JPH022380A - 酵母発見系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に関する。

特に、本発明は新規な酵母発現系に関する。

［従来の技術］ 酵母では、遺伝子の発現は、構造領域の上流にあるプロ
モーターによりまたはコード領域自身により少なくとも
部分的に調節される。幾つかの酵母プロモーターが単離
されており、そして酵母において外来遺伝子産物を発現
させるのに利用されている。該プロモーターは、それら
が正常に発現せしめる遺伝子産物の特質を有する。例え
ば、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）は本質的な
酵素であり、それ故そのプロモーターは構成的であるけ
れども、グルコースのような発酵性炭素源の存在下では
いくらか高められる（Ｍｅｌ　ｌｏｒら、１９８３）。

ＰＧＫプロモーターは、酵母中で様々な異種性ポリペプ
チドを発現させるのに利用されている（Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎら、１９８６　）。

異種性ポリペプチドの発現を調節することは、特にその
生産物が細胞に対して有害であるかまたは一度合成され
てすぐに分解される場合には、操！ 作おいて有益であるかもしれない。これらの状況下では
誘導可能な遺伝子発現系が所望される。酵母の中で最も
よく研究される制御系は、ガラクトース異化酵素の発現
を調節するものである。

ガラクトースの不在下では、ＧＡＬＩ、７および１０遺
伝子によりコードされる該異化酵素は合成されない。ガ
ラクトースの添加に応じてそしてグルコース不在下にお
いては、これらの遺伝子が迅速に活性化され、そして転
写レベルが非誘導レベルより１　、０００倍高（なる（
Ｈｏｐｐｅｒら、１９７８　。

ＳＬ、　ＪｏｈｎおよびＤａｖｉｓ、　１９７９）　、
その活性化は、ＧＡＬ４遺伝子によりコードされるｌｆ
ｌ　ｆ’ｆｆタンパク質によりもたらされる。ガラクト
ースの存在でＣＡＬ４が該構造遺伝子の上流に結合しそ
うして発現を促進せしめることを可能にする。この結合
部位は、上流活性化配列またはＵＡＳと称される（Ｇｕ
ａｒａｎｔｅら、１９Ｂ２）　。該異化遺伝子の染色体
地図を第１図に示す（Ｓｔ、ＪｏｈｎおよびＤａｖｉｓ
、　１９８１　；Ｓｔ、　Ｊｏｈｎら、１９８１）　。

単一のＵＡＳがＧＡＬＬおよびＧＡＬＩＯの分岐（ｄｉ
ｖｅｒｇｅｎｔ）転写を調節する。

プロモーターの在来ＵＡＳのＧＡＬＩＯＵＡＳによる置
換がそのプロモーターにガラクトース適応性を付与する
ことが示されている（Ｇｕａｒａｎｔｅら、１９８２）
。ガラクトースで誘導可能な、ＰＧＫ：ＧＡＬＩＯハイ
ブリッドプロモーターの構成において使用されるＧＡＬ
ＩＯＵＡＳがどちらの方向においても機能すること、即
ちＧＡＬＩＯＵＡＳを含む線状のＤＮＡ断片が在来のＰ
ＧＫ　　ＵＡＳの代わりにされてもよくそして該ＤＮＡ
断片の配向にかかわらずガラクトース制御を付与するこ
と（本発明者らの初期の同時係属出願ＥＰ−Ａ−２６８
０６７を参照のこと）もわかっている。

さらに、（ＧＡＬＩＯプロモーター−ＵＡＳ−ＧＡＬＩ
プロモーター）本体が２つの外来コード配列と一緒にそ
してその間にはさんで使用するのに適当であるポータプ
ルな分岐性調節要素であるということは、証明されては
いないが示唆されている（Ｅ　Ｐ−Ａ−１３２３０９）
。まだ示されておらずそして予想され得なかったことは
、ＧＡＬＬＵＡＳそれ自体が、たとえそれの両側の各プ
ロモーターがそれ本来のプロモーターでないとしても、
なお分岐要素として働くということである。

本発明者らは、ＧＡＬ　　ＵＡＳがハイブリッド系にお
いて２つの外来プロモーターの分岐転写を調節するのに
使用され得るということを見出した。

ＧＡＬ　　ＵＡＳがＵＡＳ配列を欠く２つのプロモータ
ーの間に適当に挿入されると、ガラクトースの存在によ
り両プロモーターにおいて転写が調節されることがわか
り、そして分岐転写が達成される。

［具体的な説明］ 従って、本発明の１つの観点は、第１お、よび第２の転
写プロモーターの間に且つ隣接して置かれたＣＡＬ　　
ＵＡＳを含んで成り、前記２つのプロモーターが各々Ｇ
ＡＬ　　ＵＡＳに対して異種のものである、ＤＮＡ配列
を提供する。

本発明はまた、各プロモーターがＧＡＬ　　ＵＡＳと所
望のポリペプチドのためのそれぞれのコード領域との間
に置かれるように前記コード領域と結合された要素を提
供する。該プロモーターおよびコード領域は、もちろん
正しい読み枠において且つ２つのコード領域がそれぞれ
のプロモーターの調節下にそれぞれ反対の方向において
転写されて所望のポリペプチドをコードしているｍＲＮ
Ａを提供するような配向にある。

