ES2834429T3 - Moléculas inhibidoras quiméricas de la activación del complemento - Google Patents

Abstract

Una molecula quimerica de un polipeptido asociado a ficolina que comprende: a) un polipeptido asociado a ficolina que comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de 5 SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde la region C-terminal del polipeptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 y b) un inhibidor de la actividad del complemento seleccionado del grupo que consiste en Factor H (FH) o un fragmento funcional del mismo que comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR del Factor H, GAS6, Proteina S, inhibidor de C1 (C1-inh), proteina de union del componente 4 del complemento (C4bp), Factor I (FI), CR1, DAF(CD55), CD59, CR2 y una molecula de inmunoglobulina o parte de la misma; molecula quimerica que es capaz de inhibir la activacion del complemento.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas inhibidoras quiméricas de la activación del complemento

Campo de la invención

La presente invención se refiere a novedosas moléculas quiméricas de polipéptidos asociados a ficolina, tales como polipéptidos de fusión para su uso en el tratamiento de afecciones asociadas a la inflamación, la apoptosis, la autoinmunidad, la coagulación, enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas. La presente invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos de fusión, vectores y células hospedadoras usados en la producción de polipéptidos de fusión.

Antecedentes de la invención

La activación del sistema del complemento (C) se logra a través de tres rutas de iniciación diferentes: La alternativa (AP), la clásica (CP) o la ruta de las lectinas (LCP). La activación de AP se produce en superficies extrañas y está provocada por una hidrólisis lenta, espontánea de C3 y la actividad de los factores properdina, factor B y factor D para formar la convertasa C3 funcional C3bBb. La AP también funciona como una ruta de amplificación (el bucle de amplificación) de las otras dos rutas. Recientemente, se ha demostrado que el ensamblaje de convertasa alternativo también puede iniciarse mediante la unión no covalente de properdina a algunas superficies diana. La activación de CP, por otro lado, se inicia cuando C1q se une a inmunoglobulinas en complejo con antígenos, que desencadena la activación de las serina proteasas C1r y C1s asociadas a C1q. C1s escinde y activa C4 y C2 para formar la convertasa CP C3 C4b2a. La LCP se activa cuando la lectina de unión a manosa (MBL) o las ficolinas se unen a patrones restringidos de carbohidratos o compuestos acetilados, por ejemplo, en la superficie de microorganismos o cuando se exponen en células hospedadoras moribundas. Tras unirse al ligando, la serina proteasa MASP-2 asociada activa y escinde C4 y C2 para formar la convertasa C4b2a de LCP C3. Se ha sugerido que la función de MASP-1 implica una estabilización de la escisión de MASP-2 de C2 y también una escisión directa de bajo grado de C3. Sin embargo, otros estudios relacionan la función y actividad de MASP-1 y MASP-2 con una intercomunicación del sistema de coagulación que implica protrombina, fibrinógeno y factor XIII. Usando MASP1/3 en ratones de inactivación génica se demostró recientemente que MASP-1 de hecho contribuye a la actividad del complemento. La función exacta de la serina proteasa MASP-3 asociada a MBL descubierta más recientemente aún no se ha dilucidado. Se han informado estudios que indican que MASP-3 se asocia con un abanico limitado de oligómeros de MBL y que MASP-3 y la proteína pequeña asociada a MBL (sMAP) están implicados en la regulación o inhibición de la activación del complemento de LCP dependiente de MBL.

MASP-1 y -3 derivan del mismo gen MASP1/3 (presente en el cromosoma 3q27-q28) a través de corte y empalme diferencial. Contienen una cadena A idéntica excepto por 15 restos C-terminales. La cadena A está compuesta por dos dominios CUB (C1r/C1s, Urchina-EGF, proteína morfogenética ósea) separados por un dominio EGF (factor de crecimiento epidérmico) y seguidos por dos dominios CCP (proteína de control del complemento). La cadena B que incluye el dominio de serina proteasa es diferente para MASP-1 y MASP-3. MASP-2 y sMAP también derivan del mismo gen (presente en el cromosoma 1p36-p36.2) donde sMAP es una forma truncada que carece del dominio de serina proteasa y una parte principal de la cadena A. Se ha demostrado que el gen MASP1/3 es polimórfico, pero la importancia funcional de esto todavía se comprende poco. Sin embargo, existe alguna evidencia de que los polimorfismos en el gen MASP2/sMAP están asociados a un mayor riesgo de infecciones. La expresión de las MASP se localiza en los hepatocitos del hígado, pero un estudio reciente describió que el ARNm de MASP-3 humana (como el único ARNm de MASP) se expresaba en un amplio abanico de tejidos.

El documento WO 2007/149567 desvela una fusión del factor H con el inhibidor del complemento CR2 que da lugar a una molécula quimérica (CR2-fH) que es capaz de inhibir la activación del complemento.

Objetivo de la invención

Es un objetivo de las realizaciones de la invención proporcionar moléculas quiméricas adecuadas para el tratamiento de afecciones asociadas con la inflamación, la apoptosis, la autoinmunidad, la coagulación y/o enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas. Las moléculas quiméricas de la invención también pueden ser adecuadas como biomarcadores para el diagnóstico y/o pronóstico de estas indicaciones, así como para enfermedades malignas, tales como cánceres.

Sumario de la invención

El presente o presentes inventores han descubierto que las moléculas quiméricas novedosas que se asocian con las moléculas de reconocimiento de la ruta del complemento de las lectinas pueden usarse en el tratamiento de afecciones médicas específicas asociadas a la inflamación, la apoptosis, la autoinmunidad, la coagulación y/o enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas.

De esta manera, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina que comprende:

a) un polipéptido asociado a ficolina que comprende la secuencia de aminoácidos 20-380 de SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde la región C-terminal del polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y

b) un inhibidor de la actividad del complemento seleccionado del grupo que consiste en Factor H (FH) o un fragmento funcional del mismo que comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR del Factor H, GAS6, Proteína S, inhibidor de C1 (C1-inh), proteína de unión del componente 4 del complemento (C4bp), Factor I (FI), CR1, DAF(CD55), CD59, CR2 y una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma;

cuya molécula quimérica es capaz de inhibir la activación del complemento.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula quimérica, en donde el polipéptido asociado a ficolina y el inhibidor de la actividad del complemento de acuerdo con la invención se fusionan directa o indirectamente entre sí en forma de una proteína de fusión.

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula quimérica, en donde el polipéptido asociado a ficolina y el inhibidor de la actividad del complemento de acuerdo con la invención se fusionan directa o indirectamente entre sí en forma de una proteína de fusión.

En un cuarto aspecto la presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula quimérica, en donde el polipéptido asociado a ficolina y el inhibidor de la actividad del complemento de acuerdo con la invención se fusionan directa o indirectamente entre sí en forma de una proteína de fusión.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para producir la molécula quimérica de acuerdo con la invención, comprendiendo el método cultivar una célula de acuerdo con la invención en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresión de la construcción polinucleotídica y recuperar el polipéptido resultante del medio de cultivo.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una composición que comprende la molécula quimérica de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la molécula quimérica de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una molécula quimérica de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere al uso de una molécula quimérica de acuerdo con la invención; para la preparación de un medicamento.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una molécula quimérica de acuerdo con la invención así como a una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica de acuerdo con la invención para el tratamiento de cualquier indicación asociada a la inflamación, la apoptosis y/o la autoinmunidad.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a una molécula quimérica de acuerdo con la invención para el tratamiento de cualquier indicación asociada a la coagulación, enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas.

En el presente documento se describe además un método para el tratamiento de cualquier indicación asociada a la inflamación, la apoptosis y/o la autoinmunidad, la coagulación, enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas, para prevenir la aparición de complicaciones tromboembólicas en pacientes identificados de alto riesgo, el tratamiento de una afección médica asociada al corazón o una afección médica asociada a una deficiencia en un polipéptido asociado a ficolina; comprendiendo el método administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una molécula quimérica de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesite.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere al uso de una composición de acuerdo con la invención; para la preparación de un medicamento.

En el presente documento se describe además un método para el tratamiento de cualquier indicación descrita en el presente documento, comprendiendo el método la administración simultánea o secuencial de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una molécula quimérica de acuerdo con la invención y una o más proteínas seleccionadas de Ficolina-1, 2, 3 y lectina de unión a manosa (MBL), C1q, proteínas tensioactivas pulmonares SP-A y/o SP-D y moléculas de defensa intracelulares similares al colágeno, tales como CL-L1.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Transcripción alternativa del gen MASP-1. La transcripción alternativa del gen MASP1 se detectó en el ADNc del hígado. Los transcritos MASP1, MASP3, y FAP se amplificaron usando un cebador directo común ubicado en el exón 6 y cebadores inversos específicos ubicados en el exón 12 (MASP1), exón 11 (MASP3) y exón 8a (FAP). El exón 8a al que se hace referencia en el presente documento puede denominarse alternativamente exón 9 con un desplazamiento hacia arriba en el número de los siguientes exones de 9-17 a 10-18 del transcrito primario. MASP1 genera un fragmento de 500 pb, MASP3 genera un fragmento de 506 pb y FAP genera un fragmento de 309 pb.

Figura 2: Corte y empalme alternativo del gen MASP1. MASP1 se genera mediante corte y empalme de 8a y el exón 11, que contienen ambos una secuencia de codón de parada (marcada con recuadros negros). La secuencia de MASP1 contiene un codón de parada en el exón 17. MASP3 se genera por corte y empalme del exón 8a y se genera FAP si no se produce ningún corte y empalme del exón 8a. La proteína FAP contiene los dos dominios CUB, el dominio EGF y el primer dominio CCP1.

Figura 3: Expresión tisular del fragmento FAP. Las distribuciones tisulares de los genes MASP-1, MASP3 y FAP se investigaron en paneles de ADNc de Clontech. los transcritos MASP-1, MASP-3 y FAP se amplificaron usando un cebador directo común y cebadores inversos específicos. Se usó GADPH como gen de referencia. Los tres genes se expresaron altamente en el hígado y, adicionalmente, FAP se expresó fuertemente en el tejido cardíaco (marcado con flechas negras). Se detectó una expresión menor del gen FAP en cerebro, colon, próstata, músculo esquelético e intestino delgado (marcado con flechas blancas).

Figura 4: Alineación de MASP-1, MASP-3 y FAP. Las secuencias de proteínas de MASP-1, MASP-3 y FAP se alinearon utilizando el software BioEdit. MASP-1 y MASP-3 contienen diferentes dominios de serina proteasa C-terminales mientras que FAP no contiene ningún dominio de serina proteasa. En cambio, la proteína contiene 17 nuevos aminoácidos en la región C-terminal.

Figura 5: Secuencia de ADNc y secuencia de proteína correspondiente de FAP. La secuencia de ADNc se muestra en la fila superior y la secuencia de proteína correspondiente se muestra a continuación. Las regiones de exones están divididas por líneas verticales negras. Los aminoácidos que se cree que están implicados en la unión a MBL/ficolinas están marcados con recuadros de color amarillo claro.

Figura 6: Activación del complemento MASP-1. Se incubaron MBL humanas con cantidad aumentada de MASP-1. MASP-1 fue capaz de activar las proteínas del complemento C3 y C4.

Figura 7: Activación del complemento MASP-2. Se incubaron MBL humanas con cantidad aumentada de MASP-2. MASP-2 fue capaz de activar fuertemente las proteínas del complemento C3 y C4.

Figura 8: Inhibición de MASP-3 del complemento. Se incubaron MBL humanas con cantidad aumentada de MASP-3. MASP-3 fue capaz de inhibir la activación de ambas de las proteínas del complemento C3 y C4.

Figura 9: Inmunoprecipitación. Inmunoprecipitación de Ficolina/MBL en suero con mAb anti-MBL 131-11, clon 219 anti-Ficolina-2 y clon 334 anti-Ficolina-3. Seguido de la separación con perlas magnéticas de Dynal, SDS-PAGE, transferencia Western y clon 8B3 anti-MASP-1/MASP-3 marcado con biotina como anticuerpo señal.

Figura 10: FAP interactúa con Ficolina cuando se une a seroalbúmina humana acetilada (AcHSA). Unión de Ficolina en suero eluida a AcHSA. Transferencia Western con el clon 8B3 anti-MASP-1/MASP-3 marcado con biotina como anticuerpo señal.

Figura 11: Cinética y constantes de disociación para la interacción entre MASP-1 y MASP-3 y rFicolina-2 (Hummelsh0j T et al., Mol. Immunol., 2007).

Figura 12: Alineación de GULF y los 17 aminoácidos únicos de FAP.

Figura 13: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con o sin MBL humana recombinante seguido de incubación con suero deficiente en MBL homocigoto de en diluciones en serie. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 14: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA de BSA acetilado/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con o sin Ficolina-3 humana recombinante seguido de incubación con suero deficiente en Ficolina-3 homocigota de en diluciones en serie. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 15: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-1 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en MBL homocigoto en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 16: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con Ficolina-3 humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-1 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en Ficolina-3 homocigota en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 17: Activación del complemento de C4 en un ELISA manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-2 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en MBL homocigoto en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 18: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con Ficolina-3 humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-2 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en Ficolina-3 homocigota en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 19: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-3 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en MBL homocigoto en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 20: Activación del complemento de C4 en un ensayo ELISA de AcBSA/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con Ficolina-3 humana recombinante seguido de incubación con diluciones seriadas de rMASP-3 como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero en una dimensión. Posteriormente se incubó suero deficiente en Ficolina-3 homocigota en diluciones en serie en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando anticuerpos policlonales anti C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estándar en determinaciones dobles de cada punto de las curvas.

Figura 21: Distribución tisular de FAP, MASP1 y MASP3. FAP se expresó mucho más en el tejido cardíaco en comparación con MASP1 y MASP3. FAP se expresó tres veces más en el tejido cardíaco en comparación con la expresión de FAP en el hígado. Adicionalmente, se observó una expresión de FAP más alta en el hígado en comparación con la expresión de MASP1 y MASP3 en el hígado. También se detectó una expresión de FAP considerable en tejidos de cerebro, de músculo esquelético y de próstata. El experimento se realizó tres veces por duplicado. Se indica el error estándar de la media.

Figura 22: Localización inmunohistoquímica hepática de MAP-1 usando antisuero policlonal de ratón producido contra los 17 restos C-terminales específicos de FAP de la Proteína. La tinción de control fue negativa. Varios anticuerpos policlonales diferentes producidos contra FAP (conejo y ratón) mostraron el mismo patrón de tinción.

Figura 23: Análisis inmunohistoquímico de localización tisular de MAP-1 (OM X10). El panel izquierdo muestra la tinción con un mAb (12B11) contra MAP-1. El panel derecho muestra la tinción de control de isotipo con un mAb IgG1k no relacionado. (A-B): Miocardio, (C-D): Músculo esquelético, (E-F): Muestra de hígado, (G-H): Tejido aórtico. La barra de la esquina inferior derecha indica 50 |jm en todos los portaobjetos.

Figura 24: Inmunoprecipitación de complejos en suero de MAP-1 y MASP-1/3. (A) MAP-1 y MASP-1/3 se inmunoprecipitaron a partir de suero usando mAb 20C4 (anti MAP-1) y mAb 8B3 (anti MASP-1/3, con un epítopo en la cadena pesada común). Las muestras reducidas se sometieron a electrotransferencia y se desarrollaron con pAb contra MAP-1 o mAb biotinilados contra Ficolina-3 (FCN334) y MBL (Hyb 131-1). (B) Inmunoprecipitación con mAb contra MBL (Hyb 131-11), Ficolina-2 (FCN219) y Ficolina-3 (FCN334) a partir de 1 ml, 3O0 j l y 100 j l de suero, respectivamente (Lado izquierdo). Los controles se precipitaron del suero con MAP-1 (sMAP-1) y rMAP-1 del sobrenadante del cultivo (rMAP-1) usando mAb anti MAP-1 20C4 (lado derecho). Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con sonda con pAb contra MAP-1.

Figura 25: Influencia de MASP-2 y MAP-1 en la deposición de C4 del complemento mediada por MBL y Ficolina-3. Las deposiciones de C4 se midieron usando un anticuerpo policlonal contra C4 y se dan como valores de DO490-650nm. Las barras de error indican dos veces la desviación estándar de las determinaciones dobles. Las concentraciones aproximadas de rMBL, rFicolina-3, rMAP-1 y rMASP-2 se dan en las marcas de las figuras. (A) Reconstitución de la deposición de C4 en una superficie recubierta de manano usando suero deficiente en MBL con rMBL a 400 ng/ml. El control se realizó sin adición de rMBL. (B) Efecto dependiente de la dosis de rMASP-2 sobre la deposición de C4 mediada por rMBL. (C) Efecto dependiente de la dosis de rMAP-1 sobre la deposición de C4 mediada por rMBL. (D) Reconstitución de la deposición de C4 en una superficie recubierta de AcBSA usando suero deficiente en Ficolina-3 con rFicolina-3 a 400 ng/ml. El control fue sin la adición de rFicolina-3. (E) Efecto dependiente de la dosis de rMASP-2 sobre la deposición de C4 mediada por rFicolina-3. (F) Efecto dependiente de la dosis de rMAP-1 sobre la deposición de C4 mediada por rFicolina-3.

Figura 26: Influencia de MASP-2 y MAP-1 en la deposición del complemento C4 en un sistema puro. Se preincubó rMBL sobre una superficie de manano con diluciones en serie de rMASP-2 en la primera dimensión. Después se aplicaron diluciones en serie de rMAP-1 en la segunda dimensión, seguido de la aplicación de C4 purificado a 1 |jg/ml. Las deposiciones de C4 se midieron con un pAb contra C4 y se dan como valores de DO490-650nm. Las barras de error indican dos veces la desviación estándar de las determinaciones dobles. Las concentraciones aproximadas de rMAP-1 y rMASP-2 se dan en las marcas de las figuras.

Figura 27: Diagrama esquemático de un vector de expresión de MAP-1/FH o FH/MAP-1 de ejemplo y construcciones quiméricas de la proteína MAP-1/FH o FH/m AP-1. Los plásmidos de expresión quimérica contienen una secuencia de Kozak (K), enlazador opcional (L) y un codón de parada (S). Los vectores también pueden contener un péptido señal (SP) opcional.

Figura 28: Diagrama esquemático de un vector de expresión de MAP-1/C4bp o C4bp/MAP-1 de ejemplo y construcciones quiméricas de la proteína MAP-1/C4bp o C4bp/MAP-1. Los plásmidos de expresión quimérica contienen una secuencia de Kozak (K), enlazador opcional (L) y un codón de parada (S). Los vectores también pueden contener un péptido señal (SP) opcional. C4bp puede estar compuesto por una cadena alfa de C4bp (C4bpA) o una cadena beta de C4bp (C4bpB) solas, o una combinación de las dos cadenas.

Figura 29: Diagrama esquemático de un vector de expresión de MAP-1/FI o FI/MAP-1 de ejemplo y construcciones quiméricas de la proteína MAP-1/FI o FI/MAP-1. Los plásmidos de expresión quimérica contienen una secuencia de Kozak (K), enlazador opcional (L) y un codón de parada (S). Los vectores también pueden contener un péptido señal (SP) opcional.

Figura 30: Diagrama esquemático de un vector de expresión MAP-1/C1-inh o C1-inh/MAP-1 de ejemplo y construcciones quiméricas de la proteína MAP-1/C1-inh o C1-inh/MAP-1. Los plásmidos de expresión quimérica contienen una secuencia de Kozak (K), enlazador opcional (L) y un codón de parada (S). Los vectores también pueden contener un péptido señal (SP) opcional.

Figura 31: rMAP-1 purificado y factor H plasmático en 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE, análisis de tinción con Azul Coomassie Brillante de factor H plasmático purificado y MAP-1 recombinante (de medio sin suero/SFM o medio con suero de ternera fetal al 10 %/FCS).

Figura 32: rMBL purificado (SFM) en 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE, análisis de tinción con Azul Coomassie Brillante de MBL recombinante purificada (de medio sin suero/SFM).

Figura 33: Visión general de la configuración del ensayo MBL; Composición del ensayo del complemento con etapas incluidas. Entre cada etapa se incluyen tres veces de lavado/bloqueo. 1a etapa: Recubrimiento con manano; 2a etapa: Aplicación de rMBL, 400 ng/ml; 3a etapa: Aplicación de rMAP-1, fH o híbrido rMAP-1/fH en 1a dimensión; 4a etapa: Aplicación de suero deficiente en MBL (D/D) en 2a dimensión; 5a etapa: Medición de la deposición de C3 o C9, anticuerpos monoclonales contra C3 o C9.

Figura 34: Impacto de la molécula híbrida de MAP-1/Factor H en la deposición de C3 mediada por MBL; Inhibición dependiente de la dosis del complemento C3 por una molécula híbrida de MAP-1/Factor H.

Figura 35A: Asociación de rMAP-1 (SFM) a rMBL unido a manano; Detección de la asociación de MAP-1 con rMBL unido a manano. La unión de rMAP-1, rMAP-1 con Factor H "libre" e Híbrido de rMAP-1/Factor H se detecta con un anticuerpo monoclonal contra MAP-1.

Figura 35B: Detección de la asociación de Factor H con rMBL unido a manano. La unión del Factor H, rMAP-1 con Factor H "libre" e Híbrido de rMAP-1/Factor H se detecta con un anticuerpo monoclonal contra el Factor H.

Figura 36A: Impacto del factor H en la deposición de C3 mediada por MBL; Inhibición dependiente de la dosis del complemento C3 mediada por MBL por Factor H "libre" purificado.

Figura 36B: Impacto del factor H en la deposición de C9 mediada por MBL (TCC); Inhibición dependiente de la dosis del complemento C9 mediada por MBL (complejo del complemento terminal/TCC) por Factor H "libre" purificado.

Figura 37A: Impacto de rMAP-1 en la deposición de C3 mediada por MBL; Inhibición dependiente de la dosis del complemento C3 mediada por MBL por MAP-1 recombinante purificado.

Figura 37B: Impacto de rMAP-1 en la deposición de C9 mediada por MBL (TCC); Inhibición dependiente de la dosis del complemento C9 mediada por MBL (complejo del complemento terminal/TCC) por MAP-1 recombinante purificado.

Figura 38A: Impacto de rMAP-1 Factor H en la deposición de C3 mediada por MBL; Inhibición dependiente de la dosis del complemento C3 mediada por MBL por MAP-1 recombinante y Factor H "libre".

Figura 38B: Impacto de rMAP-1 Factor H en la deposición de C9 mediada por MBL (TCC); Inhibición dependiente de la dosis del complemento C9 mediada por MBL (complejo del complemento terminal/TCC) por MAP-1 recombinante y Factor H "libre".

Figura 39A: Impacto del híbrido de rMAP-1/Factor H sobre la deposición de C3 mediada por MBL; Inhibición dependiente de la dosis del complemento C3 mediada por MBL por la molécula híbrida de rMAP-1/Factor H.

Figura 39B: Impacto del híbrido de rMAP-1/Factor H sobre la deposición de C9 mediada por MBL (TCC); Inhibición dependiente de la dosis del complemento C9 mediada por MBL (complejo del complemento terminal/TCC) por la molécula híbrida de rMAP-1/Factor H.

Divulgación detallada de la invención

Los presentes inventores han descubierto una nueva proteína plasmática de 40 kDa asociada a las moléculas de reconocimiento de la ruta del complemento de las lectinas y la identificaron como una nueva variante de transcripción alternativa de MASP-1/MASP-3 que a su vez corresponde a la proteína plasmática recién descubierta.

La nueva proteína (denominada por los inventores FAP (proteína asociada a Ficolina) o MAP-1 (proteína-1 asociada a MBL/Ficolina)) ha demostrado por los presentes inventores que carece de un dominio enzimático, pero que contiene el dominio de unión de ficolina/MBL y, por lo tanto, se espera que esté implicada en la regulación e inhibición de las funciones del complemento y de la coagulación a través de competiciones y desplazamiento de las MASP o, alternativamente, pero no mutuamente excluyente, como una proteína implicada en funciones de barrido o señalización.

La activación incontrolada del sistema del complemento y/o la cascada de la coagulación está fuertemente asociada a un desenlace grave fatal en diversas enfermedades que van desde la inflamación sistémica y la sepsis, hasta el infarto de miocardio y autoinmunidad.

Se ha demostrado que la inhibición de la coagulación y la activación del complemento son una herramienta terapéutica prometedora.

MAP-1 es un posible inhibidor novedoso del complemento y de las funciones de coagulación. Sin embargo, los polipéptidos asociados a ficolina pueden tener otras funciones, tales como una función de eliminador y/o una función de señalización. Por otra parte, pueden usarse como biomarcadores en diversos entornos de enfermedades, incluyendo las enfermedades malignas, autoinmunitarias, afecciones metabólicas y/o inflamatorias.

Los inventores de la presente invención descubrieron la presente proteína plasmática in vivo y la denominaron proteína asociada a Ficolina (FAP). Se muestra que se asocia principalmente con las ficolinas (figura 9), pero probablemente también puede asociarse con la lectina de unión a manosa. Al buscar en la base de datos de nucleótidos de NCBI, los inventores de la presente invención encontraron una posible variante de transcripción que corresponde a un truncado de MASP-1. Basándose en esta secuencia, se diseñaron cebadores para amplificar la transcripción del nuevo gen putativo. Posteriormente, usando ADNc de hígado humano, se identificó una nueva variante de transcripción alternativa del gen MASP-1 (figura 1). Esta cepa de ARNm se secuenció y, en consecuencia, se determinó la secuencia de aminoácidos, que corresponde al peso molecular de la proteína observada en plasma/suero de 40 kDa (figura 5). La nueva proteína es parcialmente idéntica a MASP-1 y MASP-3, pero carece de un dominio de serina proteasa, pero contienen un exón novedoso que codifica 17 aminoácidos seguido de un codón de terminación. Este exón se corta y empalma en el transcrito de MASP1 y MASP3 (figura 2). Mediante el uso de un panel de bibliotecas de expresión de ARNm, los presentes inventores han encontrado evidencia de que esta proteína se expresa fuertemente en el corazón, en el hígado y en el tejido del músculo esquelético (figura 3). Se observó una expresión débil en el cerebro, el tracto digestivo, la próstata y en el bazo (figura 3). El análisis de Taqman confirmó la expresión en células del corazón y del hígado. FAP se expresó mucho más en el tejido cardíaco en comparación con MASP1 y MASP3. FAP se expresó tres veces más en el tejido cardíaco en comparación con la expresión de FAP en el hígado. Adicionalmente, se observó una expresión de FAP más alta en el hígado en comparación con la expresión de MASP1 y MASP3 en el hígado. También se detectó una expresión de FAP considerable en tejidos de cerebro, de músculo esquelético y de próstata. El experimento se realizó tres veces por duplicado.

