CN86107554A - 利用啤酒酵母基因bar1分泌异种蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种在宿主生物中生产外来蛋白的方法，该蛋白质通过宿主的分泌途径进行后加工。生产和后加工是通过用载体转化宿主生物而达到的，该载体至少包括与外来结构基因融合的啤酒酵母BAR1基因的信号肽编码区。还提供了DNA构建体和转化体，它包括一部分编码信号肽的BAR1基因和一个KEX2后加工位点，以及一个外来结构基因。尤其是从梨酒酵母和啤酒酵母中表达和分泌了胰岛素原。

Description

本申请是1985年10月25日提交的流水号为791，305申请的后继申请。
本发明涉及新的DNA结构，该结构至少含有啤酒酵母（Saccharomyces    Cerevisae）BAR1基因的转译信号肽部分以及至少一个与用所述基因转化的宿主细胞无关的结构基因。用这样的结构去转化宿主生物可导致表达一种初级表达产物，该产物包含由融合到BAR1信号肽上的异种基因编码的结构蛋白，结果可使该蛋白通过宿主细胞的分泌途径加工并从宿主细胞分泌到培养基或周质空间中。
各种各样的原核和真核微生物已被用作通过DNA重组技术生产不能由宿主自然产生的异种多肽的宿主。人们对真核生物中的各种真菌具有特别的兴趣，包括啤酒酵母菌、梨酒酵母菌（Schizosaccharomyces    Pombe）、曲霉菌属（Aspergillus）和脉胞菌（Neurospora）。尤其是对属于芽生酵母的啤酒酵母菌作了许多工作。用一个合适的DNA结构如质粒转化酵母细胞，已能使其表达包含在该质粒中的异种基因。然而，这一技术的主要限制是，在许多场合下，宿主细胞不能将这种蛋白产物分泌到介质中，所以必须破碎这些细胞，并在不使其变性或失活的情况下从各种污染的细胞成分中纯化所希望的蛋白质。所以，希望能引导这些转化细胞分泌能简化产品提纯步骤的异种产物。此外，希望一些蛋白质进入到宿主细胞的分泌途径以便于进行合适的后加工，即形成二硫键。
已知啤酒酵母菌分泌一些天然产生的蛋白质，但是，有关这一过程的知识与由细菌和哺乳动物细胞分泌蛋白质所知道的相比是十分有限的。大多数分泌出来的酵母蛋白质似乎都是保持在周质空间的酶，但转化酶和酸性磷酯酶也可能与细胞壁结合。已知由啤酒酵母菌分泌到培养基中的蛋白质包括接合信息素（α-因子和α因子）、致死毒素以及引起Barrier活性（以下简称“Barrier”）的蛋白质。穿过细胞壁进入介质中的分泌也称为“输出”。啤酒酵母菌的接合型α细胞产生分泌到培养基中的α-因子，而α细胞产生两种分泌多肽，α-因子和Barrier因子。α-因子的基因已进行了克隆、序列测定和分析（见Kurjan和Herskowitz，Cell    30∶933-943，1982）。信号肽（一种被认为是引导细胞分泌一种附着蛋白质的短肽序列）、引导序列（Leader    Sequence）（包括一个从成熟的α-因子上切下的多肽前体）和来自α-因子的非转译基因序列（包括启动子和调节区）可用于引导在酵母中产生异种蛋白的分泌（Brake等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    81∶4642-4646，1984）。α-因子的表达由MATα1基因产物调节，而且将α-因子前体加工成成熟的蛋白质似乎至少需要两步，并认为是处于STE    13和KEX2基因的控制之下。
与α-因子相对比，Barrier因子基于它与伴刀豆球蛋白A结合的能力似乎是糖基化的。Barrier因子是由α细胞产生，其表达似乎是在MATα-2基因的控制之下。除了可能的信号肽切割外，至今未表明Barrier因子前体的加工，而且认为STE13和KEX2基因与Barrier因子的表达无关。
由于在α-因子和Barrier因子的表达控制和加工之间有上述不同，人们无法事先确定这些酵母基因中的那一个更适于引导分泌一个特定的异种蛋白。由于这两种蛋白质似乎是通过不同的分泌途径而加工的，所以希望利用Barrier因子分泌系统的特征。
因此，本发明的一个目的是要提供这样的DNA结构，它含有至少编码信号肽的BAR1基因片段，还包含一个外来结构基因，它在微生物宿主里表达后可产生一种异种蛋白，该异种蛋白通过宿主细胞的分泌途径而加工。
本发明的另一个目的是提供在一种微生物宿主里表达异种基因的方法，产生一个由该基因编码并由该宿主细胞的分泌途径加工的异种蛋白或其一部分。
本发明的另一个目的是提供一个从一种微生物宿主分泌异种蛋白的生产方法。
本发明进一步的目的是提供一个通过DNA重组技术产生异种蛋白的方法。
本发明另一个目的是提供一个通过DNA重组技术生产具有人胰岛素原和胰岛素的氨基酸序列的蛋白质。
这些目的和其它一些目的由以下对具体实施方案和权利要求的描述将成为显而易见。
本发明涉及DNA结构和利用它们的方法，这些结构至少包含有啤酒酵母BAR1基因的信号肽编码序列，至少一个与宿主生物不同的结构基因，以及在含有BAR1信号肽和该异种蛋白的融合蛋白的宿主生物中控制表达的启动子。
在附图中：
图1表示初级转译产物的BAR1基因的核苷酸序列和由其衍生的氨基酸序列。MATα2结合部位下加黑线标出，推定的信号肽切割部位用一个箭头表示，可能的糖基化部位用星号标出;
图2是质粒pZV9的示意图;
图3表示了质粒p254的构建;
图4表示了质粒pZV30、pZV31、pZV32和pZV33的构建;
图5A和5B表示了质粒pZV50的构建;
图6表示了质粒m115的构建;
图7表示了质粒pZV49的构建;
图8表示了含有TPI1启动子的质粒pZV134的构建;
图9表示了MFα1基因一部分的亚克隆;
图10表示了质粒pZV75的构建;
图11表示了含有TPI1启动子和BAR1-MFα1融合序列的质粒的构建;
图12表示了质粒pSW22的构建;
图13表示了具有BAR1-MFα1融合序列的质粒构建;
图14表示了pZV100的构建;
图15表示了质粒pZV102的构建;
图16表示了质粒pSW96的构建;
图17表示了质粒pSW97的构建;
图18表示了质粒pSW98和pSW99的构建，△表示在密码子25处的突变。
术语“DNA结构”用在这里是指任何一种DNA分子，包括质粒，它通过人为干预以某种方式被修饰过，使得该分子中的核苷酸序列与天然产生的序列不一样。术语“DNA结构”还包括这样修饰过的DNA分子的克隆。术语“表达载体”和“表达质粒”定义为这样一种DNA结构，它包括转录起始部位以及至少一个编码在宿主生物中表达的所需蛋白质的结构基因。表达载体通常还包括启动子和终止密码子这样一些控制所需蛋白质在宿主生物中的表达的片段和复制起点。本发明的表达载体通常还包含一个选择标记，例如具抗菌素抗性的基因或营养标记。
术语“DNA结构”还要认为包括与宿主染色体整合的表达载体部分。
术语“质粒”具有它通常的意义，即一个通常为闭环的能自主复制的DNA结构。
术语“信号肽”指一个初级转译产物中的一部分，它能将该产物导入产生它的细胞的分泌途径中。在这一过程中，信号肽通常由一信号肽酶从该初生多肽的其余部分中切开。信号肽的特征是存在一个疏水氨基酸核心，并且出现在该初生多肽转译产物的氨基端，长度通常是大约17至25个氨基酸。信号肽切开的部位已由Von    Heinje（Eur.J.Biochem.133∶17，1983）作过详细描述。术语“信号肽”用在这里时还可以指天然存在的信号肽的功能部分。
本发明提供了引导转化细胞通过分泌途径引导异种蛋白的方法，该方法是通过包含与酵母BAR1基因或至少具有BAR1信号肽编码的一部分连接的异种基因的DNA结构转化宿主而完成的。这样加工的蛋白质可被分泌到周质空间或培养基中。酵母的BAR1基因编码具有Barrier活性的因子，它被认为是由啤酒酵母菌的a细胞分泌的一种糖基化蛋白。这种分泌的Barrier因子可使接合型a细胞克服由α-因子引起的G1抑制。这种Barrier因子可能是一种蛋白酶（见Manney，J.Bacteriol.，155∶291-301，1983）。BAR1基因的转录由α-因子所促进。在α或a/α细胞中检测不到Barrier因子或类似的活性，而且BAR1基因在这些类型的细胞中不被转录。
图1给出了环绕BAR1基因的2750碱基对的序列，该图一起还表示了由此衍生的初级转译产物的氨基酸序列。BAR1的ATG转译起始部位是在图1所示的大约2.75千碱基片段的681位上，该片段是将从酵母基因组文库得到的一个片段亚克隆化了的（Nasmyth和Tatchell，Cell，19∶753-764，1980）。一个开放的译读码从+1处的ATG密码子开始，沿着3′方向延伸1761个碱基对。BAR1初级转译产物的最初24个氨基酸序列似乎与已知的酵母和哺乳动物的信号肽序列相似。这样，第24位上的丙氨酸可以作为一个切割位点，象在酵母转化酶和酸性磷酯酶一样。切割也可以发生在第23个氨基酸之后。在初级转译产物中，至少有九个可能的与天冬酰胺连接的糖基化部位存在，但这种分泌出的成熟的Barrier因子的糖基化程度还不清楚。BAR1基因的启动子和调节区位于距转译起始密码5′端大约680碱基对的区域中。已发现完整启动子的功能和对α-因子刺激的反应位于5′端非转译区的大约680碱基对的ATG附近。
