JPH022380A - 酵母発見系 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、組換えDNA技術の分野に関する。
特に、本発明は新規な酵母発現系に関する。
[従来の技術]
酵母では、遺伝子の発現は、構造領域の上流にあるプロ
モーターによりまたはコード領域自身により少なくとも
部分的に調節される。幾つかの酵母プロモーターが単離
されており、そして酵母において外来遺伝子産物を発現
させるのに利用されている。該プロモーターは、それら
が正常に発現せしめる遺伝子産物の特質を有する。例え
ば、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)は本質的な
酵素であり、それ故そのプロモーターは構成的であるけ
れども、グルコースのような発酵性炭素源の存在下では
いくらか高められる(Mel lorら、1983)。
モーターによりまたはコード領域自身により少なくとも
部分的に調節される。幾つかの酵母プロモーターが単離
されており、そして酵母において外来遺伝子産物を発現
させるのに利用されている。該プロモーターは、それら
が正常に発現せしめる遺伝子産物の特質を有する。例え
ば、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)は本質的な
酵素であり、それ故そのプロモーターは構成的であるけ
れども、グルコースのような発酵性炭素源の存在下では
いくらか高められる(Mel lorら、1983)。
PGKプロモーターは、酵母中で様々な異種性ポリペプ
チドを発現させるのに利用されている(Kingsma
nら、1986 )。
チドを発現させるのに利用されている(Kingsma
nら、1986 )。
異種性ポリペプチドの発現を調節することは、特にその
生産物が細胞に対して有害であるかまたは一度合成され
てすぐに分解される場合には、操! 作おいて有益であるかもしれない。これらの状況下では
誘導可能な遺伝子発現系が所望される。酵母の中で最も
よく研究される制御系は、ガラクトース異化酵素の発現
を調節するものである。
生産物が細胞に対して有害であるかまたは一度合成され
てすぐに分解される場合には、操! 作おいて有益であるかもしれない。これらの状況下では
誘導可能な遺伝子発現系が所望される。酵母の中で最も
よく研究される制御系は、ガラクトース異化酵素の発現
を調節するものである。
ガラクトースの不在下では、GALI、7および10遺
伝子によりコードされる該異化酵素は合成されない。ガ
ラクトースの添加に応じてそしてグルコース不在下にお
いては、これらの遺伝子が迅速に活性化され、そして転
写レベルが非誘導レベルより1 、000倍高(なる(
Hopperら、1978 。
伝子によりコードされる該異化酵素は合成されない。ガ
ラクトースの添加に応じてそしてグルコース不在下にお
いては、これらの遺伝子が迅速に活性化され、そして転
写レベルが非誘導レベルより1 、000倍高(なる(
Hopperら、1978 。
SL、 JohnおよびDavis、 1979) 、
その活性化は、GAL4遺伝子によりコードされるlf
l f’ffタンパク質によりもたらされる。ガラクト
ースの存在でCAL4が該構造遺伝子の上流に結合しそ
うして発現を促進せしめることを可能にする。この結合
部位は、上流活性化配列またはUASと称される(Gu
aranteら、19B2) 。該異化遺伝子の染色体
地図を第1図に示す(St、JohnおよびDavis
、 1981 ;St、 Johnら、1981) 。
その活性化は、GAL4遺伝子によりコードされるlf
l f’ffタンパク質によりもたらされる。ガラクト
ースの存在でCAL4が該構造遺伝子の上流に結合しそ
うして発現を促進せしめることを可能にする。この結合
部位は、上流活性化配列またはUASと称される(Gu
aranteら、19B2) 。該異化遺伝子の染色体
地図を第1図に示す(St、JohnおよびDavis
、 1981 ;St、 Johnら、1981) 。
単一のUASがGALLおよびGALIOの分岐(di
vergent)転写を調節する。
vergent)転写を調節する。
プロモーターの在来UASのGALIOUASによる置
換がそのプロモーターにガラクトース適応性を付与する
ことが示されている(Guaranteら、1982)
。ガラクトースで誘導可能な、PGK:GALIOハイ
ブリッドプロモーターの構成において使用されるGAL
IOUASがどちらの方向においても機能すること、即
ちGALIOUASを含む線状のDNA断片が在来のP
GK UASの代わりにされてもよくそして該DNA
断片の配向にかかわらずガラクトース制御を付与するこ
と(本発明者らの初期の同時係属出願EP−A−268
067を参照のこと)もわかっている。
換がそのプロモーターにガラクトース適応性を付与する
ことが示されている(Guaranteら、1982)
。ガラクトースで誘導可能な、PGK:GALIOハイ
ブリッドプロモーターの構成において使用されるGAL
IOUASがどちらの方向においても機能すること、即
ちGALIOUASを含む線状のDNA断片が在来のP
GK UASの代わりにされてもよくそして該DNA
断片の配向にかかわらずガラクトース制御を付与するこ
と(本発明者らの初期の同時係属出願EP−A−268
067を参照のこと)もわかっている。
さらに、(GALIOプロモーター−UAS−GALI
プロモーター)本体が2つの外来コード配列と一緒にそ
してその間にはさんで使用するのに適当であるポータプ
ルな分岐性調節要素であるということは、証明されては
いないが示唆されている(E P−A−132309)
。まだ示されておらずそして予想され得なかったことは
、GALLUASそれ自体が、たとえそれの両側の各プ
ロモーターがそれ本来のプロモーターでないとしても、
なお分岐要素として働くということである。
プロモーター)本体が2つの外来コード配列と一緒にそ
してその間にはさんで使用するのに適当であるポータプ
ルな分岐性調節要素であるということは、証明されては
いないが示唆されている(E P−A−132309)
。まだ示されておらずそして予想され得なかったことは
、GALLUASそれ自体が、たとえそれの両側の各プ
ロモーターがそれ本来のプロモーターでないとしても、
なお分岐要素として働くということである。
本発明者らは、GAL UASがハイブリッド系にお
いて2つの外来プロモーターの分岐転写を調節するのに
使用され得るということを見出した。
いて2つの外来プロモーターの分岐転写を調節するのに
使用され得るということを見出した。
GAL UASがUAS配列を欠く2つのプロモータ
ーの間に適当に挿入されると、ガラクトースの存在によ
り両プロモーターにおいて転写が調節されることがわか
り、そして分岐転写が達成される。
ーの間に適当に挿入されると、ガラクトースの存在によ
り両プロモーターにおいて転写が調節されることがわか
り、そして分岐転写が達成される。
[具体的な説明]
従って、本発明の1つの観点は、第1お、よび第2の転
写プロモーターの間に且つ隣接して置かれたCAL
UASを含んで成り、前記2つのプロモーターが各々G
AL UASに対して異種のものである、DNA配列
を提供する。
写プロモーターの間に且つ隣接して置かれたCAL
UASを含んで成り、前記2つのプロモーターが各々G
AL UASに対して異種のものである、DNA配列
を提供する。
本発明はまた、各プロモーターがGAL UASと所
望のポリペプチドのためのそれぞれのコード領域との間
に置かれるように前記コード領域と結合された要素を提
供する。該プロモーターおよびコード領域は、もちろん
正しい読み枠において且つ2つのコード領域がそれぞれ
のプロモーターの調節下にそれぞれ反対の方向において
転写されて所望のポリペプチドをコードしているmRN
Aを提供するような配向にある。
望のポリペプチドのためのそれぞれのコード領域との間