使用する両プロモーターは、一般にそれぞれのＵＡＳ　
（もしあれば）が除去されているであろう。

ある場合には、ＡおよびＴに富むけれども調節タンパク
質を結合しないＵＡＳ様領域は残され得るが、他の場合
にはそれが除去されるべきである。

当業者は、独創的な努力をすることなくそのような修飾
を行うことが可能であろう。

理解されるように、効率的な転写および翻訳に対する公
知の要求によれば、ポリペプチドを産生する構成物にお
いて本発明に係る配列が使用される時に、適当な停止シ
グナル、キャップ形成配列などが一般に包含されるだろ
う。２つのコード領域は、それぞれＧＡＬＩおよびＧＡ
Ｌ　１０ではない。

ＧＡＬ　　ＵＡＳは当技術分野において、特にＧｉｎｉ
ｇｅｒら、１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４０．７６７−７７
４において定義されている。

ＵＡＳは、ＧＡＬ４遺伝子産物である活性化タンパク質
のための結合部位として働＜、ＧＡＬＵＡＳは、二分子
対称性を示す４つの相同の１７塩基対配列を含んで成る
ものとして定義されている。この領域内でＣ；ＡＬ４タ
ンパク質の結合を指令するのがこれらの配列である。プ
ロモーターの上流のそのような１つの要素が転写を活性
化するのに十分であるが、最大レベルは該要素のマルチ
コピーにより達成される。従って、本明細書中で使用す
る場合、ＧＡＬ　　ＵＡＳ″°という表現は、ＧＡＬ４
遺伝子産物を結合するであろう、そして／または、１も
しくは複数の前記の１７塩基対の配列、そのための共通
配列もしくは近似共通配列またはそれの合成類似体、例
えばＧｉｎｉｇｅｒら、前掲文献中に記載された、特に
第７図およびそれのだめの説明文中に記載されたような
ものである、いかなる配列をも包含する。１７塩基対配
列が１個より多く存在するならば、それらは同しであっ
ても異なっていてもよい。ＧＡＬ４タンパク質を（単独
で）あまり強く結合しないように思われるので、ＵＡＳ
はむしろＧｉｎｉｇｅｒらにより同定された第四の１７
塩基対配列またはそれの組りかえしのみから成らない方
が好ましい。

前記の２つのコード＠ａ域は同じであっても異なってい
てもよい。好ましい態様においては、■方のコード領域
はヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）をコードし、他方はウ
ロキナーゼをコードする。ブローまたはプレープロー配
列が適当に含まれていてもよい。２つのポリペプチドが
異なる時には、２つのポリペプチドの精製が容易である
ように、１方のポリペプチドについては本発明のＤＮＡ
配列を保有している宿主微生物から分泌され、他方のポ
リペプチドについては生産されそして細胞内に貯蔵され
るのが好ましいだろう。従って該ＤＮＡ配列が（ｉ）適
当なシグナル配列、例えば在来のＨ３Ａシグナル配列ま
たは酵母のα−因子シグナル配列により前置きされてい
るプローＨ３Ａ、および（ｉｉ）全くシグナル配列のな
いブローウロキナーゼをコードしていてもよい。

融合タンパク質を提供するために、１つまたは複数のさ
らなるコード領域が前記の２つのプロモーターのどちら
かの調節下に含まれていてもよい。

本発明のさらなる観点は、（ａ）前記ＤＮＡ配列を含有
しそして微生物を形質転換するのに適するベクター；（
ｂ）前記ＤＮＡ配列を含有しそして適当な宿主細菌類、
藻類、真菌Ｎ（酵母を含む）または他の真核（例えば哺
乳類の）細胞中で自己複製する能力のあるプラスミド；
（Ｃ）自己複製するプラスミド上または染色体中のどち
らかに組み込まれた前記ＤＮＡ配列で形質転換された宿
主微生物（例えば、細菌、藻類、真菌類または他の真核
細胞）；（ｄ）１もしくは複数の部分または全体のＧＡ
ＬＬＪＡＳ、前記プロモーターおよび前記コード領域を
含んで成るＤＮＡ断片の適当な操作および／または合成
により、上記に定義されたようなりＮＡ配列を調製する
方法；　（ｅ）　Ｇ　Ａ　Ｌ　　Ｕ　Ａ　Ｓを活性化す
るのに十分な量のガラクトースを含む適当な培地中で、
上記（Ｃ）に記載の微生物の醗酵により１または複数の
ポリペプチドを生産する方法；並びに、げ）上記（ｅ）
の方法に従って生産された場合のポリペプチド；を包含
する。

上記（Ｃ）として挙げられた宿主微生物が酵母である場
合、ＧＡＬ４遺伝子のようなガラクトース制御系の要素
が正常に存在するであろうし、それ故ＧＡＬ　　ＵＡＳ
は通常の経路において活性化されてもよい。他の宿主に
おいては、上記に言及したコード領域のガラクトース誘
導性の転写が起こるように、そのような要素で宿主を形
質転換する必要があるかもしれない。酵母のＧＡＬ４ｉ
！！伝子を用いた咄乳類の細胞の形質転換は、Ｋａｋｉ
ｄａｎｉおよびＰｔａｓｈｎｅ、　１９８８．　Ｃｅ１
ｌ、　５２．１６１−１６７並びにＷｅｂｓ　ｔｅｒら
、１９８８．　Ｃｅ１ｌ、　５２．１６９−１７８によ
り証明されている。そのような方法は、−ｉに、“ＤＮ
Ａクローニング°゛第■巻、Ｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ｋＡ
、１９８６中のＧｏｒｎ＋ａｎによる章において教示さ
れている。ＧＡＬ４遺伝子は、本発明のプロモーター−
ＵＡＳ−プロモーターと同じベクターまたは別のベクタ
ーにおいて宿主細胞中へクローニングされてもよい。宿
主中に入ってすぐに、Ｇ　Ａ　Ｌ　４遺伝子は染色体に
取り込まれるかまたは自己複製するプラスミド上に存在
してもよい。ＧＡＬ４遺伝子は、宿主細胞と適合できる
適当な構成的または調節的プロモーター、例えば哺乳類
細胞系中のマウス乳ガンウィルス　（ＭＭＴＶ）プロモ
ーター（Ｓｃｈｅｉｄｅｒｅｉｔ　ら、１９８３．　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３０４．７４９　）の調節下にあるであろ
う。

