KR101870378B1 - 보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형 - Google Patents

보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형 Download PDF

Info

Publication number
KR101870378B1
KR101870378B1 KR1020127004301A KR20127004301A KR101870378B1 KR 101870378 B1 KR101870378 B1 KR 101870378B1 KR 1020127004301 A KR1020127004301 A KR 1020127004301A KR 20127004301 A KR20127004301 A KR 20127004301A KR 101870378 B1 KR101870378 B1 KR 101870378B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
leu
ser
glu
gly
Prior art date
Application number
KR1020127004301A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130026402A (ko
Inventor
피터 가렛
티나 훔멜스회이 글루
미켈-올레 스키외트
Original Assignee
릭스하스피탈렛
코벤하븐스 유니버시테트
시드단스크 유니베르시테
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 릭스하스피탈렛, 코벤하븐스 유니버시테트, 시드단스크 유니베르시테 filed Critical 릭스하스피탈렛
Publication of KR20130026402A publication Critical patent/KR20130026402A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101870378B1 publication Critical patent/KR101870378B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/04—Amoebicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 피콜린 관련 폴리펩타이드 및 염증, 세포자멸사, 자가면역, 응집, 혈전 또는 응고병 관련 질환과 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 있어서의 이들 피콜린 관련 폴리펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드의 용도 및 바이오마커로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 신규한 피콜린 관련 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 및 그로부터 유도된 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 이러한 폴리펩타이드의 제조시 사용되는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이기도 하다.

