SK279041B6 - Konštrukt dna, transformovaná bunka a spôsob výrob - Google Patents

Konštrukt dna, transformovaná bunka a spôsob výrob Download PDF

Info

Publication number
SK279041B6
SK279041B6 SK7764-86A SK776486A SK279041B6 SK 279041 B6 SK279041 B6 SK 279041B6 SK 776486 A SK776486 A SK 776486A SK 279041 B6 SK279041 B6 SK 279041B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
plasmid
bar1
promoter
gene
fragment
Prior art date
Application number
SK7764-86A
Other languages
English (en)
Other versions
SK776486A3 (en
Inventor
Vivian L. Mackay
Original Assignee
Zymogenetics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics filed Critical Zymogenetics
Publication of SK776486A3 publication Critical patent/SK776486A3/sk
Publication of SK279041B6 publication Critical patent/SK279041B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Tento vynález sa týka konštruktu DNA. Transformácia hostiteľských organizmov takými konštruktami vedie k expresii primárneho translačného produktu, ktorý obsahuje štruktúrny proteín, kódovaný cudzorodým génom. Fúzovaný so signálnym peptidom BAR1, takže proteín je opracovávaný v sekrečnej ceste hostiteľskej bunky a sekrétovaný do kultivačného prostredia alebo do periplazmového priestoru.
Doterajší stav techniky
Ako hostitelia na tvorbu cudzorodých polypeptidov, t. j. polypeptidov, ktoré nie sú prirodzene produkované hostiteľom, cestou rekombinantnej DNA, sa používajú rôzne prokaryotické a eukaryotické mikroorganizmy. Mimoriadne zaujímavé sú rôzne druhy eukaryotických húb, vrátane Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus a Neuurospora. Mimoriadne veľa práce bolo vykonanej na kvasinkách S. cerevisiae. Kvasinkové bunky po transformácii vhodnou DNA konštrukciou, ako je napríklad plazmid, vykonávajú expresiu cudzorodých génov nachádzajúcich sa v plazmide. Hlavným obmedzením tejto technológie je však to, že v mnohých prípadoch nie sú proteínové produkty vylučované hostiteľskými bunkami do prostredia. Je teda nutné bunky rozbiť a žiadaný proteín vyčistiť od rôznych znečisťujúcich bunkových zložiek tak, aby pri tom nedošlo k ich denaturácii alebo dezaktivácii. Je teda žiaduce, aby bolo možné smerovať transformované bunky k sekrécii takého cudzorodého produktu, čo by zjednodušilo čistenie tohto produktu. Ďalej môže byť žiaduce, aby niektoré proteíny vstupovali do sekrečnej cesty hostiteľskej bunky, čím by sa uľahčilo príslušné opracovávanie, t.j. tvorbadisulfidovej väzby.
Je známe, že S. cerevisiae vylučujú niektoré zo svojich prirodzene produkovaných proteínov, aj keď znalosti tohto procesu sú dosť obmedzené v porovnaní s tým, čo je známe o sekrécii proteínov z baktérií a z buniek cicavcov. Zdá sa, že väčšina zo sekrétovaných kvasinkových proteínov sú enzýmy, ktoré zostávajú v periplazmovom priestore, aj keď enzýmy invertáza a kyselinová fosfatáza môžu byť zahrnuté aj do bunkovej steny. Medzi bunkové proteíny, o ktorých je známe, že sú kvasinkami S. cerevisiae vylučované do kultivačného prostredia, patria pohlavné feromóny (α-faktor a a-faktor), smrtiaci toxín a proteíny ovplyvňujúce Barrierovu aktivitu (ďalej tu budú tieto proteíny označované ako „Barrier,,). Vylučovanie bunkovou stenou do prostredia je označované tiež ako „export,,. Bunky 5. cerevisiae pohlavného typu a produkujú a-faktor, ktorý je vylučovaný do kultivačného prostredia, zatiaľ čo bunky pohlavného typu a produkujú dva sekrétované polypeptidy, a-faktor Barrier proteín. Gén pre α-faktor bol klonovaný, sekvenovaný a analyzovaný (pozri: Kurjan a Herskowitz: Celí 3, 933, (1982)). Signálny peptid (krátka peptidová sekvencia, o ktorej sa predpokladá, že vedie bunky k sekrécii fuzneho proteínu), leader sekvencia (obsahujúca prekurzorový polypeptid, ktorý je odštiepený od zrelého α-faktora) a netranslačné génové sekvencie (vrátane promótorových a regulačných oblastí) z génu α-faktora sa môžu použiť na riadenie sekrécie cudzorodých proteínov produkovaných kvasinkou (Brake a spol.: Natl. Acad. Sci. USA 81, 4682 (1984)). Zdá sa, že opracovanie α-faktorového prekurzora na zrelú bielkovinu vyžaduje aspoň dva stupne, o ktoiých sa predpokladá, že sú pod kontrolou génov STE-13 a KEX2.
Na rozdiel od α-faktora sa zdá, že Barrier proteín je glykozylovaný, vzhľadom na jeho schopnosť viazať konkavalín A. Barrier je produkovaný bunkami typu a a zdá sa, že expresia je pod kontrolou génu MAT 2. S výnimkou možného odštiepenia signálneho peptidu nebolo až doteraz demonštrované žiadne opracovanie prekurzora Barriera a nepredpokladá sa teda, že by gény STE-13 a KEX2 hrali úlohu pri expresii Barriera.
Vďaka uvedeným rozdielom medzi kontrolou expresie a opracovaním d-faktora a Barriera nie je možné vopred povedať, ktorý z týchto kvasinkových génov je vhodnejší na riadenie sekrécie spomínaného cudzieho proteínu. Keďže sa zdá, že obidva proteíny sú opracovávané v rôznych sekrečných cestách, bolo by žiaduce využiť vlastnosti Barrierovho sekrečného systému.
Podstata vynálezu
Predmetom tohto vynálezu je získanie DNA konštruktov obsahujúcich segment génu BAR1, ktorý kóduje aspoň signálny peptid, a štruktúrny gén cudzorodého proteínu, ktorý' je opracovávaný na sekrečnej ceste hostiteľskej bunky v mikrobiálnom hostiteľovi.
Ďalším predmetom vynálezu je transformovaná bunka, ktorá obsahuje konštrukt DNA opísaný.
Ďalším predmetom vynálezu je spôsob výroby cudzorodého proteínu v transformovanej bunke transformáciou hostiteľskej bunky konštruktom DNA kódujúcim uvedený cudzorodý proteín a marker selekcie, a potom kultiváciou transformovanej bunky v kultivačných podmienkach vhodných na výrobu cudzorodého proteínu.
Ďalším predmetom vynálezu je spôsob expresie cudzorodých génov v mikrobiálnom hostiteľovi, pričom táto expresia vedie k sekrécii cudzorodého proteínu alebo k jeho časti (kódovanej takýmto génom), ktorý je opracovávaný na sekrečnej ceste z hostiteľskej bunky.
Iným predmetom tohto vynálezu je spôsob prípravy proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu ľudského proinzulínu alebo inzulínu.
Tento vynález sa týka koštruktov DNA a spôsobu ich použitia. Tieto konštrukty obsahujú aspoň signálny peptid kódujúci sekvenciu génu BAR1 Saccharomyces cerevisiae, aspoň jeden štruktúrny gén cudzorodý pre hostiteľský organizmus a promótor, ktorý v hostiteľskom organizme kontroluje expresiu fuzneho proteínu, ktorý obsahuje BAR1 signálny peptid a cudzorodý proteín.
Pojem „konštrukt DNA“ alebo „DNA konštrukt“ tak, ako je tu používaný, znamená akúkoľvek molekulu DNA, vrátane plazmidu, ktorá je ľudským zásahom modifikovaná tak, že sekvencia nukleotidov v tejto molekule nie je identická so sekvenciou, ktorá je produkovaná prirodzeným spôsobom. Pojem „konštrukt DNA“ zahŕňa tiež klony DNA molekúl, ktoré sú takto modifikované. Pojem „expresný vektor,, a „expresný plazmid,, sú definované ako konštrukt DNA, ktorý obsahuje iniciačné miesto transkripcie a aspoň jeden produkovaný expresiou v hostiteľskom organizme. Expresný vektor bude zvyčajne tiež obsahovať marker selekcie, akým je napríklad gén antibiotickej rezistencie alebo nutričný marker.
Pojem „konštrukt DNA„ zahŕňa tiež časti expresného vektora integrovaného do hostiteľského chromozómu.
SK 279041 Β6
Pojem „plazmid“ má svoj všeobecne prijatý význam, t. j. znamená autonómne sa replikujúci konštrukt DNA, zvyčajne uzavretú slučku.
Pojem „signálny peptid,, sa týka časti primárneho translačného produktu, ktorý zabezpečuje sekréciu proteínu. Signálny peptid sa počas tohto procesu zvyčajne odštiepi od zvyšku nascentného polypeptidu signálnou peptidázou. Signálny peptid je charakterizovaný prítomnosťou jednotlivých hydrofóbnych aminokyselín, vyskytuje sa na amínovom konci primárneho translačného produktu a zvyčajne má dĺžku asi 17 až 25 aminokyselín. Miesto štiepenia signálnou peptidázou bolo charakterizované von Heinjom (Eur. J. Biochem. 133. 17 (1983)). Pojem „signálny peptid“, tak ako je tu používaný, môže znamenať tiež funkčné časti prirodzene sa vyskytujúceho signálneho peptidu.
Tento vynález opisuje spôsob prípravy transformovaných buniek, ktoré produkujú cudzorodé proteíny sekrečnou cestou.
Spôsob výroby cudzorodého proteínu v hostiteľskom organizme spočíva podľa vynálezu v tom, že sa hostiteľská bunka predstavovaná bunkou huby transformuje konštruktom DNA, ktorý zahŕňa časť Saccharomyces cerevisiae génu BAR1, obsahujúceho aspoň sekvenciu kódujúcu uvedený cudzorodý proteín a promótor, ktorý v transformovanej bunke kontroluje expresiu fúzneho proteínu obsahujúceho signálny peptid a cudzorodý proteín, pričom difúzny proteín sa produkuje v transformovanej bunke a je z nej sekretovaný.
Takto produkované bielkoviny sekretujú do periplazmatického priestoru alebo do kultivačného média. Kvasinkový gén BAR1 kóduje Barrierovu aktivitu, o ktorej sa predpokladá, že je daná glykozylovaným proteínom sekretovaným bunkami S. cerevisiae pohlavného typu a. Sekrétovaný Barrier - proteín umožňuje, aby bunky pohlavného typu a prekonali zastavenie bunkového cyklu v G1 fáze, ktoré je stimulované α-faktorom. Predpokladá sa, že Barrier-proteín môže byť proteázou (pozri Manney: J. Bacteriol. 155, 291 (1983)). Transkripcia génu BAR1 je stimulovaná α-faktorom. Barrier ako analogická aktivita nie je detekovaná v bunkách typu a alebo a/cc bunkách a gén BAR1 nie je v bunkách tohto typu transkribovaný.