La alta expresión en el corazón es muy prominente y ha hecho que los presentes inventores sugieran un uso de los polipéptidos de acuerdo con la presente invención como un protector muy útil contra el daño tisular en autoinmunitarias, metabólicas y/o inflamatorias, tales como las afecciones médicas asociadas al corazón.

Los presentes inventores han establecido ensayos para evaluar la actividad del complemento iniciada por ficolinas y lectina de unión a manosa y de esta manera los presentes inventores han podido demostrar una posible inhibición del complemento funcional de FAP.

Los presentes inventores han establecido ensayos cuantitativos en tiempo real para medir el nivel de expresión relativo exacto en diferentes tejidos.

Los polipéptidos asociados a ficolina así como las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención pueden producirse mediante técnicas recombinantes. Los conejos o ratones pueden inmunizarse con un péptido único de 17 aminoácidos de longitud para obtener anticuerpos específicos policlonales y monoclonales de FAP, respectivamente.

Pueden usarse anticuerpos específicos contra FAP para la medición cuantitativa de FAP y la detección inmunohistoquímica en diferentes tejidos.

Las constantes de unión entre FAP y diferentes compañeros de unión como se describe en el presente documento pueden determinarse en ELISA y usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (Biacore).

Una proteína aceptora específica de FAP, tal como un receptor unido a la superficie celular específico puede identificarse mediante ensayos convencionales conocidos por el experto en la materia, tales como ensayos en los que la proteína se une directamente a las células.

La nueva proteína Proteína Asociada a Ficolina (FAP) es una variante de corte y empalme alternativo de MASP1. La proteína carece del dominio de serina proteasa pero aún contiene los dominios que están implicados en la unión a los iniciadores de la ruta de las lectinas del sistema del complemento. Por lo tanto, los presentes inventores esperan que la proteína esté implicada en la regulación e inhibición de la función de MASP-1 y MASP-3 (complemento, funciones de coagulación y otros sustratos de enzimas) a través de competiciones y desplazamiento de las MASP. Como alternativa, pero no mutuamente excluyente, FAP puede funcionar como molécula depuradora que facilita la retirada de los complejos FAP/MBL/ficolina unidos a material de desecho endógeno o patógenos.

La activación incontrolada del sistema del complemento y la cascada de la coagulación se asocian a resultados adversos y los inhibidores funcionales, tales como los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden ser muy útiles para el control del sistema del complemento y la cascada de coagulación. Además, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en otros entornos. Otro ángulo podría ser usar la proteína como biomarcador en diferentes escenarios de enfermedades.

Las moléculas quiméricas de acuerdo con la presente invención que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o un fragmento inmunológico o variante de la misma pueden tener una función específica asociada con esta secuencia particular de aminoácidos. Los presentes inventores sugieren que tales polipéptidos pueden tener una función o actividad correspondiente a la actividad de una o más proteínas seleccionadas de DNMT1 ADN (citosina-5-)-metiltransferasa 1 (DNMT1), miembro 1 de la subfamilia B de Golgina (GOLGB1), Proteína de anclaje A-quinasa 9 (AKAP9), Proteína asociada a banda de linfocitos T) (antígeno CD272), Proteína adaptadora de engrosamiento que contiene el dominio PTB 1 (GULP) y proteína 2 que contiene el dominio MACRO.

En algunas realizaciones particularmente interesantes, las moléculas quiméricas de acuerdo con la presente invención tienen una función o actividad correspondiente a la actividad de la proteína 1 adaptadora de engrosamiento que contiene el dominio PTB (GULP).

Los polipéptidos asociados a ficolina son únicos y pueden proporcionar la base para nuevos fármacos y/o nuevas herramientas de diagnóstico.

En consecuencia, los inventores de la presente invención han proporcionado moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina, cuya molécula quimérica comprende además un segundo modulador de la actividad del complemento.

Se espera que los polipéptidos asociados a ficolina sean eficaces en diversos entornos clínicos incluyendo las indicaciones asociadas a la inflamación, la apoptosis y/o la autoinmunidad. Sin embargo, las moléculas quiméricas, en donde un segundo modulador de la actividad del complemento, tal como un inhibidor del complemento, se fusiona, se añade o se conjuga al polipéptido asociado a ficolina, se espera que ofrezca ventajas potenciales significativas con respecto a la seguridad y eficacia.

Definiciones

La expresión "polipéptido asociado a ficolina" como se usa en el presente documento significa cualquier proteína o polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 20-380 de la proteína asociada a ficolina humana nativa (FAP) (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de aminoácidos de 16-363 de Se Q ID NO: 9, variantes funcionales, versiones truncadas funcionales de las mismas así como derivados o conjugados funcionales, cuyo polipéptido no tiene actividad complementaria, pero posee la capacidad de competir con MASP-1, MASP-2 o MASP-3 por la unión a ficolina-3, MBL, C1q, proteínas tensioactivas pulmonares SP-A y/o SP-D y/o CL-L1 (y otros miembros de la familia de las colectinas). Esto incluye, pero no se limita a, polipéptido asociado a ficolina humana (FAP) que tiene la SEQ ID NO: 1 y variantes de la misma.

La expresión "proteína asociada a ficolina (FAP)" como se usa en el presente documento significa proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos 1-380 (con o sin péptido señal, tal como la secuencia de aminoácidos 20-380) de FAP humana nativa (SEQ ID NO: 1), variaciones alélicas naturales y homólogos de las mismas. También incluye proteínas con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N- o C-terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoácidos N- o C-terminales siempre que esas proteínas retengan sustancialmente la actividad de FAP. La expresión "proteína asociada a ficolina (FAP)" se usa de forma intercambiable en el presente documento con las expresiones "m AP-1" o "proteína-1 asociada a MBL/Ficolina". "FAP" dentro de la definición anterior también incluye variaciones alélicas naturales que pueden existir y producirse de un individuo a otro. La expresión también incluye proteínas con secuencia homóloga y función similar derivadas de otras especies distintas de la humana, tales como bovino, cerdo, perro, caballo, rata y ratón. También, el grado y la ubicación de la glucosilación u otras modificaciones post-traduccionales pueden variar dependiendo de las células hospedadoras elegidas y la naturaleza del entorno celular del hospedador.

La expresión "Serina proteasa-1 asociada a MBL" o "MASP-1" como se usa en el presente documento significa proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos 1-699 (con o sin péptido señal, tal como la secuencia de aminoácidos 20-699) de MASP-1 humana nativa (SEQ ID NO: 5), variaciones alélicas naturales y homólogos de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o más cadenas peptídicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesada y ligera de la proteína humana nativa.

La expresión "Serina proteasa-3 asociada a MBL" o "MASP-3" como se usa en el presente documento significa proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos 1-728 (con o sin péptido señal, tal como la secuencia de aminoácidos 20-728) de MASP-3 humana nativa (SEQ ID NO: 7), variaciones alélicas naturales y homólogos de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o más cadenas peptídicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesada y ligera de la proteína humana nativa.

La expresión "Serina proteasa-2 asociada a MBL" o "MASP-2" como se usa en el presente documento significa proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos 1-686 (con o sin péptido señal, tal como la secuencia de aminoácidos 16-686) de MASP-2 humana nativa (SEQ ID NO: 9), variaciones alélicas naturales y homólogos de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o más cadenas peptídicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesada y ligera de la proteína humana nativa.

Las expresiones "proteína pequeña asociada a MBL", "sMAP", "Proteína plasmática asociada a MBL de 19 kD" o, "MAp19" como se usa en el presente documento significa proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos 1-185 (con o sin péptido señal, tal como la secuencia de aminoácidos 16-185) de sMAP humana nativa (SEQ ID NO: 11), variaciones alélicas naturales y homólogos de las mismas.

Los términos "variante" o "variantes", como se usan en el presente documento, pretenden designar cualquier proteína que comprende un polipéptido de origen natural, tal como un polipéptido asociado a ficolina que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en donde uno o más aminoácidos han sido sustituidos por otro aminoácido y/o en donde uno o más aminoácidos han sido eliminados y/o donde uno o más aminoácidos han sido insertados en el polipéptido y/o donde uno o más aminoácidos han sido ha sido añadidos al polipéptido. Dicha adición puede tener lugar en el extremo del terminal N o en el extremo del terminal C o en ambos. La "variante" o las "variantes" dentro de esta definición todavía tienen actividad funcional. En alguna realización, una variante tiene una identidad de secuencia del 70 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 80 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 90 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, una variante tiene una identidad de secuencia del 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 70 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 80 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 90 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4. En una realización adicional, una variante tiene una identidad de secuencia del 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Las expresiones "variante funcional", "versiones funcionales truncadas" y "derivados funcionales" de un polipéptido quimérico asociado a ficolina como se usa en el presente documento se refiere a variantes, versiones truncadas, así como derivados de SEQ ID NO: 1, cuyos polipéptidos comprenden partes de la secuencia esencial de SEQ ID NO: 1 y al menos poseen la capacidad de competir con MASP-1 o MASP-3 por unirse a las ficolinas o MBL sin tener la actividad del complemento y/o la actividad de serina proteasa. Debe entenderse que una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina puede tener dos o tres características seleccionadas de ser una variante y/o truncada y/o un derivado.

Una variante funcional de una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina abarca aquellas que exhiben al menos aproximadamente el 25 %, tal como al menos aproximadamente el 50 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, tal como al menos aproximadamente el 90 % de la actividad específica de FAP de tipo silvestre que se ha producido en el mismo tipo de célula, cuando se prueba en los ensayos descritos en el presente documento.

La expresión "fragmento inmunológico", como se usa en el presente documento, se refiere a un fragmento de una secuencia de aminoácidos que posee esencialmente las mismas actividades funcionales y la misma orientación espacial para ser reconocida por un anticuerpo. En consecuencia, un anticuerpo específico se unirá tanto al polipéptido como a los fragmentos inmunológicos del mismo.

La expresión "otro aminoácido" como se usa en el presente documento significa un aminoácido que es diferente de ese aminoácido presente de forma natural en esa posición. Esto incluye, pero no se limita a, aminoácidos que pueden estar codificados por un polinucleótido. En algunas realizaciones, los diferentes aminoácidos están en forma L natural y pueden estar codificados por un polinucleótido.

El término "derivado" como se usa en el presente documento, pretende designar una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina que exhibe sustancialmente la misma o mejorada actividad biológica en relación con FAP humana de tipo silvestre, en el cual uno o más de los aminoácidos del péptido original se han modificado químicamente, por ejemplo, mediante alquilación, PEGilación, acilación, formación de éster o formación de amida o similares.

La expresión "actividad del complemento" como se usa en el presente documento significa la capacidad de activar el sistema del complemento. La actividad del complemento puede medirse con un ensayo como se describe en la sección titulada "Ensayos".

La expresión "lectina de unión a manosa (MBL)" como se usa en el presente documento también significa lectina de unión a manano, proteína de unión a manosa (MBP1) y proteína de unión a manano, cuyas expresiones pueden usarse indistintamente.

La expresión "capaz de asociarse" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de las proteínas de acuerdo con la presente invención de unirse específicamente en solución a uno o más de los iniciadores de la ruta de las lectinas del sistema del complemento u otras proteínas que pueden estar implicadas en el efecto del polipéptido.

La expresión "modulador de la actividad del complemento" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuesto que influya directa o indirectamente en la actividad del complemento. El modulador de la actividad del complemento puede ser un inhibidor directo o un inhibidor indirecto. Alternativamente, el modulador puede ser un dominio autodirigido que facilita el transporte y/o la captación en un sitio particular de actividad del complemento, tal como un sitio de inflamación. Alternativamente, el modulador puede ser una molécula de inmunoglobulina, tales como un dominio Fc, ligandos para moléculas de adhesión, tales como ligandos para selectinas. En algunas realizaciones preferidas, el modulador de la actividad del complemento no es un activador del complemento. El uso del término "segundo" para un modulador de la actividad del complemento simplemente se refiere a un modulador de la actividad del complemento, que es diferente del polipéptido asociado a ficolina. El efecto inhibidor o modulador de la actividad del complemento puede medirse de acuerdo con los ensayos descritos en el presente documento o con cualquier otro ensayo conocido por el experto en la materia.

La expresión "molécula quimérica" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que comprende al menos dos dominios que normalmente no están asociados, que comprende al menos (i) un polipéptido asociado a ficolina y (ii) un segundo modulador de la actividad del complemento. El polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento pueden enlazarse mediante cualquier método conocido en la técnica, siempre que se mantengan las funcionalidades deseadas de las dos partes.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica es una proteína de fusión. La "Proteína de fusión" usada en el presente documento se refiere a dos o más péptidos, polipéptidos o proteínas unidos operativamente entre sí. En algunas realizaciones, las dos partes se fusionan directamente entre sí. En algunas realizaciones, las dos partes están unidas por una secuencia enlazadora aminoacídica. Los ejemplos de secuencias enlazadoras se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, (Gly4Ser), (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly3Ser)4, (SerGly4), (SerGly4)2, (SerGly4)3 y (SerGly4)4. Las secuencias enlazadoras también pueden comprender secuencias enlazadoras "naturales" que se encuentran entre diferentes dominios de factores del complemento. El orden del polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento en la proteína de fusión puede variar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el C-terminal del polipéptido asociado a ficolina se fusiona (directa o indirectamente) al N-terminal del segundo modulador de la actividad del complemento. En algunas realizaciones, el N-terminal del polipéptido asociado a ficolina se fusiona (directa o indirectamente) al C-terminal del segundo modulador de la actividad del complemento.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica que comprende el polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento se enlaza a través de un reticulante químico. El enlace de los dos dominios puede producirse en grupos reactivos ubicados en las dos partes. Los grupos reactivos que pueden dirigirse mediante un reticulante incluyen aminas primarias, sulfhidrilos, carbonilos, carbohidratos y ácidos carboxílicos o grupos activos que pueden añadirse a las proteínas. Los ejemplos de enlazadores químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, bismaleimidohexano, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, Reticulantes NHS-Ésteres-Maleimida tales como SPDP, carbodiimida, glutaraldehído, MBS, Sulfo-MBS, SMPB, sulfo-SMPB, GMBS, Sulfo-GMBS, EMCS, Sulfo-EMCS, reticulantes imidoéster tales como DMA, DMP, DMS, DTBP, EDC y DTME.

En algunas realizaciones, el polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento están unidos no covalentemente. Por ejemplo, las dos partes pueden unirse mediante dos proteínas puente que interactúan (tales como biotina y avidina o estreptavidina), cada una unida al polipéptido asociado a ficolina o al segundo modulador de la actividad del complemento.

En algunas realizaciones, las moléculas quiméricas forman dímeros o multímeros.

En algunas realizaciones, el polipéptido asociado a ficolina y el modulador de la actividad del complemento están directamente fusionados (es decir, unidos) entre sí como una proteína de fusión. En algunas realizaciones, el polipéptido asociado a ficolina y el modulador de la actividad del complemento se enlazan indirectamente a través de una secuencia enlazadora aminoacídica. En algunas realizaciones, el C-terminal del polipéptido asociado a ficolina se enlaza (directa o indirectamente) al N-terminal del modulador de la actividad del complemento. En algunas realizaciones, el N-terminal del polipéptido asociado a ficolina se enlaza (directa o indirectamente) al C-terminal del modulador de la actividad del complemento.

El término "construcción" pretende indicar un segmento polinucleotídico que puede basarse en una secuencia de nucleótidos de origen natural completa o parcial que codifica el polipéptido de interés. La construcción puede contener opcionalmente otros segmentos polinucleotídicos. De manera similar, la expresión "aminoácidos que pueden estar codificados por construcciones polinucleotídicas" cubre los aminoácidos que pueden estar codificados por las construcciones polinucleotídicas definidas anteriormente, es decir, aminoácidos tales como Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln. El término "vector", como se usa en el presente documento, significa cualquier entidad de ácido nucleico capaz de la amplificación en una célula hospedadora. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en una célula hospedadora, se integre en el genoma de la célula hospedadora y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los cuales se ha integrado. La elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la cual va a introducirse. Los vectores incluyen, pero no se limitan a vectores plasmídicos, vectores de fagos, de virus o vectores de cósmidos. Los vectores suelen contener un origen de replicación y al menos un gen seleccionable, es decir, un gen que codifica un producto que es fácilmente detectable o cuya presencia es esencial para el crecimiento celular.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende la construcción polinucleotídica o el vector. En algunas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una célula eucariota. En otras realizaciones, la célula hospedadora recombinante es de origen mamífero. En una realización adicional, la célula hospedadora recombinante se selecciona del grupo que consiste en células CHO, células HEK y células BHK.

La expresión "una célula hospedadora", como se usa en el presente documento, representa cualquier célula, incluyendo células híbridas, en la cual puede expresarse ADN heterólogo. Las células hospedadoras típicas incluyen, pero no se limitan a células de insectos, células de levadura, células de mamífero, incluyendo células humanas, tales como células BHK, CHO, HEK y COS. Al practicar la presente invención, las células hospedadoras que se cultivan son preferentemente células de mamífero, más preferentemente una línea celular de mamífero establecida, incluyendo, sin limitación, las líneas celulares CHO (por ejemplo, ATCC CCL 61), COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), riñón de cría de hámster (BHK) y HEK293 (por ejemplo, ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es la línea celular BHK tk- ts13 (Waechter y Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982), en lo sucesivo denominadas células BHK 570. La línea celular BHK 570 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, con el número de registro de ATCC CRL 10314. Una línea celular tk- ts13 BHK también está disponible en la ATCC con el número de registro CRL 1632. Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin limitación, Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). También son útiles las células 3T3, células Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un animal transgénico que contiene y expresa la construcción polinucleotídica.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una planta transgénica que contiene y expresa la construcción polinucleotídica.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir las moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina de la invención, comprendiendo el método cultivar una célula que comprende la construcción de polinucleótido en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresión de la construcción polinucleotídica y recuperar el polipéptido resultante del medio de cultivo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de células y la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina de la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir las moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina, comprendiendo el método recuperar el polipéptido de la leche producida por el animal transgénico.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir las moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina, comprendiendo el método cultivar una célula de una planta transgénica que comprende la construcción polinucleotídica y recuperar el polipéptido de la planta resultante.

En el presente contexto, el término "tratamiento" pretende incluir tanto la prevención de una afección esperada que implica la activación inapropiada del complemento, tales como inflamación y lesión por reperfusión como la regulación de una afección ya presente, tales como infarto de miocardio y apoplejía con el propósito de inhibir o minimizar el daño tisular. La administración profiláctica de las moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina de acuerdo con la invención se incluye por tanto en el término "tratamiento".

El término "sujeto" como se usa en el presente documento pretende significar cualquier animal, en particular mamíferos, tales como seres humanos, y puede, cuando sea adecuado, usarse indistintamente con el término "paciente".

La expresión "identidad de secuencia" como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre moléculas de ácido nucleico o entre polipéptidos, según sea el caso, como se determina por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más restos de nucleótidos o dos o más restos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si existen) dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos").

El término "similitud" es un concepto relacionado, pero a diferencia de "identidad", se refiere a una relación de secuencia que incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias de sustitución conservativa. Si dos secuencias de polipéptidos tienen, por ejemplo, (fracción (10/20)) aminoácidos idénticos, y el resto son sustituciones no conservativas, entonces el porcentaje de identidad y similitud serían ambos del 50 %. Si, en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más donde hay sustituciones conservativas, entonces el porcentaje de identidad permanece al 50 %, pero el porcentaje de similitud sería del 75 % ((fracción (15/20)). Por lo tanto, en los casos en que haya sustituciones conservativas, el grado de similitud entre dos polipéptidos será más alto que el porcentaje de identidad entre esos dos polipéptidos.

Las modificaciones conservativas de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (y las modificaciones correspondientes de los nucleótidos codificantes) producirán polipéptidos asociados a ficolina que tienen características funcionales y químicas similares a las de la FAP de origen natural. Por el contrario, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de un polipéptido asociado a ficolina seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que difieren significativamente en su efecto a la hora de mantener (a) la estructura de la cadena principal molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral.

Por ejemplo, una "sustitución de aminoácido conservativa" puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto no nativo de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición. Adicionalmente, cualquier resto nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Supl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, que analizan la mutagénesis de barrido de alanina).

Los expertos en la materia pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) en el momento en que tales sustituciones se desean. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos antes de un polipéptido asociado a ficolina o una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina, o para aumentar o disminuir la afinidad de un polipéptido asociado a ficolina descrito en el presente documento.

Los restos de origen natural pueden dividirse en clases basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) básicos: His, Lys, Arg;

5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del polipéptido asociado a ficolina humana, o en la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina que son homólogos con polipéptidos asociados a ficolina no humanos o en las regiones no homólogas de las moléculas.

Al realizar dichos cambios, puede tenerse en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se comprende en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar y que todavía retengan una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de ±2, aquellos que están dentro de ±1 son particularmente preferidos y aquellos dentro de ±0,5 son incluso más particularmente preferidos.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede efectuarse eficazmente basándose en la hidrofilia, en particular cuando la proteína equivalente biológicamente funcional o el péptido creado de este modo está pensado para su uso en realizaciones inmunológicas, como es el presente caso. La mayor hidrofilia promedio local de una proteína, regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, está correlacionada con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Se han asignado a los restos de aminoácido los siguientes valores de hidrofilidad: arginina (+3,0); lisina (3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (­ 0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Al hacer cambios basándose en valores de hidrofilidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilidad estén dentro de ±2, aquellos que están dentro de ±1 son particularmente preferidos y aquellos dentro de ±0,5 son incluso más particularmente preferidos. También pueden identificarse epítopos de secuencias de aminoácidos primarias basándose en la hidrofilidad. Estas regiones también se denominan "regiones centrales epitópicas".

Un experto en la materia podrá determinar variantes adecuadas del polipéptido como se establece en SEQ ID NO: 1 usando técnicas bien conocidas. Para identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad, un experto en la materia puede dirigirse a áreas que no se cree que sean importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otras especies, un experto en la materia puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido asociado a ficolina o un segundo modulador de la actividad del complemento con dichos polipéptidos similares. Con una comparación tal, pueden identificarse restos y partes de las moléculas que se encuentran conservados entre polipéptidos similares. Se apreciará que es menos probable que los cambios en áreas de un polipéptido asociado a ficolina o de un segundo modulador de la actividad del complemento que no se conserven en relación con dichos polipéptidos similares afecten negativamente a la actividad biológica y/o estructura de la actividad biológica asociada a ficolina. polipéptido o el segundo modulador de la actividad del complemento. Un experto en la materia también sabría que, incluso en regiones relativamente conservadas, pueden sustituirse aminoácidos químicamente similares por los restos de origen natural mientras que se retenga la actividad (sustituciones de restos de aminoácido conservativas). Por lo tanto, incluso las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden estar sujetas a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma desfavorable la estructura del polipéptido.

Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de estructura-función que identifiquen restos en polipéptidos similares que sean importantes para la actividad o la estructura. En vista de una comparación tal, puede predecirse la importancia de los restos de aminoácidos en un polipéptido asociado a ficolina o en un segundo modulador de la actividad del complemento que corresponden a los restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en polipéptidos similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes previstos de polipéptidos asociados a ficolina o segundos moduladores de la actividad del complemento y otros polipéptidos de la invención.

Un experto en la materia también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de tal información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un polipéptido asociado a ficolina o de un segundo modulador de la actividad del complemento con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales en los restos de aminoácido que se predice que están en la superficie de la proteína, dado que tales restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Por otra parte, un experto en la materia puede generar variantes de prueba que contienen una sola sustitución de aminoácido en cada resto de aminoácido deseado. A continuación, las variantes pueden cribarse usando ensayos de actividad como se describe en el presente documento. Dichas variantes pueden usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un resto de aminoácido en particular da como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, las variantes con un cambio tal se evitarían. En otras palabras, basándose en la información recopilada de tales experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde han de evitarse sustituciones adicionales, ya sean solas o en combinación con otras mutaciones.

Se ha dedicado una serie de publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211 -222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Por otra parte, en la actualidad se encuentran disponibles programas informáticos para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas, que tengan una identidad de secuencia mayor del 30 % o una similitud mayor del 40 %, normalmente tienen topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos de estructuras de proteínas (PDB, por sus siglas en inglés) ha proporcionado una predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues en la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dados y que una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural ganará precisión drásticamente.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen el "reconocimiento del plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzymol., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)) y "ligamiento evolutivo" (Véase Home, citado anteriormente y Brenner, citado anteriormente).

La identidad y similitud de polipéptidos relacionados pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad y/o la similitud están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programa informático preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete del programa GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., citado anteriormente). También puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el emparejamiento de tan solo una región corta de las dos secuencias y esta región pequeña alineada puede tener una identidad de secuencia muy elevada, incluso a pesar de que no haya una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, en algunas realizaciones, el método de alineación seleccionado (programa GAP) dará como resultado una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "rango de coincidencias", determinado por el algoritmo). Una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o el número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que generalmente es {fracción (1/10)} veces la penalización por apertura del hueco), así como una matriz de comparación tales como PAM 250 o Bl o Su M 62 se usan junto con el algoritmo. Una matriz de comparación convencional (véase Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup.3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa por el algoritmo.

Los parámetros preferidos para una comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992); Penalización por hueco: 12, Penalización por longitud de hueco: 4, Umbral de similitud: 0.

El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de polipéptidos (junto con ausencia de penalización para huecos finales) que usan el algoritmo de GAP.

Los parámetros preferidos para las comparaciones de secuencias de moléculas de ácido nucleico incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: coincidencias=+10, emparejamiento incorrecto=0, Penalización por hueco: 50, Penalización por longitud de hueco: 3.

El programa GAP es también útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros predeterminados para las comparaciones de moléculas de ácido nucleico.

Pueden usarse otros algoritmos, penalizaciones por apertura de hueco, penalizaciones por extensión de hueco, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc. de ejemplo, incluyendo aquellos expuestos en el Program Manual, Paquete Wisconsin, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares a realizar serán evidentes para los expertos en la materia y dependerán de la comparación específica que se realice, tales como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a a DN; y adicionalmente, si la comparación es entre pares de secuencias dados (en cuyo caso generalmente se prefieren GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).