本发明的DNA结构最好在Barrier因子和异种蛋白的结合处有一个切割位点的密码。一个可取的这种位点是KEX2切割位点、它是可由啤酒酵母菌的KEX2基因产物识别和切割的氨基酸序列（Julius等人，Cell    37∶1075-1080，1984）。KEX2位点是以如赖氨酸和精氨酸这样的碱性氨基酸对为特征的。KEX2位点的序列最好是Lys-Arg或Arg-Arg。这种BAR1初级转译产物在其结构区中包含有两个这样的碱性氨基酸对：在177-178位上的Arg-Arg和在404-405位上的Lys-Lys。如前面所述，KEX2基因并不涉及该Barrier因子的蛋白质前体的加工，这表明这些潜在的加工位点由于蛋白质的构象或糖基化而被阻断，并进一步表明这种Barrier因子通常可通过不同于KEX2的加工蛋白如α-因子所用的途径加工。然而，申请人发现，通过包含BAR1基因初级转译产物的一部分（含有其信号肽部分）及所需蛋白质的融合蛋白中包括进一个KEX2加工位点，在KEX2位点上切割该融合蛋白，就会导致所需蛋白质的分泌。还发现通过降低包含KEX2切割位点的融合蛋白的Barrier因子的信号肽酶切割效率，可提高所需蛋白的输出水平。KEX2切割位点可由BAR1序列或所需基因提供，或者可通过加入连接子或通过位点特异性诱变导入。
于是，按照本发明，包含ATG起始密码以及信号肽编码序列的BAR1基因的一部分可与所需的异种基因相连接，并转化到一种真核宿主细胞中。结果产生的融合基因在BAR1和外来序列结合处将包括一个加工位点，最好是一个KEX2切割位点。这样一个结构也可包括来自BAR1基因5′端非编码区的调节区和启动子，或者可以包括来自其它基因的调节区和/或启动子。除了来自BAR1基因的启动子外，其它可以利用的启动子包括来自啤酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅰ或乙醇脱氢酶Ⅱ的基因、啤酒酵母糖酵解途径的那些基因，如TPI1启动子，以及由其它菌种得到的相应的基因，包括分裂酵母梨酒酵母菌（Russell和Hall，J.Biol.Chem.，258∶143-149，1983;Russell，Nature，301∶167-169，1983）。啤酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅰ基因已由Ammerer详细描述过（Methods    in    Enzymology，101∶192-201，1983）。乙醇脱氢酶Ⅱ基因己由Russell等人作了说明（J.Biol.Chem.，258∶2674-2682，1983）。啤酒酵母的糖酵解基因已由Kawasaki（博士论文，华盛顿大学，1979）、Hitzeman等人（J.Biol.Chem.，225∶12073-12080，1980）、Kawasaki和Fraenkel（Biochem.Biophys.Res.Comm.108∶1107-1112，1982）以及Alber和Kawasaki（J.Biol.Appl.Genet.1∶419-434，1982）作出了描述。
在一个较好的实施方案中，BAR1基因信号肽的编码序列被修饰，以降低其信号肽酶切割含有KEX2切割位点的融合蛋白中Barrier因子的效率。这可以通过使那些潜在的切割位点，特别是（Barrier因子蛋白质序列的）氨基酸23-24连接处或氨基酸24-25连接处的这些部位进行位点特异性诱变来实现。
用于形成本发明DNA结构的方法只涉及常规的技术。BAR1结构基因或其一部分以及要被表达的结构基因最好用单个启动子控制，DNA片段的连接已有过大量描述，并且完全是在所涉及技术中的普通专业人员能力之内。待表达蛋白质的DNA编码序列大体上可是任何一种蛋白质的DNA，特别是象干扰素、胰岛素、胰岛素原、α-1-抗胰蛋白酶、生长因子和组织血纤维蛋白溶酶原活化因子这样一些具有商业意义的蛋白质。
在制备出含有BAR1基因或其一部分及要表达的结构基因的DNA结构后，该结构可在转化条件下转化到宿主生物中。转化原核细胞和真核细胞（包括哺乳动物细胞）的技术在文献中是已知的。
宿主细胞最好是芽生酵母啤酒酵母菌的一个菌株，但是，也可利用其它真菌，包括分裂酵母梨酒酵母菌和丝状真菌小巢状曲霉菌（Aspergillus    nidulans）和脉胞菌（Neuroprora    spp）。
下面，作为举例而不是作为限制，给出一些实例。除非特别指出，自始至终都是采用标准的分子生物学方法。限制性内切酶是由Bethesda研究实验室、新英格兰生物实验室和Beehringer-Mannheim生物化学公司得到的，并按照制造商的说明，一般与胰核糖核酸酶（10微克/毫升）一起使用。T4DNA连接酶是由Bethesda研究实验室或Boehrmger-Mannheim公司得到的，并且按照说明使用。M13和pUC宿主菌株及载体是从Bethesda研究实验室得到的。M13按Messing（Methods in Enzymology，101∶20-77，1983）描述的方法进行克隆。DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）按Maniatis等人（Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982）描述的方法使用。大肠杆菌（E.Coli）培养物通过Bolirar等人的方法（Gene，2∶95-113，1977）进行转化。啤酒酵母菌培养物按照由Mackay改进的（Methods in Enzymology 101∶325，1983）Beggs的方法（Nature275∶104-108，1978）进行转化。梨酒酵母菌按Russell（Nature    301∶167-169，1981）所述方法进行转化，接合信息素α-因子通过由Manney等人改进的（J.Cell    Biol.96∶1592-1600，1983）Duntze等人的方法（Eur.J.Biochem.35∶357-365，1973）制备或者从西格玛化学公司购得，寡聚核苷酸在一个“应用生物系统308A型DNA合成装置“上合成，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性凝胶上进行纯化。
方法
Barrier因子活性的测定
用于检测转化的酵母细胞的Barrier因子生产的方法依赖于Barrier因子逆转和α-因子接触的敏感型a细胞生长抑制的能力。试验菌株是一种因为不产生Barrier活性而对α-因子异常敏感的菌株，如菌株RC629（MATa    bar1）。利用铺在琼脂平板上的软琼脂中的这种菌株制备一个菌苔。将足够量的α-因子（Manney测定时用0.05-0.1单位，出处同上）加到该表层上以抑制这些细胞的生长。然后，将要筛选Barrier因子的转化株点在该菌苔上。由转化细胞分泌的Barrier因子立即在该点周围逆转了α-因子的生长抑制作用，因而使这些敏感细胞再生。可观察到这些再生细胞围绕着转化细胞菌苔的通常是平滑的边缘，这种环形的存在表明转化菌株中的质粒引导了Barrier因子的表达和分泌。
IRI和IRC检测法
利用从丹麦Bagsvaerd的诺娃工业公司得到的商品化成套仪器进行IRI和IRC检测。用豚鼠的抗猪胰岛素以及豚鼠的抗人C-肽抗体进行检测。
IRI测定
50微升在NaFAM（0.04M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含有牛血清清蛋白）中的样品
50微升抗体（母液以1∶30稀释）
于4℃下16-24小时
50微升125Ⅰ-胰岛素（以1∶100稀释）
于4℃下2小时
50微升在NaFAM中的1%的金黄色葡萄球菌
于0℃下45分钟
用1%BSA/TNEN＊洗涤两次
离心后对沉淀进行计数
这些不同的步骤可以很方便地在微量滴定板上进行，然后将沉淀转移到闪烁瓶中。
IRC测定
50微升在NaFAM中的样品
50微升抗体（母液以1∶50稀释）
于4℃下16-24小时
50微升125Ⅰ-C肽（母液以1∶30稀释）
于4℃下2-4小时
50微升在NaFAM中的1%金黄色葡萄球菌
于0℃下45分钟
用1%BSA/TNEN＊洗涤两次
离心后对沉淀进行计数
＊TNEN是 20mM Tris pH8.0
100mM    NaCl
1mM    EDTA
0.5%    NP-40
α-因子活性的测定
用于检测转化的酵母细胞的α-因子输出的方法利用了α-因子抑制敏感型a细胞生长的能力。试验菌株（如啤酒酵母RC629菌株（MATa    bar1））的BAR1基因中包含一个防止产生Barrier活性、并使细胞对α-因子特别敏感的突变。在标准的酵母选择性合成培养基（例如缺乏亮氨酸的培养基）平板上的软琼脂中形成该试验菌株的一个菌苔。将待筛选α-因子输出的转化株点到该菌苔上，并在30℃下保温。由转化株分泌的α-因子会引起紧挨着该菌落周围的菌苔生长受到抑制。试验细胞菌苔中的这种生长抑制的晕轮表明，该菌落正在输出活性α-因子。比较晕轮的大小使我们能够估计由每一种转化株输出的α-因子的相对数量。