上記（ｅ）の方法の特に好ましい態様においては、微生
物（例えば実験用酵母またはパン酵母）が、第１のポリ
ペプチドが分泌されてそして発酵培地から精製され、そ
して第２のポリペプチドが細胞内だけに生産されそして
微生物の破壊細胞から精製することを可能にするもので
あり、後者はすでに発酵培地から分離されている。

転写の調節は、化学的または物理的手段により調節され
るリプレッサーを提供するような酵母宿主を使って達成
され得る。ＧＡＬ遺伝子に対する種々のコリブレッサー
は、グルコース、グリセロール、および旦へ旦８０遺伝
子産物を包含する。

正の制御または活性化は、ガラクトースのような誘導物
質（ｉｎｄｕｃｅｒ）またはＧＡＬ４遺伝子産物のよう
な活性化物質（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）で行なわれ得る。

化学的制御を利用するよりもむしろ、温度域受性突然変
異を使用することもでき、これは通常約２０°Ｃ〜５０
“Ｃの範囲内で温度を上または下にシフトさせることに
よる・抑制および／または活性化を通して制御を可能に
する。

両プロモーターから下流にわたって、多数の機能を提供
する様々な種類のフランキング配列があってもよい。他
のＤＮＡ配列に連結できるように、特定の状況に応じて
該断片に付着末端または平滑末端を用意することもでき
る。分岐プロモーター機能のＤＮＡ配列を、必要な転写
または翻訳のシグナルを有する他の配列と連結せしめる
ために、プロモーターからすぐ下流を切断することが可
能である。

所望により、プロモーターから下流のある部位に終点を
有することもでき、そこでは該プロモーターから下流の
そしてそれに関連した転写および翻訳の調節シグナルの
全てが除去されている。代わりに、プロモーターから下
流のそれら転写およ流の幾つかの塩基、通常約２０塩基
以下、便利には１０塩基以下を除去することができる。

ＤＮＡ配列配列績合を可能にするであろう部位で切断す
ることもできる。この最後の状況においては、融合タン
パク質が得られるであろう。

別々のＵＡＳを利用する代りに、本発明に係る症ＫＬ　
ＵＡＳを利用する利点は、２つのｍＲＮＡおよび／また
はポリペプチドの相対レベルが例えば１：１に固定され
るだろうということである。

これは、その２つのポリペプチドが同一の代謝経路にお
いて同一のタンパク質または酵素のサブユニットである
時に有用であるだろう。さらに、２つのコード領域／プ
ロモーター系に対して１つだけのＵＡＳの存在は、プラ
スミドの安定性を減少させそして組み換えの発生率を低
下させる傾向にある。２つのプロモーターはより生産的
であり、その他にコード領域の発現にとってＥＰ−Ａ−
１３２３０９のＧＡＬＬおよびＧＡＬ　１０プロモータ
ーよりも好都合であるかもしれない。

下記の例は、添付図を参照しながら本発明の好ましい態
様を説明するものである。

［実施例］ １：　　　　　　−Ｈ３Ａ　　ウロキ　−ゼ本発明のＤ
ＮＡ配列の作製方法は以下のようであった。初めに、Ｐ
ＧＫ　　ＵＡＳを除去しそしてＧＡＬ　　ＵＡＳで置き
換えた。これはＵＡＳのす＜５′側に且つＰＧＫプロモ
ーターに対して遠位にユニーク制限部位を設ける方法に
おいて達成された。最後に、ＰＧＫプロモーターにより
指令される転写に関して転写が分岐的であるような方向
において該ユニーク部位にＣＹＣ−１プロモー　−を挿
入した。最終的構成物は、発現のための外来遺伝子の挿
入に適するユニーク制限部位も含有した。

ＤＮＡの操作においては標準法を利用した（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、（１９８２）　）　、製造業者の教示に従っ
て制限酵素および他の酵素を使用した。ホスホラミダイ
ト化学を利用して、製造業者により供給された試薬を使
ってＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０８
機（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏ中ｓｙｓｔｅｍｓ　　Ｉ
ｎｃ、、　　Ｆｏｓｔｅｒ　　Ｃ１ｔｙ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）においてオリゴヌクレオチドを
合成した。

他の常法、例えば大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）および酵母株
の形質転換、細胞抽出物の調製、ＳＤＳ電気泳動並びに
イムノブロッティングは、）ｌｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよ
びＫｅｎｎｙ　（１９８６）により記載されたように行
なった。