Preparación de polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos quiméricos de la invención

La invención también se refiere a un método para preparar polipéptidos humanos asociados a Ficolina y otros polipéptidos quiméricos de la invención como se mencionó anteriormente. Los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la invención descritos en el presente documento pueden producirse mediante técnicas de ácidos nucleicos recombinantes. En general, una secuencia de ácido nucleico de FAP de tipo silvestre clonada se modifica para codificar la proteína deseada. Esta secuencia modificada se inserta después en un vector de expresión, que a su vez se transforma o transfecta en células hospedadoras. Las células eucariotas superiores, en particular células de mamífero cultivadas, se prefieren como células hospedadoras. Las secuencias completas de aminoácidos y nucleótidos de la FAP humana se dan por las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos pueden lograrse mediante diversas técnicas. La modificación de la secuencia de ácidos nucleicos puede realizarse mediante mutagénesis específica de sitio. Las técnicas para mutagénesis específica de sitio son bien conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Zoller y Smith (DNA 3:479-488, 1984) o "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, pág. 61-68. Por lo tanto, usando las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de FAP, uno puede introducir la alteración o alteraciones de elección. Asimismo, los procedimientos para preparar una construcción de ADN usando la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos son bien conocidos por los expertos en la materia (consúltese PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EE.UU.).

Los polipéptidos de la presente invención también pueden comprender restos de aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, beta-alanina, desaminohistidina, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios métodos en la técnica para incorporar restos de aminoácidos de origen no natural en polipéptidos. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en donde se suprimen mutaciones sin sentido usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Se conocen en la técnica métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema sin células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles en el mercado. Los polipéptidos se purifican por cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer método, las células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que ha de reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia de aminoácido o aminoácidos no naturales deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora al polipéptido en lugar de su contraparte natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Los restos de aminoácidos de origen natural pueden convertirse en especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida al sitio para ampliar aún más la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

La construcción de ácido nucleico que codifica los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la invención de la invención puede ser adecuadamente de origen genómico o de ADNc, por ejemplo, obtenidos mediante la preparación de una biblioteca genómica o de ADNc y el cribado de secuencias de ADN que codifican todo o parte del polipéptido mediante hibridación usando sondas de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con técnicas convencionales (consúltese Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

La construcción de ácido nucleico que codifica un polipéptido asociado a Ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención también pueden prepararse sintéticamente mediante métodos convencionales establecidos, por ejemplo, el método de la fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869 o el método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. De acuerdo con el método de la fosfoamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores adecuados. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos humanos asociados a Ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención y otros polipéptidos de la invención también pueden prepararse mediante reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos, por ejemplo como se desvela en el documento US 4.683.202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491 o Sambrook et al., anteriormente citado.

Adicionalmente, la construcción de ácido nucleico puede ser de origen sintético y genómico mixto, sintético y ADNc mixto o genómico y ADNc mixto preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), correspondiendo los fragmentos a diversas partes de toda la construcción de ácido nucleico, de acuerdo con las técnicas convencionales.

La construcción de ácido nucleico es preferentemente una construcción de ADN. Las secuencias de ADN para su uso en la producción de polipéptidos asociados a Ficolina, segundos moduladores de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención codificarán normalmente un pre-pro polipéptido en el extremo amino de FAP para obtener el procesamiento y la secreción postraduccionales adecuados de la célula hospedadora.

Las secuencias de ADN que codifican el polipéptido humanos asociado a Ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención generalmente se insertan en un vector recombinante que puede ser cualquier vector, que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedadora en la cual va a introducirse. Por lo tanto, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en una célula hospedadora, se integre en el genoma de la célula hospedadora y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los cuales se ha integrado.

El vector es preferentemente un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica el polipéptido humano asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención están unidas operativamente a segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión deriva de ADN plasmídico o vírico, o puede contener elementos de ambos. La expresión, "operativamente unido" indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en concierto para sus fines previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y avanza a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Los vectores de expresión para su uso en la expresión del polipéptido asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención comprenderán un promotor capaz de dirigir la transcripción de un gen o ADNc clonado. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección y puede derivar de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a la célula hospedadora.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del ADN que codifica el polipéptido humano asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención en células de mamífero son el promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), el ^{promotor de MT-1 (gen de la metalotioneína) (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814), el promotor de} CmV (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) o el promotor tardío principal del adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982).

Un ejemplo de un promotor adecuado para su uso en células de insectos es el promotor de polihedrina (documento US 4.745.051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), el promotor P10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, págs. 765-776), el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis de Autographa californica (documento EP 397 485), el promotor del gen 1 temprano inmediato de baculovirus (documento US 5.155.037; documento US 5.162.222) o el promotor génico temprano retardado del baculovirus 39K (documento US 5.155.037; documento US 5.162.222).

Algunos ejemplos de promotores adecuados para su uso en células hospedadoras de levadura incluyen promotores de genes glucolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434) o genes de alcohol deshidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, Nueva York, 1982), o los promotores TPI1 (documento US 4.599.311) o ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654).

Algunos ejemplos de promotores adecuados para su uso en células hospedadoras de hongos filamentosos son, por ^{ejemplo, el promotor} AdH3 ^{(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) o el promotor tpiA. Algunos ejemplos} de otros promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de A. niger, la alfa-amilasa estable al ácido de A. niger, la glucoamilasa (gluA) de A. niger o A. awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. Se prefieren los promotores de TAKA-amilasa y gluA. Los promotores adecuados se mencionan en, por ejemplo, el documento EP 238023 y el documento EP 383 779.

Las secuencias de ADN que codifican el polipéptido humano asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención también pueden, si es necesario, estar conectadas operativamente a un terminador adecuado, tales como el terminador de la hormona del crecimiento humano (Palmiter et al., Science 222, 1983, pág. 809-814) o los terminadores TPI1 (Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pág. 419-434) o ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pág. 2093-2099). Los vectores de expresión también pueden contener un conjunto de sitios de corte y empalme de ARN ubicados en dirección 3' del promotor y en dirección 5' del sitio de inserción para la propia secuencia FAP. Los sitios de corte y empalme de ARN preferidos pueden obtenerse a partir de genes de adenovirus y/o inmunoglobulina. También está contenida en los vectores de expresión una señal de poliadenilación ubicada en dirección 3' del sitio de inserción. Las señales de poliadenilación particularmente preferidas incluyen la señal de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región Elb del adenovirus 5, el terminador del gen de la hormona del crecimiento humano (DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) o la señal de poliadenilación del gen FAP humano o el gen FAP bovino. Los vectores de expresión también pueden incluir una secuencia líder vírica no codificante, tales como el líder tripartito de adenovirus 2, ubicado entre el promotor y los sitios de corte y empalme de ARN; y secuencias potenciadoras, tales como el potenciador de SV40.

Para dirigir el polipéptido humano asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención en la ruta secretora de las células hospedadoras, puede proporcionarse una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o pre secuencia) en el vector recombinante. La secuencia señal secretora se une a las secuencias de ADN que codifican el polipéptido humano asociado a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento o moléculas quiméricas de la invención en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia señal secretora puede ser que, esté normalmente asociada con la proteína o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.

Para la secreción de células de levadura, la secuencia señal secretora puede codificar cualquier péptido señal, que asegura la dirección eficiente del polipéptido asociado a Ficolina humana expresado, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención en la ruta secretora de la célula. El péptido señal puede ser un péptido señal de origen natural, o una parte funcional del mismo, o puede ser un péptido sintético. Se ha descubierto que los péptidos señal adecuados son el péptido señal del factor alfa (consúltese el documento US 4.870.008), el péptido señal de la amilasa salival de ratón (consúltese O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pág.

643-646), un péptido señal de carboxipeptidasa modificado (consúltese L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pág. 887-897), el péptido señal BAR1 de levadura (consúltese el documento WO 87/02670) o el péptido señal de la proteasa aspártica 3 de levadura (YAP3) (consúltese M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pág. 127-137).

Para una secreción eficiente en levaduras, también puede insertarse una secuencia que codifica un péptido líder en dirección 3' de la secuencia señal y en dirección 5' de la secuencia de ADN que codifica los polipéptidos humanos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención. La función del péptido líder es permitir que el péptido expresado se dirija desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi y además a una vesícula secretora para su secreción en el medio de cultivo (es decir, la exportación de los polipéptidos humanos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención a través de la pared celular o al menos a través de la membrana celular hacia el espacio periplásmico de la célula de levadura). El péptido líder puede ser el líder del factor alfa de levadura (el uso del cual se describe en, por ejemplo, el documento US 4.546.082, el documento US 4.870.008, el documento EP 16 201, el documento EP 123294, el documento EP 123544 y el documento EP 163529). Como alternativa, el péptido líder puede ser un péptido líder sintético, es decir, un péptido líder que no se encuentra en la naturaleza. Los péptidos líderes sintéticos pueden, por ejemplo, construirse como se describe en el documento WO 89/02463 o el documento WO 92/11378.

Para su uso en hongos filamentosos, el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen que codifica una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal deriva preferentemente de un gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la alfa-amilasa neutra de A. niger, la amilasa estable al ácido de A. niger o la glucoamilasa de A. niger. Los péptidos señal adecuados se desvelan en, por ejemplo, el documento EP 238023 y el documento EP 215594.

Para su uso en células de insectos, el péptido señal puede derivar convenientemente de un gen de insecto (consúltese el documento WO 90/05783), tal como el péptido señal precursor de la hormona adipocinética de lepidóptero Manduca sexta (consúltese el documento US 5.023.328).

Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos humanos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal secretora, respectivamente, e insertarlos en vectores adecuados que contengan la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por los expertos en la materia (consúltese, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Los métodos para transfectar células de mamíferos y expresar secuencias de ADN introducidas en las células se describen en, por ejemplo, Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet.

1 (1982), 327 - 341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van der Eb, Virology 52 (1973), 456; y Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

Las secuencias de ADN clonadas se introducen en células de mamífero cultivadas mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) o electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Para identificar y seleccionar células que expresan el ADN exógeno, generalmente se introduce un gen que confiere un fenotipo seleccionable (un marcador seleccionable) en las células junto con el gen o ADNc de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen genes que confieren resistencia a fármacos tales como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es una secuencia de dihidrofolato reductasa (DHFr). Los marcadores seleccionables son revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporado en el presente documento por referencia). El experto en la materia será capaz de elegir fácilmente marcadores seleccionables adecuados.

Pueden introducirse marcadores seleccionables en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o pueden introducirse en el mismo plásmido. Si es en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, esta última disposición produce un mensaje dicistrónico. Las construcciones de este tipo se conocen en la técnica (por ejemplo, Levinson y Simonsen, el documento U.S.4.713.339). También puede ser ventajoso añadir ADN adicional, conocido como "ADN vehículo", a la mezcla que se introduce en las células.

Después de que las células hayan captado el ADN, se cultivan en un medio de crecimiento apropiado, normalmente 1-2 días, para comenzar a expresar el gen de interés. Como se usa en el presente documento, la expresión "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de células y la expresión del polipéptido de interés asociado a Ficolina humana. Los medios incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azúcares esenciales, vitaminas, sal, fosfolípidos, proteínas y factores de crecimiento. A continuación, se aplica la selección de fármacos para seleccionar el crecimiento de células que expresan el marcador seleccionable de forma estable. Para las células que han sido transfectadas con un marcador seleccionable amplificable, la concentración de fármaco puede aumentarse para seleccionar un número mayor de copias de las secuencias clonadas, aumentando de esta manera los niveles de expresión. Después, los clones de células transfectadas de forma estable se seleccionan para determinar la expresión del polipéptido de interés asociado a Ficolina humana.

La célula hospedadora en la cual se introducen las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos humanos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, además de las moléculas quiméricas de la invención, puede ser cualquier célula, que sea capaz de producir los polipéptidos humanos modificados postraduccionales e incluye levaduras, hongos y células eucarióticas superiores.

Algunos ejemplos de líneas celulares de mamíferos para su uso en la presente invención son líneas celulares COS-1 (ATCC c Rl 1650), riñón de cría de hámster (BHK) y 293 (ATCC Cr L 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es la línea celular tk-ts13 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, incorporada por referencia en el presente documento), en lo sucesivo en el presente documento denominadas células BHK 570. La línea celular BHK 570 se ha depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, con el número de registro de ATCC CRL 10314. Una línea celular tk- ts13 BHK también está disponible en la ATCC con el número de registro CRL 1632. Además, pueden usarse diversas otras líneas celulares dentro de la presente invención, incluyendo Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), células CHO (ATCC CCL 61) y DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

Algunos ejemplos de células de levadura adecuadas incluyen células de Saccharomyces spp. o Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Se describen métodos para transformar células de levadura con ADN heterólogo y producir polipéptidos heterólogos a partir de ellas, por ejemplo, en el documento US 4.599.311, el documento US 4.931.373, el documento US 4.870.008, el documento 5.037.743 y el documento US 4.845.075, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Las células transformadas se seleccionan mediante un fenotipo determinado por un marcador seleccionable, comúnmente resistencia a fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente en particular, por ejemplo, leucina. Un vector preferido para su uso en levaduras es el vector POT1 descrito en el documento US 4.931.373. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos humanos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como las moléculas quiméricas de la invención pueden estar precedidas por una secuencia señal y opcionalmente una secuencia líder, por ejemplo, como se describe anteriormente. Algunos ejemplos adicionales de células de levadura adecuadas son cepas de Kluyveromyces, tales como K. lactis, Hansenula, por ejemplo, H. polymorpha o Pichia, por ejemplo, P. pastoris (consúltese Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pág. 3459­ 3465; documento US 4.882.279).

Son ejemplos de otras células fúngicas las células de hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. o Trichoderma spp., en particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. niger. El uso de Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se describe en, por ejemplo, el documento EP 272277, el documento EP 238023, el documento Ep 184438. La transformación de F. oxysporum puede, por ejemplo, llevarse a cabo según lo descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156. La transformación de Trichoderma spp. puede realizarse, por ejemplo, como se describe en el documento EP 244234.

Cuando se usa un hongo filamentoso como la célula hospedadora, puede transformarse con la construcción de ADN de la invención, convenientemente integrando la construcción de ADN en el cromosoma hospedador para obtener una célula hospedadora recombinante. Esta integración se considera generalmente una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de las construcciones de a Dn en el cromosoma del hospedador puede realizarse de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga.

La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos heterólogos en las mismas se puede realizarse como se describe en el documento US 4.745.051; el documento US 4.879.236; el documento US 5.155.037; el documento 5.162.222; el documento EP 397.485), todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. La línea celular de insecto usada como hospedador puede ser adecuadamente una línea celular de Lepidoptera, tales como células de Spodoptera frugiperda o células de Trichoplusia ni (consúltese el documento US 5.077.214). Las condiciones de cultivo pueden ser adecuadamente como se describe en, por ejemplo, el documento WO 89/01029 o el documento WO 89/01028, o cualquiera de las referencias mencionadas anteriormente.

La célula hospedadora transformada o transfectada descrita anteriormente se cultiva después en un medio nutritivo adecuado en condiciones que permitan la expresión del polipéptido asociado a Ficolina humana, después de lo cual se puede recuperar todo o parte del péptido resultante del cultivo. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células hospedadoras, tales como medios mínimos o complejos que contienen suplementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). El polipéptido humano asociado a Ficolina producido por las células puede recuperarse después del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales que incluyen separar las células hospedadoras del medio mediante centrifugación o filtración, precipitar los componentes proteicos del sobrenadante o filtrado por medio de una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, purificación mediante diversos procedimientos cromatográficos, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, o similares, dependiendo del tipo de polipéptido en cuestión.

Puede emplearse tecnología de animales transgénicos para producir los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la invención. Se prefiere producir las proteínas dentro de las glándulas mamarias de un mamífero hembra hospedador. La expresión en la glándula mamaria y la posterior secreción de la proteína de interés en la leche superan muchas dificultades encontradas al aislar proteínas de otras fuentes. La leche se recoge fácilmente, está disponible en grandes cantidades y bioquímicamente bien caracterizada. Adicionalmente, las principales proteínas de la leche están presentes en la leche en altas concentraciones (normalmente de aproximadamente 1 a 15 g/l).

Desde un punto de vista comercial, es claramente preferible usar como un hospedador una especie que tenga una gran producción de leche. Si bien se pueden usar animales más pequeños como ratones y ratas (y se prefieren en la etapa de prueba de principio), se prefiere usar mamíferos de ganado que incluyen, pero no limitados a, cerdos, cabras, ovejas y ganado bovino. Las ovejas son particularmente preferidas debido a factores tales como la historia previa de transgénesis en esta especie, la producción de leche, el coste y la disponibilidad del equipo para recolectar leche de oveja (véase, por ejemplo, el documento WO 88/00239 para una comparación de factores que influyen en la elección de la especie hospedadora). En general, es deseable seleccionar una raza de animal hospedador que haya sido criado para uso lácteo, tales como la oveja de Frisia Oriental, o introducir ganado lechero mediante la reproducción de la línea transgénica en una fecha posterior. En cualquier caso, deben usarse animales de un buen estado de salud conocido.

Para obtener expresión en la glándula mamaria, se usa un promotor de la transcripción de un gen de la proteína de la leche. Los genes de la proteína de la leche incluyen los genes que codifican las caseínas (véase el documento US 5.304.489), la beta lactoglobulina, una lactoalbúmina y proteína ácida del suero. Se prefiere el promotor de beta lactoglobulina (BLG). En el caso del gen de la beta lactoglobulina ovina, generalmente se usará una región de al menos los 406 pb proximales de la secuencia flanqueante 5' del gen, aunque se prefieren porciones más grandes de la secuencia flanqueante 5', hasta aproximadamente 5 kpb, tales como un segmento de ADN de ~4,25 kpb que abarca el promotor flanqueante 5' y la porción no codificante del gen de la beta lactoglobulina (véase Whitelaw etal., Biochem. J. 286: 31 39 (1992)). También son adecuados fragmentos similares de ADN promotor de otras especies.

También pueden incorporarse otras regiones del gen de la beta lactoglobulina en las construcciones, al igual que las regiones genómicas del gen que se va a expresar. Se acepta generalmente en la técnica que las construcciones que carecen de intrones, por ejemplo, expresan peor en comparación con aquellas que contienen tales secuencias de ADN (véase Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 313 (1991); documento WO 89/01343; y documento WO 91/02318, cada uno de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia). A este respecto, se prefiere generalmente, cuando sea posible, usar secuencias genómicas que contengan todos o algunos de los intrones nativos de un gen que codifica la proteína o polipéptido de interés, de esta manera, se prefiere la inclusión adicional de al menos algunos intrones de, por ejemplo, el gen de la beta lactoglobulina. Una de tales regiones es un segmento de ADN que proporciona el corte y empalme de intrones y la poliadenilación del ARN de la región no codificante 3' del gen de la beta lactoglobulina ovina. Cuando se sustituye por las secuencias no codificantes 3' naturales de un gen, este segmento de beta lactoglobulina ovina puede potenciar y estabilizar los niveles de expresión de la proteína o polipéptido de interés. Dentro de otras realizaciones, la región que rodea el ATG de iniciación de la secuencia FAP se reemplaza por las secuencias correspondientes de un gen de proteína específica de la leche. Tal reemplazo proporciona un supuesto entorno de iniciación específico de tejido para mejorar la expresión. Es conveniente reemplazar todas las secuencias no codificantes de FAP pre pro y 5' por las de, por ejemplo, el gen BLG, aunque pueden reemplazarse regiones más pequeñas.

Para la expresión de polipéptidos asociados a Ficolina, el segundo modulador de la actividad del complemento, así como moléculas quiméricas de la invención en animales transgénicos, un segmento de ADN que codifica FAP está operativamente unido a segmentos de ADN adicionales necesarios para que su expresión produzca unidades de expresión. Dichos segmentos adicionales incluyen el promotor mencionado anteriormente, así como secuencias que proporcionan la terminación de la transcripción y poliadenilación del ARNm. Las unidades de expresión incluirán además un segmento de ADN que codifica una secuencia señal secretora unida operativamente al segmento que codifica la FAP modificada. La secuencia señal secretora puede ser una secuencia señal secretora de FAP nativa o puede ser la de otra proteína, tales como una proteína de la leche (véase, por ejemplo, von Heijne, Nucl. Acids Res.

14: 46834690 (1986); y Meade et al., el documento U.S.4.873.316, que se incorporan en el presente documento por referencia).

La construcción de unidades de expresión para su uso en animales transgénicos se lleva a cabo convenientemente insertando una secuencia FAP en un vector de plásmido o fago que contiene los segmentos de ADN adicionales, aunque la unidad de expresión puede construirse esencialmente mediante cualquier secuencia de ligaciones. Es particularmente conveniente proporcionar un vector que contenga un segmento de ADN que codifique una proteína de la leche y reemplazar la secuencia codificante de la proteína de la leche por la de una variante de FAP; creando de esta manera una fusión de genes que incluye las secuencias de control de la expresión del gen de la proteína de la leche. En cualquier caso, la clonación de las unidades de expresión en plásmidos u otros vectores facilita la amplificación de la secuencia FAP. La amplificación se lleva a cabo convenientemente en células hospedadoras bacterianas (por ejemplo, E. coli), por lo tanto, los vectores incluirán normalmente un origen de replicación y un marcador seleccionable funcional en células hospedadoras bacterianas. Después la unidad de expresión se introduce en los huevos fertilizados (incluyendo los embriones en etapa temprana) de la especie hospedadora elegida. La introducción de ADN heterólogo puede lograrse mediante una de varias vías, incluyendo microinyección (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 4.873.191), infección retrovírica (Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988)) o integración dirigida al sitio usando células madre embrionarias (ES) (revisado por Bradley et al., Bio/Technology 10: 534 539 (1992)). Después los huevos se implantan en los oviductos o úteros de hembras pseudopreñadas y se dejan desarrollar hasta el término. La descendencia que lleva el ADN introducido en su línea germinal puede transmitir el ADN a su progenie de la forma normal, mendeliana, permitiendo el desarrollo de rebaños transgénicos. Los procedimientos generales para producir animales transgénicos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); el documento US 4.873.191; el documento US 4.873.316; el documento WO 88/00239, el documento WO 90/05188, el documento WO 92/11757; y el documento GB 87/00458). Las técnicas para introducir secuencias de ADN extrañas en mamíferos y sus células germinales se desarrollaron originalmente en el ratón (véanse, por ejemplo, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science 214: 12441246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell 41: 343345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 44384442 (1985); y Hogan et al. (ibid.)). Estas técnicas se adaptaron posteriormente para su uso con animales más grandes, incluyendo especies de ganado (véanse, por ejemplo, el documento WO 88/00239, el documento WO 90/05188 y el documento WO 92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988)). Para resumir, en la vía más eficiente utilizada hasta la fecha en la generación de ratones o ganado transgénico, Se inyectan varios cientos de moléculas lineales del ADN de interés en uno de los pro núcleos de un óvulo fertilizado de acuerdo con técnicas establecidas. También puede emplearse la inyección de ADN en el citoplasma de un cigoto.

También puede emplearse la producción en plantas transgénicas. La expresión puede ser generalizada o dirigida a un órgano en particular, tales como un tubérculo (véase, Hiatt, Nature 344:469 479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217221 (1990); y el documento EP 0255378).

Purificación de FAP

Los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la invención pueden recuperarse del medio de cultivo celular o de la leche. Los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la presente invención pueden purificarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no limitados a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo (IEF)), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989). Preferentemente, pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos anti-FAP. Puede lograrse una purificación adicional mediante medios de purificación química convencionales, tales como la cromatografía líquida de alta resolución. Otros métodos de purificación, incluyendo precipitación de citrato de bario, se conocen en la técnica y pueden aplicarse a la purificación de los novedosos polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Con fines terapéuticos, se prefiere que los polipéptidos asociados a Ficolina y otros polipéptidos de la invención sean sustancialmente puros. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, los polipéptidos de la invención se purifican hasta al menos aproximadamente un 90 a un 95 % de homogeneidad, preferiblemente hasta al menos aproximadamente un 98 % de homogeneidad. La pureza puede evaluarse, por ejemplo, mediante electroforesis en gel y secuenciación de aminoácidos amino-terminales.

La expresión "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que (1) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales (es decir, contaminantes) con los que está asociado naturalmente. Preferentemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro polipéptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural, que interferirían con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de investigación.

El término "microorganismo" como se usa en el presente documento se refiere a bacterias, hongos, arqueas, protistas; plantas y animales microscópicos (tales como algas verdes o plancton), las planarias y amebas. Se incluyen dentro de esta definición los microorganismos patógenos.

Ensayos

Un procedimiento general para SDS-PAGE y transferencia Western:

La electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 10 % o 4-12 % (p/v) con tampones discontinuos utilizando el sistema NuPAGE® (Invitrogen) según se recomienda por su fabricación. La transferencia Western se realizó utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF-HyBond, GE-healthcare, Hilleroed, Dinamarca, n.° de cat. RPN303F), 2 |jg/ml de anticuerpo monoclonal primario marcado con biotina y visualización secundaria por estreptavidina conjugada con HRP (P0397, Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido a 1:1500 en PBS, Tween20 al 0,05 %. Las membranas se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol al 0,04 % (Sigma-aldrich, Broenby, Dinamarca, n.° de cat. A5754-100G) en acetona y H2O2 al 0,015 % en tampón de acetato sódico 50 mM pH 5.

Coinmunoprecipitación:

Inmunoprecipitación de complejos séricos de lectina de unión a manosa (MBL): 1 ml de suero humano normal se diluyó 1:1 en Tb S (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5) y se incubó de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 jg del anticuerpo monoclonal de ratón específico de MBL Hyb 131-11 (Bioporto, Gentofte, Dinamarca).

Inmunoprecipitación de complejos séricos de Ficolina-2: 0,5 ml de suero humano normal se diluyó 1:1 en TBS (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5) y se incubó de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 jg del anticuerpo monoclonal de ratón específico de Ficolina-2 Hyb 219 (Munthe-Fog L, et al.

Inmunoprecipitación de complejos séricos de Ficolina-3: 0,2 ml de suero humano normal se diluyó 1:1 en TBS (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5) y se incubó de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 jg del anticuerpo monoclonal de ratón específico de Ficolina-3 Hyb 334 (Munthe-Fog L, et al.

La precipitación de inmunocomplejos se llevó a cabo con perlas dynal magnéticas conjugadas con IgG anti-ratón de oveja (Dynal-Invitrogen, n.° de cat. 112.02D): Después de la incubación con suero y anticuerpos primarios (como anteriormente) se añadieron 5x107 perlas dynal magnéticas conjugadas de oveja anti-ratón y se incubaron durante 30 min a 4 °C. Las perlas se separaron magnéticamente y se lavaron tres veces con TBS-tween-Ca2+ (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, tween al 0,05 %, CaCl25 mM, pH 7,5) y finalmente se hirvió en tampón de carga de SDS y se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpo monoclonal marcado con biotina mAb-8B3 (que reacciona con un epítopo en la cadena pesada/cadena A compartida por MASP-1 y -3).