Na obr. 1 je uvedená sekvencia 2750 párov nukleotidov obklopujúca gén BAR1 spolu s odvodenou aminokyselinovou sekvenciou primárneho translačného produktu. ATG iniciačné miesto translácie BAR1 je v polohe na obr. 1, ktorý nebol subklonovaný z fragmentu získaného z kvasinkovej genómovej knižnice (Nasmyth a TatchelkCell 19, 743 (1980)). Otvorený čítací rám začína ATG kodónom na +1 a vedie až 1761 párov nukleotidov v smere 3'. Zdá sa, že sekvencia prvých 24 aminokyselín primárneho translačného produktu BAR1 je podobná so sekvenciami známych kvasinkových a cicavčích signálnych peptidov. Tak môže byť alanín v polohe 24 použitý ako miesto štiepania pre kvasinkovú invertázu a kyslú fosfázu.
K štiepeniu môže dochádzať tiež v mieste za aminokyselinou 23. V primárnom translačnom produkte existuje aspoň deväť potenciálnych asparagín viažucich glykozylačných miest, aj keď rozsah glykozylácie zrelého sekrétovaného Barrier - proteínu nie je ešte známy. Promótor a regulačné oblasti génu BAR1 sú umiestnené vnútri regiónu s približne 680 nukleotidovými pármi na 5', konci translačného iniciačného kodónu.
Konštrukt DNA podľa tohto vynálezu výhodne kóduje miesto štiepenia na spojení Barrier a cudzorodého proteínu. Takýmto výhodným miestom je miesto štiepenia KEX2, sekvencia aminokyselín, ktorá je rozoznávaná a štiepená produktom génu KEX2 z S. cerevisiae (Julius a spol.: Celí 37, 1075 (1984)). Miesto KEX2 je charakterizované párom bázických aminokyselín, ako je napríklad lyzín a arginín. Výhodnou sekvenciou miesta KEX2 je Lys-Arg alebo Arg-Arg. BAR1 primárny a translačný produkt obsahuje dva také páry umiestnené v štruktúrnej oblasti : Arg-Arg v polohe 177-178 a Lys-Lys v polohe 405-406. Ako bolo uvedené, gén KEX2 sa nepodieľa na posttranslačnom opracovávaní Barrierovej prekurzorovej bielkoviny. Z toho je možné odvodiť, že potenciálne procesné (opracovávacie) miesta sú blokované konformáciou proteínu alebo jeho glykozyláciou a ďalej, že Barrier-proteín sa normálne môže opracovávať inou cestou, než je tá, ktorá sa využíva KEX2 opracovávanými proteínmi, ako je faktor KEX2 procesného miesta do fúzneho proteínu obsahujúceho časť primárneho translačného produktu génu BAR1, signálny peptid, spolu s príslušnou bielkovinou, je fúzny proteín štiepený v mieste KEX2, čo vedie k sekrécii príslušného proteínu. Bolo tiež zistené, že zníženie účinnosti štiepenia signálnou peptidázou časti Barrier-proteínu fúzneho proteínu obsahujúceho miesto štiepenia KEX2, zvyšuje hladinu exportovaného príslušného proteínu. Miesto štiepenia KEX2 možno vytvoriť k sekvencii BAR1, v príslušnom štruktúrnom géne, alebo môže byť zavedené do fúzie pridaním linkera, miestne špecifickou mutagenézou atď.
Podľa tohto vynálezu môže byť teda časť génu BAR1 obsahujúca ATG iniciačný kodón a kódujúcu sekvenciu signálneho peptidu napojená na cudzorodý príslušný gén a takto transformovaná do eukaryotickej hostiteľskej bunky. Výsledný sfúzovaný gén zahŕňa miesto opracovania proteínu (procesie), výhodne aj miesto štiepenia KEX2, ktoré sa nachádza v mieste, kde sa spája sekvencia BAR1 so sekvenciou obsahujúcou cudzorodé gény. Taká konštrukcia môže obsahovať aj regulačné oblasti a promótor z 5'nekódujúcej oblasti génu BAR1 alebo môže obsahovať regulačné oblasti a/alebo promótory iných génov. Okrem promótora z génu BAR1 môžu byť použité aj iné promótory, medzi ktoré patria promótory z génov alkohol-dehydrogenázy I zo S. cerevisiae alebo alkohol-dehydrogenázy II, gény glykolitickej dráhy zo S. cerevisiae, ako je napríklad TPI1 promótor a zodpovedajúce gény z iných druhov, vrátane kvasinky Schizosaccharomyces pombe, ktorá sa rozmnožuje delením (Russel a Halí.: J. Biol. Chem. 258. 143 (1983) a Russel: náture 301, 167 (1983)). Gén S. cerevisiae alkohol-dehydrogenázy I bol opísaný Ammerom : Methods in Enzymology 101. 192 (1983). Gén Alkoholdehydrogenázy II bol opísaný Russelom a spol.: J. Biol: Chem. 258. 2674 (1983). Glykolytické gény zo 5. cerevisiae boli opísané Kawasakim: Ph. D. Thesis, University of Washington, 1979 a Hitzemanom a spol.: J. Biol. Chem. Res. Com. 108. 1107 (1982) a Alberom a Kawasakim: J. Mol. Appl. Genet. 1,419 (1982).
Vo výhodnom usporiadaní je vymenená kódujúca sekvencia signálneho peptidu génu BAR1. Tým sa zníži účinnosť štiepenia signálnou peptidázou Barrierovej časti fúzneho proteínu obsahujúceho miesto štiepenia KEX2 signálnou peptidázou. Toto možno dosiahnuť miestne špecifickou mutagenézou potenciálnych miest štiepenia, výhodne miest spájajúcich aminokyseliny 23 a 24 (proteínové sekvencie Barriera) alebo spájajúce aminokyseliny 24 a 25.
Spôsoby, ktoré sa používajú na tvorbu konštrukcií DNA podľa tohto vynálezu, zahŕňajú konvenčné techniky. Štruktúrny gén BAR1 alebo jeho časť a štruktúrny gén, ktorý má byť exprimovaný, sú výhodne pod kontrolou signálneho promótora. Spôsoby ligácie DNA fragmentov sú rozsiahlo opísané a odborníkom v tejto oblasti sú dobre zná me. DNA kódujúca sekvencia proteínu, ktorý môže byť exprimovaný, môže byť v podstate sekvenciou ktoréhokoľvek z nasledujúcich proteínov, môžu tu byť najmä proteíny obchodne dôležité, ako sú interferóny, inzulín, proinzulín, a-1-antitrypsín, rastové faktory a tkaninový plazminogénový aktivátor.
Po príprave konštruktu DNA obsahujúceho gén BAR1 alebo jeho časť a štruktúrny gén, ktorý má byť exprimovaný, sa konštrukt transformuje do hostiteľského organizmu za vhodných trasformačných podmienok. Techniky na transformovanie prokaryotov a eukaryotov (vrátane cicavčích buniek) sú z literatúry známe.
Hostiteľským organizmom je výhodne kmeň pučiacich kvasiniek Saccharomyces cerevisiae, môžu sa však používať aj iné druhy, vrátane deliacich sa kvasiniek Schizosaccharomaces pombe a tiež je možné použiť vláknité huby Aspergillus nidulans a Neurospora sp.
Reštrikčné endonukleázy boli získané od Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs a BoehringerMannheim Biochemicals. Reštrikčné endonukleázy boli používané podľa návodu výrobcu, zvyčajne sa na štiepenie pridávala pankreatická RNAáza (10 g/ml). T4 DNA ligáza bola získaná od Bethesda Research laboratories alebo Boehring-Mannheim Biochemicals a bola používaná podľa návodu. Hostiteľské kmene a vektory M13 a plJC boli získané od Bethesda Chemical Laboratories. Klonovanie M13 bolo vykonávané podľa spôsobu, ktorý opisuje Messing: Methods in Enzymology 101, 20 (1983). DNA polymeráza I (Klenowov fragment) bola používaná podľa Maniotisa a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982). Kultúry E. coli boli transformované spôsobom podľa Bolivara a spol.: gene 2
95, (1977). Kultúry S. cererevisiae boli transformované spôsobom podľa Beggsa : Náture 275, 104 (1978), ktorý modifikoval MacKay : Methods in Enzymology 101, 325 (1983). S. pombe sa transformuje podľa Russela : Náture 301, 167 (1983). Pohlavný feromón α-faktor bol pripravený spôsobom podľa Duntza a spol.: Eur. J. Biochem 35, 357 (1973) modifikovaným Manneya a spol.: J. Celí. Biol.
96, 1592 (1983) alebo bol získaný od Sigma Chemical Co. Oligonukleotidy boli syntetizované na syntetizátori Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizcr a vyčistené PAAG elektroforézou na denaturovaných géloch.
Test aktivity Barrier-proteínu
Test, ktorý je používaný na detekciu produkcie Barriera transformovanými kvasinkovými bunkami, je založený na schopnosti Barriera obnoviť rast citlivých buniek typu a a inhibovaný α-faktorom. Testovaný kmeň je jedným z kmeňov, ktoré sú abnormálne citlivé na α-faktor, ako je napríklad kmeň RC629 (MAT a Barl), pretože nemá žiadnu Barrierovu aktivitu. Tento kmeň sa použije na prípravu súvislej bunkovej vrstvy na agarových platniach. K tejto vrstve sa pridá také množstvo a-faktora (0,05 až 1 jednotka, ako bolo zistené Manneyom), ktoré stačí na inhibíciu rastu buniek. Transformanty, ktoré sú testované na produkciu Barriera, sa bodovo nanesú na povrch porastených platní. Sekrécia Barrier-proteínu transformovanými bunkami zmení a-faktorom vyvolanú inhibíciu rastu v bezprostrednom okolí škvrny, čím umožní, aby sa citlivé bunky regenerovali. Tieto bunky sa pozorujú ako lem rastúci okolo normálne hladkého zakončenia kolónie transformovaných buniek. Prítomnosť tohto lemu indikuje, že plazmid v transformovanom kmeni riadi expresiu a sekréciu Barriera.
Testy IRI a IRC
Testy IRI a IRC sa vykonávajú pomocou komerčne dostupných kitov získaných od Novo Industri, Bagsvaerd, Dánsko. Morčací antiprasačí inzulín a morčacie antihumánne C-peptidové protilátky sa dodávajú v rámci kitov.
Test IRI mikrolitrov vzorky v NaFAM (0,04 M fosforečnanový pufor, pH 7,5, ktorý obsahuje hovädzí sérumalbumín) 50 μΐ protilátky (zásobný roztok zriedený 1:30) 16 až 24 hodín pri teplote 4 °C μΐ l25I-inzulínu (zriedený 1:100) 2 hodiny pri teplote 4 °C μΐ 1 % Staphylococcus aureus v NaFAM 45 minút pri teplote 0 °C premyť dvakrát 1 % roztokom BSA/THEN* odstreďovať a spočítať pelety
Rôzne stupne sa môžu výhodne uskutočňovať v mikrotitrovacích doštičkách, kým sa pelety neprenesú do scintilačných fiol.