ＰＧＫ　　ＵＡＳの除去 ＰＧＫ　　ＵＡＳの除去は、ＰＧＫ遺伝子の５′非コー
ド領域の酵素的消化により達成された。その除去は次の
ように二方向で実施された。第一に、５′→Ｊの除去は
プラスミドｐＭ　Ａ　２７　（Ｍｅｌｌｏｒら、１９８
３）の誘導体において得られ、ここではＰＧＫの５′−
非コード領域中の一８００位のＣＩｃｂＩ部位が合成オ
リゴヌクレオチドリンカーを使ってユニーク−Ｘｈｏｌ
制限部位に転換されている。このｐＭＡ２７誘導体をＸ
ｈｏ［で切断し、そしてＢＡＬ３１エンドヌクレアーゼ
で消化した。ＢａｍＨＩ合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーの存在下でのライゲーションによりプラスミドを再び
環状にし、そして大腸菌を形質転換させた。ＤＮＡ配列
決定により除去の終点を特徴づけた。ご→５′方向にお
ける除去は、ｐＭ　Ａ２２　ａ　（Ｄｏｂｓｏｎ　ら、
１９８２）の同様な修飾により行われ、この後者の場合
のみプラスミドをＢＡＬ３１エンドヌクレアーゼ処理の
前にＢａｍＨｌで消化した。前と同様に、ＤＮＡ配列分
析により除去の終点を決定した。

プラスミドｐＤＢ４が、５′およびご欠失誘導体からの
適当なりａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を連結することに
より作製された。プラスミドｐＤＢ４は、−４２３位と
一４７０位との間が欠失しているがＰＧＫ　　ＵＡＳ自
体を含む。それ故プラスミドｐＤＢ４は、ＰＧＫ遺伝子
の５′−非コード領域中の欠失を除いて親プラスミドｐ
ＭＡ２７と同じである。酵母を形質転換させる時、この
ベクターは、マルチコピー状態にあるにもかかわらすＰ
ＧＫタンパク質のわずかに高い宿主染色体レベルを付与
するだけである。

ガークトース沃　　ＰＧＫ’　　−の ＧＡＬ　１−ＧＡＬ　１０の分岐プロモーターの構成は
第１図において示される。ＵＡＳの機能的領域の位置が
決定されており（Ｗｅｓｔら、１９８４）　、そしてそ
の位置はフランキング制限部位と一緒に示される。ＧＡ
ＬＩＯＵＡＳはプラスミドｐＬＧＳＤ　５（Ｇｕａｒａ
ｎｔｅら、１９８２）において見い出すことができる。

　ｐＬＧＳＤ　５から（Ｄ　１４４ｂｐのＲｓａｌ−へ
１ｕＩＤＮＡ断片を単離し、そしてｐＵＣ８のＳｍａＩ
部位と平滑末端連結してｐＤＢｌを形成せしめ、そして
ＥｃｏＲ１部位をｌれＩＩオリゴヌクレオチドリンカー
の挿入によりＨ■部位に転換した（第２図）。このよう
にしてＧＡＬ　１０　　ＵＡＳがユニーク０且れＵ−Ｂ
ａｍＨＩ　　ＤＮＡ断片として単離できた。次にこの断
片をｐＤＢ４中のユニークＢａｍＨ１部位中ヘクローン
化した。生じたプラスミドｐＫＶ４４はガラクトース制
御可能ＰＧＫ遺伝子をコードすることが示された。ガラ
クトースの不在下では、ｐＫＶ４４を保有している酵母
においてｐＤＢ４と同じレヘルのＰＧＫが認められた。

しかしながら、ガラクトースの添加の際そしてグルコー
スの不存在下では、ｐＫＶ４４を保有している株におい
て発現が著しく増加し、一方ｐＤＢ４を保有している株
においてはＰＧＫの発現レヘルが変化しなかった。

ＧＡＬＩＯ：ＰＧＫ　　　ベタ　−の プラスミドｐＤＢ４をＰＧＫ構造遺伝子の３′領域中に
置かれたユニーク基ＪＬＬＩ［部位で消化し、そしてそ
の線状分子をＢａ１３１エンドヌクレアーゼで消化した
。ＤＮＡ断片をフィルインしそして４ｎオリゴヌクレオ
チドリンカーの存在下で連結し、そうして形成されたプ
ラスミドをＤＮＡ配列分析によりスクリーニングして欠
失の終点を決定した。数ある中で、ＰＧＫコード配列に
関して一８位に終点を有する欠失体を得た。

上記の欠失誘導体を、ＰＧＫ遺伝子のご転写ターミネー
タ−配列の付加によりさらに修飾した。

これは、几ＩＩおよびＰｓｔｌでの該プラスミドの消化
並びにそうして生成した大きい方の断片とプラスミドｐ
Ｍ　Ａ　９　ＨＭｅｌｌｏｒら、１９８３）由来のＰＧ
Ｋ遺伝子のご転写ターミネータ−を含む。且ＬＬＩＩＰ
ｓｔｌ断片との連結により達成された。生じたプラスミ
ドをＧＡＬＩＯＵＡＳの挿入によりさらに修飾した。こ
のために、ｐＤＢ２からのに■−旦ａｍＨＩ断片（第２
図）を単離し、そしてユニークＢａｍＨ１部位において
挿入してプラスミドｐＫＶ５０を生成せしめた（第３図
）。この後者のプラスミドにおけるＵＡＳ部位の配向は
、再形成された旦ａｍＨ１部位がＰＧＫプロモーターの
後方にくるようにする。

チトクロームＣ−１遺伝子並びにそれの５′およびＩフ
ランキング領域はすでにクローン化されており、そして
それらのＤＮＡ配列は決定されている（Ｓｍｉｔｈら、
１９７９）。該フランキング領域に基づいた発現ベクタ
ーは既に記載されており（ＥｒｎｓｔおよびＣｈａｎ、
　１９８５）、そしてそれを第４図に示す。

このプラスミドｐＥＸ−２は、」匹Ｒ１−５胆Ｉ−Ｂａ
ｍ旧クローニングリンカ−の間にはさまれたプロモータ
ーおよびターミネータ−を含有し、その中に外来遺伝子
が発現のために挿入されていてもよい。プロモーター領
域は、該プロモーターがＣＹＣＩ−１３変異体から由来
するので開始コドンを含まず、この場合の開始コドンは
ＡＴＡに変異されている。従って翻訳は、この位置のご
側の最初の開始コドンで開始されるだろう。

