JP6634566B2 - コントロールスライド及びコントロール実験の方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫染色実験のためのコントロールスライド及びコントロール実験の方法に関する。

組織の免疫染色技術は確定診断に不可欠な技術である。免疫染色による診断には間違いが許されないため、染色時に陽性と陰性の対照実験（コントロール実験）を行う必要がある。
欧米先進国では上述した染色時にコントロール実験を行うことが一般化しており、コントロール実験の結果が無いものは信用されない。

免疫染色実験におけるコントロール実験は、被験物質が含まれている、又は含まれていないことが予めわかっている組織切片や培養細胞を貼付としたコントロールスライドによって行うことが理想的である。コントロールスライドは、免疫染色実験に際して実験者自らが作製したり、市販のものを購入したりすることで入手することができる。しかしながら、後述する問題点により、一般的に染色のバッチ単位に1つコントロールスライドを入れて染色している。

例えば、特許文献１では、前立腺がんの悪性度判定用キットのコントロール実験に、前立腺がん由来培養細胞ＰＣ３のパラフィン切片標本であるコントロールスライドを用いている。

特開２０１３−６３９７８号公報

従来、免疫染色実験の対象とする被験物質が発現していることが予めわかっている組織や培養細胞が無い場合には、新たに細胞株を樹立するなどしない限りはコントロールスライドを用意することができなかった。
また、従来のコントロールスライドは組織や培養細胞を用いているため、ロットによる再現性を維持することが非常に困難であるという問題がある。
また、市販のコントロールスライドは組織切片か培養細胞を用いているため高価であるという問題がある。一方、コントロールスライドを自作しようとすると、コントロールとなる組織を入手する手間や、培養細胞を培養する手間などがかかり、実験者にとって大きな負担となる。

このような状況に鑑みて、新規のコントロールスライドを提供することを本発明の解決しようとする課題とする。

上記課題を解決する本発明は、標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する免疫染色実験のためのコントロールスライドであって、
前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質が結合している担持部と、前記被験試料を固定する試料固定部を有する基板を備えることを特徴とする、コントロールスライドである。
結合性物質が担持部に結合している形態の本発明のコントロールスライドによれば、免疫染色実験と同時にそのポジティブコントロール実験を簡便に行うことができる。
また非結合性物質が担持部に結合している形態の本発明のコントロールスライドによれば、免疫染色実験と同時にそのネガティブコントロール実験を簡便に行うことができる。

本発明のコントロールスライドによれば、被験物質を含むことが予めわかっている組織や培養細胞を用意する必要が無い。そのため、そのような組織や培養細胞などの入手が困難な場合であっても、本発明のコントロールスライドによればコントロール実験を行うことができる。

また、本発明のコントロールスライドは、結合性物質及び／又は非結合性物質が結合している担持部を染色することでコントロール実験の結果を得ることができるため、組織や培養細胞を用いていた従来のコントロールスライドに比して、ロットによる差を低減することができる。すなわち、本発明のコントロールスライドによれば、再現性に優れたコントロール実験を行うことができる。

本発明の好ましい形態では、前記結合性物質及び／又は前記非結合性物質がタンパク質又は核酸である。
このような形態の本発明によれば、容易にコントロール実験を行うことができる。

本発明のコントロールスライドは、被験試料が組織切片である免疫染色実験のコントロール実験に適用することが好ましい。
従来、組織切片の免疫染色実験では、陽性又は陰性であることが確認されている組織切片や培養細胞をコントロールとして使用することが一般的であった。本発明のコントロールスライドによれば、高価でロットによる性質のバラツキがある組織切片や培養細胞を用いずとも、簡便に組織切片の免疫染色実験のコントロール実験を行うことができる。

本発明の好ましい形態では、前記担持部が粗面ガラスによって構成されている。
粗面ガラスは単位エリア当たりの表面積が大きい。そのため、このような形態の本発明は、担持部により多くの結合性物質及び／又は非結合性物質を結合することができ、感度に優れたコントロールスライドを提供することができる。

本発明の好ましい形態では、前記粗面ガラスがブラスト処理ガラス又はエッチング処理ガラスである。
これによると、簡単に安価な粗面ガラスの担持部を有するコントロールスライドを提供することができる。

