JPS63501614A - 外来タンパク質を分泌することを目的としたｂａｒ１の使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外来タンパク質を分泌することを 目的としたＢＡＲ１の使用法 本出願は、１９８５年１０月２５日に出願された出願番号７９１．３０５号の一 部継続出願である。

本発明は、少なくともサン力ロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｈａｒｏ−ｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＡＲｌのシグナルペプチド領域及び本ＤＮＡ 構築物で形質転換される宿主細胞に対して外来の少なくとも１つの構造遺伝子を 含む新しいＤＮＡ構築物に関するものである。上記構築物による宿主生物に形質 転換は、ＢＡＲ１のシグナルペプチドに融合した外来の遺伝子によりコードされ る構造タンパク質を含む一次翻訳生産物を発現し、その結果該タンパク質は宿主 細胞の分泌経路を通して処理され、宿主細胞から培地中もしくはべりプラスミン ク間隔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ）に分泌される。

異種ポリペプチドの生産に対し、その宿主として種々の原核及び真核性微生物が 用いられている。即ち、その宿主により自然界では生産されないポリペプチドを 、組換え技術によって生産させる。サツカロミセス０セレビシアエ（Ｓａｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃ ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アスベルギラス（Ａｓｐ ｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）及びニューロスポラ（Ｎｅｗｒｏｓｐｏｒａ）等を含む種 々の真核性菌類は特に興味深い。特に、出芽イーストＳ、セレビシアエ（ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）については、多くの研凭がなされてきている。プラスミドのよ うな、適当なりＮＡ構築物で形質転換すると、イースト細胞はそのプラスミド中 に含まれている異種遺伝子を発現することができる。しかし、この技術における 主要な限界は、多くの場合、そのタンパク質生産物が宿主細胞によって培地中に 分泌されず、その結果、その細胞を破壊し、そのタンパク質を変性又は不活性化 することなしに、種々の混在する細胞成分からその望ましいタンパク質を精製し なければならないことである。このように、形質転換した細胞が、後の生産物の 精製が簡単なように、その異種生産物を分泌するようにさせることができるのが 望ましい。加えて、あるタンパク質の場合には、宿主細胞の分泌経路に入り、適 当な処理、例えばジスルフィド結合の形成等がなされれば一層好ましい。

Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、それが本来生産するタンパク質 を分泌することが知られているが、その経路に関する知見は、細菌やホ乳動物細 胞からのタンパク質の分泌に関して知られているものに比べると全く限られたも のである。酵素のインバターゼ及び酸ホスファターゼは、細胞壁にも組込まれて いるが、イーストの分泌タンパク質の多くは、ペリプラズマ間隙に存在する酵素 である。Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって培地中に分泌され ることが分っているタンパク質は、接合ホルモン（α−因子及びａ−因子）、キ ラートキシン及びバリヤー活性に関するタンパク質（以後、“バリヤー”とする ）等である。細胞壁を通して培地への分泌は“エキスポート”とも呼ばれる。Ｓ 、セレビシアエ接合型α細胞は、培地中に分泌されるα−因子を生産し、一方、 ａ細胞は、２つの分泌ポリペプチド、ａ−因子及びバリヤーを生産する。α−因 子に対する遺伝子はクローン化され、配列決定され、解析されている（カージャ ン（Ｋｕｒｊａｎ）及びハースコビッツ（）ｌｅｒｓｋｏｖｉ　ｔｚ）セル（Ｃ ｅｌｌ）、３０巻、９３３〜９４３頁（１９８２年））。α−因子遺伝子からの シグナルペプチド（細胞に、それに付随するタンパク質を分泌させると考えられ ている短かいペプチド配列）、リーダー配列（成熟α−因子から切り離される前 駆体ポリペプチドを含む）及び非翻訳遺伝子配列（プロモーター及び制御類を含 む）は、イースト中で生産された外来り（Ｂｒａｋｅ）等、プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ％　８１巻、４６４２−４６４６頁、１９８４ 年）。α−因子の遺伝子の発現は、ＭＡＴα１遺伝子生産物により制御されてお り、また、α−因子前駆体の成熟タンパク質へのプロセッシングは、５ＴＥ１３ 及びＫＥＸ２遺伝子の制御下にあると考えられている、少なくとも２つのステッ プが必要であるようだ。

α−因子とは対照的に、バリヤーは、コンカナバリンＡに結合する能力に基づい て、グリコジル化されるようだ。バリヤーは、ａ細胞によって生産され、その発 現は、ＭＡＴα２遺伝子の制御下にあるようである。シグナルペプチドの切断は 別として、バリヤー前駆体のプロセッシングは今のところ示されてきていないし 、また、５ＴＥ１３及びＫＥＸ２遺伝子は、バリヤーの発現に関係していないと 考えられている。

α−因子及びバリヤーの発現とプロセンシングでの上記の差異のために、これら イースト遺伝子のどれが、特別な外来タンパク質の分泌をうながすのにより適当 であるか一部に言うことができない。この２つのタンパク質は異なる分泌経路を 通して処理されていくようであるので、バリヤーの分泌系の特性を利用すること は望ましいようだ。

それ故、本発明の目的は、少なくともシグナルペプチドをコードするＢＡＲ１遺 伝子の一部を含み、かつ宿主細胞の分泌経路を通してプロセッシングされる異種 タンパク質を微生物宿主内で発現させる外来構造遺伝子をも含むＤＮＡ構築物を 提供することにある。

さらに、本発明のもう１つの目的は、宿主細胞の分泌経路を通してプロセッシン グされる外来遺伝子によってコードされる異種タンパク質又はその１部を生ずる 微生物宿主内での外来遺伝子を発現させる方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、微生物宿主から分泌される外来タンパク質を生産す る方法を提供することにある。

またもう１つの本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術による外来タンパク質の生産 方法を提供することにある。

もう１つの目的は、組換えＤＮＡ技術によって、ヒトのプロインシュリン及びイ ンシュリンのアミノ酸配列を有するタンパク質を生産する方法を提供することに ある。

これらの及びその他の目的は、次に述べる特定の実施態様及び請求の範囲から明 らかであろう。

本発明は、少なくともサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｈａｒｏ−ｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＡＲ１遺伝子のシグナルペプチドをコードす る配列、宿主生物に対して外来の少なくとも１つの構造遺伝子及びＢＡＲ１シグ ナルペプチド及び外来タンパク質を含む融合タンパク質の宿主生物内での発現を 制御するプロモーターを含むＤＮＡ構築物及びその使用方法に関するものである 添付図 図１は、ＢＡＲ１遺伝子のヌクレオチド配列及びそれにより誘導された、−次翻 訳生産物のアミノ酸配列を示している。ＭＡＴα２結合部位は下線で示し、シグ ナルペプチドの推定切断位置を矢印で示し、潜在的なグリコジル化部位をアステ リスクで印を付けた。

図２は、プラスミドｐＺＶ９の図である。

図３は、プラスミドｐ２５４の構築を説明している。

図４は、プラスミドｐＺＶ３０、ｐＺＶ３１、ｐＺＶ３２及びｐＺＶ３３の構築 を説明している。

図５Ａ及び図５Ｂは、プラスミドｐｚｖｓｏの構築を説明している。

図６は、プラスミドｍ１１５の構築を説明している。

図７は、プラスミドｐＺＶ４９の構築を説明している。

図８は、ＴＰＩＩのプロモーターを含むプラスミドｐＺＶ１３４の構築を説明し ている。

図９は、ＭＦα１遺伝子の一部のサブクローニングを説明している。

図１０は、プラスミドｐＺＶ７５の構築を説明している。

図１１は、ＴＰＩＩプロモーター及びＢＡＲ１−ＭＦα１融合物を含むプラスミ ドの構築を説明している。

図１２は、プラスミドｐＳＷ２２の構築を説明している。

図１３は、ＢＡＲ１−ＭＦα１融合物を含むプラスミドの構築を説明している。

図１４は、ｐＺＶｌｏｏの構築を説明している。

図１５は、プラスミドｐＺ１０２の構築を説明している。

図１６は、プラスミドｐＳＷ９５の構築を説明している。

図１７は、プラスミドｐＳＷ９７の構築を説明している。

１１８は、プラスミドｐｓＷ９８及びｐｓＷ９９の構築を、説明している。Δは コドン２５の突然変異を示している。

ここで用いられているように、“ＤＮＡ構築物”という言葉はその分子中のヌク レオチド配列が天然のものと異なるように、ヒトの介在により修正されたプラス ミドを含むＤＮＡを意味している。またＤＮＡ構築物はそのように修正を受けた ＤＮＡ分子のクローンも含んでいる。“発現ベクター”及び“発現プラスミド” は、１つの転写開始部位及び宿主生物中で発現される目的のタンパク質をコード する少な（とも１つの構造遺伝子を含んでいるＤＮＡ構築物として定義される。

通常、発現ベクターは宿主生物中で、目的のタンパク質の発現及び複製の開始を 誘導するプロモーター及びターミネータ−のような適当な領域も含む。本発明に 従う発現ベクターは、通常抗生物質耐性又は栄養要求性マーカーのための遺伝子 のような選択マーカーも含む。

また“ＤＮＡ構築物”という言葉は、宿主染色体中に組込まれた発現ベクター領 域をも含むと考えられる。

“プラスミド′という言葉は、例えば、通常閉環で自己複製可能なりＮＡ構築物 であるというように、一般的な意味で使われている。

“シグナルペプチド”という言葉は、生産物を作り出した細胞の分泌経路中にそ の生産物を指向ける一次翻訳生産物のある領域を示している。通常、シグナルペ プチドは、そのプロセス中、シグナルペプチダーゼにより、発生したポリペプチ ドの残りの部分から切り離される。シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸のコア が存在するのが特徴で、−次翻訳産物はアミノ基末端から作られ、そして一般的 にその長さは約１７から２５個のアミノ酸から成り立っている。シグナルペプチ ダーゼ切断部位はフォノ・へ・インジ（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｎｊｅ）　（ヨーロピア ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ＝（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅａ ＋、）　１３３巻、１７頁（１９８３年）により特性が明らかにされた。ここで 用いられているように、“シグナルペプチド”という言葉は天然のシグナルペプ チドの機能領域をも示している。

本発明は、イーストのＢＡＲ１遺伝子又は、少なくともＢＡＲ１のシグナルペプ チドをコードする領域と結合する外来遺伝子を含むＤＮＡ構築物で宿主を形質転 換することにより、その形質転換した細胞がその異種タンパク質を分泌経路に指 向けるようにする方法を提供する。そのようにプロセシングされたタンパク質は べりプラスミンク間隙又は培地中に分泌される。イ゛−ストのＢＡＲ１遺伝子は 、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ａ細胞により分泌されるグリコ ジル化されたタンパク質であると考えられているバリヤー活性をコードしている 。分泌されたバリヤーは、接合型ａ細胞がα因子により誘導されるＧ１アレスト （ａｒｒｅｓｔ）に打勝つように働く。バリヤーはプロテアーゼであると考えら れている。