Test IRC mikrolitrov vzorka v NaFAM μΐ protilátky (zásobný roztok zriedený 1 : 50) až 24 hodín pri teplote 4 °C μΐ 1251-C peptidu (zásobný roztok zriedený 1 : 30) až 4 hodiny pri teplote 4 °C μΐ 1 % Staphyloccocus aureus v NaFAM minút pri teplote 0 °C premyť dvakrát 1 % roztokom BSA/THEN* odstreďovať a spočítať pelety * THEN je 20 mM Tris, pH 8,0, 100 ml NaCl, 1 mM EDTAa0,5%NP-40
Test α-faktorovej aktivity
Test používaný na detekciu exportu α-faktora transformovanými kvasinkami využíva schopnosť α-faktora inhibovať rast citlivých buniek typu a. Testovaný kmeň (ako napríklad S. cerevisiae kmeň RO629 (MATa barl) obsahuje v géne BAR1 mutáciu, ktorá zabraňuje produkcii Barrier-proteínu a poskytuje bunky supercitlivé na α-faktor. Na vrstve mäkkého agaru na platni štandardného kvasinkového selektívneho syntetického média (napr. média bez leucínu) sa nakultivuje vrstva testovaného kmeňa. Transformanty, ktoré sa majú testovať na export α-faktora, sa vysejú na trávnik a inkubujú sa pri 30 °C. Sekrécia α-faktora transformantomi spôsobí inhibíciu rastu vo vrstve citlivých buniek bezprostredne obklopujúcej kolóniu. Kruh inhibície rastu vrstvy testovaných buniek znamená, že kolónia exportuje aktívny α-faktor. Porovnanie veľkosti zón umožňuje odhadnúť relatívny malé množstvo α-faktora exportovaného príslušným transformantom.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje sekvenciu nukleotidov génu BAR1 a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu primárneho translačného produktu. Väzobné miesto MAT 2 je podčiarknuté. Predpokladané miesto štiepenia signálneho peptidu je označené šípkou a potenciálne glykozylačné miesta sú označené hviezdičkami.
Obrázok 2 je diagram plazmidu pZV9.
Obrázok 3 ilustruje konštrukciu plazmidu p245.
Obrázok 4 ilustruje konštrukciu plazmidov pZV30, pZV31, pZV32 a pZV33.
Obrázok 5A a 5B ilustruje konštrukciu plazmidu pZV50.
Obrázok 6 ilustruje konštrukciu plazmidu ml 15. Obrázok 7 ilustruje konštrukciu plazmidu pZV49. Obrázok 8 ilustruje konštrukciu plazmidu pZV134, ktorý obsahuje promótor TPI1.
Obrázok 9 ilustruje subklonovanie časti génu MF 1. Obrázok 10 ilustruje konštrukciu plazmidu pZV75. Obrázok 11 ilustruje konštrukciu plazmidov, ktoré obsahujú promótor TPI1 a fúziu BAR1-MF 1.
Obrázok 12 ilustruje konštrukciu plazmidu pSW22.
Obrázok 13 ilustruje konštrukciu plazmidov, ktoré obsahujú fúziu BAR1-MF 1.
Obrázok 14 ilustruje konštrukciu plazmidu pZVlOO. Obrázok 15 ilustruje konštrukciu plazmidu pZV102. Obrázok 16 ilustruje konštrukciu plazmidu pSW96. Obrázok 17 ilustruje konštrukciu plazmidu PSW97.
Obrázok 18 ilustruje konštrukciu plazmidov pSW98 a pSW99.
Označenie trojuholníkom znamená mutáciu na kodóne 25.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady sú mienené iba ako príklady a nie ako obmedzenie rozsahu vynálezu. Ak nie je uvedené inak, používajú sa štandardné metódy molekulárnej biológie.
Príklad 1
Expresia proinzulínu v S. cerevisiae pomocou génu BAR1 Rekombinantný plazmid obsahujúci úplný kvasinkový genóm sa skonštruuje (Nasmyth a Tatchell: Celí U, 753 (1980)). Pomocou binárneho vektora YEpl3 (Broach a spol.: Gene 18. 121 (1979)). Kvasinkové DNA fragmenty, produkované čiastočným rozštiepením pôsobením Sau 3A, sa vložia do YEpl3 rozštiepeného pôsobením Bam Hl. Plazmid sa použije na transformáciu S. cerevisiae kmeň XP635-10C (MAT leu 2-3 leu 2-122 bar 1 - 1 gal2: ATCC č. 20 679). Vyberú sa transformanty na leucínovú prototrofiu a nechajú sa rásť pri takej koncentrácii α-faktora, ktorá inhibuje bunky typu a barl. Výsledné kolónie sa potom testujú na schopnosť sekrétovať proteín s Barrierovou aktivitou.
Boli nájdené dve kolónie, ktoré nie sú závislé od leucínu a schopné sekrétovať Barriera. Tieto kolónie nesú plazmidy označené pBAR2 a pBAR3.
Plazmidová DNA, ktorá sa izoluje z týchto dvoch transformantov, sa použije na transformáciu E. coli kmeňa RRI (ATCC č. 31343). Transformanty boli selektované na ampicilínovú rezistenciu. Z týchto transformantov sa izolovali plazmidy pBAR2 a pBAR3. Charakterizujú sa štiepením reštrikčnou endonukleázou a elktroforézou na agarózových alebo akrylamidových géloch. Plazmid pBAR2 obsahuje inzert s približne 9200 pármi nukleotidov. £. coli RRI transformovaná plazmidom pBAR2 bola uložená v ATCC pod číslom 39410.
Subklonovanie ukázalo, že pBAR3 plazmidový inzert obsahuje časť inzertu pBAR2, ale je vo vektore orientovaný opačným smerom. Ďalšie subklonovanie a testovanie na Barrierovu sekréciu lokalizovalo funkčnú BAR1 génovú sekvenciu v oblasti s približne 2750 pármi nukleotidov. Tento fragment obsahuje kódujúcu sekvenciu, transkribované, no translácii nepodliehajúce sekvencie, promótor, re gulačné oblasti, transkripčný terminátor a obklopujúce chromozomálne sekvencie.
Plazmid pBAR2 sa rozštiepi pôsobením reštrikčných endonukleáz Hind III a Xho I. Elektroforézou na agarózovom géli sa vyčistí fragment s veľkosťou približne 3000 párov nukleotidov. Tento fragment sa vloží do plazmidu pUC13, ktorý bol rozštiepený pôsobením Hind III a Sal I. Výsledný rekombinantný plazmid, ktorý je označený pZV9 (obr. 2), sa môže použiť na transformáciu E. coli, ale nemá počiatok replikácie a selektovateľný marker, nutné na jeho použitie ako kvasinkového vektora. Plazmid pZV9 v transformovanom kmeni E. coli bol uložený v ATCC pod číslom 53 283.
Pre gén BAR1, ktorý sa použije na riadenie sekrécie proinzulínu, sa používajú fragmenty génu BAR1 obsahujúce 5', regulačnú oblasť a časť kódujúcej oblasti. Napojenie BAR1 a fragmentov proinzulínového génu sa vykoná v príslušnej čítacej oblasti a v tom bode sekvencie BAR1, v ktorom môže byť výsledný fúzny polypeptid rozštiepený, výhodne in vivo. V géne BAR1 existuje niekoľko potenciálnych miest štiepenia. Ako testovacie miesto jeho fúzie s proinzulínom bolo vybraté miesto Arg-Arg v polohe 177-178. 5'-regulačné sekvencie a kódujúce sekvencie s približne 800 pármi nukleotidov z BAR1 sa vyizolujú z plazmidu pZV9 ako Hind III-Sal I fragment s 1900 pármi nukleotidov.
Na obrázku je 3 znázornený spôsob subklonovania ľudskej proinzulínovej DNA. Ľudská preproinzulínová cDNA (pre BCA kloň), p27, sa produkuje rozštiepením pBR327 s Pst I, vznikne fragment s G-zakončením a vložením C-končiacej DNA, pripravenej opačnou transkripciou celkovej RNA z ľudskej slinivky brušnej. Plazmid pBR327 je opísaný Soberonom a spol.: Gene 9, 287 (1980). Sekvencia ľudského preproinzulínu je opísaná Bellom a spol.: Náture 232, 525 (1979); úplná translatovaná sekvencia bola odštiepená ako Nco I - Hga I fragment. Prečnievajúce konce sa doplnia DNA-polymerázou I (Klenowov fragment), súčasne sa pripoja syntetické Eco RI linkery (GGAATTCC) a Xba I linkery (CTCTAGAG). Fragment sa subklonuje do pUC13 (Vieira a Messing: Gene 19, 259 (1982) a Messing : Methods in Enzymology 101, 20 (1983)), ktorý bol rozštiepený pôsobením EcoRI a Xba I. Keďže pridávanie ECoRI linkera na konci 5'reštauruje miesto Ncol (CCATGG) na iniciačnom kodóne, plazmidy sa testujú na prítomnosť miest EcoRI, Ncol a Xba I obklopujúcich inzert s 340 pármi nukleotidov. Plazmid, ktorý má tieto vlastnosti, sa označí p47, ako znázorňuje obrázok 3. Proiznulínový (BCA) fragment so zarovnaným 5'koncom sa regeneruje opravnou syntézou priméru plazmidu p47 (Lawn a spol.: Nucl. Acids Res. 9, 6103 (1981)). Následné štiepenia pôsobením Xba I poskytujú fragment s 270 pármi nukleotidov, ktorý sa vloží do PUČI2 (Vieira a Messing: a Messing). Vektor sa pripraví štiepením pôsobením Hind III, zarovnaním koncov pôsobením DNA polymerázy I (Klenowov fragment), štiepením pôsobením Xba I a vyčistením na géli. Výsledný vektorový fragment, obsahujúci zarovnaný koniec a Xba prečnievajúce konce, sa liguje s uvedeným BCA fragmentom. Keďže maturovaný BCA začína aminokyselinou fenylalamínom (kodóm TTT), je potrebné obnoviť reštrikčné miesto pre Hind III, čo sa dosiahne na spoji týchto fragmentov a to zarovnaním ich koncov a ligáciou. Plazmidy sa testujú najprv na regeneráciu miesta Hind III a potom sekvenovaním pozdĺž spojenia použitím sekvenujúceho priemeru M13. Plazmid p254 má správnu sekvenciu.
Na obr. 4 je vidieť, že plazmid p254 sa rozštiepi pôsobením reštrikčných endonukleáz Hind III a EcoRI. Proin zulínový fragment s približne 270 pármi nukleotidov sa vyčistí na géli. Konce fragmentu sa zarovnajú DNA polymerázou 1 (Klenowov fragment) spolu s deoxynukleotidtrifosfátmi. Sal I linkerové sekvencie (GGTCGACC) sa spracúvajú pôsobením T4 polynukleotid kinázy a y-32P-ATP sa ligujú sa so zarovnanými koncami proinzulínového fragmentu. Štiepenie pôsobením Sali a Bam Hl a nasledujúca elektroforéza na 1,5 % agarózovom géli poskytne proinzulínový fragment so Sali a Bam Hl kohezivnymi (lepivými) koncami.
Proinzulínový fragment a fragment BAR1 s 1900 pármi nukleotidov sa spolu ligujú v pUC13, ktorý bol rozštiepený pôsobením Hind III a Bma HL Táto konštrukcia sa použije na transformáciu E. coli K12 (JM83).