Description

보체 활성화의 억제제로서의 ＭＡＳＰ 이소형{MASP ISOFORMS AS INHIBITORS OF COMPLEMENT ACTIVATION}
본 발명은 신규한 피콜린 관련 폴리펩타이드 및 염증, 세포자멸사, 자가면역, 응집, 혈전 또는 응고병 관련 질환과 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 있어서의 이들 피콜린 관련 폴리펩타이드로부터 유도된 폴리펩타이드의 용도 및 바이오마커로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 신규한 피콜린 관련 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 및 그로부터 유도된 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 이러한 폴리펩타이드의 제조시 사용되는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이기도 하다.
보체 시스템(C)의 활성화는 3 가지 서로 다른 출발 경로, 즉: 대체 경로(alternative:AP), 고전적 경로(classical:CP) 또는 렉틴 경로 (lectin:LCP)를 경유하여 달성된다. AP 활성화는 외래 표면에서 발생하며 C3의 느리고도 자발적인 가수분해 및 기능성 C3 컨버타제 C3bBb를 형성하는 팩터 프로퍼딘, 팩터 B 및 팩터 D의 활성에 의해 일어난다. AP는 또한 다른 2개의 경로의 증폭 경로(증폭 루프)로서 기능하기도 한다. 최근, 어떤 표적 표면에 대한 프로퍼딘의 비공유 결합에 의해서도 대체 컨버타제 어셈블리가 개시될 수 있는 것으로 나타났다. 다른 한편으로 CP 활성화는 C1q가 항원과 복합된 면역글로불린에 결합하여, C1q-관련 세린 프로테아제 C1r 및 C1s의 활성화를 격발함으로써 개시된다. C1s는 C4 및 C2를 절단하여 CP C3 컨버타제 C4b2a를 형성하도록 활성화시킨다. LCP는 만노스 결합 렉틴(MBL: mannose-binding lectin) 또는 피콜리딘이 예컨대 미생물 표면 상에 있는 것과 같은 제한된 형태의 아세틸화 화합물 또는 탄수화물에 결합하거나 또는 죽어가는 숙주 세포 상에 노출될 때 활성화된다. 리간드에 결합하면 관련된 세린 프로테아제 MASP-2가 활성화되어 C4와 C2를 절단하여 LCP C3 컨버타제 C4b2a를 형성하는 것이다. MASP-1의 기능은 C2의 MAPS-2 절단의 안정화 및 C3의 직접적인 하위등급 절단에도 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 그러나 또 다른 연구들은 MASP-1 및 MASP-2의 기능과 활성을 프로트롬빈, 피브리노겐 및 팩터 XIII과 관련된 응혈시스템 혼선과 연계시키기도 한다. 최근 MASP1/3 녹아웃 마우스를 이용한 연구 결과 MASP-1이 실상 보체 활성화에 기여하는 것으로 입증되었다. 가장 최근에 밝혀진 MBL 관련 세린 프로테아제 MASP-3의 정확한 기능은 그러나 아직도 규명되지 못하고 있다. 여러 연구 결과에 의하면 MASP-3이 제한된 범위의 MBL 올리고머들과 연계되어 MASP-3과 작은 MBL-관련 단백질 (sMA)가 MBL 의존성 LCP 보체 활성화를 조절 또는 억제한다는 연구 결과가 보고된 바 있다.
MASP-1 및 MASP-3은 동일한 MASP1/3 유전자(염색체 3q27-q28 상에 존재한다)로부터 분화를 통해 갈라져 나온다. 이들은 15 C-말단 잔기를 제외하고는 동일한 A-사슬을 함유한다. A 사슬은 EGF(상피성장인자) 도메인에 의해 분리된 2개의 CUB(C1r/C1s, 우르친-EGF, 골형성단백질) 도메인으로 이루어지며 2개의 CCP 도메인(보체조절 단백질)이 그 뒤를 잇는다. 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 B 사슬은 MASP-1과 MASP-3에서 서로 다르다. MASP-2와 sMAP 역시도 동일한 유전자 (염색체 1p36-p36.2 상에 존재한다)로부터 유래하는데 여기서 sMAP는 세린 프로테아제 도메인과 A-사슬의 주요부가 결여된 절단형(truncated form)이다. MASP1 /3 유전자는 폴리모르픽인 것으로 나타났으나, 이것의 기능적 중요성에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 그러나, MASP2/sMAP 유전자에 있어서의 다형성이 감염 위험성 증가와 연관이 있다는 몇몇 증거가 있다. MASPs의 발현은 간세포에 국소화되지만, 최근의 연구 결과 인간의 MASP-3 mRNA(유일한 MASP-mRNA로서)가 광범위한 조직에서 발현된 것으로 설명되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 구체예들의 한 가지 목적은 염증, 세포자멸사, 자가면역, 응집, 및/또는 혈전 또는 응고병 관련 질환과 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 적합한 폴리펩타이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 암과 같은 악성 질환 뿐만 아니라 이들 용도의 진단 및/또는 예측을 위한 바이오마커로서도 적합할 수 있다.
발명의 개요
본 발명자(들)은 렉틴 보체 경로의 인식 분자와 관련된 신규한 폴리펩타이드와, 그의 단편과 같은 폴리펩타이드들을 염증, 세포자멸사, 자가면역, 응집 및/또는 혈전 또는 응고병과 관련된 특이적인 병태들을 치료하는데 사용될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 첫번째 측면에서, 본 발명은 분리된 피콜린-관련 폴리펩타이드에 관한 것이다.
두번째 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 면역학적 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
세번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
네번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 SEQ NO:2와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 구조물이 발현될 수 있는 조건 하에, 적절한 성장 배지 중에서 본 발명에 따른 세포를 배양하고 얻어진 폴리펩타이드를 배양 배지로부터 회수하는 것을 포함하여 이루어지는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 생물학적 시료 중에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은:
a) 생물학적 시료를 수득하는 단계;
b) 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및
c) 시료 중 폴리펩타이드의 존재여부를 지시하는 지시자로서 폴리펩타이드와 항체와의 복합체(존재할 경우)를 검출하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 의약으로서 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 의약 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증, 세포자멸사 및/또는 자가면역과 관련된 여하한 증상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 응집, 혈전 또는 응고 관련 질환과 연관된 여하한 증상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 외과수술 중의 환자 또는 울혈성 심부전증 환자와 같이 고위험군으로 동정된 환자들에 있어서의 혈전색전성 합병증의 발병을 예방하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 심장과 관련한 의학적 상태를 치료하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피콜린 관련 폴리펩타이드의 결핍과 관련된 의학적 상태를 치료하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상자에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 염증, 세포자멸사 및/또는 자가면역과 관련된 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상자에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 응집, 혈전 또는 응고병 관련 질환의 증상을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상자에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 외과수술 중의 환자 또는 울혈성 심부전증 환자와 같이 고위험군으로 동정된 환자들에 있어서의 혈전색전성 합병증의 발병을 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 심장과 관련된 의학적 병태의 치료방법에 관한 것으로; 상기 방법은 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 치료적 또는 예방적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상자에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 피콜린 관련 폴리펩타이드의 결핍과 관련된 의학정 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 엄격 조건(stringent condition) 하에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 프로브에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 생물학적 시료를 수득하는 단계;
b) 생물학적 시료를 본 발명에 따른 핵산 프로브와 접촉시키는 단계; 및
c) 시료 중 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 존재 여부를 지시하는 지시자로서, 시료 중 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 핵산 프로브와의 복합체(존재할 경우)를 검출하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 생물학적 시료 중에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 존재 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자로부터 생물학적 시료를 수득하고 생물학적 시료 중에서 피콜린 관련 폴리펩타이드의 발현을 측정하여, 생물학적 시료 중의 피콜린 관련 폴리펩타이드의 발현이 대조군과 비교하여 증감된 경우 대상 환자가 피콜린 관련 폴리펩타이드의 이상 발현과 연관된 질환을 앓고 있음을 가리키는 것으로 하는, 피콜린 관련 폴리펩타이드의 이상 발현과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피콜린-1, 2, 3, 만노스-결합 렉틴 (MBL), C1q, 폐 표면 단백질 SP-A 및/또는 SP-D, 및 세포내 콜라겐 유사 방어 분자(intracellular collagen-like defence molecules), 예컨대 CLL-11로부터 선택되는 1종 이상의 단백질과 본 발명에 따른 폴리펩타이드와의 조합을 포함하여 이루어지는 분리된 조성물(isolated composition)에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는, 의약 조성물인 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용되기 위한 본 발명에 따른 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약을 제조하는데 사용되기 위한, 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증, 세포자멸사 및/또는 자가면역과 연관된 증상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 여하한 증상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피콜린-1, 2, 3, 및 만노스-결합 렉틴 (MBL), C1q, 폐 표면 단백질 SP-A 및/또는 SP-D, 및 세포내 콜라겐-유사 방어 분자, 예컨대 CLL-11로부터 선택된 1종 이상의 단백질 및 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 치료 또는 예방적 유효량을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 본 명세서에 정의된 여하한 증상의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암질환, 예컨대 뇌종양, 간종양, 생식관 내의 종양과 같은 악성 질환의 진단 및/또는 예측을 위한 혈액 및 조직 내 바이오마커로서의 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 자가면역, 대사성 및/또는 염증 상태의 진단 및/또는 예측을 위한 혈액 및 조직 내 바이오마커로서의 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 렉틴 보체 경로의 인식 분자들과 연계된 40 kDa의 신규한 혈장 단백질을 발견하고 이를 MASP-1/MASP-3의 새로운 대체 전사 변이체로서 동정하였으며 이는 다시 새롭게 발견된 혈장 단백질에 상응하는 것이다.
이 신규한 단백질(발명자 이름을 따서 FAP라 칭함: Ficolin Associated Protein: 피콜린 관련 단백질) 또는 MAP-1 (MBL/피콜린 관련 단백질-1))은 본 발명자들에 의해, 효소 도메인은 결여하나 피콜린/MBL 결합 도메인은 함유하며 이에 따라 MASPs의 경쟁 또는 전치(displacement)를 통해 보체의 조절 및 억제와 응혈 기능을 나타내는 반면, 스캐빈져 또는 시그널링 기능과 관련이 있는 단백질로서 상호 배타적이지는 않는 것으로 나타났다.
응혈 캐스케이드 및/또는 보체계의 조절되지 않은 활성화는 전신 염증 및 패혈증으로부터 심근경색 및 자가면역에 이르는 광범위한 질환에 있어서서 나타나는 치명적인 결과와 깊은 연관이 있다.
보체 활성화 및 응혈 억제는 유망한 치료 도구인 것으로 나타났다.
본 발명은 보체의 가능한 새로운 억제제와 응혈 기능의 양자 모두를 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다른 기능, 예컨대 스캐빈져 및/또는 시그널링 기능도 가질 수 있다. 뿐만 아니라, 이것은 악성 질환, 자가면역, 대사성 및/또는 염증성 상태를 비롯한, 여러 가지 질환 부류에서 새로운 바이오마커로서 이용될 수도 있다.
본 발명의 방명자들은 피콜린 관련 단백질(FAP)라 명명된, 생체내에 존재하는 혈장 단백질을 발견하고 이것이 주로 피콜린과 연관되어 있으나(도 9), 만노스-결합 렉틴과도 연계되어 있을 수 있음을 발견하였다. NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스를 조사한 결과 본 발명의 발명자들은 MASP-1의 절단형(truncated form)에 상응하는 가능한 전사 변이체를 발견하였다. 이 서열에 기초해서, 잠정적인 새로운 유전자 전사체를 증폭시키기 위해 프라이머를 설계하였다. 이어서, 사람의 간 cDNA를 이용하여 MASP-1 유전자의 새로운 대체 전사 변이체 (도 1)을 동정하였다. 이 mRNA 스트레인을 시퀀싱하고 이에 따라, 혈장/혈청 중 관찰된 단백질의 분자량 40 kDa에 해당하는 아미노산 서열을 결정하였다. (도 5). 이 새로운 단백질은 MASP-1 및 MASP-3과 부분적으로 동일하지만, 세린 프로테아제 도메인이 결여되어 있는 반면, 종결 코돈을 수반하는 17개 아미노산을 코딩하는 신규한 엑손을 포함한다. 이 엑손은 MASP1 및 MASP3 전사체에서 스플라이스된다 (도 2). mRNA 발현 라이브러리의 패널을 이용함으로써 본 발명자들은 이 단백질이 심장과 간, 그 다음으로 골격근에서 강력하게 발현됨을 발견하였다 (도 3). 뇌, 소화관, 전립선 및 비장에서는 약한 발현이 관찰되었다 (도 3). Taqman 분석 결과 심장과 간 세포에서도 발현되는 것으로 확인되었다. FAP는 MASP1 및 MASP3에 비해 심장 조직에서 훨씬 많이 발현되었다. FAP는 간에 비해 심장 조직에서 3배나 더 높게 발현되었다. 뿐만 아니라, 간에서의 MASP1 및 MASP3의 발현에 비해 간에서의 FAP 발현은 훨씬 더 높게 관찰되었다. 뇌, 골격근 및 전립선 조직에서도 상당량의 FAP 발현이 관찰되었다. 실험은 이중으로 3회 실시하였다.
심장에서 많이 발현된다는 것은 매우 유망한 장점이며 이에 힘입어 본 발명자들은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 자가면역, 대사성 및/또는 염증성 상태, 예컨대 심장과 연관된 의료 상태에 있어서 조직 손상에 대한 매우 유용한 프로텍터로서 사용할 가능성을 타진하였다.
본 발명자들은 피콜린과 만노스-결합 렉틴에 의해 개시되는 보체 활성화를 평가하기 위한 분석법을 확립하였으며 이에 따라 본 발명자들은 FAP의 가능한 기능성 보체 억제를 나타낼 수 있었다.
본 발명자들은 서로 다른 조직에서의 정확한 상대적 발현 수준을 측정하기 위한 실시간 정량 분석법을 확립하였다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 각각 FAP 폴리클로날 및 모노클로날 특이적 항체를 수득하기 위해, 독특한 17 아미노산 길이 펩타이드로 토끼 또는 마우스를 면역화시킬 수 있다.
여러 가지 조직에서 FAP의 정량적 측정과 면역조직화학적 검색법을 위하여 특이적인 FAP 항체를 이용할 수 있다.
본 명세서에 설명된 바와 같은 여러 가지 결합 파트너들과 FAP간의 결합 상수를 ELISA로 측정하고 표면 플라즈몬 공명기술 (Biacore)를 이용하여 구할 수 있다.
특이적인 세포 표면 결합 수용체와 같은 FAP 특이적인 억셉터 단백질을 당업자들에게 알려진 기술, 예컨대 단백질을 세포에 직접 결합시키는 것과 같은 분석법과 같은 표준 분석법에 의해 동정할 수 있다.
신규한 단백질인 피콜린 관련 단백질 (FAP)은 MASP1의 대체 스플라이싱 변이체이다. 이 단백질은 세린 프로테아데 도메인은 결여하지만 보체계의 렉틴 경로의 개시자에 결합하는데 관여하는 도메인들은 여전히 포함한다. 따라서, 본 발명자들은 이 단백질이 MASPs의 경쟁 및 전치를 통해 MASP-1 및 MASP-3의 기능 (보체, 응혈 기능 및 기타 효소 기질)을 조절 및 억제하는데 관여할 것으로 추측한다. 또는, 그러나 상호 배타적이지 않은 FAP는 내인성 폐물질 또는 병원체에 결합된 FAP/MBL/피콜린 복합체의 제거를 용이하게 해주는 스캐빈져 분자로서 기능할 수도 있다.
보체계의 조절되지 않은 활성화와 응혈 캐스케이드는 좋지 않은 결과를 초래하는데 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 기능적 억제제들은 응혈 캐스케이드와 보체계를 조절하는데 매우 유용할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 다른 환경에서도 사용할 수 있다. 또 다른 측면은 이 단백질을 여러 가지 질환 환경에서 바이오마커로서 사용하는 것이다.
이 단백질은 독특하며 새로운 약물 및/또는 새로운 진단 도구를 위한 기반을 제공할 수 있다.
SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열 또는 그의 면역학적 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 아미노산의 이러한 서열과 연관된 특이적인 기능을 가질 수 있다. 본 발명자들은 이러한 폴리펩타이드가 DNMT1 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 1 (DNMT1), 골지체 서브패밀리 B 멤버 1 (GOLGB1), A-키나제 앵커 단백질 9 (AKAP9), B- 및 T-임파구-관련 단백질)(CD272 항원), PTB 도메인-함유 탐식 어댑터 단백질 1 (GULP), 및 MACRO 도메인-함유 단백질 2로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 활성에 상응하는 기능이나 활성을 가질 것으로 생각한다.
몇몇 특정 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 PTB 도메인-함유 탐식 어댑터 단백질 1 (GULP)의 활성에 상응하는 기능 또는 활성을 갖는다.
정의
본 발명에서 "피콜린-관련 폴리펩타이드"라는 용어는 천연 인간 피콜린-관련 단백질 (FAP) (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열 20-380 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열 16-363을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드, 그의 기능성 변이체, 기능성 절단형 버젼 및 그의 기능성 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미하며, 이 폴리펩타이드는 보체 활성을 갖지는 않지만, 피콜린-3, MBL, C1q, 폐 표면 단백질 SP-A 및/또는 SP-D 및/또는 CL-L1 (및 다른 콜렉틴 패밀리 멤버들)과의 결합을 놓고 MASP-1, MASP-2, 또는 MASP-3와 경쟁할 수 있는 능력을 갖는다. 이 폴리펩타이드의 비제한적인 예로는 SEQ ID NO:1을 갖는 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드 (FAP) 및 그의 변이체를 들 수 있다.
본 발명에서 "피콜린-관련 단백질 (FAP)"라는 용어는 천연 인간 FAP (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열 1-380 (시그널 펩타이드를 가질수도 갖지 않을 수도 있음, 예컨대 아미노산 서열 20-380)을 갖는 단백질, 그의 천연 대립유전자 변형체 (천연 대립유전자 변이체) 및 그의 상동체(homologous)를 의미한다. 이 용어는 또한 약간 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질들도 포함하는데, 예컨대, 이들 단백질이 실제로 fAP의 활성을 보유하는 한, N- 또는 C-말단 아미노산이 결실 또는 부가된 것을 비롯하여 변형된 N- 또는 C-말단을 갖는 단백질들도 포함한다. "피콜린-관련 단백질 (FAP)"이라는 용어는 본 발명에서 "MAP-1" 또는 "MBL/피콜린 관련 단백질-1"이라는 용어와 상호 호환적으로 사용된다.상기 정의 중의 "FAP" 역시 존재할수 있거나, 대상개체마다 달리 일어날 수 있는 천연 대립유전자 변이체를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 예컨대 소, 돼지, 개, 말, 래트 및 마우스와 같은 인간 이외의 종으로부터 유래된, 유사한 기능과 상동 서열을 갖는 단백질도 포괄한다. 또한, 글리코실화 또는 기타 후번역 변형의 정도와 위치 역시 선택된 숙주 세포와 숙주세포 환경에 따라 변할 수 있다.
본 발명에서 "MBL-관련 세린 프로테아제-1" 또는 "MASP-1"이라는 용어는 천연 인간 MASP-1 (SEQ ID NO:5)의 아미노산 서열 1-699 (시그널 펩타이드를 가질수도 갖지 않을 수도 있음, 예컨대 아미노산 서열 20-699)를 갖는 단백질, 그의 천연 대립유전자 변이체 및 그의 상동체를 의미한다. 이 서열은 1개 이상의 펩타이드 사슬의 형태로, 예컨대 천연 인간 단백질의 중쇄 및 경쇄와 같이 2개의 사슬로 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서 "MBL-관련 세린 프로테아제-3" 또는 "MASP-3"이라는 용어는 천연 인간 MASP-3 (SEQ ID NO:7)의 아미노산 서열 1-728 (시그널 펩타이드를 가질수도 갖지 않을 수도 있음, 예컨대 아미노산 서열 20-728)를 갖는 단백질, 그의 천연 대립유전자 변이체 및 그의 상동체를 의미한다. 이 서열은 1개 이상의 펩타이드 사슬의 형태로, 예컨대 천연 인간 단백질의 중쇄 및 경쇄와 같이 2개의 사슬로 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서 "MBL-관련 세린 프로테아제-2" 또는 "MASP-2"라는 용어는 천연 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:9)의 아미노산 서열 1-686 (시그널 펩타이드를 가질수도 갖지 않을 수도 있음, 예컨대 아미노산 서열 16-686)를 갖는 단백질, 그의 천연 대립유전자 변이체 및 그의 상동체를 의미한다. 이 서열은 1개 이상의 펩타이드 사슬의 형태로, 예컨대 천연 인간 단백질의 중쇄 및 경쇄와 같이 2개의 사슬로 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명에서 "MBL-관련 소단백질 (small MBL-associated protein)", "sMAP", "19 kD의 MBL-관련 혈장 단백질" 또는 "MAp19"라는 용어는 천연 인간 sMAP (SEQ ID NO:11)의 아미노산 서열 1-185 (시그널 펩타이드를 가질수도 갖지 않을 수도 있음, 예컨대 아미노산 서열 16-185)를 갖는 단백질, 그의 천연 대립유전자 변이체 및 그의 상동체를 의미한다.
본 발명에서 "변이체" 또는 "변이체들"이라는 용어는 서열 SEQ ID NO:1을 갖는 피콜린-관련 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로서 단, 1개 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환 및/또는 1개 이상의 아미노산이 결실 및/또는 1개 이상의 아미노산이 그 폴리펩타이드에 삽입(insertion) 및/또는 1개 이상의 아미노산이 그 폴리펩타이드에 부가(addition)된 것을 가리키는 것이다. 이러한 부가는 N-말단 또는 C-말단 또는 양말단 모두에서 일어날 수 있다. 이 정의에서의 "변이체" 또는 "변이체들"은 기능적 활성 역시도 보유하는 것이다. 몇 가지 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1와 70%의 서열 동일성을 갖는다. 몇 가지 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 95%의 서열 동일성을 갖는다.
몇 가지 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4의 서열과 70%의 서열 동일성을 갖는다. 몇 가지 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4의 서열과 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4의 서열과 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4의 서열과 95%의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에서 "기능성 변이체", "기능성 절단형 버젼 (functional truncated versions)", 및 "기능성 유도체"라는 표현은 SEQ ID NO:1의 변이체, 절단형 버젼 및 유도체를 칭하는 것으로서, 단, SEQ ID NO:1의 필수적인 서열 부분을 포함하고 적어도 보체 활성 및/또는 세린 프로테아제 활성 없이 피콜린 또는 MBL에 대한 결합을 놓고 MASP-1 또는 MASP-3과 경쟁할 수 있는 능력을 적어도 갖는 것들을 가리킨다. 피콜린-관련 폴리펩타이드는 변이체 및/또는 절단형 및/또는 유도체의 두 가지 모두로부터 선택되는 두 가지 또는 세 가지 특성을 가질 수 있다.
피콜린-관련 폴리펩타이드의 기능성 변이체는 본 발명에서 설명된 분석법으로 시험할 때 동일한 종류의 세포에서 생산되는 야생형 FAP의 특이 활성의 적어도 약 25%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 90%를 나타낸다.
본 발명에서 "면역학적 단편(immunologic fragment)"이라는 용어는 기본적으로 동일한 기능 활성을 가지며 항체에 의해 인식될 공간 배향 역시 동일한 아미노산 서열 단편을 가리킨다. 따라서, 특이적인 항체는 해당 폴리펩타이드와 그의 면역학적 단편 양자 모두에 결합할 것이다.
본 발명에서 "또 다른 아미노산(another amino acid)"이라는 용어는 해당 위치에 자연적으로 존재하는 아미노산과는 다른 하나의 아미노산을 의미한다. 여기에는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있는 아미노산이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 몇 가지 구체예에서 상이한 아미노산은 천연적으로 L형이며 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명에서 "유도체(derivative)"라는 표현은 야생형 인간 FAP와 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 나타내는 피콜린-관련 폴리펩타이드를 가리키는 것으로서, 단, 모(parent) 펩타이드의 아미노산의 1개 이상이 예컨대 알킬화, 페길화(PEGylation), 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된 것이다.
본 발명에서 "보체 활성(complement activity)"이라는 용어는 보체계를 활성화시키는 능력을 의미한다. 보체 활성은 "분석법"이라는 제하의 섹션에서 설명되는 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명에서 "만노스-결합 렉틴 (MBL:mannose-binding lectin)"이라는 용어는 만난-결합 렉틴, 만노스-결합 (MBP1), 및 만난-결합 단백질 역시도 의미하며 이 용어들은 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "관련될 수 있는(capable of associating)"이라는 표현은 본 발명에 따른 단백질이 용액 중에서 보체계의 렉틴 경로의 개시제들 중 하나 이상 또는 폴리펩타이드의 효과와 연관될 수 있는 다른 단백질들에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가리킨다.
"구축물(construct)"라는 용어는 목적하는 폴리펩타이드를 코딩하는 완전한 또는 부분적인 자연발생적 뉴클레오타이드 서열에 기초할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 세그먼트를 가리킨다. 구축물은 필요에 따라 다른 폴리뉴클레오타이드 세그먼트를 함유할 수도 있다. 마찬 가지로, "폴리뉴클레오타이드 구축물에 의해 코딩될 수 있는 아미노산"이라는 용어는 전술한 정의를 갖는 폴리뉴클레오타이드 구축물에 의해 코딩될 수 있는 아미노산, 예컨대, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 및 Gln을 포함한다.
본 발명에서 "벡터"라는 용어는 숙주 세포에서 증폭할 수 있는 핵산을 의미한다. 따라서, 벡터는 독자적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체외 물질로서 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드와 같이 염색체 복제와 무관한 복제를 하는 벡터일 수 있다. 또는, 벡터는 숙주 세포로 도입될 경우, 숙주세포 게놈 내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제될 수 있는 것일 수 있다. 벡터는 종종 그 벡터가 도입될 숙주 세포에 따라 달리 선택할 수 있다. 벡터의 비제한적인 예로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 또는 코스미드 벡터를 들 수 있다. 벡터는 대체로 복제 원점과 적어도 한개의 선택가능한 유전자, 즉, 쉽게 검출가능하거나 그의 존재가 세포 성장에 필수적인 생성물을 코딩하는 유전자를 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 구축물 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 몇 가지 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 진핵세포이다. 또 다른 구체에에서, 재조합 숙주 세포는 포유동물로부터 유래한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 CHO 세포, HEK 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 "숙주 세포"라는 용어는 그 안에서 이종 DNA가 발현될 수 있는 하이브리드 세포를 비롯, 모든 세포를 말한다. 전형적인 숙주 세포의 비제한적인 예로는 곤충 세포, 효모 세포, 예컨대 BHK, CHO, HEK 및COS 세포와 같이 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포를 들 수 있다. 본 발명을 실시하는데 있어서, 배양되는 숙주 세포는 좋기로는 포유동물 세포, 더욱 좋기로는 수립된 포유동물 세포, 예컨대 CHO (예컨대, ATCC CCL 61), COS-1 (예컨대, ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장(BHK) 및 HEK293 (예컨대, ATCC CRL 1573; Graham 외, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 세포주를 들 수 있다. 바람직한 BHK 세포주는 tk- ts13 BHK 세포주 (Waechter 및 Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982)이며 이하에서 BHK 570 세포라 칭한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)에 수탁번호 CRL 10314로 기탁되어 있다. tk- ts13 BHK 세포주 역시도 ATCC에 수탁번호 CRL 1632로 기탁되어 있다. 기타 적절한 세포주의 비제한적인 예로는, Rat Hep I (쥐의 간암종; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (쥐의 간암종; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포 (Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)를 들 수 있다. 또한 3T3 세포, Namalwa 세포, 골수암종 및 골수암종세포와 다른 세포와의 융합체도 이용가능하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 구축물을 포함 및 발현하는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 구축물을 포함 및 발현하는 트랜스제닉 식물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 폴리뉴클레오타이드 구축물을 포함하는 세포를 상기 폴리뉴클레오타이드 구축물을 발현시키는 조건 하에서 적절한 성장 배지 중에서 배양시킨 다음 얻어진 폴리펩타이드를 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에서 "적절한 배양 배지"라는 용어는 세포 성장 및 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현하는데 필요한 영양분과 기타 성분들을 함유하는 배지를 의미한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 동물에 의해 생산되는 밀크로부터 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하여 이루어지는, 피콜린-관련 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물의 세포를 배양하고 얻어진 식물로부터 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하여 이루어지는, 피콜린-관련 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "치료(treatment)"라는 용어는 조직 손상을 억제 또는 최소화할 목적으로, 염증 및 염증 및 재관류 손상과 같은 부적절한 보체 활성화와 연관된 것으로 예측되는 상태의 예방과 이미 발생된 상태, 예컨대 심근경색 및 뇌졸중과 같은 상태의 조절을 모두 포괄하는 용어이다. 따라서 본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드를 예방적으로 투여하는 것은 "치료"에 포함된다.
본 발명에서 "대상자(subject)"라 함은 동물, 특히 포유동물, 예컨대 인간을 의미하며 적절하다면 "환자"와 상호 호환적으로 사용된다.
"서열 동일성 (sequence identity)"이라는 용어는 본 발명이 속한 기술 분야에 알려진 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열들을 비교함으로써 결정되는 바와 같은 서열간의 관계를 가리킨다. 본 발명이 속한 기술분야에서, "동일성"이라는 용어는 핵산 분자들간 또는 폴리펩타이들 간의 서열 관련도를 의미하며, 예를 들면 2개 이상의 뉴클레오타이드 잔기 또는 2개 이상의 아미노산 잔기 스트링 간에 매치되는 수에 따라 결정된다. "동일성"은 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉 "알고리듬")에 의해 수행되는 갭 정렬(존재하는 경우) 2개 이상의 보다 적은 서열들 간에 동일한 매치가 일어나는 백분율을 측정하는 것이다.
"유사성(similarity)"이라는 용어 역시 관련된 개념이지만 "동일성"과는 대조적으로, 동일한 매치와 보존적 치환 매치 양자를 포괄하는 서열 관계를 칭하는 것이다. 예컨대 만일 2개의 폴리펩타이드 서열 (분율 (10/20))이 동일한 아미노산 서열을 갖고 나머지는 모두 비보존적으로 치환되면, 동일성 백분율과 유사성 백분율은 두 가지 모두 50%이다. 만일, 동일한 예에서, 보존적 치환이 일어난 위치가 5개 더 있다면, 동일성 백분율은 그대로 50%이지만, 유사성 백분율은 75% (분율 (15/20))이 될 것이다. 따라서, 보존적 치환이 존재할 경우 두개의 폴리펩타이드들 간의 유사성 정도는 이들 두 개의 폴리펩타이드 간의 동일성 백분율보다 높을 것이다.
SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 대한 보존적 변형체 (및 인코딩 뉴클레오타이드에 대한 상응하는 변형체)는 자연발생적인 FAP의 기능화 화학적 특성과 유사한 기능 및 화학적 특성을 갖는 피콜린-관련 폴리펩타이드를 생산할 것이다. 이와 대조적으로, (a) 예컨대 시트상 배열 또는 나선형 배열과 같은 치환된 영역에서의 분자 골격, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크성을 유지하는데 있어서 그들의 효과가 유의적으로 상이한, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에 있어서의 치환을 선택함으로써 피콜린-관련 폴리펩타이드의 기능 및/또는 화학적 특성의 실질적 변형을 달성할 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기를, 해당 위치에서의 아미노산 잔기의 극성이나 전화에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 비천연 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 당해 폴리펩타이드 중의 천연 잔기를 이전에 "알라닌 스캐닝 돌연변이" (예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이에 관하여 논의하고 있는 MacLennan 외, 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki 외, 1998, Adv. Biophys. 35:1-24를 참조)에 설명된 바와 같이 알라닌으로 치환시킬 수도 있다.
목적하는 아미노산 치환(보존적이건 비보존적이건)은 그러한 치환이 요망될 때 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 설명된 피콜린-관련 폴리펩타이드의 중요한 잔기를 동정하거나 또는 피콜린-관련 폴리펩타이드의 치화성을 증감시키고자 할 때 아미노산 치환을 이용할 수 있다.
자연발생적인 잔기들은 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 다음의 여러 가지 클래스로 분류된다:
1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중립 친수성(neutral hydrophilic): Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 방향성에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
예컨대, 비보존적 치환은 이들 클래스들 중 어느 하나의 멤버를 다른 클래스의 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이와 같이 치환된 잔기들은 비인간 피콜린-관련 폴리펩타이드와 상동적인(homologous) 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드의 영역 내로 도입되거나 또는 그 분자의 비상동적 영역으로 도입될 수 있다.
이러한 변화를 일으킴에 있어서, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산에는 그들의 소수성과 전하특성에 기반하여 다음과 같은 소수친수 지수가 할당된다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
어떤 단백질에 생물학적 상호 기능을 부여하는 아미노산의 소수친수 지수의 중요성은 기술 분야에 널리 알려져 있다 Kyte 외, J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). 어떤 아미노산은 유사한 소수친수 지수 또는 점수를 가지면서 유사한 생물학적 활성을 그대로 보유하는 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 알려져 있다. 소수친수 지수에 기초한 변화를 만드는데 있어서, 그의 소수친수 지수가 .±2 이내인 아미노산을 치환하는 것이 바람직하며, 더욱 좋기로는 소수친수 지수가 ±1 이내, 특히 좋기로는 ±0.5 이내인 아미노산을 치환하는 것이 특히 바람직하다.
유사한 아미노산들의 치환을 소수성에 기초해서 효과적으로 수행할 수 있음이 잘 알려져 있으며, 특히, 본 발명의 경우와 같이, 면역학적 구체예에 사용될 목적으로 생물학적으로나 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩타이드를 만들려고 하는 경우 더욱 그러하다. 인접하는 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 어떤 단백질의 국지적인 최대 평균 친수성은 면역원성과 항원성, 즉 그 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다.
다음의 친수성 값들이 아미노산 잔기 별로 배당되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 ('3.0); 아스파테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초해서 변형시키고자 하는 경우, 그의 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산을 치환하는 것이 바람직하며, 더욱 좋기로는 친수성 값이 ±1 이내, 더더욱 좋기로는 친수성 값이 ±0.5 이내인 것이 가장 좋다. 당업자라면 친수성에 기초해서 주요 아미노산 서열로부터 에피토프를 동정할 수도 있을 것이다. 이러한 영역들은 또한 "에피토프 코어 영역"이라 칭하기도 한다.
당업자라면 기술 분야의 공지 기술을 이용하여 SEQ ID NO:1에 제시된 바와 같인 폴리펩타이드의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 활성을 파괴하지 않으면서 교체될 수 있는 분자의 적절한 영역을 동정하기 위해, 활성에 중요하지 않을 것으로 여겨지는 부위를 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, 동종 또는 다른 종으로부터 유사한 활성을 갖는 유사한 폴리펩타이드가 알려진 경우, 당업자는 피콜린-관련 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 그러한 유사한 폴리펩타이드와 비교해 볼 수 있다. 이러한 비교를 이용하여, 당업자는 유사한 폴리펩타이드들 간에 보존된 분자들의 잔기와 부분들을 동정할 수 있다. 이러한 유사한 폴리펩타이드에 상대적으로 보존되지 않는 피콜린-관련 폴리펩타이드의 영역들을 교체하는 것은 피콜린-관련 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 나쁜 영향을 덜 미치게 될 것이다. 당업자라면 또한, 비교적 보존된 영역에서조차, 활성을 유지하면서 자연발생적인 잔기 대신 화학적으로 유사한 아미노산을 치환할 수 있을 것이다(보존적 아미노산 잔기 치환). 따라서, 생물학적 활성이나 구조적 측면에서 중요한 영역인 경우에도 생물학적 활성을 파괴하거나 또는 폴리펩타이드의 구조에 악영향으르 미침이 없이, 보존적 아미노산 치환을 수행할 수 있다.
이에 더해서, 당업자들은 유사한 폴리펩타이드에 있어서 활성이나 구조에 중요한 잔기들을 동정하기 위한 구조-기능 연구를 참조할 수도 있다. 이러한 비교에 비추어서, 당업자들은 유사한 폴리펩타이드에 있어서 활성이나 구조에 중요한 아미노산 잔기들에 상응하는 피콜린-관련 폴리펩타이드에 있어서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자들은 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드들의 이와 같이 예측된 중요한 아미노산 잔기들을 화학적으로 유사한 아미노산들로 치환할 수 있을 것이다.
당업자들은 또한 유사한 폴리펩타이드들 중의 해당 구조와 비교한 아미노산 서열 및 3차원 구조를 분석할 수 있다. 이러한 정보를 참조로, 당업자들은 피콜린-관련 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 그의 3차원 구조와 정렬시켜 예측할 수 있다. 당업자라면 단백질 표면에 있을 것으로 예측된 아미노산 잔기에는 래디칼 변화를 일으키지 않도록 할 것인데, 이는 이러한 잔기는 다른 분자들과의 중요한 상호반응에 관여할 수도 있기 때문이다. 뿐만 아니라, 당업자들은 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 하나의 아미노산 치환을 포함하는 시험 변이체를 만들어낼 수도 있다. 이어서 이러한 변이체를 본 발명에 설명된 활성 분석법으로 스크리닝할 수 있다. 이러한 변이체는 적절한 변이체에 관한 정보를 수집하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 변화가 활성을 파괴하거나, 바람직하지 못하게 감소시키거나 또는 부적절한 활성을 야기하는 것으로 밝혀진 경우, 이러한 변화를 갖는 변이체는 회피될 것이다. 달리 말해서, 이러한 일상적인 실험을 통해 수집된 정보에 기초해서, 당업자들은 단독으로든 다른 돌연변이와의 조합에서든, 그 이상의 추가적인 치환은 회피되어야만 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
과학분야의 몇몇 간행물들은 2차 구조 예측에 집중되어왔다. 예컨대, Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou 외, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou 외, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou 외, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou 외, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou 외, Biophys. J., 26:367-384 (1979) 참조. 뿐만 아니라, 현재에는 2차 구조 예측을 도와주는 컴퓨터 프로그램 역시 이용가능하다. 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링에 기반한다. 예를 들어서, 서열 동일성이 30%가 넘거나, 유사성이 40%가 넘는 2개의 폴리펩타이드 또는 단백질들은 종종 유사한 구조적 위상학을 갖는다. 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 최근의 성장세로 인하여 폴리펩타이드의 구조 또는 단백질 구조 내에서 잠재적인 폴드 수를 비롯하여 2차 구조의 예측능이 향상되었다. 예컨대, Holm 외, Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999) 참조. Brenner 등 (Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997))은 주어진 폴리펩타이드 또는 단백질에는 제한된 수의 폴드가 있고 일단 임계 숫자의 구조가 규명되면, 구조적 예측은 그 정확성이 극적으로 증가할 것이라고 시사한 바 있다.
2차 구조를 예측하는 또 다른 방법으로는 "쓰레딩(threading)"을 들 수 있다 (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl 외, Structure, 4(1):15-9 (1996)), "profile analysis" (Bowie 외, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov 외, Meth. Enzymol., 183:146-159 (1990); Gribskov 외, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), 및 "evolutionary linkage" ( Home, 상기문헌, 및 Brenner, 상기문헌).
관련된 폴리펩타이드의 동일성과 유사성은 공지 방법에 의해 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예로는 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 및 Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., 및 Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo 외, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)에 설명된 것들을 들 수 있다.