本発明の好ましい形態では、前記結合性物質が、前記被験物質である。
一般的に免疫染色実験では被験物質と一次抗体との反応と、一次抗体と標識された二次抗体との反応の２段階の抗原抗体反応を行う。このような形態の本発明のコントロールスライドによれば、免疫染色実験で行われる前述の抗原抗体反応が全て正常に動作していることを裏付けることができる。

本発明の好ましい形態では、前記免疫染色実験が間接法によるものであって、前記結合性物質が、前記免疫染色実験において用いられる一次抗体と同一の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体である。
このような形態の本発明のコントロールスライドは、担持部に結合しているアイソタイプコントロール抗体と同一の動物種由来の一次抗体を用いる全ての免疫染色実験に用いることができるため、汎用性がある。

また、本発明は、標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する免疫染色実験のためのコントロール実験の方法であって、
基板の担持部に結合している、前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質に、
前記免疫染色実験で用いる抗体溶液を、前記免疫染色実験と同一条件で接触させることを特徴とする、方法にもある。
本発明の方法によれば、簡便に免疫染色実験のコントロール実験を行うことができる。

また、本発明は、標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する免疫染色実験のためのコントロールスライドであって、基板の一部にブラスト処理又はエッチング処理を施して担持部を設け、その担持部に前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質を結合させることを特徴とする、コントロールスライドの製造方法にもある。
本発明の製造方法によれば、容易に本発明のコントロールスライドを製造することができる。

本発明のコントロールスライドは汎用性に優れる。また、本発明によれば再現性の高いコントロール実験の結果を得ることができる。
また、本発明の一形態では、従来のコントロールスライドよりも安価なコントロールスライドを提供することができる。

本発明のコントロールスライドの実施例を表す図である。（Ａ）本発明のコントロールスライドに組織切片を固定する様子を表す図である。（Ｂ）試料固定部に組織切片を固定した状態の本発明のコントロールスライドを表す図である。（Ｃ）染色操作後のコントロールスライドにカバーガラスを載せ、組織切片を封入する様子を表す図である。（Ｄ）組織切片を封入し顕微鏡観察が可能な状態のコントロールスライドを表す図である。 マウスＩｇＧ及びヤギＩｇＧを結合したスライドガラスにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを反応させ発色させた結果を示す図である。

本明細書においては被験試料についての免疫染色実験を本実験とも言う。

本発明のコントロールスライドは、組織切片や培養細胞などを被験試料とする通常の免疫染色実験の何れにも用いることができる。

従来、組織切片を用いた免疫染色実験では、高価なコントロールスライドをコントロール実験に用いる必要があった。そのため、組織切片を用いた免疫染色実験におけるコントロール実験に本発明のコントロールスライドを使用することが特に好ましい。

本発明のコントロールスライドはタンパク質や核酸などを被験物質とする通常の免疫染色実験であれば特に制限なく適用することができる。

また、標識抗体の標識の種類も限定されず、放射性同位元素、金コロイド、蛍光色素、酵素、ビオチンなど通常免疫染色において用いられる標識を適用することができる。

免疫染色実験が、抗原に直接反応する一次抗体を標識し、抗原抗体反応を１度しか行わない直接法と、標識していない一次抗体を用いて１度目の抗原抗体反応を行い、一次抗体自体を抗原とする別の抗体（二次抗体）をさらに反応させ２回以上の抗原抗体反応を行う間接法の何れであっても、本発明を適用することができる。

本発明のコントロールスライドにおける担持部に結合させる物質は、標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質であっても、前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質であってもよい。

結合性物質が担持部に結合している形態の本発明のコントロールスライドによれば、免疫染色実験のポジティブコントロール実験を簡便に行うことができる（表１）。

直接法の免疫染色実験を行う場合に、結合性物質を被験物質とすることで、標識抗体と被験物質との抗原抗体反応のポジティブコントロール実験を行うことができる。（表１（Ａ））。

また、間接法の免疫染色実験を行う場合に、結合性物質を被験物質とすることで、免疫染色実験で行われる全ての抗原抗体反応のポジティブコントロール実験を行うことができる（表１（Ｂ））。

なお、被験物質がタンパク質である場合、該タンパク質における一次抗体の認識部位にあたるペプチドを結合性物質として担持部に結合しても良い。

また、間接法の免疫染色実験を行う場合に、結合性物質を標識抗体以外の本実験で用いる抗体とすることで、免疫染色実験における当該抗体を抗原とする抗原抗体反応、さらにはそれに続く抗原抗体反応のポジティブコントロール実験を行うことができる（表１（Ｃ））。
なお、標識していない一次抗体と標識抗体の２種類の抗体を用いる通常の間接法の免疫染色実験においては、結合性物質を一次抗体とすることで、一次抗体と標識抗体との抗原抗体反応のポジティブコントロール実験を行うことができる。