Transformované bunky sa testujú na ampicilínovú rezistenciu a na produkciu bielych kolónií. Ďalšie testovanie štiepením reštrikčnými endonukleázami Hind III, Bam Hl a Sal 1 identifikuje plazmid (pZV27) obsahujúci Hind III -Bam Hl fragment príslušnej veľkosti s jediným Sal I miestom.
Aby sa prvá aminokyselina proinzulínu napojila na Arg-Arg génu BAR1 potencionálne opracovávacie miesto produktu, vynechá sa v napojení BARl-proinzulín intervenujúci materiál. Na riadené odstránenie týchto cudzorodých materiálov zo slučky sa použijú syntetické eligonukleotidy nasledujúcim spôsobom.
Na obr. 4 je ukázané, že plazmid PZV27 sa rozštiepi pôsobením Hind III a Bam Hl. Na géli sa vyčistí fragment napojenia Barl-proinzulín s približne 2200 pármi nukleotidov. Tento fragment sa potom vloží do replikačnej formy fágového vektora M13mpll (Messing: Meth. In Ensymology 101. 20 (1983)), ktorý sa rozštiepi pôsobením Hind III a Bam Hl. Táto rekombinantná DNA sa použije na transfekciu E. coli K12 (JM103) (Messing). Replikačné formy rekombinatného fága sa testujú na správnosť reštrikčných štruktúr dvojnásobným enzýmovým štiepením pri použití Hind III + Sal I a Sal I + Bam Hl. Konštrukcia, ktorá vykazuje žiadanú štruktúru, je známa ako mpll-ZV29. Oligonukleotidový primér (sekvencia: 3'GGATCTTCTAAACACTTG 5 ) sa označí pomocou γ-32Ρ-ΑΤΡ a T4 polynukleotid-kinázy. 7,5 pmol kinázového priméru sa potom spojí s 80 ng sekvenujúceho priemeru M13 (Bethesda Research Laboratories, Inc.) Táto zmes sa aneluje s 2 g jednovláknitého mpll-ZV29. Druhé vlákno sa predĺži pomocou T4 DNA ligázy a DNA polymerázy I (Klenowov fragment), ako je opísané pre oligonukleotidovo riadenú mutáciu (metóda dvoch primárov) Zollerom a spol. (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, (1983)). DNA, ktorá sa týmto spôsobom pripraví, sa použije na transfekciu E. coli K12 (JM103). Plaky sa testujú pomocou kinázového oligoméru ako sondy (Zoller a spol.). Takto identifikované plaky sa použijú na prípravu fágovej replikačnej formy (RF) DNA (Messing). Štiepenie RF DNA reštrikčným enzýmom identifikuje dva klony, ktoré majú príslušný Xba I reštrikčný vzor (fragmenty so 7500, 810 a 650 pármi nukleotidov), ale ktorým chýba reštrikčné miesto Sal I (ktoré bolo prítomné v deletovanej oblasti napojenia BARl-proinzulín).
RF DNA z týchto dvoch klonov sa rozštiepi pôsobením Hind III a Bam Hl. Na géli sa vyčistí fragment fúzie s 1900 pármi nukleotidov z každého klonu. Tieto fragmenty sa ligujú k vektorom pUC13 a Yepl3 (Broach a spol.: Gene 8, 121 (1979)), ktoré boli rozštiepené pôsobením Hind III a Bam Hl. Hybridné plazmidy pUC/Barl-proinzulín na následné sekvenovanie sa použijú na trasformáciu E. coli KÍ2 (JM83). Dva z týchto plazmidov sa označia pZV32 a pZV33. Rekombinanty odvodené od YEpl3 sa použijú na transformáciu E.coli RR1 (Nasmyth a Reed: Proc. Nastl. Acad. Sci. USA 77, 2119 (1980)). Dva z týchto plazmidov sa označia pZV30 a pZV31 (obrázok 4).
Plazmidy pZV32 a pZV33 sa sekvenujú spôsobom podľa Maxama a Gilberta (Meth. In Ensymology 65. 57 (1980)). Fúzia BAR1 - proinzulín sa sekvenuje od miesta Bgl II, ktoré je umiestnené približne 190 párov nukleotidov k 5'strane spojenia od miesta Sau 961, ktoré je umiestnené približne 140 párov nukleotidov k 3'strane spojenia (v proinzulínovom géne). Údaje z týchto pokusov potvrdili, že došlo k skonštruovaniu žiadanej fúzii medzi génom BAR1 a génom proinzulínu.
S. cerevisiae kmeň XP635-10C sa transformuje plazmidmi pZV30 a pZV31. Jeden liter každej kultúry sa nechá rásť v štandardnom syntetickom médiu bez leucínu. Po 34 hodinách sa k 10 ml podielov každej kultúry pridá a-faktor. Po ďalších 11 hodinách sa kultúry odstreďujú. Bunkové pelety a supematanty sa testujú na prítomnosť inzulínu alebo inzulínu podobného materiálu. Výsledky dvoch takých testov supernatantu kultúry transformovanej plazmidom pZV31 ukázali 3 pmóly materiálu IRI na 1 ml kultivačného média a 5,8 pmólov materiálu IRC na ml kultivačného média. IRI je inzulín, proinzulín alebo ich degradačné produkty v natívnej konformácii. IRC je voľný C-peptid, proinzulín alebo jeho degradačné produkty v nesprávnej konformácii.
Príklad 2
Expresia proinzulínu S. cerevisiae použitím promótora alkohol-dehydrogenázy I, génu BAR1 a terminátora triózofosfátizomerázy.
Promótor alkohol-dehydrogenázy I S. cerevisiae (ďalej tu uvádzaný ako ADHI promótor známy tiež ako ADCI promótor) sa testuje na použitie pri riadení expresie cudzorodých polypeptidov v spojení so ekvenciami BAR1. Skonštruuje sa plazmid obsahujúci tieto sekvencie. Plazmid pZV50 (obrázok 5B) obsahuje ADHI promótor S cerevisiae, uvedenú fuziu BARl-proinzulín a gén terminátorovej oblasti triózo-fosfátizomerázy S. cerevisiae (TP11) (Alber a Kawasaki: J. Molec. Appl. Genet. 1, 419 (1982)). Plazmid sa skonštruuje nasledujúcim spôsobom. Plazmid pAH5 (Amerer) uvedený na obr. 5A sa rozštiepi pôsobením Hind III a Bma Hl. Na géli sa vyčistí ADHI promotorový fragment s 1500 pármi nukleotidov. Tento fragment spolu s Hind III - EcoRI polylinkerovým fragmentom z PUC13 sa vloží do EcoRI a Bam Hl rozštiepeného plazmidu pBR327 s použitím T4 DNA ligázy. Výsledný plazmid označený pAM5 sa rozštiepi pôsobením Sphl a Xba I. Na 2 % agaróznom géli sa vyčistí fragment promótora ADHI, ktorý má približne 400 párov nukeotidov. Plazmid pZV9 sa rozštiepi pôsobením Xba 1. BAR1 fragment s približne 2000 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje úplnú kódovaciu oblasť BAR1, sa vyčistí na géli podobným spôsobom. Tieto dva fragmenty (ADHI promótor a sekvencia BAR1) sa ligujú do plazmidu YEpl3, ktorý bol rozštiepený pôsobením reštrikčných endonukleáz Xbal a Sph I. Získa sa tak plazmid pZV24. Rozštiepením plazmidu pZV24 pôsobením sSpH I a Bgl II a nasledujúcim vyčistením na géli sa získa fúzia ADHI promótor - BAR I s približne 800 pármi nukleotidov, ktorá obsahuje ATG iniciačný translačný kodón, ale neobsahuje kodóny na potenciálne opracovávanie proteínu v mieste Arg-Arg. Plazmid pZV33, ktorý obsahuje fuziu BAR1-proinzulín, sa rozštiepi pôsobením Bgl II a Xba I a fuzovaný fragment (asi 500 párov nukleotidov), ktorý obsahuje kodóny Arg-Arg, sa vyčistí.
TPI1 terminátor (uvedený na obrázku 6) sa získa z plazmidu pF61 (Alber a Kawasaki). Plazmid pF61 sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Linearizované konce plazmidu sa zarovnajú DNA polymerázou I (Klenowov fragment) a pridajú sa Bam Hl linkerové sekvencie (CGGATCCA). Fragment sa rozštiepi pôsobením Bam Hl a znova sa liguje za vzniku plazmidu pl36. TPI1 terminátor so 700 pármi nukleotidov sa vyčistí z plazmidu p 136 ako Xba I-Bam Hl fragment. Tento fragment sa vloží do plazmidu YEpl3, ktorý bol rozštiepený pôsobením Xbal a Bam Hl, rozštiepi sa pôsobením Hind III, konce sa zarovnajú pôsobením DNA polymerázy I (Klenowov fragment) a opätovnou ligáciou sa získa plazmid p270. TPI1 terminátor sa vyčistí z plazmidu p270 ako Xba I - Bam Hl fragment a vloží sa do plazmidu pUC13, ktorý sa pred tým rozštiepi pôsobením Xba I a Bam HL Získa sa tak plazmid ml 15.
TPI1 terminátor (obr. 5B) sa z plazmidu ml 15 odstráni rozštiepením pôsobením Xba I a Sst I a nasledujúcim vyčistením na géli. Do plazmidu pUC18 (Norrander a spo.: Gene 26, 101 (1983)), ktorý sa rozštiepi pôsobením Sphl a Sst I, sa vložia tri fragmenty: fúzia ADHI-BAR1, fúzia BARl-proinzulín a ΤΡΠ terminátor. Títo DNA sa použije na transformáciu E. coli K12 (JM83). Selekciou na ampicilínovú rezistenciu a testovaním na produkciu bielych kolónií sa identifikuje plazmid (pZV45), ktorý obsahuje vložené sekvencie. Plazmid pZV45 sa následne rozštiepi pôsobením Sphl a Bam Hl. Na géli sa vyčistí sekvencia ADHI-BARl-proinzulín-TPIl terminátor. Plazmid YEpl3 sa rozštiepi pôsobením Sph f a Bam Hl. Do tohto rozštiepeného fragmentu sa vloží fragment ADHI-BARl-Proinzulín-TPIl terminátor. Získa sa tak S. cerevisiae expresný vektor pZV50.
S. cerevisiae kmeň XP635-10C sa transformuje plazmidom pZV50, kultivuje a testuje, ako bolo uvedené v príklade L V médiu nebol nájdený žiadny produkt IRI, produktu IRC bolo menej ako 0,5 pmólov na mililiter. Bunky, ktoré boli extrahované 0,1 % Nonidetom P-40, vykazovali 1 pmol produktu IRC na ml bunkového extraktu.
Príklad 3
Expresia proinzulínu v Schizosaccharomyces pombe použitím génu BAR1 a promótora 5. pombe alkoholdehydrogenázy
Tento príklad demonštruje použitie časti génu BAR1 na riadenie sekrécie cudzorodých polypeptidov, ktoré sú získané expresiou v transformovanom hostiteľovi, Schizosaccharomyces pombe . Skonštruuje sa plazmid, ktorý obsahuje kombináciu promótora génu S. pombe alkoholdehydrogenázy (ADH) a fúzie BAR1 - proinzulínový gén.