동일성 및/또는 유사성을 구하는 바람직한 방법은 검사되는 서열들 간에 매치수를 최대화하도록 고안된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공중이용가능한 컴퓨터 프로그램에 설명되어 있다. 2개의 서열들 간의 동일성과 유사성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램법의 비제한적인 예로는 GCG 프로그램 패키지, 예컨대 GAP (Devereux 외, Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul 외, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))를 들 수 있다. BLASTX 프로그램은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)와 기타 소스가 공중이용가능하도록 제공한 프로그램이다. 잘 알려진 스미스 워터만(Smith Waterman) 알고리듬을 이용하여서도 동일성을 구할 수 있다.
2개 이상의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정의 정렬 계획은 이들 2개의 서열들의 단지 짧은 영역의 매칭만을 결과시킬수 있고, 이러한 작은 정렬 영역은 2개의 전장 서열 간에는 이렇다할 관계가 없는 경우라 할지라도 매우 높은 서열 동일성을 갖는 경우가 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 선택된 정렬법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩타이드의 적어도 50개의 연속 아미노산에 걸친 정렬을 결과시키는 것이다.
예컨대, 컴퓨터 알고리듬 GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)를 이용하여, 서열동일성 백분율을 구하고자 하는 2개의 폴리펩타이드들을 해당 아미노산을 최적 매칭시키도록 정렬시킨다 (알고리듬에 의해 결정된 "매치형 스팬(matched span)"). 갭 오프닝 페널티(3.회 계산됨. 대각선 평균: "대각선 평균(average diagonal)"은 사용된 비교 매트릭스의 대각선의 평균이다; "대각선"은 특정한 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치에 배당된 점수 또는 수이다) 또는 갭 확장 페널티(보통 갭 오프닝 페널티의 {분율(1/10)}배이다), 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스를 알고리듬과 함께 사용한다. 표준 비교 매트릭스 (Dayhoff 외, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff 외, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) for the BLOSUM 62 comparison matrix) 역시도 알고리듬에 의해 이용된다.
폴리펩타이드 서열 비교를 위한 바람직한 변수들은 다음을 포함한다:
알고리듬: Needleman 외, J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: BLOSUM 62 from Henikoff 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992); 갭 페널티: 12, 갭 길이 페널티: 4, 유사성 역치: 0.
GAP 프로그램은 상기 변수들의 경우 유용하다. 전술한 변수들은 GAP 알고리듬을 사용하는 폴리펩타이드 비교 (엔드 갭에 대한 페널티 없음)에 있어서 디폴트 변수들이다.
핵산 서열 비교에 있어서 바람직한 변수들은 다음을 포함한다: 알고리듬: Needleman 외, J. Mol Biol., 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: 매치=+10, 미스매치=0, 갭 페널티: 50, 갭 길이 페널티: 3.
GAP 프로그램은 상기 변수들에 대해 사용하는데도 유용하다. 전술한 변수들은 핵산 비교시 디폴트 변수들이다.
프로그램 매뉴얼, 위스콘신 패키지, 버젼 9, 1997년 7월에 제공된 것을 포함하여 다른 예시적인 알고리듬, 갭 오프닝 페널티, 갭 확장 페널티, 비교 매트릭스, 유사성 역치도 이용가능하다. 당업자들에게는 다음에 어떤 특정한 선택을 하여야 할지 자명할 것이며, 즉, DNA 대 DNA, 단백질 대 단백질, 단백질 대 DNA; 및 이에 더해서, 이러한 비교가 주어진 서열간에 행해지는 것인지(이 경우 GAP 또는 BestFit가 일반적으로 바람직하다) 또는 하나의 서열과 서열의 대형 데이터베이스(이 경우 FASTA 또는 BLASTA가 바람직하다) 사이에 행해지는 지에 따라 적절히 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드의 제조
본 발명은 또한 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 전술한 다른 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드는 재조합 핵산 기술 수단에 의해 생산할 수 있다. 일반적으로, 클로닝된 야생형 FAP 핵산 서열을, 목적하는 단백질을 코딩하도록 변형시킨다. 이 변형된 서열을 이어서 발현 벡터 내로 삽입하고, 이를 숙주 세포 내로 형질전환 또는 형질감염시킨다. 숙주세포로는 고등한 진핵 세포, 특히 배양된 포유동물 세포가 바람직하다. 인간 FAP의 완전한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 나타내었다.
여러 가지 기술에 의해 아미노산 서열 교체를 실시할 수 있다. 핵산 서열 변형은 위치-특이적인 돌연변이에 의할 수 있다. 위치-특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis)는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대, Zoller 및 Smith (DNA 3:479-488, 1984) 또는 "Splicing by extension overlap", Horton 외, Gene 77, 1989, pp. 61-68에 설명되어 있다. 따라서, FAP의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 이용하여, 선택된 변형(들)을 도입시킬 수 있다. 마찬 가지로, 당업자에게는 특이적인 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 DNA 구축물을 제조하는 방법이 잘 알려져 있다 (PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA 참조).
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 자연발생적인 것이 아닌 아미소나 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 비자연발생적인 아미노산의 비제한적인 예로는 베타-알라닌, 데스아미노히스티딘, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, 3차-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 들 수 있다. 비자연발생적인 아미노산 잔기를 폴리펩타이드에 통합시키는 방법들이 기술 분야에 몇 가지 알려져 있다. 예컨대, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 이용하여 넌센스 돌연변이를 억압하는 시험관내 시스템을 이용할 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화하기 위한 방법이 기술 분야에 알려져 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 E. coli S30 추출물 및 시판되는 효소 및 기타 시약들을 포함하는 무세포계에서 수행한다. 폴리펩타이드는 크로마토그래피에 의해 정제한다. 예컨대, Robertson 외, J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman 외, Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung 외, Science 259:806-9, 1993; 및 Chung 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993) 참조. 두번째 방법에서는, 돌연변이된 mRNA와 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNAs를 마이크로주입함으로써 제노푸스 난모세포에서 번역을 실시한다 (Turcatti 외, J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). 세번째 방법에서는, 대체하고자 하는 천연 아미노산(예컨대 페닐알라닌)은 부재하고, 목적하는 비자연발생적인 아미노산(들) (예컨대, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)은 존재하는 환경에서 E. coli 세포를 배양한다. 자연발생적인 아미노산 대신 비자연발생적인 아미노산을 해당 폴리펩타이드 내로 통합시킨다. 예컨대, Koide 외, Biochem. 33:7470-6, 1994 참조. 자연발생적인 아미노산 잔기는 시험관내 화학 변형에 의해 비자연발생적인 종들로 변환될 수 있다. 화학적 변형을 위치-특이적 돌연변이와 조합시켜 치환의 범위를 확장시킬 수 있다(Wynn 및 Richards, 단백질 Sci. 2:395-403, 1993).
본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 적절하게는 게놈 기원 또는 cDNA 기원일 수 있으며, 예를 들어, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제작하고 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하여 혼성화시킴으로써 당해 폴리펩타이드를 완전히 또는 부분적으로 코딩하는 DNA 서열을 스크리닝함으로써 수득한다 (Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).
피콜린-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 구축물 역시도 수립된 표준법, 예컨대 Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869에 설명된 포스포아미다이트법, 또는 Matthes 외, EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805에 의해 설명된 방법과 같은 방법에 의해 합성될 수 있다. 포스포아미다이트법에서는, 올리고뉴클레오타이드를 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성하고, 정제, 및 어닐링시킨 다음 라이게이션시켜서 적절한 벡터 내로 클로닝시킨다. 본 발명의 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열들 역시도 예컨대 US 4,683,202, Saiki 외, Science 239 (1988), 487 - 491, 또는 Sambrook 외 (상기문헌)에 설명된 바와 같은 특이적인 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄반응으로 제조할 수 있다.
나아가, 핵산 구축물은 표준 기술에 따라 전체 핵산 구축물의 다양한 부분들에 상응하는 단편, 합성 또는 게놈성 또는 cDNA 기원(적절하다면)의 단편들을 접합함으로써 제조된, 합성 및 게놈의 혼합식, 합성 및 cDNA의 혼합식 또는 게놈 및 cDNA 기원의 혼합식일 수 있다.
핵산 구축물은 좋기로는 DNA 구축물인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드들을 생산하는데 사용되는 DNA 서열들은 일반적으로 적절한 후번역 프로세싱 및 숙주세포로부터의 분비를 위해 FAP의 아미노 말단에서 프리-프로 폴리펩타이드를 일반적으로 코딩할 것이다.
본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열을 일반적으로 재조합 벡터(아무 벡터여도 무방함) 내로 삽입하고 이어서 재조합 DNA 공정을 실시한다. 벡터의 선택은, 도입시키고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 따라서, 벡터는 독자적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체외 물질로서 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드와 같이 염색체 복제와 무관한 복제를 하는 벡터일 수 있다. 또는, 벡터는 숙주 세포로 도입될 경우, 숙주세포 게놈 내로 통합되어 이것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제될 수 있는 것일 수 있다.
벡터는 본 발명의 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사를 위해 필요한 부가적인 세그먼트에 작동적으로 링크되는, 발현 벡터인 것이 바람직하다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나 또는 엘리먼트 또는 두 가지 모두를 함유할 수 있다. "작동적으로 링크된(operably linked)"이라는 용어는 당해 세그먼트가 그의 의도한 목적, 예컨대 프로모터에서 전사가 개시되어 그 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행하는 것과 같이 기능하도록 그 세그먼트가 배열된 것을 가리킨다.
본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 발현하는데 사용되는 발현 벡터들은 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사체를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 것이면 어떤 DNA 서열이든 무방하며 해당 숙주 세포에 동종 또는 이종인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유도될 수 있다.
포유동물 세포에서 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA의 전사를 지시하는데 적합한 프로모터의 예로는 SV40 프로모터 (Subramani 외, Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Palmiter 외, Science 222 (1983), 809 - 814), CMV 프로모터 (Boshart 외, Cell 41:521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 메이저 후기 프로모터 (Kaufman 및 Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)를 들 수 있다.
곤충 세포에서 사용하는데 적합한 프로모터의 예로는 폴리헤드린 프로모터 (US 4,745,051; Vasuvedan 외, FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), P10 프로모터 (J.M. Vlak 외, J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), 오토그래파 캘리포니카 폴리에드로시스 바이러스 염기성 단백질 프로모터 (EP 397 485), 배큘로바이러스 직속 조기 유전자 1 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162,222), 또는 배큘로바이러스 39K 지연형-조기 유전자 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162,222)를 들 수 있다.
효모 숙주세포에서 사용하기에 적합한 프로모터의 예로는 효모의 해당(glycolytic) 유전자 (Hitzeman 외, J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber 및 Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434) 또는 알코올 데히드로게나제 유전자 (Young 외, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender 외, eds.), Plenum Press, New York, 1982), 또는 TPI1 (US 4,599,311) 또는 ADH2-4c (Russell 외, Nature 304 (1983), 652 - 654) 프로모터를들 수 있다.
필라멘트형 진균 숙주세포에 사용되기에 적절한 프로모터의 예로는 ADH3 프로모터 (McKnight 외, The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) 또는 tpiA 프로모터를 들 수 있다. 다른 유용한 프로모터의 예로는 A. oryzae TAKA 아밀라제, 리조뮤코 미에헤이 아스파틱 프로테이나제, A. niger 중립 알파-아밀라제, A. niger 산 안정성 알파-아밀라제, A. niger 또는 A. awamori 글루코아밀라제 (gluA), 리조뮤코 미에헤이 리파제, A. oryzae 알칼라인 프로테아제, A. oryzae 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 A. nidulans 아세트아미다제를 코딩하는 유전자로부터 유래된 것들을 들 수 있다. 바람직한 것은 TAKA-아밀라제 및 gluA 프로모터이다. 적절한 프로모터가 예컨대 EP 238 023 및 EP 383 779에 설명되어 있다..
본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열 역시도 필요하다면, 적절한 터미네이터, 예컨대, 인간 성장 호르모노 터미네이터 (Palmiter 외, Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 TPI1 (Alber 및 Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) 또는 ADH3 (McKnight 외, The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) 터미네이터에 작동적으로 연결될 수 있다. 발현 벡터는 또한 프로모터 하류 그리고 FAP서열 자체에 대한 삽입 위치로부터 상류에 일련의 RNA 스플라이스 자리를 함유할 수도 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 자리는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 얻을 수 있다. 발현 벡터에는 또한 삽입 위치의 하류에 위치한 폴리아데닐화 시그널이 함유될 수 있다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 시그널은 SV40 (Kaufman 및 Sharp, ibid.)으로부터의 조기 또는 후기 폴리아데닐화 시그널, 아데노바이러스 5 Elb 영여으로부터의 폴리아데닐화 시그널, 인간 성장 호르몬 유전자 터미네이터 (DeNoto 외 Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) 또는 인간 FAP 유전자 또는 소의 FAP 유전자로부터의 폴리아데닐화 시그널을 들 수 있다. 발현 벡터는 또한 프로모터와 RNA 스플라이스 자리 사이에 위치하는 아데노바이러스 2 트리파타이트 리더와 같은, 논코딩 바이러스 리더 서열; SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 지향시키기 위해, 분비 시그널 서열 (리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로도 알려짐)을 재조합 벡터 내에 제공할 수 있다. 분비 시그널 서열은 본 발명의 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열 내로 정확한 리딩 프레임 내로 결합된다. 분비 시그널 서열은 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 5' 위치에 공통적으로 위치된다. 분비 시그널 서열은 그 단백질과 정상적으로 연계되거나 또는 다른 분비된 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유도된 것일 수 있다.
효소 세포로부터의 분비를 위해, 분비 시그널 서열은 발현된 본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 세포의 분비 경로 내로 효과적으로 지향시키도록 해주는 시그널 펩타이드를 코딩할 수 있다. 이 시그널 펩타이드는 자연발생적인 시그널 펩타이드 또는 그의 기능성 부분일 수 있으며, 또는 이것은 합성 펩타이드일 수도 있다. 알파-팩터 시그널 펩타이드(US 4,870,008 참조), 마우스의 침샘 아밀라제의 시그널 펩타이드 (O. Hagenbuchle 외, Nature 289, 1981, pp. 643-646 참조), 변형된 카르복실펩티다제 시그널 펩타이드 (L.A. Valls 외, Cell 48, 1987, pp. 887-897 참조), 효모의 BAR1 시그널 펩타이드 (WO 87/02670), 또는 효모의 아스파르틱 프로테아제 3 (YAP3) 시그널 펩타이드(M. Egel-Mitani 외, Yeast 6, 1990, pp. 127-137)가 적절한 시그널 펩타이드인 것으로 밝혀졌다.
효모에서의 효과적인 분비를 위해, 리더 펩타이드를 코딩하는 서열 역시 본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열의 상류 및 시그널 서열의 하류에 삽입될 수 있다. 리더 펩타이드의 기능은 발현된 펩타이드로 하여금 배양 배지로의 분비를 위해 세포질세망으로부터 골지체로, 나아가 분비 소포체(secretory vesicle)로 지향하도록 하는 것이다 (즉, 본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 세포벽을 통하거나 적어도 세포막을 통해 효모 세포의 원형질막 공간 내로 배출시키는 것). 리더 펩타이드는 효모의 알파-팩터 리더일 수 있다 (이것의 사용에 관하여는 예컨대 US 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 및 EP 163 529에 설명되어 있다). 또는, 리더 펩타이드는 합성 리더 펩타이드 일 수 있는데, 이를테면 자연적으로는 발견되지 않는 리더 펩타이드일 수 있다는 의미이다. 합성 리더 펩타이드는 예컨대, WO 89/02463 또는 WO 92/11378에 설명된 바와 같이 구축될 수 있다.
필라멘트상 진균에서 사용되기 위해, 시그널 펩타이드는 아스퍼질러스 sp. 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 코딩하는 유전자, 리도뮤코 미에헤이 리파제 또는 프로테아제 또는 휴미콜라 라누기노사 리파제를 코딩하는 유전자로부터 간편하게 유도될 수 있다. 이 시그널 펩타이드는 좋기로는 A. oryzae TAKA 아밀라제, A. niger 중립 알파-아밀라제, A. niger 산-안정성 아밀라제 또는 A. niger 글루코아밀라제를 코딩하는 유전자로부터 유도되는 것이 좋다. 적절한 시그널 펩타이드는 예컨대 EP 238 023 및 EP 215 594에 개시되어 있다.
곤충 세포에서 사용되기 위하여, 시그널 펩타이드는 인시목의 만두카 섹스타 아디포키네틱 호르몬 전구체 시그널 펩타이드 (US 5,023,328 참조)와 같이, 곤충 유전자(WO 90/05783 참조)로부터 간편하게 유도시킬 수 있다.
본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열, 프로모터 및 임의로 터미네이트 및/또는 분비 시그널 서열을 각각 라이게이션시키고 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내로 삽입시키는데 이용되는 공정은 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).
포유동물 세포들을 형질감염시키고 세포 내로 도입된 DNA 서열을 발현시키는 방법은 예컨대 Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern 및 Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler 외, Cell 14 (1978), 725; Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham 및 van der Eb, Virology 52 (1973), 456; 및 Neumann 외, EMBO J. 1 (1982), 841 - 845에 설명되어 있다.
클로닝된 DNA 서열들을 예컨대 칼슘 포스페이트-매개형 형질감염 (Wigler 외, Cell 14:725-732, 1978; Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham 및 Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) 또는 전기천공법 (Neumann 외, EMBO J. 1:841-845, 1982)에 의해, 배양된 포유동물 세포 내로 도입시킨다. 외인성 DNA를 발현하는 세포를 동정 및 선별하기 위해, 선별가능한 표현형(선별가능한 마커)를 내는 유전자를 일반적으로 목적하는 유전자나, cDNA와 함께 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별가능한 마커로는 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 들 수 있다. 선별가능한 마커는 증폭가능한 선별가능한 마커일 수 있다. 바람직한 증폭가능한 선별가능한 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 서열이다. 선별가능한 마커는Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, 본 발명에 참조 통합됨)에 의해 리뷰된다. 당업자라면 선별가능한 적절한 마커를 쉽사리 선택할 수 있을 것이다.
선별가능한 마커는 목적하는 유전자와 동시에 별도의 플라스미드를 통해 세포 내로 도입할 수도 있고, 또는 동일한 플라스미드 상에 이들을 도입시킬 수도 있다. 동일한 플라스미드를 이용할 경우, 선별가능한 마커와 목적하는 유전자는 서로 다른 프로모터 또는 동일한 프로모터의 조절 하에 있을 수 있는데 후자의 배열은 디시스트로닉 메시지(dicistronic message)를 생성한다. 이러한 유형의 구축물은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Levinson 및 Simonsen, U.S. 4,713,339). 또한 "캐리어 DNA"로 알려진 부가적인 DNA를 세포 내로 도입된 혼합물에 부가하는 것이 유리할 수도 있다.
세포 내로 DNA가 통합된 후, 세포들을 적절한 배양 배지에서 대체로 1-2일간 성장하면서 목적하는 유전자를 발현하기 시작한다. 본 발명에서 "적절한 성장 배지"라는 용어는 목적하는 세포의 성장 및 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드의 발현에 필요한 영향분과 기타 성분들을 함유하는 배지를 의미한다. 이러한 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 본질적으로 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장인자들을 포함한다. 이어서 적절한 방식으로 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 위해 약물 선별을 실시한다. 증폭가능한 선별가능한 마커로 형질감염된 세포의 경우 약물 농도는 클로닝된 서열의 증가된 복제수를 선택하도록 증가됨으로 해서, 발현 수준이 증가된다. 안정하게 형질감염된 세포의 클론들을 목적하는 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드의 발현 여부에 대해 스크리닝한다.
본 발명에 따른 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열이 도입된 숙주 세포는 후번역적으로 변형된 인간 폴리펩타이드를 생산할 수 있으면 어느 세포이든 무방하며, 효모, 진균, 및 보다 고등한 진핵 세포가 여기에 포함된다.
본 발명에 사용하기 위한 포유동물 세포주의 예로는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장(BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573; Graham 외, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 세포주를 들 수 있다. 바람직한 BHK 세포주는 tk- ts13 BHK 세포주 (Waechter 및 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, 본 발명에 참조 통합됨)이며, 이하에서 BHK 570 세포라 칭하기로 한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852)에 수탁번호 CRL 10314로 기탁되어 있다. tk- ts13 BHK 세포주 역시도 ATCC에 수탁번호 CRL 1632로 기탁되어 있다. 이에 더해서, 몇몇 다른 세포주들도 본 발명에서 사용가능하며, 여기에는 Rat Hep I (래트의 간암종; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (래트의 간암종; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) 및 DUKX 세포 (Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)가 포함된다.
적절한 효모 세포의 예로는 사카로마이세스 spp. 또는 쉬조사카로마이세스 spp, 특히 사카로마이세스 세레비지에 또는 사카로마이세스 클루이베리의 균주를 들 수 있다. 효모 세포들을 이종적인 DNA로 형질감염시켜 그로부터 이종적인 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 예컨대 US 4,599,311, US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037,743, 및 US 4,845,075에 설명되어 있으며 이들 문헌 모두 본 발명에 참조되었다. 형질전환된 세포들은 선별가능한 마커, 예컨대 류신과 같은 특정 영양소의 부재 하에 성장하는 능력 또는 공통적인 약물 내성에 의해 측정되는 표현형에 의해 선별된다. 효모에서 사용하기에 바람직한 벡터는 US 4,931,373에 개시된 POT1 벡터이다. 본 발명에 따른 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 코딩하는 DNA 서열은 예컨대 전술한 바와 같은 시그널 서열과 임의로 리더 서열 다음에 올 수 있다. 적절한 효모 세포의 추가적인 예로는 클루이베로마이세스, 예컨대, K. lactis, 한세눌라, 예컨대, H. polymorpha, 또는 피치아, 예컨대 P. pastoris (cf. Gleeson 외, J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; US 4,882,279)를 들 수 있다.
다른 진균 세포의 예로는 필라멘트상 진균, 예컨대 아스퍼질러스 spp., 뉴로스포라 spp., 푸사리움 spp. 또는 트리코더마 spp.를 들 수 있으며, 특히 A. oryzae, A. nidulans 또는 A. niger 균주를 들 수 있다. 단백질 발현을 위한 아스퍼질러스 spp.의 사용은 예컨대 EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438에 설명되어 있다. 예컨대, F. oxysporum의 형질전환은 Malardier 외, 1989, Gene 78: 147-156에 설명되어 있다. 트리코더마 spp.의 형질전환은 예컨대 EP 244 234에 설명되어 있다.
필라멘트상 진균이 숙주세포로 사용될 경우, 재조합 숙주 세포를 얻기 위해숙주의 염색체 내로 DNA 구축물을 통합시킴으로써 간편하게, 본 발명의 DNA 구축물로 형질전환시킬 수 있다. 이러한 통합은 일반적으로 장점으로 여겨지는데 이는 DNA 서열이 세포 내에서 보다 안정하게 유지되는 경향이 있기 때문이다. DNA 구축물을 숙주의 염색체 내로 통합시키는 것은 통상적인 방법, 예컨대 동종 또는 이종 재조합에 의해 수행할 수 있다.
곤충 세포의 형질전환 및 그 안에서의 이종 폴리펩타이드의 생산은 US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397,485에 설명된 바와 같이 실시할 수 있으며, 이들 문헌은 모두 본 발명에 참조되었다. 숙주로서 사용되는 곤충 세포주는 적절하게는 인시목 세포주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포 (US 5,077,214)일 수 있다. 배양 조건은 예컨대 WO 89/01029 또는 WO 89/01028에 설명된 것이 적절하며 또는 전술한 문헌에 설명된 것이 수 있다.
이어서, 전술한 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를, 인간 피콜린-관련 폴리펩타이드를 발현시키는 조건 하에 적절한 영양 배지에서 배양한 다음, 얻어진 펩타이드 전부 또는 일부를 배지로부터 회수할 수 있다. 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 최소 배지 또는 적절한 보충물을 함유하는 복합 배지와 같이, 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 통상적인 모든 배지일 수 있다. 적절한 배지는 시판 공급원으로부터 구득할 수 있으며 또는 간행된 레시피(예컨대, American Type Culture Collection의 카탈로그에 게재된 것)에 따라 직접 제조할 수도 있다. 이어서, 세포에 의해 생산된 인간의 피콜린-관련 폴리펩타이드들을 통상적인 공정에 의해 배지로부터 회수할 수 있으며, 이러한 회수방법의 예로는 원심분리 또는 여과에 의해 숙주 세포를 배지로부터 분리하는 것, 염, 예컨대 황산암모늄에 의해 여액 또는 상등액의 단백질 수성 성분을 침전시키는 것, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 공정에 의해 정제하는 것 등, 목적하는 폴리펩타이드의 종류에 따라 다양하다.
트랜스제닉 동물 기술을 이용하여 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 생산할 수도 있다. 암컷(雌性) 숙주 포유동물의 유선 내에서 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 포유동물의 유선에서 발현 후 이어서 목적하는 단백질을 젖(milk)으로 분비함으로써 다른 소스로부터 단백질을 분리할 때 조우하는 여러 가지 어려움이 극복된다. 젖은 쉽게 수득할 수 있고, 대량으로 이용가능하며, 생화학적으로 잘 특징화되어 있다. 뿐만 아니라, 주요한 유단백질은 젖에 고농도로 존재한다 (일반적으로 약 1 내지 15 g/l).
상업적 관점에서 볼 때, 숙주로서 젖 생산량이 많은 종을 사용하는 것이 당연히 바람직하다. 마우스 및 래트와 같은 작은 동물들을 사용할 수 있지만 (그리고 이론 입증 단계에서도 바람직하다), 비제한적인 예로서 돼지, 염소, 양 및 암소를 비롯한 가축 포유동물을 이용하는 것이 바람직하다. 양이 특히 바람직한데 이는 이 종에 있어서의 과거 트랜스제네시스 역사, 젖 생산량, 비용 및 양젖을 수확하는데 드는 장비의 용이한 이용성 등의 관점에서 양이 특히 유리하기 때문이다 (숙주 종의 선택에 영향을 미치는 인자들을 비교한 문헌으로서 예컨대 WO 88/00239 참조). 일반적으로 이스트 프리스랜드종 양과 같이 낙농 목적으로 육종된 숙주 동물을 선택하거나 또는 후일 트랜스제닉 동물의 육종에 의해 착유용 가축으로 도입하는 것이 바람직하다. 어떤 경우에서든, 알려진, 건강 상태가 양호한 동물을 사용하여야만 한다.
유선에서 발현시키기 위해, 유단백질 유전자로부터의 전사 프로모터를 사용한다. 유단백질 유전자에는 카제인(U.S. 5,304,489 참조), 베타 락토글로불린, 락토알부민 및 유청 산성 단백질을 코딩하는 유전자들이 포함된다. 베타 락토글로불린(BLG) 프로모터가 바람직하다. 양의 베타 락토글로불린 유전자의 경우, 이 유전자의 5' 플랭킹 서열의 근위부의 적어도 406 bp를 일반적으로 사용하며, 5' 플랭킹 서열의 보다 큰 부분, 즉 약 5 kpb 이하가 바람직하고, 5' 플랭킹 프로모터와 베타 락토글로불린 유전자의 논코딩 부위를 포함하여 예컨대 ~ 4.25 kbp DNA 세그먼트를 사용한다 (예컨대 Whitelaw 외, Biochem. J. 286: 31 39 (1992)참조). 다른 종들로부터 유래된 프로모터 DNA의 유사한 단편들 역시도 적절하게 사용가능하다.
베타 락토글로불린 유전자의 다른 영역 역시도 그 유전자의 게놈 대역의 발현을 위해 구축물 내로 통합될 수 있다. 당해 기술분야에서는 일반적으로 인트론을 결여하는 구축물이 예컨대 그러한 DNA 서열을 함유하는 구축물에 비해 잘 발현되지 않는다고 받아들여지고 있다 (예컨대 Brinster 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 840 (1988); Palmiter 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478 482 (1991); Whitelaw 외, Transgenic Res. 1: 3 13 (1991); WO 89/01343; 및 WO 91/02318, 상기 문헌 모두 본 발명에 참조됨). 이 때문에, 가능하다면, 목적하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 천연 인트론의 전부 또는 일부를 함유하는 게놈 서열을 이용하는 것이 선호되며, 이로 인해, 예컨대 베타 락토글로불린 유전자로부터 적어도 일부 인트론을 추가로 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 한 가지 영역은 양의 베타 락토글로불린 유존자의 3' 논코딩 영역으로부터 인트론 스플라이싱과 RNA 폴리아데닐화를 제공하는 DNA 세그먼트이다. 유전자의 천연 3' 논코딩 서열이 치환되는 경우, 이 양의 베타 락토글로불린 세그먼트는 목적하는 단백질이나 폴리펩타이드의 발현 수준을 향상 및 안정화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, FAP 서열의 개시 ATG 코돈을 둘러산 영역을 유(milk) 특이적인 단백질 유전자로부터의 대응하는 서열로 대체시킨다. 이러한 대체는 발현을 증강시키기 위한 잠정적인 조직 특이적 개시 환경을 제공해준다. 전체 FAP 프리 프로 및 5' 논코딩 서열을 예컨대 BLG 유전자의 그것으로 대체시키는 것이 간편하며, 물론 이보다 더 적은 영역으로 대체할 수도 있다.
본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 트랜스제닉 동물에서 발현시키기 위해, FAP를 코딩하는 DNA 세그먼트를 발현 유닛을 생산하는데 필요한 부가적인 DNA 세그먼트에 작동적으로 링크시킨다. 이러한 부가적인 세그먼트에는 전술한 프로모터 뿐만 아니라, 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화를 제공하는 서열도 포함된다. 발현 유닛은 추가로, 변형된 FAP를 코딩하는 세그먼트에 작동적으로 링크된 분비 시그널 서열을 코딩하는 DNA 세그먼트를 포함한다. 이러한 분비 시그널 서열은 자연적인 FAP 분비 시그널 서열일수도 있고 유단백질과 같은 다른 단백질의 그것일 수도 있다 (예컨대, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683 4690 (1986); 및 Meade 외, U.S. 4,873,316 참조, 이들 문헌은 모두 본 발명에 참조되었다).
트랜스제닉 동물에 사용되기 위한 발현 유닛의 구축은, 비록 발현 유닛이 기본적으로 모든 라이게이션 서열에 의해 구축될 수 있기는 하지만, FAP 서열을 부가적인 DNA 세그먼트를 함유하는 플라스미드 또는 파지 벡터 내로 삽입시킴으로써 간편하게 수행한다. 특히 유단백질을 코딩하는 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터를 제공하고 유단백질을 코딩하는 서열을 FAP 변이체의 서열로 대체함으로써; 유단백질 유전자의 발현 조절 서열을 포함하는 유전자 융합체를 제작하는 것이 특히 편리하다. 어떠한 경우든, 플라스미드 또는 기타 벡터에서 발현 유닛을 클로닝함으로써 FAP 서열의 증폭을 용이하게 수행할 수 있다. 증폭은 세균(예컨대 E. coli) 숙주 세포에서 간편하게 수행되므로, 벡터는 일반적으로, 세균 숙주 세포에서 기능하는 복제 원점과 선별가능한 마커를 포함한다. 이어서 선택된 숙주 종의 수정된 난자(조기 단계의 배(embryos)를 포함한다) 내로 발현 유닛을 도입한다. 이종 DNA의 도입은 마이크로주입(예컨대 U.S. Patent No. 4,873,191), 레트로바이러스 감염(Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988)) 또는 배아줄기(ES) 세포를 이용하는 위치 지향형 통합(Bradley 외, Bio/Technology 10: 534 539 (1992)에 의하여 검토됨)과 같은 여러 가지 루트 중 한 가지에 의해 달성할 수 있다. 이어서 난자를 상상임신한 자성(female) 대상자의 난관 또는 자궁 내로 도입하여 임신기간을 채우게 한다. 생식계열에 도입된 DNA를 지니는 자손들은 DNA를 정상적인 멘델 유전 방식으로 그 후손에게 전달할 수 있기 때문에 트랜스제닉 군집이 발달하게 된다. 트랜스제닉 동물을 제조하는 일반적인 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Hogan 외, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons 외, Bio/Technology 6: 179 183 (1988); Wall 외, Biol. Reprod. 32: 645 651 (1985); Buhler 외, Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert 외, Bio/Technology 9: 835 838 (1991); Krimpenfort 외, Bio/Technology 9: 844 847 (1991); Wall 외, J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; 및 GB 87/00458 참조). 외래 DNA 서열을 포유동물 및 그들의 생식 세포 내로 도입하는 기술은 본래 마우스에서 발전된 것이다 (예컨대, Gordon 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980); Gordon 및 Ruddle, Science 214: 1244 1246 (1981); Palmiter 및 Brinster, Cell 41: 343 345 (1985); Brinster 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438 4442 (1985); 및 Hogan 외 (ibid.) 참조). 이 기술들은 후에 보다 큰 동물, 예컨대 가축동물에 사용되도록 적용되었다(예컨대, WO 88/00239, WO 90/05188, 및 WO 92/11757; 및 Simons 외, Bio/Technology 6: 179 183 (1988) 참조). 요약하자면, 트랜스제닉 마우스 또는 가축을 생산하는데 있어서 현재까지 가장 효과적으로 사용되는 루트에서는, 목적하는 DNA의 수백개의 선형 분자들을 수립된 기술에 따라 수정된 난자의 전핵체(pro nuclei)중 하나로 주입하는 것이다. 접합체(zygote)의 세포질 내로 DNA를 주입하는 것도 가능하다.
트랜스제닉 식물의 생산 역시도 이용가능하다. 발현은 일반화될 수도 있고, 덩이줄기와 같은 특별한 기관에 지향될 수도 있다(예컨대, Hiatt, Nature 344:469 479 (1990); Edelbaum 외, J. Interferon Res. 12:449 453 (1992); Sijmons 외, Bio/Technology 8:217 221 (1990); 및 EP 0 255 378 참조).
FAP 정제
본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 세포 배양 배지 또는 젖으로부터 회수할 수 있다. 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들은 비제한적인 예로서 크로마토그래피 (예컨대, 이온교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제) 전기영동 공정 (예컨대, 예비 등전 포커싱(IEF)), 용해도차 (예컨대 황산암모늄 침전), 또는 추출(예컨대 Protein Purification, J.-C. Janson 및 Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)를 비롯한 다양한 공지기술에 의해. 정제될 수 있다. 좋기로는, 이들은 항FAP 항체 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피 기술에 의해 정제되는 것이 좋다. 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 통상적인 화학정제 수단에 의해서 부가적인 정제를 달성할 수 있다. 구연산바륨 침전법을 비로하여 기술분야에 알려진 다른 정제법을 본 발명에 따른 신규한 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 정제하는데 적용할 수 있다. (예컨대, Scopes, R., 단백질 Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982 참조).
치료 목적상, 본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들은 실제로 순수한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 피콜린-관련 폴리펩타이드 및 기타 폴리펩타이드들을 적어도 약 90 내지 95% 균일성으로, 좋기로는 적어도 약 98% 균일성으로 정제하는 것이 바람직하다. 순도는 예컨대 겔 전기영동법 및 아미노-말단 아미노산 시퀀싱에 의해 평가할 수 있다.
"분리된 폴리펩타이드"라는 용어는 (1) 자연적으로 결합된 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질(즉 오염물질)의 적어도 약 50 퍼센트가 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 가리킨다. 좋기로는, 분리된 폴리펩타이드는 실제로 치료적, 진단적, 예방적 또는 연구적 용도를 저해할 수 있는, 자연환경에서 발견되는 기타의 오염성 폴리펩타이드나 기타 오염물질이 실제로 없는 것이 좋다.
본 발명에서 "미생물"이라 함은 세균, 진균, 고세균, 원생생물; 미세 식물 및 동물(예컨대 녹조류 또는 플랑크톤), 플라나리아 및 아메바를 가리킨다. 이 정의에는 병원성 미생물도 포함된다.
분석법
SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅의 일반 공정:
제조업체의 권장에 따라 NuPAGE
Figure 112012013112881-pct00001
시스템(Invitrogen사)를 이용하여 불연속적 완충액과 함께 10% 또는 4-12% (w/v) Bis-Tris 폴리아크릴아미드-겔 상에서 전기영동을 실시하였다. 웨스턴 블라팅은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (PVDF-HyBond, GE-healthcare, Hilleroed, Denmark, cat. no. RPN303F), 2 μg/ml의 바이오틴 표지된 주요 모노클로날 항체 및 PBS, 0.05% 트윈20에서 1:1500으로 희석된 HRP 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(P0397, Dako, Glostrup, Denmark)에 의해 2차로 육안관찰함으로써 실시하였다. 50 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5 중 0.015% H2O2와 아세톤 중 0.04% 3-아미노-9-에틸카르바졸(Sigma-aldrich, Broenby, Denmark, cat. no. A5754-100G)를 이용하여 막을 디벨롭시켰다.
공-면역침전법 (Co-immunoprecipitation):
만노스 결합 렉틴 (MBL) 혈청 복합체의 면역침전: 1 ml의 정상적인 인간 혈청을 TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5)에 1:1로 희석하고 4℃에서 1시간 동안 5μg의 MBL 특이적인 마우스의 모노클로날 항체 Hyb 131-11 (Bioporto, Gentofte, Denmark)과 함께 인큐베이션시켰다.
피콜린-2 혈청 복합체의 면역침전: 0.5 ml의 정상적인 인간 혈청을 TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5)에 1:1로 희석하고 4℃에서 1시간 동안 5μg의 피콜린-2 특이적인 마우스의 모노클로날 항체 Hyb 219(Munthe-Fog L, 외)와 함께 인큐베이션시켰다.
피콜린-3 혈청 복합체의 면역침전: 0.2 ml의 정상적인 인간 혈청을 TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5)에 1:1로 희석하고 4℃에서 5 ㎍의 피콜린-3 특이적 마우스 모노클로날 항체 Hyb 334 (Munthe-Fog L, 외 )와 함께 인큐베이션시켰다.
면역 복합체 침전은 양의 항마우스 IgG 컨쥬게이트된 다이날 비드(dynal beads) (Dynal-Invitrogen, Cat. No. 112.02D)를 이용하여 실시하였다: 혈청 및 주요 항체 (상기한 바와 같음)과 함께 인큐베이션시킨 후, 5 x 107개의 양의 항마우스 컨쥬게이트된 자성 다이날 비드를 첨가하고 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 비드를 자석을 이용하여 분리하고 TBS-트윈-Ca2 + (10 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.05 % 트윈, 5 mM CaCl2, pH 7.5)으로 3회 세척한 다음 마지막으로 SDS-로딩 완충액에서 비등시킨 후, 표지된 모노클로날 항체 mAb-8B3 (MASP-1 및 -3에 의해 공유되는 중쇄/A쇄 상의 에피토프와 반응함)을 이용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅에 의해 분석하였다.
FAP의 면역친화성 정제: 10 mg의 mAb-8B3 (FAP, MASP-1 및 -3에 의해 공유된 중쇄/A쇄 상에서 에피토프와 반응함) 또는 10 mg의 토끼의 폴리클로날 항FAP 항체들을 제조업체(GE-healthcare, Hilleroed, Denmark, cat. no. 17-0430-01)의 권장사항에 따라 CNBr 활성화된 세파로스에 컨쥬게이션시키고 컬럼 상에 충전시켰다.
