８６ＣＵ／ｇの
生産効率（１ｍＬ培養物の示す蛍光値を乾燥菌体重量あ
たりに換算したもの）を示した。この生産量ならびに生
産効率はＹＰＤ１００培地下では５０世代継代後も安定
であったが、ＹＰＤ培地（バクトイーストエキス（ディ
フコ社製）１ｗｔ％、バクトペプトン（ディフコ社製）
２ｗｔ％、グルコース（和光純薬社製）２ｗｔ％をそれ
ぞれ含む液体培地）下では２６ＣＵの生産量、５３．２
ＣＵ／ｇの生産効率にとどまった。
ＣＵ（コロナユニット、コロナ電気社製マイクロプレー
トリーダーＭＴＰ−３２で測定した５９０ｎｍ励起光に
よる６３０ｎｍの蛍光値）の生産量、２８６ＣＵ／ｇの
生産効率（１ｍＬ培養物の示す蛍光値を乾燥菌体重量あ
たりに換算したもの）を示した。この生産量ならびに生
産効率はＹＰＤ１００培地下では５０世代継代後も安定
であったが、ＹＰＤ培地（バクトイーストエキス（ディ
フコ社製）１ｗｔ％、バクトペプトン（ディフコ社製）
２ｗｔ％、グルコース（和光純薬社製）２ｗｔ％をそれ
ぞれ含む液体培地）下では２６ＣＵの生産量、５３．２
ＣＵ／ｇの生産効率にとどまった。
【００４２】［例２］（従来法による組込み型生産系の
構築） 公知のプラスミドｐＹＫ３２０（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，１４，３７５（１９８８））を制限酵素ＡｃｃＩ
（東洋紡社製）で消化し、ｌｅｕ１+ を含む約３．５ｋ
ｂｐの断片をゲルから切り出し、ガラスパウダー法（宝
酒造社製ＥＡＳＹＴＲＡＰ）で精製した。この断片を組
換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰの制限酵素Ｂｓｔ１１０
７Ｉ（宝酒造社製）消化断片（約５．０ｋｂｐ）とライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲーショ
ン（連結）した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換して、目的
の組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲ（９０４７ｂ
ｐ）を得た。制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）で消化し
た組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲの１μｇを用
いて特開平７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの
形質転換体ＡＳＰ２１８株およびＡＳＰ２１９株を作製
し、ＹＰＤ培地で培養した際のＥＧＦＰの生産量を調べ
た。
構築） 公知のプラスミドｐＹＫ３２０（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，１４，３７５（１９８８））を制限酵素ＡｃｃＩ
（東洋紡社製）で消化し、ｌｅｕ１+ を含む約３．５ｋ
ｂｐの断片をゲルから切り出し、ガラスパウダー法（宝
酒造社製ＥＡＳＹＴＲＡＰ）で精製した。この断片を組
換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰの制限酵素Ｂｓｔ１１０
７Ｉ（宝酒造社製）消化断片（約５．０ｋｂｐ）とライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲーショ
ン（連結）した。大腸菌ＤＨ５株を形質転換して、目的
の組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲ（９０４７ｂ
ｐ）を得た。制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）で消化し
た組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲの１μｇを用
いて特開平７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの
形質転換体ＡＳＰ２１８株およびＡＳＰ２１９株を作製
し、ＹＰＤ培地で培養した際のＥＧＦＰの生産量を調べ
た。
【００４３】その結果、１１ＣＵの生産量、２４．３Ｃ
Ｕ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生産効
率は５０世代継代後も安定であった。さらに生産量の多
いクローンの取得を試みたが、プラスミドとして菌体内
に滞留（パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム
解析により確認）するベクターを持つ株が優先的に採取
されるため、より高い生産量を示しかつ５０世代継代後
も安定な株を取得することはできなかった。
Ｕ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生産効
率は５０世代継代後も安定であった。さらに生産量の多
いクローンの取得を試みたが、プラスミドとして菌体内
に滞留（パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム
解析により確認）するベクターを持つ株が優先的に採取
されるため、より高い生産量を示しかつ５０世代継代後
も安定な株を取得することはできなかった。
【００４４】［例３］（組込み型生産系の構築） 例２で構築したｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲを制限酵素Ｓｐ
ｌＩで消化し、別にＰＣＲ増幅によって得た両端にＳｐ
ｌＩ- タグを付加したｐＢＲ３２２由来の大腸菌の複製
開始起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む領域を挿入
し、大腸菌ＤＨ５株を用いて組換えベクターｐＴＬ２Ｅ
ＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）（１１．７ｋｂｐ）を得た。
ｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）を制限酵素Ａｃｃ
Ｉで消化しさらに末端を平滑化（宝酒造社製ＤＮＡ Ｂ
ｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ使用）した断片と、ｐＴＬ２Ｅ
ＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）を制限酵素ＨｐａＩ（宝酒造
社製）で部分消化しかつ制限酵素Ｂｓｔ１１０７Ｉで完
全消化して得られた断片を連結し、大腸菌ＤＨ５株を用