Promótor 5. pombe ADH sa získa z knižnice DNA fragmentov odvodených od S. pombe kmeňa 972h' (ATCC č. 24 843), ktorý bol klonovaný od plazmidu YEpl3, ako to opísali Russel a Halí (J. Biol. Chem. 258, 143 (1983)). Promotorová sekvencia sa vyčistí ako Sph I - Eco RI - Hind III polylinkerový fragment z plazmidu pUC12 sa liguje do plazmidu YEpl3, ktorý bol pred tým rozštiepený pôsobením Sph I a Hind III. Výsledný plazmid je známy ako plazmid pEVP-11.
Pri konštrukcii S. pombe expresného vektora (obrázok 7) sa ADH promótor vyčistí od pEVP-11 ako Sph I-Yba I fragment. Plazmid pZV33 sa rozštiepi pôsobením Xbal a Bgl II. Vyčistí sa fragment BAR1 s asi 340 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje ATG iniciačný kodón. Plazmid pZV33 sa rozštiepi pôsobením Bgl II a SST I a sekvenica napojenia BARI-proinzulín sa vyčistí. Tieto tri fragmenty sa spoja s plazmidom pUC18, vopred rozštiepeným pôsobením Sph
I a Sst I. Získa sa plazmid pZV46. Keďže plazmid pUC18 nie je efektívny pri transformácii S. pombe, plazmid sa podrobí dvojnásobnému štiepeniu enzýmom. Fragment napojenia ADH promótor-BARl sa vyčistí od Hind III a Bgl II štepov a sekvencia napojenia BARl-proinzulín sa vyčistí od Bgl II a Xba I štepov. Tieto fragmenty sa vložia do plazmidu YEpl3, rozštiepeného vopred pôsobením Hind III a Xba I. Získa sa S. pombe expresný vektor pZV49.
Jeden liter kultúry transformovaného 5. pombe kmeň 118-4h‘ (ATCC č. 20680) sa nechá rásť 36 hodín pri teplote 30 °C v štandardnom kvasinkovom syntetickom médiu (-leu D), ktoré obsahuje 200 mg/1 kyseliny aspargovej, 100 mg /1 histidínu, 100 mg/1 adenínu a 100 mg/1 uracilu. Kultúra sa odstredí a supematant sa testuje testami IRI a IRC. Dve vzorky z buniek, ktoré boli transformované plazmidom pTV49, obsahovali 1,6 pikomólu/ml materiálu IRI a 0,5 mólu/ml materiálu IRC. Kontrolné vzorky z kultúry transformovanej plazmidom YEpl3 neobsahovali žiadny detekovateľný materiál IRC.
Príklad 4
Export α-faktora pri použití signálneho peptidu BAR1
Signálny peptid BAR1 sa testuje na schopnosť riadiť export α-faktora z kvasinkového transformanta. Skonštruuje sa niekoľko plazmidov obsahujúcich DNA fragmenty, ktoré kódujú napojenie proteínov rôznych dĺžok (z proteínu BAR1) a 1 alebo 4 kópie maturovaného α-faktora. Týmito plazmidmi sa transformuje diploidný hostiteľský kmeň typu a/a. Transformanty sa testujú na produkciu a-faktora kruhovým testom.
Plazmidy pSW94, pSW95, pSW96 a pSW97 obsahujú promótor S. cerevisiae triozo-fosfát-izomerázy (TPI1) fragment génu BAR1 s 355 pármi nukleotidov alebo 756 pármi nukleotidov (obsahujúci 114 alebo 251 kodónov z 5' konca sekvencie kódujúcej BAR1) a buď jeden alebo štyri kópie génu sekvencie kódujúcej α-faktor (MF1). Tieto konštrukcie sú opísané v tabuľke L
plazmid fragment BAR 1 -faktor
pSW94 355 párov nukleotidov 4 kópie
pSW95 767 párov nukleotidov 4 kópie
pSW96 355 párov nukleotidov 1 kópia
pSW97 767 párov nukleotidov 1 kópia
Plazmid pM220 (známy tiež ako plazmid pM210) bol použitý ako zdroj fragmentu promótora TPI1. E. coli RRI transformovaná plazmidom pM220 je uložená v ATCC pod číslom 39853. Plazmid pM220 sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Elektroforézou na agarózovom géli sa izoluje fragment s 900 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje TPI1 promótor. Konce sa zarovnajú DNA polymerázou I (Klenowov fragment). K fragmentu sa pridajú kinázové Xba 1 linkery. Tento fragment sa potom rozštiepi pôsobením Bgl II a Xba
I. Tento modifikovaný TPI1 promotorový fragment sa liguje do Bgl II - Xba I vektorového fragmentu (s 3400 pármi nukleotidov) z plazmidu pDR1107. Získa sa plazmid pZV118. Plazmid pDR1107 sa skonštruuje subklonovaním Bgl Π-EcoRI TPI1 promotorového fragmentu (s 900 pármi nukleotidov) z plazmidu pM220 do plazmidu pIC7 (Marsh, Erfle a Wykes:Gene 32, 481 (1984)), čím sa generuje plazmid pDRHOl. Plazmid pDRHOl sa štiepi pôsobením Hind III a Sph I. Izoluje sa čiastočný fragment promótora TP11 so 700 pármi nukleotidov. Plazmid pDRllOO, obsahujúci Xba I - Bam Hl TPI1 terminátorový fragment s 800 pármi nukleotidov z plazmidu pM220 subklonovaného do plazmidu pUC18, sa rozštiepi pôsobením Hind III a Sph I.
Čiastočný promótor ΤΡΙ1 so 700 pármi nukleotidov sa liguje do linearizovaného plazmidu pDRllOO, pričom sa získa plazmid pDR1107. Miesto EcoRI na 3'konci promótora TPI1 v plazmide pZVl 18 sa odstráni. Plazmid sa rozštiepi pôsobením Hind III a Eco RI. Izoluje sa fragment s 900 pármi nukleotidov a ten sa liguje do syntetického linkera skonštruovaného anelovaním oligonukleotidov ZC708 (5ÁATTGCTCGAGT 3') a ZC709 (3ČGAGCT-CAGTC 5'). Adícia linkera eliminuje miesto EcoRI na 3'konci TPI1 promotorovaného fragmentu a pridáva miesta Xho I a Xba I. Tento fragment sa potom spojí s plazmidom pUC13, ktorý sa predtým rozštiepi pôsobením reštrikčných endonukleáz Hind III a Xba I.
Výsledný plazmid sa označí pZV134 (obrázok 8).
Klonovanie kvasinkového pohlavného feromónu a-faktora (MFal) bolo opísané Kurjanom a Herskowitzom. Gén bol v tomto laboratóriu a podobným spôsobom izolovaný z kvasinkovej genómovej knižnice častí Sau 3A fragmentov klonovaných do miesta Bam Hl plazmidu YEpl3 (Nasmyth a Tatchell: Celí 19, 753 (1980)). Z tejto knižnice sa izoluje plazmid, ktorý expresiou dáva α-faktor v diploidnom kmeni kvasiniek homozygótnych pre mutáciu mata2-34 (Manney a spol.: J. Celí. Biol. 96, 1592 (1983)). Kloň obsahoval inzert prekrývajúci sa s génom MFal, ktorý charakterizovali Kurjan a Herskowitz. Tento plazmid, známy ako pZA2, sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Izoluje sa fragment s 1700 pármi nukleotidov, ktorý sa liguje do plazmidu pUC13 rozštiepeného pôsobením EcoRI. Výsledný plazmid, označený p 192, sa rozštiepi pôsobením EcoRI. Izoluje sa výsledný fragment MF 1 s 1700 pármi nukleotidov a tento fragment sa rozštiepi pôsobením reštrikčnej endonukleázy Mbo II. Mbo II - Eco RI fragment s 550 pármi nukleotidov sa izoluje a liguje do kinázového Sal I linkera. Naviazaný fragment sa rozštiepi pôsobením Sal 1. Výsledný Sal I fragment s 300 pármi nukleotidov sa liguje do plazmidu pUC4 rozštiepeného pôsobením Sal I (Vieira a Messing: Gene 19, 259 (1982)). Získa sa plazmid, ktorý je označený p489 (na obrázku 9).
Skonštruuje sa fúzia génu obsahujúceho časti BAR1 (114 kodónov) a kódujúce sekvenciu MFal. Plazmid pZV24 (príklad 2) sa rozštiepi pôsobením Sph I a Bgl II. Izoluje sa fragment ADHI promótor-Barl fragment s 800 pármi nukleotidov. Plazmid p489 sa rozštiepi pôsobením Bam Hl. Izoluje sa fragment MF 1 s 300 pármi nukleotidov. Tieto dva fragmenty sa spoja do trojdielnej lígácie do plazmidu YEpl3 rozštiepeného pôsobením Sph I a Bam Hl. Výsledný plazmid sa označí pZV69 (obrázok 11).
Skonštruuje sa druhá fúzia génu kódujúca 251 aminokyselín Barrier-proteínu napojených na časť prekurzora a-faktora. Plazmid pZVló, ktotý obsahuje Xba I - Sal I BAR1 fragment so 767 pármi nukleotidov z plazmidu pZV9 (príklad 1) ligovaný do plazmidu pUC13, ktorý sa vopred rozštiepi pôsobením Xba I a Sal I, sa linearizuje rozštiepením pôsobením Sal I. Tento fragment so 400 pármi nukleotidov sa spojí so Sal I fragmentom s 300 pármi nukleotidov z plazmidu p489 kódujúcim štyri kópie a-faktora. Plazmid, ktorý obsahuje fúziu BARl-MFal v správnej orientácii, sa označí pZV71. Fúzia BARl-MFal z plazmidu pZV71 sa potom napojí na promótor ADHI. Plazmid pTV71 sa rozštiepi pôsobením Xba I a Pst I a izoluje sa fragment s 1070 pármi nukleotidov. Promótor ADHI sa izoluje ako Sph Ι-Xba I fragment (so 420 pármi nukleotidov) z plazmidu pZV24. Tieto dva fragmenty sa spoja v trojdielnej ligácii s plazmidom pUC18, ktorý sa pred tým rozštiepi pôsobením Sph I a Bam Hl. Izoluje sa fragment s 1500 pármi nukleotidov obsahujúci expresnú jednotku. Tento fragment sa liguje do plazmidu YEpl3, ktorý sa rozštiepi pôsobením Sph I a Bam Hl. Vznikne plazmid pZV75 (obrázok 10).
Kvôli manipulácii sa fúzne BAR1-MF 1 jednotky z plazmidu pZV69 a pZV75 subklonujú s promótorom TPI1 do plazmidu pUC18 (Obrázok 11). Plazmid pZV69 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a BamHl. Izoluje sa fragment s 550 pármi nukleotidov, ktorý’ obsahuje fuziu. Fragment promótora TPI1 s 900 pármi nukleotidov sa izoluje z plazmidu pZV118 rozštiepením pôsobením Hind III a EcoRI. Trojdielna ligácia sa vykoná použitím fragmentu BAR1-NFal s 550 pármi nukleotidov, fragmentu promótora TP11 s 900 pármi nukleotidov a plazmidu pUC19, ktorý je rozštiepený pôsobením Hind III a Bam Hl. Výsledný plazmid sa označí pSW59. Plazmid pZV75 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam Hl. Izoluje sa fragment fúzie BARlMFal s 954 pármi nukleotidov. Tento BAR1-MF 1 fragment sa liguje v trojdielnej ligácii s Hind III - Eco RI TPI1 promótorovým fragmentom s 900 pármi nukleotidov a s plazmidom pUC18 rozštiepeným pôsobením Hind III a Bam Hl. Generuje sa plazmid pSW60.