に置かれるように前記コード領域と結合された要素を提
供する。該プロモーターおよびコード領域は、もちろん
正しい読み枠において且つ2つのコード領域がそれぞれ
のプロモーターの調節下にそれぞれ反対の方向において
転写されて所望のポリペプチドをコードしているmRN
Aを提供するような配向にある。
使用する両プロモーターは、一般にそれぞれのUAS
(もしあれば)が除去されているであろう。
(もしあれば)が除去されているであろう。
ある場合には、AおよびTに富むけれども調節タンパク
質を結合しないUAS様領域は残され得るが、他の場合
にはそれが除去されるべきである。
質を結合しないUAS様領域は残され得るが、他の場合
にはそれが除去されるべきである。
当業者は、独創的な努力をすることなくそのような修飾
を行うことが可能であろう。
を行うことが可能であろう。
理解されるように、効率的な転写および翻訳に対する公
知の要求によれば、ポリペプチドを産生する構成物にお
いて本発明に係る配列が使用される時に、適当な停止シ
グナル、キャップ形成配列などが一般に包含されるだろ
う。2つのコード領域は、それぞれGALIおよびGA
L 10ではない。
知の要求によれば、ポリペプチドを産生する構成物にお
いて本発明に係る配列が使用される時に、適当な停止シ
グナル、キャップ形成配列などが一般に包含されるだろ
う。2つのコード領域は、それぞれGALIおよびGA
L 10ではない。
GAL UASは当技術分野において、特にGini
gerら、1985. Ce1l 40.767−77
4において定義されている。
gerら、1985. Ce1l 40.767−77
4において定義されている。
UASは、GAL4遺伝子産物である活性化タンパク質
のための結合部位として働<、GALUASは、二分子
対称性を示す4つの相同の17塩基対配列を含んで成る
ものとして定義されている。この領域内でC;AL4タ
ンパク質の結合を指令するのがこれらの配列である。プ
ロモーターの上流のそのような1つの要素が転写を活性
化するのに十分であるが、最大レベルは該要素のマルチ
コピーにより達成される。従って、本明細書中で使用す
る場合、GAL UAS″°という表現は、GAL4
遺伝子産物を結合するであろう、そして/または、1も
しくは複数の前記の17塩基対の配列、そのための共通
配列もしくは近似共通配列またはそれの合成類似体、例
えばGinigerら、前掲文献中に記載された、特に
第7図およびそれのだめの説明文中に記載されたような
ものである、いかなる配列をも包含する。17塩基対配
列が1個より多く存在するならば、それらは同しであっ
ても異なっていてもよい。GAL4タンパク質を(単独
で)あまり強く結合しないように思われるので、UAS
はむしろGinigerらにより同定された第四の17
塩基対配列またはそれの組りかえしのみから成らない方
が好ましい。
のための結合部位として働<、GALUASは、二分子
対称性を示す4つの相同の17塩基対配列を含んで成る
ものとして定義されている。この領域内でC;AL4タ
ンパク質の結合を指令するのがこれらの配列である。プ
ロモーターの上流のそのような1つの要素が転写を活性
化するのに十分であるが、最大レベルは該要素のマルチ
コピーにより達成される。従って、本明細書中で使用す
る場合、GAL UAS″°という表現は、GAL4
遺伝子産物を結合するであろう、そして/または、1も
しくは複数の前記の17塩基対の配列、そのための共通
配列もしくは近似共通配列またはそれの合成類似体、例
えばGinigerら、前掲文献中に記載された、特に
第7図およびそれのだめの説明文中に記載されたような
ものである、いかなる配列をも包含する。17塩基対配
列が1個より多く存在するならば、それらは同しであっ
ても異なっていてもよい。GAL4タンパク質を(単独
で)あまり強く結合しないように思われるので、UAS
はむしろGinigerらにより同定された第四の17
塩基対配列またはそれの組りかえしのみから成らない方
が好ましい。
前記の2つのコード@a域は同じであっても異なってい
てもよい。好ましい態様においては、■方のコード領域
はヒト血清アルブミン(ISA)をコードし、他方はウ
ロキナーゼをコードする。ブローまたはプレープロー配
列が適当に含まれていてもよい。2つのポリペプチドが
異なる時には、2つのポリペプチドの精製が容易である
ように、1方のポリペプチドについては本発明のDNA
配列を保有している宿主微生物から分泌され、他方のポ
リペプチドについては生産されそして細胞内に貯蔵され
るのが好ましいだろう。従って該DNA配列が(i)適
当なシグナル配列、例えば在来のH3Aシグナル配列ま
たは酵母のα−因子シグナル配列により前置きされてい
るプローH3A、および(ii)全くシグナル配列のな
いブローウロキナーゼをコードしていてもよい。
てもよい。好ましい態様においては、■方のコード領域
はヒト血清アルブミン(ISA)をコードし、他方はウ
ロキナーゼをコードする。ブローまたはプレープロー配
列が適当に含まれていてもよい。2つのポリペプチドが
異なる時には、2つのポリペプチドの精製が容易である
ように、1方のポリペプチドについては本発明のDNA
配列を保有している宿主微生物から分泌され、他方のポ
リペプチドについては生産されそして細胞内に貯蔵され
るのが好ましいだろう。従って該DNA配列が(i)適
当なシグナル配列、例えば在来のH3Aシグナル配列ま
たは酵母のα−因子シグナル配列により前置きされてい
るプローH3A、および(ii)全くシグナル配列のな
いブローウロキナーゼをコードしていてもよい。
融合タンパク質を提供するために、1つまたは複数のさ
らなるコード領域が前記の2つのプロモーターのどちら
かの調節下に含まれていてもよい。
らなるコード領域が前記の2つのプロモーターのどちら
かの調節下に含まれていてもよい。
本発明のさらなる観点は、(a)前記DNA配列を含有
しそして微生物を形質転換するのに適するベクター;(
b)前記DNA配列を含有しそして適当な宿主細菌類、
藻類、真菌N(酵母を含む)または他の真核(例えば哺
乳類の)細胞中で自己複製する能力のあるプラスミド;
(C)自己複製するプラスミド上または染色体中のどち
らかに組み込まれた前記DNA配列で形質転換された宿
主微生物(例えば、細菌、藻類、真菌類または他の真核
細胞);(d)1もしくは複数の部分または全体のGA
LLJAS、前記プロモーターおよび前記コード領域を
含んで成るDNA断片の適当な操作および/または合成
により、上記に定義されたようなりNA配列を調製する
方法; (e) G A L U A Sを活性化す
るのに十分な量のガラクトースを含む適当な培地中で、
上記(C)に記載の微生物の醗酵により1または複数の
ポリペプチドを生産する方法;並びに、げ)上記(e)
の方法に従って生産された場合のポリペプチド;を包含
する。
しそして微生物を形質転換するのに適するベクター;(
b)前記DNA配列を含有しそして適当な宿主細菌類、
藻類、真菌N(酵母を含む)または他の真核(例えば哺
乳類の)細胞中で自己複製する能力のあるプラスミド;
(C)自己複製するプラスミド上または染色体中のどち
らかに組み込まれた前記DNA配列で形質転換された宿
主微生物(例えば、細菌、藻類、真菌類または他の真核
細胞);(d)1もしくは複数の部分または全体のGA
LLJAS、前記プロモーターおよび前記コード領域を
含んで成るDNA断片の適当な操作および/または合成
により、上記に定義されたようなりNA配列を調製する
方法; (e) G A L U A Sを活性化す
るのに十分な量のガラクトースを含む適当な培地中で、
上記(C)に記載の微生物の醗酵により1または複数の
ポリペプチドを生産する方法;並びに、げ)上記(e)
の方法に従って生産された場合のポリペプチド;を包含
する。
上記(C)として挙げられた宿主微生物が酵母である場
合、GAL4遺伝子のようなガラクトース制御系の要素