혈청으로부터의 정제: 150 ml의 정상적인 인간 혈청 풀(pool)을 TBS + 0.5 M NaCl + 10 mM EDTA (10 mM Tris, 640 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.5)와 1:1로 희석시키고 전술한 컬럼 상에 로딩시켰다. 컬럼을 1 L의 TBS + 0.5 M NaCl + 10 mM EDTA로 세척하고 1 ml 분획들을 1 M Glycine-HCl, pH 2.5로 용리시킨 다음 바이오틴 표지된 모노클로날 항체 mAb-8B3을 이용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅에 의해 분석하였다.
재조합 FAP로부터의 정제: 재조합 FAP(rFA)를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO 세포)로부터의 2-3 L의 배양 상등액 (CHO 무혈청 배지로부터/ Gibco-Invitrogen, cat. no. 12651-014)를 전술한 바와 같은 항체 컬럼 상에 로딩시켰다. 컬럼들을 1.5 l의 TBS + 0.5 M NaCl + 10 mM EDTA로 세척하고 1 ml 분획들을 1 M Glycine-HCl, pH 2.5로 용리시켰다. 용리된 분획들을 SDS-PAGE 및 쿠마씨 염색에 의해 분석하였다.
FAP의 재조합 발현: 전장 cDNA가 삽입된 pcDNA5/FRT 벡터 (Invitrogen, cat. no. V6010-20)를 Genscript사 (Genscript, New Jersey, USA)로부터 주문해서 pOG44 벡터(Invitrogen, cat. no. V6005-20)와 함께 CHO Flp-In 세포주 (Invitrogen, cat. no. R758-07)내로 공-형질감염시킨 다음 및 제조업체 (Invitrogen)의 권장 지침에 따라 선별 및 클로닝시켰다. 세포들을 프리스타일 CHO 무혈청 배지 (Invitrogen, cat. no. 12651-014)에서 배양시켜 배양 상등액을 수확하여 분석하였다.
모노클로날 및 폴리클로날 항체의 제조: FAP 특이적 17 C-말단 잔기들의 펩타이드 구축물 (Genscript사로부터 주문함, New Jersey, USA)를, 제조업체 (Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois, USA)의 권장 지침에 따라 시스테인 커플링법을 이용하여 파상풍독소 및 디프테리아 독소 상에서 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르와 함께 커플링시켰다.
마우스 6마리와 토끼 두마리를 각각 3회씩 (14일 간격으로), Al(OH)3 및 Freunds 불완전 아쥬반트 상에 흡착된 25 μg의 항원을 이용하여 면역화시켰다. 폴리클로날 항체의 적정치를 단백질 캐리어에 커플링된 서로 다른 FAP 펩타이드를 이용하여 ELISA로 평가하였다.
폴리클로날 토끼 항혈청 (≒10 ml)을 1차, 2차 및 3차 면역화한지 14일 후에 수확하였다.
2마리의 마우스를 이용하여 모노클로날 항체를 생산하였다. 융합 4일 전에 마우스에게 25 μg의 항원을 정맥주사하였다. 설명된 바와 같이 융합을 실시하였다(Kohler, G. 및 C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497).
서로 다른 단백질 캐리어에 커플링된 펩타이드들에 대한 디퍼렌셜 ELISA 스크리닝에 의해 클론을 선별하였다.
기능성 보체 분석: 피콜린-3 및 MBL 동종접합(homozygous) 결핍 혈청을 이용하여 FAP의 기능을 조사하였다.
피콜린-3 분석: Maxisorp 플레이트(NUNC, Roskilde, Denmark, cat. no. 439454)를 코팅 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.5) 중 4℃에서 12시간 동안 5 μg/ml의 아세틸화된 소혈청 알부민으로 코팅시켰다. 바르비탈/트윈 완충액 (4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4 + 0.05% 트윈) 중에서 4회 블로킹/세척한 후, 재조합 인간 피콜린-3을 500ng/ml I 바르비탈/트윈 완충액 첨가하고 20℃에서 1.5 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 바르비탈/트윈 완충액에서 플레이트를 2회 세척한 후, 재조합 FAP, 인간 MASP-1, -2 또는 -3 무혈청 배지 배양 상등액을 별도 플레이트 상에서 첫번째 디멘젼으로 계단 희석하여 첨가하고 20℃에서 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 바르비탈/트윈 완충액으로 2회 플레이트를 세척한 후, 피콜린-3 또는 MASP-2 결핍 혈청을 플레이트 상에서 2차 디멘젼으로 단계 희석하여 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 바르비탈/트윈 완충액으로 4회 세척한 후 보체 인자 C4를 1:2000으로 희석시킨 인간 C4c(Dako, Glostrup, Denmark cat. no Q0369)에 대한 폴리클로날 토끼 항체와 함께 20℃에서 1시간 인큐베이션시킴으로써 보체 인자 C4의 침착을 측정하고 이어서 4회 세척 단계를 실시한 후 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 돼지 항 토끼 항체(Dako, Glostrup, Denmark cat. no P0399)와 함께 20℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 0.12 ‰ (v/v) H2O2 를 갖는 구연산염 완충액 (35 mM 구연산, 65 mM Na2PO4, pH 5) 중에 용해된 100 ㎕/웰의 오르토-페닐렌-디아민(OPD) (0.4 mg/ml)를 이용하여 플레이트를 디벨로핑시킴으로써 시그널을 수득하였다. 효소 반응을 1 M H2SO4에 의해 중단시키고 광학 밀도 (OD) 수준을 490 nm-650 nm에서 V-max 키네틱-판독기 (Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
만노스-결합 렉틴 분석: Maxisorp 플레이트 (NUNC, Roskilde, Denmark, cat. no. 439454)를 코팅 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.5) 중에서 10 ㎍/ml의 농도의 만난(Sigma-aldrich, Broenby, Denmark, cat. no. M7504-1G)을 이용하여 4℃에서 12시간 동안 코팅시켰다. 바르비탈/트윈 완충액 (4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4 + 0.05% 트윈)에서 4회 블로킹/세척시킨 후, 재조합 인간 만노스-결합 렉틴을 0.5 μg/ml로 I 바르비탈/트윈 완충액에 첨가하고 20℃에서 1.5 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 바르비탈/트윈 완충액에서 플레이트를 2회 세척한 후, 재조합 FAP, 인간 MASP-1, -2 또는 -3 무혈청 배지 배양 상등액을 별도 플레이트 상에서 첫번째 디멘젼으로 계단 희석하여 첨가하고 20℃에서 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 바르비탈/트윈 완충액으로 2회 플레이트를 세척한 후, MBL 또는 MASP-2 결핍 혈청을 플레이트 상에서 2차 디멘젼으로 단계 희석하여 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 플레이트를 바르비탈/트윈 완충액으로 4회 세척한 후 보체 인자 C4를 1:2000으로 희석시킨 인간 C4c(Dako, Glostrup, Denmark cat. no Q0369)에 대한 폴리클로날 토끼 항체와 함께 20℃에서 1시간 인큐베이션시킴으로써 보체 인자 C4의 침착을 측정하고 이어서 4회 세척 단계를 실시한 후 호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 돼지 항 토끼 항체(Dako, Glostrup, Denmark cat. no P0399)와 함께 20℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 0.12 ‰(v/v) H2O2 를 갖는 구연산염 완충액 (35 mM 구연산, 65 mM Na2PO4, pH 5) 중에 용해된 100 ㎕/웰의 오르토-페닐렌-디아민(OPD) (0.4 mg/ml)를 이용하여 플레이트를 디벨로핑시킴으로써 시그널을 수득하였다. 효소 반응을 1 M H2SO4에 의해 중단시키고 광학 밀도 (OD) 수준을 490 nm-650 nm에서 V-max 키네틱-판독기 (Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
유전형 분석: 생물학적 분석법을 이용하여 개체별로 유전형을 분석하는 방식으로 다양한 유전형 분석법을 실시하였다. 다음과 같은 여러 가지 종류의 분석법을 이용할 수 있다:
● 혼성화-기반법
o 다이나믹 대립유전자-특이적 혼성화
o 분자 비이콘
o SNP 마이크로어레이
● 효소-기반법
o 제한 단편 길이 다형성 (Restriction fragment length polymorphism)
o PCR-기반법
o Flap 엔도뉴클리아제
o 프라이머 연장
o 5'-뉴클리아제
o 올리고뉴클레오타이드 리가아제 분석
● DNA의 물리적 특성에 기반한 기타의 증폭후 방법
o 단일가닥 배열 다형성 (Single strand conformation polymorphism)
o 온도 구배 겔 전기영동
o 변성 고성능 액체 크로마토그래피
o 전앰플리콘의 고해상 용융 (High-Resolution Melting of the entire amplicon)
o SNPlex
● 시퀀싱
투여 및 의약 조성물
복합 치료법
본 발명에 정의된 바와 같은 피콜린-관련 폴리펩타이드는 피콜린-1, 2, 3, 및 만노스-결합 렉틴 (MBL)로부터 선택된 1종 이상의 단백질과 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 팩터들을 단일 투여형태로서 공급할 수 있으며 여기서 단일 투여 형태는 두 가지 화합물 모두를 포함하거나 또는 제1 단위 투여형으로서 피콜린-관련 폴리펩타이드 제제와제2 단위 투여형으로서 1종 이상의 다른 화합물 제제를 포함하는 키트-오브-파츠 형태로 공급될 수 있다. 본 발명에서 제1, 제2 또는 제3 등의 단위투여형이라 기재할 때, 이는 선호되는 투여 순서를 가리키는 것이 아니며, 단지 편의 목적에서 단순히 번호를 매기는 것일 뿐이다.
피콜린-관련 폴리펩타이드 및 1종 이상의 다른 화합물 제제를 "동시"에 투여한다 함은 단일 투여형태로 화합물들을 투여하거나, 또는 제1제와 제2제를 투여하되 투여 간격을 15분 이내, 좋기로는 10분 이내, 더욱 좋기로는 5분 이내, 더더욱 좋기로는 2분 이내로 하여 투여하는 것을 의미한다. 어떤 팩터를 먼저 투여해도 무방하다.
"순차(sequential)" 투여라 함은 제1제를 투여하고 나서 15분 이상의 시간 간격을 두고 제2제를 투여하는 것을 의미한다. 이들 2개의 단위 투여형 중 어느 것이든 먼저 투여해도 무방하다. 좋기로는 2 가지 제제 모두를 동일한 정맥 경로로 주사하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 0 mg/ml 내지 1 mg/ml의 혈청/혈장 농도로 존재하는 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 포뮬레이션을 제공하는 것으로서, 여기서 상기 포뮬레이션의 pH는 2.0 내지 10.0인 것ㅇ다. 이 포뮬레이션은 또한 완충액 시스템, 보존제(들), 등장제(들), 킬레이팅제(들), 안정화제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 의약 포뮬레이션은 수성 포뮬레이션, 즉 물을 함유하는 포뮬레이션이다. 이러한 포뮬레이션은 대체로 용액 또는 현탁액이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 의약 포뮬레이션은 수성 용액이다. "수성 포뮬레이션(aqueous formulation)"이라는 용어는 적어도 50% w/w의 물을 함유하는 포뮬레이션으로서 정의된다. 마찬 가지로, "수용액"이라 함은 적어도 50 %w/w 물을 함유하는 용액인 것으로 정의되며, "수성 현탁액"이라는 용어는 적어도 50 % w/w의 물을 함유하는 현탁액으로서 정의된다.
또 다른 구체예에서, 의약 조성물은 동결건조형 포뮬레이션이며, 의사나 환자가 여기에 사용전에 용매 및/또는 희석제를 첨가하여 사용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 의약 조성물은 사전 용해 없이 즉석 사용가능한 건조형 포뮬레이션이다 (예컨대, 동결건조형 또는 분무건조형)
또 다른 측면에서, 본 발명은 피콜린-관련 폴리펩타이드의 수용액, 및 완충액을 함유하는 의약 포뮬레이션에 관한 것으로서, 여기서 상기 피콜린-관련 폴리펩타이드는 혈청/혈장 농도가 0-1 mg/ml 이상이고, 상기 포뮬레이션의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0인 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포뮬레이션의 pH는 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 완충액은 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 구연산염, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙신산염, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 특이적인 완충액 각각은 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 보존제를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 보존제는 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 소듐 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 보존제는 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 보존제는 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 보존제는 5 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 보존제는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특이적인 각각의 보존제는 본 발명의 또 다른 구체예들을 구성한다. 의약 조성물에 있어서 보존제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 간편한 참조자료로 Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포뮬레이션은 등장제를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 등장제는 염(예컨대 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산 (예컨대, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예컨대 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올)폴리에틸렌글리콜 (예컨대 PEG400), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류 또는 수용성 글루칸, 예컨대 프럭토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트리할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로스-Na를 사용할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 당 첨가물은 수크로스이다. 당 알코올은 적어도 1개의 --OH 결합을 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예컨대 만니톨, 소그비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨이 그 예이다. 몇 가지 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 전술한 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액상 제제에 잘 용해되고, 본 발명의 방법을 사용하여 얻어지는 안정화 효과에 악영향을 미치지 않는 한 이들의 사용량은 특히 제한되지는 않는다. 몇 가지 구체예에서, 당 또는 당 알코올 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 등장제는 1 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 등장제는 1 mg/ml 내지 7 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 등장제는 8 mg/ml 내지 24 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 등장제는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 각각의 등장제는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다. 의약 조성물에 있어서의 등장제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이에 관하여는 간편하게Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 포뮬레이션은 킬레이팅제를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 구연산 및 아스파르트산의 염, 이들의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 킬레이팅제는 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 킬레이팅제는 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 킬레이팅제는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재한다. 이들 특이적인 킬레이팅제 각각은 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다. 의약 조성물에 있어서 킬레이팅제의 용도는 당업자에게 잘 알려져 있다. 간편하게 Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 포뮬레이션은 안정화제를 추가로 함유한다. 의약 조성물에 있어서 안정화제의 용도는 당업자에게 잘 알려져 있다. 간편하게 Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은 안정한 액상 의약 조성물인데, 본 발명의 조성물은 그 치료적 활성 성분이 본래 액상 의약 포뮬레이션 중에서 보관하는 동안 응집을 형성할 가능성이 있는 폴리펩타이드를 포함하는 것이다. "응집된 형성(aggregate formation)"이라 함은 용액으로부터 침전되는 가용성 또는 대형의 육안관찰가능한 응집체로서 남아있을 수 있는 올리고머의 형성을 야기하는 폴리펩타이드 분자들 간의 물리적 상호반응을 가리킨다. "보관하는 동안"이라는 표현은 일단 제조된 액상 의약 조성물 또는 포뮬레이션이 대상자에게 즉각적으로 투여되지 않음을 의미하는 것이다. 즉 즉각 투여되기 보다는 제조 후, 보관을 위해 액상으로든 또는 냉동 상태로든 또는 나중에 대상자에게 투여하기에 적합한 액상 또는 기타 형태로 재조성되기 위한 건조 형태로든 포장되는 것을 의미하는 것이다. "건조 형태"라 함은 액상 의약 조성물 또는 포뮬레이션이 냉동 건조(즉, 동결건조; 예컨대, Williams 및 Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59 참조), 분무 건조 (Masters (1991) Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific 및 Technical, Essez, U.K. 참조), pp. 491-676; Broadhead 외 (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler 외 (1994) Pharm. Res. 11:12-20), 또는 공기 건조(Carpenter 및 Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)에 의해 건조되는 것을 의미한다. 액상 의약 조성물의 보관 도중 폴리펩타이드에 의한 응집 형성은 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 악영향을 미쳐서 의약 조성물의 치료 효능 상실을 초래할 수도 이다. 뿐만 아니라, 응집 형성은 폴리펩타이드를 함유하는 의약 조성물을 인퓨젼 시스템으로 투여할 경우, 튜빙, 막 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제를 야기할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 조성물의 보관 도중 폴리펩타이드에 의한 응집 형성을 감소시키는데 충분한 양으로 아미노산 염기를 추가로 함유할 수 있다. "아미노산 염기(amino acid base)"라 함은 아미노산 또는 아미노산의 조합을 가리키는 것으로, 주어진 아미노산이 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 존재하는 것을 말한다. 아미노산들의 조합이 사용된 경우, 아미노산 모두가 그들의 유리 염기 형태로 존재하거나, 이들 모두가 이들의 염 형태로 존재할 수 있으며, 또는 일부는 유리 염기 형태로, 나머지는 염 형태로 존재할 수도 있다. 몇 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용되는 아미노산은 하전된 측쇄, 예컨대 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 및 글루탐산일 수 있다. 특정 아미노산(예컨대, 글리신, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 입체이성질체 (즉, L, D, 또는 DL 이성질체) isomer) 또는 이들 입체이성질체들의 조합도 이들 특정 아미노산이 그의 유리 염기 형태 또는 염 형태로 존재하는 한, 본 발명의 의약 조성물 중에 존재할 수 있다. 몇 가지 구체예에서는, L-입체이성질체가 사용된다. 본 발명의 조성물은 또한 이들 아미노산의 유사체와 함께 조성될 수도 있다. "아미노산 유사체"라 함은 본 발명의 액상 의약 조성물의 보관 도중 폴리펩타이드에 의한 응집 형성을 감소시키는 소망되는 효과를 가져다 주는 자연발생적인 아미노산의 유도체를 가리키는 것으로 한다. 적절한 아르기닌 유사체의 예로는 예컨대, 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 들 수 있고, 메티오닌의 적절한 유사체로는 에티오닌과 부티오닌을, 시스테인의 적절한 유사체로는 S-메틸-L 시스테인을 들 수 있다. 다른 아미노산의 경우에도, 아미노산 유사체를 그들의 유리 염기 형태 또는 염 형태로서 조성물에 도입할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 예방 또는 지연시키는데 충분한 농축물 형태로 사용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 메티오닌 (또는 다른 함황 아미노산 또는 아미노산 유사체)을 첨가하여 치료제로서 작용하는 폴리펩타이드가 산화에 민감한 1종 이상의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩타이드인 경우, 메티오닌 잔기가 메티오닌 설폭사이드로 산화되는 것을 억제할 수 있다. "억제"라 함은 경시적으로 메티오닌 산화종(methionine oxidized species)의 축적을 최소화함을 의미한다. 메티오닌 산화를 억제하면 폴리펩타이드를 적절한 분자 형태로 훨씬 오래 유지시킬 수 있다. 메티오닌의 모든 입체이성질체(L, D, 또는 DL 이성질체) 또는 이들의 조합 역시도 사용가능하다. 그 첨가량은 메티오닌 설폭사이드의 양이 규제 당국이 허용할 수준이 되도록, 메티오닌의 잔기의 산화를 억제하는데 충분한 양이어야 한다. 일반적으로, 이것은 조성물이 메티오닌 설폭사이드를 약 10% 내지 약 30% 이상으로 함유하여서는 아니됨을 의미한다. 대체로, 이것은 첨가된 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비율이 약 1:1 내지 약 1000:1, 예컨대 10:1 내지 약 100:1의 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포뮬레이션은 고분자량 폴리머 또는 저분자량 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 안정화제를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로스 또는 이들의 유도체 (예컨대 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 예컨대 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 함황 물질 및 기타 염류 (예컨대 염화나트륨)일 수 있다. 이들 각각의 안정화제는 본 발명의 또 다른 구체예를 형성한다.
의약 조성물은 또한 치료적 활성 폴리펩타이드의 안정성을 더욱 향상시켜주는 부가적인 안정화제를 함유할 수도 있다. 본 발명에서 특히 유용한 안정화제의 비제한적인 예로는 폴리펩타이드의 메티오닌 산화를 방지해주는 메티오닌 및 EDTA, 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집으로부터 폴리펩타이드를 보호해주는 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 포뮬레이션은 계면활성제를 추가로 함유한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서 계면활성제는 세제, 에톡실화 카스터유, 폴리글리콜화 글리세라이드, 아세틸화 모노글리세라이드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 폴리머(폴록사머, 예컨대 Pluronic
Figure 112015068581873-pct00002
F68, 폴록사머 188 및 407, Triton X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예컨대 알킬화 및 알콕실화 유도체(트윈, 예컨대 Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세라이드 또는 그의 에톡실화 유도체, 디글리세라이드 또는 폴리옥시에틸렌 유도체, 알코올, 글리세롤, 렉틴 및 인지질(예컨대 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 인지질 유도체(예컨대, 디팔미토일 포스파티딘산) 및 리소인지질 유도체(예컨대 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린 및 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕시(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예컨대 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 극성 헤드기의 변형체, 즉 콜린, 에탄올아민, 포스파티딘산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨 및 양하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌 및 글리세로인지질(예컨대 세팔린), 글리세로글리코지질(예컨대 갈락토피라노사이드), 스핑고글리코지질(예컨대 세라미드, 강글리오사이드), 도데실포스포콜린, 달걀 리소레시틴, 푸시딘산 유도체-(예컨대 소듐 타우로-디히드로푸시데이트 등), 장쇄 지방산 및 그의 염 C6-C12(예컨대 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화 유도체, 또는 라이신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 또는 산성 아미노산의 여하한 조합을 포함하는 디펩타이드의 Nα-아실화 유도체, 중성 아미노산과 2개의 하전된 아미노산의 여하한 조합의 트리펩타이드의 Nα-아실화 유도체, DSS (도쿠세이트 소듐, CAS 등록번호[577-11-7]), 도쿠세이트 칼슘, CAS 등록번호 [128-49-4]), 도쿠세이트 포타슘, CAS 등록번호 [7491-09-0]), SDS (소듐 도데실 설페이트 또는 소듐 라우릴 설페이트), 소듐 카프릴레이트, 콜산 또는 그의 유도체, 담즙산 및 그의 염 및 글리신 또는 타우린 컨쥬게이트, 우르소데속시콜산, 소듐 콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-설포네이트) 1가 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제 (예컨대 N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 양이온성 계면활성제 (4급 암모늄 염기) (예컨대 세틸-트리베틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 도데실 β-D-글루코피라노사이드), 에틸렌디아민에 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드를 순차적으로 첨가하여 유도되는 4관능기 블록 코폴리머인 폴록사민 (예컨대 Tetronic's)로부터 선택되거나 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체 또는 그 혼합물로부터 선택될 수 있다. 이들 특이적인 각각의 계면활성제는 본 발명의 또 다른 구체예를 구성한다.
의약 조성물에 있어서 계면활성제의 용도는 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의상, Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 의약 포뮬레이션에는 다른 성분들도 존재할 수 있다. 이러한 부가적인 성분으로는 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 등장성 조절제, 킬레이팅제, 금속 이온, 유질 비히클(oleaginous vehicles), 단백질(예컨대 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터이온(예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘과 같은 아미노산을 들 수 있다. 이러한 부가적인 성분들은 물론 본 발명의 의약 포뮬레이션의 전반적인 안정성에 악영향을 미쳐서는 아니된다.
본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 조성물은 치료를 필요로 하는 환자에게 여러 국소 부위, 예컨대 피부 및 점막, 우회 흡수되는 부분, 예컨대 동맥내, 정맥내, 심장내, 및 흡수와 관련된 부분, 예컨대 피내, 피하, 근육내 및 복강내 등의 경로로 투여될 수 있다.
국소 투여는 화상 또는 기타 피부와 관련된 상태와 연관된 염증을 치료하는 것과 같은 국소적 염증과 관련된 상태를 치료하는데 특히 유리하다. 따라서, 몇 가지 구체예에서, 투여는 국소 투여에 의한다.
몇 가지 특정 구체예에서, 점안액은 예컨대 확산 라멜라 각막염(DLK)와 같은 각막염 등의 눈과 관련된 상태에 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 의약 조성물의 투여는 몇 가지 투여경로, 예컨대 혀, 설하, 볼, 구강내, 경구, 위장내 및 소장내, 경비, 폐, 예컨대 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합, 표피, 피내, 경피, 질내, 직장내, 눈, 예컨대 결막, 요관 및 비경구 투여를 통하여 환자에게 실시할 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 다중 에멀젼, 포말, 살브, 페이스트, 반창고, 연고, 정제, 코팅된 정제, 린스, 캡슐, 예컨대, 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌제, 직장용 캡슐, 드롭스, 젤, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안제, 안용 연고, 안용 린스, 질내용 페싸리, 질내 링, 질내 연고, 주사용액, 현장 형성 용액(in situ 형성 용액), 예컨대 현장 겔화, 현장 응고, 현장 침전, 현장 결정화, 인퓨젼 용액 및 임플란트와 같은 몇 가지 투여 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 피콜린-관련 폴리펩타이드의 안정성을 더욱 개선시키고, 생체이용성을 증가시키며, 용해도를 증가시키고, 부작용을 감소시키는 한편, 당업자에게 잘 알려진 장기 치료법을 달성하고, 환자의 순응도를 증진시키며 또는 이들의 조합적인 측면을 달성하기 위해, 추가로 예컨대 공유, 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 약물 캐리어, 약물전달계 및 개량형 약물전달계에 부착되어 조성될 수도 있다. 캐리어, 약물전달계 및 개량형 약물전달계의 비제한적인 예로는 폴리머, 예컨대 셀룰로스 및 유도체, 다당류, 예컨대 덱스트란 및 유도체, 전분 및 유도체, 폴리(비닐 알코올), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 폴리머, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이들의 블록 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 캐리어 단백질, 예컨대 알부민, 겔, 예컨대 열겔화 시스템, 예컨대 당업자에게 익히 알려져 있는 블록 코폴리머 시스템, 미셀, 리포좀, 마이크로스피어, 나노입자, 액정 및 그의 분산물, 지질-수계에서의 거동이 당업자에게 잘 알려져 있는 L2상 및 그의 분산물, 폴리머 미셀, 다중 에멀젼, 자가 유화, 자가 마이크로 유화, 시클로덱스트린 및 그의 유도체, 덴드리머를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 피콜린-관련 폴리펩타이드의 폐 투여를 위한 고체, 반고체, 분말 및 용액상 포뮬레이션으로 유용하며 이 투여 형태는 투여량 계량이 가능한 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 이용하여 투여될 수 있으며, 이들 장치 모두 당업자에게 잘 알려진 것이다.
본 발명의 조성물은 조절형, 지속형, 연장형, 지연형 및 서방형 약물전달계를 위한 포뮬레이션에 사용하는데 특히 유용하다. 더욱 구체적으로, 비제한적인 예로서 본 발명의 조성물은 당업자에게 잘 알려진 바와 같은 비경구 조절방출형 및 지속방출형 시스템(두 가지 시스템 모두 투여량 횟수를 수배 감소시켜준다)에서 유용하다. 더욱 바람직한 것은 피하로 조절방출형 및 지속방출형태로 투여하는 것이다. 본 발명의 범위를 한정함이 없이, 이러한 조절방출 시스템 및 조성물의 예로는 하이드로겔, 유질(oleaginous) 겔, 액정, 폴리머 미셀, 마이크로스피어, 나노입자를 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 유용한 조절방출 시스템을 생산하기 위한 비제한적인 방법의 예로는 결정화, 농축, 공결정화, 침전, 공침, 유화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 분무건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이트화, 상분리, 마이크로스피어 생산을 위한 용매증발, 사출 및 초임계 유체공정을 들 수 있다. 이에 관한 일반적인 내용에 관하여는 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) 및 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation 및 Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)을 참조할 수 있다..
시린지, 임의로 펜형 시린지를 이용한 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥 주사에 의해 비경구 투여를 실시할 수 있다. 별법으로, 비경구 투여는 인퓨젼 펌프에 의해 실시할 수도 있다. 추가의 옵션은 코 또는 폐 스프레이 형태로 피콜린-관련 폴리펩타이드를 투여하기 위한 용액 또는 현탁액일 수 있는 조성물이다. 또 다른 옵션으로, 본 발명에 따른 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 조성물은 주사바늘 없는 주사 또는 팻치, 임의로 이온토포레틱 팻치, 경점막, 예컨대 볼내 투여와 같은 경피 투여에 적합하게 조성될 수도 있다.
"안정화된 포뮬레이션(stabilized formulation)"이라는 용어는 물리적 안정성, 화학적 안정성 또는 이화학적 안정성이 증가된 포뮬레이션을 가리킨다.
본 발명에서 단백질 포뮬레이션의 "물리적 안정성"이라는 용어는 열-기계적 스트레스 및/또는 소수성 표면 또는 계면과 같이 탈안정화되는 계면 및 표면과의 상호반응에 단백질이 노출되는 결과, 단백질의 생물학적 불활성 및/또는 불용성 응집체가 형성되는 경향을 가리키는 것이다. 수성 단백질 포뮬레이션의 물리적 안정성은 적절한 용기(예컨대 카트리지 또는 바이알)에 충전된 포뮬레이션을 다양한 기간 동안 서로 다른 온도에서 기계/물리적 스트레스 (예컨대 교반)에 노출시킨 후 육안 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가한다. 포뮬레이션의 육안 검사는 배경을 어둡게 하여 정밀하게 촛점을 맞춘 조명 하에 실시한다. 포뮬레이션의 탁도 검사는 예컨대 탁도를 0 부터 3 까지 육안 검사 점수를 매겨서 (탁하지 않은 포뮬레이션은 비주얼 점수 0, 일광시 탁도를 나타내는 포뮬레이션은 비쥬얼 점수 3으로 점수 매김) 측정한다. 일광 하에 비주얼 탁도를 나타내면, 단백질 응집과 관련하여 물리적으로 불안정한 것으로 포뮬레이션을 분류한다. 별법으로, 포뮬레이션의 탁조는 당업자에게 잘 알려진 간단한 탁도 측정을 통해 평가할 수도 있다. 수성 단백질 포뮬레이션의 물리적 안정성은 또한 단백질의 입체배열 상태의 프로브 또는 분광제를 이용하여 평가할 수도 잇다. 프로브는 단백질의 비자연적 컨포머(conformer)에 우선 결합하는 소형 분자인 것이 바람직하다. 단백질 구조의 작은 분자상 분광 프로브의 한 가지 예는 Thioflavin T이다. Thioflavin T는 아밀로이드 피브릴을 검출하는데 널리 사용되어온 형광 염료이다. 피브릴이 존재하고 아마도 다른 단백질 입체배열 역시도 존재할 경우, Thioflavin T는 약 450 nm에서 새롭게 여기 상태로 되고 피브릴 단백질 형태에 결합하면 약 482 nm에서 증가된 방출을 나타낸다. 미결합 Thioflavin T는 기본적으로 이들 파장에서는 형광을 나타내지 않는다.
천연에서 비천연 상태로의 단백질 구조의 변화를 탐지하기 위한 프로브로서 다른 소형 분자들도 사용가능하다. 예컨대, 단백질의 노출된 소수성 팻치에 우선적으로 결합하는 "소수성 팻치(hydrophobic patch)" 프로브를 예로 들 수 있다. 소수성 팻치는 일반적으로 천연 상태에서는 단백질 3차 구조 내에 내장되어 있으나, 단백질이 언폴드 또는 변성하기 시작하면 노출되게 된다. 이러한 소형 분자, 분광 프로브의 예로는 방향성, 소수성 염료, 예컨대 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등을 들 수 있다. 기타 븐광 프로브는 금속 아미노산 복합체, 예컨대 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 및 발린 등과 같은 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체를 들 수 있다.
본 발명에서 단백질 포뮬레이션의 "화학적 안정성"이라는 용어는 단백질 구조를 천연 단백질 구조에 비해 생물학적 효능이 감소되고 및/또는 잠재적인 면역원 특성은 증가된 화학적 분해 산물 형태로 만드는, 단백질에 있어서의 화학 공유적 변화를 가리키는 것이다. 천연 단백질의 종류와 특성 및 이 단백질이 노출된 환경에 따라 다양한 화학적 분해 산물이 형성될 수 있다. 화학적 분해를 제거하는 것은 아마도 대부분 완전히 회피되지는 못할 것이며 당업자에게 잘 알려진 단백질 포뮬레이션에서 화학적 분해산물의 양은 보관 및 사용 중 계속 증가하게 마련이다. 대부분의 단백질은 글루타미닐 또는 아스파라지닐 잔기 중의 측쇄 아미드기가 유리 카르복실산으로 가수분해되는 과정인 탈아미드화되는 경향이 있다. 다른 분해 경로는 고분자량의 트랜스포메이션 산물의 형성과 관련이 있는데 여기서는 2개 이상의 단백질 분자가 트랜스아미드화 및/똔느 디설파이드 상호반응을 통해 서로 공유적으로 결합하여 공유결합된 다이머, 올리고머 및 폴리머 분해 산물을 형성하게 된다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). 산화 (예컨대 메티오닌 잔기의 산화의 경우)는 화학적 분해의 또 다른 변종이라 할 수 있다. 단백질 포뮬레이션의 화학적 안정성은 여러 가지 환경 조건 (분해 산물 형성은 종종 예컨대 온도 상승에 의해 가속화될 수 있다)에 노출시킨 후 다양한 시점에서 화학적 분해 산물의 양을 측정함으로써 평가할 수 있다. 각각의 분해 산물의 양은 여러 가지 크로마토그래피 기술을 이용하여 종종 분자 크기 및/또는 전하에 따라 분해 산물을 분리함으로써 측정가능하다 (예컨대 SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC).
따라서, 상기 개략한 바와 같이, "안정화된 포뮬레이션"이라 함은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 이화학적 안정성을 갖는 포뮬레이션을 가리킨다. 일반적으로, 포뮬레이션은 유통기한에 이를 때까지 사용 및 보관시 (권장 사용량과 권장 보관 조건 준수시) 안정하여야 한다.
본 발명의 몇 가지 구체예에서, 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 포뮬레이션은 6주 이상의 사용 기간, 그리고 3년 이상의 보관 기간 동안 안정하다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 포뮬레이션은 4주 이상의 사용 기간, 그리고 3년 이상의 보관 기간 동안 안정하다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 포뮬레이션은 4주 이상의 사용 기간, 그리고 2년 이상의 보관 기간 동안 안정하다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 피콜린-관련 폴리펩타이드를 함유하는 의약 포뮬레이션은 2주 이상의 사용 기간, 그리고 2년 이상의 보관 기간 동안 안정하다.
본 발명의 특정 구체예
전술한 바와 같이 본 발명은 분리된 피콜린-관련 폴리펩타이드 뿐만 아니라 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 그의 변이체 또는 면역학적 단편에 관한 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 실제로 순수하다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 만노스-결합 렉틴(MBL)과 결합할 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 피콜린-1, 피콜린-2, 또는 피콜린-3 중 어느 하나와 결합할 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 C1q, 폐 표면 단백질 SP-A 및/또는 SP-D, 및 세포내 콜라겐-유사 방어 분자, 예컨대 CLL-11 중 어느 하나와 결합할 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 특이 수용체와 같은 특이적인 억셉터 단백질과 결합할 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ NO:3의 아미노산 서열 20-297, 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ NO:1의 아미노산 서열 20-380 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ NO:9의 아미노산 서열 16-296 또는 그의 기능성 변이체를 포함한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SDS-PAGE 상에서 비환원 조건 하에 분자량이 약 40 kDa이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ NO:1의 49 및 178에서 선택된 위치에 상응하는 1개 또는 2개의 아미노산에서 N-링크형 글리코실화된 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 재조합 단백질이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 호모다이머 형태이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 20-380로 이루어진 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 면역학적 단편을 포함하는 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 4, 또는 그의 변이체 또는 면역학적 단편으로 이루어진 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 세포자멸사 중의 세포 및/또는 세포성 드브리스와 같이 죽어가거나 죽은 세포의 식세포 작용을 중개한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 미생물의 식세포 작용을 중개한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 항체이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 탐식 어댑터 단백질(engulfment adapter protein:GULP)과 같은 서열 상동성을 갖는, 다른 단백질과 유사한 활성을 갖는다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자는 SEQ NO:2의 서열과 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하여 이루어진다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 진핵 세포이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 포유동물로부터 기원한다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 CHO 세포, HEK 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 염증, 세포자멸사 및/도는 자가면역과 관련된 증상을 치료하기 위한 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 애디슨병, 자가면역성 용혈빈혈, 자가면역성 갑상선염, 크론병, 그레이브병, 길리안-바레 증후군, 전신홍반루푸스(SLE), 루푸스 신장염, 다발경화증, 중증근무력증, 건선, 원발성 담즙성 간경변, 류마티스성 관절염, 포도막염, 천식, 죽상동맥경화증, I형 당뇨병, 건선, 여러 가지 알레르기와 같은 자가면역 상태를 치료하는데 사용된다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 어프렌디시티스( appendicitis), 소화성 궤양, 위궤양, 십이지장궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성결장염, 위막성 결장염, 급석 결장염, 허혈성 결장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증,담관염, 담낭염, 간염, 크론병, 장염, 위플병, 알레르기, 면역복합질환, 장기 허혈, 재관류 손상, 장기 괴사, 건초열, 패혈증(sepsis), 패혈증(septicemia), 내독소쇼크, 카켁시아, 고열증, 호산구육아종, 육아종증, 사르코이드증, 패혈유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 폐기종, 비염, 폐렴, 뉴모트랜스마이크로스코픽 실리코볼케이노진폐증(pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis), 폐포염, 세기관지염, 인두염, 늑막염, 굴염, 인플루엔자, 호흡성 합포체 바이러스 감염, HIV 감염, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 파종세균혈증, 뎅그열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바증, 포충낭, 화상, 피부염, 피부근염, 일광화상, 두드러기, 사마귀, 팽진반응, 맥관염, 혈관염, 심장내막염, 동맥염, 죽상동맥경화증, 혈전동맥염, 심장막염, 심근염, 심근성 허혈, 결절동맥주위염, 류마티스열, 알츠하이머병, 복강질환, 울혈성 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군, 수막염, 마뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색증, 뇌색전증, 길리암-바레 증후군, 신경염, 신경통, 척수손상, 마비, 포도막염, 관절염증, 아쓰랄지아, 골수염, 근막염, 파젯병, 통풍, 치주병, 류마티스성 관절염, 윤활막염, 중증근무력증, 갑상선염, 전신루푸스홍반증, 굿파스튀르 증후군, 베쳇병, 동종이식거부, 이식대숙주질환, I형 당뇨병, 강직척추염, 버거병, 라이터 증후군 및 호지킨병, 각막염, 2형 당뇨병, 낭성섬유증, 심근경색, 재관류 손상, 발작, 피부근염, 대사성 증후군, 전신염증반응 증후군, 패혈증, 다발장기 부전, 파종성 혈관내 응집, 아나필락시스 쇼크로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 1형 및/또는 2형 당뇨병과 연관된 혈관 합병증 및 신장병증, 뇌수막염, 세균성 패혈증, 복합 말라리아, 비정상적 용혈요독증후군, 용혈요독증후군, 연령관련 황반변성, 발작성 야간혈색뇨증, 뱀독, 화상, 및 장기 이식 합병증