Pri konštrukcii expresných plazmidov sa ako zdroj 5'sekvencie kódujúcej BAR1 s 116 pármi nukleotidov použije plazmid pSW22, ktorý sa skonštruuje nasledujúcim spôsobom (obrázok 12). Oblasť kódujúca BAR1 nájdená v plazmide pSW22 pochádza z pZV9. Plazmid pZV9 (príklad 1) sa rozštiepi pôsobením Sal I a Bam Hl. Izoluje sa fragment BAR1 s 1300 pármi nukleotidov. Tento fragment sa subklonuje do plazmidu pUC13, ktorý je rozštiepený pôsobením Sal I a Bam Hl. Získa sa tak plazmid, ktorý je označený pZV 17. Plazmid pZV17 sa rozštiepi pôsobením EcoRI, aby sa odstránila 3'najväčšia oblasť kódujúca BAR1 s 500 pármi nukleotidov. Vektorový fragment BAR1 sa znovu liguje. Vytvorí sa plazmid označený pJH66. Plazmid pJH66 sa linearizuje pôsobením Eco RI. Konce sa zarovnávajú Klenowovým fragmentom. Pridajú sa linearizované Bam Hl linkery (5'CCGGATCCGG 3 '). Prebytok linkerov sa odstráni rozštiepením pôsobením Bam Hl pred novou ligáciou. Výsledný plazmid pSW8 sa potom rozštiepi pôsobením Sal I a Bam Hl. Izoluje sa fragment s 824 pármi nukleotidov kódujúci aminokyseliny 252 až 525 BARl. Tento fragment BAR1 sa napojí na fragment kódujúci C-terminálnu časť látky P (Munro a Pelham: EMBO J. 3, 3087 (1984)). Plazmid pPM2 obsahujúci syntetickú oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu dimérovú formu látky P v M13mp8, bol získaný od Munroa a Pellhama . Plazmid pPM2 sa linearizuje rozštiepením pôsobením Bam Hl a Sal I a liguje sa s fragmentom BARl s 824 pármi nukleotidov. Výsledný plazmid pSW14 sa rozštiepi pôsobením Sal I a Sma I. Izoluje sa fragment BARl látka P s 871 pármi nukleotidov. Plazmid pZV16 (obrázok 10) sa rozštiepi pôsobením Xba I a Sal I.
Izoluje sa 5' kódujúca sekvencia BARl s 767 pármi nukleotidov. Tento fragment sa liguje s fragmentom BARl látka P s 871 pármi nukleotidov v trojdielnej ligácii s plazmidom pUC18 rozštiepeným pôsobením Xba I a Sma I. Výsledný plazmid sa označí pSW15. Plazmid pSW!5 sa rozštiepi pôsobením Xba I a Sma I. Izoluje sa fragment BARl látka P s 1640 pármi nukleotidov. Promótor ADHI sa získa z plazmidu pRL29, ktorý obsahuje Sph I-EcoRI fragment s 540 pármi nukleotidov obsahujúci promótor ADHI a 5'kódujúcu oblasť BARl so 116 pármi nukleotidov z plazmidu pZV24 v pUC18. Plazmid pRL029 sa rozštiepi pôsobením Sph I a Xba I. Izoluje sa fragment promótora ADHI so 420 pármi nukleotidov. Terminátor TPI1
SK 279041 Β6 (Alber a Kawasaki : J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 (1982)) sa získa ako Xba I-EcoRI fragment v pUC18 s 700 pármi nukleotidov. Linearizovaný fragment obsahujúci terminátor TP11 a pUC18 s Klenowom doplneným Xba 1 koncom sa liguje s fragmentom promótora ADH1 so 420 pármi nukleotidov a s fragmentom BAR1 látka P s 1640 pármi nukleotidov v trojdielnej ligácii. Vzniká tak plazmid pSW22.
Potom sa skonštruuje plazmid pSW94 (obrázok 13). Fragment s 2300 pármi nukleotidov obsahujúci fúziu BARf-látka P a terminátor TPI1 sa izoluje s pSW22 ako Xba f - Sst fragment.
Hind ΠΙ-Xba I TPI1 promótorový fragment izolovaný z plazmidu pZV134 sa napojí na fragment BARl-látka P-TPI1 promótorový fragment v trojdielnej ligácii s plazmidom pUC18, ktorý sa predtým rozštiepi pôsobením Hind III a Sst I. Výsledný plazmid pSW81 sa rozštiepi pôsobením Hind III a EcoRI. Izoluje sa fragment s 1020 pármi nukleotidov a 5 'BAR1 fragment so 116 pármi nukleotidov. Plazmid pSW59 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam HL Izoluje sa fragment fúzie BARl-MFal s 550 pármi nukleotidov. Tento fragment sa potom liguje trojdielnou ligáciou s fragmentom TPI1 promótorom-BARl z plazmidu pSW81 a YEpl3 linearizovaným pôsobením Hind III a Bam HI. Výsledkom je plazmid pSW94,
Konštrukcia pSW95 je znázornená na obrázku 13. Plazmid pSW60 sa rozštiepi pôsobním EcoRI a BamHI. Izoluje sa fragment fúzie BARl-MFal s 954 pármi nukleotidov. Plazmid pSW61 sa rozštiepi pôsobením Hind III a EcoRI. Izoluje sa fragment TPI1 promótor-BARl s 1020 pármi nukleotidov, ktorý sa spojí s fragmentom fúzie BARl-MFal trojdielnou ligáciou s plazmidom Yrpl3, ktorý sa predtým rozštiepi pôsobením Hind III a Bam Hl. Výsledný plazmid sa označí pSW95.
Konštrukcia fúzie promótor TPI1-BAR1-MF 1 obsahujúca iba jednu kópiu α-faktora pochádza zo spojenia BARl-MFal (kódujúca štyri kópie α-faktora), ktorá obsahuje promótor TPI1 a preprosekvenciu MFal (pozri obrázky 14, 15 a 16). Plazmid pZV16 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Sali. Izolovaný fragment BAR1 so 651 pármi nukleotidov sa liguje s kinázovým Hind ΠΙ-EcoRI BAR1 špecifickým adaptorom (produkovaným aneláciou oligonukleotidov ZC566 5'AGCTTTAACAAACGATGGCACTGGTCACTTAG3'a ZC567 5 'AATTCTAAGTGACCAGTGCCATCGTTTGTTAA3') do plazmidu pUC13, ktorý-je rozštiepený pôsobením reštrikčných endonukleáz Hind III A Sal I. Výsledný plazmid pZV96 sa rozštiepi pôsobením Hind III a Sal I. Izoluje sa fragment BAR1 so 684 pármi nukleotidov. Plazmid pM220 poskytol promótor TPI1 fuzovaný na prepro-sekvenciu MFal. Pôsobením BglII a Hind II sa rozštiepi plazmid pM220. Izoluje sa promótor TPIl-MFal preprofragment s 1200 pármi nukleotidov. 3' časť oblasti kódujúcej BAR1 sa získa rozštiepením pZV9 pôsobením Sal I a Bam Hl. Izoluje sa fragment BAR1 fragment s 1300 pármi nukleotidov. Hind IH-Sal I BAR1 fragment s 684 pármi nukleotidov, Bgl II - Hind III TPI1 promótor-MFal preprofragment s 1200 pármi nukleotidov sa spojí v štvordielnej ligácii s plazmidom YEpl3, ktorý je linearizovaný pôsobením Bam Hl. Konštrukcia so žiadanou orientáciou promótora a s fúziou MF 1-BAR1 sa označila pZVlOO (obrázok 14).
Kvôli jednoduchej manipulácii sa fragment fúzie MF 1 preprosekvencie- BAR1 vyštiepený z plazmidu pZVlOO subklonuje do plazmidu pUC13 ako Pst I - Bam Hl fragment s 1600 pármi nukleotidov. Výsledný plazmid pUVlOO sa rozštiepi pôsobením Pst I a EcoRI Izoluje sa fragment MFal prepro-BARl s 270 pármi nukleotidov. Plazmid pZV69 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam Hl. Izoluje sa fragment napojenia BARl-MFal s 550 pármi nukleotidov (kódujúci štyri kópie α-faktora). Tento fragment a fragment MF 1 prepro-BARl s 270 pármi nukleotidov sa liguje v trojdielnej ligácii do plazmidu pUC 13, ktorý bol rozštiepený pôsobením Pst I a Bam HL Výsledný plazmid sa označí pZV102 (obrázok 15).
Potom sa skonštruuje expresná jednotka, ktorá obsahuje promótor TPI1, časť BAR1 a jednu kópiu sekvencie kódujúcej α-faktor (obrázok 16). Plazmid pZV102 sa rozštiepi pôsobením Pst I a Bam HL Izoluje sa fragment MFal prepro-BARl s 820 pármi nukleotidov. Hind III-Pst I fragment s 1000 pármi nukleotidov, ktorý obsahuje promótor TPI1 a preprosekvencia MFa 1, vyštiepená z plazmidu pM220, sa napoj! na fragment MFal prepro-BARl s 820 pármi nukleotidov izolovaný z plazmidu pZV102 v trojdielnej ligácii s plazmidom YEpl3 rozštiepeným pôsobením Hind III a Bam HL Výsledný plazmid sa označí pZV105. Plazmid pZV105 sa účinkom Hind III rozštiepi. Izoluje sa fragment promótor TPIl-MFal prepro s 1200 pármi nukleotidov. Plazmid pZV102 sa rozštiepi pôsobením endonukleázy Hind III. Izoluje sa vektorový fragment, ktorý obsahuje kópiu koncového α-faktora. Tento fragment vektor-MFal s 2800 pármi nukleotidov sa liguje s fragmentom promótor TPI1-MF 1 a prepro s 1200 pármi nukleotidov. Plazmid so správnou orientáciou a s jedinou kópiou sekvencie kódujúcou MF 1 sa označí pSW61. Plazmid pSW61 sa linearizuje čiastočným rozštiepením pôsobením Hind III. Pôsobením Hind III sa rozštiepi plazmid pZV102 a izoluje sa fragment BARl-MFal s 361 pármi nukleotidov. Tento fragment sa liguje do linearizovaného plazmidu pSW61. Plazmid s inzertom so správnou orientáciou v mieste Hind III 264 párov nukleotidov na 3 'konci od iniciačného kodónu MF 1 sa označí pSW70. Plazmid pSW70 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam HI. Izoluje sa fragment BARl-MFal s 361 pármi nukelotidov. Rozštiepením plazmidu pSW81 (obrázok 13) pôsobením Hind III a EcoRI sa izoluje fragment promótor TPI1-BAR1 s 1200 pármi nukleotidov. Tento fragment sa pripojí k fragmentu BAR1-MFal v trojdielnej ligácii s plazmidom YEpl3 linearizovaným pôsobením Hind III a Bam HI. Výsledný plazmid pSW96 obsahuje promótor TPI12 a 5 'kódujúcu sekvenciu BAR1 s 356 pármi nukleotidov napojenú na jednu kópiu sekvencie kódujúcej a-faktor.
Druhá konštrukcia BARl-MFal obsahujúca 767 párov nukleotidov BAR1 napojených na jednu kópiu sekvencie kódujúcej MFal, sa pripraví použitím plazmidu pZV75 ako zdroja fragmentu BAR1 (obrázok 17). Plazmid pZV75 sa rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam HI a izoluje sa fragment BAR1-MF 1 s 954 pármi nukleotidov. Plazmid pZVlOl, ktorý obsahuje sekvenciu MFal prepro napojenú na BAR1, sa rozštiepi pôsobením Pst I a EcoRI.
Izoluje sa fragment MFal prepro-BARl s 270 pármi nukleotidov. Tento fragment sa spojí s fragmentom BAR1-MF 1 s 954 pármi nukleotidov v trojdielnej ligácii s plazmidom pUC13, ktorý sa predtým rozštiepi pôsobením Hind
III. Výsledný plazmid pZV104 sa rozštiepi pôsobením Hind III. Izoluje sa BARl-MFal fragment so 700 pármi nukleotidov. Tento fragment sa liguje s plazmidom pSW61, ktorý· bol zlinearizovaný čiastočným rozštiepením pôsobením Hind III. Plazmid, ktorý má inzert so správnou orientáciou v mieste Hind III 264 párov nukleotidov od 3' iniciačného kodónu MF 1, sa označí pSW74. Plazmid pSW74 sa potom rozštiepi pôsobením EcoRI a Bam Hl. Izoluje sa fragment BARl-MFal so 738 pármi nukleotidov. Plazmid pSW81 sa rozštiepi pôsobením Hind III a EcoRI a izoluje sa fragment promótor TPI1-BAR1 s 1020 pármi nukleotidov. Tento fragment sa napojí na fragment BAR1-MF 1 so 738 pármi nukleotidov v trojdielnej ligácii s plazmidom YEpl3, ktorý sa predtým rozštiepi pôsobením Hind III a Bam HL Výsledný plazmid pSW97 obsahuje TPI1 promótor a 767 párov nukleotidov z 5'konca BAR1 napojených na jednu kópiu sekvencie kódujúcej a-faktor.
a/ct -diploidnv S.cerevisiae kmeň XP733 (Mata leu 2-3 leu 2-112 bar I - 1 gal2/MAT leu 2-3 leu 2-112 barl - 1 gal2) sa transformuje plazmidmi pSW73, pSW94 a pSW95. Plazmid pSW73 obsahuje sekvencie promótora TPI1, signálneho peptidu MFal, prepro sekvencie MFal a kódujúcu oblasť štyroch kópií α-faktora v plazmide YEpl3.
Transformanty sa nanesú na súvislú vrstvu buniek S. cerevisiae RC629 narastených na mäkkom agare na platni so selektívnym médiom a inkubujú sa cez noc pri teplote 30 °C. Z porovnania veľkosti inhibičných zón pre testované bunky s plazmidom pSW73 a pre kontrolu vyplýva, že kontrolná kultúra s pSW94 exportuje približne 15 % z množstva α-faktora, ktoré produkuje kultúra s plazmidom pSW73.
Konštrukcia obsahujúca BAR1 na jednu kópiu sekvencie kódujúcej MFal sa testuje na export α-faktora rovnakým spôsobom. Ako kontrola pre plazmidy pSW96 a pSW97 bol použitý plazmid pSW67, ktorý sa skladá z promótora TPI1, signálneho peptidu MFal, prepro MFal a oblasti kódujúcej jednu kópiu α-faktora v plazmide Y-Epl3. Porovnanie veľkosti inhibičných zón ukazuje, že plazmid pSW96 riadi sekréciu približne 30 až 40 % a-faktora v porovnaní s plazmidom pSW67 a že plazmid pSW97 riadi sekréciu približne 10 až 15 % α-faktora v porovnaní s plazmidom pSW67.
Príklad 5
Mutácia miesta štiepenia signálneho peptidu BAR1
Ako už bolo uvedené, bolo zistené, že pri zmene miesta štiepenia signálneho peptidu prekurzora Barriera možno očakávať zjednodušenie opracovávania a exportu protcínov obsahujúcich fúziu s Barrierom prostredníctvom cesty KEX2. Potenciálne miesta štiepenia sú medzi aminokyselinami 23 a 24 a medzi aminokyselinami 24 a 25. DNA sekvencia kódujúca primárny translačný produkt BAR1 sa teda mutuje, takže v polohe 25 kóduje prolínový zvyšok. Plazmidy pSW98 a pSW99 sú plazmidy založené na plazmide YEpl3, obsahujú promótor S cerevisiae TPI1, fragment génu BAR1 s 355 pármi nukleotidov a 767 pármi nukleotidov, vrátane mutovaného miesta štiepenia signálneho peptidu, a jednu kópiu sekvencie kódujúcej a-faktor.
Mutácia signálneho peptidu sa uskutoční štandardnými mutačnými metódami in vitro (Zoller a pol.: „Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course.“, Cold Spring Harbor Laboratory, (1983)) pomocou templátu fágy M13 a syntetického mutagénneho oligonukleotidu sekvencie 5'ATTACTGCTCCTACAAACGAT 3'. Fágový templát pSW54 sa skonštruuje ligáciou Sph Ι-EcoRI fragmentu s 540 pármi nukleotidov z pSW22 s M13mpl9 rozštiepeným pôsobením Sphl a EcoRI. Po in vitro mutácii sa potenciálne mutované plaky testujú hybridizáciou plakov s 32p-značeným mutagénnym oligonukleotidom. Sekvenovaním sa potvrdí prítomnosť mutácií. Replikačná forma jedného z potvrdených mutovaných fágov mZC634-7 sa roz štiepi pôsobením Sphl a EcoRI. Výsledný plazmid pSW66 (obrázok 18) sa rozštiepi pôsobením Flind III a Xba I, aby sa odstránil promótor ADH1. Fragment, ktorý obsahuje sekvencie vektora BAR1, sa liguje s Hind III-Xba I promótorom TPI1 s 900 pármi získaných z plazmidu pZV139 pôsobením Hind III a Xba I.
Tento plazmid s promótorom TPI1 a 119 pármi nukleotidov s 5 'konca BAR1 vrátane mutácie miesta štiepenia signálneho peptidu sa označí pSW82.
Ako je vidieť na obrázku 18, plazmid pSW82 sa rozštiepi pôsobením Hind III a EcoRI a Bgl II a EcoRI. Výsledný fragment s 1020 pármi nukleotidov s izoluje. Hind ΠΙ-EcoRI fragment z plazmidu pSW82 sa liguje s EcoriBam Hl fragmentom plazmidu pSW74 a s plazmidom YEpl3 rozštiepeným pôsobením Hind III a Bam Hl za vzniku plazmidu pSW99. Bgl Π-EcoRI fragment z plazmidu pSW82 sa liguje s EcoRI-Bam Hl fragmentom s 3000 pármi nukleotidov z plazmidu pSW70 a s plazmidom YEpl3 rozštiepeným pôsobením Bam Hl za vzniku plazmidu pSW98. Plazmid pSW98 zahŕňa promótor TPI1, 355 párov nukleotidov z 5' konca mutovanej sekvencie BAR1 a jednu kópiu sekvencie kódujúcu jednu kópiu - faktora. Plazmid pSW99 obsahuje identickú expresnú jednotku až na to, že mutovaná sekvencia BAR1 má 767 párov nukleotidov.
Analýza kruhovým testom ukázala, že mutácia miesta štiepenia zvýšila export α-faktora, ak sa použili plazmidy kódujúce jednu kópiu α-faktora. Transformanty obsahujúce plazmid pSW98 exportujú asi o 50 % viac α-faktora než tie, ktoré obsahujú plazmid pSW96 (t. j. pri porovnaní s nemutovaným typom).

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konštrukt DNA zahrnujúci jednotlivé sekvencie v smere transkripcie od 5'ku 3 koncu nasledovne: promótor transkripcie, časť génu BAR1 zo Saccharomyces cerevisiae, zobrazená na obr. 1 kódujúca signálny peptid, ktorý obsahuje výhodne 24 až 405 aminokyselín, ide o aminoterminálnu sekvenciu BAR1 génu počínajúc iniciačným mationínom, a aspoň jeden štruktúrny gén cudzorodý pre vybraného hostiteľa.
  2. 2. Konštrukt DNA podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje na spojenie génu BAR1 a cudzorodých génov miesto štiepenia KEX2.
  3. 3. Konštrukt DNA podľa nároku 2, v ktorom sekvencia génu BAR1 kódujúca signálny peptid je zmenená tak, že znižuje účinnosť štiepenia fúzneho polypeptidu alebo proteínu signálnou peptidázou.
  4. 4. Konštrukt DNA podľa nároku 1, v ktorom promótor znamená promótor génu kvasinkovej glykolitickej cesty.
  5. 5. Konštrukt DNA podľa nároku 1, v ktorom promótor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej zo 5. cerevisiae promótora BAR1, 5. cerevisiae promótora alkoholdehydrogenázy I a Schizosaccharomyces pombe promótora alkoholdehydrogenázy.
  6. 6. Konštrukt DNA podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje oblasť terminácie transkripcie Saccharomyces cerevisiae génu triozofosfátizomerázy.
  7. 7. Konštrukt DNA podľa nároku 1, pričom oblasť génu BAR1 ďalej obsahuje sekvenciu 5'oblasti nepodliehajúcej translácii so 680 pármi nukleotidov priľahlú k miestu iniciácie translácie proteínu.
  8. 8. Transformovaná bunka, ktorá obsahuje konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
  9. 9. Transformovaná bunka podľa nároku 8, pričom touto bunkou je bunka huby.
  10. 10. Transformovaná bunka podľa nároku 9, pričom touto hubou je Saccharomyces cerevisiae.
  11. 11. Transformovaná bunka podľa nároku 9, pričom touto hubou je Schizosaccharomyces pombe.
  12. 12. Transformovaná bunka podľa nároku 9, pričom touto hubou je Aspergillus alebo Neurospora.
  13. 13. Spôsob výroby cudzorodého proteínu v transformovanej bunke transformáciou hostiteľskej bunky konštruktom DNA kódujúcim uvedený cudzorodý proteín a selektovateľný marker a potom kultiváciou transformovanej bunky v kultivačných podmienkach vhodných na výrobu cudzorodého proteínu, vyznačujúci sa tým, že sa hostiteľská bunka, predstavovaná bunkou huby, transformuje konštruktom DNA, ktorý zahrnuje v smere transkripcie, časť génu BAR1 zo Saccharomyces cerevisiae, zobrazenú na obr. 1, kódujúcu signálny peptid, ktorý obsahuje výhodne 24 až 405 aminokyselín, pričom ide o aminoterminálnu sekvenciu BAR1 génu počínajúc iniciačným metionínom, aspoň jeden štruktúrny gén cudzorodý pre vybraného hostiteľa, pričom fuzny proteín obsahujúci signálny peptid a cudzorodý proteín sa vyrába v transformovanej bunke a je smerovaný do sekrečnej cesty bunky.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedenou bunkou je bunka huby.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ako huba sa použije Saccharomyces cerevisiae.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 14,v yznačujúci sa tým, že ako huba sa použije Schizosaccharomyces pombe.
  17. 17. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ako huba sa použije Aspergillus alebo Neurospora.
  18. 18. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa bunka huby transformuje konštruktom DNA, ktorý zahŕňa promótor, ktorý v transformovanej bunke kontroluje expresiu fúzneho proteínu obsahujúceho miesto štiepenia KEX2.
  19. 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že sa sekvencia génu BAR1 kódujúca signálny peptid zmení miestne špecifickou mutagenézou potencionálnych miest štiepenia, výhodne miest spájajúcich aminokyseliny 23 a 24 alebo 24 a 25.
  20. 20. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa bunka huby transformuje konštruktom DNA, ktorý zahŕňa promótor vybraný zo skupiny skladajúcej sa z promótora Saccharomyces cerevisiae BAR1, z promótora Saccharomyces cerevisiae alkoholdehydrogenázy I a promótora Schizosaccharomyces pombe alkoholdehydrogenázy.
  21. 21. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa bunka huby transformuje konštruktom DNA, ktorý zahŕňa ako promótor génov kvasinkovej glykolitickej dráhy.
  22. 22. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že cudzorodý proteín je exportovaný z bunky.
    východiskové látky pri vzniku proteínu zahŕňajúceho proinzulín alebo inzulín.
    21 výkresov
  23. 23. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sa zodpovedajúcim spôsobom použijú
SK7764-86A 1985-10-25 1986-10-27 Konštrukt dna, transformovaná bunka a spôsob výrob SK279041B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79130585A 1985-10-25 1985-10-25
PCT/US1986/002198 WO1987002670A1 (en) 1985-10-25 1986-10-20 Method of using bar1 for secreting foreign proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK776486A3 SK776486A3 (en) 1998-06-03
SK279041B6 true SK279041B6 (sk) 1998-06-03

Family

ID=25153298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK7764-86A SK279041B6 (sk) 1985-10-25 1986-10-27 Konštrukt dna, transformovaná bunka a spôsob výrob

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0243465A1 (sk)
JP (1) JP2523562B2 (sk)
CN (1) CN1027179C (sk)
AU (2) AU6543286A (sk)
CA (1) CA1316133C (sk)
CZ (1) CZ284251B6 (sk)
DK (1) DK320287A (sk)
FI (1) FI872801A (sk)
HU (1) HU206897B (sk)
IE (1) IE63822B1 (sk)
SK (1) SK279041B6 (sk)
UA (1) UA41863C2 (sk)
WO (1) WO1987002670A1 (sk)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
AU2334088A (en) * 1987-10-02 1989-05-18 Zymogenetics Inc. Bar1 secretion signal
US5206699A (en) * 1988-05-06 1993-04-27 Gersan Establishment Sensing a narrow frequency band of radiation and gemstones
EP0387319B1 (en) * 1988-07-23 1996-03-06 Delta Biotechnology Limited Secretory leader sequences
JPH05505308A (ja) * 1990-03-13 1993-08-12 ハワイ・バイオテクノロジー・グループ・インコーポレイテツド アオパンカビ発現システム
DK82893D0 (da) * 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
CN102080070B (zh) 1995-03-17 2016-01-20 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
DK1975177T3 (da) 1996-03-01 2011-07-25 Novo Nordisk As Appetitundertrykkende peptid, formuleringer dermed og anvendelse deraf
CA2395713C (en) 2000-01-10 2012-04-10 Torben Lauesgaard Nissen G-csf conjugates
WO2001058935A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
IL156059A0 (en) 2001-02-27 2003-12-23 Maxygen Aps NEW INTERFERON beta-LIKE MOLECULES
BR0208203A (pt) 2001-03-22 2005-04-19 Novo Nordisk Healthcare Ag Polipeptìdeo do fator vii, derivado do fator vii, composição, composição farmacêutica, construção de polinucleotìdeo, célula hospedeira eucariótica, animal transgênico, planta transgênica, e, métodos para produzir o polipeptìdeo do fator vii e um derivado do fator vii, uso de um derivado do fator vii, métodos para o tratamento de episódios de hemorragia ou distúrbios de hemorragia em um paciente ou para a intensificação do sistema hemostático normal e para inibir a formação de trobo em um paciente
US6534059B2 (en) 2001-06-05 2003-03-18 Advanced Biotherapy, Inc. Compositions and methods for treating hyperimmune response in the eye
WO2003027147A2 (en) 2001-09-27 2003-04-03 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
CN101870729A (zh) 2003-09-09 2010-10-27 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
JP2008538290A (ja) 2005-04-18 2008-10-23 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｉｌ−２１変異体
WO2007020256A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
EP2316930A1 (en) 2005-09-14 2011-05-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor VII polypeptides
WO2007103447A2 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human thrombin
AU2007292903B2 (en) 2006-09-08 2012-03-29 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or Fc scaffolds and their uses
JP5503968B2 (ja) 2006-09-27 2014-05-28 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
US8946148B2 (en) 2007-11-20 2015-02-03 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
NZ600382A (en) 2008-07-23 2013-11-29 Ambrx Inc Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
US8349325B2 (en) 2008-12-23 2013-01-08 Abbott Laboratories Soluble FMS-like tyrosine kinase-1 (sFLT-1) antibody and related composition, kit, methods of using, and materials and method for making
WO2010103038A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor
KR101870378B1 (ko) 2009-07-17 2018-06-25 릭스하스피탈렛 보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형
ES2583259T3 (es) 2009-12-01 2016-09-20 Novo Nordisk A/S Nuevas liasas alfa-amidantes de peptidil alfa-hidroxiglicina
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
AU2010341518B2 (en) 2009-12-21 2014-01-09 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
EP3815708A1 (en) 2010-03-05 2021-05-05 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
US20110229921A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Abbott Laboratories METHODS OF ASSAYING URINARY NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED LIPOCALIN (uNGAL) IN THE PROGNOSIS OF CADAVERIC KIDNEY TRANSPLANT FUNCTION IN A PATIENT, INCLUDING A PATIENT DIAGNOSED WITH DELAYED GRAFT FUNCTION (DGF), A METHOD OF ASSAYING uNGAL IN THE ASSESSMENT OF RISK OF DGF IN A PATIENT DIAGNOSED WITH EARLY GRAFT FUNCTION (EGF), AND RELATED KITS
US9551714B2 (en) 2010-06-25 2017-01-24 Abbott Laboratories Materials and methods for assay of anti-hepatitis C virus (HCV) antibodies
SG10201506443TA (en) 2010-08-17 2015-10-29 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
US20120115244A1 (en) 2010-11-09 2012-05-10 Abbott Laboratories Materials and methods for immunoassay of pterins
EP2649178B8 (en) 2010-12-09 2017-08-30 Institut Pasteur Mgmt-based method for obtaining high yield of recombinant protein expression
MX349562B (es) 2011-12-09 2017-08-02 Pasteur Institut Ensayo de inmuno deteccion multiplex.
US8993248B2 (en) 2011-12-31 2015-03-31 Abbott Laboratories Truncated human vitamin D binding protein and mutation and fusion thereof and related materials and methods of use
BR112014018630A2 (pt) 2012-02-09 2017-07-04 Var2 Pharmaceuticals Aps alvejamento de glicanos de sulfato de condroitina
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
JP2014128262A (ja) * 2012-11-27 2014-07-10 Kirin Brewery Co Ltd 接合能を持つ酵母細胞株のスクリーニング方法
MX2020011529A (es) 2018-05-01 2021-01-29 Ambrx Inc Un metodo para optimizar la expresion de anticuerpos.
EP3821244A1 (en) 2018-07-13 2021-05-19 Varct Diagnostics ApS Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa
DK3849614T3 (da) 2018-09-11 2024-02-26 Ambrx Inc Interleukin-2-polypeptidkonjugater og anvendelser deraf
JP2022512746A (ja) 2018-10-19 2022-02-07 アンブルックス，インコーポレイテッド インターロイキン－１０ポリペプチド複合体、その二量体、およびそれらの使用
KR20210136014A (ko) 2019-02-12 2021-11-16 암브룩스, 인코포레이티드 항체-tlr 작용제 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 방법 및 이의 용도
KR20220151202A (ko) 2020-03-11 2022-11-14 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 사용 방법
EP4136459A1 (en) 2020-04-13 2023-02-22 Abbott Laboratories Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a ss-coronavirus antibody in a sample
WO2022031804A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
WO2022147147A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
AU2022249223A1 (en) 2021-04-03 2023-10-12 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CN115806889B (zh) * 2022-09-28 2024-06-11 山东大学 一种提高基因表达水平的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4613572A (en) * 1983-08-15 1986-09-23 Kansas State University Research Foundation Yeast BAR1 gene plasmid
DE3537176C2 (de) * 1984-10-18 1994-06-09 Zymogenetics Inc Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung
JPS61247384A (ja) * 1984-10-18 1986-11-04 チモ−ジエネテイツクス　インコ−ポレ−テツド 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK320287D0 (da) 1987-06-23
JP2523562B2 (ja) 1996-08-14
SK776486A3 (en) 1998-06-03
UA41863C2 (uk) 2001-10-15
CA1316133C (en) 1993-04-13
FI872801A0 (fi) 1987-06-24
EP0243465A1 (en) 1987-11-04
HUT43624A (en) 1987-11-30
AU676132B2 (en) 1997-03-06
CZ284251B6 (cs) 1998-10-14
IE63822B1 (en) 1995-06-14
AU6543286A (en) 1987-05-19
CN86107554A (zh) 1987-08-26
JPS63501614A (ja) 1988-06-23
IE862804L (en) 1987-04-25
DK320287A (da) 1987-06-23
WO1987002670A1 (en) 1987-05-07
HU206897B (en) 1993-01-28
AU7400391A (en) 1991-07-18
FI872801A (fi) 1987-06-24
CN1027179C (zh) 1994-12-28
CZ776486A3 (en) 1996-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK279041B6 (sk) Konštrukt dna, transformovaná bunka a spôsob výrob
CA1340547C (en) Novel secretory leader sequences for yeasts
CA1340772C (en) Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US5037743A (en) BAR1 secretion signal
KR100227167B1 (ko) 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질
US6331414B1 (en) Preparation of human IGF via recombinant DNA technology
US4870008A (en) Secretory expression in eukaryotes
EP0123544A2 (en) Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor
JPH07503368A (ja) 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
US20070010439A1 (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5618690A (en) Method of using an ER-located endoprotease
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
US6962796B1 (en) Production of human parathyroid hormone from microorganisms
JPH04339259A (ja) 突然変異菌株の検出法
EP0220689B1 (en) Method of using bar1 for secreting foreign proteins
JP3135550B2 (ja) 成熟異種タンパク質、特にヒルジン、の製造のための改良された酵母株、および対応するヒルジンの製造法
EP0271003A2 (en) Expression vectors
EP0310137A2 (en) BAR1 secretion signal
Goodey et al. Expression and secretion of foreign polypeptides in yeast