いて組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬＲＦ（９．
１ｋｂｐ）を得た。ｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬＲＦを制限
酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）およびＡｃｃＩＩＩ（東洋
紡社製）で二重消化して得られた断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−ＬＲを制限酵素ＳｐｅＩおよびＡｃｃＩＩＩで二
重消化して得られた断片を連結し、大腸菌ＤＨ５株を用
いて組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬ（９０４８
ｂｐ）を得た。
ｌＩで消化し、別にＰＣＲ増幅によって得た両端にＳｐ
ｌＩ- タグを付加したｐＢＲ３２２由来の大腸菌の複製
開始起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む領域を挿入
し、大腸菌ＤＨ５株を用いて組換えベクターｐＴＬ２Ｅ
ＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）（１１．７ｋｂｐ）を得た。
ｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）を制限酵素Ａｃｃ
Ｉで消化しさらに末端を平滑化（宝酒造社製ＤＮＡ Ｂ
ｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ使用）した断片と、ｐＴＬ２Ｅ
ＧＦＰ−ＬＲ（ＯＡＩＦ）を制限酵素ＨｐａＩ（宝酒造
社製）で部分消化しかつ制限酵素Ｂｓｔ１１０７Ｉで完
全消化して得られた断片を連結し、大腸菌ＤＨ５株を用
いて組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬＲＦ（９．
１ｋｂｐ）を得た。ｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬＲＦを制限
酵素ＳｐｅＩ（宝酒造社製）およびＡｃｃＩＩＩ（東洋
紡社製）で二重消化して得られた断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−ＬＲを制限酵素ＳｐｅＩおよびＡｃｃＩＩＩで二
重消化して得られた断片を連結し、大腸菌ＤＨ５株を用
いて組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬ（９０４８
ｂｐ）を得た。
【００４５】制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造社製）で消化し
た組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬを１μｇ用い
て特開平７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの形
質転換を行い、形質転換体ＡＳＰ２８５株５種類を得
た。これらをＹＰＤ培地で培養し、ＥＧＦＰの生産量を
調べた。
た組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬを１μｇ用い
て特開平７−１６３３７３記載の方法でＳ．ポンベの形
質転換を行い、形質転換体ＡＳＰ２８５株５種類を得
た。これらをＹＰＤ培地で培養し、ＥＧＦＰの生産量を
調べた。
【００４６】その結果、生産量の少ないものから、生産
量と生産効率の組合わせが、１２ＣＵと２８．０ＣＵ／
ｇ、２５ＣＵと５１．８ＣＵ／ｇ、４０ＣＵと７８．１
ＣＵ／ｇ、５９ＣＵと１１５．７ＣＵ／ｇ、８１ＣＵと
１６７．９ＣＵ／ｇであった。これら段階的な生産量な
らびに生産効率はすなわち１コピーの組込みにとどまら
ず、多コピーの組込み体が得られたことを示している。
またこの生産量と生産効率は５０世代継代後も安定であ
った。さらに、パルスフィールドゲル電気泳動法による
ゲノム解析によりＥＧＦＰは染色体に複数個存在してい
ることを確認した。
量と生産効率の組合わせが、１２ＣＵと２８．０ＣＵ／
ｇ、２５ＣＵと５１．８ＣＵ／ｇ、４０ＣＵと７８．１
ＣＵ／ｇ、５９ＣＵと１１５．７ＣＵ／ｇ、８１ＣＵと
１６７．９ＣＵ／ｇであった。これら段階的な生産量な
らびに生産効率はすなわち１コピーの組込みにとどまら
ず、多コピーの組込み体が得られたことを示している。
またこの生産量と生産効率は５０世代継代後も安定であ
った。さらに、パルスフィールドゲル電気泳動法による
ゲノム解析によりＥＧＦＰは染色体に複数個存在してい
ることを確認した。
【００４７】［例４］（二重組込み型生産系の構築） 例３に示した組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−ＸＬを
制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧＦ
Ｐ−ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重消化
しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベクタ
ーｐＴＬ２ＥＧＦＰ−２ＸＬ（１０７９０ｂｐ）を得
た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴＬ
２ＥＧＦＰ−２ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３３
７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質転
換体ＡＳＰ３５６株を得た。この株をＹＰＤ培地で培養
し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧＦ
Ｐ−ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重消化
しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベクタ
ーｐＴＬ２ＥＧＦＰ−２ＸＬ（１０７９０ｂｐ）を得
た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴＬ
２ＥＧＦＰ−２ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３３
７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質転