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 장기 허혈, 재관류손상, 장기 괴사, 바술리티스, 심장내막염, 죽상동맥경화증, 혈전정맥염, 심장막염, 심근염, 심근성 허혈, 결절동맥주위염, 류마티스열, 울혈성 심부전, 성인 호흡곤란 증후군, 뇌경색증, 뇌색전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환을 치료하기 위한 것이다. 1형 및/또는 2형 당뇨병과 연관된 신장병 및 혈관성 합병증의 치료에도 이용가능하다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 응혈, 혈전 또는 응고병 관련 질환과 연관된 질환을 치료하기 위한 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 응혈, 혈전 또는 응고병 관련 질환 또는 염증반응 및 만성 혈전색전성 질환 또는 피브린 형성 관련 질환, 예컨대 혈전증과 같은 혈관 질환, 예컨대 깊은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈전증, 관상동맥 우회이식(CABG), 경피경혈관심장동맥확장술(PTCA), 혈소판침착성 발작, 종양성장, 종양 전이, 혈관신생, 혈전용해, 죽상동맥경화증, 재협착, 예컨대 동맥경화증 및/또는 혈관신생에 후속되는 재협착, 염증과 같은 급만성 증상, 패혈증, 패혈증 쇼크, 패혈증, 저혈압, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 전신염증성 반응중후군(SIRS), 파종성 혈관내 응혈이상(DIC), 폐색전증, 병리학적 혈소판 침착, 심근경색을 치료하거나, 또는 혈전 위험이 있는 죽상동맥경화증성 혈관, 말초혈액 전구세포(PBPC) 트랜스플랜테이션에 이은 정맥폐쇄성 질환, 용혈성 요독증후군(HUS), 및 혈전성 혈소판감소자반증(TTP) 및 류마티스열과 관련된 질환에 걸린 포유동물의 예방적 치료에 이용될 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 응고, 혈전성 또는 응고병 관련 질환 또는 염증반응 관련 질환 및 만성 혈전색전 질환 또는 피브린 형성 관련 질환, 예컨대 혈전증과 관련된 혈관 질환, 예컨대 깊은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈전증, 관상동맥 우회이식술(CABG), 경피경혈관심장동맥확장술(PTCA), 혈소판침착성 발작, 종양성장, 종양 전이, 혈관신생, 혈전용해, 죽상동맥경화증, 재협착, 예컨대 동맥경화증 및/또는 혈관신생에 후속되는 재협착, 염증과 같은 급만성 증상, 병리학적 혈소판 침착, 심근경색을 치료하거나, 또는 혈전 위험이 있는 죽상동맥경화증성 혈관, 말초혈액 자손세포(PBPC) 트랜스플랜테이션에 이은 정맥폐쇄성 질환, 용혈성 요독증후군(HUS), 및 혈전성 혈소판감소자반증(TTP) 및 류마티스열과 관련된 질환에 걸린 포유동물의 예방적 치료에 이용될 수 있다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 울혈성 심부전을 앓거나 외과수술중인 환자와 같은 고위험군 환자로 분류된 환자들에 있어서 혈전색전성 합병증의 발병을 에방하기 위한 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 심장과 관련된 의료 상태를 치료하기 위한 것이다.
몇 가지 구체예에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 피콜린-관련 폴리펩타이의 결핍증과 관련된 의료 상태를 치료하기 위한 것이다.
도 1: MASP-1 유전자의 대체 전사. MASP1 유전자의 대체 전사가 간의 cDNA에서 검출되었다. 엑손 6에 위치한 흔한 정방향 프라이머와 엑손 12 (MASP1), 엑손 11 (MASP3), 및 엑손 8a (FAP)에 위치하는 특이적인 역방향 프라이머를 이용하여 MASP1, MASP3, 및 FAP 전사체를 증폭시켰다. MASP1은 500 bp의 단편을, MASP3은 506 bp의 단편을, 그리고 FAP는 309 bp의 단편을 생산하였다.
도 2: MASP1 유전자의 대체 스플라이싱. MASP1은 8a 및 엑손 11의 스플라이싱에 의해 생산되는데 상기 두 가지는 모두 종결 코돈 서열(블랙 박스로 표시함)을 포함한다. MASP1 서열은 엑손 17에 종결 코돈을 함유한다. MASP3은 엑손 8a의 스플라이싱에 의해 생산되며 FAP는 엑손 8a의 스플라이싱이 일어나지 않으면 생산된다. FAP 단백질은 2개의 CUB 도메인, 즉 EFG 도메인과 첫번째 CCP1 도메인을 포함한다.
도 3: FAP 단편의 조직 발현. 클론테크사(Clontech)로부터 구득한 cDNA 패널을 이용하여 MASP-1, MASP3, 및 FAP 유전자의 조직 분포를 조사하였다. MASP-1, MASP-3, 및 FAP 전사체를 흔한 정방향 프라이머와 특이적인 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. GADPH를 레퍼런스 유전자로 사용하였다. 이들 세 가지 유전자들은 간에서 고도로 발현되었으며, 이에 더해, FAP는 심장 조직(흑색 화살표로 표시함)에서 강하게 발현되었다. 뇌, 결장, 전립선, 골격근 및 소장(백색 화살표로 표시함)에서는 FAP 유전자가 약하게 발현되었다.
도 4: MASP-1, MASP-3, 및 FAP의 정렬. MASP-1, MASP-3, 및 FAP의 단백질 서열을 BioEdit 소프트웨어를 이용하여 정렬시켰다. MASP-1 및 MASP-3은 서로 다른 C-말단 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 반면 FAP는 세린 프로테아제 도메인을 전혀 함유하지 않는다. 그 대신, 이 단백질은 C-말단 영역에 17개의 새로운 아미노산을 함유한다.
도 5: FAP의 cDNA 서열 및 대응하는 단백질 서열. cDNA 서열은 윗줄에, 대응하는 단백질 서열은 아랫줄에 나타내었다. 엑손 대역은 흑색 수직선으로 나누었다. MBL/피콜린에 대한 결합에 관여하는 것으로 믿어지는 아미노산들은 담황색 박스로 표시하였다.
도 6: MASP-1 보체 활성화. 인간의 MBL을 증가된 양의 MASP-1과 함께 인큐베이션시켰다. MASP-1 C3 및 C4 보체 단백질 두 가지 모두를 활성화시킬 수 있었다.
도 7: MASP-2 보체 활성화. 인간의 MBL을 증가된 양의 MASP-2와 함께 인큐베이션시켰다. MASP-2는 C3 및 C4 보체 단백질 두 가지 모두를 강력하게 활성화시킬 수 있었다.
도 8: 보체의 MASP-3 억제. 인간의 MBL을 증가된 양의 MASP-3과 함께인큐베이션시켰다. MASP-3은 C3 및 C4 보체 단백질 두 가지 모두의 활성을 억제시킬 수 있었다.
도 9: 면역침전. mAb 항MBL 131-11, 항피콜린-2 클론 219, 및 항피콜린-3 클론 334에 의한 혈청 피콜린/MBL 면역침전. 이어서 다이날(Dynal) 자석 비드 분리, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 및 시그널 항체로서 바이오틴 표지된 항MASP-1/MASP-3 클론 8B3.
도 10: FAP는 아세틸화된 인간 혈청 알부민(AcHSA)과 결합할 때 피콜린과 상호반응한다. AcHSA에 대한 용리된 혈청 피콜린 결합. 시그널 항체로서 바이오틴 표지된 항MASP-1/MASP-3 클론 8B3을 이용하여 웨스턴 블랏.
도 11: MASP-1과 MASP-3 및 r피콜린-2 간의 상호반응에 있어서의 동력학 및 해리상수(Hummelshoej T 외, Mol. Immunol., 2007).
도 12: GULF와 FAP의 17개의 독특한 아미노산의 정렬.
도 13: 만난/MBL ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. 만난으로 코팅된 웰들을 재조합 인간 MBL 존재 또는 부재하에 인큐베이션시킨 다음 MBL 동형접합 결핍 혈청과 함께 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 14: 아세틸화 BSA/피콜린-3 ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. AcBSA로 코팅된 웰들을 재조합 인간 피콜린-3의 존재 또는 부재하에 인큐베이션시킨 다음 피콜린-3 동형접합 결핍 혈청과 함께 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 15: 만난/MBL ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. 만난으로 코팅된 웰들을 재조합 인간 MBL과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-1의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, MBL 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 16: AcBSA/피콜린-3 ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. AcBSA로 코팅된 웰들을 재조합 인간 피콜린-3과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-1의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, 피콜린-3 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 17: 만난/MBL ELISA에 있어서 C4의 보체 활성화. 만난으로 코팅된 웰들을 재조합 인간 MBL과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-2의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, MBL 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 18: AcBSA/피콜린-3 ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. AcBSA로 코팅된 웰들을 재조합 인간 피콜린-3과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-2의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, 피콜린-3 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 19: 만난/MBL ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. 만난으로 코팅된 웰들을 재조합 인간 MBL과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-3의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, MBL 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 20: AcBSA/피콜린-3 ELISA 분석에 있어서 C4의 보체 활성화. AcBSA로 코팅된 웰들을 재조합 인간 피콜린-3과 함께 인큐베이션시키고 이어서 무혈청 배지 배양 상등액으로서 rMASP-3의 계대희석물과 함께 하나의 디멘젼으로 인큐베이션시켰다. 이어서, 피콜린-3 동형접합 결핍 혈청을 두번째 디멘젼으로 계대희석하여 인큐베이션시켰다. 폴리클로날 및 항C4c 항체를 이용하여 C4 침착(deposition)을 측정하였다. 오차 막대는 곡선 상의 각 지점에서 2회 측정시 2배의 표준 편차를 나타낸다.
도 21: FAP, MASP1 및 MASP3의 조직 분포. FAP는 MASP1 및 MASP3에 비해 심장 조직에서 훨씬 많이 발현되었다. FAP는 간에 비해 심장에서 3배나 더 많이 발현되었다. 뿐만 아니라, 간에서 MASP1 및 MASP3에 비해 FAP가 더 많이 발현되는 것으로 관찰되었다. 뇌, 골격근 및 전립선 조직에서도 FAP가 상당히 많이 발현되는 것으로 검출되었다. 이 실험은 두번씩 3회 수행하였다. 평균값의 표준오차를 나타내었다.
도 22: 당해 단백질의 17 FAP 특이적 C-말단 잔기에 대하여 발생된 폴리클로날 마우스 항혈청을 이용한 MAP-1의 면역조직화학적 간 국소화. 대조군 염색은 음성이었다. FAP에 대하여 발생한 몇몇 다른 폴리클로날 항체들(토끼와 쥐)은 동일한 염색 패턴을 나타내었다.
도 23: MAP-1 조직 국소화의 면역조직화학 분석 (OM X10). 좌측 패널은 MAP-1에 대한 mAb(12B11)의 염색 결과를 나타낸다. 우측 패널은 관련 없는 IgG1k mAb을 이용한 이소형 대조군 염색 결과를 나타낸다. (A-B): 심근, (C-D): 골격근, (E-F): 간 시료, (G-H): 대동맥 조직. 최하단의 우측 구석에 있는 막대는 모든 슬라이드에서 50 ㎛를 가리킨다.
도 24: MAP-1 및 MASP-1/3 혈청 복합체의 면역침전. (A) mAb 20C4 (항MAP-1) 및 mAb 8B3 (항MASP-1/3, 공통된 중쇄 상에 에피토프가 있음)를 이용하여 혈청으로부터 MAP-1 및 MASP-1/3을 면역침전시켰다. 환원된 시료들을 전자-블라팅시키고 MAP-1에 대한 pAB 또는 피콜린-3에 대한 바이오티닐화 mAb(FCN334) 또는 MBL에 대한 바이오티닐화 mAb(Hyb 131-1)를 생성시켰다. (B) 각각 1 ml, 300 μl 및 100 μl 혈청으로부터의 MBL (Hyb 131-11), 피콜린-2 (FCN219) 및 피콜린-3 (FCN334)에 대한 mAbs를 이용한 면역침전 (좌측). 대조군은 혈청(sMAP-1)로부터 침전된 MAP-1과 항MAP-1 mAb 20C4를 이용한 배양 상등액으로부터의 rMAP-1(rMAP-1)였다 (우측). MAP-1에 대한 pAb를 프로브로 사용하여, 시료들을 웨스턴 블라팅에 의해 분석하였다.
도 25: MBL 및 피콜린-3 매개형 보체 C4 침착에 미치는 MASP-2 및 MAP-1의 영향. C4에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 C4 침착을 측정하고 이를 OD490-650nm 값으로 나타내었다. 오차 막대는 이중 측정의 표준 편차의 두배를 나타낸다. rMBL, r피콜린-3, rMAP-1 및 rMASP-2의 대략적인 농도를 도면 라벨에 나타내었다. (A) rMBL이 400 ng/ml로 있는 MBL 결핍 혈청을 이용한 만난 코팅된 표면 상의 C4 침착의 재조성. 대조군에는 rMBL을 첨가하지 않았다. (B) rMBL 매개형 C4 침착에 미치는 rMAP-2의 투여량 의존 효과. (C) rMBL 매개형 C4 침착에 미치는 rMAP-1의 투여량 의존 효과. (D) r피콜린-3이 400 ng/ml로 존재하는 피콜린-3-결핍 혈청을 이용한 AcBSA 코팅된 표면 상의 C4 침착의 재조성. 대조군에는 r피콜린-3을 첨가하지 않았다. (E) r피콜린-3-매개형 C4 침착에 미치는 rMASP-2의 투여량 의존 효과. (F) 피콜린-3-매개형 C4 침착에 미치는 rMAP-1의 투여량 의존 효과.
도 26: 순수한 계에서 보체 C4 침착에 미치는 MASP-2 및 MAP-1의 영향. 만난 표면 상의 rMBL을 첫번째 디멘젼으로 rMASP-2의 계대희석물과 함께 예비 인큐베이션시켰다. 이어서 rMAP-1의 계대 희석물을 제2 디멘젼에 적용한 다음 정제된 C4를1 μg/ml로 적용하였다. C4에 대한 pAb를 이용하여 C4 침착을 측정하고 이를 OD490-650nm 값으로 나타내었다. 오차 막대는 2회 측정의 표준 편차의 2배를 나타낸다. rMAP-1 및 rMASP-2의 대략적인 농도를 도면 라벨에 나타내었다.
도 27: rMAP-1의 SDS-PAGE 분석. 좌측은 임뮤노블랏 분석 +/- N-글리코시다제 F 처리군(ENDO-F)를 나타낸다. 우측은 대응하는 쿠마씨 염색을 나타낸다.
도 28A, B. 검정 곡선. A) 정상적인 인간 혈청(pNHS)의 MAP-1 고갈 풀에 적용된 rMAP-1의 2배 계단 희석물 또는 PBS/0.05% 트윈/10 mM EDTA 중에 희석된 rMAP-1의 계단 희석물을 이용하여 mAb 20C4/mAb-8B3 양면 ELISA에 의해 생성된 검정 곡선. 오차 막대는 8회 측정치의 표준 편차의 2배를 나타낸다. B) MAP-1이 고갈된 혈청, 정상적인 인간 혈청 및 rMAP-1로 스파이크된 MAP-1 고갈 혈청의 임모뉴블랏.
도 29A-C. MAP-1 혈청 농도. A) 덴마크인 100명의 혈액 공여자에 있어서 MAP-1의 혈청 농도와 분포 범위. 평균 혈청 수준: 240 ng/ml. 범위: 115-466 ng/ml.; B) MASP-3과 MAP-1 혈청 수준 간의 상관관계.; C) 혈청의 냉동 및 해동 효 과. 혈청을 8 라운드 동안 냉동 및 해동시키고 MAP-1 수준을 각 라운드마다 측정하였다. 오차 막대는 이중 측정의 표준 편차의 2배를 나타낸다.
도 30. A) 100명의 덴마크인 혈액 공여자에 있어서, MAP-1과 MBL, 피콜린-2와 피콜린-3 간의 각각의 연계 수준 (상대적 O.D. 490-650 nm 유닛). P 값은 비변수성 (non-parametric) 투테일드 t-테스트에 의해 구하였다. B) MAP-1 혈청 수준과MBL, 피콜린-2 및 피콜린-3에 대한 상대적인 연계도 간읜 상관관계 (좌측). MBL, 피콜린-2, 및 피콜린-3 혈청 수준과 MAP-1에 대한 상대적인 연계도 간의 상관 관계 (우측). 비변수성 spearman 랭크 상관검사를 이용하여 상관계수 p-값 및 r-값을 구하였다.
도 31A-C. 수크로스 구배 초원심분리. A) 혈청으로부터 수집된 분획들(1-27)에 10-30% 수크로스 밀도 구배를 가하였다. 이 분획들을: MAP-1, MASP-3, MBL, 피콜린-2 및 -3에 대한특이적인 ELISA로 분석하였다. 혈청 IgM (19S) 및 IgG(7S)의 피크가 그래프 정상을 가리켰다. B) 분획 8-23은: MAP-1, MASP-1, MASP-3, sMAP, MASP-2, MBL, 피콜린-2 및 피콜린-3에 대한 임뮤노블라팅에 의하여 분석하였다. C) 분획 1-27은 고정된 아세틸화 BSA (피콜린-3 리간드) 또는 만난 (MBL 리간드) 상에서 외인적으로 적용된 인간의 C4를 활성화시키는 능력에 의하여 분석하였다.
실시예 1
MASP1 유전자의 대체 전사 검색
방법: MASP1의 3 가지 전사 변이체: MASP1, MASP3 및 FAP를 검색하기 위해, 각 변이체에 대한 특이적인 프라이머를 설계하였다. 엑손 6에서 공통 정방향 프라이머(5'-gcacccagagccacagtg-3') 및 특이적인 역방향 프라이머: 엑손 12에서 MASP1 (5'-gccttccagtgtgtgggc-3'), 엑손 11에서 MASP3 (5-gccttccagagtgtggtca-3') 및 엑손 8a에서 FAP (5'-cgatctggagagcgaactc-3')를 이용하여 PCR을 실시하였다 (도 1). PCR 증폭은: 50 ng 간 cDNA (Clontech), 각 프라이머 0.25 μM, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris·HCl, pH 8.4, 및 0.4 유닛의 Platinum Taq DNA 폴리머라제 (Invitrogen)를 함유하는 20-μl volumes 부피로 실시하였다. 다음의 사이클링 변수에 따라 PCR 반응을 수행하였다: 10분94℃, 30 또는 40 사이클(30초94℃, 50초58℃, 90초72℃), 10분72℃. 샘플을 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
결과: MASP1 유전자의 대체 전사체가 간 cDNA에서 검출되었다. 엑손 6에 위치하는 공통 정방향 프라이머 엑손 12(MASP1), 엑손 11 (MASP3), 및 엑손 8a (FAP)에 존재하는 특이적인 역방향 프라이머를 이용하여 MASP1, MASP3, 및 FAP 전사체를 증폭시켰다. MASP1은 500 bp 단편을, MASP3은 506 bp 단편을, 그리고 FAP는 309 bp 단편을 생성하였다.
FAP 단편의 조직 발현
방법: 전술한 것과 동일한 PCR 분석법을 이용하여 시중에서 구입한 인간 조직 cDNA 패널 (Clontech)을 MASP1, MASP3, 및 FAP 발현에 대해 조사하였다. 시료를 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
결과: MASP1, MASP3, 및 FAP 유전자의 조직 분포를 Clontech사로부터 구입한 cDNA 패널을 이용하여 조사하였다 (도 2). MASP1, MASP3, 및 FAP 전사체들을 공통 정방향 프라이머와 특이적 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 레퍼런스 유전자로서 GADPH를 이용하였다. 이들 세 가지 유전자는 모두 간에서 고도로 바현되었고, 이에 더해서, FAP는 심장 조직에서도 강하게 발현되었다(흑색 화살표로 표시함). 뇌, 결장, 전립선, 골격근, 및 소장에서는 FAP 유전자가 약하게 발현되었다 (백색 화살표로 표시함).
100명의 FAPexon8a의 DNA 시퀀싱.
방법:
번역 개시부 ATG에 대해 상대적으로 +44,083 내지 +44,431로부터 스패닝된 MASP1/MASP3/FAP 유전자의 인트론-엑손 경계를 포함하는 엑손 8a의 직접 시퀀싱을, 건강한 100명의 백인으로부터 게놈 DNA 템플릿에 대해 실시하였다. 단일 프라이머 세트(정방향: 5'-ctgttcttcacactggctg-3', 역방향: 5'-ctgctgagatcatgttgttc-3')을 이용하여 단편을 증폭시켰으며, 여기서 정방향 프라이머는 5'-T7 서열(5'-ttatacgactcacta-3')을 포함하였다. 50 ng 게놈 DNA, 0.25μM의 각 프라이머, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris·HCl, pH 8.4, 및 0.4 유닛의 Platinum Taq DNA 폴리머라제 (Invitrogen)를 함유하는 20μl 부피로 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 반응을 다음의 사이클링 변수에 따라 수행하고 [2분94℃, 15 사이클(30초94℃, 60초64℃, 60초72℃), 15 사이클(30초94℃, 60초58℃, 60초72℃), 5분72℃], ABI BigDye 사이클 시퀀싱 터미네이터 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 5'-바이오티닐화된 서열 프라이머를 이용하여 프로토콜에 따라 정방향으로 시퀀싱하였다. 스트렙트아비딘 비드(GenoVision)을 이용하여 PyroMark Vacuum Prep Workstation (Biotage) 상에서 서열 반응물을 정제하였다. ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems) 상에서 서열을 분석하였다. 얻어진 DNA 서열을 BioEdit 소프트웨어를 이용하여 정렬하고, 서열 전기영동도로부터 DNA 다형성을 육안으로 확인하였다.
결과: 모든 서열을 BioEdit 소프트웨어를 이용하여 정렬시켰다. 엑손 8a 또는 엑손-인트론 영역에서 100명의 건강한 대상자들 중 어떠한 유전적 변이도 관찰되지 않았다.
실시예 2
면역침전.
대조군 침전 항체로서 사용된 MASP-1/3의 공통 중쇄에 대해 반응하는 모노클로날 항체인 mAb 8B3 또는 MAp-1 특이적 mAb 20C4 (17 MAP-1 특이적 C-말단 펩타이드에 대해 생성됨)를 이용하여 혈청으로부터의 MAP-1의 특이적 면역침전을 수행하였다. 총 10 ㎍g의 항MAP-1 또는 MASP-1/3 항체를 양의 항마우스 또는 토끼 IgG Dynabeads (M-280, cat. 112.02D/112.04D, Dynal/Invitrogen)에 결합시켰다. 세척단계 후, 비드를 정상적인 인간 혈청(TBS에 1:1로 희석) 풀에 넣고 4℃에서 1시간 동안 회전시키면서 인큐베이션시켰다. 최종 세척단계 후, 비드를 자석을 이용하여 분리한 다음 SDS 로딩 완충액에서 비등시킨 후 MAP-1, MBL, 및 피콜린-3에 대한 항체로 프로브된 웨스턴 블라팅 및 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
전술한 것과 동일한 침전 공정을 MBL에 대한 mAb (Hyb 131-11, Bioporto, Denmark), 피콜린-2에 대한 mAb (FCN219) 및 피콜린-3에 대한 mAb (FCN334)에 대해 실시하였다.
MBL, 피콜린-2 및 -3의 혈청 농도 차이를 상쇄하기 위해, 이들을 각각 1 ml, 300 ㎕ 및 100 ㎕ 혈청에 침전시켰다. 시료들을 MAP-1에 대한 pAb로 프로브된 웨스턴 블라팅 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
면역조직화학.
rMAP-1을 발현하는 CHO 세포를 RPMI+10%을 함유하는 배양 플라스크에서 성장시켰다. 세포들을 80-90% 컨플루언스에서 수확하여 4% 포름알데히드-PBS에서 24시간 동안 고정시킨 후 파라핀에 내장시켰다. 6종의 서로 다른 인간 간 조직과 2개의 서로 다른 심근 조직, 2개의 골격근 조직으로부터의 시료 및 인간 대동맥으로부터 얻은 2개의 시료도 전술한 것과 마찬가지로 고정 및 파라핀에 내장시켰다. Leitz Wetzlar 마이크로톰을 이용하여 5 ㎛ 슬라이스를 얻고 이를 유리 슬라이드상에 장착하고 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다. 전술한 바와 같이 예비 처리하여 분석을 실시하였다. 1차 항체(Primary antibodies)는 MAP-1 특이적인 모노클로날 항체 mAb 12B11 또는 친화성 정제된 단일특이적 토끼 항MAP-1였으며 이들 모두 5 ㎍/ml으로 희석하였다. 이소타입 항체 대조군을 동일한 농도로 조직에 적용시켰다. 2차 항체는 EnVisionTM 항체 (HRP-항마우스 또는 HRP-항토끼, Dako, Glostrup, Denmark)였다. Leica DMLB2 현미경을 이용하여 염색 패턴을 분석하였다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블라팅.
기본적으로 제조업체가 설명한 바에 따라 NuPAGE
Figure 112015068581873-pct00003
시스템(Invitrogen)을 이용하여 불연속 완충액으로 10% 또는 4-12% (w/v) 비스-트리스 폴리아크릴아미드-겔 상에서 전기영동을 실시하였다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 ㎍/ml의 일차 mAb 및 2차 가시화 (HRP 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 (P0397, Dako),1:1500으로 희석됨) 또는 HRP-토끼 항마우스 IgG (PO260, Dako)(PBS, 0.05% Tween20에 1:1000으로 희석됨)을 이용하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다. 50mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 5) 중 3-아미노-9-에틸카르바졸 (Sigma) (아세톤 중 0.04%) 및 0.015% H2O2를 이용하여 막을 디벨로핑시켰다.
보체 활성화 분석.
MBL 및 피콜린-3 매개형 보체 인자 C4 침착에 미치는 MAP-1의 영향을 전술한 바와 같이 평가하였다. 요약하면, 만난 (MBL 리간드) (Sigma-Aldrich M7504) 또는 아세틸화된 소 혈청 알부민 (피콜린-3 리간드)를 Maxisorp ELISA 플레이트에 10μg/ml로 고정시켰다. 세척 후, rMBL 또는 r피콜린-3 (0.4μg/ml)을 첨가하고 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 첫번째 디멘젼으로 rMAP-1 또는 rMASP-2를 1시간 동안 2배 단계희석물로 적용시킨 다음 두번째 디멘젼으로 MBL 똔느 피콜린-3이 결핍된 혈청의 단계 희석물을 37℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. C4 침착을 C4c에 대한 pAb (Q0369, Dako, Glostrup/Denmark)를이용하여 측정하였다.
이에 더하여, 본 발명자들은 순수한 시스템을 이용하여 MAP-1에 의한 MASP-2의 전치를 평가하였다. 전술한 바와 같이 rMBL/만난 매트릭스 상에서 첫번째 디멘젼으로 rMASP-2를 20℃에서 45분간 단계 희석물로 예비 인큐베이션시킨 다음, 두번째 디멘젼으로 rMAP-1의 희석물과 함께 20℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 정제된 C4 (Quidel, CA, USA)를 1 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 37℃에서 45분간 인큐베이션시켰다. 상술한 바와 같이 검사를 실시하였다.
결과.
MAP-1의 피콜린-2, 피콜린-3 및 MBL과의 공침
MAP-1과 MBL 및 피콜린-3과의 가능한 결합 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 항MAP-1 mAb20C4과, MASP-1 및 MASP-3의 공통 중쇄에 대한 mAb (mAb8B3)의 두가지 항체를 이용하여 혈청 복합체를 침전시켰다. 이어서 침전물을 각각 MAP-1, MBL, 및 피콜린-3에 대한 항체로 프로브된 웨스턴 블라팅에 의해 분석하였다. 본 발명자들은 선명한 피콜린-3 공침 밴드를 관찰하였으나, MBL의 약한 밴드 역시도 관찰하였다(도 24A). 샘플들은 웨스턴 블랏에서는 작동하지 않았기 때문에 피콜린-2에 대한 항체들로는 시료를 프로브시키지 않았다. 이어서 본 발명자들은 MBL, 피콜린-2 및 피콜린-3에 대한 mAb를 이용하여 면역공침을 역전시켜 각각 1 ml, 300 ㎕ 및 100 ㎕ 혈청을 침전시키고, 이를 각각 MBL (2 μg/ml), 피콜린-2 (5 μg/ml) 및 피콜린-3 (20 μg/ml)의 혈청 농도로 차이를 조정하였다. 이어서 시료들을 MPA-1에 대한 항체로 프로브된 웨스턴 블라팅에 의해 분석하였다. 뚜렷한 MAP-1 밴드가 피콜린-2 및 -3으로부터의 침전물에서 관찰된 반면, rMAP-1 및 혈청 MAP-1이 대조군 역할을 하는 MBL 침전물에서는 훨씬 약한 밴드가 나타났다. (도 24B).
MAP-1은 렉틴 경로의 보체 활성을 억제한다.
MBL 및 피콜린-3이 결핍된 혈청을 rMBL 및 r피콜린-3과 복합적으로 사용하여 MBL 및 피콜린-3 보체 C4 활성화 활성을 재구성하였다. 만난 및 아세틸화 BSA가 각각 MBL 및 피콜린-3에 대한 리간드로서 사용되었다. rMBL 및 r피콜린-3은 양자 모두 MBL 및 피콜린-3 결핍 혈청에서 각각 C4 침착을 개시할 수 있었다 (도 25A 및 25D). rMASP-2를 적용시키자, 피콜린-3 및 MBL 활성화 경로 양자 모두를 경유하여 C4 침착의 강력한 양성 투여량 의존성 향상이 결과된 반면 (도 25B 및 25E), rMAP-1을 적용시키자 두 가지 경로 모두를 통한 C4 침착이 현저하게 투여량 의존적으로 억제되었다 (도 25C 및 25F).
또한, 본 발명자들은 rMBL, rMASP-2, rMAP-1 및 정제된 C4만을 포함하는 순수한 성분들의 시스템을 이용하여 MASP-2의 MAP-1에 의한 가능한 전치(displacement)를 시도하였다. rMASP-2를 단계 희석물로 만난/rMBL 복합체와 함께 예비-인큐베이션시켰다. 그 후, rMAP-1을 여러 농도로 첨가한 후 정제된 C4를 첨가하였다. rMAP-1을 시스템에 적용하자 C4 침착이 명백히 투여량 의존적으로 억제되었다 (도 26).
실시예 3
신규한 MBL/피콜린 관련 단백질 1 (MAP-1)의 혈청 농도 측정 및 결합 특성.
전장 길이의 태그되지 않은 MAP-1의 재조합 구축물을 만들고 CHO-DG44 세포에서 안정하게 발현시켰다. MAP-1에 대한 특이적 모노클로날 항체가 생성되었다. 또한, 혈청 측정치에 대한 정량적인 MAP-1을 수립하고 혈청 MAP-1과 피콜린-2, -3 및 MBL 사이의 결합 관계를 ELISA 및 밀도구배 분별법에 의해 시험하였다.
재조합 단백질
발현 배지로서 PowerCHO1 무혈청 배지 (Lonza, Vallensbaek/Denmark, www.lonza.com)를 사용한 것을 제외하고, 문헌 설명(Hummelshoj 외, Mol Immunol 44, 401-11, 2007; Larsen 외, J Biol Chem 279, 21302-11, 2004; Ma 외, 2009 J Biol Chem, Oct 9;284(41)) 에 따라 전장 길이의 태그되지 않은 인간 MAP-1의 구축물을 CHO-DG44 세포에서 발현시켰다. 본 발명자들은 전술한 바와 같이 (Skjoedt 외, 2009; Immunobiology, Nov 23) 항체친화성 정제를 이용하여 rMAP-1을 정제하였다. 간략히 설명하면, 15 mg의 항MAP-1 항체 (mAb 20C4)를 기본적으로 Pfeiffer 등의 설명 (Pfeiffer 외, J Immunol Methods 97, 1-9, 1987) 에 따라 CNBr 활성화된 세파로스에 공유적으로 커플링시키고 정제 매트릭스로서 사용하였다. 항MAP-1 컬럼 역시도 혈청으로부터 MAP-1을 고갈시키는데 사용하였다.
모노클로날 항체의 생산은 전술한 바와 같이 실시하였다 (Skjoedt 외, J Biol Chem 285, 8234-43, 2010).
제조업체의 권장에 따라 NuPAGE
Figure 112015068581873-pct00004
시스템(Invitrogen사)를 이용하여 불연속적 완충액과 함께 10% 또는 4-12% (w/v) Bis-Tris 폴리아크릴아미드-겔 상에서 전기영동을 실시하였다. 웨스턴 블라팅은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (PVDF-HyBond, GE-healthcare)을 이용하여 실시하였다. 막을 2 μg/ml의 주요 모노클로날 항체를 이용하여 디벨로핑시키고 1:1500으로 희석된 HRP 컨쥬게이트된 스트렙트아비딘 또는 HRP-토끼 항 마우스IgG (P0397/PO260, Dako, Glostrup/Denmark, www.dako.com)에 의해 기질로서 50mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5 중 0.04% 3-아미노-9-에틸카르바졸 (Sigma-Aldrich, Broendby/Denmark, www.sigmaaldrich.com) + 0.015% H2O2를 이용하여 2차 육안관찰하였다.
권장지침에 따라, 그리고 전술한 바와 같이 (Skjoedt 외, 2009), rMAP-1을 N-글리코시다제-F/ENDO-F (N-글리코시다제-F 탈글리코실화 키트, Roche, Mannheim/Germany, www.roche.com) 로 처리하였다. 생성물을 환원 조건 하에 SDS-PAGE로 분석한 다음 쿠마씨 염색 또는 웨스턴 블라팅을 실시하였다.
항MAP-1 mAb 20C4의 특이성은 이전에 입증된 바 있다(Skjoedt 외, 2010). Maxisorb ELISA 플레이트 (NUNCTM Roskilde/Denmark, www.nuncbrand.com)에 6 μg/ml 의 양으로 고정된 정량적 MAP-1 ELISA 에서 포획 항체로서 mAb 20C4를 이용하였다. 칼리브레이터(rMAP-1 또는 MAP-1 고갈 혈청에서 스파이크된 rMAP-1)의 단계 희석물 또는 공여자 혈청 시료를 PBS + 0.05% Tween20 + 0.5% 소 혈청 및 10 mM EDTA에 적용시켰다. 검출 항체는 3 μg/ml으로 적용되는, 전술된(Skjoedt 외, 2010; Skjoedt 외, 2009) MASP-1, -3 및 MAP-1 의 공통 사슬과 반응하는 바이오틴 표지된 mAb 8B3 항체였다.
피콜린-2 및 -3 혈청 농도를 Munthe-Fog 등 및 Hummelshoj 등의 방법 (Hummelshoj 외, Hum Mol Genet 14, 1651-8, 2005; Munthe-Fog 외, Scand J Immunol 65, 383-92, 2007; Munthe-Fog 외, Mol Immunol 45, 2660-6, 2008)에 따라 측정하고, MBL 및 MASP-3 혈청 농도는 전술한 바와 같이 측정하였다 (Skjoedt 외, 2009).
오르토-페닐렌-디아민(Dako, Glostrup/Denmark)으로 디벨로핑시키고 효소 반응을 권장지침에 따라 1M H2SO4을 이용하여 중단시켰다. 광학밀도 (OD490nm-650nm) 수준을V-max 키네틱-판독기(Molecular Devices, Sunnyvale/CA/U.S)를 이용하여 측정하였다.
MAP-1과 MBL, 피콜린-2과 -3 간의 상대적 결합을 포획 항체(6 μg/ml로 코팅됨)로서 MAP-1 특이적인 mAb20C4를 이용한 것을 제외하고, 기본적으로 전술한 바와 같은 방법(Skjoedt 외, 2009)에 따라 평가하였다. 검출 mAbs는 바이오틴-표지된 FCN-219 (피콜린-2 특이적) 또는 FCN-334 (피콜린-3 특이적) (24-25), 또는 Hyb 131-11이었으며, 이들 모두 2 μg/ml의 양으로 적용시켰다. 전술한 바와 같은 100명의 덴마크인 혈액 공여자로부터의 혈청 시료를 분석하였다.
정상적인 인간 혈청을 수크로스 구배 분리시켰다. 0.75 ml 혈청을 10 mM Tris, 145 mM NaCl, 3 mM CaCl2 및 30 ㎍/ml의 인간 혈청 알부민에 완충된 10-30% 수크로스 구배로 이루어진 40 ml 원심분리 컬럼 상에 로딩시켰다. 로딩된 이 컬럼을, SW28 로터 헤드가 구비된 L70 Beckmann 초원심분리기 중 4℃에서 24시간 동안 진공 하에 150.000 x g로 원심분리시켰다. 1.5 ml 분획을 바닥으로부터 수집하여 다음 항원에 대해 특이적 ELISA 또는 임뮤노 블라팅으로 분석하였다: MAP-1, MASP-1, MASP-2, MASP-3, sMAP, MBL, 피콜린-2 및 피콜린-3. 혈청 IgM (19S) 및 IgG (7S)의 피크들 역시도 평가하여 분자 표면 대 질량 비를 구하였다. 또한 분획들을 외부에서 적용된 C4의 활성 능력에 대해서도 분석하였다. 요약하면, 분획들을 전술한 바와 같이 (Skjoedt 외, 2010) 아세틸화 BSA (피콜린-3 리간드) 또는 만난 (MBL 리간드)로 코팅된 ELISA 플레이트에 단계 희석물로서 적용시킨 다음, 진탕시키면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트들을 세척하고 37℃에서 1시간 동안 1 μg/ml의 정제된 C4와 함께 인큐베이션시켰다. 그 후 C4c (Q 0369, Dako, Glostrup, Denmark)에 대한 폴리클로날 항체들을 이용하여 C4 침착을 측정하였다.
통계분석
통계분석 (Spearman 비변수형 상관, 비변수형 투-테일드 t-test) 및 MAP-1, MBL, 피콜린-2 및 -3 혈청 수준을 Prism4 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., La Jolla/CA/US, www.graphpad.com)를 이용하여 구하였다.
결과
rMAP-1의 정제 및 특징화
150 nM 메토트렉세이트 존재 하에서 rMAP-1은 CHO DG44 세포에서 고도로 발현되었다 (수율: 무혈청 배지 중 10-20 ㎍/ml). 정제 후, rMAP-1을 SDS-PAGE로, 이어서 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색 또는 임뮤노블라팅에 의해 분석하였다. SDS-PAGE/쿠마씨 염색 분석 결과 추정 감소 분자량 ~45 kDa의 밴드가 나타났다 (도 27). rMAP-1을 N-글리코시다제 F로 탈글리코실화시켜 시그널 펩타이드 없이 이론 질량에 상응하는 ~40 kDa로의 분자량 이동이 결과되었다. 이 패턴은 MAP-1에 특이적인 항체를 이용한 임뮤노블라팅에서도 관찰되었다.
MAP-1 혈청 수준
본 발명자들은 정량적 ELISA를 개발하여 MAP-1의 혈청 수준을 측정하였다. 이 분석법은 포획 항체로서 MAP-1 특이적 mAb 20C4와, MASP-1, -3 및 MAP-1의 공통 중쇄를 인식하는 검출 항체(mAb 8B3)에 기초한 것이다. 표쥰곡선을 이용한 공지 농도에서 정제된 rMAP-1 칼리브레이터와 MAP-1 고갈된 혈청 스파이크된 정제된 MAP-1 간에 완전한 유사성이 관찰되었다 (도 28A). 본 발명자들은 100명의 덴마크인 혈액 공여자의 MAP-1의 혈청 수준을 분석하고 115-466 ng/ml 범위에 있어서 평균값240 ng/ml임을 발견하였다 (도 29A). 본 발명자들은 전술한 바와 같이(Skjoedt 외, 2009) 동일 그룹에서 MASP-3 혈청 수준을 측정하고 MAP-1 및 MASP-3 농도를 플로팅하였다 (도 29B). 본 발명자들은 MAP-1과 MASP-3가 비록 동일 유전자로부터 나온 대체 전사체이기는 하지만, 이들의 혈청 농도 간에는 아무런 상관관계도 없음을 발견하였다.
본 발자들은 혈청 중 그리고 냉동-해동 사이클에서의 항원 및 분석 안정성을 평가하였다 (도 29C). 본 발명자들은 냉동-해동 사이클과 관계없이 MAP-1의 평가가 매우 일정함(robust)을 발견하였다.
MAP-1과 피콜린-2, -3 및 MBL 간의 결합
MAP-1과 MBL, 피콜린-2 및 -3 간의 상호반응을 측정하기 위해, 본 발명자들은 포획 항체로서 mAb 20C4를 이용하고 다음과 같은 바이오틴 표지된 mAB, 즉: FCN-219 (피콜린-2 특이적), FCN-334 (피콜린-3 특이적) 또는 Hyb 131-11 (MBL 특이적)들을 이용한 프로빙에 의한 3가지 서로 다른 ELISA 분석법을 개발하였다. 본 발명자들은 MAP-1 측정을 행한 대상자들과 동일한 100명의 혈액 공여자 혈청 시료를 분석하고 MAP-1과 피콜린-2, -3 및 MBL 간의 혈청 결합 수준을 평가한 후 이를 상대적인 O.D. 490-650nm로 나타내었다 (도 30A). 이에 더해서, 본 발명자들은 전술한 바와 같이 MBL, 피콜린-2 및 -3의 혈청 농도를 측정하였다 (Skjoedt 외, 2009).
본 발명자들은 MAP-1가 MBL, 피콜린-2 및 -3과의 복합체로서 존재함을 발견하였다. 그러나, MAP-1의 주요 부분(major part of MAP-1)은 피콜린, 특히 피콜린-3(p<0.0001)에 결합되는 것으로 보이는데, 이 패턴은 MASP-3의 경우 이미 관찰된 것과 같은 패턴이다 (Skjoedt 외, 2009).
본 발명자들은 상대적 결합 수준에 대한 MAP-1, MBL, 피콜린-2 및 -3의 혈청 농도를 플로팅하고 이로부터 MAP-1 및 MBL의 결합이 MBL 수준과 밀접한 관계가 있음을 발견하였다 (Spearman r: 0.92, p<0.0001) (도 30B, 우측 상단). 이와 대조적으로 피콜린-2 및 -3에 대한 MAP-1의 결합은 MAP-1의 혈청 수준과 관련이 있다 (Spearman r: 각각 0.45 및 0.61, p<0.0001, 도 30B 좌측). 비록 본 발명자들은 MAP-1 농도와 MBL에 대한 상대적 결합 및 피콜린-3 농도 간에 어떤 상관관계를 관찰하기는 하였으나, 그 경향은 덜 두드러진 것이었다.
밀도 구배 분획화
결합된 분자들과의 관계에서 MAP-1의 분포를 연구 조사하고 얼마나 많은 것이 결합되지 않은 것으로 나타나는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 정상적인 인간 혈청을 10-30% 수크로스 구배 및 초원심분리를 이용하여 밀도 구배 처리하였다. ㅇ이어서, 수집된 분획들을 ELISA에 의해 MAP-1, MASP-3, MBL, 피콜린-2 및 -3에 대해 분석하고 (도 31A) 및 웨스턴 블라팅에 의해 MAP-1, MASP-1, -2 및 -3, sMAP, MBL, 피콜린-2 및 -3을 분석하였다(도 31B). 그 결과 혈청 오직 MAP-1만이 피콜린과 MBL이 있는 분획 중에 존재하는 것으로 나타났는데, 이는 MAP-1이 비결합 분자로서는 존재하지 않음을 시사하는 것이다. 동일한 패턴이 sMAP, MASP-1, -2 및 -3의 경우에도 관찰되었다. 이에 더해, 이 실험 데이터는 MAP-1, sMAP 및 MASP-1, -2 및 -3의 대다수가 피콜린-3의 피크 분획에서 함께 국소화(co-localize) 됨을 나타내었다. 이러한 분포를 세파덱스-200 컬럼 상에서 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 분자의 균등 분포 패턴이 관찰되었다 (데이터 미제시).
마지막으로, 본 발명자들은 외래적으로 적용된 C4를 활성화시키기 위해 수크로스 구배 분획의 능력을 평가하였다. 고체상 만난과 아세틸화 BSA를 각각 MBL 및 피콜린-3에 대한 리간드로서 이용하였다. 본 발명자들은 수크로스 구배에 의해 분리된 피콜린-3 및 MBL 복합체를 반영하는 2개의 서로 다른 C4 침착 곡선을 관찰하였다 (도 31C).
토의
구조적 측면을 연구하고 신규한 MBL/피콜린 관련 단백질 1 (MAP-1)의 혈청 수준을 수립하기 위해, 본 발명자들은 태그되지 않은 재조합 MAP-1을 발현시키고 이에 대한 특이적인 항체들을 생성시켰다. N-글리코시다제 F 처리 및 SDS-PAGE 분석 결과 MAP-1은 글리코실화되어 N-글리칸 존재시 분자량 ~45 kDa 및 탈글리코실화 후 ~40 kDa이 되고 이는 시그널 펩타이드 없이, 유추된 아미노산 서열로부터 계산된 분자량과 동등한 것으로 나타났다.
본 발명자들은 MAP-1 특이적인 C-말단에 대하여 생성된 모노클로날 항체를 이용하여 정량적 MAP-1 ELISA를 수립하고 100명의 건강한 덴마크 혈액 공여자로부터 혈청 농도 범위를 측정하였다. 본 발명자들은 MASP-3 농도 (평균: 6500 ng/ml)에 비해, 혈청 농도가 비교적 낮음을 발견하였다 (평균: 240 ng/ml, 범위 115-466 ng/ml). 또한, 상기 2종의 단백질과 혈청 농도 사이에는 상관 관계가 없음을 발견하였는데 이는 비록 이들 2종의 분자가 동일 유전자로부터 별도로 스플라이싱된 변이체들이기는 하지만 그 발현 조절은 서로 다르다는 것을 시사하는 것이다. 최근, MASP-1, -3 및 MAP-1의 조직 분포에는 유의적인 차이가 있는 것으로 설명된 바 있다 (Degn 외, 2009; Skjoedt 외, 2010). MASP-3과 MAP-1 간의 혈청 농도에 있어서의 이러한 커다란 차이의 발견은 MASP1 유전자로부터 유래된 전사 변이체들의 상이한 조절 메카니즘에 관한 개념을 더욱 뒷받침해주는 것이다.
본 발명자들은 각각 혈청 MAP-1과 MBL, 피콜린-2 및 -3 간의 상대적 결합을 평가하기 위해 ELISA 기반의 분석법을 개발하였다. 이에 더해서, 본 발명자들은 피콜린-2, -3 및 MBL의 혈청 농도를 측정하여 이들을 상대적 결합 수준과 연관짓고자 하였다. 그 결과, MAP-1은 주로 피콜린-3 및 피콜린-2와 결합되고 MBLdp 대한 상대적 결합은 덜 현저한 것으로 나타났다. 이러한 분포가 MBL, 피콜린-2 및 -3의 평균 혈청 농도 차이를 반영하는 것이라는 반박이 있을 수 있다. 그러나, MBL-MAP-1 결합은 MBL 농도와 상관되어 있기는 하지만 이러한 상관은 MAP-1 혈청 농도가 피콜린-2와의 결합 수준과 상관관계가 있는 피콜린-2의 경우에는 명확치 않다. 피콜린-3과 MAP-1 간의 상대적 결합은 MAP-1 혈청 농도와 고도로 연관되어 있는 반면, 피콜린-3 혈청 농도에 대한 포지티브 관련성은 매우 약하다. 전술한 발견은 MAP-1과 피콜린-2 및 -3 간의 주요 결합은 단지 피콜린-2 및 -3의 농도가 일반적으로 더 높다는데 기인하는 것이 아님을 가리키는 것이다. 이러한 분포 패턴은 혈청을 밀도 구배 분리시키자 더 확실해졌다. 본 발명자들은 MAP-1 뿐만 아니라, sMAP, MASP-1, -2 및 -3 역시도 피콜린-3- 피크 분획과 함께 위치(co-localized)하는 명백한 경향을 발견하였다. 이것은 본 발명자들이 MASP-3과 관련하여 이전에 관찰한 바 있는 현상이다 (Skjoedt 외, 2009). 아세틸화 BSA (피콜린-3 리간드) 및 만난 (MBL 리간드) 상에서 외래적으로 부가된 C4를 활성화시키는 능력에 의해, 피콜린-3 및 MBL 피크 분획의 분리 역시도 평가하였다. 이들 두가지 서로 다른 활성화 표면 상의 C4 침착은 MBL 또는 피콜린-3 복합체를 함유하는 서로 다른 피크 분획을 명백히 설명해주는 것이다.
수크로스 구배 밀도 분석으로부터 얻은 데이터는 또한 표면적 대 질량 비율이 피콜린-2 및 피콜린-3에 비해 MBL의 경우가 더 높다는 것을 가리키는데, 이는 MBL이 4급 구조 (quaternary structure) 상 매우 느슨하고 개방된 배열을 갖는다는 최근의 연구 결과에 따른 관찰을 지지해주는 것이다. 피콜린의 경우 표면적 대 질량비가 더 작은데 이는 MAP-1, sMAP 및 MASPs와 같은 결합된 분자들과의 분자량 분포를 반영하는 것일 수도 있다. 이와 관련하여 MAP-1/sMAP/MASPs에 보다 많이 결합되면 보다 높은 질량과 밀도 구배를 통한 추가 이동을 야기할 것이다.
결론적으로, 본 발명자들은 MAP-1이 MASP-3에 비해 낮은 혈청 농도로 존재한다는 것과 MAP-1이 주로 피콜린과의 복합체 형태로 순환하지만 어느 정도는 MBL과도 복합체를 형성한다는 것을 밝혀내었다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 피콜린-3이 LCP 인식 분자들 중에서도 주요한 MAP-결합 분자임을 입증할 수 있었다.
Figure 112012013112881-pct00005
Figure 112012013112881-pct00006
Figure 112012013112881-pct00007
Figure 112012013112881-pct00008
Figure 112012013112881-pct00009