５′領域にあるＵＡ、Ｓの位置は既知である。これ４図
に示される（ＭｃＮｅｉｌｌおよびＳｍ１ｔｈ、　１９
８６）。

図示されたように、ｐＥ　Ｘ−２からの０．５ＫｂのＨ
ｉｎｄ　ｍ　　ＸｈｏＴ断片が転写ターミネータ−、ク
ローニングリンカ−およびプロモーターを包合するがＵ
ＡＳ配列は包含しないであろう。

２　　　ブロモ−−の これは、ｐＫＶ５０中のＧＡＬ　１０　　ＵＡＳに隣接
した前記の０．５ＫｐのＨｉｎｄ　ｍ−Ｘｈｏｌ断片を
ＰＧＫプロモーターの遠位に置き、そしてＰＧＫプロモ
ーターから反対方向を読み取ることにより達成すること
ができる。従って、ｐＫＶ５０をＢａｍＨＩで消化し、
そしてポリメラーゼのフレノウ断片での処理により平滑
末端にする。次に、該０．５Ｋｐ断片をそれ自体も平滑
末端にされているこの種と連結する（第４図）。プロモ
ーターを含有する断片をどちらの配向においても挿入す
ることができ；正しく配向されたクローン、即ちＵＡＳ
Ｏ遠位にターミネータ−を有するものを第５図に示し、
それをｐＥＫ３０と命名する。

２　　ブロモ−−による２つの　　　　ンパク２方向プ
ロモーターの有用性は、ＩＳＡおよびブローウロキナー
ゼの発現により証明された。

Ｈ３Ａ遺伝子をＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＫｅｎｎｙ
　（１９８６）により記載されたように作製し、そして
第６回において示されるプラスミドｐＥＫ１１３から得
た。

ブローウロキナーゼの遺伝子をプラスミドｐＤＢＵｒｏ
ｌ　（第７図）から単離した。このプラスミドは、Ｈｅ
ｙｎｅｋｅｒ　ら（１９８６）により記載されたように
クローン化されたブローウロキナーゼ構造遺伝子ｃＤＮ
Ａを含有する。

しかしながら、ｐＤＢＬｌｒｏｌ中の該ＤＮＡ配列は、
それ自身開始コドンをもたないｐＥ　Ｘ−２またはｐＫ
Ｖ５０　　（前掲）により生産されるものと同じじよう
な転写融合から成熟遺伝子産物が発現されれ得るように
、メチオニル−ブローウロキナーゼをコードするＮ　Ｏ
Ｘコード領域において修飾されている。この部分の遺伝
子の配列は第７図に示されている。

ＩＳＡのサブクローニング ｐＥ　Ｋ１１３　（）ＩｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＫｅ
ｎｎｙ、　１９８６）からの１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断
片を単離し、そしてｐＥＫ３０の旦■■部位中にクロー
ニングしてプラスミドｐＥＫ３１を与えた（第８図）。

ブローウロキナーゼのサブクローニングプラスミドｐＥ
Ｋ３１をＳｍａｌで消化し、ｐＤＢＵｒｏｌからの１．
６ｋｂのＨｉｎｄ　Ｉ［−３ａｃｌ断片（この末端は、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑末端化され
ている）と連結した。

５ａｃｌは、この反応において脱離するご延長部分を残
し、一方５′延長部分はフィルインインされる。

該断片とベクターとを連結すると第９圓に示されるよう
なプラスミドｐｓＪ２２を生ずる。

プラスミドｐｓＪ　２２を酵母株Ｄ　Ｂ　Ｙ７４５中に
形質転換しロイシン原栄養体について選択した。

単一の形質転換体Ｄ　Ｂ　Ｙ７４５　（ｐＳ　Ｊ　２２
）を次のようにＩＳＡおよびブローウロキナーゼ生産に
ついて分析した。

該株を、炭素源として２％（ｗ／ｖ）グルコースをを含
有するＨａｗ　ＬｈｏｒｈｅおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ（
１９６０）により記載されたような最少培地中で、ＯＤ
、。。が１．０に達するまで培養した。この時点で培地
を収集し、少量のサンプルを取り出し、そして残りを炭
素源として２％（ｉｎ／ｖ）ガラクトースを補充した最
少培地中で同じＯＤ６゜。値に再懸濁した。さらに２４
時間インキュベーションを続け、その後で培地を収集し
、そして誘導された培養物と誘導されないサンプルとの
両方から細胞抽出物を調製した。該抽出物のタンパク質
含量をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノプ
ロットにより解析した（ＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＫ
ｅｎｎｙ、　１９８６）。その結果は第１０図に示され
る。試料を２枚に負荷し、そして１セツトはウロキナー
ゼ抗体でプローブされ、もう１セントはＩＳＡ抗体でプ
ローブされた。

両タンパク質についての標準を含めた。図示されるよう
に、誘導前の試料中にはブローウロキナーゼが検出され
ず、ご（小レベルのＩＳＡだけが同試料中に観察された
。誘導に応じて、ブローウロキナーゼが現われ、そして
ＩＳＡの発現がバックグラウンドレベル以上に実質上増
加する。

これらのデータは、２方向発現系の有用性を証明する。

１２：パン 同様の結果が産業用の酵母株、特にパン酵母について得
られよう。しかし後者の場合には、初めに形質転換体の
選択のための適当な選択マーカー例えば高められたレベ
ルの銅イオンに耐性を付与するＣ　Ｕ　Ｐ−１遺伝子（
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５）を導入してもよい。