（マネー（Ｍａｎｎｅｙ）　％ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　、１５５巻、２９１〜３０１頁、１９８３年）ＢＡ Ｒ１遺伝子の転写はα−因子により活性化される。バリヤー、又は類似の活性は 、α又は、ａ／α細胞中では検出されない。すなわち、ＢＡＲ１遺伝子は、これ らの細胞中では転写されない。

ＢＡＲ１遺伝子は２７５０塩基対配列にわたり、図１にその一次翻訳産物のアミ ノ酸配列と共に示した。ＢＡＲＩのＡＴＧ翻訳開始部位は、イーストの遺伝子ラ イブラリーから得られるフラグメントからサブクローンした図１に示されるおよ そ２．７５ｋｂのフラグメントの６８１８１番目置に存在する。（ナスミス（Ｎ ａｓ＋ａｙｔｈ）及びタンチェル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ）　％セル（Ｃｅｌｌ）　 １９巻、７５３〜　。

７６４頁、１９８０年）。読み取り枠は＋１番のＡＴＧコドンで始まり、３′方 向に１７６１塩基対まで伸びている。ＢＡＲ１の第一次翻訳産物の最初の２４ケ のアミノ酸は、既知のイースト及びホ乳類のシグナルペプチドと同じであるよう だ。このように、２４番目のアラニンはイーストのインバターゼや酸ホスファタ ーゼにおけるのと同様に切断部位とし使われている。また切断は２３番目のアミ ノ酸のあとにも起こりうるようだ。成熟分泌バリヤーのグリコジル化の程度はま だ分っていないが、−次翻訳産物中には、少なくとも９個の潜在的なアスパラギ ン結合のグリコジル化部位が存在する。ＢＡＲ１遺伝子のプロモーター及び制御 面域は、その翻訳開始コドンの５′側のおよそ６８０塩基対の領域内に存在する 。全プロモーター機能及びα−因子による刺激に対する応答は５′側の非翻訳領 域のＡＴＧに隣接したおよそ６８０塩基対に局在化している。

本発明のＤＮＡ構築物は好ましくは、バリヤーと外来タンパク質領域の結合部分 に切断部位をコードしている。その好ましい部位は、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子産物により認識され、切断されるアミノ酸配 列、ＫＥＸ２切断部位である。（シュリアス（Ｊｕｌｉｕｓ）等、セル（Ｃｅｌ ｌ）　３７巻、１０７５〜１０８０頁、１９８４年）ＫＥＸ２部位は、リジン及 びアルギニンのような１対の塩基性アミノ酸により特徴づけられる。ＫＥＸ２部 位の配列は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇであることが望ましい。ＢＡＲ １−次翻訳産物は、その構造領域中にそのようなベアーを２組含んでいる。１７ ？−１７’８番目のＡｒｇ−Ａｒｇと、４０４−４０５０５番目ｙｓ−Ｌｙｓで ある。上に記したようにＫＥＸ２遺伝子は、バリヤー前駆体タンパク質のプロセ ッシングには関係していない。このことは、潜在的なプロセッシング部位はタン パク質のコンホメーション又は、グリコジル化により妨害されていること、さら に、バリヤーは通常α−因子のようなＫＥＸ２でプロセッシングされるタンパク 質によって用いられるのとは異なる経路を通してプロセンシングされるのかもし れないことを暗示している。しかし、出願者は、目的のタンパク質と共に、ＢＡ Ｒ１遺伝子のシグナルペプチドを含むＢＡＲ１遺伝子の一次翻訳産物を含む融合 タンパク質中にＫＥＸ２切断部位を含めることにより、融合タンパク質は、ＫＥ Ｘ２部位で切断し、目的のタンパク質を分泌することを発見した。また、ＫＥＸ ２切断部位を含む融合タンパク質のバリヤー領域のシグナルペプチダーゼによる 切断の効率を減少させることにより、高濃度の目的タンパク質を分泌することも 分った。ＫＥＸ２切断部位は、ＢＡＲ１配列又は目的の遺伝子により与えられる ことができるし、また、リンカ−の付加、特定部位の突然変異誘発、その他の方 法によりその融合物中に導入することができる。

このように、本発明に従って、ＡＴＧ開始コドン及びシグナルペプチドをコード する配列を含むＢＡＲ１遺伝子の一部を目的の外来遺伝子に結合し、真核性宿主 細胞に形質転換することができる。生成した融合遺伝子は、ＢＡＲ１及び外来配 列の接合部分に、プロセンシング部位、好ましくはＫＥＸ２切断部位を含むこと になる。また、このような構築物は、ＢＡＲ１遺伝子の５′側非コーデイング領 域からの制御領域及びプロモーターを含むことができ、又は、他の遺伝子からの 制御領域及び／又はプロモーターを含むこともできる。ＢＡＲ１遺伝子からのプ ロモーターに加えて、用いられるその他のプロモーターは、Ｓ、セレビシアエ（ ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉａｅ）のアルコールデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒド ロゲナーゼ■遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩＩプロモーターのような　Ｓ、 セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の解糖系の遺伝子由来のプロモーター及 び、分体性イーストのシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を含む、他の種由来の相当する遺伝子由来のプロ モーターを含んでいる（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）とホール（）ｆａｌり　、ジ ャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ ｌ、）　２５８巻、１４３〜１４９頁、１９８３年、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ） 　、ネーチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　３０１巻、１６７〜１６９頁、１９８３年） 、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール・デヒドロゲナーゼ Ｉの遺伝子は、アメラー（Ａｍｍｅｒｅｒ）によって述べられている（メソッド イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１ ０１巻、１９２〜２０１頁（１９８３年）。

アルコール・デヒドロゲナーゼ■の遺伝子は、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｔ）等によ り述べられている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー〇、Ｂｉ ｏ１．　Ｃｈｅｍ、）　２５８巻、２６７４〜２６８２頁、１９８３年）、Ｓ、 セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の解糖遺伝子については、カヮサキ（Ｋ ａｗａｓａｋｉ）　（ワシントン大学医学博士論文、１９７９年）、ヒッツェマ ン（Ｈ４ｔｚｅｍａｎ）等（ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー （Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　２２５巻、１２０７３〜１２０８０頁、１ ９８０年）、カヮサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）とフランケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ） 、（バイオケミカル・アンドバイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション （Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　）　１０８巻、１１０７〜１１１２ 頁、１９８２年）及び、アルバー（Ａｌｂｅｒ）とカヮサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ ）　（ジャ、−ナル・オブ・モレキュラーアンドアプライド・ジェネティクス（ Ｊ。

Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　１巻、４１９〜４３４頁１９８２年 ）等により述べられている。

好ましい態様においては、ＢＡＲ１遺伝子のシグナル・ペプチドをコードする配 列は、ＫＥＸ２切断部位を含む融合タンパク質のバリヤー領域のシグナルペプチ ダーゼ切断の効率が減少するよう修正されている。これは、好ましくは、アミノ 酸２３−２４（バリヤータンパク質配列の）接合部又はアミノ［１１２４−２５ 接合部等の潜在的切断部位の特定部位の突然変異誘発により行なわれる。

本発明に従ってＤＮＡ構築物を作るのに用いる方法は、従来の技術を含んでいる 。構造ＲＡＲＩ遺伝子又はその一部及び、発現すべき構造遺伝子は単一のプロモ ータの支配下にあるのが好ましい。ＤＮＡ断片の連結法は、広く述べられており 、これを成すことは、通常の当業者の能力範囲にある。発現すべきタンパク質の ＤＮＡコード配列は、基本的に、いかなるタンパク質のものでもよいが、特に商 業的に重要な、インターフェロン、インシュリン、プロインシュリン、α−１− アンチトリプシン、成長因子及び組織プラスミノーゲン活性化因子のようなタン パク質のものである。

ＢＡＲ１遺伝子もしくはその一部と、発現すべき構造遺伝子を含むＤＮＡ横築物 の調製後、その構築物を形質転換の条件下で、宿主生物へ形質転換する。原核生 物及び真核生物（ホ乳類を含む）を形質転換する技術は文献的に知られている。

好ましくは、宿主生物は、出芽イーストのサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）の株であろう。しかし、分体性 イーストのシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈ−ｉｚｏ−ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）や、繊維状菌類アスベルギラス・ニドウランス（Ａｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）やニューロスポラ（Ｎｅｗｒｏｓｐｏｒ ａ）ｓｐｐ、を含む他の菌類も使用することができる。

次にあげる実施例は、例として与えられたもので、制限として与えたものではな い。他に記述していないかぎり、標準的な分子生物学的方法が全体を通し用いら れている。制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューイングランドバイオ ラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びべ−リンガーマンハイ ムバイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ）から購入し、一般的には、膵臓のＲＮａｓｅ　（１０μｇ／ｍｊり を消化のために添加して、製造業者の指定する方法に従い使用した。Ｔ４ＤＮＡ リガーゼはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）もしくはべ一すンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手し、指示された方法に従い使用 した。Ｍ１３及びｐｔｒｃ宿主株及びベクターはベセスダ・リサーチ・ラボラト リーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から 入手した。Ｍ１３のクローニングはメツシンク（Ｍｅｓｓｉｎｇ）により、メソ ッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）、１０１巻、７０−７７頁（１９８３年）に報告した方法に従って行った。Ｄ 　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ　（クレノーフラグメント）は、マニアチス（Ｍａｎｉ ａｔｉｓ）等により述べられた方法に従い使用したニラボラトリー・マニュアル （Ａ、　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　％コールドスプリング・ハーバ −・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ）　（１９８２年）。大腸菌培養物の形質転換はポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ） 等の方法に従った；ジーン（Ｇｅｎｅ）、２巻、９５〜１１３頁（１９７７年） 、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅ−ｖｉｓｉａｅ）の培養物はベンゲス（Ｂｅｇｇ ｓ）の方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７５巻、１０４〜１０８頁（１ ９７８年））にマツケイ（Ｍａｃｋａｙ）の修正を加え（メソッド・イン・エン ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１０１巻、３ ２５頁（１９８３年））で形質転換した。支配フェロモンα−因子は、グンゼ（ Ｄｕｎｔｚｅ）等の方法に（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト リー（Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ）　％　３５巻、３５７−３６５頁、１９ ７３年）、マネー（Ｍａｎｎｅｙ）等の修正（ジャーナル・オブ・セル・バイオ ケミストリー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　９６巻、１５９２〜１ ６００頁、１９８３年）を加えた方法で調製するか、もしくはシグマ・ケミカル ・カンパ−−−’　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）から購入した 。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍ）モデル３８０Ａ　ＤＮＡ合成機で合成し、変性ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により精製した。

方法 （バリヤー活性の検定） 形質転換したイースト細胞によるバリヤー産生の検出に用いた検定法はバリヤー がα−因子にさらされた感受性ａ＠胞の増殖の阻害を押さえる能力によっている 。テスト株は、それがバリヤー活性をもたないという理由で、Ｒｅ６２９　（Ｍ ＡＴｃｔｂａｒｌ）株のような、α−因子に異常に感受性を示すものを用いた。