实例1    利用BAR1基因在啤酒酵母中表达胰岛素原
利用穿梭载体YEp    13（Broach等人，Gene8∶121-133，1979）来构建包含全部酵母基因组的重组质粒库（Nasmyth和Tatchell，Cell    19∶753-764，1980）。将通过部分Sau3A降解产生的酵母DNA片段插入Bam    HⅠ降解过的YEp    13中。用该质粒库去转化啤酒酵母XP635-10C菌株（MATa    leu2-3    leu2-112bar    1-gal2：寄存号ATCC20679），选择亮氨酸原养型转化株并在抑制a    bar1细胞的α-因子浓度下进行培养。从产生的菌落中再筛选出能够分泌Barrier因子的菌株。发现两个菌落，它们即具有亮氨酸独立性又有分泌Barrier因子的能力，这些菌落携有称为pBAR2和pBAR3的质粒。
将从这两个转化株分离出来的质粒DNA用于转化大肠杆菌RRI菌株（寄存号ATCC3    1343）。选择对氨苄青霉素有抗性的转化株。从大肠杆菌转化株中提纯质粒pBAR2和pBAR3，并用限制性内切酶降解和在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上电泳进行鉴别。质粒pBAR2表明包含一个大约9.2千碱基的扦段。用质粒pBAR2转化的大肠杆菌RRI已经寄存于ATCC，寄存号为39410。
亚克隆表明pBAR3质粒扦段含有pBAR2扦段的一部分，但在该载体中以相反的方向定位。进一步对Barrier因子的分泌进行克隆和筛选，将起作用的BAR1基因序列定位在一个大约2.75千碱基的区域中。这一片段包含了编码序列、非转译的转录序列、启动子、调节区、转录终止区和两侧的染色体序列。
用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ降解质粒pBAR2，通过琼脂糖凝胶电泳提纯一个大约3千碱基的片段。将这一片段扦进用HindⅢ和SalⅠ降解的质粒pUC    13中。得到称为pZV9（图2）的重组质粒，可用它转化大肠杆菌，但缺乏必需的复制起点和酵母载体的可选择标记。在大肠杆菌RRI转化株中的质粒pZV9已经寄存于ATCC，寄存号为53283。
用BAR1基因引导胰岛素原分泌时，采用含有5′端调节区和一部分编码序列的BAR1基因片段。在适当的译读码及在BAR1序列上使最终产生的融合多肽可在活体中切割的点上进行BAR1和胰岛素原基因片段的融合。BAR1基因中有好几个位点都是可能的切割部位，选择177-178位上的Arg-Arg作为与胰岛素原融合的试验位点。因此，以1.9千碱基的HindⅢ-SalⅠ片段的形式，从质粒pZV9中提纯出5′端调节序列和大约800碱基对的BAR1编码序列。
参照图3，它显示了对人的前胰岛素原cDNA进行亚克隆的方法。人的前胰岛素原cDNA（前BCA克隆）P27，是用带有G-尾端的PstⅠ降解的pBR327和扦入通过对人胰腺的全部RNA进行逆转录形成的带有C-尾端的DNA产生的。质粒pBR327已由Soberon等人（Gene9∶287-305，1980）作过描述，而人前胰岛素原已由Bell等人（Nature 232∶525-527，1979）报导过。完整的转译序列被切割为NcoⅠ-HgaⅠ片段。突出的两个末端用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）填上，并同时连上合成的EcoRⅠ连接子（GGAATTCC）和XbaⅠ连接子（CTCTAGAG）。将该片段亚克隆到已用EcoRⅠ和XbaⅠ切割的pUC13中（Vieira和Messing，Gene19∶259-268，1982）以及Messing，Meth.in Enzymol.101∶20-77，1980）。由于在5′端加上一个EcoRⅠ连接子而在起始密码上恢复了NcoⅠ位点（CCATGG），因此在质粒中筛选两侧具有EcoRⅠ、NcoⅠ和XbaⅠ位点的340碱基对的扦段。一个具有这些性质的质粒称为p47，如图3所示。具有一个平头5′端的胰岛素原（BCA）片段通过质粒p47的引物修补合成而生成（Lawn等人，Nuc.Acids Res.9∶6103-6114，1981）。接着用XbaⅠ降解产生一个270碱基对的片段，将它扦到pUC12中（Vieira和Messing，同上以及Messing，同上）。通过用HindⅢ切割和用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）填平末端，用XbaⅠ切割及凝胶纯化来制备载体。结果得到含有一个钝头末端和一个XbaⅠ粘性末端的载体片段，将它连接到上面所述的BCA片段上。由于成熟的BCA从苯丙氨酸（密码子TTT）开始，这两个片段的钝头的连接在连接处再产生一个HindⅢ位点。首先筛选恢复了HindⅢ位点的质粒，然后利用M13序列测定引物测定穿越连接处的序列来筛选质粒。质粒p254具有正确的序列。
参照图4，用HindⅢ和EcoRⅠ降解p254质粒，用凝胶法提提纯大约270碱基对的胰岛素原片段。该片段的两端用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）和脱氧核苷三磷酸填平，用T4多核苷酸激酶和γ-32-P-ATP处理Sal Ⅰ连接子序列（GGTCGACC），再将它连接到钝化的胰岛素原片段上。用SalⅠ和BamHⅠ降解，接着在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，得到一个具有SalⅠ和BamHⅠ粘性末端的胰岛素原片段。
将该胰岛素原片段与1.9千碱基的BAR1片段一起连接到用HindⅢ和BamHⅠ降解过的pUC13上。这一结构用于转化大肠杆菌K12（JM83）。
筛选出对氨苄青霉素有抗性、并产生白色菌落的转化细胞。通过用HindⅢ、BamHⅠ和SalⅠ进行限制性内切酶的降解进一步筛选，鉴别出一个含有适当大小的HindⅢ-BamHⅠ片段和单个SalⅠ位点的质粒（pZV27）。
为了将胰岛素原的第一氨基酸连接到BAR1基因产物的Arg-Arg-可能的加工位点上，去除在BAR1-胰岛素原融合物中的扦入物质。如下述利用合成寡聚核苷酸使这种外加物质从闭合环中去除。参照图4，用HindⅢ和BamHⅠ降解质粒pZV27，并用凝胶提纯大约2.2千碱基的BAR1-胰岛素原融合片段。然后，将此片段扦入入已用HindⅢ和BamHⅠ降解过的复制型噬菌体载体M13mp11中（Messing，Meth.in Enzymology 101∶20-77，1983）。用这种重组DNA转染大肠杆菌K12（JM103）（Messing，同上）。排出白色的噬菌斑，并通过HindⅢ+SalⅠ和SalⅠ+BamHⅠ的双酶降解筛选出具有正确限制性图谱的复制型重组噬菌体。一个显示所希望图谱的结构称为mp11-ZV29。用γ-32P-ATP和T4多核苷酸激酶对寡核苷酸引物（序列：3′GGATCTTCTAAACACTTG5′）作标记。然后，使7.5微微摩尔的激酶引物与80毫微克M13序列测定引物（Bethesda研究实验室）结合。使这种混合物退火形成2微克单股的mp11-ZV29。然后，如Zoller等人（《高级分子克隆技术手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，1983）用于寡核苷酸引导诱变（双引物方法）那样，用T4DNA连接酶和DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）来延伸第二股。用以这种方法制取的DNA转染大肠杆菌K12（JM103），并用激化的寡聚物作为探针（Zoller等人，同上）筛选噬菌斑。用这样识别出来的噬菌斑制备噬菌体复制型（RF）DNA（Messing，同上）。RF DNA的限制性酶的降解鉴别出具有合适的XbaⅠ限制性图谱（7.5千碱基、0.81千碱基和0.65千碱基的片段）和缺少一个SalⅠ限制性位点（它存在于BAR 1-胰岛素原融合物的去除区域）的两个克隆。
由这两个克隆得到的RF    DNA用HindⅢ和BamHⅠ降解，由每一个得到的1.9千碱基的融合物片段通过凝胶提纯。将这些片段连接到用HindⅢ和BamHⅠ降解过的pUC13和YEp13载体上（Broach等人，Gene8∶121-133，1979）。用随后用来进行序列测定的pUC/BAR    1-胰岛素原杂交质粒转化大肠杆菌K12（JM83）。这些质粒中的两个称为pZV32和pZV33。用YEp13衍生的重组体转化大肠杆菌RRI（Nasmyth和Reed，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.，77∶2119-2123，1980）。这些质粒中的两个称为pZV30和pZV31（图4）。