Purificación por inmunoafinidad de FAP: 10 mg de mAb-8B3 (que reacciona con un epítopo en la cadena pesada/cadena A compartida por FAP, MASP-1 y -3) o 10 mg de anticuerpos policlonales anti-FAP de conejo se conjugaron con sefarosa activada con CNBr según lo recomendado por el fabricante (GE-healthcare, Hilleroed, Dinamarca, n.° de cat. 17-0430-01) y se empaquetó en una columna.

Purificación del suero: se diluyeron 150 ml de un conjunto de suero humano normal 1:1 con TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM (Tris 10 mM, NaCl 640 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5) y se cargó en las columnas descritas anteriormente. Las columnas se lavaron con 1 l de TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM y se eluyeron fracciones de 1 ml con glicina-HCl 1 M, pH 2,5 y se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpo monoclonal mAb-8B3 marcado con biotina.

Purificación de FAP recombinante: 2-3 I de sobrenadante de cultivo (de medio libre de suero CHO/Gibco-Invitrogen, n.° de cat. 12651-014) de células de ovario de hámster chino (células CHO) que expresan FAP recombinante (rFAP) se cargó en las columnas de anticuerpos descritas anteriormente. Las columnas se lavaron con 1,5 l de TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM y se eluyeron fracciones de 1 ml con glicina-HCl 1 M, pH 2,5. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie.

Expresión recombinante de FAP: el ADNc de longitud completa insertado en el vector pcDNA5/FRT (Invitrogen, n.° de cat. V6010-20) se compró de Genscript (Genscript, Nueva Jersey, EE.UU.) y se contransfectó con el vector pOG44 (Invitrogen, n.° de cat. V6005-20) en la línea celular CHO Flp-In (Invitrogen, n.° de cat. R758-07) y se seleccionó y se clonó según lo recomendado por el fabricante (Invitrogen). Las células se cultivaron en medio libre de suero de CHO Freestyle (Invitrogen, n.° de cat. 12651-014) y los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron.

Producción de anticuerpos mono y policlonales: Una construcción peptídica (comprada de Genscript, Nueva Jersey, EE.UU.) de los restos 17 C-terminales específicos de FAP se acoplaron a la forma toxoide del tétanos y la difteria usando el método de acoplamiento de cisteína con éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida según lo recomendado por el fabricante (Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois, EE.UU.).

Se inmunizaron tres veces cada uno de seis ratones y dos conejos (con intervalos de 14 días) con 25 |jg de antígeno adsorbido en Al (OH)3 y adyuvante incompleto de Freund. Los títulos de anticuerpos policlonales se evaluaron mediante ELISA con los diferentes péptidos FAP acoplados a una proteína vehículo.

Se recogió antisuero policlonal de conejo (10 ml) 14 días después de la primera, la segunda y la tercera inmunizaciones.

Se usaron dos ratones para la producción de anticuerpos monoclonales. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección intravenosa de 25 jg de antígeno. La fusión se realizó como se describe en otra parte (Kohler, G. y C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497).

Los clones se seleccionaron mediante cribado ELISA diferencial contra péptidos acoplados a diferentes vehículos de proteínas.

Ensayos de complemento funcional: Se usaron sueros con defectos homocigotos de Ficolina-3 y MBL para investigar la función de FAP.

Ensayo Ficolina-3: Unas placas Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, n.° de cat. 439454) se recubrieron con albúmina de suero bovino acetilada a 5 jg/m l durante 12 horas a 4 °C en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,5). Después de bloquear/lavar cuatro veces en tampón barbital/tween (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, pH 7,4 Tween al 0,05 %), se añadió Ficolina-3 humana recombinante a 500 ng/ml de tampón barbital/Tween y se incubó durante 1,5 horas a 20 °C con agitación. Después de lavar las placas dos veces en tampón barbital/tween, FAP recombinante, MASP-1, -2 o -3 humanas como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero se añadieron en diluciones en serie en la 1a dimensión en placas separadas y se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitación. Después de lavar las placas dos veces en tampón barbital/tween, se añadieron sueros deficientes en Ficolina-3 o MASP-2 en diluciones seriadas en la 2a dimensión en las placas y se incubó durante 30 min a 37 °C. Después de lavar las placas cuatro veces en tampón barbital/tween, se midió la deposición del factor del complemento C4 mediante incubación durante 1 hora a 20 °C con anticuerpos policlonales de conejo contra C4c humano (Dako, Glostrup, Dinamarca n.° de cat. Q0369) diluido a 1:2000, seguido de cuatro etapas de lavado e incubación con anticuerpos anticonejo de cerdo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako, Glostrup, Dinamarca, n.° de cat. P0399) durante 45 min a 20 °C. La señal se obtuvo mediante las placas que se desarrollaron con 100 jl/pocillo de Orto-fenilendiamina (OPD) (0,4 mg/ml) disuelta en tampón citrato (ácido cítrico 35 mM, Na2PO4 65 mM, pH 5) con H2O20,12 %o (v/v). La reacción enzimática se detuvo con H2SO41 M y los niveles de densidad óptica (DO) se midieron a 490 nm-650 nm usando un lector cinético V-max (Molecular Devices).

Ensayo de lectina de unión a manosa: Unas placas Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, n.° de cat. 439454) se recubrieron con manano (Sigma-aldrich, Broenby, Dinamarca, n.° de cat. M7504-1G) a 10 jg/m l durante 12 horas a 4 °C en tampón de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, pH 9,5). Después de bloquear/lavar cuatro veces en tampón barbital/tween (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, pH 7,4 Tween al 0,05 %) se añadió lectina de unión a manosa humana recombinante de a 0,5 jg/m l de tampón barbital/tween y se incubó durante 1,5 horas a 20 °C con agitación. Después de lavar las placas dos veces en tampón barbital/tween, FAP recombinante, MASP-1, -2 o -3 humanas como sobrenadantes de cultivo de medio libre de suero se añadieron en diluciones en serie en la 1a dimensión en placas separadas y se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitación. Después de lavar las placas dos veces en tampón barbital/tween, se añadieron sueros deficientes en MBL o MASP-2 en diluciones seriadas en la 2a dimensión en las placas y se incubó durante 45 min a 37 °C. Después de lavar las placas cuatro veces en tampón barbital/tween, se midió la deposición del factor del complemento C4 mediante incubación durante 1 hora a 20 °C con anticuerpos policlonales de conejo contra C4c humano (Dako, Glostrup, Dinamarca n.° de cat. Q0369) diluido a 1:2000, seguido de cuatro etapas de lavado e incubación con anticuerpos anticonejo de cerdo conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako, Glostrup, Dinamarca, n.° de cat. P0399) durante 45 min a 20 °C. La señal se obtuvo mediante las placas que se desarrollaron con 100 jl/pocillo de Orto-fenilendiamina (OPD) (0,4 mg/ml) disuelta en tampón citrato (ácido cítrico 35 mM, Na2PO465 mM, pH 5) con H2O20,12 % (v/v). La reacción enzimática se detuvo con H2SO41 M y los niveles de densidad óptica (DO) se midieron a 490 nm-650 nm usando un lector cinético V-max (Molecular Devices).

Ensayo de genotipado: Pueden realizarse diferentes ensayos de genotipado donde el genotipo se determina en individuos usando ensayos biológicos. Podrían usarse diferentes tipos de ensayos tales como:

• Métodos basados en hibridación

o Hibridación dinámica específica de alelos

o Balizas moleculares

o Micromatrices de SNP

• Métodos basados en enzimas

o Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

o métodos basados en PCR

o Endonucleasa Flap

o Extensión de cebador

o 5'- nucleasa

o Ensayo de ligasa de oligonucleótidos

• Otros métodos de post-amplificación basados en propiedades físicas del ADN

o Polimorfismo de conformación monocatenario

o Electroforesis en gel de gradiente de temperatura

o Cromatografía líquida desnaturalizante de alta resolución

o Fusión de alta resolución de todo el amplicón

o SNPlex

• Secuenciación

Administración y composiciones farmacéuticas

Tratamientos de combinación

El polipéptido asociado a ficolina como se define en la presente memoria descriptiva puede administrarse simultánea o secuencialmente con una o más proteínas seleccionadas de Ficolina-1,2, 3 y lectina de unión a manosa (MBL). Los factores pueden suministrarse en forma de dosis única en donde la forma de dosis única contiene ambos compuestos, o en forma de un kit de partes que comprende una preparación de un polipéptido asociado a ficolina como una primera forma de dosis unitaria y una preparación del uno o más de otros compuestos como una segunda forma de dosificación unitaria. Siempre que una primera, segunda o tercera, etc., dosis unitaria se mencione a lo largo de esta memoria descriptiva esto no indica el orden de administración preferido, sino que se hace meramente por fines de conveniencia.

Por dosificación "simultánea" de una preparación de un polipéptido asociado a ficolina y una preparación de uno o más de otros compuestos se entiende la administración de los compuestos en forma de dosificación única, o la administración de un primer agente seguida de la administración de un segundo agente con un separación de tiempo de no más de 15 minutos, preferentemente 10, más preferido 5, más preferido 2 minutos. Cualquiera de los dos factores puede administrarse primero.

Por dosificación "secuencial" se entiende la administración de un primer agente seguida de la administración de un segundo agente con una separación de tiempo de más de 15 minutos. Cualquiera de las dos formas de dosificación unitarias puede administrarse primero. Preferentemente, ambos productos se inyectan a través del mismo acceso intravenoso.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido asociado a ficolina que está presente en una concentración de suero/plasma de 0 mg/ml a 1 mg/ml y en donde la formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además un sistema tampón, conservante o conservantes, agente o agentes de tonicidad, agente o agentes quelantes, estabilizantes y tensioactivos. En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, formulación que comprende agua. Esta formulación es normalmente una solución o una suspensión. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. La expresión "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos el 50 % p/p de agua. Asimismo, la expresión "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos el 50 % p/p de agua y la expresión "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos el 50 % p/p de agua.

En otras realizaciones la formulación farmacéutica es una formulación secada por congelación, a lo que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

En otras realizaciones, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, secada por congelación o secada por pulverización) lista para su uso sin disolución previa.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una solución acuosa de un polipéptido asociado a ficolina y un tampón, en donde el polipéptido asociado a ficolina está presente en una concentración de suero/plasma de 0-1 mg/ml o superior y en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

En otras realizaciones de la invención el pH de la formulación se selecciona de la lista que consiste en 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1,9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0.

En una realización adicional de la invención el tampón se selecciona del grupo que consiste en acetato sódico, carbonato sódico, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato sódico, hidrogenofosfato disódico, fosfato sódico y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional de la invención el conservante se selecciona del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, phidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato sódico, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenosina (3p-clorofenoxipropan-1,2-diol) o mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En una realización adicional de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En una realización adicional de la invención el conservante está presente en una concentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En una realización adicional de la invención el conservante está presente en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una realización adicional de la invención la formulación comprende además un agente isotónico. En una realización adicional de la invención, el agente isotónico se selecciona del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro sódico), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400), o mezclas de los mismos. Puede usarse cualquier azúcar tales como mono-, di-, o polisacáridos, o glucanos hidrosolubles, incluyendo por ejemplo fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa-Na. En algunas realizaciones, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En algunas realizaciones el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. No hay un límite fijo para la cantidad usada, siempre que el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y no afecte negativamente a los efectos estabilizantes conseguidos usando los métodos de la invención. En algunas realizaciones, la concentración de azúcar o alcohol de azúcar está entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes isotónicos específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una realización adicional de la invención la formulación comprende además un agente quelante. En una realización adicional de la invención el agente quelante se selecciona de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico y mezclas de los mismos. En una realización adicional de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. En una realización adicional de la invención el agente quelante está presente en una concentración de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una realización adicional de la invención la formulación comprende además un estabilizante. El uso de un estabilizante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

Más particularmente, las composiciones de la invención son composiciones farmacéuticas líquidas estabilizadas cuyos componentes terapéuticamente activos incluyen un polipéptido que posiblemente exhibe formación de agregados durante el almacenamiento en formulaciones farmacéuticas líquidas. Por "formación de agregados" se entiende una interacción física entre las moléculas polipeptídicas que da como resultado la formación de oligómeros, que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan de la solución. Por "durante el almacenamiento" se entiende una composición o formulación farmacéutica líquida una vez preparada, no se administra inmediatamente a un sujeto. Más bien, después de la preparación, se empaqueta para su almacenamiento, ya sea en forma líquida, en estado congelado o en forma seca para su posterior reconstitución en forma líquida u otra forma adecuada para la administración a un sujeto. Por "forma seca" se entiende que la composición o formulación farmacéutica líquida se seca por congelación (es decir, liofilización; véase, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol.

38:48-59), secado por pulverización (véase Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (5a ed; Longman Scientific and Technical, Essez, RU), pág. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20) o secado al aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, dando como resultado la pérdida de la efectividad terapéutica de la composición farmacéutica. Adicionalmente, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como el bloqueo de tubos, membranas o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene polipéptido se administra usando un sistema de infusión.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además una cantidad de una base de aminoácidos suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la composición. Por "base de aminoácidos" se entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, donde cualquier aminoácido dado está presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal, o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre mientras que otros están presentes en sus formas de sal. En algunas realizaciones, los aminoácidos para su uso en la preparación de las composiciones de la invención son los que llevan una cadena lateral cargada, tales como arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier estereoisómero (es decir, isómero L, D o DL) de un aminoácido en particular (por ejemplo, glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina y mezclas de las mismas) o combinaciones de estos estereoisómeros, puede estar presente en las composiciones farmacéuticas de la invención siempre que el aminoácido particular esté presente en su forma de base libre o en su forma de sal. En algunas realizaciones se usa el estereoisómero L. Las composiciones de la invención también pueden formularse con análogos de estos aminoácidos. Por "análogo de aminoácido" se entiende un derivado del aminoácido natural que produce el efecto deseado de disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención. Los análogos de arginina adecuados incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil L-arginina, los análogos de metionina adecuados incluyen etionina y butionina y los análogos de cisteína adecuados incluyen S-metil-L cisteína. Al igual que con los otros aminoácidos, los análogos de aminoácidos se incorporan a las composiciones en su forma de base libre o en su forma de sal. En una realización adicional de la invención, los aminoácidos o análogos de aminoácidos se usan en una concentración, que es suficiente para prevenir o retrasar la agregación de la proteína.

En una realización adicional de la invención puede añadirse metionina (u otros aminoácidos sulfúricos o análogos de aminoácidos) para inhibir la oxidación de restos de metionina a sulfóxido de metionina cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un resto de metionina susceptible a tal oxidación. Por "inhibir" se entiende la acumulación mínima de especies oxidadas con metionina a lo largo del tiempo. La inhibición de la oxidación de la metionina da como resultado una mayor retención del polipéptido en su forma molecular ^{adecuada. Puede usarse cualquier estereoisómero de metionina (isómero L, D o} Dl) ^{o combinaciones de los mismos.} La cantidad a añadir debe ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los restos de metionina de manera que la cantidad de sulfóxido de metionina sea aceptable para las agencias reguladoras. Normalmente, esto significa que la composición no contenga más de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 30 % de sulfóxido de metionina. Generalmente, esto puede lograrse añadiendo metionina de manera que la proporción de metionina añadida a los restos de metionina varíe de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1, tales como 10:1 a aproximadamente 100:1.

En una realización adicional de la invención, la formulación comprende además un estabilizante seleccionado del grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. En una realización adicional de la invención, el estabilizante se selecciona de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulosa o derivados de los mismos (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol y diferentes sales (por ejemplo, cloruro sódico). Cada uno de estos estabilizantes específicos constituye una realización alternativa de la invención.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes estabilizantes adicionales, que mejoran aún más la estabilidad de un polipéptido terapéuticamente activo en las mismas. Los agentes estabilizantes de particular interés para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, metionina y EDTA, que protegen el polipéptido contra la oxidación de metionina, y un tensioactivo no iónico, que protege el polipéptido contra la agregación asociada con la congelación-descongelación o el cizallamiento mecánico.

En una realización adicional de la invención la formulación comprende además un tensoactivo. En una realización adicional de la invención, el tensioactivo se selecciona de un detergente, aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres de ácidos grasos de sorbitano, polímeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo, poloxámeros tales como Pluronic® F68, poloxámero 188 y 407, Triton X-100), ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, polioxietileno y derivados de polietileno tales como derivados alquilados y alcoxilados (tweens, por ejemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 y Brij-35), monoglicéridos o derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados de polioxietileno de los mismos, alcoholes, glicerol, lectinas y fosfolípidos (por ejemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidil glicerol y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por ejemplo, ácido dipalmitoil fosfatídico) y lisofosfolípidos (por ejemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina y 1-acil-sn-glicero-3-fosfato ésteres de etanolamina, colina, serina o treonina) y alquilo, derivados alcoxilo (alquil éster), alcoxi (alquil éter)- de lisofosfatidil y fosfatidilcolinas, por ejemplo, derivados de lauroílo y miristoílo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y modificaciones del grupo de la cabeza polar, esto es colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol y los DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP cargados positivamente, lisofosfatidilserina y lisofosfatidil treonina y glicerofosfolípidos (por ejemplo, cefalinas), gliceroglicolípidos (por ejemplo, galactopiranósido), esfingoglicolípidos (por ejemplo, ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados del ácido fusídico (por ejemplo, tauro-dihidrofusidato sódico, etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales del mismo C6-C12 (por ejemplo, ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivados, derivados Na-acilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina, derivados Na-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina y un aminoácido neutro o ácido, derivado Na-acilado de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato sódico, n.° de registro CAS [577-11-7]), docusato cálcico, n.° de registro CAS [128-49-4]), docusato potásico, n.° de registro CAS [7491-09-0]), SDS (dodecilsulfato sódico o laurilsulfato sódico), caprilato sódico, ácido cólico o derivados del mismo, ácidos biliares y sales de los mismos y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato sódico, desoxicolato sódico, taurocolato sódico, glicocolato sódico, N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, tensioactivos monovalentes aniónicos (alquil-aril-sulfonatos), tensioactivos zwitteriónicos (por ejemplo, N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propanosulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamonio-1-propanosulfonato, tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternario) (por ejemplo, bromuro de cetil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), tensioactivos no iónicos (por ejemplo, dodecil p-D-glucopiranósido), poloxaminas (por ejemplo, Tetronic's), que son copolímeros de bloques tetrafuncionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilendiamina, o el tensioactivo puede seleccionarse del grupo de derivados de imidazolina o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tensioactivos específicos constituye una realización alternativa de la invención.

El uso de un tensioactivo en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en la formulación farmacéutica de péptidos de la presente invención. Dichos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina humana, gelatina o proteínas) y un zwiterión (por ejemplo, un aminoácido tales como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tales ingredientes adicionales, por supuesto, no debería afectar negativamente a la estabilidad global de la formulación farmacéutica de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido asociado a ficolina de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento en varios sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, sitios de piel y mucosas, en sitios que derivan la absorción, por ejemplo, administración en una arteria, en una vena, en el corazón y en los sitios que implican absorción, por ejemplo, administración en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

En algunas realizaciones, la composición de acuerdo con la invención es adecuada para administración intraocular, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intratraqueal o por inhalación.

La administración tópica puede ser una ventaja particular en el tratamiento de afecciones asociadas a la inflamación local, tales como en el tratamiento de la inflamación asociada a quemaduras u otras afecciones asociadas con la piel. En consecuencia, en algunas realizaciones, la administración es por administración tópica.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad que implica inflamación local. En algunas realizaciones particulares, pueden usarse las gotitas oculares en afecciones asociadas al ojo, tales como la queratitis, tales como la queratitis lamelar difusa (DLK).

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad asociada a drusas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un método de tratamiento (tales como reducir, retrasar, eliminar o prevenir) la formación de drusas, inflamación, pérdida de células fotorreceptoras, agudeza visual o campo visual y/o neovascularización coroidea (NVC) en el ojo de un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición que comprende una molécula quimérica de acuerdo con la invención.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar no implica la ruta clásica del complemento.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar está relacionada con la degeneración macular (tales como la degeneración macular relacionada con la edad o AMD).

La administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser a través de varias vías de administración, por ejemplo, lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estómago y el intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a través de los bronquiolos y alveolos o una combinación de los mismos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a través de la conjuntiva, uretal y parenteral a pacientes que necesiten dicho tratamiento.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en varias formas de dosificación, por ejemplo, como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsión múltiple, espumas, bálsamos, pastas, apósitos, pomadas, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, pulverizadores, polvo, aerosoles, inhalantes, colirios, pomadas oftálmicas, enjuagues oftálmicos, óvulos vaginales, anillos vaginales, pomadas vaginales, solución para inyección, soluciones de transformación in situ, por ejemplo gelificación in situ, ajuste in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución de infusión e implantes.

Las composiciones de la invención pueden combinarse en o unirse a, por ejemplo a través de interacciones covalentes, hidrófobas y electrostáticas, un vehículo de fármacos, un sistema de administración de fármacos y un sistema avanzado de administración de fármacos para mejorar aún más la estabilidad del polipéptido asociado a ficolina, aumentar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr una cronoterapia bien conocida por los expertos en la materia y aumentar el cumplimiento del paciente o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de vehículos, sistemas de administración de fármacos y sistemas avanzados de administración de fármacos incluyen, pero no se limitan a, polímeros, por ejemplo celulosa y derivados, polisacáridos, por ejemplo dextrano y derivados, almidón y derivados, poli(alcohol vinílico), polímeros de acrilato y metacrilato, ácido poliláctico y poliglicólico y copolímeros de bloque de los mismos, polietilenglicoles, proteínas vehículo, por ejemplo albúmina, geles, por ejemplo, sistemas termogelificantes, por ejemplo, sistemas copoliméricos de bloques bien conocidos por los expertos en la materia, micelas, liposomas, microesferas, nanopartículas, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de la misma, bien conocidos por los expertos en la técnica del comportamiento de fases en sistemas lípido-agua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, autoemulsionante, auto-microemulsionante, ciclodextrinas y derivados de las mismas y dendrímeros.

Las composiciones de la presente invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvo y soluciones para la administración pulmonar del polipéptido asociado a ficolina, usando, por ejemplo, un inhalador de dosis medida, un inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos dispositivos bien conocidos por los expertos en la materia.

Las composiciones de la presente invención son específicamente útiles en la formulación de sistemas de administración de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta. Más específicamente, pero no limitados a, las composiciones son útiles en la formulación de sistemas de liberación parenteral controlada y liberación sostenida (ambos sistemas conducen a una reducción de muchas veces en el número de administraciones), bien conocidos por el experto en la materia. Incluso más preferentemente, son sistemas de liberación controlada y liberación sostenida administrados por vía subcutánea. Sin limitar el alcance de la invención, algunos ejemplos de composiciones y sistemas de liberación controlada útiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

Los métodos para producir sistemas de liberación controlada útiles para las composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cristalización, condensación, co-cristalización, precipitación, coprecipitación, emulsión, dispersión, homogeneización a alta presión, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación del disolvente para producir microesferas, extrusión y procesos de fluidos supercríticos. Se hace referencia general a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000).

La administración parenteral puede realizarse por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringuilla, opcionalmente una jeringuilla con forma de bolígrafo. Como alternativa, la administración parenteral puede realizarse mediante una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser una solución o suspensión para la administración del polipéptido asociado a ficolina en forma de aerosol nasal o pulmonar. Como una opción adicional, las composiciones farmacéuticas que contienen el polipéptido asociado a ficolina de la invención también pueden adaptarse a la administración transdérmica, por ejemplo, mediante inyección sin aguja o con un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosa, por ejemplo, bucal.

La expresión "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con estabilidad física aumentada, estabilidad química aumentada o estabilidad física y química aumentada.

La expresión "estabilidad física" de la formulación de proteína como se usa en este documento se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a tensiones termomecánicas y/o interacción con interfaces y superficies que se desestabilizan, tales como superficies e interfaces hidrófobas. La estabilidad física de las formulaciones de proteínas acuosas se evalúa mediante inspección visual y/o mediciones de turbidez después de exponer la formulación cargada en recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o viales) a estrés mecánico/físico (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos períodos de tiempo. La inspección visual de las formulaciones se realiza con una luz enfocada nítida con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza por una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo, en una escala de 0 a 3 (una formulación que no muestra turbidez corresponde a una puntuación visual de 0, y una formulación que muestra turbidez visual a la luz del día corresponde a una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica como físicamente inestable con respecto a la agregación de proteínas, cuando muestra turbidez visual a la luz del día. Como alternativa, la turbidez de la formulación puede evaluarse mediante mediciones de turbidez sencillas bien conocidas por los expertos. La estabilidad física de las formulaciones de proteínas acuosas también puede evaluarse usando un agente espectroscópico o una sonda del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferentemente una molécula pequeña que se une preferentemente a un confórmero no nativo de la proteína. Un ejemplo de una pequeña sonda espectroscópica molecular de estructura proteica es la Tioflavina T. La tioflavina T es un colorante fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas, y quizás también de otras configuraciones de proteínas, la tioflavina T da lugar a un nuevo máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y una emisión mejorada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de proteína fibrilar. La tioflavina T no unida es esencialmente no fluorescente en las longitudes de onda.

Pueden usarse otras moléculas pequeñas como sondas de los cambios en la estructura de la proteína desde estados nativos a no nativos. Por ejemplo, las sondas de "parche hidrófobo" que se unen preferentemente a parches hidrófobos expuestos de una proteína. Los parches hidrofóbicos están generalmente enterrados dentro de la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo, pero quedan expuestos cuando una proteína comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Algunos ejemplos de estas sondas moleculares pequeñas espectroscópicas son tintes aromáticos hidrófobos, tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas espectroscópicas son complejos de metal-aminoácido, tales como complejos de cobalto metálico de aminoácidos hidrófobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina, o similares.

La expresión "estabilidad química" de la formulación de proteína como se usa en el presente documento se refiere a cambios químicos covalentes en la estructura de la proteína que conducen a la formación de productos de degradación química con potencial menor potencia biológica y/o potencial aumento de propiedades inmunogénicas en comparación con la estructura de proteína nativa. Pueden formarse diversos productos de degradación química dependiendo del tipo y la naturaleza de la proteína nativa y del entorno al que está expuesta la proteína. Lo más probable es que la eliminación de la degradación química no pueda evitarse por completo y, a menudo, se observan cantidades crecientes de productos de degradación química durante el almacenamiento y el uso de la formulación de proteínas, como bien conoce el experto en la materia. La mayoría de las proteínas son propensas a la desamidación, un proceso en el que el grupo amida de cadena lateral en los restos de glutaminilo o asparaginilo se hidroliza para formar un ácido carboxílico libre. Otras rutas de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular en los que dos o más moléculas de proteínas se unen covalentemente entre sí mediante transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de dímeros unidos covalentemente, productos de degradación de oligómeros y polímeros (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. y Manning M.C., Plenum Press, Nueva York 1992). La oxidación (de, por ejemplo, restos de metionina) puede mencionarse como otra variante de degradación química. La estabilidad química de la formulación de proteína puede evaluarse midiendo la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos de tiempo después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (la formación de productos de degradación a menudo puede acelerarse, por ejemplo, aumentando la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina mediante la separación de los productos de degradación dependiendo del tamaño de la molécula y/o la carga usando diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC).