換体ＡＳＰ３５６株を得た。この株をＹＰＤ培地で培養
し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
【００４８】その結果、５９ＣＵの生産量、１１８．２
ＣＵ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生産
効率はすなわち二重に重複した発現カセットが１コピー
の組込みにとどまらず、多コピーの組込み体が得られた
ことを示し、また５０世代継代後も安定であった。
ＣＵ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生産
効率はすなわち二重に重複した発現カセットが１コピー
の組込みにとどまらず、多コピーの組込み体が得られた
ことを示し、また５０世代継代後も安定であった。
【００４９】［例５］（四重組込み型生産系の構築） 例４に示した組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−２ＸＬ
を制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二
重消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−２ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベ
クターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−４ＸＬ（１４２７ｂｐ）を得
た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴＬ
２ＥＧＦＰ−４ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３３
７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質転
換体ＡＳＰ３５７株を得た。この株をＹＰＤ培地で培養
し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
を制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二
重消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−２ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベ
クターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−４ＸＬ（１４２７ｂｐ）を得
た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴＬ
２ＥＧＦＰ−４ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３３
７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質転
換体ＡＳＰ３５７株を得た。この株をＹＰＤ培地で培養
し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
【００５０】その結果、１０３ＣＵの生産量、１９２．
５ＣＵ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生
産効率はすなわち四重に重複した発現カセットが１コピ
ーの組込みにとどまらず、多コピーの組込み体が得られ
たことを示し、また５０世代継代後も安定であった。
５ＣＵ／ｇの生産効率を示した。この生産量ならびに生
産効率はすなわち四重に重複した発現カセットが１コピ
ーの組込みにとどまらず、多コピーの組込み体が得られ
たことを示し、また５０世代継代後も安定であった。
【００５１】［例６］（八重組込み型生産系の構築） 例５に示した組換えベクターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−４ＸＬ
を制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二
重消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−４ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベ
クターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−８ＸＬ（２１２４２ｂｐ）を
得た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴ
Ｌ２ＥＧＦＰ−８ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３
３７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質
転換体ＡＳＰ３５８株２種類得た。これらの株をＹＰＤ
培地で培養し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
を制限酵素ＰｖｕＩ（宝酒造社製）およびＳｐｅＩで二
重消化しさらに末端を平滑化した断片と、ｐＴＬ２ＥＧ
ＦＰ−４ＸＬを制限酵素ＰｖｕＩおよびＡｃｃＩで二重
消化しさらに末端を平滑化した断片を連結し、組換えベ
クターｐＴＬ２ＥＧＦＰ−８ＸＬ（２１２４２ｂｐ）を
得た。制限酵素ＳｐｌＩで消化した組換えベクターｐＴ
Ｌ２ＥＧＦＰ−８ＸＬを１μｇ用いて特開平７−１６３
３７３記載の方法でＳ．ポンベの形質転換を行い、形質
転換体ＡＳＰ３５８株２種類得た。これらの株をＹＰＤ
培地で培養し、ＥＧＦＰの生産量を調べた。
【００５２】その結果、生産量と生産効率がそれぞれ９
９ＣＵと２０２．５ＣＵ／ｇ、１７３ＣＵと３２９．８
ＣＵ／ｇであった。この生産量ならびに生産効率はすな
わち八重に重複した発現カセットが１コピーの組込みに
とどまらず、多コピーの組込み体が得られたことを示
し、例１に示すプラスミド型（染色体型）生産系を凌駕
する値を得た。また５０世代継代後もこれらの値は安定
であった。
９ＣＵと２０２．５ＣＵ／ｇ、１７３ＣＵと３２９．８
ＣＵ／ｇであった。この生産量ならびに生産効率はすな
わち八重に重複した発現カセットが１コピーの組込みに
とどまらず、多コピーの組込み体が得られたことを示
し、例１に示すプラスミド型（染色体型）生産系を凌駕
する値を得た。また５０世代継代後もこれらの値は安定
であった。
【００５３】
【発明の効果】大腸菌の複製開始領域を有しない組込み