pZV32和pZV33的序列测定按照Maxam和Gilbert的方法（Meth.in    Enzymology，65∶57，1980）进行。从位于距结合处5′端大约190碱基对的BglⅡ位点处到位于距结合处3′端（在胰岛素原基因中）大约140碱基对的Sau96Ⅰ位点处，对BAR1-胰岛素原融合片段进行序列测定。由这些实验得到的数据证实，已经构建了所需要的BAR1和胰岛素原基因之间的融合物。
用质粒pZV30和pZV31转化啤酒酵母XP635-10C菌株。在缺乏亮氨酸的标准酵母合成培养基中培养1升培养物。34小时后，将α-因子加到10毫升各种培养物的等分试样中。加入11小时后，通过离心收集培养物。用细胞沉淀和上清液检测胰岛素和胰岛素类似物。对用质粒pZV31转化的培养物的上清液进行的两次测定表明，每毫升培养基中有3微微摩尔IRI物质及5.8微微摩尔IRC物质。IRI是正确折迭的胰岛素、胰岛素原或其降解物。IRC是游离的C-肽，不正确折迭的胰岛素原或其降解产物。
实例2
利用乙醇脱氢酶Ⅰ启动子，BAR1基因及磷酸丙糖异构酶终止区在啤酒酵母中表达胰岛素原。
试验了啤酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ启动子（后面称为ADHⅠ启动子，人们也称它为ADCⅠ启动子），利用它来引导邻接BAR1序列的外来多肽的表达。构建了包含这些序列的质粒。
质粒pZV50（图5B）包含啤酒酵母ADHⅠ启动子，上述BAR1-胰岛素原融合序列及啤酒酵母磷酸丙糖异构酶（TPI1）基因的终止区（Alber和Kawasak;J.Molec.Appl.Genet.1∶419-434，1982）。它是以下列方式构建的。参见图5A，用HindⅢ和BamHⅠ降解质粒pAH5（Ammerer，出处同上），用凝胶纯化1.5千碱基的ADHⅠ启动子片段。利用T4DNA连接酶，将此片段与来自pUC13的HindⅢ-EcoRⅠ聚合连接子片段一起插入用EcoRⅠ、BamHⅠ降解的质粒pBR327中。所获质粒命名为pAM5，用SphⅠ和XbaⅠ使其降解，在2%琼脂糖凝胶上纯化大约0.4千碱基的ADHⅠ启动子片段。用XbaⅠ降解质粒pZV9，然后用相似的凝胶法，纯化含有整个BAR1编码区的大约2千碱基的BAR1片段。将ADHⅠ启动子和BARⅠ序列这两个片段与用XbaⅠ、SphⅠ降解的YEp13相连接，以产生出质粒pZV24。用SphⅠ和BglⅡ降解pZV24，然后进行凝胶纯化，则产生一个大约800碱基对的ADHⅠ启动子-BAR1的融合序列，它包含有ATG转译起始密码，但没有编码潜在的Arg-Arg加工位点的密码。质粒pZV33含有BAR1-胰岛素原融合序列，用BglⅡ和XbaⅠ对它进行降解，然后纯化含有Arg-Arg密码子的融合片段（大约500碱基对）。
参见图6，从质粒pFG1（Alber和Kawasaki;出处同上）中得到TPI1终止区。用Eco    RⅠ降解pFG1，用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）将线型化的质粒末端填平，然后加入BamHⅠ连接子序列（CGGATCCA）。用BamHⅠ降解该片段并再进行连接以产生质粒p136。从p136中以XbaⅠ-BamHⅠ片段的形式纯化出700碱基对的TPI1终止区。将此片段插入用XbaⅠ、BamHⅠ降解的YEp13中，然后用HindⅢ进行切割，用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）填平末端，并再连接以产生质粒p270。在p270中以XbaⅠ-BamHⅠ片段的形式纯化出TPI1终止区，然后插入用XbaⅠ、BamHⅠ降解的pUC13中以产生质粒m115。
参见图5B，通过XbaⅠ和SstⅠ降解，从质粒m115中切下TPI1终止区，然后进行凝胶纯化。将下述三个片段，即ADHⅠ-BAR1融合序列、BAR1-胰岛素原融合序列及TPI1终止区插入用SphⅠ和SstⅠ降解过的质粒pUC18中（Norrander等人，Gene，26∶101-106，1983）。用此DNA转化大肠杆菌K12菌株（JM83），筛选具有氨苄青霉素抗性及产生白色菌落的转化体，鉴定为具有所需插段的质粒（pZV45）。然后，用SphⅠ和BamHⅠ降解质粒pZV45，用凝胶纯化ADHⅠ-BAR1-胰岛素原-TP1终止区序列。将此片段插入用SphⅠ和BamHⅠ降解过的YEp13中，以产生啤酒酵母表达载体pZV50。
用质粒pZV50转化啤酒酵母XP635-10C菌株，培养后如实例1所述进行检测。培养基中没有发现IRI物质，每毫升中的IRC物质少于0.5微微摩尔。0.1%的诺乃洗涤剂（Nonidet）P-40的细胞提取物表明，每毫升细胞提取物中含有1微微摩尔的IRC物质。
实例3
利用BAR1基因及梨酒酵母菌乙醇脱氢酶启动子在梨酒酵母菌（Schizosaccharomyces    Pombe）中表达胰岛素原。
本实例说明利用BAR1基因中的部份序列，引导在转化的梨酒酵母菌宿主中表达的外来多肽的分泌。构建了一种将梨酒酵母乙醇脱氢酶（ADH）基因启动子及BAR1-胰岛素原融合序列结合在一起的质粒。
从来源于梨酒酵母菌972h菌株（ATCC    24843）的DNA片段文库中得到梨酒酵母ADH启动子，根据Russell和Hall所述方法将其克隆到YEp13中（J.Biol.Chem.258∶143-149，1983）。从文库中以0.75千碱基的SphⅠ-EcoRⅠ片段的形式纯化出启动子序列。将此片段及pUC12的EcoRⅠ-HindⅢ聚合连接子片段与用SphⅠ及HindⅢ降解过的YEp13相连接。所得质粒称为pEVP-11。
梨酒酵母菌表达载体的构建参见图7，以pEVP-11中以SphⅠ-XbaⅠ片段的形式纯化出ADH启动子。用XbaⅠ和BglⅡ降解质粒pZV33，然后纯化大约340碱基对的包含ATG起始密码的BAR1片段。用BglⅡ和SstⅠ降解pZV33，纯化BAR1-胰岛素原的融合序列。使此三个片段与用SphⅠ、SstⅠ降解过的pUC    18相结合，以产生质粒pZV46。由于pUC18不能有效地转化梨酒酵母菌，因此还得使该质粒进行两次双酶降解。从HindⅢ+BglⅡ降解中纯化出ADH启动子-BAR1融合片段，从BglⅡ+XbaⅠ降解中纯化出BAR1-胰岛素原融合序列。将这些片段插入用HindⅢ、XbaⅠ降解过的YEp13中，从而产生梨酒酵母菌的表达载体pZV49。
使1升梨酒酵母的118-4h-（ATCC20680）转化菌株培养物在30℃下培养36小时，培养在标准的酵母合成培养基（-leuD）中进行，其中含有200毫克/升天冬氨酸、100毫克/升的组氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶。通过离心收集培养物，通过IRI及IRC检测法检测上清液。两份来自pZV49转化细胞的样品分别含有1.6微微摩尔/毫升的IRI物质和0.5微微摩尔/毫升IRC反应物质。来自用YEp13转化的细胞的对照样品不含有可测量的IRC反应物质。
实例4
利用BAR1信号肽输出α因子
试验了BAR1信号肽从酵母转化体中引导α因子输出的能力。构建了好几种质粒，它们含有编码具有不同长度BAR1蛋白的融合蛋白和1或4个成熟α因子拷贝的DNA片段。将这些质粒转化到a/α二倍体宿主菌株中去，通过晕轮检测法（halo    assay）检测转化体的α因子生成。
质粒pSW94、pSW95、pSW96和pSW97含有啤酒酵母磷酸丙糖异构酶（TPI1）启动子、BAR1基因的355碱基对或767碱基对片段（分别包含BAR1编码序列5′末端的114或251个密码子）及一个或四个α因子（MFα1）编码序列的拷贝。表1列出了它们的构造。
表1（bp：碱基对）
质粒    BAR1片段    α因子
pSW94    355bp    4个拷贝
pSW95    767bp    4个拷贝
pSW96    355bp    1个拷贝
pSW97    767bp    1个拷贝
将质粒pM220（也称为pM210）用作TPI1启动子片段的来源。用pM220转化的大肠杆菌RRI已寄存于ATCC，寄存号为39853。用EcoRⅠ降解质粒pM220，通过琼脂糖凝胶电泳分离含有TPI1启动子的0.9千碱基的片段，用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）填平末端。在片段上加上活化的XbaⅠ连接子，然后用BglⅡ和XbaⅠ进行降解。然后将此经过修饰的TPI1启动子片段连接到pDR1107的3.4千碱基的BglⅡ-XbaⅠ载体片段中去，以产生pZV118。质粒pDR1107的构建是通过将pM220的900碱基对的BglⅡ-EcoRⅠTPI1启动子片段亚克隆pIC7中完成的（Marsh.Erfle及Wykes，Gene32∶481-485，1984），这样就产生了质粒pDR    1101。用HindⅢ和SphⅠ降解质粒pDR1101，以分离700碱基对的TPI1启动子的部份片段。质粒pDR1100含有亚克隆到pUC18中的pM220的800碱基对的XbaⅠ-BamHⅠ    TPI1启动子片段，用HindⅢ和SphⅠ对其进行切割。将700碱基对的TPI1启动子的部份片段与线型化的pDR1100相连接，从而产生pDR1107。