また、間接法の免疫染色実験を行う場合に、該免疫染色実験で用いる抗体と同一の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体を結合性物質としても良い。免疫染色実験における抗体を抗原とする抗原抗体反応、さらにはそれに続く抗原抗体反応のポジティブコントロール実験を行うことができる（表１（Ｄ））。
このような形態とすることによって上記表１（Ｃ）の形態と同一の効果が得られる他、当該アイソタイプコントロール抗体と同一の動物種由来の抗体を用いる全ての免疫染色実験に適用することができ、汎用性に優れる。

一方、非結合性物質が担持部に結合している形態の本発明のコントロールスライドによれば、免疫染色実験のネガティブコントロール実験を簡便に行うことができる（表２）。

直接法の免疫染色実験を行う場合に、非結合性物質を本実験で用いる抗体と抗原抗体反応を起こさない物質とすることで、免疫染色実験の結果が当該物質を検出した偽陽性でないことを示すネガティブコントロール実験を行うことができる（表２（Ａ））。
この場合、非結合性物質は被験物質と同一種類の分子種とすることが好ましい。具体的には、被験物質がタンパク質である場合には、非結合性物質もタンパク質であることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施の形態では、被験物質がタンパク質である場合には、非結合性物質は該タンパク質のホモログであることが好ましい。このような実施の形態とすることによって、本実験で得られた結果が、被験物質であるタンパク質と相同性の高いホモログを認識した偽陽性ではないことを示すことができる。

また、間接法の免疫染色実験を行う場合に、非結合性物質を本実験で用いる抗体と抗原抗体反応を起こさない物質とすることで、免疫染色実験の結果が当該物質を検出した偽陽性でないことを示すネガティブコントロール実験を行うことができる（表２（Ｂ））。
この場合、非結合性物質は被験物質と同一種類の分子種とすることが好ましい。具体的には、被験物質がタンパク質である場合には、非結合性物質もタンパク質であることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施の形態では、被験物質がタンパク質である場合には、非結合性物質は該タンパク質のホモログであることが好ましい。このような実施の形態とすることによって、本実験で得られた結果が、被験物質であるタンパク質と相同性の高いホモログを認識した偽陽性ではないことを示すことができる。

また、間接法の免疫染色実験を行う場合に、非結合性物質を本実験で用いる抗体と別の動物種由来の抗体とすることで、免疫染色実験の免疫染色実験の結果が当該抗体を検出した偽陽性でないことを示すネガティブコントロール実験を行うことができる（表２（Ｃ））。このような形態の本発明は、免疫染色実験が異なる動物種由来の複数の一次抗体を用いる多重染色である場合に有効である。
また、この場合、非結合性物質である当該抗体はアイソタイプコントロール抗体とすることが好ましい（表２（Ｄ））。このような形態の本発明は汎用性に優れる。

本発明のコントロールスライドの担持部に結合する結合性物質及び非結合性物質としては、組織、培養細胞、又は大腸菌などから抽出した生体由来の物質でも良いし、化学合成した物質でも良い。
結合性物質及び非結合性物質がタンパク質である場合には、培養細胞や組織などから抽出した内在性のタンパク質、培養細胞中で発現ベクターを用いて強制発現させた後に抽出した外来性のタンパク質、大腸菌を用いたタンパク質発現系によるリコンビナントタンパク質、さらには化学合成されたタンパク質の何れを用いても良い。

本発明のコントロールスライドは、担持部を有する基板を備える。
担持部を含む基板の素材としては特に限定されないが、ガラスが好ましい。ガラスは透明性に優れるとともに薬品に対して安定しているため、標識抗体の呈色や蛍光を容易に観察することができる。

基板をガラス製とする場合には、滑面ガラスであっても粗面ガラスであっても構わないが、担持部は粗面ガラスとすることが好ましい。粗面ガラスは、ブラスト処理やエッチング処理で容易に施すことができる。
このように担持部を粗面ガラスとすることによって、結合できる結合性物質又は非結合性物質の量を増やすことができる。