Por tanto, como se indica anteriormente, una "formulación estabilizada" se refiere a una formulación con estabilidad física aumentada, estabilidad química aumentada o estabilidad física y química aumentada. En general, una formulación debe ser estable durante su uso y almacenamiento (de acuerdo con las condiciones de uso y almacenamiento recomendadas) hasta que se alcance la fecha de caducidad.

En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido asociado a ficolina es estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento. En otras realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido asociado a ficolina es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido asociado a ficolina es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento. En una realización más adicional de la invención, la formulación farmacéutica que comprende el polipéptido asociado a ficolina es estable durante más de 2 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.

Los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para el tratamiento de determinadas enfermedades renales, tales como la glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II (MPGN II), síndrome urémico hemolítico (SUH), nefritis lúpica.

Los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención se usa para el tratamiento de la isquemia por reperfusión (incluyendo, por ejemplo, isquemia por reperfusión renal e isquemia por reperfusión intestinal).

También se proporcionan métodos para tratar los rechazos de trasplantes de órganos. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para retrasar el inicio del rechazo vascular agudo (tal como el rechazo de un trasplante de corazón mediado por anticuerpos), o para mejorar la supervivencia del trasplante de órganos en un individuo mediante la administración de una molécula quimérica de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para mejorar la supervivencia del trasplante de órganos en un individuo, el método comprende perfundir el órgano a trasplantar a un individuo con una composición que comprende una molécula quimérica de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para mejorar la supervivencia de un donante de trasplante de órganos, que comprende administrar al individuo donante de trasplante de órganos una cantidad eficaz de una composición que comprende una molécula quimérica de acuerdo con la presente invención.

Realizaciones específicas de la invención: Como se describió anteriormente, la presente invención se refiere a moléculas quiméricas de un polipéptido asociado a ficolina que comprende un polipéptido asociado a ficolina y un segundo modulador de la actividad del complemento.

En algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento es un inhibidor de la activación del complemento.

En algunas realizaciones el inhibidor de la activación del complemento se selecciona de la lista que consiste en Factor H (FH), GAS6, Proteína S, inhibidor de C1 (C1-inh), proteína de unión del componente 4 del complemento (C4bp), Factor I (FI), CR1, DAF (CD55), CD59, CR2 o un fragmento funcional de los mismos.

En algunas realizaciones, el inhibidor de la activación del complemento es un péptido sintético inhibidor, tales como compstatina con una secuencia de ICVVQDWGHHRCT, en donde Thr-13 es una amida C-terminal y C2 y C12 forman un puente disulfuro.

En algunas realizaciones, el inhibidor de la activación del complemento es una proteína de evasión microbiana, tales como una cualquiera seleccionada de la lista que consiste en Proteína de unión al fibrinógeno extracelular (Efb), Proteína similar a superantígeno estafilocócico-7 (SSL-7), Inhibidor del complemento de Staphylococcus (SCIN), Proteína que tri-abarca el receptor de C2 del complemento (CRIT) y la proteína inhibidora de la quimiotaxis de Staphylococcus aureus (CHIPS).

En algunas realizaciones, el inhibidor de la activación del complemento es una proteína de evasión microbiana seleccionada de la tabla 1 derivada de JD Lambris, D Ricklin, BV Geisbrecht "Complement evasion by human pathogens" - Nature Reviews Microbiology, feb de 2008, Vol. 6, página 132 cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia.

Tabla 1:

(continuación)

(continuación)

En algunas realizaciones el inhibidor de la activación del complemento es el factor H, o un fragmento funcional del mismo. En algunas realizaciones el Factor H, o un fragmento funcional del mismo, comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR del Factor H.

En algunas realizaciones el segundo modulador de la actividad del complemento es una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma. En algunas realizaciones la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma se selecciona del componente Fc de la IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 humana.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina es capaz de asociarse con la lectina de unión a manosa (MBL).

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina es capaz de asociarse con una cualquiera de ficolina-1, ficolina-2 o ficolina-3.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina es capaz de asociarse con uno cualquiera de C1q, proteínas tensioactivas pulmonares SP-A y/o SP-D y moléculas de defensa intracelulares similares al colágeno, tales como CLL-11.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina es capaz de asociarse a una proteína aceptora específica, tales como un receptor específico.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos 20-297 de SEQ ID NO: 3 o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos 20-380 de SEQ ID NO: 1 o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos 16-296 de SEQ ID NO: 9 o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina tiene una masa molecular de aproximadamente 40 kDa en condiciones no reductoras en una SDS-PAGE.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina está glucosilado enlazado a N en uno o dos aminoácidos correspondientes a una posición seleccionada entre 49 y 178 de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina es una proteína recombinante.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina está en forma de homodímero.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina consiste en la secuencia de aminoácidos 20-380 de SEQ ID NO 1.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o variantes o fragmentos inmunológicos de la misma.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención media la fagocitosis de células moribundas o muertas, tales como células apoptóticas y/o restos celulares.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención media la fagocitosis de un microorganismo.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina tiene actividad similar a otras proteínas con homología de secuencia, tales como la proteína adaptadora de engullimiento (GULP).

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento se fusionan directa o indirectamente entre sí en forma de una proteína de fusión.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento se unen mediante un reticulante químico.

En algunas realizaciones el polipéptido asociado a ficolina y el segundo modulador de la actividad del complemento están unidos no covalentemente.

En algunas realizaciones la célula hospedadora de acuerdo con la presente invención es una célula eucariota.

En algunas realizaciones la célula hospedadora de acuerdo con la presente invención es de origen mamífero.

En algunas realizaciones la célula hospedadora de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en células CHO, células HEK y células BHK.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de cualquier indicación asociada a la inflamación, la apoptosis y/o la autoinmunidad.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de cualquier afección autoinmune tales como enfermedad de Addison, anemia hemolítica autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barre, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis por lupus, esclerosis múltiple, miastenia grave, psoriasis, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide y uveítis, asma, ateroesclerosis, diabetes de tipo I, psoriasis, diversas alergias.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de cualquier trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en apendicitis, úlcera péptica, úlcera gástrica, úlcera duodenal, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerosa, colitis pseudomembranosa, colitis aguda, colitis isquémica, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis, enfermedad de Whipple, alergia, enfermedad del complejo inmunitario, isquemia de órganos, lesión por reperfusión, necrosis de órganos, fiebre del heno, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatosis, sarcoidosis, aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, neumonitis, enfermedad pulmonar producida por la intoxicación de sílice o al respirar ceniza de un volcán, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía, sinusitis, gripe, infección por el virus sincicial respiratorio, infección por VIH, infección por el virus de la hepatitis B, infección por el virus de la hepatitis C, bacteremia diseminada, dengue, candidiasis, paludismo, filariasis, amebiasis, quistes hidatídicos, quemaduras, dermatitis, dermatomiositis, quemadura solar, urticaria, verrugas, ronchas, vasculitis, angeítis, endocarditis, arteritis, ateroesclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocárdica, periarteritis nodosa, fiebre reumática, enfermedad de Alzheimer, enfermedad celíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de la dificultad respiratoria en adultos, meningitis, encefalitis, esclerosis múltiple, infarto cerebral, embolia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, sinovitis, miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjertos, enfermedad del injerto contra hospedador, diabetes de tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, síndrome de Reiter y enfermedad de Hodgkin, queratitis, diabetes tipo 2, fibrosis quística, infarto de miocardio, lesión por reperfusión, ictus, dermatomiositis, síndrome metabólico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, sepsis, insuficiencia multiorgánica, coagulación intravascular diseminada, choque anafiláctico. Complicación vascular y nefropatía asociada a diabetes tipo 1 y/o tipo 2, meningitis, septicemia bacteriana, malaria complicada, síndrome urémico hemolítico atípico, síndrome urémico hemolítico, degeneración macular relacionada con la edad, hemoglobinuria paroxística nocturna, mordedura de veneno de serpiente, lesión por quemaduras y complicaciones de los trasplantes de órganos.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de cualquier trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en isquemia de órganos, lesión por reperfusión, necrosis de órganos, vasculitis, endocarditis, ateroesclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocárdica, periarteritis nodosa, fiebre reumática, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de la dificultad respiratoria en adultos, infarto cerebral, embolia cerebral. Complicaciones vasculares y nefropatía asociada a diabetes tipo 1 y/o tipo 2.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de cualquier indicación asociada a la coagulación, enfermedades relacionadas trombóticas o coagulopáticas.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de una indicación asociada a la coagulación, enfermedades o trastornos trombóticos o coagulopáticos que incluyen respuesta inflamatoria y enfermedades o trastornos tromboembólicos crónicos asociados a la formación de fibrina que incluyen trastornos vasculares tales como trombosis, tales como trombosis venosa profunda, trombosis arterial, trombosis postquirúrgica, injerto de derivación de arteria coronaria (CABG), angioplastia coronaria transdérmica percutánea (ACTP), apoplejía por deposición de plaquetas, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, angiogénesis, trombolisis, ateroesclerosis, reestenosis, tales como arteriosclerosis y/o reestenosis después de angioplastia, indicaciones agudas y crónicas tales como inflamación, sepsis, choque séptico, septicemia, hipotensión, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (ARDS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), coagulación intravascular diseminada (CID), embolia pulmonar, deposición patológica de plaquetas, infarto de miocardio o el tratamiento profiláctico de mamíferos con vasos ateroscleróticos en riesgo de trombosis, enfermedad venooclusiva después de un trasplante de células progenitoras de sangre periférica (PBPC), síndrome urémico hemolítico (SUH) y púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y fiebre reumática.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de una indicación asociada a la coagulación, enfermedades o trastornos trombóticos o coagulopáticos que incluyen respuesta inflamatoria y enfermedades o trastornos tromboembólicos crónicos asociados a la formación de fibrina que incluyen trastornos vasculares tales como trombosis, tales como trombosis venosa profunda, trombosis arterial, trombosis postquirúrgica, injerto de derivación de arteria coronaria (CABG), angioplastia coronaria transdérmica percutánea (ACTP), apoplejía por deposición de plaquetas, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, angiogénesis, trombolisis, ateroesclerosis, reestenosis, tales como arteriosclerosis y/o reestenosis después de angioplastia, indicaciones agudas y crónicas tales como inflamación, deposición patológica de plaquetas, infarto de miocardio o el tratamiento profiláctico de mamíferos con vasos ateroscleróticos en riesgo de trombosis, enfermedad venooclusiva después de un trasplante de células progenitoras de sangre periférica (PBPC), síndrome urémico hemolítico (SUH) y púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y fiebre reumática.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para prevenir la aparición de complicaciones tromboembólicas en pacientes identificados de alto riesgo, tales como los que se someten a cirugía o aquellos con insuficiencia cardíaca congestiva.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de una afección médica asociada al corazón.

En algunas realizaciones la molécula quimérica de acuerdo con la presente invención es para el tratamiento de una afección médica asociada a una deficiencia en un polipéptido asociado a ficolina.

Moduladores de la actividad del complemento:

Como se analizó anteriormente, el segundo modulador de la actividad del complemento usado en la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina puede ser por cualquier compuesto que influya directa o indirectamente en la actividad del complemento.

Los inhibidores naturales del complemento y las proteínas reguladoras previenen la activación del sistema del complemento e incluyen: (i) receptor del complemento 1 (CR1 o CD35) y DAF (factor de aceleración de la desintegración o CD55), que compiten con el factor B por unirse con C3b y bloquean la ruta alternativa, así como bloquean de manera similar C4b de la ruta clásica para que no interactúe con C2, (ii) factor I, una proteasa plasmática que escinde C3b y C4b en sus formas inactivas para bloquear la formación de convertasas y (iii) factor H que puede competir con el factor B, desplazar Bb de la convertasa, actuar como cofactor para el factor I y unir C3b que ya está unido a las células. CD59 es una proteína reguladora del complemento que inhibe MAC (C5b-9).

En algunas realizaciones, el modulador de la actividad del complemento utilizado de acuerdo con la presente invención es el factor H. El factor H es un regulador del complemento del plasma humano que actúa como un cofactor significativo para el factor I en la escisión y regulación negativa de C4 y C3 activados y activación adicional del complemento posterior (Zipfel PF. Complement factor H: physiology and pathophysiology. Semin Thromb Hemost 2001; 27:191-9). Por tanto, el factor H actúa en la parte central del sistema del complemento cuando la iniciación y la activación ya se han producido. En algunas realizaciones, el factor H es un factor H de tipo silvestre, tales como el factor humano H de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el factor H es una variante del factor H silvestre.

En algunas realizaciones, el modulador de la actividad del complemento usado de acuerdo con la presente invención es la Proteína S. Este gen codifica una proteína plasmática dependiente de vitamina K que funciona como cofactor de la proteasa anticoagulante, proteína C activada (APC) para inhibir la coagulación sanguínea. Se encuentra en el plasma tanto en forma libre funcionalmente activa como también en forma inactiva complejada con la proteína de unión a C4b y ayuda a prevenir la coagulación y estimular la fibrinólisis. Las mutaciones en este gen dan como resultado una trombofilia hereditaria autosómica dominante. En algunas realizaciones, la Proteína S es una Proteína S de tipo silvestre, tales como la Proteína S humana de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la Proteína S es una variante de la Proteína S de tipo silvestre. Las secuencias de aminoácidos de la Proteína S humana (SEQ ID NO: 52) es un ejemplo adecuado de una secuencia que podría usarse como modulador de la actividad del complemento de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. La secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica MAP-1/Proteína S humana de ejemplo se ilustra por SEQ ID NO: 56, y la proteína quimérica Proteína S/MAP1 humana por SEQ ID NO: 57. Por ejemplo, una variante de Proteína S puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una Proteína S humana de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 52), por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera del 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una Proteína S de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 52). En alguna realización, una variante de la Proteína S (o un fragmento de la misma) retiene toda la actividad de inhibición del complemento de la Proteína S (o un fragmento de la misma). En algunas realizaciones, la variante de Proteína S (o un fragmento de la misma) retiene al menos aproximadamente 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la actividad inhibidora del complemento de la Proteína S (o un fragmento de la misma).

En algunas realizaciones, el modulador de la actividad del complemento usado de acuerdo con la presente invención es GAS6. Este producto génico es una proteína que contiene ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) que se cree que está implicado en la estimulación de la proliferación celular y puede desempeñar un papel en la trombosis al amplificar las plaquetas. Es un ligando para los receptores de tirosina-proteína quinasa AXL, TYRO3 y MER, cuya señalización está implicada en el crecimiento y la supervivencia celular, la adhesión celular y la migración celular. Alternativamente se han descubierto variantes transcritos de corte y empalme que codifican diferentes isoformas para este gen. La variante de transcrito 1 es el transcrito predominante y codifica la isoforma más larga. A la variante de transcrito 2 le faltan varios exones 5' y contiene una UTR 5' diferente en comparación con la variante de transcrito 1. Esto da como resultado una isoforma 2 con un N-terminal más corto, pero conservando los dos dominios LamG en el C-terminal. A la variante de transcrito 3 le faltan varios exones 5' y contiene una UTR 5' distinta en comparación con la variante de transcrito 1. Esto da como resultado una isoforma 3 con un N-terminal más corto, pero conservando los dos dominios LamG en el C-terminal. En algunas realizaciones, la GAS6 es una GAS6 de tipo silvestre, tales como la GAS6 humana de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la GAS6 es una variante de GAS6 de tipo silvestre.

Las secuencias de aminoácidos de GAS6 humana (SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 50) son ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como moduladores de la actividad del complemento de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. La secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica MAP-1/GAS6 humana de ejemplo se ilustra por SEQ ID NO: 54, y la proteína quimérica GAS6/MAP1 humana por SEQ ID NO: 55. Por ejemplo, una variante de GAS6 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente el 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una GAS6 humana de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, o SEQ ID NO: 50), por ejemplo, al menos aproximadamente cualquiera del 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una GAS6 natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 50). En alguna realización, una variante de GAS6 (o un fragmento de la misma) retiene toda la actividad de inhibición del complemento de GAS6 (o un fragmento de la misma). En algunas realizaciones, la variante de GAS6 (o un fragmento de la misma) retiene al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la actividad inhibidora del complemento de GAS6 (o un fragmento de la misma).

En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un inhibidor de C5, C5a o C5b. En algunas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico de C5, C5a o C5b. En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un polipéptido o un compuesto de molécula pequeña que inhibe C5, C5a o C5b. En aún otras realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a C5. En aún otras realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo monoclonal humano contra el componente C5 del complemento, incluyendo eculizumab, pexelizumab u otro anticuerpo anti-C5.

En otra realización más el compuesto inhibidor del complemento es un inhibidor de C3 o convertasa C3. En algunas realizaciones, el compuesto es un inhibidor específico de C3 o convertasa C3. En aún otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un polipéptido, un anticuerpo o un compuesto de molécula pequeña que inhibe C3 o la convertasa C3.

En una realización más adicional el compuesto inhibidor del complemento es un potenciador del factor H. En algunas realizaciones, el compuesto es un fragmento específico del factor H administrado a la articulación. En aún otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un polipéptido, un anticuerpo o un compuesto de molécula pequeña que potencia el Factor H. En otras realizaciones más, el inhibidor del complemento consiste en parte de un anticuerpo monoclonal específico del Factor H que promueve la unión al cartílago. En aún otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano aislado.

En otra realización, el compuesto inhibidor del complemento es un inhibidor del complejo de ataque a la membrana.

En otra realización, el compuesto inhibidor del complemento es un inhibidor de proteasas implicadas en el sistema del complemento. En algunas realizaciones, el inhibidor del complemento es C1-INH. En aún otras realizaciones, el inhibidor del complemento es C1-INH purificado a partir de plasma o producido de forma recombinante en animales transgénicos. En algunas realizaciones, el C1-INH es un inhibidor de C1 humano recombinante o un equivalente funcional del mismo. En otra realización, el inhibidor del complemento es un regulador del complemento soluble. En algunas realizaciones, el inhibidor del complemento es CR1 soluble (sCR1) o análogos del mismo. En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es una proteína de fusión CR2-Factor H o una proteína de fusión CR2-Crry.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es una molécula pequeña. En aún otras realizaciones, la molécula pequeña inhibe C5a o C3a. En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un compuesto que previene la escisión de C2, C3, C4 o C5.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es una proteína de control del complemento de Vaccinia (Vaccinia CCP).

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un factor de aceleración de la descomposición (DAF), un factor de aceleración de la descomposición soluble (sDAF), una proteína cofactor de membrana (MCP), una proteína cofactor de membrana soluble (sMCP), una proteína de fusión que comprende sMCP fusionado a DAF (sMCP-DAF), CD59, una proteína CD59 soluble (sCD59) o una proteína de fusión que comprende DAF y CD59 (DAF-CD59). En aún otras realizaciones, el compuesto es una proteína de fusión MCP-DAF. En otras realizaciones más, la proteína es CAB-2.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es una proteína C5a variante o mutante.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se une específicamente a C5, C3, C5a, C3a, C4a, C6, C7, C8, C9, factor B factor D, properdina (factor P), CD20, Cd 38, receptor de C5 (C5R) o receptor de C5a (C5aR).

En aún otras realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente al receptor C5 es neutrazumab.

En aún otras realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a C5 es eculizumab. En aún otras realizaciones, el anticuerpo que se une a CD38 es HuMax-CD38.

En aún otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es eculizumab.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un antagonista de C5aR seleccionado del grupo que consiste en N Me-FKPdChaWdR y F-(OpdChaWR) (Phe-[Orn-Pro-D-ciclohexilalanina-Trp-Arg]) C5aR.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un aptámero de ARN. En aún otras realizaciones, el aptámero se une a e inhibe selectivamente C5. En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es un péptido inhibidor de C3 o un análogo funcional del mismo.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento es BCX-1470, FUT-175, K-76, lectina de unión a manosa humana recombinante (rhMBL), APT070, TNX-234, TNX-558, TA106, proteína de unión del componente 4 del complemento (C4bp), Factor H, Factor I, carboxipeptidasa N, vitronectina, clusterina, JSM-7717, JPE-1375 o proteína OmCI.

En otras realizaciones, el compuesto inhibidor del complemento inhibe C5, C3, C5a, C3a, C4a, C6, C7, C8, C9, factor B factor D, properdina (factor p), CD20, CD38, receptor de C5 (C5R), receptor de C5a (C5aR), C1q, C1, C1r o C1s.

En otra realización, el método comprende además administrar al sujeto un tratamiento terapéutico adicional. En diversas realizaciones, el tratamiento terapéutico adicional comprende la administración de un principio activo, tales como un agente antiinflamatorio, un analgésico o un esteroide. En otras realizaciones, el tratamiento terapéutico adicional es una fisioterapia, ejercicio o un tratamiento térmico local. En una realización, cuando el tratamiento terapéutico adicional es un principio activo, el agente antiinflamatorio es un agente antiinflamatorio no esteroideo o un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2, el analgésico es un analgésico no opioide o el esteroide es un fármaco corticosteroide. En algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento de la molécula quimérica es el Factor H (FH), o un fragmento funcional del mismo.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica comprende una, dos o más (tales como cualquiera de tres, cuatro, cinco o más) partes del factor H. Estas partes del factor H pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo en términos de secuencias de aminoácidos, estructuras y/o funciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula quimérica (tal como una proteína de fusión) comprende: 1) un polipéptido asociado a ficolina y 2) una, dos o más partes del Factor H que comprenden un FH o un fragmento del mismo.

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende un Factor H de longitud completa. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende un fragmento del Factor H. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende al menos los primeros cuatro dominios de repetición consenso corta (SCR) N-terminales del Factor H. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende al menos los primeros cinco dominios SCR N-terminales del Factor H. En algunas realizaciones, la parte del factor H carece de un sitio de unión a heparina. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende un Factor H o un fragmento del mismo que tiene un polimorfismo que protege contra la degeneración macular relacionada con la edad.

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende al menos los primeros 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más dominios SCR N-terminales del Factor H.

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende los aminoácidos 21 a 320 de SEQ ID NO: 20.

En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido asociado a ficolina y una porción de Factor H también comprende una secuencia que codifica un péptido señal unido operativamente en el extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína de fusión. En algunas realizaciones, se usa una secuencia enlazadora para enlazar el polipéptido asociado a ficolina y la parte del Factor H.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad que está asociada a deficiencias de factor H (incluyendo, por ejemplo, la disminución del nivel de factor H, la disminución de la actividad del factor H o la falta de factor H de tipo silvestre o protector). En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar no es una enfermedad asociada a deficiencias de Factor H.

Las expresiones "parte del factor H", "Factor H" o simplemente "FH" se refiere al factor H humano de acuerdo con SEQ ID NO: 20 o un fragmento funcional del mismo.

La parte del Factor H de la molécula quimérica descrita en el presente documento comprende el Factor H o un fragmento del mismo. El factor H del complemento (FH) es una glucoproteína plasmática de cadena polipeptídica única. La proteína se compone de 20 dominios SCR repetitivos de aproximadamente 60 aminoácidos, dispuestos de manera continua como una cadena de 20 cuentas. El factor H se une a C3b, acelera la descomposición de la ruta alternativa de C3-convertasa (C3Bb) y actúa como cofactor para la inactivación proteolítica de C3b. En presencia del factor H, la proteólisis de C3b da como resultado la escisión de C3b. El factor H tiene al menos tres dominios de unión distintos para C3b, que se encuentran dentro de SCR 1-4, SCR 5-8 y SCR 19-20. Cada sitio del factor H se une a una región distinta dentro de la proteína C3b: los sitios N-terminales se unen a C3b nativo; el segundo sitio, ubicado en la región media del factor H, se une al fragmento C3c y el situado dentro de SCR19 y 20 se une a la región C3d. Además, el factor H también contiene sitios de unión para la heparina, que se encuentran dentro de SCR 7, SCR 5-12 y SCR 20 del factor H y se superponen con el del sitio de unión a C3b. Los análisis estructurales y funcionales han demostrado que los dominios para la actividad inhibidora del complemento del factor H están ubicados dentro de los primeros cuatro dominios SCR N-terminales.

La SEQ ID NO: 20 representa la secuencia de la proteína del Factor H humano de longitud completa. Los aminoácidos 1-18 corresponden al péptido líder, los aminoácidos 21-80 corresponden a SCR 1, los aminoácidos 85-141 corresponden a SCR 2, los aminoácidos 146-205 corresponden a SCR 3, los aminoácidos 210-262 corresponden a SCR4, los aminoácidos 267-320 corresponden a SCR5. Se entiende que existen variaciones de especies y cepas para los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos y que el Factor H o un fragmento del mismo abarca todas las especies y variaciones de cepas.

La porción de factor H descrita en el presente documento se refiere a cualquier parte de una proteína de factor H que tiene parte o toda la actividad inhibidora del complemento de la proteína FH, e incluye, pero no se limita a, proteínas de factor H de longitud completa, fragmentos biológicamente activos de las proteínas del factor H, un fragmento de factor H que comprende SCR1-4 o cualquier homólogo o variante de un factor H natural o fragmento del mismo, como se describe en detalle a continuación. En algunas realizaciones, la porción del Factor H tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) unión a la proteína C reactiva (CRP), (2) unión a C3b, (3) unión a heparina, (4) unión al ácido siálico, (5) unión a superficies de células endoteliales, (6) unión al receptor de integrina celular, (7) unión a patógenos, (8) actividad del cofactor C3b, (9) actividad de aceleración de la descomposición de C3b y (10) inhibición de la ruta alternativa del complemento.

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende los primeros cuatro dominios SCR N-terminales del Factor H. En algunas realizaciones, la construcción comprende los primeros cinco dominios SCR N-terminales del Factor H. En algunas realizaciones, la construcción comprende los primeros seis dominios SCR N-terminales del Factor H. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende (y en algunas realizaciones consiste en o consiste esencialmente en) al menos los primeros cuatro dominios SCR N-terminales del Factor H, incluyendo, por ejemplo, al menos cualquiera de los primeros 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más dominios SCR N-terminales del Factor H.