ＣＵ　Ｐ−１遺伝子は、プラスミドｐＦ、Ｔ１３：１（
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、　１９８５）から得ることがで
き、その構造は概略的に第１１図において示されている
。

これは２Ｋｂのｘ匹■断片上においてＣＵ　Ｐ　−１を
コードしている。従って、プラスミドｐＳＪ２２を＋ｉ
で消化し、そして上記の断片を連結すると、第１２図に
示されるようなｐＳＪ２２ａを生ずる。次にこのプラス
ミドをＢＢｌＯ，２株中へ形質転換せしめ、Ｈｉｎｃｈ
ｌｉｆｆｅおよびＫｅｎｎｙ　（１９８６）により記載
されたように銅−耐性について選択してもよい。

３：ブローウロキ　−ゼの この例においては、ＩＳＡおよびプローウロキナーゼの
誘導合成を、後者は例１のように細胞内に残留されるが
ＩＳＡは培地に分泌されるのを可能にするプラスミドを
二方向発現系を利用して作製した。これは、ＩＳＡの構
造遺伝子のすぐ５′側に酵母ＭＦα−１遺伝子のシグナ
ル配列（プレプロ配列）を置くことにより達成された。

ＭＦα−１プレープロコード　　の ＭＦα−１プレ一プロ配列は、公表された配列（Ｐｉｇ
ｇｏｔｔ　ら、１９８７．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、　１２＋５６１−５６７）に従って、第１３
図に示されるような一連のオリゴヌクレオドとして作製
された。これらはＨｅａｐｈｙ　ら、　Ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、上１４２５−４３１．１９
８７により記載された方法に従って組み立てられた。オ
リゴヌクレオチド類は最初に酵素的にリン酸化され、混
合され、そしてＨｅａｐｈｙらにより記載されたように
連結された。オリゴヌクレオチドｌおよび３ａはリン酸
化されないままにしておいた。連結に続いて、希望とす
るフラグメントをＭ１３ｍ　ｐ　１９（Ｍｅｓｓｉｎｇ
、　１９８３．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　１０１　２０　７８）中のＢａｍＨＩ部位と
ＨｉｎｄＩＩ［部位との間にクローニングし、ｍｐ１９
αを生成せしめた。

ＭＦα−１プレープロ　　のＩＳＡへの初めに、Ｔｉ１
１）　１９．７（ＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＫｅｎｎ
ｙ１９８６）をＸｈｏＩおよび３１ヌクレアーゼで消化
し、そして合成オリゴヌクレオチドと連結してｍｐ１９
．７αｌ（第１４図）を生成せしめる。この後者の分子
を次にＸｂａｌおよび）遅」で消化し、そして同様に消
化されたｐＥＫ１１２と連結して、第１５図に示される
ようなｍｐ　１９．７α２を生成せしめる。

ｐＥＫ１１２は、Ｈ３Ａコード部分の挿入が形成体分子
において逆の方向であることを除いて、ｐＥ　Ｋ１１３
　（ＨｉｎｃｈｌｉｆｆｅおよびＫｅｎｎｙ、　１９８
６）と本質的に等しい。

この置換体は、旦ａｍＨ１部位をＩＳＡ構造遺伝子配列
のご側に置いた。最後に、ｍｐ　１９αからのからのＢ
ａｍＨｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ断片と連結し、そしてこの混合
物をＨａで消化されたｐＥＫ３０と連結してｐＥＫ４４
　　（第１６図）を生成せしめた。

ＥＫ４４　　のブローウロキナーゼ′　　のＬ二二三ノ
久 プラスミドｐＥＫ４４をＳｍａｌで消化し、そしてＭｅ
ｔ−ｕ−ＰＡをコードするｐＤＢＵｒｏｌからの平滑末
端化された３ａｃｌ　−Ｈｌｎｄ　Ｉ［ｌ断片と連結し
た。これは２方向発現プラスミドｐＥＫ７２’（第１７
図）を生じた。これは、成熟Ｈ３Ａをコードしている遺
伝子の前にＭＦα−１プレ一プロ配列があることを除い
ては、本質的にプラスミドｐｓ　Ｊ　２２と等しい。

形ｌ上Ｊｕ１死た扼 プラスミドｐＥＫ４４およびｐＥＫ７２を、宿主酵母Ｄ
　Ｂ　Ｙ７４５中に形質転換し、そして前に記載したよ
うに誘導した培養物および誘導しない培養物の両方の抽
出物を調製した。しかしこの場合には、ＳＤＳ電気泳動
およびウエスタンブロツテングの技術を利用して、細胞
内画分をブローウロキナーゼについて分析しそして培地
をＩＳＡについて分析した。得られた結果を比較すると
ｐＳＪ２２についての前の結果と一致した。ガラク＋−
−ス不在下のｐＥＫ７２はＩＳＡの低レベルの分泌を指
令し、これはガラクトース存在下では著しく増加した。

ｐＥＫ７２およびｐＥＫ４４形質転換体により分泌され
るＩＳＡのレベルは同じであった。

ｐＥＫ４４培養物または非誘導のｐＥＫ７２培養物の細
胞内抽出物においては、ブローウロキナーゼは検出され
ず、そしてガラクトースで誘導されたｐＥＫ７２培養物
においてのみ検出することができた。