粗面ガラスとする場合の平均の粗さ（Ｒａ）は、０．０１〜２０．０μｍであることが好ましく、０．０５〜１０．０μｍであることがより好ましく、０．１〜１μｍであることがさらに好ましく、０．２〜０．３μｍであることがさらに好ましく、０．２２６〜０．２５２μｍであることが最も好ましい。

また、粗面ガラスとする場合の突出の最大の深さ（Ｒｚ）は、０．１〜１５０．０μｍであることが好ましく、０．５〜１００．０μｍであることがより好ましく、１．０〜１０．０μｍであることがさらに好ましく、２．０〜３．０μｍであることがさらに好ましく、２．１９〜２．７０μｍであることが最も好ましい。

また、粗面ガラスとする場合の突出の間隔（Ｓｍ）は、１０〜２０００μｍであることが好ましく、３０〜１０００μｍであることがより好ましく、５０〜５００μｍであることがさらに好ましく、１００〜２００μｍであることがさらに好ましく、１６５〜１７９μｍであることが最も好ましい。

なお、平均の粗さ（Ｒａ）、最大の深さ（Ｒｚ）、突出の間隔（Ｓｍ）は、ＪＩＳ Ｂ０６０１で規定された定義を用いるものとする。

結合性物質又は非結合性物質を担持部に結合させる方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
ガラス製の基板の担持部にタンパク質や核酸などの生体物質である結合性物質又は非結合性物質を担持させる方法については、シランカップリング法、シリコンバイオ法など、当業者に公知の方法を適用することができる。

具体的には、以下の方法によりガラス製の基板の担持部にタンパク質である結合性物質又は非結合性物質を結合させることができる。
すなわち、担持部を０．５％酢酸に溶解した１％（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン溶液に１６時間浸漬した後、乾燥した圧搾空気を吹き付けて乾燥する。
また、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で結合性物質又は非結合性物質であるタンパク質を溶解した溶液を調製する。
そして、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン溶液により処理された担持部に、前記タンパク質溶液を滴下し、１６時間静置する。
１６時間に静置の後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で担持部を洗浄し、さらに担持部を１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＴＢＳに室温で１時間浸漬する。
その後、担持部を水で洗い流して乾燥した圧搾空気を吹き付けて乾燥することによって、結合性物質又は非結合性物質であるタンパク質を担持部に結合することができる。

担持部に結合性物質又は非結合性物質を結合した後に、マイクロウエーブ処理、温浴処理、そしてオートクレーブ処理などの賦活化処理を行うこともできる。

基板における担持部の数は１つであっても良いが、好ましくは２以上である。
担持部の数を２以上とする場合には、結合性物質と非結合性物質の両方を担持部に結合することが好ましい。このような形態とすることによって、一つのコントロールスライドによってポジティブコントロール実験とネガティブコントロール実験を同時に行うことができる。

また、担持部の数を２以上とする場合には、異なる量の結合性物質又は非結合性物質をそれぞれの担持部に結合させることが好ましい。
結合した結合性物質又は非結合性物質の量に比例した強度のシグナルが得られれば、該シグナルが担持部に結合した結合性物質又は非結合性物質に由来することを確認することができる。

また、本実験である免疫染色実験が多重染色である場合には、多重染色の対象である複数の被験物質、多重染色で用いる複数の一次抗体、多重染色で用いる一次抗体と同一の動物種由来の複数のアイソタイプコントロール抗体などを結合するために、担持部は複数設けることが好ましい。

本発明のコントロールスライドは被験試料を固定するための試料固定部を基板に有する。
本発明のコントロールスライドは、コントロール実験のための担持部と、本実験のための試料固定部を同一の基板に有するため、コントロール実験と本実験を同一条件のもと行うことができ、信頼性の高い実験結果を得ることができる。

本発明のコントロールスライドを用いた実験は、通常の免疫染色実験と同様の手法により行うことができる。すなわち、抗体溶液とのインキュベーションと洗浄操作を行うことにより染色を行うことができる。この時、コントロールスライド全体を抗体溶液及び緩衝液に含浸することで、抗原抗体反応及び洗浄操作を行うことができる。

このように、本発明のコントロールスライド１０によれば、インキュベーション時間、温度など本実験における抗原抗体反応と同様の条件でコントロール実験を行うことができるため、信頼性の高い実験結果を得ることができる。