寒天プレート上に重層した乾寒天中に上記の株のローンを作った。十分なα−因 子量＜０．０５〜０．１ニー’−７ト；マネー（Ｍａｎｎｅｙ）等により検定さ れた値、同誌）をその重層の上に添加し、細胞の生育を阻止した。バリヤー産生 でスクリーニングされた形質転換をそのローン上にスポツティングし、形質転換 された細胞によるバリヤーの分泌がスポットの周辺のα−因子による生育阻害を 押え、それにより感受性細胞が再生することができる。その再生した細胞は形質 転換した細胞のコロニーの正常の滑らかなエツジのまわりの生育のフリンジとし て観察される。このフリンジの存在は、形質転換した株中のプラスミドがバリヤ ーの発現及び分泌をうながしていることを示している。

（ＩＲＩ及びＩＲＣ検定） ＩＲＩ及びＩＲＣ検定は、ノボ・インダストリ（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ） （バグスバード（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）、デンマーク）から入手した市販のキッ トを使って行った。ギニア豚抗−豚インシュリン及びギニア豚抗ヒトＣ−ペプチ ド抗体はキットのものを使用した。

、（ＴＲＩ検定） （１１ＮａＦＡＭ（ウシ血清アルブミンを含むｐＨ７，４の０．０４Ｍリン酸バ ッファ）中５０μｌの試料 （２１５０μｌ抗体（ストックを３０倍希釈）（３）４℃で１６〜２４時間 （４１５０μＪ（Ｄ”’ｌ−１７シユｌＪ７　（１００倍希釈）（５）４℃で２ 時間 ＋６１　ＮａＦＡＭ中１％のスタフィロコフカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　５０　ｕ　１（７）０℃、４５分間 （８）１％ＢＳＡ／ＴＮＥＮ”で２回洗浄（９）遠心及びペレット計数 ペレットをシンチレーション・バイアルに移すまでは、便宜上各ステップは、マ イクロプレート中で行った。

＊　ＴＮＥＮ　：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０１００ｍＭ　ＮａＣＩ！ １ｍＭ　ＥＤＴＡ ０．５％ＮＰ−４０ （ＩＲＣ検定） （１）ＮａＦＡＭ中の試料５０ｐｌ （２１５０μ！抗体くストック５０倍希釈）（３）４℃で１６〜２４時間 ＋４１　５Ｑμ！（７）”５１−Ｃペア”チＦ　（ス）ツク３０倍希釈）（５） ４℃、２〜４時間 ＋６１　ＮａＦＡＭ中１％のＳ、アウレウス（ａｕｒｕｓ）　５０　ｐ　ｊ！（ ７）０℃で４５分間 （８）１％ＢＳ’Ａ／ＴＮＥＮで二度洗浄（９）遠心及びペレットの計数 （α−因子活性検定） 形質転換したイースト細胞によるα因子分泌の検出に用いた検定法は、感受性ａ 細胞の生育をα因子が阻害する能力を利用している。テスト株（Ｓ、セレビシア エ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＲＣ６２９株（ＭＡ　Ｔａ　ｂａｒ　１　）のよ うな）は、ＢＡＲＩ遺伝子に、バリヤー活性の生産を妨害し、その細胞をα因子 に対し、鐙惑受性にする突然変異を含んでいる。テスト株のローンを標準イース ト選択合成培地（例えば、ロイシンを欠いた培地）のプレート上に軟寒天を重層 したもので作った。α因子輸送でスクリーニングした形質転換体をそのローン上 にスポットし、３０℃でインキュベートした。その形質転換体によるα因子の分 泌はそのコロニーの周辺のローン内の生育を阻害するであろう。テスト細胞のロ ーン中の生育阻害によるハローは、そのコロニーが活性のあるα因子を分泌して いることを示す。ハローの大きさの比較で、各形質転換体により分泌されるα− 因子の相対的量を見積ることができる。

実施例Ｉ ＢＡＲ１遺伝子を用いたＳ、セレビシアエ中でのプロインシュリンの発現 全イースト遺伝子を含む組換えプラスミドプールをシャトルベクターＹＥｐ１３ （ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、８巻、１２１〜１３３ 頁、１９７９年）を用いて構築した（ナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）及びタッチエ ル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ）　、セル（Ｃｅ１１）　、１９巻、７５３〜７６４頁、 １９８０年））、５ａｕ３Ａの部分分解によって生成したイーストのＤＮＡ断片 をＢａｍＨＩで消化したＹＥｐ１３に挿入した。そのプラスミドブールをＳ、セ レビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｘ　Ｐ　６３５−１０　Ｃ株（ＭＡＴａ 　１ｅｕ２−３１ｅｕ２−１１２　ｂａｒｌ−１ｑａ１２：ＡＴＣＣ＃２０６７ ９）に形質転換し、その形質転換体をロイシン原栄養性及びａ　ｂａｒ　１細胞 に阻害的な濃度のα因子を含む培地での生育により選択した。

生じたコロニーはバリヤー活性を分泌する能力でスクリーニングした。ロイシン への非依存性とバリヤー分泌能をもつ２つのコロニーが見つかった。これらのコ ロニーはｐＢＡＲ２及びｐＢＡｉ３と命名したプラスミドを有している。これら ２つの形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡを大腸菌のＲＲＩ株（ＡＴＣＣ ＃３１３４３）を形質転換するのに用いた。この形質転換体はアンピシリン耐性 により選択した。プラスミドｐＢＡＲ２及びｐＢＡＲ３を大腸菌の形質転換体か ら精製し、制限エンドヌクレアーゼ消化とアガローズ又はアクリルアミドゲル電 気泳動によりその特性を明らかにした。プラスミドｐＢＡＲ２はおよそ９．２キ ロ塩基の挿入物を含むことが分った。プラスミドｐＢＡＲ２で形質転換した大腸 菌ＲＲＩは、受理番号３９４１０号としてＡＴＣＣに登録した。

サブクローニングによりｐＢＡＲ３プラス、ミド挿入物は、ｐＢＡＲ２の挿入物 の一部であるが、ベクター上で、蕃の方向が逆であることが分った。さらにサブ クローニングと、バリヤー分泌に対するスクリーニングにより、機能性のＢＡＲ １遺伝子間列をおよそ２．７５ｋｂの領域に絞ることができた。この断片は、コ ード配列、非翻訳の転写配列、プロモーター、制御領域、転写のターミネータ− 及び隣接する染色体配列を含んでいる。

プラスミドｐＢＡＲ２を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌ［Ｉ及びＸｈｏｌで 消化し、およそ３ｋｂの断片をアガローズゲル電気泳動で精製した。この断片を Ｈｉｎｄ　ｍ及び５ａｉ１で消化したプラスミドｐＵｃ１３中に挿入した。ｐＺ Ｖ９　（図２）と命名した、この組換えプラスミドを大腸菌への形質転換に用い ることができるが、複製に必要な開始点及びイーストベクターに対する選択マー カーを欠いている。大腸菌ＲＲＩ株の形質転換体中のプラスミドｐＺＶ９を、受 理番号５３２８３号としてＡＴＣＣに登録した。

プロインシュリンの分泌をうながすのに用いるＢＡＲＩ遺伝子ポリペプチドが望 ましくは、生体内で切断されうるＢＡＲ１配列中の個所で行なわれた。ＢＡＲ１ 遺伝子中の数部位が潜在的な切断個所となる；１７７〜１７８番のＡｒｇ−Ａｒ ｇをプロインシュリンの融合のテスト部位として選んだ。従って、その５′側制 御配列及びＢＡＲ１のコード配列のおよそ８００塩基対を、１．９　ｋｂのＨｉ ｎｄｌＩｌ　−Ｓａｌ　１断片として、プラスミドから精製した。

図３に、ヒトのプレプロインシュリンのｃＤＮＡをサブクローニングする方法を 示した。ヒトのプレプロインシュリンｃＤＮＡ（ｐｒｅ　Ｂ　ＣＡ　ｃｌｏｎｅ ）　、ｐ　２７をＰｓｔｌで消化したｐＢＲ３２２の末端をＧ−テーリングする こと及び、ヒトの膵臓由来の全ＲＮＡを逆転写することにより作った、Ｃ−テー リングしたＤＮＡの挿入により作った。プラスミドｐＢＲ３２７はソベロン（Ｓ ｏｂｅｒｏｎ）等により、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、９巻、２８７−３０５頁（１ ９８０年）に報告されており、ヒトのプレプロインシュリンの配列はベル（Ｂｅ ｌｌ）等によりネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２３２巻、５２５−５２７頁（ １９７９年）に報告されている。完全な翻訳配列はＮｃｏｌ−Ｈｇａ　Ｉ断片と して切り出した。突き出た末端は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ　（クレノーフラグ メント）で満たし、合成したＥｃ。

Ｒ１リンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）及びＸｂａ　Ｉリンカ−（ＣＴＣＴＡＧＡＧ ）を同時に結合した。ＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断したｐＵｃ１３（ビエイラ（ Ｖｉｅｉｒａ）及びメフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９ 巻、２５９−２６８頁、１９８２年；及びメフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）メソツ ド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ３’）　１０１巻、２０−７７頁（１９８３年））に そのフラグメントをサブクローンした。その５′端へのＥｃｏＲＩリンカ−の付 加は、Ｎｃｏ　１部位（ＣＣＡＴＧＧ）をその開始コドン中に維持させるので、 プラスミドは３４０塩基対の挿入物に隣在するＥＣＯＲＩ％　ＮＣＯＩ及びＸｂ ａ１部位の存在でスクリーニングされる。これらの性質をもつプラスミドは、図 ３に示すようにｐ４７と命名した。５′プラント末端をもつプロインシュリン（ ＢＣＡ）断片をプラスミドＩ）４７のプライマー修複合成によす作った（ローン （Ｌａｗｎ）等、ヌレクイック・アシソズ・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、）　９巻、６１０３−６１１４頁１９８１年）。

さらにＸｂａｌによる消化でｐＵｃ１２に挿入する２７０塩基対のフラグメント を生成した。（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）及びメフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、 同誌、及びメンシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）同誌）。そのベクターをＨｉｎｄ　ｍ で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノーフラグメント）でプラントエンド 化し、Ｘｂａｌで消化し、そしてゲルによる精製をすることにより調製した。１ つのプラントエンド及び１つのＸｂａｌ粘着末端を含む、そのベクターフラグメ ントを、上述のＢＣＡフラグメントに連結した。成熟型のＢＣＡはアミノ酸フェ ニルアラニンで開始（コドンＴＴＴ）するので、その２つのフラグメントのプラ ントエンドの連結は、その結合部にＨｉｎｄＩ［１部位を生ずる。プラスミドは 、まず、Ｈｉｎｄｎ１部位の再生によりスクリーニングし、さらに、Ｍ１３シー ケンシングブライマーを用いて、その結合部を配列決定することにより、スクリ ーニングした。プラスミドｐ２４５は正しい配列を有していた。