が正常に存在するであろうし、それ故GAL UAS
は通常の経路において活性化されてもよい。他の宿主に
おいては、上記に言及したコード領域のガラクトース誘
導性の転写が起こるように、そのような要素で宿主を形
質転換する必要があるかもしれない。酵母のGAL4i
!!伝子を用いた咄乳類の細胞の形質転換は、Kaki
daniおよびPtashne、 1988. Ce1
l、 52.161−167並びにWebs terら
、1988. Ce1l、 52.169−178によ
り証明されている。そのような方法は、−iに、“DN
Aクローニング°゛第■巻、D、 Glover kA
、1986中のGorn+anによる章において教示さ
れている。GAL4遺伝子は、本発明のプロモーター−
UAS−プロモーターと同じベクターまたは別のベクタ
ーにおいて宿主細胞中へクローニングされてもよい。宿
主中に入ってすぐに、G A L 4遺伝子は染色体に
取り込まれるかまたは自己複製するプラスミド上に存在
してもよい。GAL4遺伝子は、宿主細胞と適合できる
適当な構成的または調節的プロモーター、例えば哺乳類
細胞系中のマウス乳ガンウィルス (MMTV)プロモ
ーター(Scheidereit ら、1983. N
ature 304.749 )の調節下にあるであろ
う。
合、GAL4遺伝子のようなガラクトース制御系の要素
が正常に存在するであろうし、それ故GAL UAS
は通常の経路において活性化されてもよい。他の宿主に
おいては、上記に言及したコード領域のガラクトース誘
導性の転写が起こるように、そのような要素で宿主を形
質転換する必要があるかもしれない。酵母のGAL4i
!!伝子を用いた咄乳類の細胞の形質転換は、Kaki
daniおよびPtashne、 1988. Ce1
l、 52.161−167並びにWebs terら
、1988. Ce1l、 52.169−178によ
り証明されている。そのような方法は、−iに、“DN
Aクローニング°゛第■巻、D、 Glover kA
、1986中のGorn+anによる章において教示さ
れている。GAL4遺伝子は、本発明のプロモーター−
UAS−プロモーターと同じベクターまたは別のベクタ
ーにおいて宿主細胞中へクローニングされてもよい。宿
主中に入ってすぐに、G A L 4遺伝子は染色体に
取り込まれるかまたは自己複製するプラスミド上に存在
してもよい。GAL4遺伝子は、宿主細胞と適合できる
適当な構成的または調節的プロモーター、例えば哺乳類
細胞系中のマウス乳ガンウィルス (MMTV)プロモ
ーター(Scheidereit ら、1983. N
ature 304.749 )の調節下にあるであろ
う。
上記(e)の方法の特に好ましい態様においては、微生
物(例えば実験用酵母またはパン酵母)が、第1のポリ
ペプチドが分泌されてそして発酵培地から精製され、そ
して第2のポリペプチドが細胞内だけに生産されそして
微生物の破壊細胞から精製することを可能にするもので
あり、後者はすでに発酵培地から分離されている。
物(例えば実験用酵母またはパン酵母)が、第1のポリ
ペプチドが分泌されてそして発酵培地から精製され、そ
して第2のポリペプチドが細胞内だけに生産されそして
微生物の破壊細胞から精製することを可能にするもので
あり、後者はすでに発酵培地から分離されている。
転写の調節は、化学的または物理的手段により調節され
るリプレッサーを提供するような酵母宿主を使って達成
され得る。GAL遺伝子に対する種々のコリブレッサー
は、グルコース、グリセロール、および旦へ旦80遺伝
子産物を包含する。
るリプレッサーを提供するような酵母宿主を使って達成
され得る。GAL遺伝子に対する種々のコリブレッサー
は、グルコース、グリセロール、および旦へ旦80遺伝
子産物を包含する。
正の制御または活性化は、ガラクトースのような誘導物
質(inducer)またはGAL4遺伝子産物のよう
な活性化物質(activator)で行なわれ得る。
質(inducer)またはGAL4遺伝子産物のよう
な活性化物質(activator)で行なわれ得る。
化学的制御を利用するよりもむしろ、温度域受性突然変
異を使用することもでき、これは通常約20°C〜50
“Cの範囲内で温度を上または下にシフトさせることに
よる・抑制および/または活性化を通して制御を可能に
する。
異を使用することもでき、これは通常約20°C〜50
“Cの範囲内で温度を上または下にシフトさせることに
よる・抑制および/または活性化を通して制御を可能に
する。
両プロモーターから下流にわたって、多数の機能を提供
する様々な種類のフランキング配列があってもよい。他
のDNA配列に連結できるように、特定の状況に応じて
該断片に付着末端または平滑末端を用意することもでき
る。分岐プロモーター機能のDNA配列を、必要な転写
または翻訳のシグナルを有する他の配列と連結せしめる
ために、プロモーターからすぐ下流を切断することが可
能である。
する様々な種類のフランキング配列があってもよい。他
のDNA配列に連結できるように、特定の状況に応じて
該断片に付着末端または平滑末端を用意することもでき
る。分岐プロモーター機能のDNA配列を、必要な転写
または翻訳のシグナルを有する他の配列と連結せしめる
ために、プロモーターからすぐ下流を切断することが可
能である。
所望により、プロモーターから下流のある部位に終点を
有することもでき、そこでは該プロモーターから下流の
そしてそれに関連した転写および翻訳の調節シグナルの
全てが除去されている。代わりに、プロモーターから下
流のそれら転写およ流の幾つかの塩基、通常約20塩基
以下、便利には10塩基以下を除去することができる。
有することもでき、そこでは該プロモーターから下流の
そしてそれに関連した転写および翻訳の調節シグナルの
全てが除去されている。代わりに、プロモーターから下
流のそれら転写およ流の幾つかの塩基、通常約20塩基
以下、便利には10塩基以下を除去することができる。
DNA配列配列績合を可能にするであろう部位で切断す
ることもできる。この最後の状況においては、融合タン
パク質が得られるであろう。
ることもできる。この最後の状況においては、融合タン
パク質が得られるであろう。
別々のUASを利用する代りに、本発明に係る症KL
UASを利用する利点は、2つのmRNAおよび/また
はポリペプチドの相対レベルが例えば1:1に固定され
るだろうということである。
UASを利用する利点は、2つのmRNAおよび/また
はポリペプチドの相対レベルが例えば1:1に固定され
るだろうということである。
これは、その2つのポリペプチドが同一の代謝経路にお
いて同一のタンパク質または酵素のサブユニットである
時に有用であるだろう。さらに、2つのコード領域/プ
ロモーター系に対して1つだけのUASの存在は、プラ
スミドの安定性を減少させそして組み換えの発生率を低
下させる傾向にある。2つのプロモーターはより生産的
であり、その他にコード領域の発現にとってEP−A−
132309のGALLおよびGAL 10プロモータ
ーよりも好都合であるかもしれない。
いて同一のタンパク質または酵素のサブユニットである
時に有用であるだろう。さらに、2つのコード領域/プ
ロモーター系に対して1つだけのUASの存在は、プラ
スミドの安定性を減少させそして組み換えの発生率を低
下させる傾向にある。2つのプロモーターはより生産的
であり、その他にコード領域の発現にとってEP−A−
132309のGALLおよびGAL 10プロモータ
ーよりも好都合であるかもしれない。
下記の例は、添付図を参照しながら本発明の好ましい態
様を説明するものである。
様を説明するものである。
[実施例]
1: −H3A ウロキ −ゼ本発明のD
NA配列の作製方法は以下のようであった。初めに、P
GK UASを除去しそしてGAL UASで置き
換えた。これはUASのす<5′側に且つPGKプロモ
ーターに対して遠位にユニーク制限部位を設ける方法に
おいて達成された。最後に、PGKプロモーターにより