型ベクターをＳ．ポンベの染色体に組込むことにより、
ベクターが高い効率で染色体に組込まれる。また、発現
カセットを複数有する組込み型ベクターを組込むことに
より、より多数の発現カセットを組込むことができる。
その結果、異種蛋白質の生産量、生産効率を著しく高め
ることができた。
型ベクターをＳ．ポンベの染色体に組込むことにより、
ベクターが高い効率で染色体に組込まれる。また、発現
カセットを複数有する組込み型ベクターを組込むことに
より、より多数の発現カセットを組込むことができる。
その結果、異種蛋白質の生産量、生産効率を著しく高め
ることができた。
Claims (14)
- 【請求項１】シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染色体
に、異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含む発現カ
セットおよび染色体に対して相同的組換えを行わせる遺
伝子部位を有するベクターであって、かつベクター構築
の過程において必要とした、シゾサッカロミセス・ポン
ベ以外の細胞中で機能する複製開始領域を有しないベク
ターを、相同的組換え法で組込むことを特徴とする、シ
ゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法。 - 【請求項２】複製開始領域が大腸菌の複製開始領域であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】複製開始領域が、シゾサッカロミセス・ポ
ンベの染色体に対して相同的組換えを行わせる遺伝子部
位の中に存在していた、請求項１または２に記載の方
法。 - 【請求項４】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセット、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染
色体に対して相同的組換えを行わせる遺伝子部位および
大腸菌の複製開始領域を有する相同的組換えベクターを
大腸菌を使用して構築し、次いでそのベクターを大腸菌
の複製開始領域を除いてシゾサッカロミセス・ポンベの
染色体に組込むことを特徴とする、シゾサッカロミセス
・ポンベの形質転換方法。 - 【請求項５】複製開始領域が、シゾサッカロミセス・ポ
ンベの染色体に対して相同的組換えを行わせる遺伝子部
位の中に存在する、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】染色体に対して相同的組換えを行わせる遺
伝子部位が、シゾサッカロミセス・ポンベのイソプロピ
ルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、オロチジンリン酸
デカルボキシラーゼ遺伝子、ヒスチジノールリン酸アミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子またはホスホリボシルＡＭ
Ｐシクロヒドラーゼ遺伝子と相同の遺伝子部位である、
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】ベクターが２以上の発現カセットを有す
る、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】異種蛋白質構造遺伝子とプロモータとを含
む発現カセットおよびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）
の染色体に対して相同的組換えを行わせる遺伝子部位を
有するベクターであって、かつベクター構築の過程にお
いて必要とした、シゾサッカロミセス・ポンベ以外の細
胞中で機能する複製開始領域を有しないベクターである
ことを特徴とする、相同的組換え法でシゾサッカロミセ
ス・ポンベの染色体に異種蛋白質構造遺伝子を導入する
ためのベクター。 - 【請求項９】複製開始領域が大腸菌の複製開始領域であ
る、請求項８に記載のベクター。 - 【請求項１０】染色体に対して相同的組換えを行わせる
遺伝子部位が、シゾサッカロミセス・ポンベのイソプロ
ピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、オロチジンリン
酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ヒスチジノールリン酸ア
ミノトランスフェラーゼ遺伝子またはホスホリボシルＡ
ＭＰシクロヒドラーゼ遺伝子と相同の遺伝子部位であ
る、請求項８または９に記載のベクター。 - 【請求項１１】大腸菌染色体の複製開始領域が、シゾサ
ッカロミセス・ポンベの染色体に対して相同的組換えを
行わせる遺伝子部位の中に存在する、請求項８、９また
は１０に記載のベクター。 - 【請求項１２】ベクターが２以上の発現カセットを有す
る、請求項８、９、１０または１１に記載のベクター。 - 【請求項１３】請求項１〜７のいずれかに記載の方法で
得られた形質転換されたシゾサッカロミセス・ポンベ。 - 【請求項１４】請求項１３に記載の形質転換されたシゾ
サッカロミセス・ポンベを培養し、産生された異種蛋白
質を取得することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07434299A JP4305998B2 (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法 |
| US09/515,326 US6235499B1 (en) | 1999-03-18 | 2000-02-29 | Method for transforming schizosaccharomyces pombe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07434299A JP4305998B2 (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000262284A true JP2000262284A (ja) | 2000-09-26 |
| JP4305998B2 JP4305998B2 (ja) | 2009-07-29 |
Family
ID=13544366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07434299A Expired - Lifetime JP4305998B2 (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6235499B1 (ja) |