また、本発明は、基板の担持部に結合した結合性物質及び／又は非結合性物質に、免疫染色実験で用いる抗体溶液を、免疫染色実験と同一条件で接触させることを特徴とする、標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する免疫染色実験のためのコントロール実験の方法にも関する。
本発明のコントロール実験の方法は、上述の本発明のコントロールスライドを用いることで実現することができる。

＜１＞本発明のコントロールスライドの実施例
図１を参照しながら、本発明のコントロールスライド１０の一実施形態を説明する。

コントロールスライド１０は、スライドガラス１１を基板とする。
また、コントロールスライド１０は担持部１２１と担持部１２２の２つの担持部を有している。担持部１２１には結合性物質、担持部１２２には非結合性物質を結合している。
そして、コントロールスライド１０は、被験試料を固定するための試料固定部１３を有している。

次に、被験試料としてパラフィン包埋組織切片を用いる場合の本発明のコントロールスライド１０の使用方法について説明する。
パラフィン包埋組織切片（組織切片１４、パラフィン１４１）は常法に従ってスライドガラス１１上の試料固定部１３に固定する（図１Ａ）。

なお、被験試料として培養細胞を用いる場合には、コントロールスライド１０をサイトスピンに設置し、遠心によって培養細胞を試料固定部１３に固定することができる。

パラフィン包埋組織切片を固定した後には常法に従い、脱パラフィン処理を行い、パラフィン１４１を除去する（図１Ｂ）。その後、通常の組織免疫染色と同様、抗原を賦活化させるために、コントロールスライド１０をマイクロウエーブ処理、温浴処理、そしてオートクレーブ処理などで加熱処理する。

その後は通常の免疫染色実験と同様の手順によって染色操作を行うことができる。
すなわち、コントロールスライド１０の抗体溶液への含浸と緩衝液による洗浄により染色を行うことができる。
また、撥水ペンを用いて試料固定部と担持部の周りに撥水サークルを形成し、そこへ抗体溶液及び緩衝液を滴下することによって、抗原抗体反応及び洗浄を行ってもよい。
標識抗体が酵素標識である場合には、標識抗体による抗原抗体反応に続く洗浄の後に、試料固定部と担持部を基質溶液と反応させ発色させる。

その後、組織切片１４上に封入剤を滴下し、カバーガラス１５を載せて組織切片１４を封入する（図１Ｃ、Ｄ）。
その後、必要に応じてマニキュア液によりカバーガラス１５の端をシールした後に顕微鏡観察を行う。

結合性物質を結合させた担持部１２１が染色され、非結合性物質を結合させた担持部１２２が染色されていなければ、それぞれの担持部の結果は、組織切片１４の染色結果のポジティブコントロール及びネガティブコントロールとすることができる（図１Ｄ）。

＜２＞試験例
以下、スライドガラスを基板とする本発明のコントロールスライドを用いた試験例について説明する。本試験例においては、結合性物質としてマウスＩｇＧ、非結合性物質としてヤギＩｇＧを用いた。

（１）マウスＩｇＧの調製
マウス血清を４℃、４０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を得た。この上清１０ｍｌを１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ＧＥヘルスケア）に１ｍｌ／ｍｉｎの流速で通し、次いで２０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した。０．１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）でカラムに結合したＩｇＧを溶出し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を１／１０容量加えて中和し、４０ｍｇのマウスＩｇＧを得た。

（２）ヤギＩｇＧの調製
ヤギ血清を４℃、４０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を得た。実施例１と同様の手順でＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ＧＥヘルスケア）を用いて６０ｍｇのＩｇＧを得た。

（３）スライドガラスの加工
２６ｍｍ×７６ｍｍのスライドガラスの一部をブラスト処理したものを作製した。ブラスト処理部分の隣に約５ｍｍの幅でガラスエッチング剤（グラスファンタジー、有限会社フロステック）を塗布し、室温で３０分間静置した。静置後水でエッチング剤を洗い流し、乾燥した圧搾空気を吹き付けて乾燥してエッチング処理部分を作製した。