指令される転写に関して転写が分岐的であるような方向
において該ユニーク部位にCYC−1プロモー −を挿
入した。最終的構成物は、発現のための外来遺伝子の挿
入に適するユニーク制限部位も含有した。
NA配列の作製方法は以下のようであった。初めに、P
GK UASを除去しそしてGAL UASで置き
換えた。これはUASのす<5′側に且つPGKプロモ
ーターに対して遠位にユニーク制限部位を設ける方法に
おいて達成された。最後に、PGKプロモーターにより
指令される転写に関して転写が分岐的であるような方向
において該ユニーク部位にCYC−1プロモー −を挿
入した。最終的構成物は、発現のための外来遺伝子の挿
入に適するユニーク制限部位も含有した。
DNAの操作においては標準法を利用した(Mania
tisら、(1982) ) 、製造業者の教示に従っ
て制限酵素および他の酵素を使用した。ホスホラミダイ
ト化学を利用して、製造業者により供給された試薬を使
ってApplied Biosystems 3808
機(Applied Bio中systems I
nc、、 Foster C1ty。
tisら、(1982) ) 、製造業者の教示に従っ
て制限酵素および他の酵素を使用した。ホスホラミダイ
ト化学を利用して、製造業者により供給された試薬を使
ってApplied Biosystems 3808
機(Applied Bio中systems I
nc、、 Foster C1ty。
Ca1ifornia)においてオリゴヌクレオチドを
合成した。
合成した。
他の常法、例えば大腸菌(E、Co11)および酵母株
の形質転換、細胞抽出物の調製、SDS電気泳動並びに
イムノブロッティングは、)linchliffeおよ
びKenny (1986)により記載されたように行
なった。
の形質転換、細胞抽出物の調製、SDS電気泳動並びに
イムノブロッティングは、)linchliffeおよ
びKenny (1986)により記載されたように行
なった。
PGK UASの除去
PGK UASの除去は、PGK遺伝子の5′非コー
ド領域の酵素的消化により達成された。その除去は次の
ように二方向で実施された。第一に、5′→Jの除去は
プラスミドpM A 27 (Mellorら、198
3)の誘導体において得られ、ここではPGKの5′−
非コード領域中の一800位のCIcbI部位が合成オ
リゴヌクレオチドリンカーを使ってユニーク−Xhol
制限部位に転換されている。このpMA27誘導体をX
ho[で切断し、そしてBAL31エンドヌクレアーゼ
で消化した。BamHI合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーの存在下でのライゲーションによりプラスミドを再び
環状にし、そして大腸菌を形質転換させた。DNA配列
決定により除去の終点を特徴づけた。ご→5′方向にお
ける除去は、pM A22 a (Dobson ら、
1982)の同様な修飾により行われ、この後者の場合
のみプラスミドをBAL31エンドヌクレアーゼ処理の
前にBamHlで消化した。前と同様に、DNA配列分
析により除去の終点を決定した。
ド領域の酵素的消化により達成された。その除去は次の
ように二方向で実施された。第一に、5′→Jの除去は
プラスミドpM A 27 (Mellorら、198
3)の誘導体において得られ、ここではPGKの5′−
非コード領域中の一800位のCIcbI部位が合成オ
リゴヌクレオチドリンカーを使ってユニーク−Xhol
制限部位に転換されている。このpMA27誘導体をX
ho[で切断し、そしてBAL31エンドヌクレアーゼ
で消化した。BamHI合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーの存在下でのライゲーションによりプラスミドを再び
環状にし、そして大腸菌を形質転換させた。DNA配列
決定により除去の終点を特徴づけた。ご→5′方向にお
ける除去は、pM A22 a (Dobson ら、
1982)の同様な修飾により行われ、この後者の場合
のみプラスミドをBAL31エンドヌクレアーゼ処理の
前にBamHlで消化した。前と同様に、DNA配列分
析により除去の終点を決定した。
プラスミドpDB4が、5′およびご欠失誘導体からの
適当なりamHI −Pst I断片を連結することに
より作製された。プラスミドpDB4は、−423位と
一470位との間が欠失しているがPGK UAS自
体を含む。それ故プラスミドpDB4は、PGK遺伝子
の5′−非コード領域中の欠失を除いて親プラスミドp
MA27と同じである。酵母を形質転換させる時、この
ベクターは、マルチコピー状態にあるにもかかわらすP
GKタンパク質のわずかに高い宿主染色体レベルを付与
するだけである。
適当なりamHI −Pst I断片を連結することに
より作製された。プラスミドpDB4は、−423位と
一470位との間が欠失しているがPGK UAS自
体を含む。それ故プラスミドpDB4は、PGK遺伝子
の5′−非コード領域中の欠失を除いて親プラスミドp
MA27と同じである。酵母を形質転換させる時、この
ベクターは、マルチコピー状態にあるにもかかわらすP
GKタンパク質のわずかに高い宿主染色体レベルを付与
するだけである。
ガークトース沃 PGK’ −の
GAL 1−GAL 10の分岐プロモーターの構成は
第1図において示される。UASの機能的領域の位置が
決定されており(Westら、1984) 、そしてそ
の位置はフランキング制限部位と一緒に示される。GA
LIOUASはプラスミドpLGSD 5(Guara
nteら、1982)において見い出すことができる。
第1図において示される。UASの機能的領域の位置が
決定されており(Westら、1984) 、そしてそ
の位置はフランキング制限部位と一緒に示される。GA
LIOUASはプラスミドpLGSD 5(Guara
nteら、1982)において見い出すことができる。
pLGSD 5から(D 144bpのRsal−へ
1uIDNA断片を単離し、そしてpUC8のSmaI
部位と平滑末端連結してpDBlを形成せしめ、そして
EcoR1部位をlれIIオリゴヌクレオチドリンカー
の挿入によりH■部位に転換した(第2図)。このよう
にしてGAL 10 UASがユニーク0且れU−B
amHI DNA断片として単離できた。次にこの断
片をpDB4中のユニークBamH1部位中ヘクローン
化した。生じたプラスミドpKV44はガラクトース制
御可能PGK遺伝子をコードすることが示された。ガラ
クトースの不在下では、pKV44を保有している酵母
においてpDB4と同じレヘルのPGKが認められた。
1uIDNA断片を単離し、そしてpUC8のSmaI
部位と平滑末端連結してpDBlを形成せしめ、そして
EcoR1部位をlれIIオリゴヌクレオチドリンカー
の挿入によりH■部位に転換した(第2図)。このよう
にしてGAL 10 UASがユニーク0且れU−B
amHI DNA断片として単離できた。次にこの断
片をpDB4中のユニークBamH1部位中ヘクローン
化した。生じたプラスミドpKV44はガラクトース制
御可能PGK遺伝子をコードすることが示された。ガラ
クトースの不在下では、pKV44を保有している酵母
においてpDB4と同じレヘルのPGKが認められた。
しかしながら、ガラクトースの添加の際そしてグルコー
スの不存在下では、pKV44を保有している株におい
て発現が著しく増加し、一方pDB4を保有している株
においてはPGKの発現レヘルが変化しなかった。
スの不存在下では、pKV44を保有している株におい
て発現が著しく増加し、一方pDB4を保有している株
においてはPGKの発現レヘルが変化しなかった。
GALIO:PGK ベタ −の
プラスミドpDB4をPGK構造遺伝子の3′領域中に
置かれたユニーク基JLLI[部位で消化し、そしてそ
の線状分子をBa131エンドヌクレアーゼで消化した