然后，破坏pZV118中TPI1启动子3′末端的EcoRⅠ位点。用HindⅢ和EcoRⅠ降解该质粒，分离0.9千碱基的片段，並将它与一个合成的连接子相连，该连接子是通过使寡聚核苷酸ZC708（5′AATTGCTCGAGT3′）和ZC709（3′CGAGCTCAGATC5′）退火而构建的。加入连接子去掉了TPI1启动子片段3′末端的EcoRⅠ位点，并加进了XhoⅠ的XbaⅠ位点。然后将此片段与用HindⅢ-XbaⅠ切割的PUC13相接。获得的质粒命名为pZV134（图8）。
Kurjan和Herskowitz描述过酵母结合信息素α因子（MFα1）的克隆方法（出处同上）。本实验室以相似方法从Sau3A部份片段的酵母基因组文库中分离了该基因，该文库是克隆在YEp    13的BamHⅠ位点中的（Nasmyth和TaTchell，Cell    19∶753-764，1980）。以此文库中分离到了这样一个质粒，它能在纯合的酵母二倍体菌株matα    2-34突变体中表达α因子（Manney等人，J.Cell.Biol，96∶1592，1983）。Kurjan和Herskowitz发现，此克隆含有一个与MFα1基因叠合的插段。此质粒称为pZA2，用EcoRⅠ进行降解后分离含有MFα1的1.7千碱基的片段，然后连接到EcoRⅠ切割的pUC13中。所获质粒命名为p192，用EcoRⅠ进行裂解后分离所产生的1.7千碱基的MFα1片段，然后用MboⅡ进行降解。分离550碱基对的MboⅡ-EcoRⅠ片段并与活化的SalⅠ连接子相连。用SalⅠ切割连接好的片段。将所得到的0.3千碱基的SalⅠ片段与SalⅠ切割的pUC4相连（Vieiva    and    Messing，Gene19∶259-268，1982），从而产生命名为p489的质粒（图9）。
然后构建含有BAR1（114个密码子）和MFα1部份编码序列的融合基因。用SphⅠ和BglⅡ降解质粒pZV24（实例2），分离0.8千碱基的ADHⅠ启动子-BAR1片段。用BamHⅠ裂解质粒p489并分离0.3千碱基的MFα1片段。将这两个片段以三段连接的方式与SphⅠ+BamHⅠ切割的YEp13相连。所获质粒命名为pZV69（图11）。
构建了第二个融合基因，它编码了251个Barrier氨基酸並与α因子前体的一部份相连。质粒pZV16含有连接在XbaⅠ+SalⅠ切割的pUC13中的pZV9（实例1）的767碱基对XbaⅠ-SalⅠBAR1片段，用SalⅠ降解使其线型化。使此4.0千碱基的片段与来自p489的编码四个α因子拷贝的0.3千碱基SalⅠ片段相连。在正确定向上具有BAR1-MFα1融合体的质粒命名为pZV71。使来自pZV71的BAR1-MFα1融合体然后与ADHⅠ启动子相连。用XbaⅠ和PstⅠ降解质粒pZV71并分离1.07千碱基的片段。从pZV24中以0.42千碱基的SphⅠ-XbaⅠ片段的形式分离出ADHⅠ启动子。以三段连接的方式将这两个片段连接到SphⅠ+PstⅠ切割的pUC18中。用SphⅠ和BamHⅠ降解得到的质粒pZV73，分离含有表达单位的1.5千碱基的片段，并将它连接到SphⅠ+BamHⅠ切割的YEp13中，从而形成pZV75（图10）。
为了操作的方便，将来自pZV69和pZV75的BAR1-MFα1融合单位与TPI1一起亚克隆到pUC18中（图11）。用EcoRⅠ和BamHⅠ降解质粒pZV69，分离含有融合部份的0.55千碱基的片段。通过用HindⅢ和EcoRⅠ进行降解，从pZV118中分离出0.9千碱基的TPI1启动子片段。将0.55千碱基的BAR1-MFα1片段，0.9千碱基的TPI1启动子片段和HindⅢ及BamHⅠ切割的pUC19三部份连接起来。所获质粒命名为pSW59。用EcoRⅠ和BamHⅠ降解质粒pZV75，以分离954碱基对的BAR1-MFα1融合片段。将此BAR1-MFα1片段以三段连接的方式与0.9千碱基的HindⅢ+EcoRⅠTPI1启动子片段和HindⅢ+BamHⅠ切割的pUC18相连接，从而产生质粒pSW60。
在表达质粒的构建中，BAR1编码序列5′末端116碱基对的来源是pSW22，它是以下述方法构建的（图12）。pSW22中的BAR1编码区来源于pZV9。用SalⅠ和BamHⅠ切割质粒pZV9（实例1）以分离出1.3千碱基的BAR1片段。将此片段亚克隆到SalⅠ和BamHⅠ切割的pUC13中，从而产生命名为pZV17的质粒。用EcoRⅠ降解质粒pZV17以去除BAR1编码区3′端最尽头的0.5千碱基。将载体-BAR1片段再连接以产生命名为pJH66的质粒。用EcoRⅠ使质粒pJH66线型化并用Klenow片段填平末端。加入BamHⅠ活化的连接子（5′CCGGATCCGG3′），在再连接之前用BamHⅠ降解以去除过剩的连接子。所获质粒为pSW8，用SalⅠ和BamHⅠ切割以分离编码BAR1    252-525氨基酸的824碱基对的片段。将此BAR1片段与编码物质P的C-末端部份的片段相融合（Munro和Pelham，EMBO    J.3∶3087-3093，1984）。质粒pPM2是从Munro和Pelham处得到的，它含有编码M13mp8中物质P的二聚体形式的合成寡聚核苷酸序列。用BamHⅠ和SalⅠ降解使质粒pPM2线型化，并使其与824碱基对的BAR1片段相连。用SalⅠ和SmaⅠ降解所获质粒pSW14，以分离871碱基对的BAR1-物质P片段。用XbaⅠ和SalⅠ切割质粒pZV16（图10）以分离BAR1    5′端的767碱基对的编码序列。将此片段和871碱基对的BAR1-物质P片段以三段连接方式与用XbaⅠ和SmaⅠ切割的pUC18相连。所获质粒命名为pSW15。用XbaⅠ和SmaⅠ降解质粒pSW15以分离1.64千碱基的BAR1-物质P片段。从pRL029中得到了ADHⅠ启动子，它包括0.54千碱基的SphⅠ-EcoRⅠ片段，其中含有APHⅠ启动子和来自pUC18中pZV24的BAR1    5′端编码区的116碱基对。用SphⅠ和XbaⅠ降解质粒PRL029以分离0.42千碱基的ADHⅠ启动子片段。以pUC18中0.7千碱基的XbaⅠ+EcoRⅠ片段的形式提供TPI1终止区（Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1∶419-434，1982）。将含有TPI1终止区和具有Klenow填充的XbaⅠ末端及SphⅠ末端的pUC18的线型片段以三段连接的方式，与0.42千碱基的ADHⅠ启动子片段和1.64千碱基的BAR1-物质P片段相连接，从而产生质粒pSW22。
然后构建质粒pSW94（图13）。从质粒pSW22中以XbaⅠ-SstⅠ片段的形式分离出2.3千碱基的片段，其中含有BAR1-物质P融合序列和TPI1终止区。将从pZV134中分离出的HindⅢ-XbaⅠTPI1启动子片段以三段连接的方式，和用HindⅢ+SstⅠ切割的pUC18一道与BAR1-物质P-TPI1终止区片段相连。用HindⅢ和EcoRⅠ裂解所获质粒pSW81，以分离出含有TPI1启动子和BAR1    5′端116碱基对的1.02千碱基的片段。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒pSW59以分离0.55千碱基的BAR1-MFα1融合片段。然后以三段连接的方式，将此片段与来自pSW81的TPI1启动子-BAR1片段和用HindⅢ+BamHⅠ线型化的YEp13连接，从而产生质粒pSW94。
图13说明了pSW95的构建。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒pSW60以分离954碱基对的BAR1-MFα1融合片段。用HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒pSW81以分离1.02千碱基的TPI1启动子-BAR1片段，然后以三段连接的方式，将其和BAR1-MFα1融合片段一道与用HindⅢ+BamHⅠ切割的YEp13相连接。所获质粒命名为pSW95。
仅仅含有一个α因子拷贝的TPI1启动子-BAR1-MFα1融合构建体来源于BAR1-MFα1融合片段（编码四个α因子的拷贝），它含有TPI1启动子和MFα1的前原序列（参见图14、15和16），用EcoRⅠ和SalⅠ降解质粒pZV16。将分离的651碱基对的BAR1片段和活化的HindⅢ-EcoRⅠBAR1的特异连接物（通过寡聚核苷酸ZC566：
5′AGC    TTT    AACAAACGATGGCACTGGTCACTTAG3′和ZC567：5′AATTCTAAGTGACCAGTGCCATCGTTTGTTAA3′退火产生）连接到用HindⅢ和SalⅠ切割的pUC13中。用HindⅢ和SalⅠ降解所获质粒pZV96，以分离684碱基对BAR1片段。使提供TPI1启动子的质粒pM220与MFα1前原序列相融合。用BglⅡ和HindⅢ降解质粒pM220以分离1.2千碱基的TPI1启动子-MFα1前原片段。通过用SalⅠ和BamHⅠ切割pZV9得到BAR1编码区的3′端部分序列，以分离出1.3千碱基的BAR1片段。以四段连接的方式，将684碱基对的HindⅢ-SalⅠBAR1片段、1.2千碱基的BglⅡ-HindⅢTPI1启动子-MFα1前原片段和1.3千碱基的SaⅠ-BamHⅠBAR1片段与用BamHⅠ线型化的YEp13相连接。具有所需定向的启动子和MFα1-BAR1融合序列的构建体命名为pZV100（图14）。