| JP (1) | JP4305998B2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002101038A1 (fr) * | 2001-05-29 | 2002-12-19 | Asahi Glass Company, Limited | Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere |
| WO2010038802A1 (ja) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | 旭硝子株式会社 | 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 |
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| JP2010158256A (ja) * | 2010-04-23 | 2010-07-22 | Asahi Glass Co Ltd | 酵母の形質転換方法 |
| WO2010087344A1 (ja) | 2009-01-27 | 2010-08-05 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2011021629A1 (ja) | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
| WO2012060389A1 (ja) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法 |
| WO2012128260A1 (ja) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 |
| WO2014030644A1 (ja) | 2012-08-20 | 2014-02-27 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター |
| WO2015076393A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0672753B1 (en) | 1993-10-05 | 2008-01-02 | Asahi Glass Company Ltd. | Multicloning vector, expression vector, and production of foreign protein with expression vector |
| JP3730256B2 (ja) | 1995-02-03 | 2005-12-21 | 旭硝子株式会社 | 分泌シグナル遺伝子およびそれを有する発現ベクター |
-
1999
- 1999-03-18 JP JP07434299A patent/JP4305998B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-29 US US09/515,326 patent/US6235499B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7723098B2 (en) | 2001-05-29 | 2010-05-25 | Asahi Glass Company, Limited | Method of constructing host and method of producing heterologous protein |
| WO2002101038A1 (fr) * | 2001-05-29 | 2002-12-19 | Asahi Glass Company, Limited | Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere |
| US8329448B2 (en) | 2005-08-03 | 2012-12-11 | Asahi Glass Company, Limited | Yeast host, transformant and method for producing heterologous proteins |
| EP2182060A1 (en) | 2005-08-03 | 2010-05-05 | Asahi Glass Company, Limited | Transformed yeast host cells and method of producing foreign protein |
| US7790450B2 (en) | 2005-08-29 | 2010-09-07 | Asahi Glass Company, Limited | Expression vector, a transformant carrying the same and a method for producing heterologous protein |
| WO2010038802A1 (ja) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | 旭硝子株式会社 | 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにｏ－グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 |
| WO2010087344A1 (ja) | 2009-01-27 | 2010-08-05 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 |
| JPWO2010087344A1 (ja) * | 2009-01-27 | 2012-08-02 | 旭硝子株式会社 | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 |
| WO2011021629A1 (ja) | 2009-08-21 | 2011-02-24 | 旭硝子株式会社 | 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 |
| US9284561B2 (en) | 2009-08-21 | 2016-03-15 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
| JP2010158256A (ja) * | 2010-04-23 | 2010-07-22 | Asahi Glass Co Ltd | 酵母の形質転換方法 |
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