これらのデータは、２方向プロモーター系の有用性をさ
らに証明する。

本発明のさらなる観点は、前述の新規プラスミド、　ｐ
ＫＶ’５０　、　　ｐＥＫ３０　、　　ｐＥＫ３１　　
。

ｐｓＪ　２２およびｐＳＪ２２ａ、並びにｐＳＪ２２ａ
で形質転換された酵母（特にパン酵母）を包含する。

Ｕ−献 Ｄｏｂｓｏｎら、　　（１９８２）＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ２６２５−２６３７゜ Ｒｅｓ、＋ 利。

Ｇａｔｉｇｎｏｌ、　Ａ、、　Ｂａｒｏｎ、　Ｆおよび
Ｔｉｒａｂｙ、　Ｇ。

（１９８７）　　Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
２０７　３４２−３４８゜Ｇｉｎｉｇｅｒ、Ｅ、、Ｖａ
ｒｎｕｍ、Ｓ、Ｍ。

（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４０．　７６７　７７４゜お
よび Ｐｔａｓｈｎｅ。

門。

Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，（１９８６） Ｇｌｏｖｅｒ、　　Ｄ、鳩、　　ＩＲＬ”ＤＮＡ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ” Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

Ｖｏ　ｌ　ｕｍｅ ＩＩ Ｇｕａｒａｎｔｅ＋　Ｌ、、　Ｙｏｃｕｍ、　Ｒ，Ｒ，
、およびＧｉｆｆｏｒｄ、　Ｐ。

（１９８２）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｔｌｓＡ　　７９．　７４１０７
４１４゜ Ｈａｉｖｔｈｏｒｎｅ、　Ｄ、Ｃ，およびＭｏｒｔｉｍ
ｅｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　　４５　１０８５−１１１０゜
Ｒ，Ｋ。

Ｈｅａｐｈｙら（１９８７）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ上、４２５−４３１゜ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｃ，Ａ、、　Ｃｏｘ、　Ｂ
、Ｓ、および（１９８５）、　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ
、　９　、　１３３゜Ｈｅｙｎｅｋｅｒ＋　Ｈ，Ｌ、、
　Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｗ、Ｅ、およびＧ、Ａ、　（１９８
６）英国特許２１２１０５０Ｂ。

Ｔｕｂｂ。

Ｖｅｈａｒ。

Ｒ１ Ｈ４ｎｃｈｌｉｆｆｅ、　Ｅ。

ＥＰ−Ａ−２０１２３９ および Ｋｅｎｎｙ。

Ｅ。

Ｈｏｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｅ、、　Ｂｒｏａｃｈ＋　Ｊ、Ｒ
，＋およびＲｏｗｅ。

Ｌ、Ｂ、　　（１９７８）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｔｌｓＡ　　７５゜
２８７８−２８８２゜ にａｋｉｄａｎｉ、　Ｈ，およびＰｔａｓｈｎｅ、　Ｍ
、（１９８８）　Ｃｅｌ！。

皿、　　１６１−１６７゜ Ｋｉｎｇｓｍａｎ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　
Ａ、Ｊ、、およびＭｅｌｌｏｒ＋Ｊ、（１９８６）ＴＩ
ＢＴＥＣ）ｌ　　５，５３−５７゜Ｍａｎｉａｔｉｓ＋
　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ＋　Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋ＋Ｊ、（１９８２）　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、、ＩＪＳＡ。

ＭｃＮｅｉｌｌ、　Ｊ、Ｂ、＋およびＳｍ１ｔｈ、　Ｍ
、　（１９８６）　Ｊ−Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ：、１８７．
３６３　３７８゜Ｍｅｌｌｏｒ、Ｊ、、Ｄｏｂｓｏｎ、
Ｍ、Ｊｌ　Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｎ、Ａ−＋Ｔｕｉｔｅ、　
　Ｍ、Ｆ、、　　Ｅｍｔａｇｅ、　　Ｊ、Ｓ、、　　Ｗ
ｈｉｔｅ、　　Ｓ、、　　Ｌｏｗｅ。

Ｐ、Ａ、、　Ｐａｔｅｌ、　Ｔ、、　Ｋｉｎｇｓｍａｎ
、　Ａ、Ｊ、およびＫｉｎｇｓｍａｎ、　　Ｓ、Ｍ、　
　（１９８３）　　Ｇｅｎｅ、２４．　１−１４゜Ｍｅ
ｓｓｉｇ＋　　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１＋２０−７８゜ Ｐｉｇｇｏｔ　ら（１９８７）　Ｃｕｒｒｅｎｔ５６７
゜ ５ｃｈｅｉｄｅｒｅｉｔ、　Ｃ，ら、　（１９８３）Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ １２．５６１− Ｎａｔｕｒｅ　３０４．７４９−７５２、Ｓｍ１ｔｈ、
　Ｍ、＋　Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、Ｗ、、　Ｇｉｌｌａｍ、
　Ｓ、、およびＡｓｔｅｌｌ、　　Ｃ，Ｒ，、（１９７
９）　　Ｃｅ１ｌ、　　１４．　７５３−７６１゜Ｓｔ
、Ｊｏｈｎ、Ｔ、、５ｃｈｒｅｒｅｒ、Ｓ、、ＭｃＤｏ
ｎｎｅｌｌ、Ｍ、。