Figure 112012013112881-pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Rigshospitalet K?enhavns Universitet Syddansk Universitet <120> INHIBITORS OF COMPLEMENT ACTIVATION <130> 17952PCT00 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp 35 40 45 Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asp Gln Val Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gln Thr Pro Gly Gln Glu Val Val Leu Ser Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Val Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 145 150 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 165 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Val Glu Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gln 180 185 190 Arg Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 195 200 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Val 210 215 220 Asn Leu Gln Phe Glu Asp Ile Phe Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Val 225 230 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys Ile Lys Val Gly Pro Lys Val Leu 245 250 255 Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gln Ser 260 265 270 His Ser Val Leu Ile Leu Phe His Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 275 280 285 Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Asn Glu Cys Pro Glu Leu 290 295 300 Gln Pro Pro Val His Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Phe Lys Asp Gln Val Leu Val Ser Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Val Leu 325 330 335 Lys Asp Asn Val Glu Met Asp Thr Phe Gln Ile Glu Cys Leu Lys Asp 340 345 350 Gly Thr Trp Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys Lys Lys Asn Glu Ile Asp 355 360 365 Leu Glu Ser Glu Leu Lys Ser Glu Gln Val Thr Glu 370 375 380 <210> 2 <211> 1143 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaggtggc tgcttctcta ttatgctctg tgcttctccc tgtcaaaggc ttcagcccac 60 accgtggagc taaacaatat gtttggccag atccagtcgc ctggttatcc agactcctat 120 cccagtgatt cagaggtgac ttggaatatc actgtcccag atgggtttcg gatcaagctt 180 tacttcatgc acttcaactt ggaatcctcc tacctttgtg aatatgacta tgtgaaggta 240 gaaactgagg accaggtgct ggcaaccttc tgtggcaggg agaccacaga cacagagcag 300 actcccggcc aggaggtggt cctctcccct ggctccttca tgtccatcac tttccggtca 360 gatttctcca atgaggagcg tttcacaggc tttgatgccc actacatggc tgtggatgtg 420 gacgagtgca aggagaggga ggacgaggag ctgtcctgtg accactactg ccacaactac 480 attggcggct actactgctc ctgccgcttc ggctacatcc tccacacaga caacaggacc 540 tgccgagtgg agtgcagtga caacctcttc actcaaagga ctggggtgat caccagccct 600 gacttcccaa acccttaccc caagagctct gaatgcctgt ataccatcga gctggaggag 660 ggtttcatgg tcaacctgca gtttgaggac atatttgaca ttgaggacca tcctgaggtg 720 ccctgcccct atgactacat caagatcaaa gttggtccaa aagttttggg gcctttctgt 780 ggagagaaag ccccagaacc catcagcacc cagagccaca gtgtcctgat cctgttccat 840 agtgacaact cgggagagaa ccggggctgg aggctctcat acagggctgc aggaaatgag 900 tgcccagagc tacagcctcc tgtccatggg aaaatcgagc cctcccaagc caagtatttc 960 ttcaaagacc aagtgctcgt cagctgtgac acaggctaca aagtgctgaa ggataatgtg 1020 gagatggaca cattccagat tgagtgtctg aaggatggga cgtggagtaa caagattccc 1080 acctgtaaaa aaaatgaaat cgatctggag agcgaactca agtcagagca agtgacagag 1140 tga 1143 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp 35 40 45 Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asp Gln Val Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gln Thr Pro Gly Gln Glu Val Val Leu Ser Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Val Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 145 150 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 165 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Val Glu Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gln 180 185 190 Arg Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 195 200 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Val 210 215 220 Asn Leu Gln Phe Glu Asp Ile Phe Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Val 225 230 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys Ile Lys Val Gly Pro Lys Val Leu 245 250 255 Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gln Ser 260 265 270 His Ser Val Leu Ile Leu Phe His Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 275 280 285 Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala 290 295 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Asn Glu Ile Asp Leu Glu Ser Glu Leu Lys Ser Glu Gln Val Thr 1 5 10 15 Glu <210> 5 <211> 699 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp 35 40 45 Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asp Gln Val Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gln Thr Pro Gly Gln Glu Val Val Leu Ser Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Val Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 145 150 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 165 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Val Glu Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gln 180 185 190 Arg Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 195 200 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Val 210 215 220 Asn Leu Gln Phe Glu Asp Ile Phe Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Val 225 230 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys Ile Lys Val Gly Pro Lys Val Leu 245 250 255 Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gln Ser 260 265 270 His Ser Val Leu Ile Leu Phe His Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 275 280 285 Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Asn Glu Cys Pro Glu Leu 290 295 300 Gln Pro Pro Val His Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Phe Lys Asp Gln Val Leu Val Ser Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Val Leu 325 330 335 Lys Asp Asn Val Glu Met Asp Thr Phe Gln Ile Glu Cys Leu Lys Asp 340 345 350 Gly Thr Trp Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys Lys Ile Val Asp Cys Arg 355 360 365 Ala Pro Gly Glu Leu Glu His Gly Leu Ile Thr Phe Ser Thr Arg Asn 370 375 380 Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Lys Tyr Ser Cys Gln Glu Pro 385 390 395 400 Tyr Tyr Lys Met Leu Asn Asn Asn Thr Gly Ile Tyr Thr Cys Ser Ala 405 410 415 Gln Gly Val Trp Met Asn Lys Val Leu Gly Arg Ser Leu Pro Thr Cys 420 425 430 Leu Pro Val Cys Gly Leu Pro Lys Phe Ser Arg Lys Leu Met Ala Arg 435 440 445 Ile Phe Asn Gly Arg Pro Ala Gln Lys Gly Thr Thr Pro Trp Ile Ala 450 455 460 Met Leu Ser His Leu Asn Gly Gln Pro Phe Cys Gly Gly Ser Leu Leu 465 470 475 480 Gly Ser Ser Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Leu His Gln Ser Leu 485 490 495 Asp Pro Glu Asp Pro Thr Leu Arg Asp Ser Asp Leu Leu Ser Pro Ser 500 505 510 Asp Phe Lys Ile Ile Leu Gly Lys His Trp Arg Leu Arg Ser Asp Glu 515 520 525 Asn Glu Gln His Leu Gly Val Lys His Thr Thr Leu His Pro Gln Tyr 530 535 540 Asp Pro Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ala Leu Val Glu Leu Leu Glu 545 550 555 560 Ser Pro Val Leu Asn Ala Phe Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Glu Gly 565 570 575 Pro Gln Gln Glu Gly Ala Met Val Ile Val Ser Gly Trp Gly Lys Gln 580 585 590 Phe Leu Gln Arg Phe Pro Glu Thr Leu Met Glu Ile Glu Ile Pro Ile 595 600 605 Val Asp His Ser Thr Cys Gln Lys Ala Tyr Ala Pro Leu Lys Lys Lys 610 615 620 Val Thr Arg Asp Met Ile Cys Ala Gly Glu Lys Glu Gly Gly Lys Asp 625 630 635 640 Ala Cys Ala Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Thr Leu Asn Arg Glu 645 650 655 Arg Gly Gln Trp Tyr Leu Val Gly Thr Val Ser Trp Gly Asp Asp Cys 660 665 670 Gly Lys Lys Asp Arg Tyr Gly Val Tyr Ser Tyr Ile His His Asn Lys 675 680 685 Asp Trp Ile Gln Arg Val Thr Gly Val Arg Asn 690 695 <210> 6 <211> 4353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gaagtcagcc acacaggata aaggagggaa gggaaggagc agatcttttc ggtaggaaga 60 cagattttgt tgtcaggttc ctgggagtgc aagagcaagt caaaggagag agagaggaga 120 gaggaaaagc cagagggaga gagggggaga ggggatctgt tgcaggcagg ggaaggcgtg 180 acctgaatgg agaatgccag ccaattccag agacacacag ggacctcaga acaaagataa 240 ggcatcacgg acaccacacc gggcacgagc tcacaggcaa gtcaagctgg gaggaccaag 300 gccgggcagc cgggagcacc caaggcagga aaatgaggtg gctgcttctc tattatgctc 360 tgtgcttctc cctgtcaaag gcttcagccc acaccgtgga gctaaacaat atgtttggcc 420 agatccagtc gcctggttat ccagactcct atcccagtga ttcagaggtg acttggaata 480 tcactgtccc agatgggttt cggatcaagc tttacttcat gcacttcaac ttggaatcct 540 cctacctttg tgaatatgac tatgtgaagg tagaaactga ggaccaggtg ctggcaacct 600 tctgtggcag ggagaccaca gacacagagc agactcccgg ccaggaggtg gtcctctccc 660 ctggctcctt catgtccatc actttccggt cagatttctc caatgaggag cgtttcacag 720 gctttgatgc ccactacatg gctgtggatg tggacgagtg caaggagagg gaggacgagg 780 agctgtcctg tgaccactac tgccacaact acattggcgg ctactactgc tcctgccgct 840 tcggctacat cctccacaca gacaacagga cctgccgagt ggagtgcagt gacaacctct 900 tcactcaaag gactggggtg atcaccagcc ctgacttccc aaacccttac cccaagagct 960 ctgaatgcct gtataccatc gagctggagg agggtttcat ggtcaacctg cagtttgagg 1020 acatatttga cattgaggac catcctgagg tgccctgccc ctatgactac atcaagatca 1080 aagttggtcc aaaagttttg gggcctttct gtggagagaa agccccagaa cccatcagca 1140 cccagagcca cagtgtcctg atcctgttcc atagtgacaa ctcgggagag aaccggggct 1200 ggaggctctc atacagggct gcaggaaatg agtgcccaga gctacagcct cctgtccatg 1260 ggaaaatcga gccctcccaa gccaagtatt tcttcaaaga ccaagtgctc gtcagctgtg 1320 acacaggcta caaagtgctg aaggataatg tggagatgga cacattccag attgagtgtc 1380 tgaaggatgg gacgtggagt aacaagattc ccacctgtaa aattgtagac tgtagagccc 1440 caggagagct ggaacacggg ctgatcacct tctctacaag gaacaacctc accacataca 1500 agtctgagat caaatactcc tgtcaggagc cctattacaa gatgctcaac aataacacag 1560 gtatatatac ctgttctgcc caaggagtct ggatgaataa agtattgggg agaagcctac 1620 ccacctgcct tccagtgtgt gggctcccca agttctcccg gaagctgatg gccaggatct 1680 tcaatggacg cccagcccag aaaggcacca ctccctggat tgccatgctg tcacacctga 1740 atgggcagcc cttctgcgga ggctcccttc taggctccag ctggatcgtg accgccgcac 1800 actgcctcca ccagtcactc gatccggaag atccgaccct acgtgattca gacttgctca 1860 gcccttctga cttcaaaatc atcctgggca agcattggag gctccggtca gatgaaaatg 1920 aacagcatct cggcgtcaaa cacaccactc tccaccccca gtatgatccc aacacattcg 1980 agaatgacgt ggctctggtg gagctgttgg agagcccagt gctgaatgcc ttcgtgatgc 2040 ccatctgtct gcctgaggga ccccagcagg aaggagccat ggtcatcgtc agcggctggg 2100 ggaagcagtt cttgcaaagg ttcccagaga ccctgatgga gattgaaatc ccgattgttg 2160 accacagcac ctgccagaag gcttatgccc cgctgaagaa gaaagtgacc agggacatga 2220 tctgtgctgg ggagaaggaa gggggaaagg acgcctgtgc gggtgactct ggaggcccca 2280 tggtgaccct gaatagagaa agaggccagt ggtacctggt gggcactgtg tcctggggtg 2340 atgactgtgg gaagaaggac cgctacggag tatactctta catccaccac aacaaggact 2400 ggatccagag ggtcaccgga gtgaggaact gaatttggct cctcagcccc agcaccacca 2460 gctgtgggca gtcagtagca gaggacgatc ctccgatgaa agcagccatt tctcctttcc 2520 ttcctcccat cccccctcct tcggcctatc cattactggg caatagagca ggtatcttca 2580 cccccttttc actctcttta aagagatgga gcaagagagt ggtcagaaca caggccgaat 2640 ccaggctcta tcacttacta gtttgcagtg ctgggcaggt gacttcatct cttcgaactt 2700 cagtttcttc ataagatgga aatgctatac cttacctacc tcgtaaaagt ctgatgagga 2760 aaagattaac taatagatgc atagcactta acagagtgca tagcatacac tgttttcaat 2820 aaatgcacct tagcagaagg tcgatgtgtc taccaggcag acgaagctct cttacaaacc 2880 cctgcctggg tcttagcatt gatcagtgac acacctctcc cctcaacctt gaccatctcc 2940 atctgccctt aaatgctgta tgcttttttg ccaccgtgca acttgcccaa catcaatctt 3000 caccctcatc cctaaaaaag taaaacagac aaggttctga gtcctgtggt atgtccccta 3060 gcaaatgtaa ctaggaacat gcactagatg acagattgcg ggagggcctg agagaagcag 3120 ggacaggagg gagcctgggg attgtggttt gggaaggcag acacctggtt ctagaactag 3180 ctctgccctt agccccctgt atgaccctat gcaagtcctc ctccctcatc tcaaagggtc 3240 ctcaaagctc tgacgatcta agatacaatg aagccatttt ccccctgata agatgaggta 3300 aagccaatgt aaccaaaagg caaaaattac aatcggttca aaggaacttt gatgcagaca 3360 aaatgctgct gctgctgctc ctgaaatacc cacccctttc cactacgggt gggttcccaa 3420 ggacatggga caggcaaagt gtgagccaaa ggatccttcc ttattcctaa gcagagcatc 3480 tgctctgggc cctggcctcc ttcccttctt gggaaactgg gctgcatgag gtgggccctg 3540 gtagtttgta ccccaggccc ctatactctt ccttcctatg tccacagctg accccaagca 3600 gccgttcccc gactcctcac ccctgagcct caccctgaac tccctcatct tgcaaggcca 3660 taagtgtttt ccaagcaaaa tgcctctccc atcctctctc aggaagcttc tagagacttt 3720 atgccctcca gagctccaag atataagccc tccaagggat cagaagctcc aagttcctgt 3780 cttctgtttt atagaaattg atcttccctg ggggacttta actcttgacc tgtatgcagc 3840 tgttggagta attccaggtc tcttgaaaaa aaagaggaag ataatggaga atgagaacat 3900 atatatatat atattaagcc ccaggctgaa tactcaggga cagcaattca cagcctgcct 3960 ctggttctat aaacaagtca ttctacctct ttgtgccctg ctgtttattc tgtaagggga 4020 aggtggcaat gggacccagc tccatcagac acttgtcaag ctagcagaaa ctccattttc 4080 aatgccaaag aagaactgta atgctgtttt ggaatcatcc caaggcatcc caagacacca 4140 tatcttccca tttcaagcac tgcctgggca caccccaaca tcccaggctg tggtggctcc 4200 tgtgggaact acctagatga agagagtatc atttatacct tctaggagct cctattggga 4260 gacatgaaac atatgtaatt gactaccatg taatagaaca aaccctgcca agtgctgctt 4320 tggaaagtca tggaggtaaa agaaagacca ttc 4353 <210> 7 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp 35 40 45 Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asp Gln Val Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gln Thr Pro Gly Gln Glu Val Val Leu Ser Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Val Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 145 150 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 165 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Val Glu Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gln 180 185 190 Arg Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 195 200 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Val 210 215 220 Asn Leu Gln Phe Glu Asp Ile Phe Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Val 225 230 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys Ile Lys Val Gly Pro Lys Val Leu 245 250 255 Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gln Ser 260 265 270 His Ser Val Leu Ile Leu Phe His Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 275 280 285 Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Asn Glu Cys Pro Glu Leu 290 295 300 Gln Pro Pro Val His Gly Lys Ile Glu Pro Ser Gln Ala Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Phe Lys Asp Gln Val Leu Val Ser Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Val Leu 325 330 335 Lys Asp Asn Val Glu Met Asp Thr Phe Gln Ile Glu Cys Leu Lys Asp 340 345 350 Gly Thr Trp Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys Lys Ile Val Asp Cys Arg 355 360 365 Ala Pro Gly Glu Leu Glu His Gly Leu Ile Thr Phe Ser Thr Arg Asn 370 375 380 Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Lys Tyr Ser Cys Gln Glu Pro 385 390 395 400 Tyr Tyr Lys Met Leu Asn Asn Asn Thr Gly Ile Tyr Thr Cys Ser Ala 405 410 415 Gln Gly Val Trp Met Asn Lys Val Leu Gly Arg Ser Leu Pro Thr Cys 420 425 430 Leu Pro Glu Cys Gly Gln Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ser Leu Val Lys 435 440 445 Arg Ile Ile Gly Gly Arg Asn Ala Glu Pro Gly Leu Phe Pro Trp Gln 450 455 460 Ala Leu Ile Val Val Glu Asp Thr Ser Arg Val Pro Asn Asp Lys Trp 465 470 475 480 Phe Gly Ser Gly Ala Leu Leu Ser Ala Ser Trp Ile Leu Thr Ala Ala 485 490 495 His Val Leu Arg Ser Gln Arg Arg Asp Thr Thr Val Ile Pro Val Ser 500 505 510 Lys Glu His Val Thr Val Tyr Leu Gly Leu His Asp Val Arg Asp Lys 515 520 525 Ser Gly Ala Val Asn Ser Ser Ala Ala Arg Val Val Leu His Pro Asp 530 535 540 Phe Asn Ile Gln Asn Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Val Gln Leu Gln 545 550 555 560 Glu Pro Val Pro Leu Gly Pro His Val Met Pro Val Cys Leu Pro Arg 565 570 575 Leu Glu Pro Glu Gly Pro Ala Pro His Met Leu Gly Leu Val Ala Gly 580 585 590 Trp Gly Ile Ser Asn Pro Asn Val Thr Val Asp Glu Ile Ile Ser Ser 595 600 605 Gly Thr Arg Thr Leu Ser Asp Val Leu Gln Tyr Val Lys Leu Pro Val 610 615 620 Val Pro His Ala Glu Cys Lys Thr Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Gly Asn 625 630 635 640 Tyr Ser Val Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Tyr Glu Gly Gly 645 650 655 Lys Asp Thr Cys Leu Gly Asp Ser Gly Gly Ala Phe Val Ile Phe Asp 660 665 670 Asp Leu Ser Gln Arg Trp Val Val Gln Gly Leu Val Ser Trp Gly Gly 675 680 685 Pro Glu Glu Cys Gly Ser Lys Gln Val Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 690 695 700 Ser Asn Tyr Val Asp Trp Val Trp Glu Gln Met Gly Leu Pro Gln Ser 705 710 715 720 Val Val Glu Pro Gln Val Glu Arg 725 <210> 8 <211> 4137 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gaagtcagcc acacaggata aaggagggaa gggaaggagc agatcttttc ggtaggaaga 60 cagattttgt tgtcaggttc ctgggagtgc aagagcaagt caaaggagag agagaggaga 120 gaggaaaagc cagagggaga gagggggaga ggggatctgt tgcaggcagg ggaaggcgtg 180 acctgaatgg agaatgccag ccaattccag agacacacag ggacctcaga acaaagataa 240 ggcatcacgg acaccacacc gggcacgagc tcacaggcaa gtcaagctgg gaggaccaag 300 gccgggcagc cgggagcacc caaggcagga aaatgaggtg gctgcttctc tattatgctc 360 tgtgcttctc cctgtcaaag gcttcagccc acaccgtgga gctaaacaat atgtttggcc 420 agatccagtc gcctggttat ccagactcct atcccagtga ttcagaggtg acttggaata 480 tcactgtccc agatgggttt cggatcaagc tttacttcat gcacttcaac ttggaatcct 540 cctacctttg tgaatatgac tatgtgaagg tagaaactga ggaccaggtg ctggcaacct 600 tctgtggcag ggagaccaca gacacagagc agactcccgg ccaggaggtg gtcctctccc 660 ctggctcctt catgtccatc actttccggt cagatttctc caatgaggag cgtttcacag 720 gctttgatgc ccactacatg gctgtggatg tggacgagtg caaggagagg gaggacgagg 780 agctgtcctg tgaccactac tgccacaact acattggcgg ctactactgc tcctgccgct 840 tcggctacat cctccacaca gacaacagga cctgccgagt ggagtgcagt gacaacctct 900 tcactcaaag gactggggtg atcaccagcc ctgacttccc aaacccttac cccaagagct 960 ctgaatgcct gtataccatc gagctggagg agggtttcat ggtcaacctg cagtttgagg 1020 acatatttga cattgaggac catcctgagg tgccctgccc ctatgactac atcaagatca 1080 aagttggtcc aaaagttttg gggcctttct gtggagagaa agccccagaa cccatcagca 1140 cccagagcca cagtgtcctg atcctgttcc atagtgacaa ctcgggagag aaccggggct 1200 ggaggctctc atacagggct gcaggaaatg agtgcccaga gctacagcct cctgtccatg 1260 ggaaaatcga gccctcccaa gccaagtatt tcttcaaaga ccaagtgctc gtcagctgtg 1320 acacaggcta caaagtgctg aaggataatg tggagatgga cacattccag attgagtgtc 1380 tgaaggatgg gacgtggagt aacaagattc ccacctgtaa aattgtagac tgtagagccc 1440 caggagagct ggaacacggg ctgatcacct tctctacaag gaacaacctc accacataca 1500 agtctgagat caaatactcc tgtcaggagc cctattacaa gatgctcaac aataacacag 1560 gtatatatac ctgttctgcc caaggagtct ggatgaataa agtattgggg agaagcctac 1620 ccacctgcct tccagagtgt ggtcagccct cccgctccct gccaagcctg gtcaagagga 1680 tcattggggg ccgaaatgct gagcctggcc tcttcccgtg gcaggccctg atagtggtgg 1740 aggacacttc gagagtgcca aatgacaagt ggtttgggag tggggccctg ctctctgcgt 1800 cctggatcct cacagcagct catgtgctgc gctcccagcg tagagacacc acggtgatac 1860 cagtctccaa ggagcatgtc accgtctacc tgggcttgca tgatgtgcga gacaaatcgg 1920 gggcagtcaa cagctcagct gcccgagtgg tgctccaccc agacttcaac atccaaaact 1980 acaaccacga tatagctctg gtgcagctgc aggagcctgt gcccctggga ccccacgtta 2040 tgcctgtctg cctgccaagg cttgagcctg aaggcccggc cccccacatg ctgggcctgg 2100 tggccggctg gggcatctcc aatcccaatg tgacagtgga tgagatcatc agcagtggca 2160 cacggacctt gtcagatgtc ctgcagtatg tcaagttacc cgtggtgcct cacgctgagt 2220 gcaaaactag ctatgagtcc cgctcgggca attacagcgt cacggagaac atgttctgtg 2280 ctggctacta cgagggcggc aaagacacgt gccttggaga tagcggtggg gcctttgtca 2340 tctttgatga cttgagccag cgctgggtgg tgcaaggcct ggtgtcctgg gggggacctg 2400 aagaatgcgg cagcaagcag gtctatggag tctacacaaa ggtctccaat tacgtggact 2460 gggtgtggga gcagatgggc ttaccacaaa gtgttgtgga gccccaggtg gaacggtgag 2520 ctgacttact tcctcggggc ctgcctcccc tgagcgaagc tacaccgcac ttccgacagc 2580 acactccaca ttacttatca gaccatatgg aatggaacac actgacctag cggtggcttc 2640 tcctaccgag acagccccca ggaccctgag aggcagagtg tggtataggg aaaaggctcc 2700 aggcaggaga cctgtgttcc tgagcttgtc caagtctctt tccctgtctg ggcctcactc 2760 taccgagtaa tacaatgcag gagctcaacc aaggcctctg tgccaatccc agcactcctt 2820 tccaggccat gcttcttacc ccagtggcct ttattcactc ctgaccactt atcaaaccca 2880 tcggtcctac tgttggtata actgagcttg gacctgacta ttagaaaatg gtttctaaca 2940 ttgaactgaa tgccgcatct gtatattttc ctgctctgcc ttctgggact agccttggcc 3000 taatccttcc tctaggagaa gagcattcag gttttgggag atggctcata gccaagcccc 3060 tctctcttag tgtgatccct tggagcacct tcatgcctgg ggtttctctc ccaaaagctt 3120 cttgcagtct aagccttatc ccttatgttc cccattaaag gaatttcaaa agacatggag 3180 aaagttggga aggtttgtgc tgactgctgg gagcagaata gccgtgggag gcccaccaag 3240 cccttaaatt cccattgtca actcagaaca catttgggcc catatgccac cctggaacac 3300 cagctgacac catgggcgtc cacacctgct gctccagaca agcacaaagc aatctttcag 3360 ccttgaaatg tattatctga aaggctacct gaagcccagg cccgaatatg gggacttagt 3420 cgattacctg gaaaaagaaa agacccacac tgtgtcctgc tgtgcttttg ggcaggaaaa 3480 tggaagaaag agtggggtgg gcacattaga agtcacccaa atcctgccag gctgcctggc 3540 atccctgggg catgagctgg gcggagaatc caccccgcag gatgttcaga gggacccact 3600 ccttcatttt tcagagtcaa aggaatcaga ggctcaccca tggcaggcag tgaaaagagc 3660 caggagtcct gggttctagt ccctgctctg cccccaactg gctgtataac ctttgaaaaa 3720 tcattttctt tgtctgagtc tctggttctc cgtcagcaac aggctggcat aaggtcccct 3780 gcaggttcct tctagctgga gcactcagag cttccctgac tgctagcagc ctctctggcc 3840 ctcacagggc tgattgttct ccttctccct ggagctctct ctcctgaaaa tctccatcag 3900 agcaaggcag ccagagaagc ccctgagagg gaatgattgg gaagtgtcca ctttctcaac 3960 cggctcatca aacacactcc tttgtctatg aatggcacat gtaaatgatg ttatattttg 4020 tatcttttat atcatatgct tcaccattct gtaaagggcc tctgcattgt tgctcccatc 4080 aggggtctca agtggaaata aaccctcgtg gataaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 4137 <210> 9 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 405 410 415 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro 420 425 430 Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 435 440 445 Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly 450 455 460 Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Val Leu Thr 465 470 475 480 Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495 Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gln Ala 500 505 510 Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Val Val Ile 530 535 540 Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560 Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575 Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val Asp Ile Pro Ile 580 585 590 Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605 Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 625 630 635 640 Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 645 650 655 Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 660 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 10 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggccagctgg acgggcacac catgaggctg ctgaccctcc tgggccttct gtgtggctcg 60 gtggccaccc ccttgggccc gaagtggcct gaacctgtgt tcgggcgcct ggcatccccc 120 ggctttccag gggagtatgc caatgaccag gagcggcgct ggaccctgac tgcacccccc 180 ggctaccgcc tgcgcctcta cttcacccac ttcgacctgg agctctccca cctctgcgag 240 tacgacttcg tcaagctgag ctcgggggcc aaggtgctgg ccacgctgtg cgggcaggag 300 agcacagaca cggagcgggc ccctggcaag gacactttct actcgctggg ctccagcctg 360 gacattacct tccgctccga ctactccaac gagaagccgt tcacggggtt cgaggccttc 420 tatgcagccg aggacattga cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac 480 caccactgcc acaaccacct gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg 540 caccgtaaca agcgcacctg ctcagccctg tgctccggcc aggtcttcac ccagaggtct 600 ggggagctca gcagccctga atacccacgg ccgtatccca aactctccag ttgcacttac 660 agcatcagcc tggaggaggg gttcagtgtc attctggact ttgtggagtc cttcgatgtg 720 gagacacacc ctgaaaccct gtgtccctac gactttctca agattcaaac agacagagaa 780 gaacatggcc cattctgtgg gaagacattg ccccacagga ttgaaacaaa aagcaacacg 840 gtgaccatca cctttgtcac agatgaatca ggagaccaca caggctggaa gatccactac 900 acgagcacag cgcagccttg cccttatccg atggcgccac ctaatggcca cgtttcacct 960 gtgcaagcca aatacatcct gaaagacagc ttctccatct tttgcgagac tggctatgag 1020 cttctgcaag gtcacttgcc cctgaaatcc tttactgcag tttgtcagaa agatggatct 1080 tgggaccggc caatgcccgc gtgcagcatt gttgactgtg gccctcctga tgatctaccc 1140 agtggccgag tggagtacat cacaggtcct ggagtgacca cctacaaagc tgtgattcag 1200 tacagctgtg aagagacctt ctacacaatg aaagtgaatg atggtaaata tgtgtgtgag 1260 gctgatggat tctggacgag ctccaaagga gaaaaatcac tcccagtctg tgagcctgtt 1320 tgtggactat cagcccgcac aacaggaggg cgtatatatg gagggcaaaa ggcaaaacct 1380 ggtgattttc cttggcaagt cctgatatta ggtggaacca cagcagcagg tgcactttta 1440 tatgacaact gggtcctaac agctgctcat gccgtctatg agcaaaaaca tgatgcatcc 1500 gccctggaca ttcgaatggg caccctgaaa agactatcac ctcattatac acaagcctgg 1560 tctgaagctg tttttataca tgaaggttat actcatgatg ctggctttga caatgacata 1620 gcactgatta aattgaataa caaagttgta atcaatagca acatcacgcc tatttgtctg 1680 ccaagaaaag aagctgaatc ctttatgagg acagatgaca ttggaactgc atctggatgg 1740 ggattaaccc aaaggggttt tcttgctaga aatctaatgt atgtcgacat accgattgtt 1800 gaccatcaaa aatgtactgc tgcatatgaa aagccaccct atccaagggg aagtgtaact 1860 gctaacatgc tttgtgctgg cttagaaagt gggggcaagg acagctgcag aggtgacagc 1920 ggaggggcac tggtgtttct agatagtgaa acagagaggt ggtttgtggg aggaatagtg 1980 tcctggggtt ccatgaattg tggggaagca ggtcagtatg gagtctacac aaaagttatt 2040 aactatattc cctggatcga gaacataatt agtgattttt aacttgcgtg tctgcagtca 2100 aggattcttc atttttagaa atgcctgtga agaccttggc agcgacgtgg ctcgagaagc 2160 attcatcatt actgtggaca tggcagttgt tgctccaccc aaaaaaacag actccaggtg 2220 aggctgctgt catttctcca cttgccagtt taattccagc cttacccatt gactcaaggg 2280 gacataaacc acgagagtga cagtcatctt tgcccaccca gtgtaatgtc actgctcaaa 2340 ttacatttca ttaccttaaa aagccagtct cttttcatac tggctgttgg catttctgta 2400 aactgcctgt ccatgctctt tgtttttaaa cttgttctta ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 <210> 11 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Glu Gln Ser Leu 180 185 <210> 12 <211> 738 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggccagctgg acgggcacac catgaggctg ctgaccctcc tgggccttct gtgtggctcg 60 gtggccaccc ccttgggccc gaagtggcct gaacctgtgt tcgggcgcct ggcatccccc 120 ggctttccag gggagtatgc caatgaccag gagcggcgct ggaccctgac tgcacccccc 180 ggctaccgcc tgcgcctcta cttcacccac ttcgacctgg agctctccca cctctgcgag 240 tacgacttcg tcaagctgag ctcgggggcc aaggtgctgg ccacgctgtg cgggcaggag 300 agcacagaca cggagcgggc ccctggcaag gacactttct actcgctggg ctccagcctg 360 gacattacct tccgctccga ctactccaac gagaagccgt tcacggggtt cgaggccttc 420 tatgcagccg aggacattga cgagtgccag gtggccccgg gagaggcgcc cacctgcgac 480 caccactgcc acaaccacct gggcggtttc tactgctcct gccgcgcagg ctacgtcctg 540 caccgtaaca agcgcacctg ctcagagcag agcctctagc ctcccctgga gctccggcct 600 gcccagcagg tcagaagcca gagccagcct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat 660 ggctgtgccc caactcccat tcacccacca tggacccaat aataaacctg gccccacccc 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 738 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 13 gcacccagag ccacagtg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 14 gccttccagt gtgtgggc 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 15 gccttccaga gtgtggtca 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 16 cgatctggag agcgaactc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 17 ctgttcttca cactggctg 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 18 ctgctgagat catgttgttc 20 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 19 ttatacgact cacta 15