図４のように、プラスミドｐ２５４をＨｉｎｄＩ［［及びＥｃｏＲＩテ消化し、 およそ２７０塩基対のプロインシュリン断片をゲルにより精製した。その断片の 末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメント）とデオキシヌクレオチド三 リン酸を用いてプラント化した。Ｓａｌ　Ｉリンカ−配列（ＧＧＴＣＧＡＣＣ） を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−”Ｐ−ＡＴＰを用いて処理し、プラン トエンドをもつプロインシュリン断片に連結した。Ｓａｌ　Ｉ及びＢａｍＨｌに よる消化と、１．５％アガロースゲル電気泳動により、５ａｌＩ及びＢａｍＨ１ 粘着末端をもつプロインシュリン断片を生成した。

プロインシュリン断片及び１．９ｋｂのＢＡＲ１断片をＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＢａ ｍＨｌで消化したｐＵｃ１３に一緒に連結した。この構築物は大腸菌に１２　（ ＪＭ８３）を形質転換するのに用いた。

形質転換した細胞をアンピシリン耐性及び白色コロニーの産生によってスクリー ニングした。さらにＨｉｎｄＩ［［、ＢａｎＨｌ及びＳａｔ　Ｉを用いた制限エ ンドヌクレアーゼ消化によるスクリーニングにより、適正な大きさのＨｉｎｄＩ ［［−Ｂ　ａｍ　Ｈ１断片及び単一のＳａｌ　１部位を含むプラスミド（ｐＺＶ ２７）と同定された。

プロインシュリンの第１番目のアミノ酸をＢＡＲ１遺伝子産物のＡｒｇ　Ａｒｇ の潜在的プロセッシング部位を結合するために、ＢＡＲ１−プロインシュリン融 合物中の介在物は欠失させた。次のような方法によってこの外来物質をループア ウトさせるために合成オリゴヌクレオチドを用いた。図４のように、プラスミド ｐＺＶ２７をＨｉｎｄ　ｍ及びＢａｍＨｌで消化し、およそ２．２　ｋｂのＢＡ ＲＩ−プロインシュリン融合物ｍ１片をゲルにより精製した。

さらに、この断片を、）（ｉｎｄｌｌ［及びＢａｍＨｌで消化した、複製型のフ ァージベクターＭ１３ｍｐＨ（メフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、メソッド・イン ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｉｏｌｏｇｙ）、１０１巻、 ２０−７７頁（１９８３年）中に挿入した。この組換えＤＮＡを大腸菌に１２　 （ＪＭ１０３）にトランスフェクトした。

（メフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、同誌）、白色プラークをビックアンプし、 その複製型の組換えファージを（Ｈｉｎｄ　ｍ＋ｓａｌ　１）及び（Ｓａｌｌ　 ＋Ｂａｍ　Ｈｌ）を用いた二重酵素消化による適正な制限パターンでスクリーニ ングした。望ましいパターンを示す構築物はｍｐＨＺＶ２９として知られている 。オリゴヌクレオチドブライマー（配列：３’　ＧＧＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡ ＣＴＴＧ５’）をγ−”Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでラベル した。さらに７．５μｍｏ＋のリン酸化プライマーを８０ｎｇのＭ１３シーケン シングプライマー（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅＳｄａ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）　）と合わせ、こ の混合物を２μｇの一本ｔ！ｍｐｘ１−ｚｖ２９にアニールし、そしてゼラー（ Ｚｏｌｌｅｒ）等によりオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発（ツー・プライ マー法）に対し報告されたように（マニュアル・フォー・アトバーンスト・テク エックス・イン・モレキュラー〇クローニング（Ｍａｎｕａｌ　Ｆｏｒ　Ａｄｖ ａｎｃｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、１９８３年 ）、第２の鎖をＴ４ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノーフラ グメント）を用いて伸長した。このように調製したＤＮＡを大腸菌に１２　（Ｊ Ｍ１０３）にトランスフェクトし、そして、そのプラークを、プローブとしてリ ン酸化したオリゴマーを用いてスクリーニングした（ゼラー（Ｚｏｌｌｅｒ）等 、同誌）。

そのように同定されたプラークはファージの複製型（ＲＦ）ＤＮＡの調製に用い た（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇｕ）同誌）　。ＲＦＤＮＡの制限酵素消化によ り、適正なＸｂａｌ制限バクーン（７，５ｋｂ。

０．８１ｋｂ及び０．６５ｋｂの断片）及び５ａｌｌ制限部位の欠損（ＢＡＲＩ −プロインシュリン融合物の欠失領域に存在した）を示す２つのクローンが同定 された。

これら２つのクローンからのＲＦＤＮＡをＨｉｎｄｌ［Ｉ及びＢａＩＩＩＨｌで 消化し、さらに、その各々からの１．９ｋｂの融合断片をゲルで精製した。これ らの断片をＨ４ｒ＋ｆｆ１Ｉ［［及びＢａｍＨｌで消化したｐＵｃ１３及びＹＥ ｐ１３ベクター（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）　８巻、１ ２１−１３３頁（１９７９年））に連結した。

引きつづき配列決定するためにｐＵｃ／ＢＡＲＩ−プロインシュリン・ハイブリ ッドプラスミドを大腸菌に１２　（ＪＭ８３）を形質転換するために用いた。こ れら２つのプラスミドをｐＺＶ３２及びｐＺＶ３３と名付けた。ＹＥｐ　１３由 来の組換え体を大腸菌ＲＲＩに形質転換した（ナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）及び リード（Ｒｅｅｄ）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　ＬＩＳＡ、　 ７１’ｔ５．２１１９−２１２３頁、１９８０年）。コれら２つのブーｙスミド をｐＺＶ３０及びｐＺＶ３１と命名した（図４）。

ｐＺＶ３２及びｐＺＶ３３の配列決定をマキサム（Ｍａｙａｍ）及びギルバート （Ｇｉｌｂｅｒｔ　）の方法（メソッド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５巻、５７頁、１９８０年）で行なった。

そのＢＡＲ１−プロインシュリン融合体をその結合部の５′側およそ１９０ｂｐ に位置するＢｇｒ１１部位から（プロインシュリン遺伝子中の）結合部の３′側 およそ１４０ｂｐのところに位置する５ａｎ９６１部位までの配列を決定した。

これらの実験データはＢＡＲ１及びプロインシュリン遺伝子間に望ましい融合体 が構築されたことを確証した。

Ｓ、セレビシア：Ｔ−（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｘ　Ｐ　３６５　１０　Ｃ株 をプラスミドｐＺＶ３０及びｐＺＶ３１で形質転換した。それをロイシンを欠く 標準イースト合成培地ｌｉ中で増殖させた。３４時間後、各培養物１０ｍＪ部分 標本にα因子を添加した。さらに１１時間インシュリン又は、インシュリン様物 質の存在についてテストした。プラスミドｐＺＶ３１で形質転換した培養物の上 清に関するその２つの検定結果は、各ｈ、培養培地１ミリリットル当り、３ｐ　 １ＩｌｏｌｅのＩＲＩ物質及び培養培地１ミリリットル当り、５．８　ｐａ＋ｏ ｌのＩＲＣ物質という値を示した。ＩＲＩは、正しく折りたたまったインシュリ ン、プロインシュリンまたはその分解産物であり、ＩＲＣは遊離したＣ−ペプチ ド、不適切に折りたたまったプロインシュリン又は、その分解産物である。

実施例２ アルコールデヒドロゲナーゼＩのプロモーター、ＢＡＲ１遺伝子及びトリオース ・ホスフェート・イソメラーゼのターミネータ−を使用した、Ｓ、セレビシアエ （ｃｅｒｅｖｆｓｉａｅ）中でのプロインシュリンの発現。

Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール・デヒドロゲナーゼ■ のプロモーター（以後、ＡＤＨＩプロモーターとする。またＡＤＣ！プロモータ ーとしても知られている。）を、ＢＡＲ１配列に結合させた外来ポリペプチドの 発現に対して使用することのテストを行なった。これらの配列を含むプラスミド を構築した。

そのプラスミドｐｚｖｓｏ　（図５Ｂ）は、Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　）のＡＤＨ１プロモーター、上述したＢＡＲ１−プロインシュリン融合 物及びＳ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリオース・ホスフェート ・イソメラーゼ（ＴＰＩＩ）遺伝子のターミネータ領域を含んでいる（アルバー （Ａｌｂｅｒ）及びカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、 　Ｇｅｎｅｔ、　）　１巻、４１９〜４３４頁、１９８２年）それは次のような 方法で構築された。

図５のように、プラスミドｐＡＨ５（アメラー（Ａｍｍｅｒｅｒ）、同誌）をＨ ｉｎｄｎｌ及びＢａＩＩＩＨｌで消化し、その１．５ｋｂのＡＤＨ１プロモータ ー断片をゲルで精製した。ｐＵｃ１３由来のＨｉｎｄｎｌ−ＥｃｏＲ１ポリリン カー断片と一緒に、この断片を７４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｅｃｏ　Ｒ１，Ｂ ａ＋ｎ　Ｈｌで処理したｐＢＲ３２７中に挿入した。ｐＡＭ５と命名したこのプ ラスミドを５ｐｈＩ及びＸｂａｌで消化し、およそ０．４　ｋｂのＡＤＨＩプロ モーター断片を２％のアガロースゲルで精製した。プラスミドｐＺＶ９をＸｂａ ｌで消化し、そして、およそ２ｋｂの全ＢＡＲコード領域を含むＢＡＲ１断片を 同様にゲルで精製した。ＡＤＨプロモーター及びＢＡＲ１配列の２つの断片をＸ ｂａ　ＴＳｓｐｈ　＋で消化したＹＥｐ１３に連結しプラスミドｐＺＶ２４を生 成した。ｐＺＶ２４のｓｐｈ　夏及びＢｇｌＩＩによる消化と、ひきつづくゲル による精製で、ＡＴＧ翻訳開始コドンは有するが、Ａｒｇ−Ａｒｇの潜在的プロ セッシング部位を欠いたおよそｓ　ｏ　ｏ　ｂｐのＡＤＨ１プロモーター−ＢＡ Ｒ１の融合体が生じた。ＢＡＲ１−プロインシュリン融合体を含むプラスミドｐ ＺＶ３３をＢｇｌＩＩ及び）（ｂａｌで消化し、Ａｒｇ−Ａｒｇコドンを含む融 合断片（およそ５００　ｂｐ　）を精製した。

図６のように、ＴＰＩＩターミネータ−、プラスミドｐＦＧ１から得た（アルバ ー（Ａｌｂｅｒ）及びカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）同誌）。

ｐＦＧｌをＥｃｏＲｌで消化し、線状となったプラスミド末端をＤＮＡポリメラ ーゼｌ　（クレノー・フラグメント）でプラント化し、ＢａｍＨ１リンカ−配列 （ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を付加した。

その断片をＢａＩＩＩＨｌで消化し、再び連結してプラスミドｐ１３６を生成し た。７００　ｂｐのＴＰＩＩターミネータ−を、Ｘｂａｌ−Ｂａ＋ＩＩＨ１断片 としてｐ１３６から精製した。この断片をＸｂａ　ＩＳＢａｍ　Ｈｌで消化した ＹＥｐ　１３に挿入し、それをＨｉｎｄｍで切断、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ク レノーフラグメント）を用いてプラントエンドとし、そして、再連結することに より、プラスミドｐ２７０を作った。そのＴＰＩＩ断片をｐ２７０からＸｂａ　 Ｉ−ＢａＴ６Ｈ１断片として精製しＸｂａｌ、Ｂａ＋ｎＨ１で消化したｐＵｃ１ ３に挿入し、プラスミドｍ１１５を作った。

図５Ｂに示したように、ＴＰＩＩターミネークーをＸｂａ　Ｉ及びＳｓｔ　Ｉに よるプラスミドｍ１１５の消化により取り除き、ゲルによる精製を行った。その ３つの断片：　ＡＤＨＩ　−ＢＡＲ１融合体、ＢＡＲ−プロインシュリン融合体 及びＴＰＩＩターミネータ−を、５ｐｈＩ及び５ｓｔＩで消化したプラスミドｐ Ｕｃ１８に挿入した（ノランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　）等、ジーン（Ｇｅｎ ｅ）　２６巻、１０１〜１０６頁、１９８３年）。このＤ　Ｎ　Ａを大腸菌に１ ２（ＪＭ８３）株を形質転換するのに用いた。

アンピシリン耐性による選択及び白色コロニーの生成によるスクリーニングによ り、望ましい挿入物を含むプラスミド（ｐＺｖ４５）を同定した。つづいて、プ ラスミドｐ　ＺＶ４５を５ｐｈｌ及びＢａ＋＊Ｈ１で消化し、そのＡＤＨＩ　− ＢＡＲ１−プロインシュリン−ＴＰＩターミネータ−配列をゲルにより精製した 。この断片を５ｐｈｌ及びＢａｍＨｌで消化したＹＥｐ１３に挿入し、Ｓ、セレ ビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発現ベクターｐＺＶ５０を作った。

Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｘ　Ｐ　６３５−１０　Ｃ株をｐ ＺＶ５０で形質転換し、それを培養、さらに上記実施例１に述べた検定を行った 。培地中にＩＲＩ物質はみつからず、ＩＲＣ物質は、ミリリットル当り０．５　 ｐｍｏ１以下であった。０．１％ノニデフトＰ−４０で抽出した細胞は、細胞抽 出物ミリリフドル当りｌ　ｐｍｏｌのＩＲＣ物質を示した。

実施例３ ＢＡＲ１遺伝子及びＳ、ボンベのアルコール・デヒドロゲナーゼのプロモーター を用いた、シゾサツカロミセス・ボンベ中でのプロインシュリンの発現。

この実施例は、形質転換したシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）宿主中で発現した外来のポリペプチドの分 泌をうながすためにＢＡＰＩ遺伝子の一部を使用することを示している。Ｓ、ボ ンベ（ｐｏｍｂｅ）のアルコール・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子を、ＢＡ Ｒｌ−インシュリン遺伝子融合体に結合したプラスミドを構築した。

Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）　Ａ　Ｄ　Ｈプロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅ ｌ　１）及びホール（Ｈａｌｌ）によって報告されているように（ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）　２５８巻、１４３−１４９頁、１９８３年）　、ＹＥｐ１３に クローン化した、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）　９７２　ｈ−株（ＡＴＣＣ２４８ ４３＞からのＤＮＡ断片ライブラリーから得た。そのプロモーター配列はそのラ イブラリーから、０．７５ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ　−ＥｃｏＲ１断片として精製した 。この断片及びｐＵＣ１２のＥ　ｃｏ　ＲＩ　ＨｉｎｄＩ［Ｉポリリンカー（断 片を、５ｐｈＩ及びＨｉｎｄＩ［で消化したＹＥｐ　１３中に連結した。生じた プラスミドはｐＥＶＰ−１１として知られている。

Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）の発現ベクターの構築を示した図７に示すように、Ａ Ｄ）（プロモーターを、５ｐｈｌ−Ｘｂａ　Ｉ断片としてｐＥＶＰ−１１から精 製した。プラスミドｐＺＶ３３をＸｂａ　Ｉ及びＢｇｌＩＩで消化し、およそ３ ４０ｂｐのＡＴＧ開始コドンをもつＢＡＲＩ断片を精製した。ｐＺＶ３３をＢｇ ｌＩＩ及びＳｓｔ　Ｉで消化し、ＢＡＲ１−プロインシュリン融合配列を精製し た。この３つの断片を５ｐｈＩ、Ｓｓｔ　Ｉで消化したｐＵｃ１８に結合し、プ ラスミドｐＺＶ４６を作った。ｐｕｃｌｓは、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）の形質 転換には有効ではないので、そのプラスミドを、２つの二重酵素消化をほどこし た。１つのＡＤＨプロモーター−ＢＡＲ１融合断片をＨ４ｎｄｌｎ＋Ｂｇｌ　Ｉ Ｉ消化より精製し、そして、１つのＢＡＲ１−プロインシュリン融合配列をＢｇ ｌ　ＩＩ＋Ｘｂａｌ消化から精製した。これらの断片をＨｉｎｄＩｆｆ、Ｘｂａ ｌで消化したＹＥｐ　１３に挿入し、Ｓ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）発現ベクターｐ ＺＶ４９を作った。

形質転換したＳ、ボンベ（ｐｏｍｂｅ）の１１８−４ｈ−株（ＡＴＣＣ＃２０６ ８０）の１リツトル培養を２００■／ｌのアスパラギン［１及び１００■／７！ のヒスチジン、アデニン、及びウラシルを含む、標準イースト合成培地（−１ｅ ｎＤ）中で３０℃、３６時間培養した。その培養物を遠心により集菌し、その上 清に対しＩＲＩ及びＩＲＣ検定を行った。ｐＺＶ４９で形質転換した細胞からの 試料は、ＩＲＩ物質を１．６　ｐｍｏｌ　／　ｍ　ｌ及びＩＲＣ−反応性物質を ０、５　ｐｍｏｌ　／　ｔａ　ｊ！含んでいた。ＹＥｐ　１３で形質転換した培 養物からの試料にはＩＲＣ反応性物質が検出されなかった。

実施例４ ＢＡＲ１シグナルペプチドを用いたアルファ因子の分泌ＢＡＲ１のシグナルペプ チドに対しイーストの形質転換体からα因子の分泌をうながす能力についてテス トした。種々の長さのＢＡＲ１タンパク質及び、成熟α因子の１個又は４個のコ ピーをもつ融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むいくつかのプラスミド を構築した。これらのプラスミドを、ａ／αデブロイドの宿主にトランスフオー ムし、その形質転換体に対し、ハロー検定法によりα因子産生を検定した。

プラスミドｐＳＷ９４、ｐＳＷ９５、ｐＳＷ９６及びｐＳＷ９７はＳ、セレビシ アエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ（Ｔ Ｐｌｌ）のプロモーター、３５５ｂｐ又は７６７ｂｐのＢＡＲ１遺伝予断片（各 々、ＢＡＲＩ　ＢＡＲＩコード配列の５′側１１４又は２５１コドンを含む）、 及び１個又は４個のアルファー因子（ＭＦα１）コード配列を含んでいる。これ らの構築物を表１にあげた。

表１ プラスミド　ＢＡＲ１断片　α因子 ｐｓＷ９４　３５５ｂｐ　４コピー ｐｓＷ９５　７６７ｂｐ　４コピー ｐＳＷ９６　３５５ｂｐ　１コピー ｐｓＷ９７　７６７ｂｐ　１コピ一 プスミドｐＭ２２０　（ｐＭ２１０としても知られている）を、ＴＰＩＩプロモ ーター断片源として用いた。ｐＭ２２０で形質転換した大腸菌ＲＲＩを受理番号 ３９８５３号としてＡＴＣＣに保管した。プラスミドｐＭ２２０をＥｃｏＲｌで 消化し、その０．９ｋｂのＴＰＩＩプロモーターを含む断片をアガローズゲル電 気泳動により単離し、ＤＮＡポリメラーゼ■　（クレノーフラグメント）により プラントエンドとした。

キナーゼによるリン酸化を行ったＸｂａＩリンカ−をその断片に結合し、さらに ＢｇＮＩＩ及びＸｂａｌで消化した。それからこの修正したＴＰ１１プロモータ ー断片をｐＤＲ１１０７の３．４ｋｂＢｇｊ！ＩＩ−ＸｂａＩベクター断片に連 結し、ｐＺＶｌｌ、８を作った。

プラスミドｐＤＲ１１０１を生成する目的で、ｐｒｃ７に、９００ｂｐのｐＭ２ ２０のＢｇＩ２］Ｔ＝ＥｃｏＲＩ　ＴＰ　Ｔ　１プロモ一ター断片をサブクロー ニングすることにより　（マーシュ（Ｍａｒｓｈ）、アーフル（Ｅｒｆｌｅ）及 びワイクス（Ｗｙｋｅｓ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３２巻、４８１−４８５頁 １９８４年）、プラスミドｐＤＲ１１０７を構築した。プラスミドｐＤＲ１１０ １をＨｉｎｄｌｆｆ及び５ｐｈｒで消化し、７００　ｂｐの部分的なＴＰ　Ｉ　 １プロモ一ター断片を単離した。

ｐＵｃ１８中にサブクローンしたｐＭ２２０の８００　ｂｐのＸｂａ　Ｔ−Ｂａ ｍＨＩ　ＴＰ　Ｉ　１ターミネータ−断片を含むプラスミドｐＤＲ１１００をＨ ４ｎｄｎｌと５ｐｈｌで消化した。その７００ｂｐ（７）部分的ＴＰＩＩプロモ ーターを線状にしたｐＤＲｌｌｏｏに連結しｐＤＲ１１０７を作った。

その後、ｐＺＶｌｌ８中のＴＰｒｌプｔｌｌモーターノ３　’端ニするＥｃｏＲ １部位を破壊した。そのプラスミドをＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＥｃ。

Ｒ１で消化し、０．９ｋｂのフラグメントを単離し、そして、オリゴヌクレオチ ドＺＣ７０８（５’　ＡＡＴＴＧＣＴＣＧＡＧＴ３　’）及びＺＣ７０９（３’ 　ＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣ５’）をアニールすることにより構築した合成リン カ−に連結した。そのリンカ−の付加はＴＰＩＩブモーター断片の３′端のＥｃ ｏＲ１部位を除き、そして、ＸｈｏＴ及びＸｂａ１部位を与えた。この断片をさ らにＨｔｎｄＩＩＩ　−Ｘｂａ　Ｉで切断したｐＵｃ１３に結合した。生成した プラスミドをｐＺＶ１３４と命名した（図８）。

イーストの接合フェロモンα因子（ＭＦα１）遺伝子のクローニングはカージャ ン（Ｋｕｒｊａｎ）及びハースコビッッ（）Ｉｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ）（同誌） により報告されている。その遺伝子を同様の方法で、ＹＥｐ　１３のＢａｍＨ１ 部位にクローン化した部分消化のＳａｍ３Ａ断片のイースト遺伝子ライブラリー からこの研究室で単離した。

（ナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）及びタッチエル（Ｔａｃｈｅｌｌ）　、セル（Ｃ ｅｌｌ）１９巻、７５３−７６４頁１９８０年）。このライブラリーから、ｍａ ｔα２−３４突然変異と同型のイーストの倍数体中で一一因子を発現するものを 単離した。（マネー（Ｍａｎｎｅｙ）等ジャーナル・オブ・セラー・バイオロジ ー（１、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ）　９６巻、１５９２、頁、１９８３年）。この クローンは、カージャン（Ｋｕｒｊａｎ）及びハースコビッッ（）Ｉｅｒｓｋｏ ｗｉ　ｔｚ）により特徴づけられたＭＦα１遺伝子と重複する挿入物を含んでい た。ｐＺＡ２として知られるこのプラスミドを、ＥｃｏＲＩで消化し、そのＭＦ α１を含む１．７ｋｂの断片を単離し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１３に連結 した。

ｐ１９２と命名したそのプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、生じた１、７ｋｂの ＩＦα１断片を単離し、さらにＭｂｏＩＩで消化した。この５５０　ｂｐのＭｂ ｏＩＩ　−ＥｃｏＲ１断片を単離し、キナーゼによるリン酸化を行ったＳａ７！ Ｉリンカ−に連結した。そのリンカ−断片をＳａｄ　Ｉで切断した。生じた０、 ３ｋｂのＳａｊ！　Ｉ断片をＳａｄ　Ｉで切断したｐＵＣ４に連結しくビエイラ （ν１ｅｉｒａ）及びメフシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、 １９巻、２５９−２６８頁、１９８２年）ｐ４８９と命名したプラスミドを作っ た（図８）。

ＢＡＲ１の一部（１１４コドン）及びＭＦα１コードニーを含む遺伝子融合体を 構築した。プラスミドｐＺＶ２４　（実施例２）を５ｐｈｌ及びＢｇｊ！　ＩＩ で消化し、その０．８ｋｂのプロモーター−ＢＡＲ１断片を単離した。プラスミ ドｐ４８９をＢａｍＨｌで切断し、その０．３ｋｂのＭＦα１断片を単離した。

これら２つの断片を（Ｓｐｈ　Ｉ　＋　ＢａｍＨＩ　）切断したＹＥｌｌ）　１ ３に結合した。生じたプラスミドをｐＺＶ６９と命名した（図１１）。

α因子前駆体の一部に結合したバリヤーの２５１のアミノ酸をコードする第２の 融合遺伝子を構築した。（Ｘｂａ　１　＋　Ｓａｊ！　Ｔ　）Ｘｂａｌ−３ａ＃ 　Ｉ　ＢＡＲ１断片を含むプラスミドｐＺＶ１６を５ａ（１１による消化で線状 化した。この４．０ｋｂの断片を４個のα因子をコードする、ｐ４８９由来の０ ．３ｋｂのＳａｊ！　Ｉ断片と結合した。正しい方向で、ＢＡＲ１−ＭＦα１融 合体を有するプラスミドをｐＺＶ７１と命名した。さらに、ｐＺＶ７１由来のＢ ＡＲＩ−ＭＦα１をＡＤＨ１プロモーターに結合した。プラスミドｐＺＶ７１を Ｘｂａｌ及びＰｓｔｌで消化し、その１．０７ｋｂの断片を単離した。ＡＤＨＩ プロモーターを、ｐＺＶ２４から、０．４２ｋｂのＳｐｈ　１−　Ｘｂａ　Ｉ断 片として単離した。これら２つの断片を（Ｓｐｈ　ｊ　＋　Ｐｓｔ　Ｉ　）で切 断したｐＵｃ１８に結合した。生じたプラスミドｐＺＶ７３を５ｐｈｌ及びＢａ ｍＨｌで消化し、発現ユニットを有する１、５ｋｂの断片を単離し、（Ｓｐｈ　 Ｉ　＋　Ｂａｏ＋Ｈ１）で切断したＹＥｐ　１３に連結して、ｐＺＶ７５を作っ た（図１０）。

操作をＦＭ’４にするために、ｐＺＶ６９及びｐＺＶ７５由来のＢＡＲ１−ＭＦ α１融合ユニットをＴＰＩＩプロモーターとともに、ｐＵｃ１８にサブクローン した（図１１）。プラスミドｐＺＶ６９を、ＥｃｏＫｌ及びＢａｍＨｌで消化し 、その融合体を含む０．５５ｋｂの断片を単離した。０．９ｋｂのＴＰＩＩプロ モーター断片はｐＺＶｌｌ８をＨｉｎｄＩ［＋及びＥｃｏＫｌで消化することに より単離された。

０．５５ｋｂのＢＡＲｌ−ＭＦα１断片、０．９ｋｂのＴＰＩＩプロモーター断 片及び、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ及びＢａｍＨｌで切断したｐＵｃ１５の三体を連結した 。生じたプラスミドをｐＳＷ５９と命名した。

プラスミドｐＺＶ７５をＥｃｏＲＩ及びＢａＩＩＩＨｌで消化し、９５４ｂｐの ＢＡＲＩ−ＭＦα１融合断片を単離した。このＢＡＲＩ−ＩＱ１ｒｌ断片を０． ９ｋｂの（Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　＋ＥｃｏＲ１）のＴＰＩＩプロモーター断片及び、 Ｈｉｎｄｌ及びＢａｍＨｌで切断したｐＵｃ１８と二律連結し、プラスミドｐｓ Ｗ６０を作った。

発現プラスミドの構築において、ＢＡＲ１コ一ド配列の５′側１１６ｂｐの源は 、次のような方法で構築したｐｓＷ２２である（図１２）、ｐＳＷ２２中（７） ＢＡＲＩ：ｌ−ド領域はｐＺＶ９に由来してい゛る。プラスミドｐＺＶ９　（実 施例１）を、５ａｉｌ及びＢａｍＨｌで切断し、１．３ｋｂのＢＡＲ１断片を単 離した。この断片を５ａｉｌ及びＢａｍＨＩで切断したｐＵｃ１３にサブクロー ンし、ｐＺＶ１７と命名したプラスミドを作った。プラスミドｐＺν１７をＥｃ ｏＲｌで消化し、ＢＡＲＩのコード領域の３′側０．５ｋｂを除いた。そのベク ターＢＡＲ１断片を再連結し、ｐＪＨ６６と命名したプラスミドを作った。プラ スミドｐＪＨ６６をＥｃｏＲｌで線状とし、クレノーフラグメントでプラントエ ンドとした。キナーゼによるリン酸化を行ったＢａｍＨＩリンカ−（５’　ＣＣ ＧＧＡＴＣＣＧＧ３′）を付加し、過剰のリンカ−を再連結前にＢａｍＨＩで消 化することにより除いた。生じたプラスミドｐＳＷ８をＳａｊ！　Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断し、ＢＡＲ１の２５２から５２５のアミノ酸をコードする８　２４　 ｂｐの断片を単離した。このＢＡＲ１断片を物質Ｐ＆Ｃ末端部分をコードする断 片に融合した（ムンロ（Ｍｕｎｒｏ）及びペルハム（Ｐｅｌｈａ＋ｏ）エンボ・ ジャーナル（ＥＭＢＯ，Ｊ、）　、３巻、３０８７−３０９３頁、１９８°４年 ）、Ｍ１３ｍｐ８中に物質Ｐの二量体型をコードする合成オリゴヌクレオチド配 列を含むプラスミドｐＰＭ２をムンロ（Ｍｕｎｒｏ）及びベルハム（Ｐｅｌｈａ ｍ）から入手した。プラスミドｐＰＭ２をＢａｒａＨＩ及びＳａ７！Ｉで消化す ることにより線状化し、８２４ｂｐのＢＡＲＩ断片と連結した。生じたプラスミ ドｐｓＷ１４をＳａｄ　Ｉ及びＳｍａｌで消化し、８７１ｂｐのＢＡＲ１−物質 Ｐ断片を単離した。プラスミドｐＺＶ１６（図１０）をＫｂａＴ及びＳａｆ　Ｉ で切断し、７６７　ｂｐのＢＡＲｌ　５′側コ一ド配列を単離した。この断片を Ｘｂａｌ及びＳｍａｌで切断したｐｕｃと連結した、８７１　ｂｐのＢＡＲ１− 物質Ｐ断片と３体連結した。生じたプラスミドをｐｓＷ１５と命名した。

プラスミドｐｓＷ１５をＸｂａｌ及びＳｍａｌで消化し、１．６４ｋｂのＢＡＲ １−物質Ｐ断片を単離した。ＡＤＨ１プロモーターを、ＡＤＨｌプロモーターと 、ｐＵｃ１８中のｐＺＶ２４由来のＢＡＲｌ　５’コード領域１］６ｂｐを含む ０．５４ｋｂの５ｐｈ−ｘ−ＥｃｏＲ１断片を含むｐＲＬＯ２９から得た。プラ スミドｐＲＬ０２９を５ｐｈｌ及びＸｂａｌで消化し、０．４２ｋｂのＡＤＨプ ロモーター断片を単離した。ＴＰＩＩターミネータ−（アルバー（Ａｌｂｅｒ） 及びカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ アプライド・ジェネティックス（Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎ、）　１巻、４１９−４３４頁、１９８２年）は、ｐＵｃ１８中の０．７ ｋｂの（Ｘｂａ　Ｉ　＋　ＥｃｏＲ１）断片として得た。ＴＰＩＩターミネータ −及び、クレノーで満たしたＸｂａｌ末端と５ｐｈｌ末端をもつｐｔｒｃを含む 線状断片は、０．４２ｋｂのＡＤＨ１プロモーター断片及び１．６４ｋｂのＢＡ Ｒ１−物質Ｐ断片と二律連結することによりプラスミドｐＳＷ２２を作った。

さらに、プラスミドｐｓＷ９４を構築した（図１３）　、　ＢＡＲＩ−物質Ｐ融 合体及びＴＰＩＩクーミネーターを含む２．３ｋｂの断片を、Ｘｂａ　Ｉ　−Ｓ ｓｔ　１断片としてプラスミドｐｓＷ２２から単離した。ｐＺＶ１３４から単離 したＨｉｎｄ　ｎ［−ＸｂａＩ　ＴＰ　Ｉ　１ブロモ−゛ター断片を（Ｈｉｎｄ 　ｍ　＋　Ｓｓｔ　Ｔ　）で切断したｐＵ０１８とともに、ＢＡＲ１−物質Ｐ− ＴＰ　Ｉ　１ターミネータ−断片と二律連結した。生じたプラスミドｐｓＷ８１ をＨｉｎｄＩ［［及びＥｃｏＲｌで切断し、ＴＰＩＩプロモーター及びＢＡＲｌ の５′側１１６　ｂｐを含む１．０２ｋｂの断片を単離した。プラスミドｐＳＷ ５９をＥｃｏＲＩ及びＢａｒａＨＩで切断し、０．５５ｋｂのＢＡＲｌ−ＭＦα １融合断片を単離した。さらに、この断片を、ｐｓＷ８１由来のＴＰＩＩプロモ ーター−ＢＡＲ１断片及びＨｉｎｄＩ［ｌ及びＢａｍＨＩで線状化したＹＥｐ　 １３と二律連結し、プラスミドｐＳＷ９４を作った。

ｐＳＷ９５の構築を図１３に説明した。プラスミドｐｓＷ６０をＥｃｏＲｌ及び ＢａｍＨｌで切断し、９５４　ｂｐのＢＡＲ１−ＭＦα１融合断片を単離した。

プラスミドｐＳＷ８１をＨ４ｎｄｌｌｌ及びＥｃｏＲｌで切断し、１．０２ｋｂ のＴＰｒｌプロモーター−ＢＡＲ１断片を単離し、これを、（ＨｉｎｄＩ［ｌ　 ＋　ＢａｍＨＴ　）で切断したＹＥｐ　１３にＢＡＲ１−ＭＦα１融合断片と二 律連結した。生じたプラスミドをｐＳＷ９５と命名した。

唯一のα因子を含、むＴＰＩＩプロモーター−ＢＡＲ１−ＭＦα１融合構築物は 、ＴＰＩＩプロモーター及びＭＦα１プレプロ配列を含む（図１４．１５及び１ ６）ＢＡＲｌ−ＭＦα１融合物（α因子４コピーをコードする）由来のものであ る。プラスミドｐＺＶ１６をＥｃｏＲｌ及びＳａｌ　Ｉで消化した。単離した６ ５１ｂｐのＢＡＲ１断片をＨｉｎｄｍ及びＳａｌ　Ｉで切断したｐＵｃ１３に、 キナーゼによるリン酸化を行ったＨｉｎｄＩ［ｌ　−ＥｃｏＲＩ　ＢＡＲＩ特異 的アダプターを用いて（オリゴヌクレオチドＺＣ５６６：５　’　ＡＧＣＴＴＴ ＡＡＣＡＡＡＣＧＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡ　３　’及びＺＣ５６７ ：５　’　ＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＴＡ Ａ　３　’をアニールすることによって作った）連結した。生じたプラスミドｐ ＺＶ９６をＨｉｎｄｌ及びＳａＩ！Ｉで消化し、６８４　ｂｐのＢＡＲ１断片を 単離した。

プラスミドｐＭ２２０は１．ＭＦα１プレプロ配列に融合したＴＰ１１プロモー ターを提供した。プラスミドｐＭ２２０をＢｇｊ！　Ｉｒ及び旧ｎｄｌｌｌで消 化し、１．２ｋｂのＴＰＩＩプロモーター−ＭＦ　αＳａｊ’　！及びＢａｍＨ ＩでｐｉＺＶ９を切断することにより生成し、１．３ｋｂのＢＡＲＩ断片を単離 した。６８４ｂｐのＨ４ｎｄＩＩＩ　−３ａ１２１　ＢＡＲ１断片、１．２ｋｂ のＢＪＪ　ｎ−ＨｌｎｄｎｌＴＰ　Ｉ　１プロモーター−ＭＦα１プレプロ配列 及び１．３　ｋｂ　５ａＩｌＩ　−ＢａｒａＨＩ　ＢＡＲＩ断片をＢａｍＨｌで 線状化したＹＥｐ　１３と凸体の結合を行なわせた。プロモーター及びＭＦα− １−ＢＡＲ１融合物が望ましい方向性をもつ構築物をｐＺＶｌｏｏと命名したく 図１４）。

操作性のため、ｐｚｖｉｏｏ由来の端を切り取ったＭＦαｌプレプロ配列−ＢＡ Ｒ１融合断片を、１．６ｋｂのＰｓｔ　１−　Ｂａｎ＋Ｈ１断片としてｐＵｃ１ ３にサブクローンした。生じたプラスミドｐＺＶ１０１をＰｓｔｌ及びＥｃｏＲ ｌで切断し、２７０　ｂｐのＭＦα１ブレプローＢＡＲＩ断片を単離した。プラ スミドｐＺＶ６９をＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨｌで消化し、０．５５ｋｂのＢＡＲ １−ＭＦα１融合断片（α因子４コピーをコードしている）を単離した。

この断片及び２７０　ｂｐのＭＦα１ブレプローＢＡＲ１断片を、さらに、ＴＰ ＩＩブロモ−クー、ＢＡＲ１の一部及びα因１コピーをコードする配列を含む発 現単位を構築した（図１６）。プラスミドｐＺＶ１０２をＰｓｔｌ及びＢａｍＨ ｌで切断し、０．８２ｋｂのＭＦα１ブレプローＢＡＲ１断片を単離した。ＴＰ ＩＩブロモ−ター及び、９Ｍ２２０由来の端を切り取ったＭＦα１プレプロ配列 を含むｌｋｂのＨ４ｎｄ　ｍ−Ｐｓｔｌ断片を、Ｈｉｎｄｌ［ｌ及びＢａｍＨｌ で切断したＹＥｐ　１３とともに、ｐＺＶ１０２から単離した０、８２ｋｂのＭ Ｆα１プレブローＢＡＲ１断片に二律連結した。

生じたプラスミドをｐＺＶ１０２と命名した。プラスミドｐＺＶ１０５をＨｉｎ ｄｌｌ［で切断し、１．２ｋｂのＴＰＩＩプロモーター−ＭＦα１プレプロ断片 を単離した。プラスミドｐＺＶ１０２を′Ｈｉｎｄ　ｍで消化し、末端のα因子 コピーを含むベクター断片を単離した。この２．８ｋｂのベクター−ＭＦα１断 片を１．２ｋｂのＴｐＨｐＨ上−ター−ＭＦα１プレプロ断片と連結した。正し い方向性及びＭＦα１コードニーの単一コピーを有するプラスミドをｐｓｗｓｔ と命名した。プラスミドｐｓＷ６１をＨｉｎｄＩ［＋の部分消化により線状化し た。プラスミドｐＺＶ１０２をＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、０．３　ｋ’ｂのＢＡ ＲＩ−ＭＦα１断片を単離した。この断片を線状化したｐｓＷ６１と連結した。

ＭＦα１開始コドンの３′側２６４　ｂｐのＨｉｎｄ　Ｉ［１部位における挿入 物をもつプラスミドをｐｓＷ７０と命名した。プラスミドｐ　ＳＷ７０をＥｃｏ ＲＩ及びＢａｎ＋Ｈ１で切断し、３６１　ｂｐのＢＡＲＩ−ＭＦαｌ断片を単離 した。プラスミドｐｓＷ８１（図１３）を、ＨｉｎｄＩ［ｌ及びＥｃ。

Ｒ１で切断し、１．０２ｋｂのＴＰＩＩプロモーター−ＢＡＲ１断片を単離した 。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨｌで線状化したＹＥｐ　１３ととも に、ＢＡＲ１−ＭＦα１断片と二律の連結を行った。生じたプラスミドｐｓＷ９ ６はＴＰＩＩプロモーター及びｌコピーのα因子コード配列に融合したＢＡＲＩ の５′側コ一ド配列３５６　ｋｂを含んでいた。

ＭＦα１コード配列１つと融合した７　６７　ｂｐのＢＡＲ１を含む第２のＢＡ ＲＩ−ＭＦα１構築物をｐＺＶ７５からのＢＡＲ１断片を用いて作った。（図１ ７）プラスミドｐＺＶ７５をＥｃ。

Ｒ１及びＢａｍＨＩで消化し、９５４　ｂｐのＢＡＲＩ−ＭＦαｌ断片を単離し た。ＢＡＲ１に融合したＭＦα１プレプロ配列を含むプラスミドｐＺＶ１０１を Ｐｓｔｌ及びＥｃｏＲｌで切断し、０．２７ｋｂのＭＦα１プレブローＢＡＲ１ 断片を単離した。この断片を、Ｐｓｔｌ及びＢａｍＨＩで線状化したｐＵｃ１３ とともに、９５４ｂｐのＢＡＲｌ−ＭＦα１断片と二律の連結を行った。生じた プラスミドｐＺＶ１０４をＨｉｎｄＩ［［で切断し、０．７０ｋｂのＢＡＲ１− ＭＦα１断片を単離した。この断片を、Ｈｉｎｄ　ｍでの部分消化による線状化 したｐｓＷ６１に連結した。ＭＦα１の開始コドンの３′側２６４　ｂｐのＨｉ ｍｄ　ｍ部位における正しい方向の挿入物を含むプラスミドをｐ　ＳＷ７４と命 名した。プラスミドｐｓＷ７４をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、７３８　 ｂｐのＢＡＲＩ−１１Ｆα１断片を単離した。プラスミドｐ、５Ｗ８１を、Ｈｉ ｎｄＩ［［及びＥｃ。

Ｒ１で切断し、１．０２ｋｂのＴＰＩＩプロモーター−ＢＡＲ１断片を単離した 。この断片を、（ＨｉｎｄＩ［Ｉ　＋　ＢａｍＨＩ　）で切断したＹＥｐ　１３ とともに、７３８　ｂｐのＢＡＲ１−ＭＦα１断片と二律の連結を行った。生じ たプラスミドｐＳＷ９７は、ＴＰＩＩプロモーター及び１つのα因子コード配列 に融合したＢＡＲｌの５′側の７６７　ｂｐを含んでいる。

ａ／αデブロイドのＳ、セレビシアｘ　（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｘ　Ｐ　７ ３３株（ＭＡＴａ　１ｌｅｕ２−３　ｆｅｕ２−１２２　ｂａｒｌ−１ｇａｆ２ ／ＭＡＴαｊ！ｅｕ２−３　１ｅｕ２　１１２　ｂａｒｌ−１ｇａ１２）をプラ スミドｐｓＷ７３、ｐＳＷ９４及びｐＳＷ９５で形質転換した。プラスミドｐｓ Ｗ７３は、ＴＰＩＩプロモーター、ＭＦα１のシグナルペプチド及びプレプロ配 列、及びＹＥｐ　１３中の４コピーのα因子コード領域を含んでいる。その形質 転換体を、選択培地のプレート上に重層した軟寒天中の、Ｓ、セレビシアエ（ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＲＣ６２９細胞のローン上にスポツティングし、３０℃ で１晩インキユベートした。ｐ　ＳＷ７３及びコントロールを用いたハローの大 きさの比較は、ｐｓＷ９４はｐＳＷ７３のα因子のおよそ１５％を分泌させた。

１つのＭＦα１コードニーに融合したＢＡＲ１を含む構築物に対し、同じ方法で 、α因子の分泌の検定を行った。ＴＰＴＩプロモーター、ＭＦα１シグナルペプ チド、プレプロ及びＹＥｐ　１３中の１つのα因子に対するコート領域を含むプ ラスミドｐＳＷ６７をプラスミドｐＳＷ９６及びｐ　ＳＷ９７に対するコントロ ールとして用いた。ハローの大きさの比較は、ｐＳＷ９６がｐＳＷ６７のα因子 のおよそ３０〜４０％の分泌をうながし、そしてｐＳＷ９７は、ｐＳＷ６７のα 因子のおよそ１０−１５％の分泌をうながすことを示した。

実施例５ ＢＡＲ１シグナルペプチド切断部位の突然変異上記のように、バリヤー前駆体の シグナルペプチド切断部位を修正するとＫＥＸ２経路を通じたバリヤー含有融合 タンパク質のプロセッシング及び分泌が可能になることが予想できると分った。

潜在的な切断部位はアミノ酸２３と２４、及びアミノ酸２４と２５の間にある。

そこで、ＢＡＲＩの一次翻訳産物をコードするＤＮＡ配列を変異させ、２５番目 の位置をプロリンとなるようにした。プラスミドｐＳＷ９８及びｐＳＷ９９は、 Ｓ、セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＰＩＩプロモーター、変異した シグナルペプチド切断部位を含む、３５５　ｂｐ又は７６７　ｂｐのＢＡＲ１遺 伝子の断片、及びα因子コード配列１コピーを含む、ＹＥｐ　１３を基礎とした プラスミドである。

シグナルペプチドの突然変異を、ファージＭ１３テンプレート及び変異性合成オ リゴヌクレオチ）’　（５’　ＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡＣＧＡＴ３′ ）を用いた試験管内標準突然変異誘発法（ゼラー（Ｚｏｌｌｅｒ）等、マニュア ル・フォー・アトバーンスト・テクニック・イン・モレキュラー・クローニング ・コース（Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ＡｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ）　、コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ）１９８３年）により導入した。ファージテンプレートｐＳ Ｗ５４を、０．５ｋｂのｐ　ＳＷ２２のＳｐｈ　■−Ｅｃｏ　Ｒ１断片と、５ｐ ｈ１−ＥｃｏＲＩで消化したＭｌ　３ｍｐ　１９を連結することにより構築した 。試験管内突然変異誘発につづいて、潜在的に変異を起こしたプラークを、３２ Ｐ−標識した変異性オリゴヌクレオチドとのプラークハイブリダイゼーションに よりスクリーニングし、突然変異の存在を確かめるために配列を決定した。突然 変異が明確となったファージの１つ、ｍＺｃ６３４−７の複製型ＤＮＡをｓｐｈ 　Ｉ及びＥＣ０ＲＩで消化し、その０．５４ｋｂ断片を単離し、（Ｓｐｈ　Ｉ＋ Ｅｃｏ　Ｒ１）で切断したｐＵｃ１８と連結した。生じたプラスミドｐＳＷ６６ （図１８）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａ　■で消化し、ＡＤＨ１プロモーターを 取除き、そして、ベクター及びＢＡＲ１配列を含むその断片を、０．９ｋｂの、 ｐＺＶ１３４の）（ｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ　ＴＰ　Ｔ　１プロモ一ター断片と 連結した。このＴＰＩＩプロモーター及びシグナルペプチド切断部位に突然変異 を含むＢＡＲ１の５＠１１９ｂｐを有するプラスミドをｐＳＷ８２と命名した。

図１８に示すように、プラスミドｐＳＷ８２をＨｉｎｄＩ［ｌとＥｃ。

Ｒ１、及びＢｇｊ！ｎ及びＥｃｏＲｌで消化し、生じた１、０２ｋｂの断片を単 離した。ｐＳＷ８２のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ　ｃｏ　Ｒ１断片をｐｓＷ７４のＥｃ ｏ　Ｒ１−Ｂａ１ｌＨ１断片及び（ＨｉｎｄＩｆｆ＋Ｂａｍ　Ｈｌ）で消化した ＹＥｐｌ　３と連結しｐＳＷ９９を作った。ｐｓＷ８２のＢｇｌ’Ｕ−Ｅｃｏ　 Ｒ１断片を、０．３０ｋｂのｐｓＷ７０のＥｃ。

ＲＩ　ＢａＩＩＩＨ１断片及びＢａａ＋Ｈ１で消化したＹＥｐ　１３と連結し、 ｐｓＷ９８を作った。プラスミドｐＳＷ９８は、ＴＰＩＩプロモーター、突然変 異したＢＡＲ１配列の５′側３５５　ｂｐ及び単一のα因子コード配列を含んで いる。プラスミドｐ　ＳＷ９９は、突然変異したＢＡＲ１配列７６７　ｂｐをも つこと以外は、同一の発現単位を含んでいる。

ハロー検定による分析により、１つのα因子をコードするプラスミドを用いたと きはその切断部位の突然変異はα因子の分泌を促進させることが示された。ｐ　 ＳＷ９８を含むトランスフォーマントは、野生型コントロールであるｐＳＷ９６ を含むものの約５０％増のα因子を分泌する。

３？　と；？：　イれ　ビ；　２：　亡東　七ミζα　４＞　ｌ−Ｊ　１ｍ（１ ５）　ｔｏζ　ｓｕ　ｌ−１−ｉ！　ビ、！　じ１　亡ご　８ｊ　む１　８ご　 Ｈｇトａ　α−トψ　Ｌ１１５　ロζ　トー　１０　Ｕ−α＼　αり　ａ（りに 　ｑり　トー　Ｕコ　ｄ−ｌり―　ζ−ｕｌＩ　α−ζ−Φｈ　ａ−−罐Ｉ！Ｉ 口　Ｉ！ＩＯ＋−ψ　ｕΦ　ｇ４　Ｓ（Ｊ　ＪＯＣコＯ−ζ−Ｓ−Ｕ＋　Φ　− Ｌ　ロク 噛τ」　トド　αト　ロ）　＋ｉ　Ｊ　Ｉ−−（（ｒ＋　ＬＪ　Ｊｌｕｃｋ　＞ −〇−〇−云シ　荘テ　とｋ　８２ＦＩＧ、−２ ＦＩＧ、−４ Ｂａ１ｎ 下ＩＧ、−８ ↓ ↓ ＦＩＧ、−９ ＦＩＧ、−１１ ＦＩＧ、−１３ ＦＩＧ、−１４ ＦＩＧ、　−１５ ＦＩＧ、−１８ 国際調査報告 １＋ｍ＋ｎａＬ１＋＋ｎａ１＾＋＋＋＋１１ｍｌａＩＩｈ−（＝Ｔ１０Ｓ８ｇ１ ０２１９Ｍ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）のＢＡＲ１遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列を含むサッ カロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）のＢＡＲ１遺伝子の一部、選ばれた宿主に対して外来の構造遺伝子の少なくと も１つ、及び上記のＢＡＲ１遺伝子の一部と構造遺伝子とから得られる融合ポリ ペプチド又はタンパク質の発現を、本ＤＮＡ構築物で形質転換した宿主細胞中で 制御するプロモーターを含むＤＮＡ構築物。
2. ２．上記融合ポリペプチド又はタンパク質がＫＥＸ２プロセッシング部位を含む 請求の範囲第１に記載の構築物。
3. ３．上記ＢＡＲ１遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列が融合ポリペプチ ド又はタンパク質のシグナルペプチダーゼによる切断効率を減少するよう修正し たものである請求の範囲第２に記載の構築物。
4. ４．上記プロモーターがイーストの解糖系遺伝子プロモーターである請求の範囲 １に記載の構築物。
5. ５．上記プロモーターが、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＡＲ １プロモーター、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコールデヒ ドロゲナーゼ１のプロモーター及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）のアルコール・デヒドロゲナーゼの プロモーターからなる群カら選ばれるものである、請求の範囲１に記載の構築物 。
6. ６．上記構築物がｐＺＶ３０、ｐＺＶ３１、ｐＺＶ４９及びｐＺＶ５０からなる 群から選ばれるものである請求の範囲５に記載の構築物。
7. ７．サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）のトリオース・ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子の転写ターミネ ーター領域をさらに含む、請求の範囲１に記載の構築物。
8. ８．上記ＢＡＲ１遺伝子の一部が翻訳開始部位の５′側に隣接して６８０塩基対 の非翻訳領域を含む請求の範囲１に記載の構築物。
9. ９．請求の範囲１から８に記載の構築物を含む形質転換細胞。
10. １０．上記細胞が菌類の細胞である請求の範囲９に記載の形質転換細胞。
11. １１．上記菌類がサッカロミセス・セレビシァェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求の範囲１０に記載の細胞。
12. １２．上記菌類がシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）である請求の範囲１０に記載の細胞。
13. １３．上記菌類がアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はニューロスポ ラ（Ｎｅｗｒｏｓｐｏｒａ）である請求の範囲１０に記載の細胞。
14. １４．以下に示す工程を含む、形質転換細胞中で異種タンパク質を生産し、該タ ンパク質を上記細胞の分泌系に向ける方法。 （ａ）少なくともシグナルペプチドをコードする配列を含むＳ，セレビシアエ（ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＡＲ１遺伝子の一部、上記異種タンパク質をコード する構造遺伝子及び上記細胞中で上記シグナルペプチド及び上記異種タンパク質 を含む融合タンパク質の発現を制御するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で宿主 細胞を形質転換する。 （ｂ）上記融合タンパク質の生産のための選択に適した生育条件下で、工程（ａ ）からの細胞を生育させる。
15. １５．上記細胞が菌類細胞である請求の範囲１４に記載の方法。
16. １６．上記菌類がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求の範囲１５に記載の方法。
17. １７．上記菌類がシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ −ｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）である請求の範囲１５に記載の方法。
18. １８．上記菌類がアスぺルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはニューロス ポラ（Ｎｅｗｒｏｓｐｏｒａ）である請求の範囲１５に記載の細胞。
19. １９．上記融合タンパク質がＫＥＸ２プロセッシング部位を含む請求の範囲１４ に記載の方法。
20. ２０．上記ＢＡＲ１遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列が、そのポリペ プチド又はタンパク質のシグナルペプチダーゼによる切断効率を減少させるよう に修正されている請求の範囲１９に記載の方法。
21. ２１．上記プロモーターがＳ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＡＲ １プロモーター、Ｓ．セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール・デ ヒドロゲナーゼＩのプロモーター、及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉ ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）のアルコール・デヒドロゲナー ゼのプロモーターからなる群から選ばれるものである請求の範囲１４に記載の方 法。
22. ２２．上記プロモーターがイーストの解糖系遺伝子プロモーターである請求の範 囲１４に記載の方法。
23. ２３．上記ＤＮＡ構築物がｐＺＶ３０、ｐＺＶ３１、ｐＺＶ４９及びｐＺＶ５０ からなる群から選ばれるものである請求の範囲２２に記載の方法。
24. ２４．上記異種タンパク質が上記細胞から分泌される、請求の範囲１４に記載の 方法。
25. ２５．上記タンパク質がプロインシュリン又はインシュリンを含む、請求の範囲 １４に記載の方法。
26. ２６．請求の範囲第１４に記載の方法により生産したタンパク質。
27. ２７．ヒトのプロインシュリン又はインシュリンのアミノ酸配列を含む請求の範 囲１４に記載の方法により生産したタンパク質。