およびＤａｖｉｄ、　Ｒ，（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、　１５２゜３１７−３３４゜ Ｓｔ、　Ｊｏｈｎ＋　Ｔ、＋およびＤａｖｉｄ、　Ｒ，
（１９８１）　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　　１５２　２８５−３１５゜Ｓｔ、　Ｊｏ
ｈｎ、　Ｔ、、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，（１９７９）
　Ｃｅ１１１６、　４４３−４５２゜ Ｗｅｂｓｔｅｒ、　Ｎ、ら（１９８８）　Ｃｅ１ｌ、　
５２．１６９−１７８Ｗｅｓｔ、　Ｒ，Ｗ、ら（１９８
４）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、土、　２４６
７−２４７８゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓ、セレビシェ−のＧＡＬＬＧＡＬＩＯ分岐
プロモーター領域の図解である；第２図は、ＵＡＳ　　
ＧＡＬプラスミドｐＤＢ１およびｐＤＢ２の構成を示す
： 第３図は、プラスミドｐＫＶ５０の制限酵素地図である
： 第４図は、ｐＥＸ−２の制限酵素地図である（Ｅｒｎｓ
ｔおよびＣｈａｎ＋　１９８５　；　Ｇａｔｉｇｎｏｌ
ら、　１９８７から引用）； 第５図は、ｐＥＫ３０の制限酵素地図である；第６図は
、ｐＥＫ１１３の制限酵素地図（）Ｉｉｎ−ｃｈｌｉｆ
ｆｅおよびＫｅｎｎｙ、　１９８６）であり、ここで黒
ぬりのブロックはｐＢＲ３２２ＤＮＡを表わし、そして
白ぬきのブロックはｎｅｔ−ＩＳＡ　　、ＤＮＡを表わ
す： 第７図はｐＤＢＵｒｏｌの制限酵素地図であり、ここで
Ｎ端のコード領域および５′領域の配列が示されている
； 第８図は、ｐＥＫ３１の制限酵素地図である；第９図は
、ｐｓＪ２２の制限酵素地図である；第１０図は、ｐｓ
Ｊ　２２におけるブローウロキナーゼおよびＩＳＡの細
胞内発現を証明するウェスタンブロンドの模式的表示で
ある。レーン１〜４および５〜８は、それぞれブローウ
ロキナーゼ抗血清およびＨ３Ａ抗血清を使ったイムノプ
ロットを表わす。負荷の順は次のようである：レーンｌ
および５；誘導された可溶性細胞画分レーン２および７
；誘導された不溶性細胞画分レーン３および６；誘導さ
れない不溶性細胞画分 レーン４および８；それぞれウロキナーゼおよびＩＳＡ
の標準物質： 第１１図は、ｐＥＴ１３：１の制限酵素地図である（Ｈ
ｅｎｄｅｒｓｏｎら１９８５）　；第１２図は、ｐＳＪ
２２ａの制限酵素地図である；第１３図は、部分的なＭ
Ｆα−１プレ一プロ配列をコードしている２５５塩基対
のＢａｍＨＩ　−Ｈｉｎｄ■断片のヌクレオチド配列を
示す。これは合成二本鎖オリゴヌクレオチド１　１ａ、
　　２−２ａおよび３−３ａの連結により合成した。実
線は個々のオリゴヌクレオチドの境界を示す。次いでこ
の断片を、Ｍ１３　ｍｐ　１９のＢａｍＨ１部位とＨ４
ｎｄＩ１１部位の間に挿入してｍｐ　１９αを生成せし
めた；第１４図は、プラスミドｍｐ　１９．７α１の構
成を示す； 第１５図は、プラスミドｍｐ　１９．７α２の構成を示
す； 第１６図は、ｐＥＫ４４の構造を示す：第１７図は、ｐ
ＥＫ７２の制限酵素地図である。 この場合Ｈ３Ａ転写は、生じたポリペプチドが分泌され
るようにＭＦα−１融合である。ｕ−ＰＡはＮ−メチオ
ニルでありそして細胞内に残留されるであろう。 一面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１および第２の転写プロモーターの間に置かれた
   ＧＡＬ　ＵＡＳを含んで成り、前記２つのプロモーター
   の各々がＧＡＬ　ＵＡＳに対して異種のものである、Ｄ
   ＮＡ配列。２、前記ＧＡＬ　ＵＡＳから遠位の前記２つ
   のプロモーターの両側に且つ該両プロモーターに関して
   正しい読み枠においてそれぞれ置かれている２つのコー
   ド領域を、該コード領域がそれぞれ￥ＧＡＬ￥１および
   ￥ＧＡＬ￥１０についてのものでないという条件で、さ
   らに含んで成る、請求項１に記載の配列。 ３、前記２つのコード領域が、それぞれヒト血清アルブ
   ミン（ＨＳＡ）およびウロキナーゼをコードしている、
   請求項２に記載の配列。 ４、前記コード領域の一方がその５端にアミノ酸配列を
   コードする開始領域を有し、該コード領域から翻訳され
   たポリペプチドがそのＮ端で前記アミノ酸配列に連結さ
   れてそしてＤＮＡ配列が転写および翻訳のために置かれ
   る宿主細胞から分泌されるように選択されている、請求
   項３に記載の配列。 ５、前記ＧＡＬ　ＵＡＳが、酵母中でＧＡＬ４タンパク
   質を結合する４つの１７塩基対の相同配列のいずれか１
   つまたは複数のマルチコピーを含んで成る、請求項１〜
   ４のいずれか一項に記載の配列。 ６、請求項１〜５のいずれか一項に記載の配列を含有し
   そして微生物を形質転換するのに適するベクター。 ７、酵母中で自己複製することのできる、請求項６に記
   載のプラスミド。 ８、請求項７に記載のプラスミドで形質転換された酵母
   細胞。 ９、前記ＧＡＬ　ＵＡＳを活性化するのに十分な量のガ
   ラクトースを含む適当な培地中で、請求項８に記載の酵
   母細胞の発酵により２種またはそれより多くのポリペプ
   チドを生産する方法。