（４）ＩｇＧの担持部への結合
スライドガラスにおけるブラスト処理部分、エッチング処理部分そして、これらの処理がなされていない無処理部分を担持部として、以下の手順で結合性物質であるマウスＩｇＧと、非結合性物質であるヤギＩｇＧを結合した。
加工したスライドガラスを０．５％酢酸に溶解した１％（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン溶液に１６時間浸漬し、その後、乾燥した圧搾空気を吹き付けて乾燥した。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を溶媒として調製したマウスＩｇＧとヤギＩｇＧの１ｍｇ／ｍｌと０．１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。スライドガラスのブラスト処理部分、エッチング処理部分、及び無処理部分に、上述のマウスＩｇＧ溶液及びヤギＩｇＧ溶液、並びに２０％スクロース水溶液 １μｌを滴下して１６時間静置した。静置後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＴＢＳに室温で１時間浸漬した。浸漬後水で洗い流し、乾燥した圧搾空気を吹き付けて乾燥した。

（５）染色
賦活化処理を行った後にＴＢＳで洗浄し、上述のマウスＩｇＧ及びヤギＩｇＧ溶液、並びに２０％スクロース水溶液を滴下した部分に、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＴＢＳで５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を滴下し、乾燥しないように蓋ができるプラスティック箱に入れて２５℃で１時間静置して反応させた。反応後、ＴＢＳでペルオキシダーゼ標識抗体を洗浄除去し、ペルオキシダーゼ染色ＤＡＢキット（ナカライテスク）を用いて５分間染色した。結果を図２に示す。

図２に示すように、マウスＩｇＧを結合した担持部はマウスＩｇＧの濃度が１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの何れであっても染色された。一方、ヤギＩｇＧを結合した担持部は何れも染色されなかった。
結合性物質であるマウスＩｇＧを結合した担持部での観察結果は、ペルオキシダーゼ標識抗体が正常に動作していることを示すポジティブコントロールとなっていることを示している。
また、非結合性物質であるヤギＩｇＧを結合した担持部での観察結果は、ペルオキシダーゼ標識抗体がヤギＩｇＧに交差反応をしていないことを示すネガティブコントロールとなっていることを示している。

また、図２に示すように、ブラスト処理されている担持部における発色が最も強く観察され、無処理の担持部における発色が最も弱かった。
この結果は、担持部を粗面ガラスとすることによって、単位エリア当たりに結合できる結合性物質の量を増大させ、結果として標識抗体からのシグナルを増大させることができることを示唆している。

本発明は、免疫染色実験のコントロール実験に応用することができる。

１０ コントロールスライド
１１ スライドガラス（基板）
１２１ 結合性物質を結合させた担持部
１２２ 非結合性物質を結合させた担持部
１３ 試料固定部
１４ 組織切片（被験試料）
１４１ パラフィン
１５ カバーガラス

Claims (6)

1. 標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する、間接法による免疫染色実験のためのコントロールスライドであって、
   前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質が結合している担持部と、前記被験試料を固定する試料固定部を有する基板を備え、
   前記結合性物質は、
   標識抗体以外の前記免疫染色実験で用いる抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と同一の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体であり、
   前記非結合性物質は、
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来の抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体
   であることを特徴とする、コントロールスライド。
2. 前記被験試料が組織切片であることを特徴とする、請求項１に記載のコントロールスライド。
3. 前記担持部が粗面ガラスによって構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のコントロールスライド。
4. 前記粗面ガラスがブラスト処理ガラス又はエッチング処理ガラスであることを特徴とする、請求項３に記載のコントロールスライド。
5. 標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する、間接法による免疫染色実験のためのコントロール実験の方法であって、
   基板の担持部に結合している、前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質に、
   前記免疫染色実験で用いる抗体溶液を、前記免疫染色実験と同一条件で接触させることを特徴とし、
   前記結合性物質は、
   標識抗体以外の前記免疫染色実験で用いる抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と同一の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体であり、
   前記非結合性物質は、
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来の抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体
   であることを特徴とする、方法。
6. 標識抗体を用いて被験試料中の被験物質を検出する、間接法による免疫染色実験のためのコントロールスライドの製造方法であって、
   基板の一部にブラスト処理又はエッチング処理を施して担持部を設け、その担持部に前記標識抗体と直接若しくは間接的に複合体を形成し得る結合性物質及び／又は前記標識抗体と複合体を形成し得ない非結合性物質を結合させることを特徴とし、
   前記結合性物質は、
   標識抗体以外の前記免疫染色実験で用いる抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と同一の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体であり、
   前記非結合性物質は、
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来の抗体、及び／又は
   前記免疫染色実験で用いる抗体と別の動物種由来のアイソタイプコントロール抗体
   であることを特徴とする、コントロールスライドの製造方法。