。DNA断片をフィルインしそして4nオリゴヌクレオ
チドリンカーの存在下で連結し、そうして形成されたプ
ラスミドをDNA配列分析によりスクリーニングして欠
失の終点を決定した。数ある中で、PGKコード配列に
関して一8位に終点を有する欠失体を得た。
置かれたユニーク基JLLI[部位で消化し、そしてそ
の線状分子をBa131エンドヌクレアーゼで消化した
。DNA断片をフィルインしそして4nオリゴヌクレオ
チドリンカーの存在下で連結し、そうして形成されたプ
ラスミドをDNA配列分析によりスクリーニングして欠
失の終点を決定した。数ある中で、PGKコード配列に
関して一8位に終点を有する欠失体を得た。
上記の欠失誘導体を、PGK遺伝子のご転写ターミネー
タ−配列の付加によりさらに修飾した。
タ−配列の付加によりさらに修飾した。
これは、几IIおよびPstlでの該プラスミドの消化
並びにそうして生成した大きい方の断片とプラスミドp
M A 9 HMellorら、1983)由来のPG
K遺伝子のご転写ターミネータ−を含む。且LLIIP
stl断片との連結により達成された。生じたプラスミ
ドをGALIOUASの挿入によりさらに修飾した。こ
のために、pDB2からのに■−旦amHI断片(第2
図)を単離し、そしてユニークBamH1部位において
挿入してプラスミドpKV50を生成せしめた(第3図
)。この後者のプラスミドにおけるUAS部位の配向は
、再形成された旦amH1部位がPGKプロモーターの
後方にくるようにする。
並びにそうして生成した大きい方の断片とプラスミドp
M A 9 HMellorら、1983)由来のPG
K遺伝子のご転写ターミネータ−を含む。且LLIIP
stl断片との連結により達成された。生じたプラスミ
ドをGALIOUASの挿入によりさらに修飾した。こ
のために、pDB2からのに■−旦amHI断片(第2
図)を単離し、そしてユニークBamH1部位において
挿入してプラスミドpKV50を生成せしめた(第3図
)。この後者のプラスミドにおけるUAS部位の配向は
、再形成された旦amH1部位がPGKプロモーターの
後方にくるようにする。
チトクロームC−1遺伝子並びにそれの5′およびIフ
ランキング領域はすでにクローン化されており、そして
それらのDNA配列は決定されている(Smithら、
1979)。該フランキング領域に基づいた発現ベクタ
ーは既に記載されており(ErnstおよびChan、
1985)、そしてそれを第4図に示す。
ランキング領域はすでにクローン化されており、そして
それらのDNA配列は決定されている(Smithら、
1979)。該フランキング領域に基づいた発現ベクタ
ーは既に記載されており(ErnstおよびChan、
1985)、そしてそれを第4図に示す。
このプラスミドpEX−2は、」匹R1−5胆I−Ba
m旧クローニングリンカ−の間にはさまれたプロモータ
ーおよびターミネータ−を含有し、その中に外来遺伝子
が発現のために挿入されていてもよい。プロモーター領
域は、該プロモーターがCYCI−13変異体から由来
するので開始コドンを含まず、この場合の開始コドンは
ATAに変異されている。従って翻訳は、この位置のご
側の最初の開始コドンで開始されるだろう。
m旧クローニングリンカ−の間にはさまれたプロモータ
ーおよびターミネータ−を含有し、その中に外来遺伝子
が発現のために挿入されていてもよい。プロモーター領
域は、該プロモーターがCYCI−13変異体から由来
するので開始コドンを含まず、この場合の開始コドンは
ATAに変異されている。従って翻訳は、この位置のご
側の最初の開始コドンで開始されるだろう。
5′領域にあるUA、Sの位置は既知である。これ4図
に示される(McNeillおよびSm1th、 19
86)。
に示される(McNeillおよびSm1th、 19
86)。
図示されたように、pE X−2からの0.5KbのH
ind m XhoT断片が転写ターミネータ−、ク
ローニングリンカ−およびプロモーターを包合するがU
AS配列は包含しないであろう。
ind m XhoT断片が転写ターミネータ−、ク
ローニングリンカ−およびプロモーターを包合するがU
AS配列は包含しないであろう。
2 ブロモ−−の
これは、pKV50中のGAL 10 UASに隣接
した前記の0.5KpのHind m−Xhol断片を
PGKプロモーターの遠位に置き、そしてPGKプロモ
ーターから反対方向を読み取ることにより達成すること
ができる。従って、pKV50をBamHIで消化し、
そしてポリメラーゼのフレノウ断片での処理により平滑
末端にする。次に、該0.5Kp断片をそれ自体も平滑
末端にされているこの種と連結する(第4図)。プロモ
ーターを含有する断片をどちらの配向においても挿入す
ることができ;正しく配向されたクローン、即ちUAS
O遠位にターミネータ−を有するものを第5図に示し、
それをpEK30と命名する。
した前記の0.5KpのHind m−Xhol断片を
PGKプロモーターの遠位に置き、そしてPGKプロモ
ーターから反対方向を読み取ることにより達成すること
ができる。従って、pKV50をBamHIで消化し、
そしてポリメラーゼのフレノウ断片での処理により平滑
末端にする。次に、該0.5Kp断片をそれ自体も平滑
末端にされているこの種と連結する(第4図)。プロモ
ーターを含有する断片をどちらの配向においても挿入す
ることができ;正しく配向されたクローン、即ちUAS
O遠位にターミネータ−を有するものを第5図に示し、
それをpEK30と命名する。
2 ブロモ−−による2つの ンパク2方向プ
ロモーターの有用性は、ISAおよびブローウロキナー
ゼの発現により証明された。
ロモーターの有用性は、ISAおよびブローウロキナー
ゼの発現により証明された。
H3A遺伝子をHinchliffeおよびKenny
(1986)により記載されたように作製し、そして
第6回において示されるプラスミドpEK113から得
た。
(1986)により記載されたように作製し、そして
第6回において示されるプラスミドpEK113から得
た。
ブローウロキナーゼの遺伝子をプラスミドpDBUro
l (第7図)から単離した。このプラスミドは、He
yneker ら(1986)により記載されたように
クローン化されたブローウロキナーゼ構造遺伝子cDN
Aを含有する。
l (第7図)から単離した。このプラスミドは、He
yneker ら(1986)により記載されたように
クローン化されたブローウロキナーゼ構造遺伝子cDN
Aを含有する。
しかしながら、pDBLlrol中の該DNA配列は、
それ自身開始コドンをもたないpE X−2またはpK
V50 (前掲)により生産されるものと同じじよう
な転写融合から成熟遺伝子産物が発現されれ得るように
、メチオニル−ブローウロキナーゼをコードするN O
Xコード領域において修飾されている。この部分の遺伝
子の配列は第7図に示されている。
それ自身開始コドンをもたないpE X−2またはpK
V50 (前掲)により生産されるものと同じじよう
な転写融合から成熟遺伝子産物が発現されれ得るように
、メチオニル−ブローウロキナーゼをコードするN O
Xコード領域において修飾されている。この部分の遺伝
子の配列は第7図に示されている。
ISAのサブクローニング
pE K113 ()IinchliffeおよびKe
nny、 1986)からの1.8kbのBamHI断
片を単離し、そしてpEK30の旦■■部位中にクロー
ニングしてプラスミドpEK31を与えた(第8図)。
nny、 1986)からの1.8kbのBamHI断
片を単離し、そしてpEK30の旦■■部位中にクロー
ニングしてプラスミドpEK31を与えた(第8図)。
ブローウロキナーゼのサブクローニングプラスミドpE
K31をSmalで消化し、pDBUrolからの1.
6kbのHind I[−3acl断片(この末端は、
T4DNAポリメラーゼでの処理により平滑末端化され
ている)と連結した。
K31をSmalで消化し、pDBUrolからの1.
6kbのHind I[−3acl断片(この末端は、
T4DNAポリメラーゼでの処理により平滑末端化され
ている)と連結した。
5aclは、この反応において脱離するご延長部分を残
し、一方5′延長部分はフィルインインされる。
し、一方5′延長部分はフィルインインされる。
該断片とベクターとを連結すると第9圓に示されるよう
なプラスミドpsJ22を生ずる。
なプラスミドpsJ22を生ずる。
プラスミドpsJ 22を酵母株D B Y745中に
形質転換しロイシン原栄養体について選択した。
形質転換しロイシン原栄養体について選択した。
単一の形質転換体D B Y745 (pS J 22
)を次のようにISAおよびブローウロキナーゼ生産に
ついて分析した。
)を次のようにISAおよびブローウロキナーゼ生産に
ついて分析した。
該株を、炭素源として2%(w/v)グルコースをを含
有するHaw LhorheおよびMortimer(
1960)により記載されたような最少培地中で、OD
、。。が1.0に達するまで培養した。この時点で培地
を収集し、少量のサンプルを取り出し、そして残りを炭
素源として2%(in/v)ガラクトースを補充した最
少培地中で同じOD6゜。値に再懸濁した。さらに24
時間インキュベーションを続け、その後で培地を収集し
、そして誘導された培養物と誘導されないサンプルとの
両方から細胞抽出物を調製した。該抽出物のタンパク質
含量をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノプ
ロットにより解析した(HinchliffeおよびK
enny、 1986)。その結果は第10図に示され
る。試料を2枚に負荷し、そして1セツトはウロキナー
ゼ抗体でプローブされ、もう1セントはISA抗体でプ
ローブされた。
有するHaw LhorheおよびMortimer(
1960)により記載されたような最少培地中で、OD
、。。が1.0に達するまで培養した。この時点で培地
を収集し、少量のサンプルを取り出し、そして残りを炭
素源として2%(in/v)ガラクトースを補充した最
少培地中で同じOD6゜。値に再懸濁した。さらに24
時間インキュベーションを続け、その後で培地を収集し
、そして誘導された培養物と誘導されないサンプルとの
両方から細胞抽出物を調製した。該抽出物のタンパク質
含量をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノプ
ロットにより解析した(HinchliffeおよびK
enny、 1986)。その結果は第10図に示され
る。試料を2枚に負荷し、そして1セツトはウロキナー
ゼ抗体でプローブされ、もう1セントはISA抗体でプ
ローブされた。
両タンパク質についての標準を含めた。図示されるよう
に、誘導前の試料中にはブローウロキナーゼが検出され
ず、ご(小レベルのISAだけが同試料中に観察された
。誘導に応じて、ブローウロキナーゼが現われ、そして
ISAの発現がバックグラウンドレベル以上に実質上増
加する。
に、誘導前の試料中にはブローウロキナーゼが検出され
ず、ご(小レベルのISAだけが同試料中に観察された
。誘導に応じて、ブローウロキナーゼが現われ、そして
ISAの発現がバックグラウンドレベル以上に実質上増
加する。
これらのデータは、2方向発現系の有用性を証明する。
12:パン
同様の結果が産業用の酵母株、特にパン酵母について得
られよう。しかし後者の場合には、初めに形質転換体の
選択のための適当な選択マーカー例えば高められたレベ
ルの銅イオンに耐性を付与するC U P−1遺伝子(
Hendersonら、1985)を導入してもよい。
られよう。しかし後者の場合には、初めに形質転換体の
選択のための適当な選択マーカー例えば高められたレベ
ルの銅イオンに耐性を付与するC U P−1遺伝子(
Hendersonら、1985)を導入してもよい。
CU P−1遺伝子は、プラスミドpF、T13:1(
Hendersonら、 1985)から得ることがで
き、その構造は概略的に第11図において示されている
。
Hendersonら、 1985)から得ることがで
き、その構造は概略的に第11図において示されている
。
これは2Kbのx匹■断片上においてCU P −1を
コードしている。従って、プラスミドpSJ22を+i
で消化し、そして上記の断片を連結すると、第12図に
示されるようなpSJ22aを生ずる。次にこのプラス
ミドをBBlO,2株中へ形質転換せしめ、Hinch
liffeおよびKenny (1986)により記載
されたように銅−耐性について選択してもよい。
コードしている。従って、プラスミドpSJ22を+i
で消化し、そして上記の断片を連結すると、第12図に
示されるようなpSJ22aを生ずる。次にこのプラス
ミドをBBlO,2株中へ形質転換せしめ、Hinch
liffeおよびKenny (1986)により記載
されたように銅−耐性について選択してもよい。
3:ブローウロキ −ゼの
この例においては、ISAおよびプローウロキナーゼの
誘導合成を、後者は例1のように細胞内に残留されるが
ISAは培地に分泌されるのを可能にするプラスミドを
二方向発現系を利用して作製した。これは、ISAの構
造遺伝子のすぐ5′側に酵母MFα−1遺伝子のシグナ
ル配列(プレプロ配列)を置くことにより達成された。
誘導合成を、後者は例1のように細胞内に残留されるが
ISAは培地に分泌されるのを可能にするプラスミドを
二方向発現系を利用して作製した。これは、ISAの構
造遺伝子のすぐ5′側に酵母MFα−1遺伝子のシグナ
ル配列(プレプロ配列)を置くことにより達成された。
MFα−1プレープロコード の
MFα−1プレ一プロ配列は、公表された配列(Pig
gott ら、1987. Current Gene
tics、 12+561−567)に従って、第13
図に示されるような一連のオリゴヌクレオドとして作製
された。これらはHeaphy ら、 Protein
Engineering、上1425−431.19
87により記載された方法に従って組み立てられた。オ
リゴヌクレオチド類は最初に酵素的にリン酸化され、混
合され、そしてHeaphyらにより記載されたように
連結された。オリゴヌクレオチドlおよび3aはリン酸
化されないままにしておいた。連結に続いて、希望とす
るフラグメントをM13m p 19(Messing
、 1983. Methods inEnzymol
ogy、 101 20 78)中のBamHI部位と
HindII[部位との間にクローニングし、mp19
αを生成せしめた。
gott ら、1987. Current Gene
tics、 12+561−567)に従って、第13
図に示されるような一連のオリゴヌクレオドとして作製
された。これらはHeaphy ら、 Protein
Engineering、上1425−431.19
87により記載された方法に従って組み立てられた。オ
リゴヌクレオチド類は最初に酵素的にリン酸化され、混
合され、そしてHeaphyらにより記載されたように
連結された。オリゴヌクレオチドlおよび3aはリン酸
化されないままにしておいた。連結に続いて、希望とす
るフラグメントをM13m p 19(Messing
、 1983. Methods inEnzymol
ogy、 101 20 78)中のBamHI部位と
HindII[部位との間にクローニングし、mp19
αを生成せしめた。
MFα−1プレープロ のISAへの初めに、Ti1
1) 19.7(HinchliffeおよびKenn
y1986)をXhoIおよび31ヌクレアーゼで消化
し、そして合成オリゴヌクレオチドと連結してmp19
.7αl(第14図)を生成せしめる。この後者の分子
を次にXbalおよび)遅」で消化し、そして同様に消
化されたpEK112と連結して、第15図に示される
ようなmp 19.7α2を生成せしめる。
1) 19.7(HinchliffeおよびKenn
y1986)をXhoIおよび31ヌクレアーゼで消化
し、そして合成オリゴヌクレオチドと連結してmp19
.7αl(第14図)を生成せしめる。この後者の分子
を次にXbalおよび)遅」で消化し、そして同様に消
化されたpEK112と連結して、第15図に示される
ようなmp 19.7α2を生成せしめる。
pEK112は、H3Aコード部分の挿入が形成体分子
において逆の方向であることを除いて、pE K113
(HinchliffeおよびKenny、 198
6)と本質的に等しい。
において逆の方向であることを除いて、pE K113
(HinchliffeおよびKenny、 198
6)と本質的に等しい。
この置換体は、旦amH1部位をISA構造遺伝子配列
のご側に置いた。最後に、mp 19αからのからのB
amHl−Hlnd m断片と連結し、そしてこの混合
物をHaで消化されたpEK30と連結してpEK44
(第16図)を生成せしめた。
のご側に置いた。最後に、mp 19αからのからのB
amHl−Hlnd m断片と連結し、そしてこの混合
物をHaで消化されたpEK30と連結してpEK44
(第16図)を生成せしめた。
EK44 のブローウロキナーゼ′ のL二二三ノ
久 プラスミドpEK44をSmalで消化し、そしてMe
t−u−PAをコードするpDBUrolからの平滑末
端化された3acl −Hlnd I[l断片と連結し
た。これは2方向発現プラスミドpEK72’(第17
図)を生じた。これは、成熟H3Aをコードしている遺
伝子の前にMFα−1プレ一プロ配列があることを除い
ては、本質的にプラスミドps J 22と等しい。
久 プラスミドpEK44をSmalで消化し、そしてMe
t−u−PAをコードするpDBUrolからの平滑末
端化された3acl −Hlnd I[l断片と連結し
た。これは2方向発現プラスミドpEK72’(第17
図)を生じた。これは、成熟H3Aをコードしている遺
伝子の前にMFα−1プレ一プロ配列があることを除い
ては、本質的にプラスミドps J 22と等しい。
形l上Ju1死た扼
プラスミドpEK44およびpEK72を、宿主酵母D
B Y745中に形質転換し、そして前に記載したよ
うに誘導した培養物および誘導しない培養物の両方の抽
出物を調製した。しかしこの場合には、SDS電気泳動
およびウエスタンブロツテングの技術を利用して、細胞
内画分をブローウロキナーゼについて分析しそして培地
をISAについて分析した。得られた結果を比較すると
pSJ22についての前の結果と一致した。ガラク+−
−ス不在下のpEK72はISAの低レベルの分泌を指
令し、これはガラクトース存在下では著しく増加した。
B Y745中に形質転換し、そして前に記載したよ
うに誘導した培養物および誘導しない培養物の両方の抽
出物を調製した。しかしこの場合には、SDS電気泳動
およびウエスタンブロツテングの技術を利用して、細胞
内画分をブローウロキナーゼについて分析しそして培地
をISAについて分析した。得られた結果を比較すると
pSJ22についての前の結果と一致した。ガラク+−
−ス不在下のpEK72はISAの低レベルの分泌を指
令し、これはガラクトース存在下では著しく増加した。
pEK72およびpEK44形質転換体により分泌され
るISAのレベルは同じであった。
るISAのレベルは同じであった。
pEK44培養物または非誘導のpEK72培養物の細
胞内抽出物においては、ブローウロキナーゼは検出され
ず、そしてガラクトースで誘導されたpEK72培養物
においてのみ検出することができた。
胞内抽出物においては、ブローウロキナーゼは検出され
ず、そしてガラクトースで誘導されたpEK72培養物
においてのみ検出することができた。
これらのデータは、2方向プロモーター系の有用性をさ
らに証明する。
らに証明する。
本発明のさらなる観点は、前述の新規プラスミド、 p
KV’50 、 pEK30 、 pEK31
。
KV’50 、 pEK30 、 pEK31
。
psJ 22およびpSJ22a、並びにpSJ22a
で形質転換された酵母(特にパン酵母)を包含する。
で形質転換された酵母(特にパン酵母)を包含する。
U−献
Dobsonら、 (1982)+ Nucleic
Ac1ds2625−2637゜ Res、+ 利。
Ac1ds2625−2637゜ Res、+ 利。
Gatignol、 A、、 Baron、 Fおよび
Tiraby、 G。
Tiraby、 G。
(1987) Mol、 Gen、 Genet、
207 342−348゜Giniger、E、、Va
rnum、S、M。
207 342−348゜Giniger、E、、Va
rnum、S、M。
(1985) Ce1l 40. 767 774゜お
よび Ptashne。
よび Ptashne。
門。
Gorman、C,(1986)
Glover、 D、鳩、 IRL”DNA Cl
oning” Press、0xford。
oning” Press、0xford。
Vo l ume
II
Guarante+ L、、 Yocum、 R,R,
、およびGifford、 P。
、およびGifford、 P。
(1982) Proc、 Natl、 八ca
d、 Sci、 tlsA 79. 74107
414゜ Haivthorne、 D、C,およびMortim
erGenetics 45 1085−1110゜
R,K。
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R,K。
Heaphyら(1987) Protein Eng
ineering上、425−431゜ Henderson、 R,C,A、、 Cox、 B
、S、および(1985)、 Curr、 Genet
、 9 、 133゜Heyneker+ H,L、、
Holmes、 W、E、およびG、A、 (198
6)英国特許2121050B。
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、S、および(1985)、 Curr、 Genet
、 9 、 133゜Heyneker+ H,L、、
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Tubb。
Vehar。
R1
H4nchliffe、 E。
EP−A−201239
および
Kenny。
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Hopper、 J、E、、 Broach+ J、R
,+およびRowe。
,+およびRowe。
L、B、 (1978) Proc、 Natl
、 Acad、 Sci、 tlsA 75゜
2878−2882゜ にakidani、 H,およびPtashne、 M
、(1988) Cel!。
、 Acad、 Sci、 tlsA 75゜
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A、J、、およびMellor+J、(1986)TI
BTEC)l 5,53−57゜Maniatis+
T、、 Fr1tsch+ E、F、およびSamb
rook+J、(1982) Mo1ecular
Cloning: A LaboratoryMan
ual、 Co1d Spring Harbor
Laboratory、ColdSpring Ha
rbor、N、Y、、IJSA。
A、J、、およびMellor+J、(1986)TI
BTEC)l 5,53−57゜Maniatis+
T、、 Fr1tsch+ E、F、およびSamb
rook+J、(1982) Mo1ecular
Cloning: A LaboratoryMan
ual、 Co1d Spring Harbor
Laboratory、ColdSpring Ha
rbor、N、Y、、IJSA。
McNeill、 J、B、+およびSm1th、 M
、 (1986) J−Mo1.Biol:、187.
363 378゜Mellor、J、、Dobson、
M、Jl Roberts、N、A−+Tuite、
M、F、、 Emtage、 J、S、、 W
hite、 S、、 Lowe。
、 (1986) J−Mo1.Biol:、187.
363 378゜Mellor、J、、Dobson、
M、Jl Roberts、N、A−+Tuite、
M、F、、 Emtage、 J、S、、 W
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P、A、、 Patel、 T、、 Kingsman
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M、+ Leung、 D、W、、 Gillam、
S、、およびAstell、 C,R,、(197
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、John、T、、5chrerer、S、、McDo
nnell、M、。
、 A、J、およびKingsman、 S、M、
(1983) Gene、24. 1−14゜Me
ssig+ (1983) Methods in
Enzymology 101+20−78゜ Piggot ら(1987) Current567
゜ 5cheidereit、 C,ら、 (1983)G
enetics 12.561− Nature 304.749−752、Sm1th、
M、+ Leung、 D、W、、 Gillam、
S、、およびAstell、 C,R,、(197
9) Ce1l、 14. 753−761゜St
、John、T、、5chrerer、S、、McDo
nnell、M、。
およびDavid、 R,(1981) J、 Mo1
.Biol、 152゜317−334゜ St、 John+ T、+およびDavid、 R,
(1981) J、 Mol。
.Biol、 152゜317−334゜ St、 John+ T、+およびDavid、 R,
(1981) J、 Mol。
Biol、 152 285−315゜St、 Jo
hn、 T、、およびDavis、 R,(1979)
Ce1116、 443−452゜ Webster、 N、ら(1988) Ce1l、
52.169−178West、 R,W、ら(198
4) Mo1. Ce11. Biol、土、 246
7−2478゜
hn、 T、、およびDavis、 R,(1979)
Ce1116、 443−452゜ Webster、 N、ら(1988) Ce1l、
52.169−178West、 R,W、ら(198
4) Mo1. Ce11. Biol、土、 246
7−2478゜
第1図は、S、セレビシェ−のGALLGALIO分岐
プロモーター領域の図解である;第2図は、UAS
GALプラスミドpDB1およびpDB2の構成を示す
: 第3図は、プラスミドpKV50の制限酵素地図である
: 第4図は、pEX−2の制限酵素地図である(Erns
tおよびChan+ 1985 ; Gatignol
ら、 1987から引用); 第5図は、pEK30の制限酵素地図である;第6図は
、pEK113の制限酵素地図()Iin−chlif
feおよびKenny、 1986)であり、ここで黒
ぬりのブロックはpBR322DNAを表わし、そして
白ぬきのブロックはnet−ISA 、DNAを表わ
す: 第7図はpDBUrolの制限酵素地図であり、ここで
N端のコード領域および5′領域の配列が示されている
; 第8図は、pEK31の制限酵素地図である;第9図は
、psJ22の制限酵素地図である;第10図は、ps
J 22におけるブローウロキナーゼおよびISAの細
胞内発現を証明するウェスタンブロンドの模式的表示で
ある。レーン1〜4および5〜8は、それぞれブローウ
ロキナーゼ抗血清およびH3A抗血清を使ったイムノプ
ロットを表わす。負荷の順は次のようである:レーンl
および5;誘導された可溶性細胞画分レーン2および7
;誘導された不溶性細胞画分レーン3および6;誘導さ
れない不溶性細胞画分 レーン4および8;それぞれウロキナーゼおよびISA
の標準物質: 第11図は、pET13:1の制限酵素地図である(H
endersonら1985) ;第12図は、pSJ
22aの制限酵素地図である;第13図は、部分的なM
Fα−1プレ一プロ配列をコードしている255塩基対
のBamHI −Hind■断片のヌクレオチド配列を
示す。これは合成二本鎖オリゴヌクレオチド1 1a、
2−2aおよび3−3aの連結により合成した。実
線は個々のオリゴヌクレオチドの境界を示す。次いでこ
の断片を、M13 mp 19のBamH1部位とH4
ndI11部位の間に挿入してmp 19αを生成せし
めた;第14図は、プラスミドmp 19.7α1の構
成を示す; 第15図は、プラスミドmp 19.7α2の構成を示
す; 第16図は、pEK44の構造を示す:第17図は、p
EK72の制限酵素地図である。 この場合H3A転写は、生じたポリペプチドが分泌され
るようにMFα−1融合である。u−PAはN−メチオ
ニルでありそして細胞内に残留されるであろう。 一面の浄書(内容に変更なし)
プロモーター領域の図解である;第2図は、UAS
GALプラスミドpDB1およびpDB2の構成を示す
: 第3図は、プラスミドpKV50の制限酵素地図である
: 第4図は、pEX−2の制限酵素地図である(Erns
tおよびChan+ 1985 ; Gatignol
ら、 1987から引用); 第5図は、pEK30の制限酵素地図である;第6図は
、pEK113の制限酵素地図()Iin−chlif
feおよびKenny、 1986)であり、ここで黒
ぬりのブロックはpBR322DNAを表わし、そして
白ぬきのブロックはnet−ISA 、DNAを表わ
す: 第7図はpDBUrolの制限酵素地図であり、ここで
N端のコード領域および5′領域の配列が示されている
; 第8図は、pEK31の制限酵素地図である;第9図は
、psJ22の制限酵素地図である;第10図は、ps
J 22におけるブローウロキナーゼおよびISAの細
胞内発現を証明するウェスタンブロンドの模式的表示で
ある。レーン1〜4および5〜8は、それぞれブローウ
ロキナーゼ抗血清およびH3A抗血清を使ったイムノプ