Claims (64)

  1. 그를 필요로 하는 대상자에서 보체 활성화를 억제하는데 사용하기 위한, SEQ NO:1의 아미노산 서열 20-380을 포함하는 분리된 피콜린-관련 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 폴리펩타이드는 세린 프로테아제 활성을 갖지 않는 것이고,
    상기 약학적 조성물은 염증, 세포자멸사 및/또는 자가면역과 관련된 증상의 치료, 애디슨병, 자가면역성 용혈빈혈, 자가면역성 갑상선염, 크론병, 그레이브병, 길리안-바레 증후군, 전신홍반루푸스(SLE), 루푸스 신장염, 다발경화증, 중증근무력증, 건선, 원발성 담즙성 간경변, 류마티스성 관절염, 포도막염, 천식, 죽상동맥경화증, I형 당뇨병, 건선, 여러 가지 알레르기를 포함하는 자가면역 상태의 치료, 어프렌디시티스(appendicitis), 소화성 궤양, 위궤양, 십이지장궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성결장염, 위막성 결장염, 급석 결장염, 허혈성 결장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증,담관염, 담낭염, 간염, 크론병, 장염, 위플병, 알레르기, 면역복합질환, 장기 허혈, 재관류 손상, 장기 괴사, 건초열, 패혈증(sepsis), 패혈증(septicemia), 내독소쇼크, 카켁시아, 고열증, 호산구육아종, 육아종증, 사르코이드증, 패혈유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 폐기종, 비염, 폐렴, 뉴모트랜스마이크로스코픽 실리코볼케이노진폐증 (pneumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis), 폐포염, 세기관지염, 인두염,늑막염, 굴염, 인플루엔자, 호흡성 합포체 바이러스 감염, HIV 감염, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 파종세균혈증, 뎅그열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바증, 포충낭, 화상, 피부염, 피부근염, 일광화상, 두드러기, 사마귀, 팽진반응, 맥관염, 혈관염, 심장내막염, 동맥염, 죽상동맥경화증, 혈전동맥염, 심장막염, 심근염, 심근성 허혈, 결절동맥주위염, 류마티스열, 알츠하이머병, 복강질환, 울혈성 심부전, 성인 호흡 곤란 증후군, 수막염, 마뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색증, 뇌색전증, 길리암-바레 증후군, 신경염, 신경통, 척수손상, 마비, 포도막염, 관절염증, 아쓰랄지아, 골수염, 근막염, 파젯병, 통풍, 치주병, 류마티스성 관절염, 윤활막염, 중증근무력증, 갑상선염, 전신루푸스홍반증, 굿파스튀르 증후군, 베쳇병, 동종이식거부, 이식대숙주질환, I형 당뇨병, 강직척추염, 버거병, 라이터 증후군 및 호지킨병, 각막염, 2형 당뇨병, 낭성섬유증, 심근경색, 재관류 손상, 발작, 피부근염, 대사성 증후군, 전신염증반응 증후군, 패혈증, 다발장기 부전, 파종성 혈관내 응집, 아나필락시스 쇼크, 1형 및/또는 2형 당뇨병과 연관된 혈관 합병증 및 신장병증, 뇌수막염, 세균성 패혈증, 복합 말라리아, 비정상적 용혈요독증후군, 용혈요독증후군, 연령관련 황반변성, 발작성 야간혈색뇨증, 뱀독, 화상, 및 장기 이식 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 치료, 장기 허혈, 재관류손상, 장기 괴사, 바술리티스, 심장내막염, 죽상동맥경화증, 혈전정맥염, 심장막염, 심근염, 심근성 허혈, 결절동맥주위염, 류마티스열, 울혈성 심부전, 성인 호흡곤란 증후군, 뇌경색증, 뇌색전증, 1형 및/또는 2형 당뇨병과 연관된 신장병 및 혈관성 합병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 염증성 질환의 치료, 응혈, 혈전성 또는 응고병 관련 질환과 관련된 증상의 치료, 응혈, 혈전 또는 응고병 관련 질환 또는 염증반응 및 만성 혈전색전성 질환 또는 혈관 질환을 포함하는 피브린 형성 관련 질환, 혈전증, 깊은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈전증, 관상동맥 우회이식(CABG), 경피경혈관심장동맥확장술(PTCA), 혈소판침착성 발작, 종양성장, 종양 전이, 혈관신생, 혈전용해, 죽상동맥경화증, 재협착, 동맥경화증 및/또는 혈관신생에 후속되는 재협착, 염증을 포함하는 급만성 증상, 패혈증, 패혈증 쇼크, 패혈증, 저혈압, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 전신염증성 반응중후군(SIRS), 파종성 혈관내 응혈이상(DIC), 폐색전증, 병리학적 혈소판 침착, 심근경색의 치료, 또는 혈전 위험이 있는 죽상동맥경화증성 혈관, 말초혈액 전구세포(PBPC) 트랜스플랜테이션에 이은 정맥폐쇄성 질환, 용혈성 요독증후군(HUS), 및 혈전성 혈소판감소자반증(TTP) 및 류마티스열과 관련된 질환과 관련된 증상의 치료, 응고, 혈전성 또는 응고병 관련 질환 또는 염증반응 관련 질환 및 만성 혈전색전 질환 또는 피브린 형성 관련 질환, 혈전증과 관련된 혈관 질환, 깊은 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈전증, 관상동맥 우회이식술(CABG), 경피경혈관심장동맥확장술(PTCA), 혈소판침착성 발작, 종양성장, 종양 전이, 혈관신생, 혈전용해, 죽상동맥경화증, 재협착, 동맥경화증 및/또는 혈관신생에 후속되는 재협착, 염증을 포함하는 급만성 증상, 병리학적 혈소판 침착, 심근경색의 치료, 또는 혈전 위험이 있는 죽상동맥경화증성 혈관, 말초혈액 전구세포(PBPC) 트랜스플랜테이션에 이은 정맥폐쇄성 질환, 용혈성 요독증후군(HUS), 및 혈전성 혈소판감소자반증(TTP) 및 류마티스열과 관련된 증상의 치료, 또는 외과수술 중의 환자 또는 울혈성 심부전 증상이 있는 환자를 포함하는 고위험군으로 동정된 환자에서 혈전색전성 합병증의 발병의 예방을 위한 것인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 만노스-결합 렉틴(MBL); 피콜린-1, 피콜린-2, 또는 피콜린-3 중 어느 하나; C1q, 폐 표면 단백질 SP-A 또는 SP-D 중 어느 하나, 또는 CL-L1과 결합할 수 있는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 재조합된 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 시그널 펩타이드를 갖지 않는 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
KR1020127004301A 2009-07-17 2010-07-16 보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형 KR101870378B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09165770 2009-07-17
EP09165770.0 2009-07-17
EP09171941.9 2009-10-01
EP09171941 2009-10-01
US31104910P 2010-03-05 2010-03-05
US61/311,049 2010-03-05
PCT/EP2010/060279 WO2011006982A2 (en) 2009-07-17 2010-07-16 Inhibitors of complement activation