为了操作的方便，将从pZV100中平头切下的MFα1前原序列-BAR1融合片段，以1.6千碱基的PstⅠ-BamHⅠ片段的形式亚克隆到pUC13中，用PstⅠ和EcoRⅠ裂解所获质粒pZV101，以分离270碱基对的MFα1前原-BAR1片段。用EcoRⅠ和BamHⅠ降解质粒pZV69以分离0.55千碱基的BAR1-MFα1融合片段（编码四个α因子拷贝）。将此片段和270碱基对的MFα1前原-BAR1片段以三段连接的方式，连接到用PstⅠ和BamHⅠ切割的pUC13中。所获质粒命名为pZV102（图15）。
然后，构建包括TPI1启动子、一部份BAR1和单个α因子拷贝编码序列的表达单位（图16）。用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒pZV102以分离0.82千碱基的MFα1前原-BAR1片段。将来自pM220的含有TPI1启动子和平切的MFα1前原序列的1千碱基的HindⅢ-PstⅠ片段，以三段连接的方式，和从pZV102中分离的0.82千碱基的MFα1前原-BAR1片段和用HindⅢ及BamHⅠ切割的YEp13相连接。所获质粒命名为pZV105。用HindⅢ裂解质粒pZV105以分离1.2千碱基的TPI1启动子-MFα1前原片段。用HindⅢ降解质粒pZV102以分离含有末端α因子拷贝的载体片段。将此2.8千碱基的载体一MFα1片段与1.2千碱基的TPI1启动子-MFα1前原片段相连接。具有正确定向和MFα1单个拷贝编码序列的质粒命名为pSW61。通过HindⅢ的部份降解使质粒pSW61线型化。用HindⅢ降解质粒pZV102以分离0.3千碱基的BAR1-MFα1片段。将此片段连接到线型pSW61中。在距离MFα1起始密码3′端264碱基对的HindⅢ位点处具有正确定向插段的质粒命名为pSW70。用EcoRⅠ和BamHⅠ裂解质粒pSW70以分离361碱基对的BAR1-MFα1片段，用HindⅢ和EcoRⅠ降解质粒pSW81（图13）以分离1.02千碱基的TPI1启动子-BAR1片段。将此片段以三段连接的方式，与BAR1-MFα1片段和用HindⅢ+BamHⅠ线型化的YEp13相连接。得到的质粒pSW96含有TPI1启动子和BAR1    5′端编码序列的356碱基对，它们与一个α因子编码序列的拷贝相融合。
利用pZV75作为BAR1片段的来源，构建了第二个BAR1-MFα1序列，它含有与一个MFα1编码序列的拷贝相融合的BAR1的767碱基对（图17）。用EcoRⅠ和BamHⅠ降解质粒pZV75以分离954碱基对的BAR1-MFα1片段。质粒pZV101含有与BAR1融合的MFα1前原序列，用PstⅠ和EcoRⅠ切割此质粒以分离0.27千碱基的MFα1前原-BAR1片段。将此片段以三段连接的方式，与954碱基对的BAR1-MFα1片段和用PstⅠ+BamHⅠ线型化的pUC13相连接。用HindⅢ裂解所获质粒pZV104以分离0.70千碱基的BAR1-MFα1片段。将此片段与通过HindⅢ的部份降解而线型化的pSW61相连接。在距离MFα1起始密码3′端264碱基对的HindⅢ位点处具有正确定向插段的质粒命名为pSW74。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒pSW74以分离738碱基对的BAR1-MFα1片段。用HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒pSW81以分离出1.02千碱基的TPI1启动子-BAR1片段。将此片段以三段连接方式与738碱基对的BAR1-MFα1片段和用HindⅢ+BamHⅠ切割的YEp13相连。所获质粒pSW97含有TPI1启动子和与α因子编码序列的单个拷贝相融合的BAR1    5′端的767碱基对。
用质粒pSW73、pSW94和pSW95转化啤酒酵母的a/α双倍体菌株XP733（MATaleu2-3leu2-112bar1-1    gal2/MATα    leu2-3leu2-112bar1-1gal12）。质粒pSW73包含有TPI1启动子、MFα1信号肽和前原序列以及YEp13中α因子的四个拷贝的编码区。将转化体点在软琼脂中的啤酒酵母RC629菌株细胞的菌苔上，在30℃下保温过夜，该软琼脂铺在选择培养基平板上。pSW73和对照的晕轮大小的比较表明，pSW94输出的α因子大约相当于pSW73输出的15%。
以同样的方式，检测含有与MFα1编码序列的一个拷贝相融合的BAR1的构建体输出的α因子的情况。利用含有TPI1启动子、MFα1信号肽、YEp13中α因子单拷贝的前原区和编码区的质粒pSW67，作为质粒pSW96和pSW97的对照。晕轮大小的比较表明，pSW96分泌的α因子大约相当于pSW67分泌的30-40%，pSW97分泌的α因子大约相当于pSW67的10-15%。
实例5
BAR1信号肽切割位点的突变
如上所述，已发现改变Barrier前体的信号肽切割位点，可期望通过KEX2途径促进含有Barrier的融合蛋白的后加工和输出。潜在的切割位点在氨基酸23和24之间和氨基酸24和25之间。因此，使BAR1原初转译产物的DNA编码序列产生突变，使它在25位置处编码脯氨酸残基。质粒pSW98和pSW99是以YEp13为基础的质粒，它们含有啤酒酵母TPI1启动子、一个BAR1基因的355碱基对或767碱基对片段、其中包括有突变过的信号肽切割位点、以及一个α因子编码序列的拷贝。
信号肽突变是利用噬菌体M13模板和合成的诱变寡聚核苷酸（5′ATTACTGCTCCTACAAAC GAT3′序列），通常常规的离体诱变方法而完成的（Zoller等人，《高级分子克隆技术手册》，Cold Springer Harbor Laboratory，1983）。噬菌体模板pSW54的构建，是通过将pSW22的0.54千碱基的SphⅠ-EcoRⅠ片段和SphⅠ-EcoRⅠ降解的M13mp19相连接而完成的。离体诱变之后，通过用32P。标记的诱变寡聚核苷酸与噬菌斑杂交，筛选出潜在的被诱变的噬菌斑，然后进行序列测定以确定突变的发生。用SphⅠ和EcoRⅠ降解已确定被诱变的噬菌体以mZC634-7的复制型，分离0.54千碱基的片段并与SphⅠ+EcoRⅠ切割的pUC18相连接。用HindⅢ和XbaⅠ降解所获得的质粒pSW66（图18），以切下ADHⅠ启动子，将包含载体和BAR1序列的片段与pZV134的0.9千碱基的HindⅢ-XbaⅠTPI1启动子片段相连接。此质粒命名为pSW82，它含有TPI1启动子和包括信号肽切割突变在内的BAR1    5′端的119碱基对。
参见图18，用HindⅢ和EcoRⅠ及BglⅡ和EcoRⅠ降解质粒pSW82，分离产生的1.02千碱基的片段。将pSW82的HindⅢ-EcoRⅠ片段与pSW74的EcoRⅠ-BamHⅠ片段和用HindⅢ+BamHⅠ降解的YEp13相连接，从而形成pSW99。将pSW82的BglⅡ-EcoRⅠ片段与pSW70的0.30千碱基的EcoRⅠ-BamHⅠ片段和BamHⅠ降解的YEp13相连接，从而形成pSW98。质粒pSW98包括TPI1启动子，诱变的BAR1序列5′端的355碱基对和单个α因子编码序列的拷贝，质粒pSW99含有相同的表达单位，只是它所具有的诱变的BAR1序列的片段为767碱基对。
晕轮检测的分析表明，如果使用编码一个α因子的拷贝的质粒，则切割位点的突变能加强α因子的输出。含有pSW98的转化体输出的α因子大约比含有pSW96的野生型对照的转化体多50%。

Claims (27)

1、一种DNA构建体，其特征在于它包括一部份啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BRA1基因，其中包括该基因信号肽的编码序列，至少一个对于所选择的宿主来说的外来结构基因及一个启动子、该启动子在用所述DNA转化的所述宿主中控制一种融合多肽或由所述部份BAR1基因及所述结构基因编码的蛋白的表达。
2、根据权利要求1的构建体，其中所述融合多肽或蛋白包括一个KEX  2后加工位点。
3、根据权利要求2的构建体，其中所述BAR1基因的所述信号肽编码序列已被改变，以降低融合多肽或蛋白的信号肽酶的裂解效率。
4、根据权利要求1的构建体，其中所述启动子是一种酵母糖酵解途径基因的启动子。
5、根据权利要求1的构建体，其中所述启动子是从啤酒酵母BAR1启动子、啤酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ启动子和梨酒酵母（Schizosaccharomycls  pombe）乙醇脱氢酵启动子中选择出来的。
6、根据权利要求5的构建体，其中所述构建体是pZV30、pZV31、pzV49和pZV50中选择出来的。
7、根据权利要求1的构建体，它进一步包括啤酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的转录终止区。
8、根据权利要求1的构建体，其中所述部份所述BAR1基因进一步包括邻接转录起始位点的5′端非转录区的680碱基对的序列。
9、一种含有根据权利要求1-8中任一项的构建体的转化细胞。
10、根据权利要求9的转化细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
11、根据权利要求10的细胞，其中所述真菌是啤酒酵母。
12、根据权利要求10的细胞，其中所述真菌是梨酒酵母。
13、根据权利要求10的细胞，其中所述真菌是曲霉菌（Aspergillus）或脉胞菌（Neurospora）。
14、一种在转化细胞中生产异种蛋血和将所述蛋白引向细胞分泌途径的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
（a）用DNA构建体转化一种宿主细胞、该DNA包括一部份啤酒酵母BAR1基因，其中至少包括信号肽编码序列、编码所述异种蛋白的结构基因及启动子、该启动子在所述细胞中控制包括所述信号肽和所述异种蛋白的融合蛋白的表达。
（b）在适于为生产所述融合蛋白进行选择的生长条件下，培养步骤（a）中所述的细胞。
15、根据权利要求14的方法，其中所述细胞是真菌细胞。
16、根据权利要求15的方法，其中所述真菌是啤酒酵母。
17、根据权利要求15的方法，其中所述真菌是梨酒酵母。
18、根据权利要求15的方法，其中所述真菌是曲霉菌或脉胞菌。
19、根据权利要求14的方法，其中所述融合蛋白包括一个KEX2后加工位点。
20、根据权利要求19的方法，其中所述BAR1基因的所述信号肽编码序列已被改变、以降低多肽或蛋白的信号肽酶的裂解效率。
21、根据权利要求14的方法，其中所述启动子是从啤酒酵母BAR1启动子、啤酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ启动子和梨酒酵母乙醇脱氢酶启动子中选择出来的。
22、根据权利要求14的方法，其中所述启动子是酵母糖酵解途径基因的启动子。
23、根据权利要求22的方法。其中所述DNA构建体是从pZV30、pZV31、pZV49和pZV50中选择出来的。
24、根据权利要求14的方法，其中所述异种蛋白从所述细胞中被输出。
25、根据权利要求14的方法，其中所述蛋白包括胰岛素原或胰岛素。
26、一种根据权利要求14的方法所产生出来的蛋白质。
27、一种根据权利要求14的方法生产出来的蛋白质，它包括人胰岛素原或胰岛素的氨基酸序列。
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
JP2730923B2 (ja) * 1987-10-02 1998-03-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド Ｂａｒ１分泌シグナル
US5206699A (en) * 1988-05-06 1993-04-27 Gersan Establishment Sensing a narrow frequency band of radiation and gemstones
HU213571B (en) * 1988-07-23 1997-08-28 Delta Biotechnology Ltd Process for producing peptides and dna sequences
WO1991013971A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Neurospora expression system
DK82893D0 (da) * 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
EP1683860B1 (en) 1995-03-17 2013-10-23 Novozymes A/S Novel endoglucanases
EP1975177B1 (en) 1996-03-01 2011-04-13 Novo Nordisk A/S An appetite-suppressing peptide, its compositions and use
AU782580B2 (en) 2000-01-10 2005-08-11 Maxygen, Inc. G-CSF conjugates
ATE428445T1 (de) 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
EP1373493B1 (en) 2001-03-22 2013-07-31 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii derivative
US6534059B2 (en) 2001-06-05 2003-03-18 Advanced Biotherapy, Inc. Compositions and methods for treating hyperimmune response in the eye
ATE532858T1 (de) 2001-09-27 2011-11-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Menschliche gerinnungsfaktor-vii-polypeptide
ES2381110T3 (es) 2003-09-09 2012-05-23 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación
BRPI0609079A2 (pt) 2005-04-18 2010-11-16 Novo Nordisk As peptìdeo, composição farmacêutica, método para o tratamento de cáncer, uso de um peptìdeo construto de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, e, anticorpo
WO2007020256A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
JP5690047B2 (ja) 2005-09-14 2015-03-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド
EP2407561A3 (en) 2006-03-06 2012-05-30 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human fibrinogen
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
EP2069502B1 (en) 2006-09-27 2014-02-26 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides
AU2008247815B2 (en) 2007-05-02 2012-09-06 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
JP5547083B2 (ja) 2007-11-20 2014-07-09 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
US8349325B2 (en) 2008-12-23 2013-01-08 Abbott Laboratories Soluble FMS-like tyrosine kinase-1 (sFLT-1) antibody and related composition, kit, methods of using, and materials and method for making
US20120107267A1 (en) 2009-03-11 2012-05-03 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor
KR102184713B1 (ko) 2009-07-17 2020-12-01 오메로스 코포레이션 보체 활성화의 억제제로서의 masp 이소형
US9096843B2 (en) 2009-12-01 2015-08-04 Novo Nordisk A/S Peptidyl α-hydroxyglycine α-amidating lyases
CA2784800A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
AU2010341516B2 (en) 2009-12-21 2014-01-16 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
AU2011222883B2 (en) 2010-03-05 2016-05-26 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
US20110229921A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Abbott Laboratories METHODS OF ASSAYING URINARY NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED LIPOCALIN (uNGAL) IN THE PROGNOSIS OF CADAVERIC KIDNEY TRANSPLANT FUNCTION IN A PATIENT, INCLUDING A PATIENT DIAGNOSED WITH DELAYED GRAFT FUNCTION (DGF), A METHOD OF ASSAYING uNGAL IN THE ASSESSMENT OF RISK OF DGF IN A PATIENT DIAGNOSED WITH EARLY GRAFT FUNCTION (EGF), AND RELATED KITS
WO2011163558A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Abbott Laboratories Materials and methods for assay of anti-hepatitis c virus (hcv) antibodies
SG10201506443TA (en) 2010-08-17 2015-10-29 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
US20120115244A1 (en) 2010-11-09 2012-05-10 Abbott Laboratories Materials and methods for immunoassay of pterins
CN105821078A (zh) 2010-12-09 2016-08-03 巴斯德研究所 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法
AU2012350229B2 (en) 2011-12-09 2018-03-22 Institut Pasteur Multiplex immuno screening assay
US8993248B2 (en) 2011-12-31 2015-03-31 Abbott Laboratories Truncated human vitamin D binding protein and mutation and fusion thereof and related materials and methods of use
JP6517018B2 (ja) 2012-02-09 2019-05-22 ヴァー２・ファーマシューティカルズ・アンパルトセルスカブＶＡＲ２ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡｐＳ コンドロイチン硫酸グリカンのターゲティング
EP2906693A1 (en) 2012-10-15 2015-08-19 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii polypeptides
JP2014128262A (ja) * 2012-11-27 2014-07-10 Kirin Brewery Co Ltd 接合能を持つ酵母細胞株のスクリーニング方法
AU2019263303A1 (en) 2018-05-01 2020-12-24 Ambrx, Inc. A method for optimizing antibody expression
CN112789504A (zh) 2018-07-13 2021-05-11 瓦克特诊断有限责任公司 使用重组疟疾蛋白var2csa分离胎儿来源的循环细胞
CA3111576A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
EP3867265A1 (en) 2018-10-19 2021-08-25 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CA3128081A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-tlr agonist conjugates
KR20220151202A (ko) 2020-03-11 2022-11-14 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 사용 방법
CA3175523A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Antti Virtanen Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a .beta.-coronavirus antibody in a sample
EP4193149A1 (en) 2020-08-04 2023-06-14 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
US20230302150A1 (en) 2020-08-20 2023-09-28 Ambrx, Inc. Antibody-tlr agonist conjugates, methods and uses thereof
EP4271998A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
AU2022249223A1 (en) 2021-04-03 2023-10-12 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CN115806889B (zh) * 2022-09-28 2024-06-11 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4613572A (en) * 1983-08-15 1986-09-23 Kansas State University Research Foundation Yeast BAR1 gene plasmid
DE3537176C2 (de) * 1984-10-18 1994-06-09 Zymogenetics Inc Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung
JPS61247384A (ja) * 1984-10-18 1986-11-04 チモ−ジエネテイツクス　インコ−ポレ−テツド 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU676132B2 (en) 1997-03-06
JP2523562B2 (ja) 1996-08-14
HU206897B (en) 1993-01-28
WO1987002670A1 (en) 1987-05-07
CZ284251B6 (cs) 1998-10-14
FI872801A0 (fi) 1987-06-24
IE862804L (en) 1987-04-25
IE63822B1 (en) 1995-06-14
SK776486A3 (en) 1998-06-03
CA1316133C (en) 1993-04-13
UA41863C2 (uk) 2001-10-15
JPS63501614A (ja) 1988-06-23
HUT43624A (en) 1987-11-30
DK320287A (da) 1987-06-23
AU6543286A (en) 1987-05-19
CZ776486A3 (en) 1996-09-11
EP0243465A1 (en) 1987-11-04
CN1027179C (zh) 1994-12-28
SK279041B6 (sk) 1998-06-03
AU7400391A (en) 1991-07-18
FI872801A (fi) 1987-06-24
DK320287D0 (da) 1987-06-23

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