ロットを表わす。負荷の順は次のようである:レーンl
および5;誘導された可溶性細胞画分レーン2および7
;誘導された不溶性細胞画分レーン3および6;誘導さ
れない不溶性細胞画分 レーン4および8;それぞれウロキナーゼおよびISA
の標準物質: 第11図は、pET13:1の制限酵素地図である(H
endersonら1985) ;第12図は、pSJ
22aの制限酵素地図である;第13図は、部分的なM
Fα−1プレ一プロ配列をコードしている255塩基対
のBamHI −Hind■断片のヌクレオチド配列を
示す。これは合成二本鎖オリゴヌクレオチド1 1a、
2−2aおよび3−3aの連結により合成した。実
線は個々のオリゴヌクレオチドの境界を示す。次いでこ
の断片を、M13 mp 19のBamH1部位とH4
ndI11部位の間に挿入してmp 19αを生成せし
めた;第14図は、プラスミドmp 19.7α1の構
成を示す; 第15図は、プラスミドmp 19.7α2の構成を示
す; 第16図は、pEK44の構造を示す:第17図は、p
EK72の制限酵素地図である。 この場合H3A転写は、生じたポリペプチドが分泌され
るようにMFα−1融合である。u−PAはN−メチオ
ニルでありそして細胞内に残留されるであろう。 一面の浄書(内容に変更なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、第1および第2の転写プロモーターの間に置かれた
GAL UASを含んで成り、前記2つのプロモーター
の各々がGAL UASに対して異種のものである、D
NA配列。2、前記GAL UASから遠位の前記2つ
のプロモーターの両側に且つ該両プロモーターに関して
正しい読み枠においてそれぞれ置かれている2つのコー
ド領域を、該コード領域がそれぞれ¥GAL¥1および
¥GAL¥10についてのものでないという条件で、さ
らに含んで成る、請求項1に記載の配列。 3、前記2つのコード領域が、それぞれヒト血清アルブ
ミン(HSA)およびウロキナーゼをコードしている、
請求項2に記載の配列。 4、前記コード領域の一方がその5端にアミノ酸配列を
コードする開始領域を有し、該コード領域から翻訳され
たポリペプチドがそのN端で前記アミノ酸配列に連結さ
れてそしてDNA配列が転写および翻訳のために置かれ
る宿主細胞から分泌されるように選択されている、請求
項3に記載の配列。 5、前記GAL UASが、酵母中でGAL4タンパク
質を結合する4つの17塩基対の相同配列のいずれか1
つまたは複数のマルチコピーを含んで成る、請求項1〜
4のいずれか一項に記載の配列。 6、請求項1〜5のいずれか一項に記載の配列を含有し
そして微生物を形質転換するのに適するベクター。 7、酵母中で自己複製することのできる、請求項6に記
載のプラスミド。 8、請求項7に記載のプラスミドで形質転換された酵母
細胞。 9、前記GAL UASを活性化するのに十分な量のガ
ラクトースを含む適当な培地中で、請求項8に記載の酵
母細胞の発酵により2種またはそれより多くのポリペプ
チドを生産する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8726953 | 1987-11-18 | ||
GB878726953A GB8726953D0 (en) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | Yeast expression system |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH022380A true JPH022380A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=10627133
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63289004A Pending JPH022380A (ja) | 1987-11-18 | 1988-11-17 | 酵母発見系 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0317254B1 (ja) |
JP (1) | JPH022380A (ja) |
AT (1) | ATE95242T1 (ja) |
DE (1) | DE3884565T2 (ja) |
GB (1) | GB8726953D0 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4962426A (en) * | 1988-04-07 | 1990-10-09 | Hitachi, Ltd. | Dynamic noise reduction circuit for image luminance signal |
US5719462A (en) * | 1993-02-05 | 1998-02-17 | Nikon Corporation | Ultrasonic motor having improved stator |
US6046527A (en) * | 1996-07-05 | 2000-04-04 | Honeybee Robotics, Inc. | Ultrasonic positioner with multiple degrees of freedom of movement |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL101651A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus surface proteins with reduced host carbohydrate content |
US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
EP1997829A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-12-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU2002364587A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
DK2046826T3 (da) | 2006-07-24 | 2011-10-24 | Biorexis Pharmaceutical Corp | Exendin-fusionsproteiner |
SG11201608080RA (en) | 2014-04-17 | 2016-10-28 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh | Recombinant host cell for expressing proteins of interest |
SG11201608084TA (en) | 2014-04-17 | 2016-10-28 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh | Recombinant host cell engineered to overexpress helper proteins |
EP2952584A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-09 | Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG | Improved protein production |
WO2018178126A1 (en) | 2017-03-29 | 2018-10-04 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Recombinant host cell with altered membrane lipid composition |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0132309A3 (en) * | 1983-06-27 | 1985-12-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Novel regulatable eukaryotic promoter element |
-
1987
- 1987-11-18 GB GB878726953A patent/GB8726953D0/en active Pending
-
1988
- 1988-11-15 DE DE88310755T patent/DE3884565T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-15 EP EP88310755A patent/EP0317254B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-15 AT AT88310755T patent/ATE95242T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-17 JP JP63289004A patent/JPH022380A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4962426A (en) * | 1988-04-07 | 1990-10-09 | Hitachi, Ltd. | Dynamic noise reduction circuit for image luminance signal |
US5719462A (en) * | 1993-02-05 | 1998-02-17 | Nikon Corporation | Ultrasonic motor having improved stator |
US6046527A (en) * | 1996-07-05 | 2000-04-04 | Honeybee Robotics, Inc. | Ultrasonic positioner with multiple degrees of freedom of movement |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0317254A1 (en) | 1989-05-24 |
DE3884565T2 (de) | 1994-05-11 |
ATE95242T1 (de) | 1993-10-15 |
GB8726953D0 (en) | 1987-12-23 |
EP0317254B1 (en) | 1993-09-29 |
DE3884565D1 (de) | 1993-11-04 |
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