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187005648A Division KR102184713B1 (ko) 2009-07-17 2010-07-16 보체 활성화의 억제제로서의 masp 이소형

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130026402A KR20130026402A (ko) 2013-03-13
KR101870378B1 true KR101870378B1 (ko) 2018-06-25

Family

ID=43449884

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187005648A KR102184713B1 (ko) 2009-07-17 2010-07-16 보체 활성화의 억제제로서의 masp 이소형
KR1020127004301A KR101870378B1 (ko) 2009-07-17 2010-07-16 보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187005648A KR102184713B1 (ko) 2009-07-17 2010-07-16 보체 활성화의 억제제로서의 masp 이소형

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20120282285A1 (ko)
EP (2) EP3395828A1 (ko)
JP (3) JP2012533288A (ko)
KR (2) KR102184713B1 (ko)
CN (2) CN107513103A (ko)
AU (1) AU2010272483B2 (ko)
BR (1) BR112012001070B1 (ko)
CA (1) CA2767755C (ko)
WO (1) WO2011006982A2 (ko)
ZA (1) ZA201200953B (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8840893B2 (en) 2004-06-10 2014-09-23 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
EP2694108B1 (en) 2011-04-08 2018-06-06 University Of Leicester Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
US9644035B2 (en) 2011-04-08 2017-05-09 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
WO2013000471A1 (en) * 2011-06-28 2013-01-03 Rigshospitalet Therapeutic targeting of ficolin-3
IN2014KN02324A (ko) * 2012-04-06 2015-05-01 Omeros Corp
CN104717975A (zh) * 2012-06-18 2015-06-17 奥默罗斯公司 用于治疗各种疾病和病症的抑制masp-1和/或masp-2和/或masp-3的组合物和方法
DK3521312T3 (da) 2013-02-20 2021-06-28 Innate Pharma Forbindelse, der binder specifikt til kir3dl2, til anvendelse til behandling af perifert t-cellelymfom
IL283373B2 (en) 2013-10-17 2024-08-01 Omeros Corp Pharmaceutical preparations containing substances that suppress MASP-2 to suppress complement activation that depends on MASP-2 and related diseases
JP6634566B2 (ja) * 2015-03-06 2020-01-22 株式会社森永生科学研究所 コントロールスライド及びコントロール実験の方法
JOP20170154B1 (ar) 2016-08-01 2023-03-28 Omeros Corp تركيبات وطرق لتثبيط masp-3 لعلاج أمراض واضطرابات مختلفة
JP6143209B1 (ja) * 2016-10-31 2017-06-07 国立大学法人大阪大学 自己免疫疾患用または難治性血管炎用の治療剤、および、これらの疾患の診断のためのデータの取得方法
KR102094802B1 (ko) * 2017-10-24 2020-03-31 고려대학교 산학협력단 소변 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법
CN109829885B (zh) * 2018-12-24 2022-07-22 广州柏视医疗科技有限公司 一种基于深度语义分割网络的自动识别鼻咽癌原发肿瘤方法
WO2020190081A1 (ko) * 2019-03-20 2020-09-24 (주)레티마크 실명 유발 주요 안질환 진단용 혈액 마커 및 이를 이용한 진단 방법
JP2022532069A (ja) * 2019-05-07 2022-07-13 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト Ｍａｓｐ阻害化合物およびその使用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032157A1 (en) 2002-08-08 2005-02-10 Peter Gal Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof
WO2007047995A2 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Catalyst Biosciences, Inc. Modified proteases that inhibit complement activation

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4203570A (en) 1978-08-23 1980-05-20 The Western States Machine Company Power-operated loading gate for centrifugal machines incorporating an auxiliary drive device
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4546082A (en) 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
WO1984004330A1 (en) 1983-04-22 1984-11-08 Amgen Secretion of exogenous polypeptides from yeast
NZ207926A (en) 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
DK58285D0 (da) 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
US4885249A (en) 1984-12-05 1989-12-05 Allelix, Inc. Aspergillus niger transformation system
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
NZ217373A (en) 1985-08-29 1990-10-26 Genencor Inc Production of heterologous peptide in filamentous fungi, vectors and dna
US4754051A (en) * 1985-09-30 1988-06-28 Dainippon Ink And Chemicals, Inc. Optically active tolan derivative
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
JP2523562B2 (ja) 1985-10-25 1996-08-14 ザイモジェネティックス インコーポレーテッド 外来タンパク質を分泌することを目的としたｂａｒ１の使用法
US4935349A (en) * 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
GB8615942D0 (en) 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
ATE170557T1 (de) 1987-07-24 1998-09-15 Chiron Corp Züchtung von insektenzellen mit airlift-reaktoren
US5024947A (en) 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
DE3886221T3 (de) 1987-09-04 2000-12-21 Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PROTEINPRODUKTEN IN -i(ASPERGILLUS) UND PROMOTOREN ZUR VERWENDUNG IN -i(ASPERGILLUS).
DK463887D0 (da) 1987-09-07 1987-09-07 Novo Industri As Gaerleader
US5037743A (en) * 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
GB8826446D0 (en) 1988-11-11 1988-12-14 Agricultural & Food Res Peptide production
WO1990005783A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 Cetus Corporation Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins
GB8910962D0 (en) 1989-05-12 1989-06-28 Natural Environment Res Novel baculovirus expression vectors and use thereof in the expression of foreign proteins in insects or insect cells
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
US5155037A (en) 1989-08-04 1992-10-13 The Texas A&M University System Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems
US5073964A (en) 1989-08-04 1991-12-17 Aware, Inc. Signal processing device and method
US5023328A (en) 1989-08-04 1991-06-11 The Texas A&M University System Lepidopteran AKH signal sequence
DK300090D0 (da) 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
CA2099562C (en) 1991-01-11 2010-04-20 William N. Drohan Expression of active human protein c in mammary tissue of transgenic animals
US7083786B2 (en) * 1997-04-03 2006-08-01 Jensenius Jens Chr MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it
AU785149B2 (en) * 1999-12-02 2006-10-05 Jens Christian Jensenius MASP-3, a complement-fixing enzyme, and uses for it
DK1303591T3 (da) 2000-07-13 2009-11-02 Helion Biotech Aps MASP-2, et komplementfikserende enzym, og anvendelser af det
ATE337014T1 (de) * 2002-03-15 2006-09-15 Natimmune As Mannose-bindungsprotein enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
DE60310736T2 (de) * 2002-09-10 2007-10-11 Natlmmune A/S Collectin-komplement aktivierende proteinchimären
PT2465534T (pt) * 2004-06-10 2017-06-27 Univ Leicester Métodos para tratar condições associadas com a ativação do complemento dependente de masp-2
US20120058956A1 (en) * 2009-03-03 2012-03-08 Metamorefix Ltd. Peptides derived from ficolin as surfactants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032157A1 (en) 2002-08-08 2005-02-10 Peter Gal Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof
WO2007047995A2 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Catalyst Biosciences, Inc. Modified proteases that inhibit complement activation

Also Published As

Publication number Publication date
EP2454281B1 (en) 2018-11-14
US20170334961A1 (en) 2017-11-23
AU2010272483B2 (en) 2016-07-21
ZA201200953B (en) 2012-10-31
EP2454281A2 (en) 2012-05-23
KR102184713B1 (ko) 2020-12-01
BR112012001070A2 (pt) 2016-11-22
KR20130026402A (ko) 2013-03-13
CN107513103A (zh) 2017-12-26
EP3395828A1 (en) 2018-10-31
BR112012001070B1 (pt) 2022-05-03
US11203622B2 (en) 2021-12-21
WO2011006982A3 (en) 2011-03-31
CA2767755A1 (en) 2011-01-20
JP2016026195A (ja) 2016-02-12
CN102712687A (zh) 2012-10-03
JP2012533288A (ja) 2012-12-27
CA2767755C (en) 2021-10-12
US20120282285A1 (en) 2012-11-08
WO2011006982A2 (en) 2011-01-20
JP6290845B2 (ja) 2018-03-07
AU2010272483A1 (en) 2012-02-09
JP6820286B2 (ja) 2021-01-27
KR20180026557A (ko) 2018-03-12
JP2018099125A (ja) 2018-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101870378B1 (ko) 보체 활성화의 억제제로서의 ｍａｓｐ 이소형
US11945848B2 (en) Chimeric inhibitor molecules of complement activation
JP2003515338A (ja) 補体結合酵素、ｍａｓｐ−３、及びその使用
ES2709748T3 (es) Isoformas de MASP como inhibidores de la activación del complemento
ES2834429T3 (es) Moléculas inhibidoras quiméricas de la activación del complemento
JP2004292444A (ja) 上部消化管疾患の予防・治療剤
WO2002016579A2 (en) Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant