BR112012001070B1

BR112012001070B1 - Composição de polipeptídeo associado à ficolina e uso da mesma

Info

Publication number: BR112012001070B1
Application number: BR112012001070-0A
Authority: BR
Inventors: Peter Garred; Tina Hummelshoj Glue; Mikkel-Ole Skjodt
Original assignee: Omeros Corporation
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2022-05-03
Also published as: EP2454281B1; US20170334961A1; AU2010272483B2; ZA201200953B; EP2454281A2; KR102184713B1; BR112012001070A2; KR20130026402A; CN107513103A; EP3395828A1; US11203622B2; WO2011006982A3; CA2767755A1; KR101870378B1; JP2016026195A; CN102712687A; JP2012533288A; CA2767755C; US20120282285A1; WO2011006982A2

Abstract

INIBIDORES DE ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTOS. A presente invenção refere-se a polipeptídeos associados à ficolina, novos, e polipeptídeos derivados desses polipeptídeos associados à ficolina para uso no tratamento de condições associadas a doenças relacionadas à inflamação, apoptose, autoimunidade, coagulação, trombose ou coagulopatia, bem como ao uso como biomarcadores. A presente invenção também refere-se a anticorpos que reconhecem tais polipeptídeos associados à ficolina novos, e polipeptídeos derivados dos mesmos, moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos, vetores e células hospedeiras usadas na produção do polipeptídeo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos associados à ficolina novos, e polipeptídeos derivados desses polipeptídeos associados à ficolina para uso no tratamento de condições associadas a doenças relacionadas à inflamação, apoptose, autoimunidade, coagulação, trombose ou coagulopatia, bem como seu uso como biomarcadores. A presente invenção também se refere a anticorpos que reconhecem tais polipeptídeos associados à ficolina e polipeptídeos derivados destes, moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos, vetores e células hospedeiras usadas na produção dos polipeptídeos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A ativação do sistema de complemento (C) é realizada via três caminhos de iniciação diferentes: o caminho alternativo (AP), o clássico (CP) ou o de lectina (LCP). A ativação via AP ocorre em superfícies exógenas e é causada por uma hidrólise vagarosa e espontânea de C3 e pela atividade dos fatores properdina, fator B e fator D para formar a convertase C3 funcional C3bBb. O AP também funciona como um caminho de amplificação (o laço de amplificação) dos dois outros caminhos. Recentemente, foi mostrado que a montagem da convertase alternativa também pode ser iniciada por uma ligação não covalente de properdina a algumas superfícies alvo. A ativação via CP, por outro lado, é iniciada quando C1q se liga a imunoglobulinas em complexo com antígenos, o que desencadeia a ativação das serina proteases associadas a C1q C1r e C1s. A C1s cliva e ativa C4 e C2 de modo a formar a convertase de CP C3 C4b2a. O LCP é ativado quando a lectina que se liga à manose (MBL) ou ficolinas se ligam a padrões restritos de carboidratos ou compostos acetilados, por exemplo, na superfície de microrganismos ou quando exposto em células hospedeiras perecendo. Quando da ligação ao ligante, a serina protease associada MASP-2 ativa e cliva C2 e C4 para formar a convertase de LCP C3 C4b2a. Sugere-se que a função de MASP-1 envolva a estabilização de clivagem de MASP-2 de C2 e também clivagem de baixo grau direta de C3. Mas em outro estudo relaciona a função e a atividade de MASP-1 e MASP-2 à conversão cruzada do sistema de coagulação envolvendo protrombina, fibrinogênio e fator XIII. Através do uso de camundongos de nocaute MASP1/3, foi recentemente demonstrado que MASP-1 de fato contribui para a atividade do complemento. A função exata da serina protease associada a MBL mais recentemente descoberta ainda deve ser elucidada. Estudos que indicam que a MASP-3 se associa a uma faixa limitada de oligômeros de MBL e que a MASP-3 e proteína pequena associada a MBL (sMAP) estão envolvidas na regulação ou inibição da ativação do complemento de LCP dependente de MBL foram relatados.

[003] As MASP-1 e -3 são derivadas do mesmo gene MASP1/3 (presente no cromossomo 3q27 - q28) através de emendas diferenciais. Elas contêm uma cadeia A idêntica exceto pelos resíduos de terminal 15 C. A cadeia A é composta de dois domínios CUB (C1r/C1s, Urquina-EGF, proteína óssea morfogenética) separados por um domínio EGF (fator de crescimento epidérmico) e seguidos por dois domínios CCP (proteína de controle de complemento). A cadeia B que inclui o domínio de serina protease é diferente para a MASP-1 e MASP- 3. A MASP-2 e sMAP também são derivadas do mesmo gene (presente no cromossomo 1p36-p36.2) em que sMAP é uma forma truncada sem o domínio da serina protease e uma grande parte da cadeia A. O gene de MASP1/3 foi demonstrado ser polimórfico, mas a importância funcional disto ainda não é bem entendida. Entretanto, há algumas evidências de que os polimorfismos no gene de MASP2/3 estão asso- ciados ao risco aumentado de infecções. A expressão das MASPs é localizada nos hepatócitos do fígado, mas um estudo recente descreveu que o mRNA humano de MASP-3 (como o único mRNA de MASP) estava expresso em uma ampla gama de tecidos.

OBJETO DA INVENÇÃO

[004] Um objeto de modalidades desta invenção é proporcionar polipeptídeos adequados para o tratamento de condições associadas à inflamação, apoptose, autoimunidade, coagulação e/ou doenças relacionadas a trombose ou à coagulopatia. Os polipeptídeos da invenção podem também ser adequados como biomarcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico dessas indicações, bem como para doenças malignas, como câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Constatou-se que polipeptídeos novos que são associados ao reconhecimento de moléculas do caminho de complemento de lec- tina bem como polipeptídeos, como os fragmentos derivados deste podem ser usados no tratamento de condições médicas específicas associadas à inflamação, apoptose, autoimunidade, coagulação e/ou doenças relacionadas a trombose ou à coagulopatia.

[006] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo associado à ficolina, isolado.

[007] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo que compreende o aminoácido de SEQ ID NO:4 ou variantes ou fragmentos imunológicos deste.

[008] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[009] Em um quarto aspecto a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico, isolada, que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[010] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma mo lécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotí- deos que é pelo menos 70% idêntica àquela de SEQ NO: 2.

[011] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico, isolada, que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[012] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma cé lula hospedeira que compreende uma molécula de ácidos nucleicos, isolada, que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[013] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para a produção do polipeptídeo de acordo com a invenção, método esse que compreende cultivar uma célula de acordo com a invenção em um meio de cultura apropriado, sob condições que permitam a expressão da construção de polinucleotídeo e recuperar o polipeptídeo resultante do meio de cultura.

[014] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma com posição compreendendo um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[015] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[016] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para detectar um polipeptídeo de acordo com a presente invenção em uma amostra biológica, método que compreende: a) obter uma amostra biológica; b) contatar a amostra biológica com um anticorpo de acordo com a invenção; e c) detectar complexos do anticorpo e do polipeptídeo, se houver; como um indicativo da presença do polipeptídeo na amostra.

[017] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso do polipeptídeo, de acordo com a presente invenção; para uso como um medicamento.

[018] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo, de acordo com a presente invenção; para a preparação de um medicamento.

[019] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção para o tratamento de quaisquer indicações associadas à inflamação, apoptose e/ou autoi- munidade.

[020] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção para a prevenção da ocorrência de quaisquer indicações associadas à coagulação, trombose e ou doenças relacionadas à coagulopatia.

[021] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção para a prevenção da ocorrência de complicações tromboembólicas em pacientes de alto risco identificados, como aqueles submetidos a cirurgias ou aqueles com insuficiência cardíaca congestiva.

[022] Em outro aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo de acordo com a presente invenção para o tratamento de uma condição médica associada ao coração.

[023] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção para o tratamento de uma condição médica associada a uma deficiência em um polipeptí- deo associado à ficolina.

[024] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para o tratamento de qualquer indicação associada a inflamação, apoptose e/ou autoimunidade; método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com a invenção a um paciente que necessite.

[025] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para o tratamento de qualquer indicação associada a doenças relacionadas à coagulação, trombose ou coagulapatias; método que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente ou profila- ticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção a um paciente que necessite do mesmo.

[026] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para a prevenção da ocorrência de complicações tromboembóli- cas em paciente identificados como de alto risco, como pacientes submetidos a cirurgias ou aqueles com insuficiência cardíaca congestiva; método que compreende administrar uma quantidade terapeuti- camente ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção em um paciente que necessite.

[027] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para o tratamento de uma condição médica associada ao coração; método que compreende administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo, de acordo com a presente invenção, a um paciente que necessite.

[028] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para o tratamento de uma condição médica associada a uma deficiência em um polipeptídeo associado à ficolina; método que compreende administrar uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo, de acordo com a presente invenção, a um paciente que necessite.

[029] Ainda em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma sonda de ácido nucleico capaz de se hibridizar sob condições es- tringentes em uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica um po- lipeptídeo de acordo com a presente invenção.

[030] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para detectar a presença de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de acordo com a presente invenção em uma amostra biológica, método que compreende: a) obter uma amostra biológica; b) contatar a amostra biológica com uma sonda de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção; e c) detectar complexos de uma sonda de ácidos nucleicos e do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, se houver; como indicação da presença do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo na amostra.

[031] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para o diagnóstico de um distúrbio associado à expressão aberrante de um polipeptídeo associado à ficolina, compreendendo obter uma amostra biológica de um paciente e medir a expressão na amostra biológica do polipeptídeo associado à ficolina, em que uma expressão aumentada ou diminuída do polipeptídeo associado à ficolina na amostra biológica quando comparado a um controle indica que o paciente sofre de um distúrbio associado à expressão aberrante de um po- lipeptídeo associado à ficolina.

[032] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição isolada compreendendo a combinação de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção junto com uma ou mais proteínas selecionadas de Ficolina 1, 2, 3, lectina ligante à manose (MBL), C1q, proteínas tensoativas do pulmão SP-A e/ou SP-D e moléculas de defesa do tipo colágeno intracelular, como CLL-11.

[033] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição que compreende um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, para uso como medicamento.

[034] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma composição, de acordo com a presente invenção; para a preparação de um medicamento.

[035] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para o tratamento de qualquer indicação associada à inflamação, apoptose e/ou autoimunidade.

[036] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para o tratamento de qualquer indicação conforme definida aqui.

[037] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um mé todo para o tratamento de qualquer indicação conforme definida aqui, método que compreende administrar simultaneamente ou sequencialmente uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, e uma ou mais proteínas selecionadas de Ficolina 1, 2, 3, lectina ligante à manose (MBL), C1q, proteínas tensoativas do pulmão SP-A e/ou SP-D e moléculas de defesa do tipo colágeno intracelular, como CLL-11.

[038] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção como um biomar- cador no sangue e tecido para o diagnóstico e/ou prognóstico de uma doença maligna, tal qual câncer, como tumores cerebrais, tumores no fígado e tumores no trato reprodutivo.

[039] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção como um biomarca- dor no sangue e tecido para o diagnóstico e/ou prognóstico de uma condição autoimune, metabólica e/ou inflamatória conforme definidas aqui. LEGENDAS DAS FIGURAS

[040] Figura 1: Transcrição alternativa do gene MASP-1. Trans crição alternativa do gene MASP1 foi detectada em cDNA do fígado. Os transcritos MASP1, MASP3 e FAP foram amplificados usando um iniciador direto comum localizado no exon 6 e iniciadores específcos reversos localizados no exon 12 (MASP1), exon 11 (MASP3) e exon 8a (FAP). MASP1 gera um fragmento de 500 bp, MASP3 gera um fragmento de 506 bp e FAP gera um fragmento de 309 bp.

[041] Figura 2: Partição alternativa do gene MASP1. MASP1 é gerado pela partição do exon 8a e 11, ambos os quais contêm uma sequência de parada de códon (marcada por caixas pretas). A sequência de MASP1 contém o códon de parada no exon 17. MASP3 é gerada por partição do exon 8a e FAP é gerada quando não ocorre partição do exon 8a. A proteína FAP contém os dois domínios CUB, o domínio EFG e o primeiro domínio CCP1.

[042] Figura 3: Expressão de tecido do fragmento FAP. As distri buições de tecido de genes MASP-1, MASP3 e FAP foram investigadas em painéis de cDNA de Clontech. Transcritos MASP-1, MASP-3 e FAP foram amplificados usando um iniciador direto comum e iniciadores reversos específicos. GADPH foi usado como gene de referência. Todos os três genes foram altamente expressos no fígado e, adicionalmente, FAP foi fortemente expresso em tecido cardíaco (marcado por flechas pretas). A expressão menor do gene FAP foi detectada no cérebro, cólon, próstata, músculo esquelético e intestino delgado (marcado por flechas brancas).

[043] Figura 4: Alinhamento de MASP-1, MASP-3 e FAP. As se quências de proteína de MASP-1, MASP-3 e FAP foram alinhadas usando o software BioEdit. MASP-1 e MASP-3 contêm domínios de serina protease de término C diferentes ao passo que FAP não contém nenhum domínio de serina protease. Ao invés disso, a proteína contém 17 novos aminoácidos na região de término C.

[044] Figura 5: sequência de cDNA e sequência de proteínas cor respondente de FAP. A sequência de cDNA é mostrada na linha superior e a sequência de proteínas correspondente é mostrada abaixo. Regiões de exons são divididas por linhas verticais pretas. Aminoáci- dos que se acredita estarem envolvidos na ligação a MBL/ficolinas são marcados com caixas amarelo claro.

[045] Figura 6: Ativação do complemento de MASP-1. MBL hu mana foi incubada com quantidade aumentada de MASP-1. MASP-1 foi capaz de ativar ambas as proteínas de complemento C3 e C4.

[046] Figura 7: Ativação do complemento de MASP-2. MBL hu mana foi incubada com quantidade aumentada de MASP-2. MASP-2 foi capaz de ativar ambas as proteínas de complemento C3 e C4.

[047] Figura 8: Ativação do complemento de MASP-3. MBL huma na foi incubada com quantidade aumentada de MASP-3. MASP-3 foi capaz de inibir a ativação de ambas as proteínas de complemento C3 e C4.

[048] Figura 9: Imunoprecipitação. Imunoprecipitação de soro de Ficolina/MBL com mAb anti-MBL 131 - 11, clone 219 de anti-Ficolina-2 e clone 334 de anti-Ficolina-3. Seguido por separação por conchas magnéticas Dynal, SDS-PAGE, Western Blot e clone anti-MASP-1 / MASP-3 marcado com biotina 8B3 como anticorpo sinal.

[049] Figura 10: Interação de FAP com Ficolina quando ligada à albumina do soro humano acetilada (AcHSA). Ficolina do soro eluído ligando-se a AcHSA. Western blot com clone anti-MASP-1 / MASP-3 marcado com biotina 8B3 como anticorpo sinal.

[050] Figura 11: Constantes de cinética e de dissociação para a interação entre MASP-1 e MASP-3 e rFicolina-2 (Hummelshoj T et al., Mol. Immunol., 2007).

[051] Figura 12: Alinhamento de GULF e dos 17 aminoácidos únicos de FAP.

[052] Figura 13: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de manana/MBL. Poços revestidos por manana foram incubados com ou sem MBL humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-1 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em MBL homo- zigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimen- são. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlo- nais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[053] Figura 14: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de BSA/Ficolina-3. Poços revestidos por AcBSA foram incubados com ou sem Ficolina-3 humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-1 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em Ficolina-3 homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[054] Figura 15: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de manana/MBL. Poços revestidos por manana foram incubados com MBL humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-1 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em MBL homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[055] Figura 16: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Poços revestidos por AcBSA foram incubados com Ficolina-3 humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-1 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em Ficolina-3 homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[056] Figura 17: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de manana/MBL. Poços revestidos por manana foram incubados com MBL humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-2 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em MBL homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[057] Figura 18: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Poços revestidos por AcBSA foram incubados com Ficolina-3 humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-2 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em Ficolina-3 homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[058] Figura 19: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de manan/MBL. Poços revestidos por manana foram incubados com MBL humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-3 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em MBL homozigótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[059] Figura 20: Ativação do complemento de C4 em um ensaio ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Poços revestidos por AcBSA foram incubados com Ficolina humana recombinante seguido por incubação com diluições seriais de rMASP-3 como sobrenadantes de cultura de meio livre de soro em uma dimensão. Soro deficiente em Ficolina-3 homozi- gótico foi a seguir incubado em diluições seriais na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando anticorpos anti C4c policlonais. As barras de erro indicam duas vezes os desvios padrão em determinações duplas de cada ponto das curvas.

[060] Figura 21: Distribuição de tecido de FAP, MASP1 e MASP3. FAP foi muito mais expressa em tecido cardíaco se comparada a MASP1 e MASP3. FAP foi expressa três vezes mais em tecido cardíaco comparado à expressão de FAP no fígado. Ademais, uma expressão de FAP mais alta foi observada no fígado em comparação à expressão de MASP1 e MASP3 no fígado. Expressão considerável de FAP também foi detectada no cérebro, músculo esquelético e tecidos da próstata. O experimento foi realizado três vezes em duplicatas. O erro padrão da média é indicado.

[061] Figura 22: Localização imuno-histoquímica no fígado de MAP-1 usando antissoro de camundongo policlonal contra resíduos de término C específicos a FAP de proteína. Coloração de controle foi negativo. Diversos anticorpos policlonais diferentes criados contra FAP (coelho e camundongo) mostraram o mesmo padrão de coloração.

[062] Figura 23: Análise imuno-histoquímica de MAP-1 da localização no tecido (OM X10). O painel esquerdo mostra a coloração com um mAb (12B11) para MAP-1. Painel da direita mostra a coloração controle do isotipo com um IgG1k mAb não-relacionado. (A- B): Miocárdio, (C-D): músculo esquelético, (E-F): amostra de fígado, (G-H): tecido aórtico. Barra no canto inferior direito indica 50 μm em todos os slides.

[063] Figura 24: Imunoprecipitação de complexos de soro de MAP-1 e MASP-1/3. (A) MAP-1 e MASP-1/3 foi imunoprecipitada do soro usando mAb 20C4 (anti MAP-1) e mAb 8B3 (anti MASP-1/3 com um epítopo na cadeia pesada comum). Amostras reduzidas sofreram eletro-blot e se desenvolveram com pAb para MAP-1 ou mAbs biotini- ladas para Ficolina-3 (FCN334) e MBL (Hyb 131-1). (B) Imunoprecipi- tação com mAbs para MBL (Hyb 131-11), Ficolina-2 (FCN219) e Fico- lina-3 (FCN334) de 1 mL, 300 μL e 100 μL de soro, respectivamente (lado esquerdo). Controles foram MAP-1 precipitada do soro (sMAP-1) e rMAP-1 de sobrenadante (rMAP-1) usando mAb anti-MAP-1 20C4 (lado direito). As amostras foram analisadas por western blot sondado com pAb para MAP-1.

[064] Figura 25: Influência de MASP-2 e MAP-1 na deposição do complemento C4 mediado por MBL e Ficolina-3. As deposições de C4 foram medidas usando um anticorpo policlonal para C4 e são dadas como valores OD490-650nm. As barras de erro indicam duas vezes o desvio padrão de determinações duplas. Concentrações aproximadas de rMBL, rFicolina-3. RMAP-1 e rMASP-2 são dadas nos rótulos da figura. (A) Reconstituição da deposição de C4 em uma superfície revestida por manana usando soro deficiente MBL com rMBL a 400 ng/mL. O controle foi sem a adição de rMBL. (B) Efeito dose dependente de rMASP-2 na deposição de C4 mediada por rMBL. (C) Efeito dose dependente de rMAP-1 na deposição de C4 mediada por rMBL. (D) Reconstituição da deposição de C4 em uma superfície revestida por AcBSA usando soro deficiente em Ficolina-3 com rFicolina-3 a 400 ng/mL. O controle foi sem adição de rFicolina-3. (E) Efeito dose dependente de rMASP-2 na deposição de C4 mediada por rFicolina-3. (F) Efeito dose dependente de rMAP-1 na deposição de C4 mediada por rFicolina-3.

[065] Figura 26: Influência de MASP-2 e MAP-1 na deposição do complemento de C4 em um sistema puro. RMBL em uma superfície de manana foi pré-incubada com diluições seriais de rMASP-2 na primeira dimensão. Diluições seriais de rMAP-1 foram então aplicadas na se gunda dimensão seguido pela aplicação de C4 purificada a 1 μg/mL. As deposições de C4 foram medidas com um pAb para C4 e são dadas como valores OD490-650nm. As barras de erro indicam duas vezes o desvio padrão das determinações duplas. As concentrações aproximadas de rMAP-1 e rMASP-2 são dadas nos rótulos da figura.

[066] Figura 27: Análise SDS-PAGE de rMAP-1. O lado esquerdo mostra a análise imunoblot +/- tratamento com N-glicosidase F (ENDO- F). O lado direito mostra a coloração com Coomassie correspondente.

[067] Figura 28A, B. Curvas de calibração. A) Curva de calibra- ção gerada por ELISA de dois lados mAb 20C4/mAb-8B3 com duas diluições seriais de rMAP-1 aplicadas a um conjunto de MAP-1 esgotado de soro humano normal (pNHS) ou diluições seriais de rMAP-1 diluída em PBS/0,05% Tween / 10 mM de EDTA. As barras de erro indicam duas vezes o desvio padrão de oito determinações. B) Imuno- blot de soro esgotado de MAP-1, soro humano normal e soro esgotado de MAP-1 com rMAP-1.

[068] Figura 29A - C. Concentrações no soro de MAP-1. A) Con centrações no soro e faixa de distribuição de MAP-1 em 100 doadores de sangue dinamarqueses. Nível médio do soro: 240 ng/mL. Faixa: 115 - 466 ng/mL.; B) Correlação entre os níveis no soro de MASP-3 e MAP-1; C) Influência do congelamento e descongelamento do soro. O soro foi congelado e descongelado por 8 vezes e o nível de MAP-1 foi medido para cada vez. As barras de erro indicam duas vezes o desvio padrão de determinações duplas.

[069] Figura 30 A) Níveis de associação (em unidades relativas de O.D. 490 - 650 nm) entre MAP-1, MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3 respectivamente em 100 doadores de sangue dinamarqueses. Os valores P foram obtidos por teste t de duas caudas, não paramétricos. B) Correlação entre os níveis de soro de MAP-1 e a associação relativa a MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3 (lado esquerdo). Correlação entre os níveis de soro de MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3 e a associação relativa a MAP-1 (lado direito). Valores r e p de correlação foram calculados usando o teste de correlação de classificação de Spearman não paramétrico.

[070] Figura 31A - C. Ultracentrifugação de gradiente de sacaro se. A) Frações coletadas (1 - 27) de soro submetido a um gradiente de densidade de sacarose de 10 - 30%. As frações coletadas foram analisadas por ELISA específico para: MAP-1, MASP-3, MBL, Ficolina- 2 e -3. Os picos de IgM (19S) e IgG (7S) no soro são indicados no topo do gráfico. B) Frações número 8 - 23 analisadas por immunblotting para: MAP-1, MASP-1, MASP-3, sMAP, MASP-2, MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3. C) Frações 1 - 27 analisadas pela capacidade de ativar C4 humana ativada de modo exógeno em BSA acetilado imobilizado (um ligante de Ficolina-3) ou manana (um ligante de MBL).

EXPOSIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[071] Constatou-se uma proteína plasmática nova de 40 kDa as sociada ao reconhecimento de moléculas do caminho do complemento de lectina e identificada como uma nova variante de transcrição alternativa de MASP-1 / MASP-3 que por sua vez corresponde à proteína plasmática recém-descoberta.

[072] Mostrou-se que a proteína nova (nomeada pelos inventores de FAP (Proteína associada à Ficolina) ou MAP-1 (proteína associada à MBL/Ficolina -1) não contém um domínio enzimático, mas contém o domínio ligante a ficolina/MBL e, assim, espera-se que esteja envolvida na regulação e inibição das funções de complemento e coagulação através de competição e deslocamento das MASPs ou alternativamente, mas não exclusivamente, como uma proteína envolvida em funções de varredura ou sinalização.

[073] A ativação descontrolada do sistema de complementos e/ou da cascata de coagulação é fortemente associada ao resultado grave fatal em uma variedade de doenças variando de inflamação e sepse sistêmicos, através infarto do miocárdio e autoimunidade.

[074] A inibição de coagulação e ativação de complementos mos trou ser uma ferramenta terapêutica promissor.

[075] A presente invenção descreve ambas as funções de inibi ção de complemento e de coagulação. Contudo, os polipeptídeos, de acordo com a invenção, podem ter outras funções, tais como re- cuperador e/ou uma função sinalizadora. Além disso, pode ser usado como um novo marcador em várias configurações de doença, incluindo doenças malignas, condições autoimunes, metabólicas e/ou inflamatórias.

[076] Evidenciou-se uma proteína plasmática presente in vivo denominada Proteína Associada à Ficolina (FAP) e demonstrou-se que é primariamente associada às ficolinas (Figura 9), mas pode ser provável também de associação com lectina de ligação à manose. Ao pesquisarem a base de dados de nucleotídeos de NCBI, os inventores da presente invenção encontraram uma variante de transcrito possível que corresponde a um truncado de MASP-1. Com base nesta sequência, os iniciadores foram desenhados de modo a amplificar o novo transcrito de gene putativo. Subsequentemente, usando-se cDNA de fígado humano, foi identificada uma nova variante de transcrito alternativo do gene de MASP-1 (Figura 1). A cepa de mRNA foi sequenciada, e, por conseguinte, a sequência de aminoácidos foi determinada, que corresponde ao peso molecular da proteína observada em plas- ma/soro de 40 kDa (Figura 5). A nova proteína é parcialmente idêntica às MASP-1 e MASP-3, mas carece de um domínio de serina protease, mas contêm um novo exon que codifica 17 aminoácidos seguindo por um códon de parada. O exon é particionado no transcrito MASP1 e MASP3 (Figura 2). Usando-se um painel de bibliotecas de expressão de mRNA, os presentes inventores encontraram evidência de que es- sa proteína é fortemente expressa no coração e no fígado, seguida por musculatura esquelética (Figura 3). Expressão fraca foi observada no cérebro, no aparelho digestivo, na próstata e no baço (Figura 3). Análise Taqman confirmou a expressão nas células do coração e do fígado. FAP foi expressa três vezes mais altas no tecido cardíaco em comparação com a expressão de FAP no fígado. Além disso, a expressão de FAP mais alta foi observada no fígado em comparação. Expressão de FAP considerável foi também detectada no cérebro, musculatura esquelética e nos tecidos da próstata. O experimento foi realizado três vezes em duplicatas.

[077] A expressão alta no coração é bastante proeminente e fez com que os presentes inventores sugerissem o uso dos polipeptídeos, de acordo com a presente invenção, como um protetor bastante útil contra dano tecidual em condições autoimunes, metabólicas e/ou anti- inflamatórias, tais como as condições médicas associadas ao coração.

[078] Estabeleceu-se ensaios para avaliar atividade de comple mento iniciada por ficolinas e lectina de ligação à manose e assim foi possível que os presentes inventores mostrassem uma inibição de complemento funcional de FAP.

[079] Estabeleceu-se ensaios quantitativos em tempo real para medir o nível exato de expressão relativa em tecidos diferentes.

[080] Os polipeptídeos, de acordo com a presente invenção, po dem ser produzidos por técnicas recombinantes. Coelhos ou camundongos podem ser imunizados com um único peptídeo longo de ami- noácido 15 para obter anticorpos específicos para FAP policlonais e monoclonais, respectivamente.

[081] Anticorpos para FAP específicos podem ser usados para me dição quantitativa e detecção imunoistoquímica em diferentes tecidos.

[082] Constantes de ligação entre FAP e parceiros de ligação di ferentes, conforme descrição aqui, podem ser determinadas em ELISA e usando-se tecnologia de ressonância de plasmônio de superfície (Biacore).

[083] Uma proteína aceptora específica para FAP, tal como um receptor ligação à superfície de célula específica, pode ser identificada por ensaios padrão conhecidos daquele versado na técnica, em que a proteína é ligada diretamente às células.

[084] A nova proteína Associada À Ficolina (FAP) é uma varian te de partição alternativa de MASP1. A proteína carece de domínio de serina protease, mas ela ainda contém os domínios que estão envolvidos na ligação aos iniciadores da via da lectina do sistema de complementos. Assim, os presentes inventores esperam que a proteína esteja envolvida na regulação e inibição da função de MASP-1 e MASP-3 (complemento, funções de coagulação e outros substratos de enzimas) através de competições e deslocamento das MASps. Alternativamente, mas não mutuamente exclusivo, a FAP pode funcionar como molécula recuperadora que facilita a remoção dos complexos de FAP/MBL/ficolina ligados a materiais de despejo endógenos ou patógenos.

[085] A ativação descontrolada do sistema de complementos e a cascata de coagulação estão associadas ao resultado adverso e inibidores funcionais, tais como os polipeptídeos de acordo com a invenção, podem ser úteis para o controle do sistema de complementos e para a cascata de coagulação. Além disso, os polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser usados em outras configurações. Outro ângulo poderia ser usar a proteína como biomarcador em configurações de doenças diferentes.

[086] A proteína é única e pode proporcionar a base para novos fármacos e/ou para novas ferramentas de diagnóstico.

[087] Os polipeptídeos, de acordo com a presente invenção, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ou um fragmento imunológico ou variante deste pode ter uma função específica associada a esta sequência de aminoácidos. É sugerido pelos presentes inventores que tais polipeptídeos podem ter uma função ou atividade correspondente à atividade de uma ou mais proteínas selecionadas de DNMT1 DNA (citosina-5-)-metiltransferase 1 (DNMT1), membro 1 da subfamília B de Golgin (GOLGB1), proteína 9 de anco-ragem de A-quinase (AKAP9), proteína associada a linfócito B e T (an- tígeno CD272), proteína 1 de adaptador de engolfamento contendo o domínio PTB (GULP), e proteína 2 contendo domínio MACRO.

[088] Em algumas modalidades de interesse particular, os poli- peptídeos, de acordo com a presente invenção, têm a função ou atividade correspondente à atividade da proteína 1 de adaptador de engol- famento contendo domínio PTB (GULP).

Definições

[089] A expressão "polipeptídeo associada à ficolina", conforme usada aqui, significa qualquer proteína ou polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos 20-380 da proteína associada à ficoli- na (FAP), humana, nativa (SEQ ID NO:1) ou sequência de aminoáci- dos de 16-363 da SEQ ID NO:9, variantes funcionais, versões truncadas funcionais desates bem como derivados ou conjugados funcionais, cujo polipeptídeo não tem atividade de complemento, mas possui a capacidade de competir com MASP-1, MASP-2 ou MASP-3 por ligação com a ficolina-3, MBL, C1q, proteínas tensoativas do pulmão SP-A e/ou SP-D e/ou CL-L1 (e outros membros da família da colectina). Isso inclui, mas sem limitação, polipeptídeo associado à ficolina (FAP), humana, tendo SEQ ID NO:1 e variantes desta.

[090] A expressão "proteína associada à ficolina (FAP)", como usada aqui, significa proteínas que têm a sequência de aminoácidos 1380 (com ou sem peptídeo de sinal, tal como a sequência de aminoá- cidos 20-380) de FAP humana, nativa (SEQ ID NO:1), variações aléli- cas naturais e homólogos destas. Isso inclui também proteínas com uma sequência de aminoácidos levemente modificada, por exemplo, uma extremidade N-terminal ou uma extremidade C-terminal, modificadas, incluindo deleções ou adições de aminoácidos N-terminal ou C- terminal desde que estas proteínas retenham substancialmente a atividade da FAP. A expressão "proteína associada à ficolina (FAP)" é usada de modo intercambiável com os temos "Map-1" ou "proteína 1 associada à MBL/Ficolina". "FAP" dentro da definição acima inclui também variações alélicas naturais que podem existir e ocorrer de um modo individual a outro. O termo inclui também proteína com sequências homólogas e função similar derivadas de outras espécies que não a humana, tais como bovinos, porco, cachorro, cavalo, rato e camundongo. Também, o grau e a localização da glicosilação ou outras modificações pós-traducionais podem variar dependendo das células hospedeiras escolhidas e da natureza do ambiente celular hospedeiro.

[091] O termo "serina protease associada à MBL-1" ou "MASP-1" conforme usado aqui significa proteínas que possuem a sequência de aminoácidos 1 - 699 (com ou sem o peptídeo de sinal, como a sequência de aminoácidos 20 - 699) de MASP-1 humana nativa (SEQ ID NO: 5), variações alélicas naturais e homólogas destas. Deve ser entendido que a sequência pode estar em uma ou mais cadeias de pep- tídeos, como em duas cadeias, ou seja, as cadeias leve e pesada da proteína humana nativa.

[092] O termo "serina protease associada a MBL-3" ou "MASP-3" conforme usado aqui significa proteínas que possuem a sequência de aminoácidos 1 - 728 (com ou sem o peptídeo de sinal, como a sequência de aminoácidos 20 - 728) de MASP-3 humana nativa (SEQ ID NO: 7), variações alélicas naturais e homólogas destas. Deve ser entendido que a sequência pode estar em uma ou mais cadeias de pep- tídeos, como em duas cadeias, ou seja, as cadeias leve e pesada da proteína humana nativa.

[093] O termo "serina protease associada a MBL-2" ou "MASP-2" conforme usado aqui significa proteínas que possuem a sequência de aminoácidos 1 - 686 (com ou sem o peptídeo de sinal, como a sequência de aminoácidos 16 - 686) de MASP-2 humana nativa (SEQ ID NO: 9), variações alélicas naturais e homólogas destas. Deve ser entendido que a sequência pode estar em uma ou mais cadeias de pep- tídeos, como em duas cadeias, ou seja, as cadeias leve e pesada da proteína humana nativa.

[094] Os termos "proteína associada a MBL pequena", "sMAP", "proteína plasmática associada a MBL de 19 kD" ou "Map19" conforme usados aqui significam proteínas que possuem a sequência de amino- ácidos 1 - 185 (com ou sem peptídeo de sinal, como a sequência de aminoácidos 16 - 185) de sMAP humana nativa (SEQ ID NO: 11), variações alélicas naturais e homológos destas.

[095] Os termos "variante" ou "variantes", conforme usados aqui, têm por objetivo designar um polipeptídeo associado à ficolina que possui a sequência de SEQ ID NO:2 ou um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, em que um ou mais aminoácidos foram substituídos por outro aminoácido e/ou em que um ou mais aminoácidos foram deletados e/ou em que um ou mais aminoácidos foram inseridos no polipeptídeo, e/ou em que um ou mais aminoácidos foram adicionados ao polipeptídeo. Tal adição pode ocorrer ou no N-terminal ou no C-terminal ou em ambos. A "variante" ou "variantes" dentro dessa definição ainda possui atividade funcional. Em algumas modalidades, uma variante possui 70% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, uma variante possui uma sequência de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, uma variante possui 90% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, uma variante possui 95% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:1.

[096] Em algumas modalidades, uma variante possui 70% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, uma variante possui 80% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, uma variante possui 90% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, uma variante possui 95% de identidade com a sequência de SEQ ID NO:4.

[097] As frases "variante funcional, "versões truncadas funcio nais" e "derivados funcionais", conforme usadas aqui, referem-se a variantes, versões truncadas, bem como a derivados de SEQ ID NO:1, cujos polipeptídeos compreendam partes de sequência essenciais de SEQ ID NO:1 e tenham pelo menos a capacidade de competir com MASP-1 e MASP-3 para a ligação às ficolinas ou MBL sem possuir a atividade de complemento e/ou atividade de serina protease. Deve ser entendido que um polipeptídeo associado à ficolina pode possuir duas ou três dessas características selecionadas dentre ser uma variante, e/ou truncamento e/ou derivado.

[098] Uma variante funcional de um polipeptídeo associado à fi- colina engloba aqueles que exibem pelo menos cerca de 25%, tal qual pelo menos cerca de 50%, tal qual pelo menos cerca de 75%, tal qual pelo menos cerca de 90% da atividade específica de FAP do tipo selvagem que foi produzida no mesmo tipo celular, quando testada nos ensaios descritos aqui.

[099] O termo "fragmento imunológico", conforme usado aqui, refere-se a um fragmento de uma sequência de aminoácidos que possui essencialmente as mesmas atividades funcionais e a mesma orientação espacial a ser reconhecida por um anticorpo. Assim, um anticorpo específico se ligará a ambos o polipeptídeo e a fragmentos imuno- lógicos deste.

[0100] O termo "outro aminoácido" conforme usado aqui significa um aminoácido que é diferente daquele aminoácido naturalmente presente naquela posição. Isto inclui, sem limitação, aminoácidos que podem ser codificados por um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o aminoácido diferente estará na forma L natural e pode ser codificado por um polinucleotídeo.

[0101] O termo "derivado" conforme usado aqui pretende designar um polipeptídeo associado à ficolina que exibe atividade biológica subs-tancialmente igual ou melhorada com relação à FAP humana do tipo selvagem, no qual um ou mais aminoácidos do peptídeo parente foram quimicamente modificados através de, por exemplo, alquilação, peguila- ção, acilação, formação de éster ou formação de amida ou similares.

[0102] O termo "atividade de complemento", conforme usado aqui, significa a capacidade de ativar o sistema de complemento. A atividade de complemento pode ser medida com ensaio conforme descrito na seção intitulada "ensaios".

[0103] O termo "lectina que se liga à manose (MBL)" conforme usado aqui, também significa lectina que se liga à manana, lectina que se liga à manose (MBP1) e proteína que se liga à manana, cujos termos podem ser usados de modo intercambiável.

[0104] O termo "capaz de se associar" conforme usado aqui, refe re-a à capacidade das proteínas de acordo com a presente invenção de se ligarem especificamente em solução a um ou mais dos iniciadores do caminho de lectina do sistema de complemento ou outras proteínas que possam estar envolvidas no efeito do polipeptídeo.

[0105] O termo "construção" pretende indicar um segmento de po- linucleotídeo que pode ser baseado em uma sequência de nucleotí- deos de ocorrência natural completa ou parcial que codifica o polipep- tídeo de interesse. A construção pode conter, opcionalmente, outros segmentos de polinucleotídeos. De maneira similar, o termo "aminoá- cidos que podem ser codificados por construções de polinucleotídeos" engloba aminoácidos que podem ser codificados por construções de polinucleotídeos definidos acima, ou seja, aminoácidos como Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp e Gln.

[0106] O termo "vetor" conforme usado aqui significa qualquer en tidade de ácidos nucleicos capaz de amplificação em uma célula hospedeira. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extra-cromossômica, cuja replicação seja independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. De maneira alternativa, o vetor pode ser tal que quando introduzido em uma célula hospedeira, seja integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo ao qual foi integrado. A escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual ele será introduzido. Vetores incluem, sem limitação, vetores de plasmídeos, vetores de fagos, vírus e vetores de cosmídeos. Vetores normalmente contêm uma origem de replicação e pelo menos um gene selecionável, ou seja, um gene que codifica um produto que é prontamente detectável ou cuja presença é essencial para o crescimento celular.

[0107] Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedei ra recombinante compreendendo uma construção de polinucleotídeos ou o vetor. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recombinan- te é uma célula eucariótica. Em outras modalidades a célula hospedeira recombinante é de origem mamífera. Em outra modalidade, a célula hospedeira recombinante é selecionada do grupo que consiste em células de CHO, células HEK e células BHK.

[0108] O termo "uma célula hospedeira", conforme usado aqui, representa qualquer célula, incluindo células híbridas, em que DNA heterólogo possa ser expresso. Células hospedeiras típicas incluem, sem limitação, células de inseto, células de levedura, células de mamíferos, incluindo células humanas, tais quais células BHK, CHO, HEK e COS. Na prática da presente invenção, as células hospedeiras sendo cultivadas são preferivelmente células mamíferas e, mais preferivelmente, uma linhagem celular mamífera estabelecida incluindo, sem limitação, linhagem celular CHO (por exemplo, ATCC CCL 61), CO-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), rim de filhote de hamster (BHK) e HEK293 (por exemplo, ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 - 72, 1977). Uma linhagem celular BHK preferida é a linhagem celular BHK tk- ts13 (Waechter e Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106 - 1110, 1982), daqui em diante referida por células BHK 570. A linhagem celular BHK 570 está disponível pela American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, sob número de acesso ATCC CRL 10314. Uma linhagem celular BHK tk- ts13 também está disponível pelo número de acesso ATCC CRL 1632. Outras linhagens celulares adequadas incluem, sem limitação, Hep I de rato (hepatoma de rato; ATCC CRL 1600), Hep de rato II (hepatoma de rato; ATCC CRL 9.1) e células DUKX (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 - 4220, 1980). Também úteis são células 3T3, células de Namalwa, mielomas e fusões de mielomas com outras células.

[0109] Em outro aspecto, a invenção fornece um animal transgêni- co que contém e expressa uma construção de polinucleotídeos.

[0110] Em outro aspecto, a invenção fornece uma planta transgê- nica que contém e expressa a construção de polinucleotídeos.

[0111] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a produção do polipeptídeo associado à ficolina da invenção, método que compreende cultivar uma célula que compreende a construção de polinucleotídeos em um meio de crescimento apropriado sob condições que permitam a expressão da construção de polinucleotídeos e a recuperação do polipeptídeo resultante do meio de cultura.

[0112] Conforme usado aqui, o termo "meio de crescimento apro priado" significa um meio que contém nutrientes e outros componentes exigidos para o crescimento de células e para a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo associado à ficolina da invenção.

[0113] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a produção do polipeptídeo associado à ficolina, método que compreende recuperar o polipeptídeo de leite produzido pelo animal transgênico.

[0114] Em outro método, a invenção se refere a um método para a produção do polipeptídeo associado à ficolina, método que compreende cultivar uma célula de uma planta transgênica compreendendo a construção de polinucleotídeo e recuperar o polipeptídeo da planta resultante.

[0115] No presente contexto, o termo "tratamento" significa incluir tanto a prevenção de uma condição esperada envolvendo a ativação inapropriada do complemento, tais como inflamação e dano de reperfu- são como a regulação de uma condição que já ocorre, como um infarto e parada do miocárdio com o propósito de inibir ou minimizar o dano ao tecido. A administração profilática do polipeptídeo associado à ficolina de acordo com a invenção é assim inclusa no termo "tratamento".

[0116] O termo "paciente" conforme usado aqui pretende significar qualquer animal, em particular mamíferos, tais quais humanos e, pode, quando apropriado, ser usado de modo intercambiável com o termo "sujeito".

[0117] O termo "identidade de sequência" conforme conhecido da técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeos ou duas ou mais moléculas de ácidos nu- cleicos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa um grau de relacionamento de sequências entre moléculas de ácidos nucleicos ou entre polipeptí- deos, conforme o caso, como determinado pelo número de pares entre as fitas de dois ou mais resíduos de nucleotídeos ou dois ou mais resíduos de aminoácidos. "Identidade" mede o percentual de pares idênticos entre as menores de duas ou mais sequências com alinhamento de lacunas (se houver) tratadas por um modelo matemático ou programa de computador particular (ou seja, "algoritmos").

[0118] O termo "similaridade" é um conceito relacionado, mas ao contrário de "identidade", refere-se a uma relação de sequência que inclui tanto pares idênticos como pares de substituição conservadora. Se duas sequências de polipeptídeos possuem, por exemplo, aminoá- cidos idênticos (fração (10/20)), e o restante são todas substituições não conservadoras, então a identidade e a similaridade percentual seriam ambas 50%. Se, no mesmo exemplo, há 5 mais posições em que há substituições conservadoras, então a identidade percentual permanece 50%, mas a similaridade percentual seria de 75% ((fração (15/20))). Portanto, nos casos em que há substituições conservadoras, o grau de similaridade entre dois polipeptídeos será maior que o percentual de identidade entre esses dois polipeptídeos.

[0119] Modificações conservadoras à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (e as modificações correspondentes aos nucleotídeos codificadores) produzirão polipeptídeos associados à ficolina que possuem características funcionais e químicas similares àquelas de FAP de ocorrência natural. Ao contrário, modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas de um polipeptídeo associado à ficolina podem ser realizadas pela seleção de substituições na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que difiram significativamente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura da espinha dorsal molecular na área de substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) na carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) na maior parte da cadeia lateral.

[0120] Por exemplo, uma "substituição de aminoácidos conserva dora" pode envolver a substituição de um resíduo de aminoácidos nativo com um resíduo não ativo de modo que haja pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácidos naquela posição. Ademais, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo também pode ser substituído com alanina, conforme foi previamente descrito em "mutagênese de monitoramento de alanina" (vide, por exemplo, Ma- cLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, o qual discute a mutagênese de monitoramento de alanina).

[0121] Substituições de aminoácidos desejadas (sejam conserva doras ou não conservadoras) podem ser determinadas pelos técnicos no assunto na hora em que tais substituições forem desejadas. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes de um polipeptídeo associado à ficolina, ou para aumentar ou diminuir a afinidade de um polipeptídeo associado à ficolina descrito aqui.

[0122] Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades de cadeias laterais comuns: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) acídicos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0123] Por exemplo, substituições não conservadoras podem en volver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do polipeptídeo associado à ficolina humana que são homólogas com os polipeptídeos associados à ficolina não humana, ou nas regiões não homólogas da molécula.

[0124] Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático dos aminoáci- dos pode ser considerado. A cada aminoácido foi designado um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga, esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilala- nina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); gli- cina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspar- tato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

[0125] A importância do índice hidropático dos aminoácidos na avaliação da função biológica interativa em uma proteína é entendida na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105 - 131 (1982). Sabe-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoáci- dos que possuem um índice hidropático similar e ainda mantêm uma atividade biológica similar. Ao se fazerem mudanças baseadas no índice hidropático, a substituição desses aminoácidos cujos índices hi- dropáticos estão dentro de ±.2 é preferível, aqueles que estão dentro de ±.1 são particularmente preferíveis e aqueles dentro de ±.05 são ainda mais preferíveis.

[0126] Também é entendido na técnica que a substituição de ami- noácidos similares pode ser feita de maneira eficaz com base na hidro- filicidade, particularmente onde a proteína ou peptídeo biologicamente funcionalmente equivalente assim criado é pretendido para uso em modalidades imunológicas, como no presente caso. A maior hidrofilici- dade média local de uma proteína, conforme regida pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com sua imunogeni- cidade e antigenicidade, ou seja, com uma propriedade biológica da proteína.

[0127] Os seguintes valores de hidrofilicidade foram designados para os resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (3,0); asparta- to (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leu- cina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofa- no (-3,4). Ao se fazerem mudanças baseadas em índices de hidrofili- cidade similares, a substituição desses aminoácidos cujos índices de hidrofilicidade estão dentro de ±.2 é preferível, aqueles que estão dentro de ±.1 são particularmente preferíveis e aqueles dentro de ±.05 são ainda mais preferíveis. Também se pode identificar epítopos de sequências de aminoácidos primários com base na hidrofilicidade. Essas regiões são também referidas por "regiões de núcleo de epítopo".

[0128] Um técnico no assunto será capaz de determinar variantes adequadas do polipeptídeo conforme revelado em SEQ ID NO:1 usando técnicas bem conhecidas. Para a identificação de áreas adequadas da molécula que podem ser mudadas sem que se destrua a atividade, um técnico no assunto pode mirar áreas alvo que se acredita não serem importantes para a atividade. Por exemplo, quando polipeptídeos similares com atividade similar da mesma espécie ou de outras espécies são conhecidos, um técnico no assunto pode comparar a sequência de ami- noácidos do polipeptídeo associado à ficolina a tais polipeptídeos similares. Com tal comparação, podem-se identificar resíduos e partes das moléculas que não são conservadas dentre polipeptídeos similares. Deve ser entendido que mudanças em áreas de um polipeptídeo associado à ficolina que não são conservadas com relação a polipeptídeos similares teriam menos probabilidade de afetar adversamente a atividade biológica e/ou a estrutura do polipeptídeo associado à ficolina. Um técnico no assunto também sabe que, mesmo em regiões relativamente conservadas, pode-se substituir aminoácidos quimicamente similares para os resíduos de ocorrência natural enquanto se mantém a atividade (substituições de aminoácidos conservadoras). Portanto, mesmo essas áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem ser submetidas a substituições conservadoras de ami- noácidos sem que se destrua a atividade biológica ou sem que se afete adversamente a estrutura do polipeptídeo.

[0129] Adicionalmente, um técnico no assunto pode rever estudos de função-estrutura identificando resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. Tendo em vista tal comparação, pode-se predizer a importância dos resíduos de aminoá- cidos em um polipeptídeo associado à ficolina que correspondem aos resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade ou estrutura em polipeptídeos similares. Um técnico no assunto pode optar por substituições quimicamente similares de aminoácidos para tais resíduos de aminoácidos preditivamente importantes de polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção.

[0130] Um técnico no assunto também pode analisar a estrutura tridimensional e a sequência de aminoácidos com relação à estrutura em polipeptídeos similares. Tendo em vista essa informação, um técnico no assunto pode prever o alinhamento de resíduos de aminoáci- dos de um polipeptídeo associado à ficolina com relação à sua estrutura tridimensional. Um técnico no assunto pode escolher não fazer mudanças radicais nos resíduos de aminoácidos que foram previstos como estando na superfície da proteína, já que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Ademais, um técnico no assunto pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácidos em cada resíduo de aminoáci- dos desejado. Tais variantes poderiam ser usadas para colher informações quanto a variantes adequadas. Por exemplo, se é descoberto que uma mudança em um resíduo de aminoácidos em particular resul- ta em atividade destruída, reduzida indesejavelmente ou inadequada, variantes com tais mudanças seriam evitadas. Em outras palavras, baseado na informação colhida de tais experimentos rotineiros, um técnico no assunto pode prontamente determinar os aminoácidos em que substituições adicionais devem ser evitadas ou sozinhas ou em combinação com outras mutações.

[0131] Diversas publicações científicas foram devotadas a prever a estrutura secundária. Vide Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 e Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Ademais, programas de computador estão atualmente disponíveis para ajudar na previsão da estrutura secundária. Um método de prever a estrutura secundária é baseado na modelagem da homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas, os quais possuem uma identidade de sequência maior que 30%, ou similaridade maior que 40% frequentemente possuem topologias estruturais similares. O recente crescimento do banco de dados estrutural de proteínas (PDB) forneceu previsibilidade melhorada da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro da estrutura do polipeptídeo ou da proteína. Vide Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Foi sugerido que (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) há um número limitado de dobras em um dado polipeptídeo ou proteína e uma vez que um número crítico de estruturas foi resolvido, a previsão estrutural melhorará dramaticamente em precisão.

[0132] Métodos adicionais de previsão da estrutura secundária in cluem "formação de fios" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377- 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-9 (1996)), "análise de perfis" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzymol., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), e "ligação evolucionária" (Vide Home, supra, e Brenner, acima).

[0133] Identidade e similaridade de polipeptídeos relacionados po dem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, sem limitação, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

[0134] Métodos preferíveis para a determinação de identidade e/ou similaridade são projetados para fornecer o maior número de pares entre as sequências testadas. Métodos para determinar identidade e similaridade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, sem limitação, o paco do programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX é disponibilizado publicamente por National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Al- tschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser usado para determinar identidade.

[0135] Determinados esquemas de alinhamento de duas sequên- cias de aminoácidos podem resultar em pareamento de somente uma região curta das duas sequências, e essa pequena região alinhada podem possuir uma identidade de sequência muito alta mesmo embora não haja relação significativa entre as duas sequências de comprimento completo. Assim, em uma modalidade preferida, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) resultará em um alinhamento que cobre pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo alvo.

[0136] Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Ge netics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin), dois polipeptídeos para os quais o percentual de identidade de sequência deve ser determinado são alinhados para pareamento ótimo de seus respectivos aminoácidos (o "alcance de pareamento", conforme determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de espaço (a qual é calculada como 3 vezes a diagonal média; a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a "diagonal" é o valor ou o número assinalado para cada par perfeito de aminoácidos pela matriz de comparação particular), bem como uma matriz de comparação tal qual PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunção com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (Ver, Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3 (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.

[0137] Parâmetros preferidos para uma comparação de sequência de polipeptídeos incluem os seguintes:

[0138] Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); Matriz de Comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992); Penalidade de Lacuna: 12, Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4, Limite de Similaridade: 0

[0139] O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os pa râmetros acima mencionados são os parâmetros padrões para comparações de polipeptídeos (junto com nenhuma penalidade para lacunas terminais) usando o algoritmo GAP.

[0140] Parâmetros preferidos para as comparações de sequências de moléculas de ácidos nucleicos incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970) Matriz de Comparação: pares = +10, incompatíveis: 0, Penalidade da Lacuna: 50, Penalidade do Comprimento da Lacuna: 3.

[0141] O programa GAP também é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros padrões para comparações de moléculas de ácidos nucleicos.

[0142] Outros algoritmos exemplares, penalidades para a abertura de lacunas, penalidades para a extensão de lacunas, matrizes de comparação, fronteiras de similaridade, etc. podem ser usadas, incluindo-se aqueles revelados no manual do programa, Wisconsin Package, versão 9, setembro de 1997. As escolhas particulares a serem feitas serão claras para os técnicos no assunto e dependerão da comparação específica a ser feita, como DNA com DNA, proteína com proteína, proteína com DNA e, adicionalmente, se a comparação é feita entre os pares dados de uma sequência (nesse caso GAP ou Best- Fit são geralmente preferidos) ou entre uma sequência e um grande banco de dados de sequências (nesse caso, FASTA ou BLASTA são preferidos).

[0143] Preparação dos polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção.

[0144] A invenção também se refere a um método para a prepara ção de polipeptídeos humanos associados à ficolina e outros polipep- tídeos da invenção conforme mencionados aqui. Os polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção descritos aqui podem ser produzidos por meio de técnicas de ácidos nucleicos re- combinantes. Em geral, uma sequência de ácidos nucleicos FAP do tipo selvagem é modificada para codificar a proteína desejada. Essa sequência modificada é então inserida em um vetor de expressão, o qual é por sua vez transformado ou transfectado para células hospedeiras. Células eucarióticas superiores, em particular células de mamíferos cultivadas, são células hospedeiras preferíveis. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos completas para FAP humana é dada por SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.

[0145] As alterações na sequência de aminoácidos podem ser conseguidas por diversas técnicas. A modificação da sequência de ácidos nucleicos pode ser obtida por mutagênese específica a sítio. Técnicas para mutagênese específica a sítio são bem conhecidas na técnica e descritas em, por exemplo, Zoller e Smith (DNA 3:479 - 488, 1984) ou "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, páginas 61 - 68. Assim, usando as sequências de nucleotídeos e ami- noácidos de FAP, podem-se introduzir alterações à escolha. Da mesma forma, procedimentos para a preparação de uma construção de DNA usando reação em cadeia de polimerase usando iniciadores específicos são bem conhecidos pelos técnicos no assunto (cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, Califórnia, EUA).

[0146] Os polipeptídeos da presente invenção podem também compreender resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, sem limitação, beta- alanina, desamino-histidina, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidróxi prolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreoninq, hidróxi etilcisteína, hidróxi etil homocisteína, nitrogluta- mina, homoglutamina, ácido pipecólico, tiazolidina, ácido carboxílico, diidroprolina, 3- e 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, e 4-flúor fenilalanina. Diversos métodos são conhecidos da técnica para a incorporação de resíduos de ocorrência não natural em polipeptídeos. Por exemplo, um sistema in vitro pode ser empregado onde mutações sem sentido são suprimidas usando tRNAs supressores quimicamente aminoacetilados. Métodos para a síntese de aminoácidos e tRNA amino acetilado são conhecidos na técnica. A transcrição e a tradução de plasmídeos contendo mutações sem sentido é realizada em um sistema livre de células compreendendo um extrato de E. Coli S30 e enzimas e outros reagentes comercialmente disponíveis. Os polipeptídeos são purificados por cromatografia. Vide, por exemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; e Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Em um segundo método, a tradução é realizada em oócitos Xenopus por microinjeção de mRNA mutado e tRNAs supressores quimicamente amino acetilados (Tucatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 - 8, 1996). Dentro de um terceiro método, células de E. Coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que deve ser substituído (por exemplo, fenilalani- na) e na presença do aminoácido de ocorrência não natural desejado (por exemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina ou 4-flúor fenilalanina). O aminoácido de ocorrência não natural é incorporado no polipeptídeo no lugar de sua contra parte natural. Vide, Koide et al., Biochem. 33:7470 - 6, 1994. Resíduos de aminoácidos de ocorrência natural podem ser convertidos em espécies de ocorrência não natural por modificação química in vitro. A modificação química in vitro pode ser combinada com mutagênese direcionada a sítio para expandir adicionalmente a gama de substituições (Wynn e Richards, Protein Sci. 2:395 - 403, 1993).

[0147] A construção de ácidos nucleicos que codifica os polipeptí- deos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção pode ser adequadamente de origem genômica ou de cDNA, por exemplo, obtidos pela preparação de uma biblioteca genômica ou de cDNA e monitorando para sequências de DNA que codificam todo ou parte do polipeptídeo por hibridização usando sondas de oligonucleotídeos sintéticas de acordo com técnicas padrões (cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

[0148] A construção de ácidos nucleicos, que codifica um polipep- tídeo associado à ficolina, também pode ser preparada sinteticamente por métodos padrões estabelecidos, por exemplo, método de fosfoa- midita descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letter 22 (1981), 1859 - 1869, ou pelo método descrito em Mathess et al., EM- BO Journal 3 (1984), 801 - 805. De acordo com o método de fosfoa- midita, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sinteti- zador de DNA automático, purificados, recozidos, ligados e clonados em vetores adequados. As sequências de DNA que codificam os poli- peptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção também podem ser preparadas por reação em cadeia de polimerase usando iniciadores específicos, por exemplo, conforme descrito em US 4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491, ou Sambrook et al., acima.

[0149] Ademais, a construção de ácidos nucleicos pode ser de ori gem misturada sintética e genômica, sintética e de cDNA ou genômica e de cDNA preparada pela ligação dos fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (conforme apropriado), os fragmentos correspondendo às várias partes da construção inteira de ácidos nucleicos, de acordo com técnicas padrões.

[0150] A construção de ácidos nucleicos é de preferência uma construção de DNA. Sequências de DNA para uso na produção de po- lipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção irão tipicamente codificar um pré - pró polipeptí- deo na terminação de FAP para obter um processamento pós- traducional adequado e secreção da célula hospedeira.

[0151] As sequências de DNA que codificam os polipeptídeos as sociados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a invenção são em geral inseridas em um vetor recombinante que pode ser qualquer vetor, o qual pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor irá depender frequentemente da célula hospedeira na qual ele deve ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, por exemplo, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação do cromossomo, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser tal que quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado ao genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo ao qual ele foi integrado.

[0152] O vetor é preferivelmente um vetor de expressão no qual a sequência de DNA que codifica os polipeptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção seja ligada operacionalmente a segmentos adicionais exigidos para a transcrição do DNA. Em geral, o vetor de expressão é derivado de plasmídeo ou DNA viral, ou pode conter elementos de ambos. O termo "ligado operacionalmente" indica que os segmentos são ajustados de modo que funcionem de acordo com seus propósitos pretendidos, por exemplo, a transcrição se inicia em um promotor e procede através da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo.

[0153] Os vetores de expressão para uso na expressão de poli- peptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção irão compreender um promotor capaz de direcionar a transcrição de um gene clonado ou cDNA. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes que codificam proteínas ou homólogas ou heterólogas em relação à célula hospedeira.

[0154] Exemplos de promotores adequados para o direcionamento da transcrição do DNA que codifica o polipeptídeo associado à ficolina humana em células de mamíferos são o promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), o promotor MT-1 (gene da me- talo tioneína) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814), o promotor CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) ou o promotor tardio principal de adenovírus 2 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:13041319, 1982).

[0155] Um exemplo de um promotor adequado para uso em célu las de insetos é o promotor de poli-hedrina (US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), o promotor P10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), o promotor da proteína básica do vírus de poli-hedrose Autographa californica (EP 397 485), o promotor do gene 1 inicial imediato do baculovírus (US 5.155.037; US 5.162.222), ou o promotor do gene inicial retardado de 39 K de bacu- lovírus (US 5.155.037; US 5.162.222).

[0156] Exemplos de promotores adequados para uso em células hospedeiras de levedura incluem promotores de genes glicolíticos de levedura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber e Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434) ou os genes de desidrogenase do álcool (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), ou os promotores TPI1 (US 4,599,311) ou ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654).

[0157] Exemplos de promotores adequados para uso em células hospedeiras de fungos filamentosos são, por exemplo, o promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) ou o promotor tpiA. Exemplos de outros promotores úteis são aqueles derivados do gene que codificam a amilase de A. oryzae TAKA, proteinase aspár- tica de Rhizomucor miehe, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa-amilase estável ácida de A. niger, glucoamilase de A. niger ou A. awamori (gluA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triosefosfatoisomerase de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulan.

[0158] As sequências de DNA humano que codificam os polipeptí- deos associados à ficolina e outros polipeptídeos de acordo com a invenção podem também, se necessário, ser operacionalmente conectadas a um terminador adequado, como o terminador do hormônio do crescimento humano (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) ou os termi- nadores TPI1 (Alber e Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) ou ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099). Os vetores de expressão também podem conter um conjunto de sítios de emendas de RNA localizados abaixo do promotor e acima do sítio de inserção para a própria sequência FAP. Sítios de emendas de RNA preferíveis podem ser obtidos de genes de adenovírus e/ou imunoglobulina. Também contido nos vetores de expressão está um sinal de poliadenila- ção abaixo do sítio de inserção. Sinais de poliadenilação particularmente preferíveis incluem o sinal de poliadenilação anterior ou posterior da região 5 Elb de adenovírus, o terminador do gene do hormônio de crescimento humano (DeNoto et al., Nucl. Acids Res. 9:3719 - 3730, 1981) ou o sinal de poliadenilação do gene de FAP humana ou gene de FAP bovina. Os vetores de expressão também podem incluir uma sequência líder viral não codificadora, como o líder tripartite de adenovírus 2, localizado entre os sítios de emendas de RNA e promotor; e sequências aperfeiço- adoras, como o aperfeiçoador SV40.

[0159] Para direcionar os polipeptídeos associados à ficolina hu mana e outros polipeptídeos da presente invenção no caminho de se- creção das células hospedeiras, uma sequência de sinal de secreção (também conhecida como uma sequência líder, pré-pró sequência ou pré sequência) pode ser fornecida no vetor recombinante. A sequência de sinal de secreção é unida às sequências de DNA que codificam os polipeptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção no quadro de leitura correto. Sequências de sinal de secreção são comumente posicionadas em 5' da sequência de DNA que codifica o peptídeo. A sequência de sinal de secreção pode ser normalmente associada à proteína ou pode ser de um gene que codifica outra proteína secretada.

[0160] Para a secreção em células de levedura, a sequência de sinal de secreção pode codificar qualquer peptídeo de sinal, o que garante direção eficaz dos polipeptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção expressos na via de secreção da célula. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de ocorrência natural, ou uma parte funcional deste, ou pode ser um peptídeo sintético. Constatou-se que peptídeos sinais adequados são o peptídeo de sinal do fator alfa (US 4.870.008), o peptídeo de sinal da amilase salivar de camundongos (cf. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646), um peptídeo de sinal de carboxipepti- dase modificado (cf. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897),o peptídeo de sinal de levedura BAR1 (cf. WO 87/02670),ou o peptídeo de sinal da protease aspártica de levedura 3 (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137).

[0161] Para uma secreção eficaz em levedura, uma sequência que codifica um peptídeo líder pode também ser inserida abaixo da sequência sinal e acima da sequência de DNA que codifica os polipeptí- deos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção. A função do polipeptídeo líder é permitir que o peptídeo expresso seja direcionado a partir do retículo endoplasmá- tico para o complexo de Golgi e adiante para uma vesícula secretória para secreção no meio de cultura (por exemplo, exportação dos poli- peptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção ao longo da parede celular ou pelo menos através da membrana celular para dentro do espaço periplas- mático da célula de levedura). O peptídeo líder pode ser o líder do fator alfa de levedura (cujo uso é descrito em, por exemplo, US 4.546.082, US 4.870.008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 e EP 163 529). Alternativamente, o peptídeo líder pode ser um peptídeo líder sintético, o que significa dizer um peptídeo líder não encontrado na natureza. Peptídeos líderes sintéticos podem ser construídos, por exemplo, conforme descrito em WO 89/02463 ou WO 92/11378.

[0162] Para o uso em fungos filamentosos, o peptídeo de sinal po de ser convenientemente derivado de um gene que codifica uma ami- lase ou glicoamilase de Aspergillus sp., um gene que codifica a lipase ou protease de Rhizomocur miehei ou uma lipase de Humicola lanuginosa. O peptídeo de sinal é preferivelmente derivado de um gene que codifica a amilase TAKA de A. oryzae, alfa-amilase neutra de A. niger, amilase estável ácida de A. niger ou glicoamilase de A. niger. Peptí- deos de sinal adequados são revelados em, por exemplo, EP 238 023 e EP 215 594.

[0163] Para uso em células de insetos, o peptídeo de sinal pode ser convenientemente derivado de um gene de inseto (WO 90/05783), como o peptídeo de sinal precursor do hormônio adipocinético do lepi- dóptero Manduca sexta (US 5,023.328).

[0164] Os procedimentos usados para ligar as sequências de DNA que codificam os polipeptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção, o promotor e, opci-onalmente, as sequências terminadoras e/ou secretórias, respectivamente, e para inserir elas em vetores adequados contendo a informa- ção necessária para a replicação são bem conhecidas na técnica (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

[0165] Métodos para a transfecção de células mamíferas e ex pressão de sequências de DNA introduzidas nas células são descritas em, por exemplo, Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern e Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham e van der Eb, Virology 52 (1973), 456; e Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

[0166] Sequências de DNA clonado são introduzidas em células de mamíferos cultivadas por, por exemplo, transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham e Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) ou eletroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Para identificar e selecionar células que expressam DNA exógeno, um gene que confere um fenótipo selecionável (um marcador selecionável) é em geral introduzido nas células junto com o gene ou cDNA de interesse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem genes que conferem resistência a drogas como a neomi- cina, higromicina e metotrexato. O marcador selecionável pode ser um marcador selecionável amplificável. Um marcador selecionável amplifi- cável selecionável é a sequência de redutase de diidrofolato (DHFR). Marcadores selecionáveis são examinados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporado aqui a título de referência). Um técnico no assunto será facilmente capaz de escolher marcadores selecionáveis adequados.

[0167] Marcadores selecionáveis podem ser introduzidos na célula em um plasmídeo separado ao mesmo tempo que o gene de interes- se, ou eles podem ser introduzidos no mesmo plasmídeo. Se estiverem no mesmo plasmídeo, o marcador selecionável e o gene de interesse podem estar sob o controle de promotores diferentes ou do mesmo promotor, o último arranjo produzindo uma mensagem dicis- trônica. Construções deste tipo são conhecidas na técnica (por exemplo, Levinson e Simonsen, US 4.713.339). Também pode ser vantajoso adicionar DNA adicional, conhecido como "DNA veículo" à mistura que é introduzida nas células.

[0168] Depois que as células são levadas ao DNA, elas são culti vadas em um meio de cultivo apropriado por, tipicamente, 1 a 2 dias, para que comecem a expressar o gene de interesse. Conforme usado aqui, o termo "meio de crescimento apropriado" significa um meio contendo nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células e da expressão do polipeptídeo associado à ficolina humana de interesse. O meio em geral inclui uma fonte de carbonos, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, açúcares essenciais, vitaminas, sais, fosfolipídios, proteínas e fatores de crescimento. Seleção da droga é então aplicada para selecionar o crescimento de células que expressam o marcador selecionável de uma maneira estável. Para as células que foram transfectadas com um marcador selecioná- vel amplificável, a concentração da droga pode ser aumentada para selecionar um número aumentado de cópias das sequências clonadas, assim aumentando os níveis de expressão. Os clones de células esta- velmente transfectadas são então monitorados para expressão do po- lipeptídeo associado à ficolina humana de interesse.

[0169] A célula hospedeira na qual as sequências de DNA que co dificam os polipeptídeos associados à ficolina humana ou outros poli- peptídeos de acordo com a presente invenção é introduzida pode ser quaisquer células capazes de produzir os polipeptídeos humanos modificados pós-tradução e inclui células de levedura, de fungos e euca- rióticas superiores.

[0170] Exemplos de linhagens de células de mamíferos para uso na presente invenção são linhagens celulares COS-1 (ATCC CRL 1650), rim de filhote de hamster (BHK) e 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Uma linagem celular BHK preferida é a linhagem celular BHK ts-13 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, incorporado aqui a título de referência), daqui em diante referida por células BHK 570. A linha celular BHK 570 foi depositada por American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, sob número de acesso ATCC CRL 10314. Uma linhagem celular BHK ts-13 também está disponível sob o número de acesso ATCC CRL 1632. Adicionalmente, diversas outras linhagens celulares podem ser usadas na presente invenção, incluindo células Rat Hep 1 (hepatoma de rato; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rato; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmão humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) e DUKX (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, 1980).

[0171] Exemplos de células de levedura adequadas incluem célu las de Saccharomyces spp ou Schizosaccharomyces spp, em particular, cepas de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces kluyveri. Métodos para transformar células de levedura com DNA heterólogo e produzir polipeptídeos heterólogos dessas são descritos em, por exemplo, US 4.599.311. US 4.931.373, US 4.870.008, 5.037.743 e US 4.845.075, todas aqui incorporadas a título de referência. Células transformadas são selecionadas por um fenótipo que é determinado por um marcador selecionável, comumente, resistência a drogas ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular, por exemplo, leucina. Um vetor preferido para uso na levedura é o vetor POT1 revelado em US 4.931.373. As sequências de DNA que codifi- cam os polipeptídeos associados à ficolina humana e outros polipeptí- deos de acordo com a presente invenção podem ser precedidas por uma sequência sinal e, opcionalmente, por uma sequência líder, por exemplo, conforme descrito acima. Exemplos adicionais de células de levedura adequadas são cepas de Kluyveromyces, tal qual K. Lactis, Hansenula, por exemplo, H. Polymorpha ou Pichia, por exemplo, P. Pastoris (cf. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 34593465; US 4,882,279).

[0172] Exemplos de outras células de fungos são células de fun gos filamentosos, por exemplo, Aspergillus spp, Neurospora spp, Fusarium spp ou Trichoderma spp, em particular, cepas de A. oryzar, A. nidulans ou A. niger. O uso de Aspergillus spp para a expressão de proteínas é descrito em, por exemplo, EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438. A transformação de F. Oxysporum pode ser realizada, por exemplo, conforme descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 - 156. A transformação de Trichoderma spp pode ser realizada, por exemplo, conforme descrito em EP 244 234.

[0173] Quando um fungo filamentoso é usado como a célula hospe deira, ele pode ser transformado com a construção de DNA da invenção, convenientemente pela integração da construção de DNA no cromossomo hospedeiro para obter uma célula hospedeira recombinante. A integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem já que é mais provável que a sequência de DNA seja mantida estavelmente na célula. A integração das construções de DNA no cromossomo do hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga.

[0174] A transformação de células de insetos e a produção de po- lipeptídeos heterólogos nestas pode ser realizada de acordo com o descrito em US 4.745.051, US 4.879.236, US 5.155.037, 5.162.222, EP 397.485, todas incorporadas aqui a título de referência. A linhagem de células de insetos usada como hospedeira pode ser uma linhagem celular de lepidópteros adequada, como células de Spodoptera frugi- perda ou células de Trichoplusia ni (cf. US 5.077.214). As condições de cultura podem ser adequadamente como descritas em, por exemplo, WO 89/01029, ou WO 89/01028, ou qualquer uma das referências acima mencionadas.

[0175] A célula hospedeira transformada ou transfectada descrita acima é então cultivada em um meio nutriente adequado sob condições, que permitam a expressão do polipeptídeo associado à ficolina humana, após a qual parte do peptídeo resultante pode ser recuperada da cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para o cultivo de células hospedeiras, como um meio mínimo ou complexo contendo os suplementos apropriados. Meios adequados são disponibilizados por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). O polipeptídeo associado à ficolina humana produzido pelas células pode então ser recuperado do meio de cultura através de procedimentos convencionais incluindo separação das células hospedeiras do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes protéicos aquosos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, purificação por diversos procedimentos cromatográ- ficos, por exemplo, cromatografia por troca de íons, cromatografia por filtração em gel, cromatografia por afinidade ou similares, dependendo do tipo do polipeptídeo em questão.

[0176] Tecnologia de animais transgênicos pode ser empregada para produzir os polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptí- deos da invenção. É preferível produzir as proteínas dentro de glândulas mamárias de um mamífero hospedeiro fêmea. A expressão na glândula mamária e a secreção subsequente da proteína de interesse no leite superam diversas dificuldades encontradas no isolamento de proteínas de outras fontes. O leite é prontamente coletado, disponível em grandes quantidades e bioquimicamente bem caracterizado. Ademais, as principais proteínas do leite estão presentes no leite em altas concentrações (tipicamente de cerca de 1 a 15 g/L).

[0177] Do ponto de vista comercial, é claramente preferível usar como hospedeiro uma espécie que produza muito leite. Embora animais menores como camundongos e ratos possam ser usados (e são preferíveis para prova nas etapas iniciais), é preferível usar gado incluindo, sem limitação porcos, cabras, ovelhas e bovinos. Ovelhas são particularmente preferíveis devido a tais fatores como história prévia de transgênese na espécie, geração de leite, custo e a pronta disponibilidade de equipamento para a coleta de leite de ovelha (ver, por exemplo, WO 88/00239 para uma comparação dos fatores que influenciam a escolha da espécie hospedeira). É em geral desejável selecionar uma raça de animal hospedeiro que tenha sido criada para uso diário, como a ovelha East Friesland ou para introduzir estoque de leite pela reprodução de linhagens transgênica em uma data posterior. Em qualquer caso, animais com reconhecida boa saúde devem ser usados.

[0178] Para obter a expressão na glândula mamária, um promotor de transcrição de um gene da proteína do leite é usado. Genes da proteína do leite incluem aqueles genes que codificam caseínas (ver US 5.304.489), beta-lactoglobulina, uma lactalbumina e proteína acídica do soro do leite. O promotor da beta lactoglobulina (BLG) é preferível. No caso do gene de beta lactoglobulina ovino, uma região de pelo menos o 406 bp próximo da sequência de flanqueamento 5' será geralmente usada, como um segmento de cerca de 4,25 kbp de DNA englobando o promotor de flanqueamento 5' e parte não codificadora do gene de beta-lactoglobulina (ver Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31 39 (1992)). Fragmentos similares do DNA promotor de outras espécies também são adequados.

[0179] Outras regiões do gene de beta lactoglobulina também po dem ser incorporadas nas construções, bem como regiões genômicas do gene a ser expresso. É geralmente aceitável na técnica que as construções sem introns, por exemplo, expressos de maneira pobre se comparados àqueles que contêm tais sequências de DNA (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478 482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3 13 (1991); WO 89/01343; e WO 91/02318, todos aqui incorporados a título de referência). Em relação a isso, é em geral preferível, quando possível, usar sequências genômicas contendo alguns ou todos os introns nativos de um gene que codifica a proteína ou po- lipeptídeo de interesse, assim a inclusão adicional de pelo menos alguns introns do gene de, por exemplo, beta lactoglobulina é preferível. Tal região é um segmento de DNA que fornece junção de introns e po- liadenilação de RNA da região não codificador 3' do gene de beta- lactoglobulina ovina. Quando substituído por sequências não codificadoras 3' naturais de um gene, esse segmento de beta-lactoglobulina ovina pode aperfeiçoar e estabilizar os níveis de expressão da proteína ou polipeptídeo de interesse. Em outras modalidades, a região que cerca a ATG de iniciação da sequência de FAP é substituída com sequências correspondentes de um gene de proteína específica do leite. Tal substituição fornece um ambiente de iniciação específica de tecido putativo para aperfeiçoar a expressão. É conveniente substituir as sequências inteiras não codificadoras pré, pró e 5' de FAP com aquelas de, por exemplo, gene de BLG, embora regiões menores possam ser substituídas.

[0180] Para a expressão dos polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptídeos de acordo com a presente invenção em animais transgênicos, um segmento de DNA que codifica FAP é operacionalmente ligado a segmentos de DNA adicionais exigidos para sua expressão para produzir unidades de expressão. Tais segmentos adicionais incluem o promotor acima mencionado, bem como sequências que fornecem o término da transcrição e poliadenilação do mRNA. As unidades de expressão irão incluir adicionalmente um segmento de DNA que codifica uma sequência de sinal secretória operacionalmente ligada ao segmento que codifica a FAP modificada. A sequência sinal secretória pode ser uma sequência sinal secretória de FAP nativa ou pode ser de outra proteína, como uma proteína do leite (vide, por exemplo, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683 4690 (1986); e Meade et al., U.S. 4,873,316, incorporados aqui a título de referência).

[0181] A construção de unidades de expressão para uso em ani mais transgênicos é convenientemente realizada pela inserção de uma sequência de FAP em um vetor de plasmídeo ou fago contendo os segmentos de DNA adicionais, embora a unidade de expressão seja construída essencialmente por qualquer sequência de ligações. É particularmente conveniente fornecer um vetor contendo um segmento de DNA que codifica uma proteína do leite e para substituir a sequência codificadora pela proteína do leite com aquela de uma variante FAP; assim criando uma fusão de genes que inclui as sequências de controle de expressão do gene da proteína do leite. Em qualquer caso, a clonagem de unidades de expressão em plasmídeos ou outros vetores facilita a amplificação da sequência de FAP. A amplificação é convenientemente realizada em células hospedeiras bacterianas (por exemplo, E. Coli), assim os vetores tipicamente incluirão uma origem de re- plicação e um marcador selecionável funcional em células hospedeiras bacterianas. A unidade de expressão é então introduzida em ovos fertilizados (incluindo embriões em etapas iniciais) das espécies de hos-pedeiros escolhidas. A introdução de DNA heterólogo pode ser reali- zada por uma de diversas rotas, incluindo microinjeção (por exemplo, patente US 4.873.191), infecção retroviral (Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988)) ou integração direta a sítio usando células-tronco embrionárias (ES) (analisado por Bradley et al., Bio/Technology 10: 534 539 (1992)). Os ovos são então implantados nos ovidutos ou úteros de fêmeas pseudo-grávidas e desenvolvem a gestação. As crias que carregam o DNA introduzido nas suas linhagens de germes podem passar o DNA para sua descendência da maneira normal, de Mendel, fazendo com que linhagens transgênicas sejam desenvolvidas. Procedimentos gerais para a produção de animais transgênicos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La-boratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645 651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835 838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844 847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); US 4.873.191; US 4.873.316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; e GB 87/00458). Técnicas para a introdução de sequências de DNA exógeno em mamíferos e suas células de germes são originalmente desenvolvidas em camundongos (vide, por exemplo, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980); Gordon e Ruddle, Science 214: 1244 1246 (1981); Palmiter e Brinster, Cell 41: 343 345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438 4442 (1985); e Hogan et al. (ibid.)). Essas técnicas foram depois adaptadas para uso em animais maiores, incluindo espécies de gado (vide, por exemplo, WO 88/00239, WO 90/05188, e WO 92/11757; e Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988)). Em suma, na rota mais eficiente usada até hoje para a geração de camundongos ou gado transgênico, diversas centenas de moléculas lineares do DNA de interesse são inje- tadas em um dos pró-núcleos de um ovo fertilizado de acordo com técnicas estabelecidas. A injeção de DNA no citoplasma de um zigoto também pode ser empregada.

[0182] A produção em plantas transgênicas também pode ser em pregada. A expressão pode ser generalizada ou direcionada a um órgão em particular, tal qual um tubérculo (vide Hiatt, Nature 344:469 479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449 453 (1992); Sij- mons et al., Bio/Technology 8:217 221 (1990); e EP 0 255 378).

Purificação de FAP

[0183] Os polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptí- deos da invenção podem ser recuperados de meio de cultura de células ou leite. Nos polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptí- deos da presente invenção podem ser purificados por diversos procedimentos conhecidos na técnica incluindo, sem limitação, cromatogra- fia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbica, focagem croma- tográfica e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa (IEF), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), ou extração (vide, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson ed Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989). Preferivelmente, eles podem ser purificados por cromatografia por afinidade em uma coluna de anticorpos anti-FAP. Purificação adicional pode ser conseguida por meios de purificação química, tal qual cromatografia líquida de alta performance. Outros métodos de purificação, incluindo precipitação com citrato de bário, são conhecidos na técnica e podem ser aplicados na purificação dos polipeptídeos associados à ficolina e outros polipeptí- deos descritos aqui (vide, por exemplo, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982).

[0184] Para propósitos terapêuticos, é preferível que os polipeptí- deos associados à ficolina e outros polipeptídeos da invenção sejam substancialmente puros. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, os polipeptídeos da invenção são purificados até pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade, preferivelmente pelo menos cerca de 98% de homogeneidade. A pureza pode ser avaliada por, por exemplo, eletroforese em gel e sequenciamento de aminoácidos amino-terminal.

[0185] O termo "polipeptídeo isolado" se refere a um polipeptídeo da presente invenção que (1) foi separado de pelo menos cerca de 50% de polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais (ou seja, contaminantes) com os quais está naturalmente associado. Preferivelmente, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de quaisquer outros polipeptídeos contaminantes ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural, os quais interfeririam com seu uso terapêutico, diagnóstico, profilático e em pesquisa.

[0186] O termo "microrganismo" conforme usado aqui se refere a bactérias, fungos, archaea, protistas, plantas microscópicas e animais (como plâncton ou algas verdes), planárias e amebas. Inclusos nessa definição estão micro-organismos patogênicos.

Ensaios

[0187] Um procedimento geral para SDS-PAGE e Western blotting:

[0188] Eletroforese foi realizada em 10% ou 4 - 12% (peso em vo lume) de géis de poliacrilamida Bis-Tris com tampões descontínuos usando o sistema NuPAGE (invitrogen) conforme recomendado pelo fabricante. Western blotting foi realizado usando membranas de po- li(difluoreto de ivinilideno) (PVDF-HyBond, GE-Healthcare, Hilleroed, Dinamarca, número RPN303F), 2 μg/mL de anticorpo monoclonal primário marcado com biotina e visualização secundária por estreptavidi- na conjugada de HRP (P0397, Dako, Glostrup, Dinamarca) diluída para 1:500 em PBS, 0,05% de Tween20. As membranas foram desenvolvidas com 0,04% de 3-amino-9-etil-carbazol (Sigma-Aldrich, Broen- by, Dinamarca, número A5754-100G) em acetona e 0,015% de H2O2 em 50 mM de tampão de acetato de sódio de pH 5.

Co-imunoprecipitação

[0189] Imunoprecipitação dos complexos do soro de lectina que se liga à manose (MBL): 1 mL de soro normal humano foi diluído 1:1 em TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5) e incubado de fim a fim por uma hora a 4oC com 5 μg de anticorpo monoclonal de camundongo específico de MBL Hyb 131-11 (Bioporto, Gentofte, Dinamarca).

[0190] Imunoprecipitação dos complexos do soro Ficolina-2: 0,5 mL de soro normal humano foi diluído 1:1 em TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5) e incubado de fim a fim por uma hora a 4oC com 5 μg de anticorpo monoclonal de camundongo específico de Ficolina-2 Hyb 219 (Munthe-Fog L, et al.).

[0191] Imunoprecipitação dos complexos do soro Ficolina-3: 0,2 mL de soro normal humano foi diluído 1:1 em TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5) e incubado, de fim a fim, por uma hora a 4oC com 5 μg de anticorpo monoclonal de camundongo específico de Ficolina-3 Hyb 334 (Munthe-Fog L, et al.).

[0192] A precipitação do imunocomplexo foi conduzida com contas Dynal magnéticas conjugadas de IgG de anti-camundongo de ovelha (Dynal-Invitrogen, Cat. No. 112.02D): Após a incubação com soro e anticorpos primários (como acima) 5 x 107 contas Dynal magnéticas conjugadas anti-camundongo de ovelhas foram adicionadas e incubadas por 30 min a 4oC. As contas foram separadas magneticamente e lavadas por três vezes com TBS-Tween-Ca2+ (10 mM Tris, 140 mM NaCl, 0,05% tween, 5 mM CaCl2, pH 7,5) e finalmente fervidas em tampão carregador de SDS e analisadas por SDS-PAGE e western blotting com anticorpo monoclonal marcado com biotina mAb-8B3 (reagindo com um epítopo na cadeia pesada/cadeia A compartilhada por MASP-1 e -3).

[0193] Purificação de imunoafinidade de FAP: 10 mg de mAb-8B3 (reagindo com um epítopo na cadeia pesada/cadeia A compartilhada por FAP, MASP-1 e -3) ou 10 mg de anticorpos anti FAP policlonais de coelho foram conjugados com sefarose ativada por CNBr conforme recomendado pelo fabricante (GE-healthcare, Hilleroes, Dinamarca, número 17-0430-01) e empacotados em uma coluna.

[0194] Purificação do soro: 150 mL de um conjunto de soro huma no normal foram diluídos 1: 1 com TBS + 0,5 M de NaCl + 10 mM de EDTA (10 mM Tris, 640 mM de NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,5) e carregado nas colunas descritas acima. As colunas foram lavadas com 1 L de TBS + 0,5 M de NaCl + 10 mM de EDTA e frações de 1 mL foram eluídas com 1 M de Glicina-HCl, pH 2,5 e analisadas por SDS-PAGE e Western blotting com o anticorpo monoclonal marcado com biotina mAb-8B3.

[0195] Purificação de FAP recombinante: 2 - 3 L de sobrenadante de cultura (de meio livre de soro CHO/Gibco-Invitrogen, número 12651-014) de células do ovário de hamsters chineses (células CHO) expressando FAP recombinante (rFAP) foram carregados nas colunas de anticorpos descritas acima. As colunas foram lavadas com 1 L de TBS + 0,5 M de NaCl + 10 mM de EDTA e frações de 1 mL foram eluí- das com 1 M de Glicina-HCl, pH 2,5. As frações eluídas foram analisadas por SDS-PAGE e coloração com Coomassie.

[0196] Expressão de FAP recombinante: cDNA de comprimento completo inserido no vetor pcDNA5/FRT (Invitrogen, número V601020) foi pedido da Genscript (Genscript, New Jersey, EUA) e co- transfectado com o vetor pOG44 (Invitrogen, número V6005-20) na linhagem celular CHO Flp-In (Invitrogen, número R758-07) e selecionado e clonado conforme recomendado pelo fabricante (Invitrogen). As células foram cultivadas em meio livre de soro de CHO Freestyle (Invi- trogen, número 12651-014) e os sobrenadantes cultivados foram co- lhidos e analisados.

[0197] A produção de anticorpos mono e policlonais: Uma constru ção de peptídeos (pedido da Genscript, New Jersey, EUA) de resíduos de terminal 17C específicos a FAP foi acoplada na forma toxóide de tétano e difteria usando o método de acoplamento com cisteína com éster de m-maleimido-benzoíl-N-hidróxi-succinimida conforme recomendado pelo fabricante (Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois, EUA).

[0198] Seis camundongos e dois coelhos foram, cada um, imuni zados três vezes (com intervalos de 14 dias) com 25 μg de antígeno adsorvidos em Al(OH)3 e adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpo policlonal foram avaliados usando ELISA com os diferentes peptídeos de FAP acoplados a um veículo de proteína.

[0199] Antissoro de coelho policlonal (cerca de 10 mL) foi colhido 14 dias após a primeira, segunda e terceira imunização.

[0200] Dois camundongos foram usados para a produção de anti corpos monoclonais. Quatro dias antes da fusão, os camundongos receberam uma injeção intravenosa de 25 μg de antígeno. A fusão foi conduzida conforme descrito em outro local (Kohler, G. e C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497).

[0201] Os clones foram selecionados por monitoramento por ELI SA diferencial contra peptídeos acoplados a diferentes veículos de proteína.

[0202] Ensaio complemento funcional: Soro defeituoso homozigó- tico de Ficolina-3 e MBL foi usado para investigar a função de FAP.

[0203] Ensaio de Ficolina-3: pratos Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, número 439454) foram revestidos com albumina do soro bovino acetilada a 5 μg/mL por 12 horas a 4oC em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,5). Após blo- queio/lavagem por quatro vezes no tampão de barbital/Tween (4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4 + 0,05% Tween), Ficolina-3 humana recombinante foi adicionada a 500 ng/mL, tampão de barbital/Tween e incubado por 1,5 horas a 20oC com agitação. Após a lavagem dos pratos por duas vezes no tampão de barbital/tween, FAP recombinante, MASP-1, -2 ou -3 humana como sobrenadante de cultura de meio livre de soro foram adicionadas em diluições seriais na primeira dimensão em pratos separados e incubados por 1 hora a 20oC com agitação. Após a lavagem dos pratos por duas vezes no tampão de barbital/Tween, soro deficiente em MASP-2 ou Ficolina-3 foram adicionados em diluições seriais na segunda dimensão nos pratos e incubados por 30 minutos 37oC. Após a lavagem dos pratos por quatro vezes no tampão de barbital/Tween, a deposição do fator de complemento C4 foi medida por incubação por 1 hora a 20oC com anticorpos de coelho policlonais para humanos C4c (Dako, Glostrup, Dinamarca, número Q0369) diluído a 1:2000, seguido por quatro etapas de lavagem e incubação com anticorpos anticoelho suínos conjugados com raiz forte peroxidase (Dako, Glostrup, Dinamarca, número P0399) por 45 minutos a 20oC. O sinal obtido pelos pratos foi desenvolvido com um poço de 100 μL de orto-fenileno- diamina (OPD) (0,4 mg/mL) dissolvido em tampão de citrato (35 mM de ácido cítrico, 65 mM de Na2PO4, pH 5) com 0,12 por mil (volume em volume) de H2O2. A reação enzimática foi interrompida com 1 M de H2SO4 e níveis de densidade óptica (OD) foram medidos a 490 nm - 650 nm usando um leitor cinético V-max (Molecular Devices).

[0204] Ensaio de lectina que se liga à manose: pratos Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, número 439454) foram revestidos com manana (Sigma-Aldrich, Broenby, Dinamarca, número M7504-1G) a 10 μg/mL por 12 horas a 4oC em tampão de revestimento (15 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, pH 9,5). Após bloqueio/lavagem por qua- tro vezes no tampão de barbital/Tween (4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7,4 + 0,05% de Tween), lectina que se liga à manose humana recombinante foi adicionada a 0,5 μg/mL, tampão de barbital/Tween e incubada por 1,5 horas a 20oC com agitação. Após a lavagem dos pratos por duas vezes no tampão de barbital/Tween, FAP recombinante, MASP-1, -2 ou -3 humana como sobrenadante de cultura de meio livre de soro foram adicionadas em diluições seriais na primeira dimensão em pratos separados e incubados por 1 hora a 20oC com agitação. Após a lavagem dos pratos por duas vezes no tampão de barbital/Tween, soro deficiente em MASP-2 ou Ficolina-3 foram adicionados em diluições seriais na segunda dimensão nos pratos e incubados por 45 minutos 37oC. Após a lavagem dos pratos por quatro vezes no tampão de barbital/tween, a deposição do fator de complemento C4 foi medida por incubação por 1 hora a 20oC com anticorpos de coelho policlonais para humanos C4c (Dako, Glostrup, Dinamarca, número Q0369) diluído a 1:2000, seguido por quatro etapas de lavagem e incubação com anticorpos anti-coelho suínos conjugados com raiz forte peroxidase (Dako, Glostrup, Dinamarca, número P0399) por 45 minutos a 20oC. O sinal obtido pelos pratos foi desenvolvido com um poço de 100 μL de orto-fenileno- diamina (OPD) (0,4 mg/mL) dissolvido em tampão de citrato (35 mM de ácido cítrico, 65 mM de Na2PO4, pH 5) com 0,12 por mil (volume em volume) de H2O2. A reação enzimática foi parada com 1 M de H2SO4 e níveis de densidade óptica (OD) foram medidos a 490 nm - 650 nm usando um leitor cinético V-max (Molecular Devices).

[0205] Ensaio de genotipagem: Diferentes ensaios de Genotipa- gem podem ser conduzidos em que o genótipo é determinado em indivíduos usando ensaios biológicos. Tipos diferentes de ensaios podem ser usados tais quais: • Métodos baseados em hibridização oHibridização dinâmica específica a alelos oFaróis moleculares oMicroarrays SNP • Métodos baseados em enzimas oPolimorfismo de comprimento de fragmento de restrição o Métodos baseados em PCR o Endonuclease Flap o Extensão de iniciadores o Nuclease 5' oEnsaio de oligonucleotídeo ligase • Outros métodos de pós-amplificação baseados em propriedades físicas de DNA o Polimorfismo conformacional de fita única o Eletroforese por gel de gradiente de temperatura o Cromatografia líquida de alta performance com desnaturação o Desnaturação de alta resolução do amplicon inteiro o SNPlex • Sequenciamento

Administração e composições farmacêuticas Tratamentos de combinação

[0206] O polipeptídeo associado à ficolina conforme definido no presente relatório descritivo pode administrado simultânea ou sequencialmente com uma ou mais proteínas selecionadas de Ficolina-1, -2, - 3 ou lectina que se liga à manose (MBL), Os fatores podem ser fornecidos em uma forma de dose única em que a forma de dose única contém ambos os compostos, ou na forma de um kit em partes compreendendo um polipeptídeo associado à ficolina como uma primeira forma de dose e uma preparação de um ou mais outros compostos como uma segunda forma de dose. Quando uma primeira, segunda, terceira, et., dose unitária é mencionada ao longo deste relatório descrito, isto não indica uma ordem preferida de administração, isto é meramente feito para fins de conveniência.

[0207] Por dosagem "simultânea" de um polipeptídeo associado à ficolina e uma preparação de um ou mais compostos, quer-se dizer a administração dos compostos em uma forma de dose única, ou a ad-ministração de um primeiro agente seguido pela administração de um segundo agente com um tempo de separação de não mais que 15 minutos, preferivelmente 10, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 2 minutos. Qualquer fator pode ser administrado primeiro.

[0208] Por dosagem "sequencial", quer-se dizer a administração de um primeiro agente seguida pela administração de um segundo agente com uma separação de tempo de mais que 15 minutos. Qualquer uma das duas formas de dosagem unitárias pode ser administrada em primeiro lugar. Preferivelmente, ambos os produtos são injetados pelo mesmo acesso intravenoso.

[0209] Outro objeto da presente invenção é fornecer uma compo sição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo associado à fico- lina que está presente em uma concentração no soro/plasma de 0 mg/mL a 1 mg/mL, e em que a formulação possui um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode também compreender um sistema tampão, preservativos, agentes de tonicidade, agentes quelantes, estabilizadores e tensoativos. Em algumas modalidades da invenção, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação compreendendo água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em outra modalidade da invenção, a formulação far-macêutica é uma solução aquosa. O termo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo pelo menos 50% em peso de água. Da mesma forma, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50% em peso de água, e o termo "suspensão aquosa é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50% em peso de água".

[0210] Em outras modalidades da invenção, a formulação farma cêutica é uma formulação congelada a seco, a qual o médico ou o paciente adicionam solventes e/ou diluentes antes do uso.

[0211] Em outras modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, congelada a seco ou pulverizada a seco) pronta para uso sem nenhuma dissolução antes.

[0212] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma formulação farmacêutica que compreende uma solução aquosa de um polipeptídeo associado à ficolina e um tampão, em que o polipeptídeo associado à ficolina está presente em uma concentração de 0 - 1 mg/mL ou mais, e em que a formulação possui um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

[0213] Em outras modalidades da invenção, o pH da invenção é selecionado da lista que consiste em 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, e 10,0.

[0214] Em outra modalidade da invenção, o tampão é selecionado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicil glicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato de sódio mo- nobásico, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio e tris (hidróxi- metil)-aminometane, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido ma- léico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um desses tampões específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.

[0215] Em outra modalidade da invenção, a formulação também compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade da invenção, o preservativo é selecionado do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidróxi-benzoato de metila, p-hidróxi-benzoato de propila, 2-fenoxietanol, p-hidróxi- benzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tio- merosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, cloro-hexidina, diidroace- tato de sódio, clorocresol, p-hidróxi-benzoato de etila, cloreto de ben- zetônio, clorfenesina (3p-clorfenóxi-propano-1,2-diol) ou misturas destes. Em outra modalidade da invenção, o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/mL a 20 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o preservativo está presente em uma concentração de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o preservativo está presente em uma concentração de 5 mg/mL a 10 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o preservativo está presente em uma concentração de 10 mg/mL a 20 mg/mL. Cada um desses preservativos específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um preservativo em composições farmacêuticas é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[0216] Em outra modalidade da invenção, a formulação também compreende um agente isotônico. Em outra modalidade da invenção, o agente isotônico é selecionado do grupo que consiste em um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou um álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleu- cina, ácido aspártico, triptofan, treonina), um alditol (por exemplo, gli- cerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propileno glicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietileno glicol (por exemplo, PEG400) ou misturas destes. Qualquer açúcar como mono, di ou polissacarídeos ou glica- nos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, mano- se, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrana, pu- lulana, dextrina, ciclo dextrina, amido solúvel, amido hidroxietílico e carboximetilcelulose sódica podem ser usados. Em algumas modalidades, o aditivo de açúcar é sacarose. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4 - C8 contendo pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em algumas modalidades, o aditivo de álcool de açúcar é o manitol. Os açúcares e álcoois de açúcares mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há um limite fixo quanto à quantidade a ser usada, desde que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitos estabilizadores conseguidos usando os métodos da invenção. Em algumas modalidades, a concentração do açúcar ou álcool de açúcar é de entre cerca de 1 mg/mL e cerca de 150 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/mL a 50 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/mL a 50 mg/mL. Cada um desses agentes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um agente isotôni- co em composições farmacêuticas é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[0217] Em outra modalidade da invenção, a formulação também compreende um agente quelante. Em outra modalidade da invenção, o agente quelante é selecionado de sais de ácido etileno diamino tetra acético (EDTA), ácido cítrico e ácido aspártico e misturas destes. Em outra modalidade da invenção, o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1 mg/mL a 2 mg/mL. Em outra modalidade da invenção, o agente quelante está presente em uma concentração de 2 mg/mL a 5 mg/mL. Cada um desses agentes quelantes específicos constitui uma modali- dade alternativa da invenção. O uso do agente quelante em composições farmacêuticas é bem conhecido por técnicos no assunto. Por conveniência, faz-se referência à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edição, 1995.

[0218] Em outra modalidade da invenção, a formulação também compreende um estabilizador. O uso de um estabilizador em composições farmacêuticas é bem conhecido por técnicos no assunto. Por conveniência, faz-se referência à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[0219] Mais particularmente, as composições da invenção são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas, cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe a formação de agregados durante o armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. Por "formação de agregado" pretende- se dizer uma interação física entre as moléculas de polipeptídeos que resultam na formação de oligômeros, os quais podem ser mantidos solúveis, ou agregados grandes e visíveis que precipitam da solução. Por "durante o armazenamento", quer-se dizer uma composição ou formulação farmacêutica líquida que uma vez preparada não é imediatamente administrada ao paciente. De outra forma, seguindo a preparação, é embalada para armazenamento, seja em uma forma líquida, em um estado congelado, ou em uma forma seca para posterior re-constituição em uma forma líquida ou outra forma adequada de administração a um paciente. Por "forma seca" quer-se dizer que a formulação ou composição farmacêutica líquida é secada ou por congelamento a seco (ou seja, liofilização; ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59), pulverização a seco (ver Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (5a edição; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou aeragem a seco (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:4753). A formação de agregados por um polipeptídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar adversamente a atividade biológica daquele polipeptídeo, resultando na perda da eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Ademais, a formação de agregado pode causar outros problemas como bloqueio de tubos, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica que contém um polipeptídeo é administrada através de um sistema de infusão.

[0220] As composições farmacêuticas da invenção podem também compreender uma quantidade de uma base de aminoácidos suficientes para diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante o armazenamento da composição. Por "base de aminoácidos", quer-se dizer um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que qualquer dado aminoácido está presente ou na forma de sua base livre ou na sua forma de sal. Quando uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em sua forma de base livre, todos podem estar presentes nas suas formas de sais, ou alguns podem estar presentes nas suas formas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sais. Em algumas modalidades, os aminoácidos para uso na preparação das composições da invenção são aqueles que carregam uma cadeia lateral carregada, tais como a arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (ou seja, isômero L, D, DL) de um aminoácido em particular (por exemplo, glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção desde que o aminoácido em particular esteja presente ou em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em algumas modalidades, o L-estereoisômero é usado. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos desses aminoácidos. Por "análogos de aminoácidos" quer-se dizer um derivado do aminoácido de ocorrência natural que resulte no efeito desejado de diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante o armazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Análogos da arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos adequados da metionina incluem etionina e butionina e análogos adequados da cisteína incluem S-metil-L cisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos são incorporados às composições em sua forma de base livre ou na sua forma de sal. Em outra modalidade da invenção, os aminoácidos ou análogos de aminoácidos são usados em uma concentração que é suficiente para impedir ou atrasar a agregação da proteína.

[0221] Em outra modalidade da invenção, a metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou análogos de aminoácidos) pode ser adicionada para impedir a oxidação de resíduos de metionina em sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo agindo como agente terapêutico é um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metioni- na suscetível a tal oxidação. Por "inibir", quer-se dizer acumulação mínima de espécies oxidadas de metionina ao longo do tempo. Inibir a oxidação da metionina resulta em uma maior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular apropriada. Qualquer estereoisômero da me- tionina (isômeros L, D ou DL) ou combinações destes podem ser usados. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina de tal modo que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para agências re-guladoras. Tipicamente, isso significa que a composição não contém mais que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Em geral, isso pode ser conseguido adicionando-se metionina de tal modo que a razão de metionina adicionada para os resíduos de metionina esteja na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 1.000:1, tal qual de 10:1 a cerca de 100:1.

[0222] Em outra modalidade da invenção, a formulação também compreende um estabilizador selecionado do grupo de polímeros de alto peso molecular ou de compostos de baixo peso molecular. Em outra modalidade da invenção, o estabilizador é selecionado de polieti- leno glicol (por exemplo, PEG 3350), poli(álcool vinílico) (PVA), polivinil pirrolidona, carboxicelulose, hidroxicelulose ou derivados destas (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias que contêm enxofre como o monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2- metil-tioetanol e sais diversos (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um desses estabilizadores específicos constituem uma modalidade alternativa da invenção.

[0223] As composições farmacêuticas podem também compreen der agentes estabilizadores adicionais, os quais melhoram ainda mais a estabilidade do polipeptídeo terapeuticamente ativo presente. Agentes estabilizadores de interesse particular incluem, sem limitação, me- tionina e EDTA, os quais protegem o polipeptídeo contra a oxidação da metionina, e um tensoativo não iônico, o qual protege o polipeptí- deo contra a agregação associada ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.

[0224] Em outra modalidade da invenção, a formulação compre ende um tensoativo. Em outra modalidade da invenção, o tensoativo é selecionado de um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos po- liglicolisados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácidos graxos de sorbitan, polímeros de bloqueio de polioxipropileno-polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros como Pluronic F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X-100), ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano, deri- vados de polioxietileno e polietileno como derivados alquilados e alco- xilados (tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij- 35), monoglicerídeos ou derivados etoxilados destes, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, álcoois, glicerol, lectinas e fosfolipí- dios (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanola- mina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídios (por exemplo, ácido dipalmitoíl fosfatídico) e lisofosfoli- pídios (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina e ésteres de 1-acil- sn-glícero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina e treonina) e derivados alquila, alcoxila (éster alquila), alcóxi (éter alquila) de liso fosfa- tidil e fosfatidil colinas, por exemplo, derivados de lauroíla e miristoíla de lisofosfatidil colina, dipalmitoíl fosfatidil colina e modificações no grupo principal polar, ou seja colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol e DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, liso fosfatidil serina e liso fosfatidil treonina, e glícero fosfolipídios (por exemplo, cefalinas), glícero licolipídios (por exemplo, galactopiransói- de), esfingo licolipídios (por exemplo, ceramidas, gangliosidas), dodecil fosfocolina, liso lecitina de ovo de galinha, derivados do ácio fusídico (por exemplo, tauro diidro fusidato de sódio, etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais destes C6 - C12 (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Nα-acilados de di- peptídeos compreendendo qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácídico e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato de sódio, registro CAS número [577-11-7]), do- cusato de cálcio, registro CAS número [128-49-4]), docusato de potássio, registro CAS número [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico ou derivados destes, ácidos biliares e sais desses e conjugados de taurina ou glici- na, ácido ursodeoxicólico, colato de sódio, deóxi colato de sódio, tau- rocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-heaxdecil-N,N-dimetil-3- amônio-1-propano-sulfonato, tensoativos monovalentes aniônicos (sulfonatos de alquil arila), tensoativos zwitteriônicos (por exemplo, N- alquil-N,N-dimetil-amônio-1-propano-sulfonatos, 3-colamido-1-propil- dimetil-amônio-1-propano-sulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetil trimetil-amônio, clotero de cetil piridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, dodecil β-D-glico-piranosidio), poloxaminas (por exemplo, Tetrônicas), as quais são copolímeros de bloco tetrafuncionais derivadas da adição sequencial de óxido de propileno e óxido de etileno à etileno diamina, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imi- dazol, ou misturas destes. Cada um desses tensoativos específicos compreende uma modalidade alternativa da invenção.

[0225] O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem conhecido por técnicos no assunto. Por conveniência, faz-se referência à Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[0226] É possível que outros ingredientes estejam presentes na formulação farmacêutica de peptídeos da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem inclui agentes umidificantes, emulsifican- tes, antioxidantes, agentes agregadores, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina do soro humano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácido tal como betaína, taurina, ar- ginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais não devem, é claro, afetar adversamente a estabilidade geral da formulação farmacêutica da presente invenção.

[0227] As composições farmacêuticas contendo um polipeptídeo associado à ficolina, de acordo com a presente invenção, podem ser administradas a um paciente que necessite de tal tratamento em diversos locais, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplo, sítios de pele e mucosa, em sítios que evitam absorção, por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração e em sítios que envolvam absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, no músculo ou abdômen.

[0228] A administração tópica pode ser uma vantagem particular no tratamento de condições associadas a inflamações locais, tal qual no tratamento de inflamação associada a queimaduras ou outras condições associadas à pele. Assim, em algumas modalidades, a administração é por administração tópica.

[0229] Em algumas modalidades particulares, colírio ocular pode ser usado em condições associadas ao olho, como a ceratite , como a ceratite lamelar difusa (DLK).

[0230] A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser através de diversas rotas de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos brônquios e alvéolos ou uma combinação destas, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplo, através da conjuntiva, uretal e parenteral em pacientes que necessitem de tal tratamento.

[0231] As composições da presente invenção podem ser adminis tradas em diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, unguentos, pastas, emplastros, pomadas, tabletes, tabletes revestidos, enxágues, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina rígida e cápsula de gelatina macia, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, sprays, pós, aerossóis, inaladores, colírios, emplastros oftálmicos, enxágues oftálmicos, pessários vaginais, anéis vaginais, emplastros vaginais, solução de injeção, soluções transformadoras in situ, por exemplo, ge- lificação in situ, assentamento in situ, cristalização in situ, solução para infusão e implantes.

[0232] As composições da invenção podem ser ainda compostas por, ou anexadas a, por exemplo, através de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, um veículo de droga, sistema de entrega de droga e sistema de entrega de droga avançado de modo a aperfeiçoar ainda mais a estabilidade do polipeptídeo associado à ficolina, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a solubilidade, diminuir os efeitos adversos, conseguir cronoterapia de forma bem conhecida pelos técnicos no assunto, e aumentar a observância do paciente ou qualquer combinação destes. Exemplos de veículos, sistemas de entregas de drogas e sistemas de entrega de drogas avançados incluem, sem limitação, polímeros, por exemplo, celulose e derivados, polissa- carídeos, por exemplo, dextran e derivados, amido e derivados, álcool (poli)vinílico, polímeros de acrilato e metacrilato, poli(ácido láctico) e poliglicólico e copolímeros de bloco destes, polietileno glicóis, proteínas veículo, por exemplo, albumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplo, sistemas de copolímeros de bloco bem conhecidos pelos técnicos no assunto, micelas, lipossomas, microesfe- ras, nano partículas, cristais líquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões desta bem conhecidas pelos técnicos no assunto do comportamento de sistemas lipídio-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, auto-emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclo dextrinas e derivados destas e dendrímeros.

[0233] As composições da presente invenção são úteis na formulação de sólidos, semi-sólidos, pós e soluções para administração pulmonar do polipeptídeo associado à ficolina usando, por exemplo, um inalador de dose mensurável, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0234] As composições da presente invenção são especificamente úteis na formulação de sistemas de distribuição de drogas controlados, sustentados, prolongados, retardados e de liberação lenta. Mais especificamente e sem limitação, as composições são úteis na formulação de sistemas de liberação controlada e liberação sustentada parenteral (ambos os sistemas levando a uma redução de muitas vezes no número de administrações) bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Ainda mais preferíveis, são sistemas de liberação sustentada e liberação controlada administrados por via subcutânea. Sem que se limite o escopo da invenção, exemplos de composições e sistemas de liberação controlada úteis são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas e nanopartículas.

[0235] Métodos para a produção de sistemas de liberação contro lada úteis para as composições da atual invenção incluem, sem limitação, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co- precipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em alta pressão, encapsulamento, pulverização a seco, micro-encapsulamento, coacervação, separação de fase, evaporação de solvente para produzir microesferas, extrusão e processos de fluidos supercríticos. Referência geral é feito ao manual Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).

[0236] A administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente, uma seringa tipo caneta. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Outra opção é uma composição que pode ser uma solução ou uma suspensão para a administração do polipeptídeo associado à ficolina na forma de spray nasal ou pulmonar. Ainda como outra opção, as composições farmacêuticas contendo o polipeptídeo associado à ficolina da invenção também podem ser adaptados para administração transdérmica, por exemplo, por uma injeção sem agulha ou por um adesivo, opcionalmente, um adesivo iontoforético, ou administração transmucosal, por exemplo, bucal.

[0237] O termo "formulação estabilizada" se refere a uma formula ção com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade química e física aumentada.

[0238] O termo "estabilidade física" de uma formulação de proteí nas, conforme usado aqui, se refere à tendência da proteína de formar agregados biologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como resultado da exposição da proteína a estresses termo-mecânicos e/ou interações com interfaces e superfícies que são desestabilizadoras, como superfícies e interfaces hidrofóbicas. A estabilidade física de formulações de proteína aquosas é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medições de turbidez após a exposição da formulação enchida em um recipiente adequado (por exemplo, cartuchos ou ampolas) à estresse mecânico/físico (por exemplo, agitação) em temperaturas diferentes por diversos períodos de tempo. A inspeção visual da formulação é caracterizada por uma classificação de pontuação visual do grau de turbidez em, por exemplo, uma escala de 0 a 3 (uma formulação que não mostra nenhuma turbidez corresponde à pontuação visual 0, e uma formulação que demonstra turbidez visual à luz do dia corresponde à pontuação visual 3). Uma formulação é classificada como fisicamente instável com relação à agregação de proteína, quando ela mostra turbidez visual à luz do dia. Alternativamente, a tur- bidez da formulação pode ser avaliada pelo uso de uma sonda ou agente espectroscópico do status conformacional da proteína. A sonda é preferivelmente uma molécula pequena que se liga preferencialmente a um conformador não nativo da proteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular pequena de estrutura de proteínas é Tioflavina T. A Tioflavina T é uma tinta fluorescente que tem sido am- plamente usada para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença das fibrilas, e talvez outras configurações de proteínas também, a Tio- flavina T dá origem a uma nova excitação máxima em cerca de 450 nm e emissão melhorada em cerca de 482 nm quando ligada a uma forma de proteína de fibrila. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.

[0239] Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sonda das mudanças na estrutura da proteína de estados nativos para não nativos. Por exemplo, sondas de "adesivo hidrofóbico" que se ligam preferivelmente a adesivos hidrofóbicos expostos em uma proteína. Os adesivos hidrofóbicos são geralmente enterrados dentro da estrutura terciária da proteína em seu estado nativo, mas se tornam expostos à medida que uma proteína começa a se desdobrar ou desnaturar. Exemplos dessas sondas espectroscópicas moleculares pequenas são tintas hidrofóbicas aromáticas, tais quais antraceno, acridina, fenantro- lina e similares. Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal-aminoácidos, como complexos de cobalto aminoácidos hidrofó- bicos, tais como a fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina ou similares.

[0240] O termo "estabilidade química" de uma formulação de pro teína conforme usado aqui, se refere a mudanças químicas covalentes na estrutura da proteína que leva à formação de produtos de degradação química com potência biológica potencialmente reduzida e/ou propriedades imunogênicas potencialmente aumentadas se comparadas com a estrutura da proteína nativa. Diversos tipos de produtos de degradação química podem ser formados dependendo do tipo e da natureza da proteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. A eliminação de degradação química muito provavelmente não pode ser completamente evitada e quantidades crescentes de produtos de degradação química são frequentemente vistos durante a armazenagem e o uso da formulação química, tais como bem conhecidos por um técnico no assunto. A maior parte das proteínas tende à desamidação, um processo no qual o grupo amida da cadeia lateral nos resíduos glu- taminil ou asparaginil é hidrolisado de modo a formar um ácido carbo- xílico livre. Outras vias de degradação envolvem a formação de produtos de transformação de alto peso molecular em que duas ou mais moléculas de proteína são ligadas de maneira covalente uma à outra através de transamidação e/ou interações de dissulfeto levando à formação de produtos de degradação diméricos, oligoméricos e poliméri- cos covalentemente ligados (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). A oxidação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante da degradação química. A estabilidade química da formulação de proteína pode ser avaliada pela medição da quantidade de produtos de degradação química em vários períodos de tempo após a exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação pode ser frequentemente acelerada por, por exemplo, aumento da temperatura). A quantidade de cada produto de degradação individual é frequentemente determinada pela separação dos produtos de degradação dependendo do tamanho molecular e/ou carga usando várias técnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).

[0241] Assim, conforme realçado acima, uma "formulação estabili zada" se refere a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade química e física aumentada. Em geral, uma formulação deve ser estável durante o uso e armazenamento (observando as condições recomendadas para uso e armazenamento) até que a data de validade se expire.

[0242] Em algumas modalidades da invenção, a formulação far macêutica compreendendo o polipeptídeo associado à ficolina é está- vel por mais de 6 semanas de uso e por mais de 3 anos em armazenamento. Em outras modalidades da invenção, a formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo associado à ficolina é estável por mais que quatro semanas de uso e por mais de 3 anos em armazenamento. Em outras modalidades da invenção, a formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo associado à ficolina é estável por mais que quatro semanas de uso e por mais de 2 anos em arma-zenamento. Ainda, em outra modalidade da invenção, a formulação farmacêutica compreendendo o polipeptídeo associado à ficolina é estável por mais que 2 semanas de uso e por mais de 2 anos em armazenamento. Modalidades específicas da invenção

[0243] Conforme descrito acima, a presente invenção se refere a polipeptídeos associados à ficolina isolados bem como a polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ou variantes ou fragmentos imunológicos desta.

[0244] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é substancialmente puro.

[0245] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é capaz de se associar à lectina de ligação à ma- nose (MBL).

[0246] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é capaz de se associar a qualquer uma de ficolina- 1, ficolina-2, ficolina-3.

[0247] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é capaz de se associar a qualquer uma de C1q, proteínas tensoativas do pulmão SP-A e/ou SP-D, e moléculas intracelulares de defesa, tipo colágeno, tal qual CLL-11.

[0248] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é capaz de se associar a uma proteína aceptora específica, tal qual um receptor específico.

[0249] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende a sequência de aminoácidos 20 - 297 de SEQ NO: 3, ou uma variante funcional desta.

[0250] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende a sequência de aminoácidos 20 - 3807 de SEQ NO: 1, ou uma variante funcional desta.

[0251] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende a sequência de aminoácidos 16 - 296 de SEQ NO: 9, ou uma variante funcional desta.

[0252] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção possui uma massa molecular de cerca de 40 kDa sob condições não redutoras em um SDS-PAGE.

[0253] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é glicosilado por ligação N em um ou mais aminoá- cidos que correspondem a uma posição selecionada de 49 e 178 de SEQ NO: 1.

[0254] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é uma proteína recombinante.

[0255] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção está na forma homodímera.

[0256] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção consiste na sequência de aminoácidos 20 - 380 de SEQ ID NO: 1.

[0257] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou variantes ou fragmentos imunológicos desta.

[0258] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção consiste em SEQ ID NO: 4 ou variantes ou fragmentos imunológicos desta.

[0259] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção medeia a fagocitose de células mortas ou que estão morrendo, tais como células apoptóticas e/ou resíduos celulares.

[0260] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção medeia a fagocitose de um microorganismo.

[0261] Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam es pecificamente a um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0262] Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam es pecificamente a um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0263] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção possui atividade similar a outras proteínas com homo- logia de sequência, tal como a proteína adaptadora de engolfamento (GULP).

[0264] Em algumas modalidades, a molécula de ácidos nucleicos, isolada, que codifica um polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeos, que é pelo menos 70% idêntica à sequência de SEQ NO: 2.

[0265] Em algumas modalidades, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção é uma célula eucariótica.

[0266] Em algumas modalidades, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção é de origem mamífera.

[0267] Em algumas modalidades, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção é selecionada do grupo que consiste em células CHO, células HEK e células BHK.

[0268] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de quaisquer indicações associadas à inflamação, apoptose e/ou autoimunidade.

[0269] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de quaisquer condições autoi- munes tais como doença de Addison, anemia hemolítica autoimune, tireoidite autoimune, doença de Crohn, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite de lúpus, esclerose múltipla, miastenia grave, psoríase, cirrose biliar primária, artrite e uveíte reumatoide, aterosclerose, diabetes tipo I, psoríase, diversas alergias.

[0270] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de quaisquer distúrbios inflamatórios selecionados do grupo que consiste em apendicite, úlcera pépti- ca, úlcera gástrica, úlcera do duodeno, peritonite, pancreatite, colite ul- cerativa, colite pseudomembrânica, colite aguda, colite isquêmica, diver- ticulite, epiglotite, acalasia, colangite, colecistite, hepatite, doença de Crohn, enterite, doença de Whipple, alergia, doença do complexo imune, isquemia de órgão, dano de reperfusão, necrose de órgão, febre do feno, sepse, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatose, sarcoidose, aborto séptico, epididimite, vaginite, prostatite, uretrite, bronquite, enfisema, rinite, pneumonite, silicovulcanoconiose pneumotransmicroscópica, alveolite, bron- quiolite, faringite, pleurite, sinusite, influenza, infecção viral sincicial respiratória, infecção por HIV, infecção por vírus da hepatite B, infecção por vírus da hepatite C, bacteremia disseminada, dengue, candidíase, malária, filaríase, amebíase, cistos hidáticos, queimaduras, dermatite, der- matomiosite, queimaduras solares, urticária, verrugas, pápulas, vasculi- te, angeíte, endocardite, arterite, aterosclerose, tromboflebite, pericardite, miocardite, isquemia do miocárdio, periarterite nodosa, febre reumática, mal de Alzheimer, doença celíaca, insuficiência cardíaca congestiva, síndrome da dificuldade respiratória adulta, meningite, encefalite, esclerose múltipla, infarto cerebral, embolia cerebral, síndrome de Guil- lame-Barre, neurite, neuralgia, dano à medula espinhal, paralisia, uveí- te, artritides, artralgias, osteomielite, fasceíte, gota, doença periodontal, artrite reumatoide, sinovite, miastenia gravis, lúpus sistêmico eritemato- so, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rejeição de aloen- xertos, doença do enxerto-vs-hospedeiro, diabetes tipo I, espondilite anquilosante, doença de Berger, síndrome de Reiter e doença de Hodgkin, ceratite , diabetes tipo 2, fibrose cística, infarto do miocárdio, dano de reperfusão, ataque cardíaco, dermatomiosite, síndrome metabólica, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, sepse, falência múltipla dos órgãos, coagulação intravascular disseminada, choque anafilático. Complicação vascular e nefropatia associada à diabetes tipo 1 e/ou tipo 2, meningite, septicemia bacteriana, malária complicada, síndrome urêmica hemolítica atípica, síndrome urêmica hemolítica, degeneração macular relacionada à idade, hemoglobinúria noturna paroximal, mordida com veneno de cobra, dano por queimadura e complicações em transplante de órgãos.

[0271] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de qualquer distúrbio inflamatório selecionado do grupo que consiste em isquemia de órgão, dano de reperfusão, necrose de órgão, vasculite, endocardite, aterosclerose, tromboflebite, pericardite, miocardite, isquemia do miocárdio, periarterite nodosa, febre reumática, insuficiência cardíaca congestiva, síndro- me da dificuldade respiratória adulta, infarto cerebral, embolia cerebral. Complicações vasculares e nefropatias associadas à diabetes tipo 1 e/ou tipo 2.

[0272] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de qualquer uma das indicações associadas a doenças relacionadas à coagulação, trombóticas ou coagulopáticas.

[0273] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de uma indicação associada a doenças ou distúrbios relacionados à coagulação, trombóticas ou coa- gulopáticas incluindo resposta inflamatória e distúrbios ou doenças tromboembólicas crônicas associadas à formação de fibrina, incluindo distúrbios vasculares como a trombose, trombose venosa profunda, trombose arterial, trombose pós-cirúrgica, enxerto de ponte arterial coronária (CABG), angioplastia coronária transdérmica percutânea (PTCA), ataque de deposição de plaquetas, crescimento tumoral, me- tástase tumoral, angiogênese, trombólise, aterosclerose, reestenose, como arteriosclerose e/ou reestenose após angioplastia, indicações agudas e crônicas como inflamação, sepse, choque séptico, septicemia, hipotensão, síndrome da dificuldade respiratória adulta (ARDS), síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), coagulopatia intravascular disseminada (DIC), embolia pulmonar, deposição patológica de plaquetas, infarto do miocárdio, ou o tratamento profilático de mamíferos com vasos ateroscleróticos em risco de trombose, doença oclusiva venal após transplante de célula progenitora do sangue periférico (PBPC), síndrome urêmica hemolítica (HUS), e púrpura trombo- citopênica trombótica (TTP) e febre reumática.

[0274] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de uma indicação associada a doenças ou distúrbios relacionados à coagulação, trombóticas ou coa- gulopáticas, incluindo a resposta inflamatória e distúrbios ou doenças tromboembólicas crônicas associadas à formação de fibrina, incluindo distúrbios vasculares como a trombose, trombose venosa profunda, trombose arterial, trombose pós-cirúrgica, enxerto de ponte arterial coronária (CABG), angioplastia coronária transdérmica percutânea (PTCA), ataque de deposição de plaquetas, crescimento tumoral, me- tástase tumoral, angiogênese, trombólise, aterosclerose, reestenose, como arteriosclerose e/ou reestenose após angioplastia, indicações agudas e crônicas como inflamação, deposição patológica de plaque- tas, infarto do miocárdio, ou o tratamento profilático de mamíferos com vasos ateroscleróticos em risco de trombose, doença oclusiva venal após transplante de célula progenitora do sangue periférico (PBPC), síndrome urêmica hemolítica (HUS), e púrpura trombocitopênica trom- bótica (TTP) e febre reumática.

[0275] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para a prevenção da ocorrência de complicações tromboembólicas em pacientes identificados como de alto risco, como aqueles estão sendo submetidos a cirurgias ou aqueles com insuficiência cardíaca congestiva.

[0276] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de uma condição médica associada ao coração.

[0277] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção é para o tratamento de uma condição médica associada a uma deficiência em um polipeptídeo associado à ficolina.

EXEMPLO 1 Detecção da transcrição alternativa do gene MASP1

[0278] Métodos: de modo a detectar três variantes de transcrição de MASP1: MASP1, MASP3 e FAP, iniciadores específicos para cada variante foram projetados. PCR foi configurada com um iniciador adiante comum no exon 6 (5'-gcacccagagccacagtg-3') e iniciadores específicos reversos: MASP1 no exon 12 (5'-gccttccagtgtgtgggc-3'), MASP3 no exon 11 (5-gccttccagagtgtggtca-3') e FAP no exon 8a (5'- cgatctggagagcgaactc-3') (Figura 1). Amplificações PCR foram realizadas em volumes de 20 μL contendo: 50 ng de cDNA de fígado (Clon- tech), 0,25 μM de cada iniciador, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris^HCl, pH 8,4, e 0,4 unidades de polimerase de DNA Taq Plantinum (Invitrogen). As reações PCR foram realizadas nos seguintes parâmetros de ciclagem 10min94 C, 30 ou 40 ciclos (30 s 94oC, 50 s 58oC, 90 s 72oC), 10 min 72oC. As amostras foram analisadas em gel de agarose a 2%.

[0279] Resultados: Transcrição alternativa do gene de MASP1 foi detectada no cDNA de fígado. As transcrições de MASP1, MASP3 e FAP foram amplificadas usando um iniciador adiante comum localizado no exon 6 e iniciadores reversos específicos localizados no exon 12 (MASP1), exon 11 (MASP3) e exon 8a (FAP). MASP1 gera um fragmento de 500 bp, MASP3 gera um fragmento de 506 bp e FAP gera um fragmento de 309 bp. Expressão em tecido do fragmento FAP

[0280] Métodos: Painéis de cDNA de tecido humano comercial mente disponíveis (Clontech) foram investigados para a expressão de MASP1, MASP3 e FAP com os mesmos ensaios PCR descritos acima. As amostras foram analisadas em gel de agarose a 2%.

[0281] Resultados: As distribuições de tecido dos genes de MASP1, MASP3 e FAP foram investigadas em painéis de cDNA da Clontech (Figura 2). Transcrições de MASP1, MASP3 e FAP foram amplificadas usando um iniciador adiante comum e iniciadores específicos reversos. GADPH foi usado como gene de referência. Todos os três genes foram altamente expressos no fígado e, adicionalmente, FAP foi altamente expresso no tecido cardíaco (marcado com flechas pretas). Expressão menor do gene de FAP foi detectada no cérebro, cólon, próstata, músculo esquelético e intestino delgado (marcado com flechas brancas).

[0282] Sequenciamento de DNA do FAPexon8a de 100 indivíduos.

[0283] Métodos: Sequenciamento direto do exon 8a incluindo a fronteira íntron-exon do gene de MASP1/MASP3/FAP cobrindo a posição +44.083 a +44.431 com relação ao sítio de início de tradução ATG, foi realizado em modelos de DNA genômico de 100 indivíduos caucasianos saudáveis. O fragmento foi amplificado usando um conjunto de iniciadores únicos (adiante: 5'-ctgttcttcacactggctg-3', reverso: 5'- ctgctgagatcatgttgttc-3'), em que os iniciadores adiantes continham uma sequência 5'-T7 (5'-ttatacgactcacta-3'). Amplificações PCR foram realizadas em volumes de 20 μL contendo: 50 ng de DNA genômico, 0,25 μM de cada iniciador, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris^HCl, pH 8,4, e 0,4 unidades de polimerase de DNA Taq Planti- num (Invitrogen). As reações PCR foram realizadas nos seguintes parâmetros de ciclagem 2 min 94OC, 15 ciclos (30 s 94oC, 60 s 64oC, 60 s 72OC), 10 min 72OC, 15 ciclos (30 s 94oC, 60 s 58oC, 60 s 72oC), 5 min 72oC e foram sequenciadas adiante usando o kit terminador de sequen- ciamento de ciclo ABI BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com o protocolo usando iniciadores de sequência 5' biotinilados. As reações de sequência foram purificadas em PyroMark Vacuum Prep Workstation (Biotage) usando contas de estreptavidina (Applied Biosystems). As sequências de DNA resultantes foram alinhadas usando o software BioEdit, e polimorfismos de DNA foram confirmados visualmente a partir de eletroferogramas de sequência.

[0284] Resultados: Todas as sequências foram alinhadas usando o software BioEdit. Não se observou nenhuma variação genética nos 100 indivíduos saudáveis no éxon 8a ou nas regiões exon-intron.

EXEMPLO 2

[0285] Imunoprecipitação.

[0286] Imunoprecipitação específica de MAP-1 de soro foi realiza da no MAP-1 específico mAb 20C4 (criado contra o peptídeo de terminal C 17 específico a MAP-1) ou mAb 8B3, um anticorpo monoclonal que reage contra a cadeia pesada comum de MASP-1/3 usado como um anticorpo de precipitação de controle. Foi permitido que um total de 10 μg de anticorpo anti MAP-1 ou MASP-1/3 se ligasse a IgG de ovelha anti camundongos ou anti coelhos de Dynabeads (M-280, número 112.02D/112.04D, Dynal/Invitrogen). Após a etapa de lavagem, as contas foram aplicadas a um conjunto de soro humano normal (diluído 1:1 em TBS) e incubados fim a fim por 1 hora a 4oC. Após as etapas de lavagem final e separação magnética, as contas foram fervidas em tampão carregador de SDS e submetidas a SDS-PAGE e Western blotting, sondadas com anticorpos para MAP-1, MBL e Ficolina-3.

[0287] O mesmo procedimento de precipitação que aquele des crito acima foi realizado com mAbs para MBL (Hyb 131-11, Bioporto, Dinamarca), Ficolina-2 (FCN219) e Ficolina-3 (FCN334). Para compensar as diferenças nas concentrações, o soro de MBL, Ficolina-2 e - 3 foi precipitado para 1 mL, 300 μL e 100 μL de soro, respectivamente. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e western blotting sondadas com pAb contra MAP-1.

Imunoistoquímica

[0288] Células de CHO expressando rMAP-1 foram cultivadas em balões de cultura em RPMI + 10%. As células foram colhidas em 80 - 90% de confluência e fixadas por 24 horas em 4% de formaldeído-PBS e, a seguir, embutidas em parafina. Seis tecidos de fígado humano, diferentes, e amostras de dois tecidos de miocárdio diferentes, dois tecidos de músculo esquelético e duas amostras obtidas de aorta humana foram também fixados em parafina embutida conforme descrito acima. Seções de fatias de 5 μm foram obtidas com um microtomo e postas em lâminas de vidro e armazenadas a 4oC até que fossem ensaiadas. Pré-tratamentos e análises foram realizados conforme descrito anteriormente. Anticorpos primários foram os anticorpos mono- clonais específicos de MAP-1 mAb 12B11 ou anti-MAP-1 de coelho monoespecífico purificado por afinidade todos diluídos em 5 μg/mL. Controles de anticorpos de isótipo foram aplicados na mesma concentração. Anticorpo secundário foi o anticorpo EnVision (HRP anti- camundongo ou HRP anti-coelho, Dako, Glostrupo, Dinamarca). A análise de padrões de coloração foi conduzida sob um microscópio Leica DMLB2.

[0289] SDS-PAGE e Western blotting.

[0290] Eletroforese foi realizada em 10% ou 4 - 12% (peso em vo lume de géis bis-tris de poliacrilamida com tampões descontínuos usando o sistema NuPAGE (Invitrogen) essencialmente conforme descrito pelo fabricante. Western blotting foi realizada usando membranas de poli(difluoreto de vinilideno) (PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 μg/mL de mAbs primário e visualização secundária por estrepta- vidina conjugada HRP (P0397, Dako) diluída para 1:1500 de IgG anti camundongo de coelho HRP (PO260, Dako) diluída para 1:1000 em PBS, 0,05% de Tween20. As membranas foram desenvolvidas com 3- amino-9-etil-carbazola (Sigma) (0,04% em acetona) e 0,015% de H2O2 em 50 mM de tampão de acetato de sódio de pH 5.

[0291] Ensaio de ativação de complementos.

[0292] A influência de MAP-1 na deposição do fator de comple mento C4 mediado por Ficolina-3 e MBL foi avaliada essencialmente como descrito anteriormente. Em suma, manana (ligante MBL) (Sigma-Aldrich M7504) ou albumina do soro bovino acetilada (ligante Fico- lina-3) foi imobilizado com pratos de ELISA da Maxisorp (Nunc, Dinamarca) a 10 μg/mL. Após lavagem, rMBL ou rFicolina-3 (0,4 μg/mL) foi adicionada e incubada por 1,5 horas. RMAP-1 ou rMASP-2 foi aplicada por uma hora em diluição serial por duas vezes na primeira dimensão seguida por incubação por 45 minutos a 37oC com diluições seriais de soro deficiente de MBL ou Ficolina-3 na segunda dimensão. A deposição de C4 foi medida usando um pAb para C4c (Q0369, Dako, Glos- trup / Dinamarca).

[0293] Adicionalmente, avaliou-se o deslocamento de MASP-2 com MAP-1 usando um sistema puro. RMASP-2 foi pré-incubada por 45 minutos a 20oC em diluições seriais na primeira dimensão em uma matriz de rMBL/manana conforme descrito acima seguido por incubação com diluições de rMAP-1 na segunda dimensão por 45 minutos a 20oC. C4 purificada (da Quidel, CA, EUA) foi adicionada a uma concentração de 1 μg/mL e incubada por 45 minutos a 37OC. A detecção foi conduzida conforme acima.

[0294] Resultados.

Co-precipitados de MAP-1 com Ficolina-2, Ficolina-3 e MBL

[0295] Para investigar a possível associação de MAP-1 com MBL e Ficolina-3, nós precipitamos complexos de soro usando ambos anti MAP-1 mAb20C4 e um mAb contra a cadeia pesada comum de MASP-1 e MASP-3 (mAb8b3). Os precipitados foram subsequentemente analisados por western blotting sondado com anticorpos para MAP-1, MBL e Ficolina-3, respectivamente. Observamos bandas de co-precipitação de Ficolina-3 pronunciadas, mas bandas mais fracas também foram vistas com MBL (figura 24a). As amostras não foram sondadas com anticorpos contra a Ficolina-2 já que elas não funcionam em western blot. Revertemos então a imunoprecipitação usando mAbs contra MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3 para precipitar 1 mL, 300 μL e 100 μL de soro, respectivamente, que foi usado para realizado para ajustar diferenças na concentração de soro de MBL (2 μg/mL), Ficoli- na-2 (5 μg/mL) e Ficolina-3 (20 μg/mL), respectivamente. As amostras foram a seguir analisadas por western blotting sondado com anticorpos para MAP-1. Bandas distintas de MAP-1 foram observadas nos precipitados de Ficolina-2 e -3 e bandas muito mais fracas ficaram aparentes no precipitado de MBL, em rMAP-1 imunoprecipitada e MAP-1 de soro serviram de controle (figura 24b).

[0296] MAP-1 inibe a atividade do complemento do caminho de lectina.

[0297] Soro deficiente em MBL e Ficolina-3 em combinação com rMBL e rFicolina-3 foi usado para reconstituir a atividade de ativação do complemento C4 de MBL e Ficolina-3. Manan e BSA acetilado serviram de ligantes para MBL e Ficolina-3, respectivamente. Ambos rMBL e rFicolina-3 foram capazes de iniciar a deposição de C4 em soro deficiente em MBL e Ficolina-3, respectivamente (figura 25A e 25D). A aplicação de rMASP-2 resultou em uma melhora positiva forte dose dependente da deposição de C4 através de ambos os caminhos de ativação de Ficolina-3 e MBL (figura 25B e 25E), enquanto a aplicação de rMAP-1 resultou em uma inibição pronunciada dose dependente da deposição de C4 via ambos os caminhos (figura 25C e 25 F).

[0298] Adicionalmente, focamos em um possível deslocamento de MASP-2 com MAP-1 usando um sistema de componentes puros com-preendendo somente rMBL, rMASP-2, rMAP-1 e C4 purificada. RMASP-2 foi pré-incubada com complexos de manana-rMBL em diluições seriais. A seguir, rMAP-1 foi adicionada em concentrações variáveis seguido pela adição de C4 purificada. A aplicação de rMAP-1 ao sistema claramente resultou em uma inibição dose dependente da deposição de C4 (figura 26).

EXEMPLO 3

[0299] Determinação da concentração no soro e de propriedades de associação da proteína associada a MBL/Ficolina 1 (MAP-1).

[0300] Construções recombinantes não marcadas e de compri mento completo de MAP-1 foram geradas e expressas estavelmente em células CHO-DG44. Anticorpos monoclonais específicos contra MAP-1 foram criados. Ademais, ensaio ELISA quantitativo para medições de soro de MAP-1 foi estabelecido e as associações entre MAP- 1, Ficolina-2, -3 e MBL no soro foi examinada por ELISA e fracionamento por gradiente de densidade.

Proteínas recombinantes

[0301] Construções de comprimento completo de MAP-1 humana não marcada foram expressas em células CHO-DG44 conforme descrito em outro lugar (Hummelshoj et al., Mol Immunol 44, 401-11, 2007; Larsen et al., J Biol Chem 279, 21302-11, 2004; Ma et al., 2009 J Biol Chem, Oct 9;284(41)) com as modificações de que meio livre de soro PowerCHO1 (Lonza, Vallensbaek/Dinamarca, www.lonza.com) foi usado como meio de expressão. Nós usamos purificação por afinidade de anticorpo para purificar rMAP-1 conforme descrito previamente (Skoedt et al., 2009; Immunobiology, Nov 23). Em suma, 15 mg do anticorpo anti MAP-1 (mAb 20C4) foi acoplado de modo covalente à sefarose ativada por CNBr essencialmente do modo descrito em Pfeiffer et al. (Pfeiffer et al., J Immunol Methods 97, 1 - 9, 1987) e usados como a matriz de purificação. A coluna anti-MAP-1 também foi usada para esgotar MAP-1 do soro.

[0302] A geração de anticorpos monoclonais foi feita conforme des crito anteriormente (Skjoedt et al., J Biol Chem 285, 8234 - 43, 2010).

[0303] Eletroforese foi realizada em 10% ou 4 - 12% (peso em vo lume) de géis bis-tris de poliacrilamida com tampões descontínuos usando o sistema NuPAGE (Invitrogen) conforme recomendado. Western blotting foi realizado usando membranas de poli(difluoreto de vinilideno) (PVDF-HyBond, Amersham Bioscience). As membranas foram desenvolvidas usando 2 μg/mL de mAbs primário e visualização secundária por estreptavidina conjugada HRP diluída para 1:1500 ou IgG anti camundongo de coelho HRP (PO/397PO260, Dako, Glostrup/Dinamarca, www.dako.com) com 0,04% de 3-amino-9-etil-carbazola (Sigma-Aldrich, Broenby/Dinamarca, www.sigmaaldrich.com) + 0,015% de H2O2 em 50 mM de tampão de acetato de sódio de pH 5 como substrato.

[0304] RMAP-1 foi tratado com N-glicosidase-F/ENDO-F (kit de deglicosilação de N-glicosidase-F, Roche, Mannheim, Alemanha, www.roche.com) conforme recomendado e descrito anteriormente (Skjoedt et al., 2009). Produtos foram analisados por SDS-PAGE sob condições redutoras seguidos por coloração com Coomassie ou Western blotting.

[0305] A especificidade de mAb anti-MAP-1 20C4 foi previamente demonstrada (Skjoedt et al., 2010). A mAb 20C4 foi usada como anti- corpo de pegada em ELISA de MAP-1 quantitativo imobilizado a 6 μg/mL em placas de ELISA da Maxisorb (NUNC, Roskilde/Dinamarca, www.nuncbrand.com). Diluições em série do calibrador (rMAP-1 ou rMAP-1 adicionados em soro deplecionado de MAP-1) ou amostras de soro de doador foram aplicadas em PBS + 0,05% de Tween20 + 0,5% de soro bovino em 10 mM de EDTA. O anticorpo de detecção foi mAb marcado com biotina 8B3 reagindo a cadeia comum de MASP-1, -3 e MAP-1 descrito previamente (Skjoedt et al., 2010; Skjoedt et al., 2009) aplicados a 3 μg/mL.

[0306] As concentrações de soro de Ficolina-2 e -3 foram determi nadas conforme descrito por Munthe-Fog et al. e Hummelshoj et al. (Hummelshoj et al., Hum Mol Genet 14, 1651-8, 2005; Munthe-Fog et al., Scand J Immunol 65, 383-92, 2007; Munthe-Fog et al., Mol Immunol 45, 2660-6, 2008) e as concentrações de soro MBL e MASP-3 foram determinadas conforme descrito previamente (Skjoedt et al., 2009).

[0307] O desenvolvimento foi obtido com orto-fenileno-diamina (Dako, Glostrup/Dinamarca) e a reação enzimática foi interrompida com 1 M de H2SO4 conforme recomendado. Níveis de densidade óptica (OD490nm - 650 nm) foram medidos usando um leitor cinético V- max (Molecular Devices, Sunnyvale, Califórnia, EUA).

[0308] A associação relativa entre MAP-1 e MBL, Ficolina-2 e -3 foi avaliada essencialmente conforme descrição anterior (Skjoedt et al., 2009) com a modificação de que mAb específico a MAP-1 20C4 foi usado como anticorpo de captura (revestido a 6 μg/mL). A detecção de mAbs foi marcada com biotina FCN-219 (específica a Ficolina-2) ou FCN-334 (específica a Ficolina-3) (24 - 25) ou Hyb 131-11, todos aplicados a 2 μg/mL. As amostras de soro analisadas foram todas dos mesmos 100 doadores de sangue dinamarqueses que acima.

[0309] Soro humano normal foi submetido à gradiente de separação de sacarose. 0,75 mL de soro foi carregado em colunas de centrifugação de 40 mL consistindo em 10 - 30% de gradientes de sacarose tampona- dos em 10 mM de Tris, 145 mM de NaCl, 3 mM de CaCl2 e albumina do soro humano a 30 μg/mL. As colunas carregadas foram centrifugadas a 150.000 x g a vácuo por 24 horas a 4oC em uma ultra centrífuga Beckmann L70 com uma cabeça de rotor SW28. Frações de 1,5 mL foram coletadas do fundo e analisadas por ELISA específico ou immunoblotting quanto aos seguintes antígenos: MAP-1, MASP-1, MASP-2, MASP-3, sMAP, MBL, Ficolina-2 e Ficolina-3. Os picos de IgM (19S) e IgG (7s) em soro foram avaliados indicando a superfície molecular em relação a ra-zão de massa. Adicionalmente, as frações foram analisadas quanto à capacidade de ativar C4 aplicada de modo exógeno. Em suma, as frações foram aplicadas em diluições seriais a pratos de ELISA revestidos com BSA acetilado (um ligante de Ficolina-3) ou manana (um ligante de MBL) conforme descrito previamente (Skjoedt et al., 2010) seguido por incubação por 1 hora a 4oC com agitação. As placas foram então lavadas e incubadas com C4 purificada a 1 μg/mL por 1 hora a 37oC. A de-posição de C4 foi medida a seguir com anticorpos policlonais para C4c (Q 0369, Dako, Glostrup, Dinamarca).

Análise estatística

[0310] Estatísticas (correlação não paramétrica de Spearman, tes te t de duas caudas não paramétrico) e níveis no soro de MAP-1, MBL, Ficolina-2 e -3 foram calculados usando o software Prism4 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Califórnia, EUA, www.graphpad.com).

Resultados Purificação e caracterização de rMAP-1

[0311] A expressão de rMAP-1 em células CHO DG44 resultou em um alto rendimento na presença de 150 nM de metotrexato (rendimento: 1 - 20 μg/mL em meio livre de soro). Após a purificação, rMAP-1 foi analisada em SDS-PAGE seguido por coloração com azul brilhante de Coomassie ou immunoblotting. A análise por coloração SDS- PAGE/Coomassie revelou uma banda com uma massa molecular reduzida estimada em cerca de 45 kDa (figura 27). A deglicosilação de rMAP-1 com N-glicosidase F resultou em uma mudança da massa molecular para cerca de 40 kDa correspondente à massa teórica sem o peptídeo de sinal. Este padrão também foi observado com immunoblotting usando anticorpos específicos a MAP-1.

Níveis séricos de MAP-1

[0312] Desenvolveu-se um ensaio ELISA quantitativo para deter minar os níveis séricos de MAP-1. O ensaio foi baseado em mAb específico MAP-1 20C4 como anticorpo de captura e um anticorpo de detecção (mAb 8B3) que reconhece a cadeia pesada comum de MASP-1, -3 e MAP-1. Paralelismo perfeito foi observado entre o calibrador de rMAP-1 purificado e MAP-1 purificado adicionado de soro esgotado de MAP-1, em uma concentração conhecida com uma curva padrão (Figura 28A). Analisamos o nível sérico de MAP-1 em 100 doadores de sangue dinamarqueses e encontramos uma media de 240 ng/mL com uma faixa de 115 - 466 ng/mL (figura 29A). Medimos o nível sérico de MASP-3 no mesmo grupo que aquele descrito previamente (Skjoedt et al., 2009) e traçamos o gráfico da concentração de MAP-1 e MASP-3 (figura 29B). Não encontramos correlação entre a concentração de MAP-1 e MASP-3 embora eles representem transcri-ções alternativas do mesmo gene.

[0313] Avaliou-se o antígeno e a estabilidade do ensaio em soro durante ciclos de congelamento-descongelamento (figura 29C). Notamos que a avaliação de MAP-1 foi muito robusta independentemente dos ciclos de congelamento-descongelamento. Associação entre MAP-1 e Ficolina-2, -3 e MBL

[0314] De modo a medir as interações entre MAP-1 e MBL, Ficolina- 2 e -3, nós desenvolvemos três ensaios diferentes ELISA usando mAb 20C4 como o anticorpo de captura e sondagem com mAbs marcados com biotina: FCN-219 (específico a Ficolina-2), FCN-334 (específico a Ficolina-3) ou Hyb 131-11 (específico a MBL). Analisamos as mesmas amostras de soro de 100 doadores que as usadas nas determinações de MAP-1 e avaliou-se os níveis de associação do soro entre MAP-1 e Fi- colina-2, -3 e MBL dados como densidade óptica relativa 490 - 650 nm (figura 30A). Adicionalmente, medimos a concentração no soro de MBL, Ficolina-2 e -3 conforme previamente (skjoedt et al., 2009).

[0315] Constatou-se que MAP-1 existe em complexo com MBL, Fi- colina-2, e -3. Entretanto, parece que a maior parte da MAP-1 é associada às ficolinas e especialmente à Ficolina-3 (p < 0,0001), um padrão que também foi observado previamente para MASP-3 (Skjoedt et al., 2009).

[0316] Traçou-se o gráfico das concentrações de soro de MAP-1, MB< Ficolina-2 e -3 aos níveis de associação relativos e constatamos que a associação entre MAP-1 e MBL é altamente correlacionada ao nível de MBL (Spearman r: 0,92, p < 0,0001) (figura 30B, lado superior direito). Ao contrário disto, a associação de MAP-1 relativa à Ficolina-2 e -3 ao nível de soro de MAP-1 (Spearman r:0,45 e 0,61, respectivamente, p < 0,0001, figura 30B, lado esquerdo). Embora tenhamos observado certa correlação entre a concentração de MAP-1 e a associação relativa à concentração de MBL e Ficolina-3, as tendências foram menos pronunciadas. Fracionamento por gradiente de densidade

[0317] Para que fosse investigada a distribuição de MAP-1 com relação às moléculas associadas e para examinar o quanto parece ser não associado, submetemos soro humano normal a fracionamento por densidade usando um gradiente de sacarose de 10 - 30% e ultracen- trifugação. A seguir, as frações coletadas foram analisadas por MAP-1, MASP-3, MBL, Ficolina-2 e -3 por ELISA (figura 31 A) e MAP-1, MASP-1, -2 e -3, sMAP, MBL, Ficolina-2 e -3 por Western blotting (figura 31B). Os resultados mostraram que MAP-1 no soro só estava presente nas frações com ficolinas e MBL, sugerindo que MAP-1 não existe como molécula não associada. O mesmo padrão foi observado para sMAP, MASP-1, -2 e -3. Adicionalmente, os dados indicaram que a maior parte de MAP-1, sMAP e MASP-1, -2 e -3 se co-localizam nas frações de pico de Ficolina-3. Essa distribuição também foi analisada por cromatografia por exclusão de tamanho em uma coluna Sephadex- 200. Um padrão de distribuição equivalente das moléculas foi observado (dados não mostrados).

[0318] Finalmente, avaliou-se a capacidade das frações gradientes de sacarose de ativar C4 aplicada de modo exógeno. Manana em fase sólida e BSA acetilado foram usados como ligantes para MBL e Ficoli- na-3, respectivamente. Verificamos duas curvas de deposição de C4 refletindo os picos dos complexos de Ficolina-3 e MBL separados pelo gradiente de sacarose (figura 31C).

Discussão

[0319] Para investigar os aspectos estruturais e para estabelecer o nível de soro da proteína associada a MBL/ficolina 1 nova (MAP-1), nós expressamos MAP-1 recombinante não marcada e geramos anticorpos específicos contra ela. Tratamento com N-glicosidase F e análise por SDS-PAGE indicaram que a MAP-1 é glicosilada resultando em uma massa molecular de cerca de 45 kDa com N-glicanos e cerca de 40 kDa após desglicosilação equivalente à massa molecular calculada da sequência de aminoácidos deduzida, sem o peptídeo de sinal.

[0320] Usou-se um anticorpo monoclonal gerado contra C-terminal específico para MAP-1 para estabelecer um ELISA de MAP-1 quantitativo e para determinar a faixa de concentração no soro em 100 doadores de sangue, dinamarqueses, saudáveis. Encontramos uma concentração de soro relativamente baixa (média: 240 ng/mL, faixa 115 - 466 ng/mL) no grupo doador comparado à concentração de MASP-3 (média: 6500 ng/mL). Adicionalmente, não houve correlação entre as con- centrações de soro das duas proteínas, sugerindo que embora as duas moléculas sejam variantes partidas diferencialmente do mesmo gene, a regulação da expressão é diferente. Recentemente, uma diferença significativa na distribuição no tecido de MASP-1, -3 e MAP-1 foi descrita (Degn et al., 2009; Skjoedt et al., 2010). A descoberta de uma diferença grande na concentração em soro entre MASP-3 e MAP-1 também apoia a noção de que o mecanismo regulatório diferencial das variantes de transcrição deriva do gene de MASP1.

[0321] Desenvolveu-se ensaios baseados em ELISA para avaliar a associação relativa entre MAP-1, MBL, Ficolina-2 e -3 no soro, respec-tivamente. Adicionalmente, nós determinamos a concentração no soro de Ficolina-2, -3 e MBL de modo a relacioná-las aos níveis de associação relativos. Os resultados mostram que a MAP-1 é associada primariamente à Ficolina-3 e Ficolina-2 e que a associação relativa à MBL parece menos pronunciada. Pode ser discutido que essa distribuição reflete a diferença na concentração de soro média de MBL, Fi- colina-2 e -3. Entretanto, embora a associação MBL-MAP-1 se correlacione com a concentração de MBL, o mesmo não é evidente para a Ficolina-2, em que a concentração no soro de MAP-1 se correlaciona com o nível de associação de Ficolina-2. A associação relativa entre Ficolina-3 e MAP-1 foi altamente correlacionada com a concentração de MAP-1 no soro, enquanto uma correlação positiva com o nível no soro de Ficolina-3 foi muito fraca. As descobertas acima indicam que a associação principal entre MAP-1 e Ficolina-2 e -3 não se deve sim-plesmente à concentração geral maior da Ficolina-2 e-3. Este padrão de distribuição foi ainda mais substanciado pela análise do soro submetido à separação por gradiente de densidade. Nós encontramos uma clara tendência que não somente MAP-1, mas também sMAP, MASP-1, -2 e -3 se co-localizam com as frações de pico de Ficolina-3. Este é um fenômeno que nós observamos previamente para MASP-3 (Skjoedt et al., 2009). A separação das frações de pico de Ficolina-3 e MBL também foi avaliada pela capacidade de ativar C4 adicionada por via exógena em BSA acetilado (um ligante de Ficolina-3) e manan (um ligante de MBL). A deposição de C4 nas duas superfícies de ativação diferentes ilustra claramente as frações de pico diferentes contendo os complexos de MBL ou Ficolina-3.

[0322] Os dados da análise de densidade de gradiente de sacaro se também indicaram que a razão entre superfície e massa é mais alta para MBL que para Ficolina-2 e Ficolina-3, o que apoia as observações de um estudo recente que sugere que a MBL possui uma conformação muito solta e aberta na estrutura quaternária (Jensenius et al., 2009). Entretanto, a razão de superfície para massa menor das ficolinas também pode refletir a distribuição molecular com as moléculas associadas como MAP-1, sMAP e as MASPs. Com relação a isso, estar mais associada a MAP-1/sMAP/MASPs resultaria em uma massa maior e uma maior migração através do gradiente de densidade.

[0323] Concluindo, mostra-se que MAP-1 está presente em con trações baixas no soro se comparada a MASP-3 e que MAP-1 circula em complexos predominantemente com as ficolinas, mas também, em algum nível, com MBL. Ademais, demonstramos que a Ficolina-3 parece ser a principal molécula associada à MAP-1 entre as moléculas de reconhecimento de LCP. SEQ ID NO: 1. As sequências de 380 aminoácidos completas para FAP humana. (Dois sítios de glicosilação potenciais identificados na posição de aminoácido 49 e 78 estão realçados) MRwLLLYYALCFOI.SKASAHTVELlllWFGQIQSPGYPDSYPSDOEVTXllITVPDGFRIKLYETíHFllLESSYI.CEYDYVKV 80 ETEDWLATFCGRETTDTEQTEGQEWLSPGSFMSITFRSDFStlEERFTGFDAHYHAVDVDECKEREDEELSCDHYCHHY 160 IGGYYCSCRFGYILHTElIRTCR’.'ECSDllLFTQRTGVITSPDFPllPYPKSSECLYTIEI.EEGFM’Ziπ.QFEDirDrEDHPEV 240 PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDtlSGEHWWRLSYRAAGHECPELQPPVHGKIEPSQAKYF 320 FKDQ’ZLVSCDTGYK’ZLKDHVEMDTFGrECLKDGTWSHKIFTCKKHEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO:2. As sequências de nucleotídeos de cDNA completas para FAP humana. atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagctaaacaata tgtttggccaqatccagtcgcctgqttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtccc agatgggtttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttgqaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaag gtagaaactgaggaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggagg tggtcctctcccctggctccttcatgtccatcactttccggtcdgatttctccaatgaggagcgtttcacaggctttga tgcccactacatggctgtggatgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccac aactacattggcggctactactgctcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagt gcagtgacaacctcttcactcaaaggactggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctga atgcctgtataccatcqaqctggaggagggtttcatggtcadcctgcagtttgaggacatatttgacattgaqgaccat cctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatcaaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaag ccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgatcctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctg gaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctacagcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaa gccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggctacaaagtgctgaaggataatgtggagatgg acacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcccacctgtaaaaaaaatgaaatcgatct ggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtga SEQ NO:3. Sequência mínima de um polipeptídeo associado à ficolina compreendo os domínios CUB1-EGF-CUB2 incluindo um peptídeo de sinal dos aminoácidos 1 - 19. A sequência corresponde ao exon 2 a exon 6. MRWLM.nALCFSLSKASAHTVFlMNMFGÔIQSPGYPMYPSDSEVTTOlITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 00 ETEDÇVIATFCGRETTDTEQTPGOEWLSPGSFMSITFRSDFSHEERETGFDABYKAVDVDECKEREDEELSCDHYCHUY 160 IGGYYC5CRFGYILHTDllRTCRVECSDHLFrQRTGVIT5PDFPtlPYPKSSECI.YTIELEEGFMVlILQFEDIFDIEDHPEV 240 PCPYDYIKlKVGPKVMPFCGEKAPEPISTQMWLILFHSDtlSGEMRGWRLSYRAA SEQ ID NO:4: Dezessete aminoácidos de terminação única da FAP KNEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO:5: Sequência de proteínas de MASP-1 humana. MRWLilYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYL CEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDEC KEREDEELSCDHYCHNYlGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLfTQRTGVrrSPDFPNPYPKSSECLYTl ELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRG WRLSYRAAGNECPELQPPVHGKtEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIP TCKIVDCRAPGELEHGL1TFSTRNNLTTYKSE1KYSCQEPYYKMLNNNTGIYTCSAQGVWMNKVLGRSLPTC LPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPWIAMLSHLNGQPFCGGSLLGSSWIVTAAHCLHQSLDPEDPTLR DSDLLSPSDFKΠLGKHWRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGP QQEGAMVIVSGWGKQFLQRFPETLMEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGG PMVTLNRERGQWYLVGTVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRN SEQ ID NO:6 Sequência de cDNA de MASP-1 humana. GAAGTCAfiCCACACAGGATAAAGGACGGAAGGGAAGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGAAGACAGATTTTGT TGTCAEGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAerCAAAGGAGAGAGAGAC-GAGAGAGGAAAAGCCAGAGGGAGA GAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAG AGACACACAGGGACCTCAGAACAAAGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCAÇAGGCAA GTCAAGCTGGGAGGACCAAGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTC TATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAAAGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCC AGATCCAfiTCGCCTaSTTATIÍCAGACTCCTATCCCAGTGA.TTCAÜAGGrGACTTGGAATATCACTGTCCC AGATSXfrTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGChCTTCAACTTGGAATCCTCCTACCTTTGTGAATATGAC TATGTGAAGGTftGAAAUTGAGGACUAGGTGCTGGUAACCTTUTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGC AGACTCeCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC CAATGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGG GAGGACGAGGAGCTCTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCeTGCCGCT TCGGCTACATCCTCCACACAGACAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAG GACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAAACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGG TGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGAA AGCCCCAGAÀCCCATCÀGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACAACTCGGGAGAG AACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATG GGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTA CAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGT AACAAGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGAACACGGGCTGATCACCT TCTCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAGTCTGAGATCAAATACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACAA GATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGG AGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCT TCAATGGACGCCCAGCCCAGAAAGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCC CTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGATCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTC GATCCGGAAGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGACTTCAAAATCATCCTGGGCA ÀGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAAACACACCACTCTCCACCCCCA GTATGA^CCCAACACATTCG AGAATGACGT GGCTCTGGTGGaGCTC-TTGGaG AGCCCAGTGCT GAATGCC TTCGTGATGCCCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGAAGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGG GGAAGCAJGTTCTTGCAAAGGTTCCCAGAGACCCTGATGGAGATTGAAATCCCGATTGTTGACCACAGCAC CTCCCAfi.AACCCTTA'l'CCCCCC-Cl'GAACAAQAAACTGACCAGGGACATGATCT<3TGCTGGG<iAGAAGGAA GGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATAGAGAAAGAGGCCAGT GGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGAAGGACCGCTACGGAGTATACTCTTA CATCCAOCACAACAAGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGAACTGAATTTGGCTCCTCAGCCCC AGCACCACCAGCTGTGGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCrTTCC TTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATCCATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTC ACTCTC™TAAAGAGATGGAC-CAAGAGAC-TfiGTCAGAACACAGGCCC-AATCCAGGCTCTATCACTTACTA ÚTTTÜCAGTÚCTGGGCACGTGAÍ-JTÜATCTC-JTÜÜAACTT^GTTTC-.-JÜATAAGA-JGGAAATGC-JATAC CTTACCTAÇÇTCC-TAAAAGTCTGATGAGGAAAJ4GATTAACTARTAGATSCATAC-CACTTAACAGAGTGCA TAGCATACMTGTTTTC^TWiATGCyiCCTTAGCAGWiSOTCGATSWTCTACCMSCJiGftαSAMCTCT CTTACAAACCCGTG OCTGGGTC TTAGCATT GATC7AGTG A^ACr.CCTG TCCCGTCAAÇGTTG AC CATCTCC Al'CTGCBOTAAAlOCTCTATiSCTTrTTTiSCCACCGTGCAACTTGCCCAACATCAATCTTCAODCTCAl'C CCTAAAAJUWTAAAACAGACAAÍÍGTTCTG^ GTCCTGTGG TATGTCCCCTAGCAAATGT^ACTAGGAACST GCftCTAaATGftCASATTCCG(SGiMGGCCTÍ*AGAGAAGaàGeGACAC-C-AGÜGA(jCerGGGGArrCKGTTT GGGAAHKAGACACC?GGTTCTAGhACTAGCTCTGCCCTTAGCCCOCTGTATGACCCTATGCAAGTCCTC L’TGCCTCATL’TGAAAGGGTCCTCAAAGCTCTCAL’GATCTAAGATACAATGAAGCCATTTTGCCCCTGATA AGATGAGGTAAAGCCAA’i'GTAACCAAAAGSCAAAAAT'iACAA'iCCSrTCAAAGGAACTTTCATGGAGACA AAATGC3GCTGCTG<∑?GCTCCT GAAAT ACC CACtCCTTT WACTACC- GGTGGGTT CCCAAGGA CATGGG A CAGGCAAAOTGIGàetXyiAAiSGAKtTÍMTArrCCTAMCAGASCATCTGCTeKGGCCCTeaCtTCC TTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGCGGGCCCT GGTAGTTT G∑ACCCCAGGCCCCCACACTCTT CCTTGCTATGTCCACAGCTGACCCCAAGCAGCC&TTCCCCGAÚTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAAIC TCCCTC JLTCTTGCAAGGCCATAASTGTTTTCCAAGCAAAATGCCTCTCCCATÇCTÇTCTCAÍKAAGCTTC TAG AG ACTTTATGC CCTL’CAC-AGCTL’C AAL-ATATAAGCC CTCCAAGG GATC AÜAAGCTCC A AG TTCCTGT CTTCTOTrTTATAGAAATTGATCTTCCCT&GGGGACTTTAACTCTTGACCTGTAreCAGCTGfrTθGAGTA ATTCCACKTCTCTTGAAAAAAAAGAGGAAC-ATAATúâAlfiAATGAGAACATATATATATATATATTAAGCC CCAGGCTG AATACT CAGGGACM3CAATTCACAGCCTGCC TCTGGTTCTATAMCA AGTCBTTCTACCTCT TTGTGCCCTGCTGT rCATTCTGCAAGGGGAAGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATGAGACACCCGCCP.AG CTAGOUSiAMCTCCATTTTCWkTGHyUlASAAGJiACTOTAATGCTGTTl'TGGAAKATGCCAAflGCATCC CAAGACACCATATC^CCCATTTCAAGCACTGCCTGGGCACACCCCAACATCCCAGÊCTGTGC-TGGCTCC TGTGCKAACTACC'LA<;ATGAAGÍAGAÜTATCA--'TTATACCT1'CT.AGÜAGCTCCTA.T,--'3GÜAÜACA:'3.-.-..-.C ATATGTAATTGACTACCATGTAATAGAACAAACCÇTGCCAAGTGCTC-CTTTGGAAAGTCATGC-AGGTAAA AGAAAGACCATTC SEQ ID NO:7 Sequência de proteínas de MASP-3 humana MRWLU-YYALCFSL3KASAJHTVELIIMMFGQL-Q3PtiYF DS Y FSDSEVTWHITVPDGFRIKLYFMH FHLESSYLCEYDYVKVETEDQ VLAT FCxSRETTDTEQTPGQEWLS PGSFMSITFRSDFSH EERFTG FDAH IYMAV DVDECKERÊ DEELSCDU YCUNYIGGY YC&CRF GY ZLHTOTRTCRVEC5DNLFTQRTGVITSFDFFtlP YFKS SECLYT LELEEGEWVBI^QFEE IFDIEDHFEVFOFYDY IK IKVÊPKV LGPFCGEKAPEP rSTQSHSVtrIiFHgUHSGKHHGWRLSir RAAGMECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVT.VSCDTGYKVI.KDWU' EM DT FQIECLKDGTWSWK IPTCKIVDCRA PGELEHGLITFS TPNWLTTY KSEIK YSCQEPYYKMZ.WNWTGI YTCSAQGVWMNKVL GRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRITAEFGLFPXQALT’.^’EETSRVPMDK'AFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRHDTT'^TP VSKEJIVTZYLGLJi DVRDKSGAVlíS&^RVVL HP3FNTQNYHHC lAEVQLQEPVPBÇPBWMFVlCIkFÍR LEPE GRAPHMLGLVAGWGI SNPHVTVDE11SSGTRTLS RVLQYVKLPWP HAECKTS Y ESRSGHYSWEHMFCASYY EGGK DTCLGBSGGAFVIFDDLSQRWV QGLVfiWQGFEECGS KQVTrGVYTKVStlYVIlWVIffiEQMGL PQSWEFQTE R SEQ ID NO:8 Sequência de cDNA de MASP-3 humana GAAGTCAQCCACACA<3GATAAA<3GK3GGAA<3<3GAAGGAG CAGATCTT TTCGGTAG GAAGAC AGATTTTGT T:JTL AJGGCTCCTGG SAJTÜC A?.S?.X’?A>-T CAAAGGAG A '-AU.-.Ü AGGA<3 rG.=.üG A AAAGCC AG AGGG r.ii? GAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGQAGGCAGGθG AAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAG AG AC ACAC AGGGAC CTAGAAC AAAG AT AAQGCATCACG GACACC ACACCGGGC AC CπAGCTCAC A5GCPJ. GTCAJUSCTGGGASSaCOUlGGCCβGGαbSCCGGGAGCACCCJUlGGCAiGSaJUUkTGAGGTGGCTGCTTCTC TATT ATHCTCTGTC; CTTCTCCC TGTCAAAG GCTTC AGCC CACACCGT GG AGCTAAAC AA.T ATGTTTGGCC AGATCCAOTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTSATTCAIGAGGTGACTTGGAATATCACTGTCCC AGATGGGT-TTCGGATCSAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCT-TTGTSAATJ^TGAC TATGTGiAeGTAGAAACTGftGC-ACCAÜGTtSCTGGCAA)C5CTTCTGTQGCAGGtiA)GACCACAGAC-ACAQAGC AGJhCTCCCGGCCAG GAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTC ATGTCC ATC ACTTTCCGGTC AG ATTTCTC CAATGAQGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCcuACTACAT GGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGG ItCCCTftCaiCflC CACAC AGA CAACAGGAOCTGCCOAG TGGAGTGCAGTC AC AAÍXTCTTCACTCAAAJJ GACTGGOGTGATCACCAGCCCT-SACTTCC; c; AAACCCTTA<7<7CCAAJGA<3CTCTG AATSCCTGTATA.CCATC GAGCTtSaAlGGAGGGTTTGn.TGGTCAACCTGCA.GTTTGftOGA.CATATTT«JiCATTGAlGGACCATC>C<rGAGG TGCCCT<3<7<7<7CTAT <3A<7TAC AT CAA.G ATCAAAGTTGGTC CAAAAGTT TTGGGGCCTTTCTGTG GA.GA.GAA AGCCCCÜGAACCCJkTCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAiGrGACAACTCGGGAGAG **CCGGGGCTGGAGβCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTθTCCATG GGAAAATCGAGCCCTtCCAAC<CA^GTATTTCTTCAAAfiACCAAGTSCTCGTCAGCTGTGftCACAGGCTA C*AAUrt3CTGAAÍS3AT*ATGTGGAGATGGACACRTTCCAGATTGAGTX5TCTGAA<SGATGGGACGTGGhGT AAC A AG ATTL'CCAC C7GT AAAATTGT AG AC ZGT AG AGCC CL'AGGAG AGL'TGGAA.CAL'GGGCTGAZL'ACCT rC'rCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAiGTCrCAGATCAAATACTCCTCTCAiGGACCCCTATTACAA GATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAASrATTGGGG AGAAÜCCZACCCACC^GCCTTCCAGAGTGTGGTCAGCCCTCCCGCTCCCTGCCAJWSCCTGGTCAAGAGGA TCATTGGGGGCCGAAATGCTGAGC CTGGCC TC TTCCCGT GGCAGGCC C TGATAGT<3GTGGAGGACACTTC GAGAGT<jL'L'AAATGAC'AAGTGGZ7TGGGAGZGGGGCCCTGL'TCTCTGL'GTCCTGGAZCCTCACAGL'AGCT CA.TGTGCTGCGCTC OCAGCGTAGAGACACCACGGTGATACCAGTCTC CAAGGAGCATGTCACCGTCTACC TGGGCT'TGL'ATGATGT’GCGAGAL'AAATCGGisGGCAGTCAAL'AGCTCAGL'TGCCCGAGTGGT'ALTL'L'ACCC AGACTTCAACATCCAAJUiCTACAACCACGATATftGCTCTGGTGCAGCTGCAGGAGCCTGTGCCCCTGGGA CCCC ACGTTATGCC TCJTLTGCC 7UCC AAGG CTTGAGCCT LAAGGCCC GGCCCCCCALATGLTGGÜCCTGG TGGCCGGCTGGGG^ATCTCCAATCCCAATGTGACAGTÍSjATGAGATCATChGCAGTGGCACACGGACCTT GTCA.GATGTCCTGCAGTATGTCAAGTTA.CCCGTGGTGCCZCACGCTGAGTGCAAAACTAGLCATGAGTCC CGCTCGSSCSATTAiCAiGCGTCAiCSGfcGAACMGTl'CTGTGCTGGCTAiCTACGASGGCGGCflJUliSAαiCGT GCCTTGGAGATAGCGGTGGGGCCTTTGTCATCTTTGATGACTTGAGCCAGCGCT&SGTGGTGCAAGGCCT GÚTCTCC—GfJÚÜCL GACCTGAAGAATGC GG CAÜCA AGCAGGTCTATG GAÚTCT ACAC AAAGGICTCCA AT TACGTGGACTGGGT GCGGGAGCAGATGGGC TTACCACAAAGTGTTGT G<3AGCCCCA<3GTGGAAC<3GTGAG CTG ACTCACTTCCT CGGGGCCT GCCTCCCt TGAGCGAAÊ LTAC ACCGCACTTCCGACAGC ACALTCCAC.A TTACTTÍLTCAGACCÍLTATGGAATGGAACACACTGACCTAGCGGTGGCTTCTCCTACCGAGAC^LGCCCCCA GGACCC7GAGAGGCAGAGTGTGG7ATAGGGAAAAGGCTCCAGGCAGGAGACCTGTGTTCCTGAGC7TGTC CAAGTCTCTTTCCCCGTCTGGGCCTCACTCTACCGAGTAATACMTGaAGGAGCTCAACCAAGGCCTCTG TGCC AACCCCAGC ACTCCTTTC LAGGCC ATGC TTCTTACCCCAGTGGCCTTTATTCACTCCTGACCACTT ATCAAAiOOCATCÍSjTCCTACTGTTGGTATAACTGAGCTTGGACCTGiACTATTAGWUUiTGGTrTCTRAaA TTGA.ACTGAATGCCGCATCTGTATATTTTCCTGCTCTGCCTTCTGGGAL'TAGCCTTGGCCTAATCCTTCC TÜTAGGACAACAGCACTÜAGCTZCTÜGCAGATCÚGTCATACCCAACCÍÍCTCTCTCl-rACTGrQATCKCT TGG AGC ACCTTCAT GCCTGGGGTTTCTCTC OCAAAAGCT TCTTGCAGTCTAAGCC TTATCCCT TATGTTC CLCATTAAAGGAATTCCAAAAGAÍATGCAGAAAGTTGGGAAGGTTTC-TGLTGACTGCTGGGAGC-ASAATA GCCGTGGGAGGCCCACCAAGCC CTTAAATT 7CC ATTGTC AACTCAG AACACATTT GGGCCC AT AZGCC AC L'L'TGGAACAL'C AGC CGAC ACC AZGGGCGTC L'ACAL'CTGC ZGCTCCAGAL'AAGC ACAAAGCP.ATCTTTTC AG CCTTGAAATGTATTÍLTCTGAAAGGCTACCTGAAGCCCAG GCCCGAATATGGGGAC 77AGTCGATTACCTG GCACÀTTAGAAGTCACCCMATCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAIGAATC CACCCCGCAGGATG 77CAGAGG GAC<7CACT<7<7 TTCATTT 77CAGAGT CAAAGGAATCAGAGGC TCACCCA TGGCAiSSCAGTGAAAAGAGCCAiGSAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCOGAACTGGCTβTATJUIC CTTTGAAAAATCAT 77TCTTTG TCTG AGK7 7TTGGTTCT <7<7GTCAG<7AACAGGCT GGC AT A AG G7TCCCT CCAGGTTCCTTCrAOCTCGAGCACrrCACAGCTTCCCTGACTGCTAQCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGC T:3ATTG~CTCCTT~CCCTGGA<3CTCTCTCTCCT GAAAATCTCCATCAGAGCAAGGCAGCCAGAGAAGC CLCTGAGAGGGAATGATTGGSAAGTGTCCACTTTGTCAACCGIJCTCA:L-.---..-.CACAGTI:CTTTGTCTATG AATGGCA<7ATGTAAATGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATAT<3<7TTCA<7CATTCTGTAAA<3GGCC TCTGCATTGTTGCTOCCATCAGGGGTCTCAAGTGGAAATAAACCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAAA AAAAAAA SEQ ID NO:9 Sequência de proteínas de MASP-2 humana H R LLTLLG LLCGSVATPLGP K W PE PV FG RLAS PG FPG EYAN DQE RRWTLTAP PGYRLRLY FTH FDLE LSH LG E Y DFV KLSSGAKVLATLCGQ ESTDTERAPG KDTFYS LGSS LDITFRSDYS N EK P FIG F EAFYAAED IDECQVAP G EAPTC D H HCH MH LG GFYCSCRAG WLH RN KRTCSALC5GQVFTQ RSG EL$SP EYPRPYPKLSSCTY SI SLE E GFSVILDFV ES FDV ETHP ETLC PY DFLKIQT D RE E HGP FCG KT LPtl R1L T KS NTVTIT FVT DE SG D HTG W KI H YTSTAQPCPY PMA PP NG HVS PVQA KYI LK D S FS LFCETGY ELLQGH LP LK S FTAVCQK DGSW D RP M PACSI V DCG PP DDLP s GRVE Y [TGPGVTTYKAV:QYSCÉ El IYT M KVN DGKYVCEA □ GFWT SSKGEKS LPVCE P VC GLSARπGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGCTTAAGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRL SPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNNIKWINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQ RGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLLSGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWF VGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYLPWIENLISDF SEQ ID NO:10 Sequência de cDNA de MASP-2 GGCCAGCTGC-ACGGG:ACACCATGAGGCTG:?GACCCTCC I'GQGC CT TC TKG TK-I: KKTKKACK KTT QGGCCCGAAGT GGCC TGAACKGTCT TKMKKTKCAT CCCKGGC TIT KAKKAGT ATK CAAT li.-.ilCAi-G AGIK- lit IGL I Tffi ACKTM(ITMIMICt II It ’"GIICITAIKIGCCTGIIG IK I T( IT ACT 7( IAKII Ail T TCG AKTGGAGCTCTKC AKTCTGCG ACT ACGACTTCG7CAAGCTGAGCKGGGGGCCAAGG TGCTffi CCAMCTGTKCGGCAÍKAGAGCACAGACACGGAGCCCGCCCCTMCAAGGACACTTKTAC1CCCTGGG C TCCAGCCTC-GACAT TACC TTCCGC'l'CCGAC'.’AC TCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCC-AGGCCTTC TATC-CAGÜGGAGGACA^TGACGAGTGCCrtGGTÜGCCCÜGGGAGAGGCGÜGÜACCTGiGACCACÜ.-.CJGCC JüCAACCACCTGÜGÍGGTTTCrACTÜCTCCTGOCGCC-CAGGCTACC-TCCTGCACCGTAACAAC-CGCACCZÜ CTCAGCCCTGTGCTCCOGCCAGGTCTimcCCAGAGGTCTGGGGAGCTGJiGCnGCCCTiGÀATACCCACOG CCGTATCCCAAACTCTCCMTTGCACTTACACJC^TCAGCCTGGAMAS&GGTTGAGTGTCATTCTGGACT T TGT GC-AC-TCCT TGC-A2GT GC-AGACAC AlC G. G AAACCCTGTGTC CC TACGAC TTT GlGAAC-AT TGAAAC JilGACAGA&AAGAAGATQGCCCATTCTGTGGGAAJGACATTGCGOCACAG&ATTGAAAGAAAAAlGCAACJiCG GTGAOCATCACC ITT GGGAG.-.GA J'C-AA TCAGGAGACCACACAQGC TC-GAAGATCC’AG Z'ACACG.-.GGAGAG CGCAGCCTTGCGCTTAZeÇGATGGCGCÇACGTAATGGCCACSTTTCACCTGTGÇAAGCGAAATACATCCT GAAAGACASCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTISjCTATGAGCTTCrGCAAGGTCACTTGCCCCTGAAATCC TTTACGGCAG 7T TGT GACAA AGA TCGATCTTGCC ACCÜGGCAATG CCCGCC2GO.G GATTGTTCAG7G 7C GCGC TCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTÕGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAAAQC TGTGAT TCAGT.'-.CAGGTGT G AAGACiACCTT GTJ’LC ACA.'. TGJ’JU’LGT GAATG ,7GGT.’ LAGLT.', TG 7(i TGTGAG G( 7TGA7Í ÍGAT 7t: TGGM Zi.-.'ii: T( :CAAAGGAGAAAAA7t A.GTGi VAGTCTGTGAGGi: TGTT TG 7GÍ 5A( ?TAT CAGCCCGCACAACAG 3AGG3CGTATATATGGAGGGCAAAAGGCAAAACCTGGTGATT7TCCTTGGCAAGT CCTGATATTACCTGGAACCACACCAGCACGTQCACTTTTA2A7GAGAACTCGGTCCTAACAGCTGGGCAT GCGC-TC T ATGAGCAAAAACA'∑GA TGCA GGC GCCC TC-GACAGTCGAATGÕGCAICCCT GAAAAGAÜ TA7CAC t:TCATTATACAt:AAG::(7TGGTCTGAAt;CTGT7TTTATACA7:;AAGGTTATACTCAT:;ATGCTt5GCT7TGA CAAT GAG AT.-.GG.-.;.'7 GATT.-----.T TGAA TAACAAAGI TC TAATCAAT AGC AACA TCAGGCC TA7T TG7G 7G CGAAGMAAGAAGCT3AATCI? TT TATG AGG ACAGATGACATTGGA '< TGCATC TGG A7GGG&AT TfUCQC AAAGGtSGTTTTCTTGCÜAC-AAATCTAATGTATCTCC-ACATACCGATTGTTGACCArCAAAAATGTACTGC TQCATMGAAAAGCCAOCCTATCCAAGGGGAAGTGTAACTGCTAACATGCTTTGTGCKGCTTAGAAAGT GGGGGCAAGGACAGGTGCAG AGG TGACAGGGGAGGGGCAGTGGTG TT TC TAiGA TAG TGAAACAGAGAGGT GGTT TG TGGGAGGAJ'LTJAGT GTi?C TGGGG.T” ÇÇATÇAAT TG7GGAG AJAGCAGGTCAG TATGGAGTÇTAÇAÇ AAAASTTATTAACTATATTCCCTGGATÇGASÍACATAATTAGTGATTTTTAACTTG^GTGTCTGCAGTCA AO3ATTCTTCATTTTTMAAATGCC7GTGA1GACCT7GCCAGO3ACGTGCC7CGAG1AGCAT7CATCATT ACTGTQG ACATGSC ACTTG TTGC TCCACCCAAAAAAACAG AICTCCAGGTGAGGCTG GTGTCATT TCTCCA 7 7TGCCAGTTTAATT GCAGCC TTACÜC ATT GACTCAAGGGGACAT'AAACCACGAGAGTGACAGTCATC TT TGCCCACCCAGTGTAA7GTCACTGC7ÇAAAT7AÇATTTCA7TACCTTAAAAAGÇCA3TCTGTTTT7ATAC TGGt: TGTTGGt TA TTT GTCiTA AAt: TGCX: 737 GCATGt: 7t: TT7G7TT TT AAAt :7TGTT G7TATTGAAAA AAA AAAAAAAAAA SEQ ID NO:11 Sequência de proteínas de sMAP humana (Map19) HR LLTLLG LLCGS VATPLGP KWPEPVFGRLAS PG FPG EYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHL CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDEC QVAPGE A PTCDH HC H N H LGG FYCSCR AGYVLHR N KRTCSE QS L SEQ ID NO:12 Sequência de cDNA de sMAP humana (Map19). GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCC7GGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACOC CCTTGQGCCCGAAGTGQCCTGAACCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCACCGGÃCTATOC CAATG ACC AC-GAGCGGCGCTGGACCCTGACTÕCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCAC T TCGACCTGC-AGCTC TCCCACCTCTGCGAGTACGAC TTCG . ÜAAGCTGAGCTCGGGGQCCAAGG TGCTQG : :UAC: Gt: TG TGGGGGC : AGGAGAÍ ;t :AC: AGACACGC JAGCGGGCC :::I ?TG GC :AAGGA::A::C TTCT AC :?(:: CTCCfcGCC TGG ACATTACC TTCCGCTCCGA CTAC T0CJLACG AGAA GCCG TTCACGG GGTTCGAGGCCT TC TATGCAGCCGAGGRCATTC-ACGAGTCCCAGGTGCCCCCGCGMSAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTCαC ACAACCACCTGGGCGGLTT CL-AC TGCTCCT GCCGCGC AGGCTACG Teel-Ge ACCGL’ AACAAGCGCACÜ :G :: TCASAC ;t: AGAGCCT CTAG r t: TÍ :ctx:TGGAGt: Tt:c Gt;t ÍCTGCC X:AGC :AGGTC AGAAGÍ :cACiAjt;t :: ?AG::Í :T GCTG GCCTCAGC T::L GGGT TGGÜCTGAGAT GGCTGTGLCLÍCAACT CCCATTCACCCACCATGGACGCAAT AATMACCTGGCCCCACCCCJUUÜUÜUiAAiUIAAJlAAAA

[0324] Iniciadores de DNA: SEQ ID NO:13: SEQ ID NO:14: SEQ ID NO:16: SEQ ID NO:17: SEQ ID NO:18: SEQ ID NO:19:

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo associado à ficolina (FAP) recombinante e um veículo farmaceuticamente aceitável, sendo que o polipeptídeo FAP compreende a sequência de aminoácidos 20 - 380 de SEQ NO: 1 e tem em sua extremidade C-terminal a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, sendo que o polipeptídeo FAP compreende ainda uma sequência de sinal não nativa, sendo que o dito polipeptídeo apresenta atividade FAP, e sendo que o dito polipeptídeo não tem atividade de serina protease.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo fato de que o dito polipeptídeo é capaz de associar-se com qualquer uma dentre lectina de ligação à manose (MBL), ficolina-1, ficolina-2, ficolina-3, C1q, proteínas tensoativas do pulmão SP-A e/ou SP-D e CL-L1.

3. Uso de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autoimune.