En algunas realizaciones, el factor H es un factor H de tipo silvestre, tales como el factor humano H de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el factor H es una variante del factor H silvestre.

En algunas realizaciones, la parte del factor H carece de un sitio de unión a heparina. Esto puede lograrse, por ejemplo, por mutación del sitio de unión de heparina en el factor H, o seleccionando fragmentos de factor H que no contienen un sitio de unión de heparina. En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende un Factor H o un fragmento del mismo que tiene un polimorfismo que protege de la degeneración macular relacionada con la edad. Hageman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 102(20):7227.

Un homólogo o variante de una proteína de Factor H o un fragmento de la misma incluye proteínas que difieren de un Factor H de origen natural (o fragmento de Factor H) en que al menos uno o unos pocos, pero no limitado a uno o unos pocos, aminoácidos se han eliminado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tales como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol). Por ejemplo, un homólogo o variante de Factor H puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un Factor H humano de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 20), por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera del 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un Factor H de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 20). En alguna realización, un homólogo o variante del Factor H (o un fragmento del mismo) retiene toda la actividad de inhibición del complemento del Factor H (o un fragmento del mismo). En algunas realizaciones, el homólogo o variante del Factor H (o un fragmento del mismo) retiene al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la actividad inhibidora del complemento del Factor H (o un fragmento del mismo).

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR N-terminales de un Factor H humano, tales como una parte del Factor H que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 21 a 262 del Factor H humano (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, la parte del factor H comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR N-terminales del factor H humano que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente cualquiera del 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idénticos a los aminoácidos 21 a 262 del Factor H humano (SEQ ID NO: 20).

En algunas realizaciones, la parte del Factor H comprende al menos los primeros cinco dominios SCR N-terminales de un Factor H humano, tales como una parte del Factor H que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos los aminoácidos 21 a 320 del Factor H humano (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, la parte del factor H comprende al menos los primeros cinco dominios SCR N-terminales del factor H humano que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente cualquiera del 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a los aminoácidos 21 a 320 del Factor H humano (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, la parte del factor H comprende una longitud completa o un fragmento de una molécula similar al factor H 1 (FHL-1), una proteína codificada por un transcrito de corte y empalme alternativo del gen del factor H. La FHL-1 madura contiene 431 aminoácidos. Los primeros 427 aminoácidos organizan siete dominios SCR y son idénticos a los dominios SCR N-terminales del factor H. Los cuatro restos de aminoácidos restantes Ser-Phe-Thr-Leu (SFTL) en el extremo C-terminal son específicos de FHL-1. FHL-1 se ha caracterizado funcionalmente y se ha demostrado que tiene actividad reguladora del complemento del factor H. La expresión "parte del factor H" también abarca la longitud completa o fragmentos de moléculas relacionadas con el factor H, incluyendo, pero no se limitan a, proteínas codificadas por los genes FHR1, FHR2, FHR3, FHR4, FHR5. Estas proteínas relacionadas con el factor H se desvelan, por ejemplo, en de Cordoba et al., Molecular Immunology 2004, 41: 355-367.

En algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento de la molécula quimérica es C4bp o un fragmento funcional o una parte del mismo.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica comprende una, dos o más (tales como cualquiera de tres, cuatro, cinco o más) partes de C4bp. En algunas realizaciones, la molécula quimérica comprende la cadena alfa o la cadena beta o una combinación de ambas. Estas partes de C4bp pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo en términos de secuencias de aminoácidos, estructuras y/o funciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula quimérica (tal como una proteína de fusión) comprende: 1) un polipéptido asociado a ficolina y 2) una, dos o más partes de C4bp que comprenden un C4bp o un fragmento del mismo.

En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende una C4bp de longitud completa. En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende un fragmento de C4bp. En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende al menos los primeros tres dominios de repetición consenso corta (SCR) N-terminales de la cadena alfa de C4bp y/o el segundo dominio SCR de la cadena beta de C4bp. En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende un C4bp o un fragmento del mismo que tiene un polimorfismo que protege contra la degeneración macular relacionada con la edad.

En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende al menos los primeros 3, 4, 5, 6, 7, 8 dominios SCR N-terminales de C4bp alfa.

En algunas realizaciones, la parte de C4bp comprende al menos los primeros 1, 2, 3 dominios SCR de C4bp beta.

En algunas realizaciones, la parte de C4bp alfa comprende los aminoácidos 21 a 597 de SEQ ID NO: 21.

En algunas realizaciones, la parte de C4bp beta comprende los aminoácidos 21 a 252 de SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido asociado a ficolina y una porción de C4bp también comprende una secuencia que codifica un péptido señal unido operativamente en el extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína de fusión. En algunas realizaciones, se usa una secuencia enlazadora para enlazar el polipéptido asociado a ficolina y la parte de C4bp.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad que está asociada a deficiencias de C4bp (incluyendo, por ejemplo, la disminución del nivel de C4bp, la disminución de la actividad de C4bp o la falta de C4bp de tipo silvestre o protector). En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar no es una enfermedad asociada a deficiencias de C4bp.

Las expresiones "parte de C4bp", "proteína de unión a C4" o simplemente "C4bp", se refiere a C4bp humano de acuerdo con SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 o un fragmento funcional de las mismas.

La parte de C4bp de la molécula quimérica descrita en el presente documento comprende C4bp o un fragmento del mismo. La proteína de unión del complemento C4 (C4bp) es una glucoproteína plasmática de cadena polipeptídica única. La proteína se compone de siete cadenas alfa idénticas y una cadena beta unidas por sus partes C-terminales en un núcleo central. Inhibe la acción de C4. Divide la convertasa C4 y es un cofactor del factor I que escinde C4b. C4BP se une a las células necróticas y al ADN, para limpiar después de la hinchazón. La proteína C4bp tiene al menos dos dominios de unión distintos para C4b, que se encuentran dentro de alfa SCR 1-3 y beta SCR 2.

SEQ ID NO: 21 representa la cadena alfa de longitud completa de la secuencia de la proteína C4bp humana. Los aminoácidos 1-20 corresponden al péptido líder, los aminoácidos 49-110 corresponden a SCR 1, los aminoácidos 111­ 172 corresponden a SCR 2, los aminoácidos 173-236 corresponden a SCR 3, los aminoácidos 237-296 corresponden a SCR4, los aminoácidos 297-362 corresponden a SCR5, los aminoácidos 363-424 corresponden a SCR6, los aminoácidos 425-482 corresponden a SCR7, los aminoácidos 483-540 corresponden a SCR8. Se entiende que existen variaciones de especies y cepas para los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos y que la cadena alfa de C4bp o un fragmento de la misma abarca todas las especies y variaciones de cepas.

SEQ ID NO: 22 representa la cadena beta de longitud completa de la secuencia de la proteína C4bp humana. Los aminoácidos 1-20 corresponden al péptido líder, los aminoácidos 21-78 corresponden a SCR 1, los aminoácidos 79­ 136 corresponden a SCR 2, los aminoácidos 137-193 corresponden a SCR 3. Se entiende que existen variaciones de especies y cepas para los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos y que la cadena beta de C4bp o un fragmento de la misma abarca todas las especies y variaciones de cepas.

La parte de C4bp descrita en el presente documento se refiere a cualquier parte de una proteína C4bp que tiene parte 0 toda la actividad inhibidora del complemento de la proteína C4bp, e incluye, pero no se limita a, las proteínas C4bp de longitud completa, fragmentos biológicamente activos de proteínas C4bp, un fragmento de C4bp que comprende SCR1-3 o cualquier homólogo o variante de un C4bp natural o fragmento del mismo, como se describe en detalle a continuación. En algunas realizaciones, la parte C4bp tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) unión a C4, (2) unión a C3b/C4b, (3) acelerar la degradación del complejo C4bC2a disociando el fragmento del complemento C2a.

En algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento de la molécula quimérica es el Factor 1 (FI) o un fragmento funcional o parte del mismo.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica comprende una, dos o más (tales como cualquiera de tres, cuatro, cinco o más) partes de FI. Estas partes de FI pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo en términos de secuencias de aminoácidos, estructuras y/o funciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula quimérica (tal como una proteína de fusión) comprende: 1) un polipéptido asociado a ficolina y 2) una, dos o más partes de FI que comprenden un FI o un fragmento del mismo.

En algunas realizaciones, la parte de FI comprende un FI de longitud completa. En algunas realizaciones, la parte de FI comprende un fragmento de FI. En algunas realizaciones, la parte de FI comprende al menos el dominio SP. En algunas realizaciones, la parte de FI comprende los dominios FIMAC, SRCR, LDLRa1, LDLRb1. En algunas realizaciones, la parte de FI comprende un FI o un fragmento del mismo que tiene un polimorfismo que protege contra la degeneración macular relacionada con la edad.

En algunas realizaciones, la parte de FI comprende los aminoácidos 21 a 583 de SEQ ID NO: 23.

En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido asociado a ficolina y una parte de FI también comprende una secuencia que codifica un péptido señal unido operativamente en el extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína de fusión. En algunas realizaciones, se usa una secuencia enlazadora para enlazar el polipéptido asociado a ficolina y la parte de FI.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad que está asociada a deficiencias de FI (incluyendo, por ejemplo, la disminución del nivel de FI, la disminución de la actividad de FI o la falta de FI de tipo silvestre o protector). En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar no es una enfermedad asociada a deficiencias de FI.

Las expresiones "parte de FI" o simplemente "FI" se refieren al Factor I humano de acuerdo con SEQ ID NO: 23 o un fragmento funcional del mismo.

La parte de FI de la molécula quimérica descrita en el presente documento comprende FI o un fragmento del mismo. La proteína de unión al factor I (FI) es una glucoproteína plasmática de cadena polipeptídica única. FI tiene una especificidad restringida limitada a la escisión de los límites de arginilo en sus sustratos proteicos naturales C3b y C4b. Los componentes tales como FH, CR1, MCP o C4bp se requieren como cofactores. Fi se sintetiza como una única cadena polipeptídica con una cadena pesada N-terminal (317 aminoácidos) y una cadena ligera C-terminal (244 aminoácidos). La cadena pesada de FI tiene cuatro dominios: un dominio FlMAC, un dominio rico en cisteína del receptor eliminador (SRCR) y dos dominios de clase A del receptor de LDL; se desconoce la función biológica precisa de la cadena pesada, pero es probable que juegue un papel clave en el reconocimiento de los sustratos de escisión de FI (C3b y C4b) y las proteínas cofactor necesarias para la escisión de C3b (FH, CR1, MCP) y C4b (C4BP). Es probable que cada uno de los dominios del receptor de LDL contenga un sitio de unión al calcio. La cadena ligera FI es el dominio de serina proteasa (SP) que contiene la tríada catalítica responsable de la escisión específica de C3b y C4b.

SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de la proteína FI humana de longitud completa. Los aminoácidos 1-18 corresponden al péptido líder, los aminoácidos 55-108 corresponden al dominio FIMAC; los aminoácidos 114-212 corresponden al dominio rico en cisteína del receptor eliminador (SRCR), los aminoácidos 213-257 corresponden a los dominios de clase A1 del receptor de LDL, los aminoácidos 258-294 corresponden a los dominios de clase A2 del receptor de LDL, los aminoácidos 340-574 corresponden al dominio de peptidasa.

La parte de FI descrita en el presente documento se refiere a cualquier parte de una proteína FI que tiene parte o toda la actividad inhibidora del complemento de la proteína FI, e incluye, pero no se limita a, proteínas FI de longitud completa, fragmentos biológicamente activos de proteínas FI, un fragmento de FI que comprende al menos el dominio de serina proteasa, o cualquier homólogo o variante de un FI de origen natural o fragmento del mismo, como se describe en detalle a continuación. En algunas realizaciones, la parte de FI tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) escisión de C3b (2) escisión de C4b.

En algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento de la molécula quimérica es el inhibidor de C1 (C1-inh) o un fragmento funcional o una parte del mismo.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica comprende una, dos o más (tales como cualquiera de tres, cuatro, cinco o más) partes de C1-inh. Estas partes de C1-inh pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo en términos de secuencias de aminoácidos, estructuras y/o funciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula quimérica (tal como una proteína de fusión) comprende: 1) un polipéptido asociado a ficolina y 2) una, dos o más partes de C1-inh que comprenden un C1-inh o un fragmento del mismo.

En algunas realizaciones, la parte de C1-inh comprende un C1-inh de longitud completa. En algunas realizaciones, la parte de C1-inh comprende un fragmento de C1-inh. En algunas realizaciones, la parte de C1-inh comprende al menos parte del dominio de serpina. En algunas realizaciones, la parte de C1-inh comprende un C1-inh o un fragmento del mismo que tiene un polimorfismo que protege contra la degeneración macular relacionada con la edad.

En algunas realizaciones, la parte de C1-inh comprende los aminoácidos 21 a 500 de SEQ ID NO: 24.

En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende un polipéptido asociado a ficolina y una parte de C1-inh también comprende una secuencia que codifica un péptido señal unido operativamente en el extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína de fusión. En algunas realizaciones, se usa una secuencia enlazadora para enlazar el polipéptido asociado a ficolina y la parte de C1-inh.

En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar es una enfermedad que está asociada a deficiencias de C1-inh (incluyendo, por ejemplo, la disminución del nivel de C1-inh, la disminución de la actividad de C1-inh o la falta de C1-inh de tipo silvestre o protector). En algunas realizaciones, la enfermedad a tratar no es una enfermedad asociada a deficiencias de C1-inh.

Las expresiones "parte de C1-inh" o simplemente "C1-inh" se refieren al inhibidor de C1 humano de acuerdo con SEQ ID NO: 24 o un fragmento funcional del mismo.

La parte de C1-inh de la molécula quimérica descrita en el presente documento comprende C1-inh o un fragmento del mismo. La proteína inhibidora del complemento C1 (C1-inh) es una proteína inhibidora de la serina proteasa (serpina), cuya función principal es la inhibición del sistema del complemento para prevenir la activación espontánea. El dominio de serpina C-terminal es similar a otras serpinas, y esta parte de C1-inh proporciona la actividad inhibidora de C1-inh. El dominio N-terminal (también denominado algunas veces como la cola N-terminal) no es esencial para que C1-inh inhiba las proteinasas. Este dominio no tiene similitud con otras proteínas. C1-inh está altamente glucosilado, llevando tanto N- como O-glucanos. El dominio N-terminal está de manera especial fuertemente glucosilado. C1-inh es una proteína de fase aguda, circula en sangre. C1-inh se une irreversiblemente e inactiva las proteinasas C1r y C1s en el complejo C1 de la ruta clásica del complemento. Las proteinasas MASP-1 y MASP-2 en los complejos MBL de la ruta de la lectina también se inactivan. De esta manera, C1-inh evita la escisión proteolítica de los componentes posteriores del complemento C4 y C2 por C1 y MBL. Aunque recibe su nombre de su actividad inhibidora del complemento, C1-inh también inhibe las proteinasas de las rutas fibrinolítica, de coagulación y de la quinina. De manera más destacable, C1-inh es el inhibidor fisiológico más importante de la calicreína plasmática, fXIa y fXIIa.

SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de la proteína C1-inh humana de longitud completa. Los aminoácidos 1-22 corresponden al péptido líder, los aminoácidos 23-500 corresponden al dominio serpina. Se entiende que existen variaciones de especies y cepas para los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos y que el C1-inh o un fragmento del mismo abarca todas las especies y variaciones de cepas.

La parte de C1-inh descrita en el presente documento se refiere a cualquier parte de una proteína C1-inh que tiene parte o toda la actividad inhibidora del complemento de la proteína C1-inh, e incluye, pero no se limita a, proteínas C1-inh de longitud completa, fragmentos biológicamente activos de proteínas C1-inh, un fragmento de C1-inh que comprende SCR1-3 o cualquier homólogo o variante de un C1-inh natural o fragmento del mismo, como se describe en detalle a continuación. En algunas realizaciones, la parte de C1-inh tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) unión a C1r y C1s, (2) inhibe la actividad de las proteinasas MASP-1 y MASP-2, (3) inhibe las proteinasas de las rutas fibrinolítica, de coagulación y de la quinina, (4) inhibidor de la calicreína plasmática, el Factor XIa y el Factor XIIa.

En otras realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento es un dominio de búsqueda que facilita el transporte y/o la captación en un sitio particular de la actividad del complemento, tal como un sitio de inflamación.

En consecuencia, en algunas realizaciones, el segundo modulador de la actividad del complemento es una molécula de direccionamiento o resto de direccionamiento que aumenta la eficiencia de direccionamiento de la molécula quimérica. Por ejemplo, el segundo modulador de la actividad del complemento puede ser un ligando (tal como una secuencia de aminoácidos) que tiene la capacidad de unirse o de otro modo unirse a una célula endotelial de un vaso sanguíneo (denominado "ligando de aminoácidos dirigido al endotelio vascular"). Los ligandos de dirección endotelial vascular de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, VEGF, FGF, integrina, fibronectina, I-CAM, PDGF o un anticuerpo contra una molécula expresada en la superficie de una célula endotelial vascular.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina se conjuga (tal como se fusiona) a un ligando para moléculas de adhesión intercelular. Por ejemplo, el segundo modulador de la actividad del complemento puede ser uno o más restos de carbohidratos que se unen a una molécula de adhesión intercelular. El resto de carbohidrato facilita la localización de la molécula quimérica en el sitio de la lesión. El resto de carbohidrato puede unirse a la molécula quimérica por medio de un evento extracelular tal como una unión química o enzimática, o puede ser el resultado de un evento de procesamiento intracelular logrado mediante la expresión de enzimas apropiadas. En algunas realizaciones, el resto de carbohidrato se une a una clase particular de moléculas de adhesión tales como integrinas o selectinas, incluyendo E-selectina, L-selectina o P-selectina. En algunas realizaciones, el resto de carbohidrato comprende un carbohidrato enlazado a N, por ejemplo, el tipo complejo, incluidos los carbohidratos fucosilados y sialilados. En algunas realizaciones, el resto de carbohidratos está relacionado con el antígeno de Lewis X, por ejemplo, el antígeno de Lewis X sialilado.

Para el tratamiento de enfermedades oculares tales como AMD, el segundo modulador de la actividad del complemento puede ser un anticuerpo que reconoce un neoepítopo de las drusas. También pueden usarse otras moléculas de direccionamiento tales como péptidos de direccionamiento pequeños. Otras modificaciones de la molécula quimérica incluyen, por ejemplo, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos y similares.

El segundo modulador de la actividad del complemento puede ser un dominio inmunológicamente activo, tales como un epítopo de anticuerpo u otra etiqueta, para facilitar el direccionamiento del polipéptido. Otras secuencias de aminoácidos que pueden incluirse en la molécula quimérica incluyen dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas tales como una hidrolasa, dominios de glicosilación y señales de direccionamiento celular.

Dominio para aumentar la semivida circulatoria:

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la invención se modifica adicionalmente con un dominio para aumentar la semivida circulatoria de la molécula quimérica en comparación con el polipéptido asociado a ficolina, cuyo dominio es un sustituyente hidrófilo.

La expresión "sustituyente hidrófilo", como se usa en el presente documento significa una molécula que es capaz de conjugarse con un punto de unión del péptido y que es hidrosoluble. Los términos "hidrófilo" e "hidrófobo" se definen generalmente en términos de un coeficiente de partición P, que es la relación entre la concentración de equilibrio de un compuesto en una fase orgánica y la de una fase acuosa. Un compuesto hidrófilo tiene un valor de log P de menos de 1,0, normalmente menos de aproximadamente -0,5, donde P es el coeficiente de reparto del compuesto entre octanol y agua, mientras que los compuestos hidrófobos generalmente tendrán un log P mayor que aproximadamente 3,0, normalmente mayor que aproximadamente 5,0.

La molécula de polímero es una molécula formada por enlace covalente de dos o más monómeros en la que ninguno de los monómeros es un resto de aminoácido. Los polímeros preferidos son moléculas de polímero seleccionadas del grupo que consiste en óxidos de polialquileno, incluyendo polialquilenglicol (PAG), tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, anhídrido de polietileno-co-ácido maleico, anhídrido de poliestireno-co-ácido maleico y dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano, siendo particularmente preferido el PEG. La expresión "grupo de unión" pretende indicar un grupo funcional del péptido capaz de unirse a una molécula de polímero. Los grupos de unión útiles son, por ejemplo, amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, cetona, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona, oxima o halo acetato.

El término "PAO" como se usa en este documento se refiere a cualquier polióxido de alquileno, incluyendo polialquilenglicol (PAG), tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), p Eg ramificados y metoxipolietilenglicol (mPEG) con un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 100.000 Dalton.

La molécula de polímero que se va a acoplar al polipéptido asociado a ficolina puede ser cualquier molécula adecuada tal como un homopolímero o heteropolímero natural o sintético, normalmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 300-100.000 Da, tales como aproximadamente 500-20.000 Da, o aproximadamente 500­ 15.000 Da, o 2-15 kDa, o 3-15 kDa, o aproximadamente 10 kDa.

Cuando el término "aproximadamente" se usa en el presente documento en relación con un cierto peso molecular, la palabra "aproximadamente" indica una distribución de peso molecular promedio aproximado en una preparación de polímero dada.

Los ejemplos de homopolímeros incluyen un polialcohol (es decir, poli-OH), una poliamina (es decir, poli-NH2) y un ácido policarboxílico (es decir, poli-COOH). Un heteropolímero es un polímero que comprende diferentes grupos de acoplamiento tales como grupo hidroxilo y grupo amina.

Algunos ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas incluyen molécula polimérica seleccionada del grupo que consiste en polióxido de alquileno, incluyendo polialquilenglicol (PAG), tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, anhídrido de polietileno-co-ácido maleico, anhídrido de poliestireno-co-ácido maleico, dextrano, incluyendo carboximetil-dextrano o cualquier otro polímero adecuado para reducir la inmunogenicidad y/o aumentar la semivida in vivo funcional y/o semivida en suero. Generalmente, los polímeros derivados de polialquilenglicol son biocompatibles, no tóxicos, no antigénicos y no inmunogénicos, tienen diversas propiedades de solubilidad en agua y se excretan fácilmente de los organismos vivos.

PEG es la molécula de polímero preferida, ya que solo tiene unos pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con, por ejemplo, polisacáridos tales como dextrano. En particular, el PEG monofuncional, por ejemplo, metoxipolietilenglicol (mPEG) es de interés ya que su química de acoplamiento es relativamente sencilla (solo hay disponible un grupo reactivo para conjugar el péptido con grupos de unión).

Para efectuar la unión covalente de la molécula o moléculas de polímero a un polipéptido asociado a ficolina, los grupos hidroxilo terminales de la molécula de polímero deben proporcionarse en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos (ejemplos de los cuales incluyen grupos amino primarios, hidrazida (HZ), tiol (SH), succinato (SUC), succinato de succinimidilo (SS), succinamida de succinimidilo (SSA), propionato de succinimidilo (SPA), 3-mercaptopropionato de succinimidilo (SSPA), Norleucina (NOR), carboximetilato de succinimidilo (SCM), butanoato de succimidilo (SBA), carbonato de succinimidilo (SC), glutarato de succinimidilo (SG), dietil acetal acetaldehído (ACET), carboximetilato de succinimidilo (SCM), carbonato de benzotriazol (BTC), N-hidroxisuccinimida (NHS), aldehído (ALD), carbonato de triclorofenilo (TCP), nitrofenilcarbonato (NPC), maleimida (MAL), vinilsulfona (VS), carbonilimidazol (CDI), isocianato (NCO), yodo (IODO), expóxido (Ep o X), yodoacetamida (IA), glutarato de succinimidilo (SG) y tresilato (TRES).

Las moléculas de polímero activado adecuadas están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Nektar, anteriormente conocido como Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, EE.UU., o de PolyMASC Pharmaceuticals pic, RU o de Enzon pharmaceuticals. Como alternativa, las moléculas de polímero pueden activarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se desvela en el documento WO 90/13540. Se describen ejemplos específicos de moléculas poliméricas lineales o ramificadas activadas para su uso en la presente invención en Shearwater Polymers, Inc. Catálogos de 1997 y 2000 (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, incorporado en el presente documento por referencia).

Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG (por ejemplo, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG y SCM-PEG) y NOR-PEG, SCM-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, IA-PEG, ACET-PEG y MAL-PEG y PEG ramificados tales como PEG2-NHS y aquellos desvelados en el documento US 5.672.662, el documento US 5.932.462 y el documento US 5.643.575, ambos incorporados en el presente documento por referencia. Adicionalmente las siguientes publicaciones, incorporadas por referencia en el presente documento, desvelan moléculas poliméricas y/o químicas de PEGilación útiles: el documento US 4.179.337, el documento US 5.824.778, el documento US 5.476.653, el documento WO 97/32607, el documento EP 229.108, el documento EP 402.378, el documento documento US 5.281.698, el documento US 5.122.614, el documento US 5.219.564, el documento l documento WO 94/04193, el documento WO 94/14758, el documento US 94/17039, el documento 47, el documento WO 94,28024, el documento WO 95/00162, el documento WO 95/11924, el documento 90, el documento WO 95/33490, el documento WO 96/00080, el documento WO 97/18832, el documento

62, el documento WO 98/48837, el documento WO 99/32134, el documento WO 99/32139, el documento 40, el documento WO 96/40791, el documento WO 98/32466, el documento WO 95/06058, el documento EP 439 508, el documento WO 97/03106, el documento WO 96/21469, el documento WO 95/13312, el documento EP 921 131, el documento US 5.736.625, el documento WO 98/05363, el documento EP 809 996, el documento US 5.629.384, el documento WO 96/41813, el documento WO 96/07670, el documento US 5.473, 034, el documento US 5.516.673, el documento 305. 382. 657; el documento EP 605963, el documento EP 510356, el documento EP 400472, el documento EP 183503 y el documento EP 154316 y Roberts et al. Adv. Drug Delivery Revl. 54: 459--476 (2002) y las referencias descritas en el presente documento. La conjugación entre un polipéptido asociado a ficolina y el polímero activado se realiza mediante un método convencional. Los expertos en la materia conocen métodos convencionales.

Se entenderá que la conjugación del polímero está diseñada para producir la molécula óptima con respecto al número de moléculas de polímero unidas, el tamaño y la forma de tales moléculas (por ejemplo, si son lineales o ramificadas), y el sitio o sitios de unión en polipéptidos asociados a ficolina. El peso molecular del polímero que se usará puede, por ejemplo, elegirse según el efecto deseado a lograr.

El sustituyente hidrófilo puede unirse a un grupo amino del resto polipeptídico asociado a ficolina por medio de un grupo carboxilo del sustituyente hidrófilo que forma un enlace amida con un grupo amino del aminoácido al que está unido. Como alternativa, el sustituyente hidrófilo puede unirse a dicho aminoácido de tal forma que un grupo amino del sustituyente hidrófilo forme un enlace amida con un grupo carboxilo del aminoácido. Como una opción adicional, el sustituyente hidrófilo puede estar unido al polipéptido asociado a ficolina a través de un enlace éster. Desde el punto de vista formal, el éster puede formarse por reacción entre un grupo carboxilo del polipéptido asociado a ficolina y un grupo hidroxilo del sustituyente futuro o por reacción entre un grupo hidroxilo del polipéptido asociado a ficolina y un grupo carboxilo del sustituyente futuro. Como alternativa adicional, el sustituyente hidrófilo puede ser un grupo alquilo que se introduce en un grupo amino primario del polipéptido asociado a ficolina.

En una realización de la invención el sustituyente hidrófilo comprende H(OCH2CH2)nO-en donde n>4 con un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 100.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo comprende CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-en donde n> 4 con un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 100.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo es polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 5000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo es polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de aproximadamente 5000 a aproximadamente 20.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo es polietilenglicol (PEG) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 100.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo comprende o es un metoxi-PEG (m-PEG) con un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 5000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo es metoxi-polietilenglicol (mPEG) con un peso molecular de aproximadamente 5000 a aproximadamente 20.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo es metoxi-polietilenglicol (mPEG) con un peso molecular de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 100.000 Dalton.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo se une a un resto de aminoácido de tal manera que un grupo carboxilo del sustituyente hidrófilo forma un enlace amida con un grupo amino del resto de aminoácido.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo está unido a un resto Lys.

En una realización de la invención, el sustituyente hidrófilo se une a un resto de aminoácido de tal manera que un grupo amino del sustituyente hidrófilo forma un enlace amida con un grupo carboxilo del resto de aminoácido.

En algunas realizaciones, la molécula quimérica de acuerdo con la invención se modifica adicionalmente con un dominio para aumentar la semivida circulatoria de la molécula quimérica en comparación con el polipéptido asociado a ficolina, cuyo dominio es un sustituyente lipófilo.

La expresión "sustituyente lipófilo" se caracteriza por comprender 4-40 átomos de carbono y tener una solubilidad en agua a 20 °C en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/100 ml de agua a aproximadamente 250 mg/100 ml de agua, tal como en el intervalo de aproximadamente 0,3 mg/100 ml de agua a aproximadamente 75 mg/100 ml de agua. Por ejemplo, el ácido octanoico (C8) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 68 mg/100 ml, el ácido decanoico (C10) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 15 mg/100 ml y el ácido octadecanoico (C18) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 0,3 mg/100 ml.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo comprende de 4 a 40 átomos de carbono.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo comprende de 8 a 25 átomos de carbono.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo comprende de 12 a 20 átomos de carbono.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo se une a un resto de aminoácido de tal manera que u carboxilo del sustituyente lipófilo forma un enlace amida con un grupo amino del resto de aminoácido.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está unido a un resto Lys.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo se une a un resto de aminoácido de tal manera que un grupo amino del sustituyente lipófilo forma un enlace amida con un grupo carboxilo del resto de aminoácido.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo se une al polipéptido asociado a ficolina por medio de un espaciador.

En una realización de la invención, el espaciador es un grupo de ácido alcano a,w-dicarboxílico no ramificado que tiene de 1 a 7 grupos metileno, tal como dos grupos metileno cuyo espaciador forma un puente entre un grupo amino del polipéptido asociado a ficolina y un grupo amino del sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención, el espaciador es un resto de aminoácido excepto un resto de Cys, o un dipéptido.

Los ejemplos de espaciadores adecuados incluyen p-alanina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), ácido Y-glutámico, ácido succínico, Lys, Glu o Asp, o un dipéptido tales como Gly-Lys. Cuando el espaciador es ácido succínico, un grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del resto de aminoácido y el otro grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo. Cuando el espaciador es Lys, Glu o Asp, el grupo carboxilo de los mismos puede formar un enlace amida con un grupo amino del resto de aminoácido y el grupo amino de los mismos puede formar un enlace amida con un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo. Cuando se usa Lys como espaciador, en algunos casos puede insertarse un espaciador adicional entre el grupo £-amino de Lys y el sustituyente lipófilo. En una realización, dicho espaciador adicional es ácido succínico que forma un enlace amida con el grupo £-amino de Lys y con un grupo amino presente en el sustituyente lipófilo. En otra realización, dicho espaciador adicional es Glu o Asp que forma un enlace amida con el grupo £-amino de Lys y otro enlace amida con un grupo carboxilo presente en el sustituyente lipófilo, es decir, el sustituyente lipófilo es un resto de lisina NE-acilada.

En una realización de la invención el espaciador se selecciona de la lista que consiste en p-alanina, ácido gammaaminobutírico (GABA), ácido Y-glutámico, Lys, Asp, Glu, un dipéptido que contiene Asp, un dipéptido que contiene Glu o un dipéptido que contiene Lys. En una realización de la invención el espaciador es p-alanina. En una realización de la invención el espaciador es ácido gamma-aminobutírico (GABA). En una realización de la invención, el espaciador es ácido Y-glutámico.

En una realización de la invención un grupo carboxilo del polipéptido asociado a ficolina forma un enlace amida con un grupo amino de un espaciador y el grupo carboxilo del aminoácido o dipéptido espaciador forma un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención un grupo amino del polipéptido asociado a ficolina forma un enlace amida con un grupo carboxílico de un espaciador y un grupo amino del espaciador forma un enlace amida con un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo comprende una estructura principal de ciclopentanofenatreno parcial o completamente hidrogenado.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada. En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es el grupo acilo de un ácido graso de cadena lineal o ramificada.

En una realización de la invención el grupo acilo de un sustituyente lipófilo se selecciona del grupo que comprende CH3(CH2)nCO-, en donde n es 4 a 38, tales como CH3(CH2)sCO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2) ioCO-, CH3(CH2)i2CO-, CH3(CH2)l4CO-, CH3(CH2)l6CO-, CH3(CH2)l8CO-, CH3(CH2)20CO- y CH3(CH2)22CO-.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo acilo de un ácido alcano a,w-dicarboxílico de cadena lineal o ramificada.

En una realización de la invención el grupo acilo del sustituyente lipófilo se selecciona del grupo que comprende HOOC(CH2)mCO-, en donde m es 4 a 38, tales como HOOC(CH2)i4CO-, HOOC(CH2) isCO-, HOOC(CH2) i8CO, HOOC(CH2)2oCO- y HOOC(CH2)22CO-.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-, en donde p y q son números enteros y p+q es un número entero de 8 a 40, tal como de 12 a 35.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula CH3(CH2)rCO-NH-CH(COOH)(CH2)2CO-, en donde r es un número entero de 10 a 24.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula CH3(CH2)sCO-NH-CH((CH2)2COOH)CO-, en donde s es un número entero de 8 a 24.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula COOH(CH2)tCO- en donde t es un número entero de 8 a 24.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3, en donde u es un número entero de 8 a l8.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3, en donde w es un número entero de 10 a 16.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3, en donde x es un número entero de 10 a 16.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es un grupo de fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2cH(COOH)NHCO(CH2)yCH3, en donde y es cero o un número entero de 1 a 22.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es N-litocoloílo.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es N-coloílo.

En una realización de la invención la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina tiene un sustituyente lipófilo. En una realización de la invención la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina tiene dos sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina tiene tres sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención la molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina tiene cuatro sustituyentes lipófilos.

Ejemplo 1

Detección de transcripción alternativa del gen MASP1

Métodos: Para detectar las tres variantes de transcripción de MASP1: MASP1, MASP3 y FAP, se diseñaron cebadores específicos para cada variante. La PCR se estableció con un cebador directo común en el exón 6 (5'-gcacccagagccacagtg-3') y cebadores inversos específicos: MASP1 en el exón 12 (5'-gccttccagtgtgtgggc-3'), MASP3 en el exón 11 (5-gccttccagagtgtggtca-3') y FAP en el exón 8a (5'-cgatctggagagcgaactc-3') (figura 1). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en volúmenes de 20 pl que contenían: 50 ng de ADNc de hígado (Clontech), 0,25 pM de cada cebador, MgCl 2,5 mM2, dNTP 0,2 mM, KCI 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,4 y 0,4 unidades de ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron con los siguientes parámetros de ciclo: 10 min 94 (°C) 30 o 40 ciclos (30 s 94 °C, 50 s 58 (°C) 90 s 72 (°C) 10 min 72 °C. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 2 %.

Resultados: La transcripción alternativa del gen MASP1 se detectó en el ADNc del hígado. Los transcritos MASP1, MASP3, y FAP se amplificaron usando un cebador directo común ubicado en el exón 6 y cebadores inversos específicos ubicados en el exón 12 (MASP1), exón 11 (MASP3) y exón 8a (FAP). MASP1 genera un fragmento de 500 pb, MASP3 genera un fragmento de 506 pb y FAP genera un fragmento de 309 pb.

Expresión tisular del fragmento FAP

Métodos: Se investigaron paneles de ADNc de tejido humano disponibles en el mercado (Clontech) para la expresión de MASP1, MASP3 y FAP con los mismos ensayos de PCR descritos anteriormente. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 2 %.

Resultados: Las distribuciones tisulares de los genes MASP1, MASP3 y FAP se investigaron en paneles de ADNc de Clontech (figura 2). Los transcritos MASP1, MASP3 y FAP se amplificaron usando un cebador directo común y cebadores inversos específicos. Se usó GADPH como gen de referencia. Los tres genes se expresaron altamente en el hígado y, adicionalmente, FAP se expresó fuertemente en el tejido cardíaco (marcado con flechas negras). Se detectó una expresión menor del gen FAP en cerebro, colon, próstata, músculo esquelético e intestino delgado (marcado con flechas blancas).

Secuenciación del ADN del exón 8a de FAP de 100 individuos.

Métodos: La secuenciación directa del exón 8a incluyendo el límite intrón-exón del gen MASP1/MASP3/FAP que se extiende desde la posición 44.083 a 44.431 en relación con el sitio de inicio de traducción ATG, se realizó en moldes de ADN genómico de 100 individuos caucásicos sanos. El fragmento se amplificó utilizando un único conjunto de cebadores (directo: 5'-ctgttcttcacactggctg-3', inverso: 5'-ctgctgagatcatgttgttc-3'), donde los cebadores directos contenían una secuencia 5'-T7 (5'-ttatacgactcacta-3'). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en volúmenes de 20 pl que contenían: 50 ng de ADN genómico, 0,25 pM de cada cebador, MgCl 2,5 mM2, dNTP 0,2 mM, KCI 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,4 y 0,4 unidades de ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron con los siguientes parámetros de ciclo: 2 min 94 °C, 15 ciclos (30 s 94 °C, 60 s 64 °C, 60 s 72 °C, 15 ciclos (30 s 94 °C, 60 s 58 °C, 60 s 72 °C, 5 min 72 °C y se secuenciaron en la dirección de avance usando el kit de terminación de secuenciación de ciclo ABI BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con el protocolo usando cebadores de secuencia 5'-biotinilados. Las reacciones de secuencia se purificaron en la estación de trabajo PyroMark Vacuum Prep (Biotage) usando perlas de estreptavidina (GenoVision). El análisis de secuencia se realizó en un analizador genético ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Las secuencias de ADN resultantes se alinearon usando el software BioEdit y los polimorfismos de ADN se confirmaron visualmente a partir de electroferogramas de secuencia.

Resultados: Todas las secuencias se alinearon usando el software BioEdit. No se observaron variaciones genéticas en los 100 individuos sanos en el exón 8a o en las regiones exón-intrón.

Ejemplo 2

Inmunoprecipitación.

La inmunoprecipitación específica de MAP-1 del suero se realizó con el mAb 20C4 específico de MAP-1 (generado contra el péptido C-terminal 17 específico de MAP-1) o el mAb 8B3, un anticuerpo monoclonal que reacciona contra la cadena pesada común de MASP-1/3 usado como anticuerpo de precipitación de control. Se permitió que un total de 10 pg de anticuerpo anti MAP-1 o MASP-1/3 se uniera a Dynabeads de IgG anti-ratón o conejo de oveja (M-280, cat. 112.02D/112.04D, Dynal/Invitrogen). Después de una etapa de lavado las perlas se aplicaron a un conjunto de suero humano normal (diluido 1:1 en TBS) y se incubaron de punta a punta durante 1 hora a 4 °C. Después de las etapas de lavado finales y la separación magnética, las perlas se hirvieron en tampón de carga de SDS y se sometieron a SDS-PAGE y se sondaron las transferencias Western con anticuerpos contra MAP-1, MBL y Ficolina-3.

Se realizó el mismo procedimiento de precipitación que se describió anteriormente con mAb para MBL (Hyb 131-11, Bioporto, Dinamarca), Ficolina-2 (FCN219) y Ficolina-3 (FCN334). Para compensar las diferencias en las concentraciones séricas de MBL, Ficolina-2 y -3 se precipitaron a partir de 1 ml, 300 pl y 100 pl de suero, respectivamente. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y se sondaron las transferencias Western con pAb contra MAP-1.

Inmunohistoquímica.

Las células CHO que expresan rMAP-1 se cultivaron en matraces de cultivo en RPMI 10 %. Las células se recogieron a una confluencia del 80-90 %, las células se recogieron y se fijaron durante 24 h en formaldehído al 4 %-PBS y posteriormente se incluyeron en parafina. Seis tejidos de hígado humano diferentes y muestras de dos tejidos de miocardio diferentes, dos tejidos de músculo esquelético y dos muestras obtenidas de aorta humana también se fijaron y se embebieron en parafina como se describió anteriormente. Se obtuvieron secciones para portaobjetos de 5 pm con un micrótomo Leitz Wetzlar y se colocaron en portaobjetos de vidrio y se almacenaron a 4 °C hasta su análisis. Los pretratamientos y análisis se realizaron como se describió anteriormente. Los anticuerpos primarios fueron los anticuerpos monoclonales específicos de MAP-1 mAb 12B11 o anti-MAP-1 monoespecífico de conejo purificados por afinidad todo diluido a 5 pg/ml. Se aplicaron controles de anticuerpo de isotipo a los tejidos a la misma concentración. El anticuerpo secundario fue el anticuerpo EnVision™ (HRP-anti-ratón o HRp-anti-conejo, Dako, Glostrup, Dinamarca). El análisis de los patrones de tinción se realizó bajo un microscopio Leica DMLB2.

SDS-PAGE y transferencia Western.

La electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 10 % o 4-12 % (p/v) con tampones discontinuos utilizando el sistema NuPAGE® (Invitrogen) esencialmente como recomienda el fabricante. La transferencia Western se realizó utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 pg/ml de mAb primarios y visualización secundaria con estreptavidina conjugada con HRP (P0397, Dako) diluida a 1:1500 o HRP-conejo anti-IgG de ratón (PO260, Dako) diluido a 1:1000 en PBS, Tween20 al 0,05 %. Las membranas se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma) (0,04 % en acetona) y H2O2 al 0,015 % en tampón de acetato sódico 50 mM pH 5.

Ensayo de activación del complemento.

La influencia de MAP-1 sobre la deposición del factor de complemento C4 mediada por MBL y Ficolina-3 se evaluó esencialmente como se describió anteriormente. Brevemente, se inmovilizó manano (ligando MBL) (Sigma-Aldrich M7504) o albúmina de suero bovino acetilada (ligando Ficolina-3) en placas de ELISA Maxisorp (Nunc, Dinamarca) a 10 pg/ml. Después de lavarse con, rMBL o rFicolina-3 (0,4 pg/ml) se añadió y se incubó durante 1,5 horas. Se aplicó rMAP-1 o rMASP-2 durante 1 hora en diluciones seriadas dobles en la primera dimensión seguido de incubación durante 45 min a 37 °C con diluciones seriadas de suero deficiente de MBL o Ficolina-3 en la segunda dimensión. La deposición de C4 se midió usando un pAb para C4c (Q0369, Dako, Glostrup/Dinamarca).

Además los presentes inventores evaluaron el desplazamiento de MASP-2 con MAP-1 usando un sistema puro. Se preincubó rMASP-2 durante 45 min a 20 °C en diluciones seriadas en la primera dimensión en una matriz de rMBL/manano como se describió anteriormente seguido de incubación con diluciones de rMAP-1 en la segunda dimensión durante 45 min a 20 °C. C4 purificado (de Quidel, CA, EE.UU.) se añadió a una concentración de 1 pg/ml y se incubó durante 45 min a 37 °C. La detección se realizó como anteriormente.

Resultados.

MAP-1 coprecipita con Ficolina-2, Ficolina-3 y MBL

Para investigar una posible asociación de MAP-1 con MBL y Ficolina-3, los presentes inventores precipitaron complejos de suero usando mAb20C4 anti MAP-1 y un mAb contra la cadena pesada común de MASP-1 y MASP-3 (mAb8B3). Posteriormente los precipitados se analizaron mediante transferencia Western con sonda con anticuerpos contra m AP-1, MBL y Ficolina-3, respectivamente. Los presentes inventores observaron bandas pronunciadas de coprecipitación de Ficolina-3, pero también se observaron bandas más débiles con MBL (figura 24A). Las muestras no se sondaron con anticuerpos contra Ficolina-2 ya que no funcionaron en transferencia Western. Después revirtieron la inmunoprecipitación usando mAb contra MBL, Ficolina-2 y Ficolina-3 para precipitar 1 ml, 300 pl y 100 pl de suero, respectivamente, lo que se realizó para ajustar las diferencias en la concentración sérica de MBL (2 pg/ml), Ficolina-2 (5 pg/ml) y Ficolina-3 (20 pg/ml), respectivamente. Posteriormente las muestras se analizaron mediante transferencia Western con sonda con anticuerpos contra MAP-1. Se observaron distintas bandas de MAP-1 en los precipitados de Ficolina-2 y -3 y se observó una banda mucho más débil en el precipitado de MBL, donde rMAP-1 inmunoprecipitado y MAP-1 en suero sirvieron como controles (figura 24B).

MAP-1 inhibe la actividad del complemento de la ruta de las lectinas.

Se usó suero deficiente de MBL y Ficolina-3 en combinación con rMBL y rFicolina-3 para reconstituir la actividad de activación de C4 del complemento de MBL y Ficolina-3. El manano y la BSA acetilada sirvieron como ligandos para MBL y Ficolina-3, respectivamente. Tanto rMBL como rFicolina-3 pudieron iniciar la deposición de C4 en sueros deficientes en MBL y Ficolina-3, respectivamente (figura 25A y 25D). La aplicación de rMASP-2 dio como resultado un fuerte aumento positivo dependiente de la dosis de la deposición de C4 a través de las rutas de activación de Ficolina-3 y MBL (figura 25B y 25E), mientras que la aplicación de rMAP-1 dio como resultado una pronunciada inhibición dependiente de la dosis de la deposición de C4 a través de ambas rutas (figura 25C y 25F).

Además, los presentes inventores abordaron un posible desplazamiento de MASP-2 con MAP-1 usando un sistema de componentes puros que comprende solo rMBL, rMASP-2, rMAP-1 y C4 purificado. Se preincubó rMASP-2 con complejos manano/rMBL en diluciones seriadas. En lo sucesivo, se añadió rMAP-1 en concentraciones variables seguido de la adición de C4 purificado. La aplicación de rMAP-1 al sistema resultó claramente en una inhibición dependiente de la dosis de la deposición de C4 (figura 26).

Ejemplo 3

Las moléculas quiméricas compuestas por MAP-1 y otras proteínas inhibidoras del complemento se generan de acuerdo con los siguientes procedimientos convencionales de ejemplo. La proteína MAP-1 (completa) se conjuga con las siguientes proteínas humanas: Factor I, Factor H, C4bp y C1inh usando métodos convencionales para el acoplamiento covalente, tales como:

1) Se usa clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, un reticulante de longitud cero) para acoplar la proteína MAP-1 a otros conjugados mediante un acoplamiento de grupos carboxilo a aminas primarias como lo describe el fabricante (Pierce, n.° CAS 25952-53-8).

2) Se usa suberato de succinimidilo (DSS) (con un brazo espaciador de 8 carbonos) para acoplar la proteína MAP-1 a otros conjugados mediante el acoplamiento de amina a grupos de aminas como lo describe el fabricante (Pierce, n.° CAS 68528-80-3).

3) Se usa EMCS (éster de [Ne-Maleimidocaproiloxi]succinimida) (con un brazo espaciador de 9,4 a) se usa para acoplar la proteína MAP-1 a otros conjugados mediante el acoplamiento de sulfhidrilo a grupo amino como describe el fabricante (Pierce, n.° de producto 22308).

Ejemplo 4

La siguiente lista son ejemplos de construcciones de la presente invención elaboradas de acuerdo con las enseñanzas del presente documento. Todas las construcciones tienen la fórmula básica de MAP-1-enlazador-modulador del complemento o modulador del complemento-enlazador-MAP-1. Las construcciones también pueden generarse sin ningún enlazador. Las notaciones entre paréntesis indican detalles dentro de una sección particular de la composición. Por ejemplo, "(completo)" significa que la secuencia de la proteína madura completa con la secuencia de aminoácidos 20-380 de la FAP humana nativa (SEQ ID NO: 1) se usa en la construcción. Se entiende que esta lista no es limitante y solo proporciona ejemplos de algunas de las construcciones descritas en la presente solicitud. MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-DAF

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Factor H

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-CD59 humano

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-MCP

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-R1

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Crry

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-CD59 de ratón

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Fc de IgG 1 humana

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Fc de IgM humana

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Fc de IgG3 murina

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Fc de IgM murina

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Factor I

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-C4bp

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-C1 inh

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-DAF

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Factor H

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-CD59 humano

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-MCP

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-CR1

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Crry

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-CD59 de ratón

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Fc de IgG 1 humana

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Fc de IgM humana

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Fc de IgG3 murina

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Fc de IgM murina

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-Factor I

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-C4bp

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-C1 inh

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-DAF (SCR 2-4)

MAP-1 (completo)-(Gly3Ser)4-DAF (SCR 2-4)

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-CR1 (LP-SCR1-4-SCR8-11-SCR15-18)

MAP-1 (completo)-(Gly4Ser)3-Crry (5 SCR N-terminal)

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-DAF

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Factor H

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-CD59 humano

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-MCP

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-CR1

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Crry

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-CD59 de ratón

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Fc de IgG1 humana

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Fc de IgM humana

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Fc de IgG3 murina

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Fc de IgM murina

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Factor I

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-C4bp

MAP-1 (completo)-VSVFPLE-Clinh

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-DAF

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-CD59 humano

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-MCP

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-CR1

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Crry

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-CD59 de ratón

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Fc de IgG1 humana

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Fc de IgM humana

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Fc de IgG3 murina

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Fc de IgM murina

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Factor I

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-C4bp

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Clinh

MAP-1 (completo)-m-éster de Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-Factor H

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-DAF

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Factor H

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-CD59 humano

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-MCP

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-CR1

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Crry

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-CD59 de ratón

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Fc de IgG1 humana

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Fc de IgM humana

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Fc de IgG3 murina

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Fc de IgM murina

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Factor I

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-C4bp

MAP-1 (completo)-bismaleimidohexano-Clinh

Ejemplo 5

Secuencias específicas de ejemplo de moléculas quiméricas MAP-1, que pueden producirse como proteínas de fusión: Las proteínas de fusión humanas que contienen una porción polipeptídica asociada a ficolina y un segundo modulador de la actividad del complemento pueden prepararse mediante un método de clonación de ADN recombinante y expresión génica.

Secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica MAP-1/FH humana de ejemplo (SEQ ID NO: 25) y una secuencia polinucleotídica de ejemplo que codifica la proteína quimérica MAP-1/FH humana (SEQ ID NO: 26). La construcción se ilustra en la figura 27.

Secuencia de aminoácidos de una proteína quimérica FH/MAP-1 humana de ejemplo (SEQ ID NO: 27) y una secuencia polinucleotídica de ejemplo que codifica la proteína quimérica FH/MAP-1 humana (SEQ ID NO: 28). La construcción se ilustra en la figura 27. Las secuencias de aminoácidos de MAP-1 humana (SEQ ID NO: 29-31) son todas ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como la parte de MAP-1 de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. Las secuencias de aminoácidos de FH humana (SEQ ID NO: 32-36) son todas ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como la parte de FH de una proteína quimérica de acuerdo con la invención.

En los siguientes ejemplos la parte de FH puede reemplazarse por uno cualquiera de C4bp, FI o C1-inh:

Las secuencias de aminoácidos de C4bp humana (SEQ ID NO: 37-40) son todas ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como una parte de C4bp de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. La construcción se ilustra en la figura 28.

Las secuencias de aminoácidos de FI humana (SEQ ID NO: 41-44) son todas ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como la parte de FI de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. La construcción se ilustra en la figura 29.

Las secuencias de aminoácidos de C1-inh humana (SEQ ID NO: 45) son todas ejemplos adecuados de secuencias que podrían usarse como la parte de C1-inh de una proteína quimérica de acuerdo con la invención. La construcción se ilustra en la figura 30.

Ejemplo 6

Procedimiento de ejemplo detallado para la producción de proteína de fusión MAP-1/FH:

Construcción de vectores de expresión

El vector pEDdC, que lleva una secuencia de clonación para la inserción del gen diana seguida del marcador seleccionable y amplificable (dhfr), se usará para la expresión del gen de fusión.

Se diseñan dos conjuntos de cebadores para que cada gen esté enlazado. Estos cebadores contienen secuencias de enzimas de restricción adaptables con el vector de expresión. Los cebadores se desarrollan para amplificar las dos proteínas de fusión, MAP-1 y FH. MAP-1 y FH tendrán secuencias de enzimas de restricción idénticas en la región a enlazar. Puede incorporarse una secuencia enlazadora opcional.

Para poder obtener la expresión de proteínas en el sobrenadante de cultivo celular, puede incorporarse una construcción que contenga un péptido señal opcional. Para la expresión citoplasmática de proteína quimérica, la construcción no contiene el péptido señal. De esta manera, la proteína de fusión se expresaría y se acumularía en el área citoplásmica de la célula hospedadora en lugar de la del sobrenadante.

Construcción de genes de fusión

La clonación de MAP-1/FH se realiza brevemente como sigue. Los genes MAP-1 y FH se amplifican a partir de ADNc de hígado humano y se procesan en gel de agarosa. Después, el gen se extrae del gel, se purifica y se digiere con las respectivas enzimas de restricción. Los productos se purifican y los dos genes se ligan. Después de la ligación, la construcción génica se purifica y se inserta en el vector pED y se caracteriza. El vector pEDdC/MAP-1/FH se transforma en bacterias Escherichia co liy se siembra en medio selectivo LB (que contiene 100 |jg/ml de ampicilina) y se deja crecer durante la noche a 37 °C. Las colonias bacterianas se seleccionan para detectar la presencia de ambos genes mediante PCR de colonias. Se recogen las colonias positivas, se rayan y se cultivan en LB. Los plásmidos se purifican y se secuencian para confirmar la secuencia.

Transfección y expresión de MAP-1/FH

La construcción pEDdC/MAP-1/FH se transfecta en la línea celular DG44 de ovario de hámster chino (CHO). Este clon CHO es un mutante de doble deleción que no contiene copias del gen dhfr de hámster. Las células no transfectadas se cultivan en IMDM suplementado con dFBS al 10 %, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, L-glutamina 2 mM, Hipoxantina 10 mM y timidina 1,6 mM (suplemento HT) en una atmósfera humidificada a 37 °C que contiene 5 % de CO2. Las células se pasan utilizando tripsina al 0,05 % en PBS. Las transfecciones estables se realizan usando el kit de reactivos LipofectAMINE PLUS. La transfección se realiza sembrando 8 x 105 células en pocillos de cultivo de 6 cm el día 0. El día 1, el medio celular se reemplaza y las células se transfectan de acuerdo con el protocolo del fabricante, añadiendo 60 j l de LipofectAMINE, 0,2 jg de pSV2neo y 20 jg del vector pEDdC/MAP-1/FH. El día 3, las células se transfieren a matraces de 25 cm2 y el día 5, las células se transfieren a un medio que contiene 0,5 mg/ml de G418 y que carece de hipoxantina y timidina. Los clones resistentes a G418 se obtienen normalmente después de 12 días. La selección y la amplificación de genes con MTX se inician cultivando células en medio celular que contiene 0,5 mg/ml de G418, MTX 50 nM, que carecía de hipoxantina y timidina. Cuando las células recuperan la tasa de crecimiento y la morfología normales, la concentración de MTX se aumenta gradualmente hasta 200 nM.

Ejemplo 7

Proteínas quiméricas de rMAP-1 y Factor H.

Purificación de proteínas

El factor H de plasma humano se purificó esencialmente como lo describe Laine et al. J Immunol 2007; 178:3831-6 con la modificación de que el anticuerpo monoclonal anti Factor H humano Hyb 268-01 (Bioporto A/S, Gentofte, Dinamarca) se acopló a la matriz de purificación y se usó para purificar por afinidad el factor H.

Se expresaron aptámeros recombinantes de longitud completa, no etiquetados de MBL/Proteína-1 asociada a Ficolina (rMAP-1) en células CHO DG 44 en medio sin suero (SFM) (CHO c D-1, Lonza) y RPMI 1640 con suero de ternero fetal al 10 % (FCS) y se purificaron como se describió anteriormente Skjoedt MO, et al. Serum concentration and interaction properties of MBL/ficolin associated protein-1. Immunobiology doi:101016/jimbio201009011.

Se expresó lectina de unión a manosa recombinante (rMBL), de longitud completa, sin etiquetar en células CHO DG 44 en medio sin suero (SFM) (CHO CD-1, Lonza) y se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de manano-agarosa como se describió anteriormente Skjoedt MO, et al. J Biol Chem 2010; 285:8234-43.

SDS-PAGE

Se usó Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% y tinción de Coomassie para determinar la composición molecular y la pureza de las proteínas mencionadas anteriormente. Las condiciones fueron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen).

Acoplamiento de proteínas

rMAP-1 y el factor H se enlazaron covalentemente mediante acoplamiento de glutaraldehído de acuerdo con las recomendaciones de Carter JM. Conjugation of Peptides to Carrier Proteins via Glutaraldehyde The Protein Protocols Handbook, Parte VII, 679-687, DOI: 101007/978-1-60327-259-9_117: Springer, 1996. El producto conjugado se denomina molécula híbrida de rMAP-1/Factor H.

Ensayos de activación del complemento

La activación del complemento dependiente de MBL se analizó con las proteínas purificadas descritas anteriormente. Los métodos y reactivos utilizados en estos ensayos se han descrito previamente (Skjoedt MO, etl al. J Biol Chem 2010; 285:8234-43, and Palarasah Y, et al. J Clin Microbiol; 48:908-14), excepto por la inclusión del factor H plasmático y la molécula híbrida rMAP-1/Factor H descrita aquí.

Resultados y análisis

Análisis de proteínas

El análisis del MAP-1 recombinante purificado reveló una masa molecular no reducida esperada de =45 kDa (Figura 31). No se observó formación disfuncional de puentes disulfuro. El análisis del Factor H en plasma purificado reveló una masa molecular esperada de = 150 kDa (Figura 31). Se observó una alta pureza tanto para rMAP-1 como para Factor H.

El análisis de MBL recombinante purificado reveló una masa molecular no reducida esperada de =30 kDa. Se observó una alta pureza para rMBL (Figura 32). El patrón de análisis no reducido de rMBL reveló una oligomerización mediada por puente disulfuro comparable con MBL derivada de suero nativo (Figura 32).

Ensayos de deposición de complemento

Un esquema sencillo ilustra la composición de los ensayos empleados a continuación (Figura 33).

Inicialmente, la molécula híbrida de rMAP-1/Factor H se introdujo en el ensayo de complemento dependiente de MBL para investigar si esta proteína quimérica es capaz de inhibir la activación y deposición del factor de complemento C3. La Figura 34 ilustra una clara inhibición dependiente de la dosis mediada por la proteína quimérica de la activación de C3 dependiente de MBL.

Para investigar más a fondo si rMAP-1 y el factor H se unen a rMBL en las condiciones empleadas aquí, los presentes inventores midieron la asociación con anticuerpos monoclonales específicos para MAP-1 y Factor H, respectivamente. La Figura 35A muestra la unión de rMAP-1 a rMBL unido a manano. La molécula híbrida de rMAP-1/Factor H muestra una unión reducida a rMBL en comparación con la rMAP-1 no conjugada, sugiriendo que una parte del rMAP-1 unido al Factor H tiene un cambio conformacional. La Figura 35B muestra la unión del factor H a rMBL. Como era de esperar, solo el Factor H en la forma híbrida de rMAP-1/Factor H es capaz de unirse al complejo MBL/manano.

El factor H plasmático purificado no muestra ningún efecto sobre la deposición de C3 (Figura 36A) o la formación del complejo C9/Complemento terminal (Figura 36B) en el ensayo MBL. En contraste con esto, el rMAP-1 purificado mostró una inhibición significativa de la deposición de C3 (Figura 37A) y la formación del complejo C9/Complemento terminal (Figura 37B). Cuando rMAP-1 purificado no conjugado y Factor H se aplican juntos en los ensayos, los patrones de deposición son equivalentes a los resultados obtenidos con rMAP-1 solo (Figura 38A-B). Estos datos muestran que el factor H no juega un papel a menos que esté unido covalentemente a rMAP-1. Cuando se emplea la molécula híbrida de rMAP-1/Factor H en los ensayos de activación del complemento, se produce una pronunciada inhibición dependiente de la dosis tanto de la deposición de C3 (Figura 39A) como de la formación del complejo del complemento C9/Terminal (Figura 39B). Esto es a pesar del hecho de que una gran proporción de rMAP-1 presumiblemente no es capaz de unirse a rMBL debido al plegamiento incorrecto después del acoplamiento de glutaraldehído (véase la Figura 35A). Por tanto, una molécula híbrida de MAP-1/Factor H combinada podría ser un potente regulador de la inflamación in vivo provocada por la activación del complemento y quizás también podría funcionar a niveles donde se ha demostrado que las proteínas relacionadas con la ruta de las lectinas juegan un papel (apoptosis, necrosis, trombosis y coagulación).

SEQ ID NO: 1. Las secuencias completas de 380 aminoácidos para FAP humana. (Se destacan dos posibles sitios de glucosilación identificados en la posición de los aminoácidos 49 y 178):

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELHHMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQV LATFCGRETTDTEQTFGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHWYIGGYYCSCRFGY ILHTDKRTCRVECSDMLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGP PCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDHSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDHVEMDT PQIECLEDGTWSNEIFTCKKHEIDLESELKSE ^W TE

SEQ ID NO: 2. Las secuencias de nucleótidos de ADNc completas para FAP humana:

atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagctaaacaatatgtt tggccagatccagtcgcctggttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtcccagatgggt ttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttggaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaaggtagaaactgag gaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggaggtggtcctctcccctgg ctccttcatgtceatcactttccggtcagatttetccaatgaggagcgtttcacaggctttgatgcccactacatggctgtgg atgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccacaactacattggcggctactactgc tcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagtgcagtgacaacctcttcactcaaaggac tggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctgaatgcctgtataccatcgagctggaggagggtt tcatggtcaacctgcagtttgaggacatatttgacattgaggaccatcctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatc aaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaagccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgat cctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctggaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctac agcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaagccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggc tacaaagtgctgaaggataatgtggagatggacacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcc cacctgtaaaaaaaatgaaatcgatctggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtga

SEQ ID NO: 3. Secuencia mínima de un polipéptido asociado a ficolina que comprende los dominios CUB1-EGF-CUB2 que incluyen un péptido señal de los aminoácidos 1-19. La secuencia corresponde del exón 2 al exón 6:

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQ VLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYD YIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAA

SEQ ID NO: 4. 17 aminoácidos terminales únicos de FAP:

KNEIDLESELKSEQVTE

SEQ ID NO: 5 Secuencia de proteínas de MASP-1 humana:

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFIELESSYLCEYDYVKVETE

DQVLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYC

SCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKI

KVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTG

AQGVWMNKVLGRSLPTCLPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPWIAMLSHLNGQPFCGGSLLGSSWIVTAAHCLHQSLDP

EDPTLRDSDLLSPSDFKIILGKHWRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGPQQEG

AMVIVSGWGKQFLQRFPETLMEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGGPMVTLNRERGQWYLVG

TVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRN

SEQ ID NO: 6 secuencia de ADNc de MASP-1 humana:

GAAGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGAAGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGAAGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGG AGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAAAGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGG GGAAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGAACAAAGATAAGGCATCACGGACACC

ACACCGGGCACGAGCTCACAGGCAAGTCAAGCTGGGAGGACCAAGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTG GCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAAAGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCCAGATC CAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGAATATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGC TTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCTTTGTGAATATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGC AACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATC ACTTTCCGGTCAGATTTCTCCAATGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGG AGAGGGAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACAT CCTCCACACAGACAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGAC TTCCCAAACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATCGAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGG ACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTGGGGCC TTTCTGTGGAGAGAAAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACAACTCGGGAGAG AACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATGGGAAAATCGAGCCCT CCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGA CACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGTAACAAGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGA GAGCTGGAACACGGGCTGATCACCTTCTCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAGTCTGAGATCAAATACTCCTGTCAGGAGC CCTATTACAAGATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGGAGAAG CCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCTTCAATGGACGCCCAGCCCAG AAAGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCCCTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGA TCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTCGATCCGGAAGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGA CTTCAAAATCATCCTGGGCAAGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAAACACACCACTCTCCAC CCCCAGTATGATCCCAACACATTCGAGAATGACGTGGCTCTGGTGGAGCTGTTGGAGAGCCCAGTGCTGAATGCCTTCGTGATGC CCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGAAGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGGGGAAGCAGTTCTTGCAAAGGTTCCC AGAGACCCTGATGGAGATTGAAATCCCGATTGTTGACCACAGCACCTGCCAGAAGGCTTATGCCCCGCTGAAGAAGAAAGTGACC AGGGACATGATCTGTGCTGGGGAGAAGGAAGGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATA GAGAAAGAGGCCAGTGGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGAAGGACCGCTACGGAGTATACTCTTA CATCCACCACAACAAGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGAACTGAATTTGGCTCCTCAGCCCCAGCACCACCAGCTGT GGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCTTTCCTTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATC CATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTCACTCTCTTTAAAGAGATGGAGCAAGAGAGTGGTCAGAACACAGGC CGAATCCAGGCTCTATCACTTACTAGTTTGCAGTGCTGGGCAGGTGACTTCATCTCTTCGAACTTCAGTTTCTTCATAAGATGGA AATGCTATACCTTACCTACCTCGTAAAAGTCTGATGAGGAAAAGATTAACTAATAGATGCATAGCACTTAACAGAGTGCATAGCA TACACTGTTTTCAATAAATGCACCTTAGCAGAAGGTCGATGTGTCTACCAGGCAGACGAAGCTCTCTTACAAACCCCTGCCTGGG TCTTAGCATTGATCAGTGACACACCTCTCCCCTCAACCTTGACCATCTCCATCTGCCCTTAAATGCTGTATGCTTTTTTGCCACC GTGCAACTTGCCCAACATCAATCTTCACCCTCATCCCTAAAAAAGTAAAACAGACAAGGTTCTGAGTCCTGTGGTATGTCCCCTA GCAAATGTAACTAGGAACATGCACTAGATGACAGATTGCGGGAGGGCCTGAGAGAAGCAGGGACAGGAGGGAGCCTGGGGATTGT GGTTTGGGAAGGCAGACACCTGGTTCTAGAACTAGCTCTGCCCTTAGCCCCCTGTATGACCCTATGCAAGTCCTCCTCCCTCATC TCAAAGGGTCCTCAAAGCTCTGACGATCTAAGATACAATGAAGCCATTTTCCCCCTGATAAGATGAGGTAAAGCCAATGTAACCA AAAGGCAAAAATTACAATCGGTTCAAAGGAACTTTGATGCAGACAAAATGCTGCTGCTGCTGCTCCTGAAATACCCACCCCTTTC CACTACGGGTGGGTTCCCAAGGACATGGGACAGGCAAAGTGTGAGCCAAAGGATCCTTCCTTATTCCTAAGCAGAGCATCTGCTC TGGGCCCTGGCCTCCTTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGTGGGCCCTGGTAGTTTGTACCCCAGGCCCCTATACTCTT CCTTCCTATGTCCACAGCTGACCCCAAGCAGCCGTTCCCCGACTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAACTCCCTCATCTTGCAA GGCCATAAGTGTTTTCCAAGCAAAATGCCTCTCCCATCCTCTCTCAGGAAGCTTCTAGAGACTTTATGCCCTCCAGAGCTCCAAG ATATAAGCCCTCCAAGGGATCAGAAGCTCCAAGTTCCTGTCTTCTGTTTTATAGAAATTGATCTTCCCTGGGGGACTTTAACTCT TGACCTGTATGCAGCTGTTGGAGTAATTCCAGGTCTCTTGAAAAAAAAGAGGAAGATAATGGAGAATGAGAACATATATATATAT ATATTAAGCCCCAGGCTGAATACTCAGGGACAGCAATTCACAGCCTGCCTCTGGTTCTATAAACAAGTCATTCTACCTCTTTGTG CCCTGCTGTTTATTCTGTAAGGGGAAGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATCAGACACTTGTCAAGCTAGCAGAAACTCCATTTTC AATGCCAAAGAAGAACTGTAATGCTGTTTTGGAATCATCCCAAGGCATCCCAAGACACCATATCTTCCCATTTCAAGCACTGCCT GGGCACACCCCAACATCCCAGGCTGTGGTGGCTCCTGTGGGAACTACCTAGATGAAGAGAGTATCATTTATACCTTCTAGGAGCT CCTATTGGGAGACATGAAACATATGTAATTGACTACCATGTAATAGAACAAACCCTGCCAAGTGCTGCTTTGGAAAGTCATGGAG GTAAAAGAAAGACCATTC

SEQ ID NO: 7 Secuencia de proteínas de MASP-3 humana:

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETE DQVLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYC SCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKI KVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTG YKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGIYTCS AQGVWMNKVLGRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRNAEPGLFPWQALIWEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHV LRSQRRDTTVIPVSKEHVTVYLGLHDVRDKSGAVNSSAARWLHPDFNIQNYNHDIALVQLQEPVPLGPHVMPVCLPRLEPEG PAPHMLGLVAGWGISNPNVTVDEIISSGTRTLSDVLQYVKLPWPHAECKTSYESRSGNYSVTENMFCAGYYEGGKDTCLGDS GGAFVIFDDLSQRWWQGLVSWGGPEECGSKQVYGVYTKVSNYVDWVWEQMGLPQSWEPQVER

SEQ ID NO: 8 secuencia de ADNc de MASP-3 humana:

GAAGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGAAGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGAAGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGG AGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAAAGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGG GGAAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGAACAAAGATAAGGCATCACGGACACC ACACCGGGCACGAGCTCACAGGCAAGTCAAGCTGGGAGGACCAAGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTG GCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAAAGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCCAGATC CAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGAATATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGC TTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCTTTGTGAATATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGC AACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATC ACTTTCCGGTCAGATTTCTCCAATGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGG AGAGGGAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACAT CCTCCACACAGACAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGAC TTCCCAAACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATCGAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGG ACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTGGGGCC TTTCTGTGGAGAGAAAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACAACTCGGGAGAG AACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATGGGAAAATCGAGCCCT CCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGA CACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGTAACAAGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGA GAGCTGGAACACGGGCTGATCACCTTCTCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAGTCTGAGATCAAATACTCCTGTCAGGAGC CCTATTACAAGATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGGAGAAG CCTACCCACCTGCCTTCCAGAGTGTGGTCAGCCCTCCCGCTCCCTGCCAAGCCTGGTCAAGAGGATCATTGGGGGCCGAAATGCT GAGCCTGGCCTCTTCCCGTGGCAGGCCCTGATAGTGGTGGAGGACACTTCGAGAGTGCCAAATGACAAGTGGTTTGGGAGTGGGG CCCTGCTCTCTGCGTCCTGGATCCTCACAGCAGCTCATGTGCTGCGCTCCCAGCGTAGAGACACCACGGTGATACCAGTCTCCAA GGAGCATGTCACCGTCTACCTGGGCTTGCATGATGTGCGAGACAAATCGGGGGCAGTCAACAGCTCAGCTGCCCGAGTGGTGCTC CACCCAGACTTCAACATCCAAAACTACAACCACGATATAGCTCTGGTGCAGCTGCAGGAGCCTGTGCCCCTGGGACCCCACGTTA TGCCTGTCTGCCTGCCAAGGCTTGAGCCTGAAGGCCCGGCCCCCCACATGCTGGGCCTGGTGGCCGGCTGGGGCATCTCCAATCC CAATGTGACAGTGGATGAGATCATCAGCAGTGGCACACGGACCTTGTCAGATGTCCTGCAGTATGTCAAGTTACCCGTGGTGCCT CACGCTGAGTGCAAAACTAGCTATGAGTCCCGCTCGGGCAATTACAGCGTCACGGAGAACATGTTCTGTGCTGGCTACTACGAGG GCGGCAAAGACACGTGCCTTGGAGATAGCGGTGGGGCCTTTGTCATCTTTGATGACTTGAGCCAGCGCTGGGTGGTGCAAGGCCT GGTGTCCTGGGGGGGACCTGAAGAATGCGGCAGCAAGCAGGTCTATGGAGTCTACACAAAGGTCTCCAATTACGTGGACTGGGTG TGGGAGCAGATGGGCTTACCACAAAGTGTTGTGGAGCCCCAGGTGGAACGGTGAGCTGACTTACTTCCTCGGGGCCTGCCTCCCC TGAGCGAAGCTACACCGCACTTCCGACAGCACACTCCACATTACTTATCAGACCATATGGAATGGAACACACTGACCTAGCGGTG GCTTCTCCTACCGAGACAGCCCCCAGGACCCTGAGAGGCAGAGTGTGGTATAGGGAAAAGGCTCCAGGCAGGAGACCTGTGTTCC TGAGCTTGTCCAAGTCTCTTTCCCTGTCTGGGCCTCACTCTACCGAGTAATACAATGCAGGAGCTCAACCAAGGCCTCTGTGCCA ATCCCAGCACTCCTTTCCAGGCCATGCTTCTTACCCCAGTGGCCTTTATTCACTCCTGACCACTTATCAAACCCATCGGTCCTAC TGTTGGTATAACTGAGCTTGGACCTGACTATTAGAAAATGGTTTCTAACATTGAACTGAATGCCGCATCTGTATATTTTCCTGCT CTGCCTTCTGGGACTAGCCTTGGCCTAATCCTTCCTCTAGGAGAAGAGCATTCAGGTTTTGGGAGATGGCTCATAGCCAAGCCCC TCTCTCTTAGTGTGATCCCTTGGAGCACCTTCATGCCTGGGGTTTCTCTCCCAAAAGCTTCTTGCAGTCTAAGCCTTATCCCTTA TGTTCCCCATTAAAGGAATTTCAAAAGACATGGAGAAAGTTGGGAAGGTTTGTGCTGACTGCTGGGAGCAGAATAGCCGTGGGAG GCCCACCAAGCCCTTAAATTCCCATTGTCAACTCAGAACACATTTGGGCCCATATGCCACCCTGGAACACCAGCTGACACCATGG GCGTCCACACCTGCTGCTCCAGACAAGCACAAAGCAATCTTTCAGCCTTGAAATGTATTATCTGAAAGGCTACCTGAAGCCCAGG CCCGAATATGGGGACTTAGTCGATTACCTGGAAAAAGAAAAGACCCACACTGTGTCCTGCTGTGCTTTTGGGCAGGAAAATGGAA GAAAGAGTGGGGTGGGCACATTAGAAGTCACCCAAATCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAGAATC CACCCCGCAGGATGTTCAGAGGGACCCACTCCTTCATTTTTCAGAGTCAAAGGAATCAGAGGCTCACCCATGGCAGGCAGTGAAA AGAGCCAGGAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCCCAACTGGCTGTATAACCTTTGAAAAATCATTTTCTTTGTCTGAGTC TCTGGTTCTCCGTCAGCAACAGGCTGGCATAAGGTCCCCTGCAGGTTCCTTCTAGCTGGAGCACTCAGAGCTTCCCTGACTGCTA GCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGCTGATTGTTCTCCTTCTCCCTGGAGCTCTCTCTCCTGAAAATCTCCATCAGAGCAAGGCAG CCAGAGAAGCCCCTGAGAGGGAATGATTGGGAAGTGTCCACTTTCTCAACCGGCTCATCAAACACACTCCTTTGTCTATGAATGG CACATGTAAATGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATATGCTTCACCATTCTGTAAAGGGCCTCTGCATTGTTGCTCCCATC AGGGGTCTCAAGTGGAAATAAACCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 9 Secuencia de proteínas de MASP-2 humana:

MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGA KVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNHLGGFYCS CRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQ TDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGY ELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEAD GFWTSSKGEKSLPVCEPVCGLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTAAGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIR MGTLKRLSPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNNKWINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGFL ARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWFVGGIVSWGSMNCGEAG QYGVYTKVINYIPWIENIISDF

SEQ ID NO: 10 secuencia de ADNc de MASP-2 humana:

GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCC GAAGTGGCCTGAACCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCAATGACCAGGAGCGGCGCT GGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAG TACGACTTCGTCAAGCTGAGCTCGGGGGCCAAGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGC CCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGT TCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGAC CACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTAACAAGCGCACCTG CTCAGCCCTGTGCTCCGGCCAGGTCTTCACCCAGAGGTCTGGGGAGCTCAGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCA AACTCTCCAGTTGCACTTACAGCATCAGCCTGGAGGAGGGGTTCAGTGTCATTCTGGACTTTGTGGAGTCCTTCGATGTG GAGACACACCCTGAAACCCTGTGTCCCTACGACTTTCTCAAGATTCAAACAGACAGAGAAGAACATGGCCCATTCTGTGG GAAGACATTGCCCCACAGGATTGAAACAAAAAGCAACACGGTGACCATCACCTTTGTCACAGATGAATCAGGAGACCACA CAGGCTGGAAGATCCACTACACGAGCACAGCGCAGCCTTGCCCTTATCCGATGGCGCCACCTAATGGCCACGTTTCACCT GTGCAAGCCAAATACATCCTGAAAGACAGCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTGGCTATGAGCTTCTGCAAGGTCACTTGCC CCTGAAATCCTTTACTGCAGTTTGTCAGAAAGATGGATCTTGGGACCGGCCAATGCCCGCGTGCAGCATTGTTGACTGTG GCCCTCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTGGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAAAGCTGTGATTCAG TACAGCTGTGAAGAGACCTTCTACACAATGAAAGTGAATGATGGTAAATATGTGTGTGAGGCTGATGGATTCTGGACGAG CTCCAAAGGAGAAAAATCACTCCCAGTCTGTGAGCCTGTTTGTGGACTATCAGCCCGCACAACAGGAGGGCGTATATATG GAGGGCAAAAGGCAAAACCTGGTGATTTTCCTTGGCAAGTCCTGATATTAGGTGGAACCACAGCAGCAGGTGCACTTTTA TATGACAACTGGGTCCTAACAGCTGCTCATGCCGTCTATGAGCAAAAACATGATGCATCCGCCCTGGACATTCGAATGGG CACCCTGAAAAGACTATCACCTCATTATACACAAGCCTGGTCTGAAGCTGTTTTTATACATGAAGGTTATACTCATGATG CTGGCTTTGACAATGACATAGCACTGATTAAATTGAATAACAAAGTTGTAATCAATAGCAACATCACGCCTATTTGTCTG CCAAGAAAAGAAGCTGAATCCTTTATGAGGACAGATGACATTGGAACTGCATCTGGATGGGGATTAACCCAAAGGGGTTT TCTTGCTAGAAATCTAATGTATGTCGACATACCGATTGTTGACCATCAAAAATGTACTGCTGCATATGAAAAGCCACCCT ATCCAAGGGGAAGTGTAACTGCTAACATGCTTTGTGCTGGCTTAGAAAGTGGGGGCAAGGACAGCTGCAGAGGTGACAGC GGAGGGGCACTGGTGTTTCTAGATAGTGAAACAGAGAGGTGGTTTGTGGGAGGAATAGTGTCCTGGGGTTCCATGAATTG TGGGGAAGCAGGTCAGTATGGAGTCTACACAAAAGTTATTAACTATATTCCCTGGATCGAGAACATAATTAGTGATTTTT AACTTGCGTGTCTGCAGTCAAGGATTCTTCATTTTTAGAAATGCCTGTGAAGACCTTGGCAGCGACGTGGCTCGAGAAGC ATTCATCATTACTGTGGACATGGCAGTTGTTGCTCCACCCAAAAAAACAGACTCCAGGTGAGGCTGCTGTCATTTCTCCA CTTGCCAGTTTAATTCCAGCCTTACCCATTGACTCAAGGGGACATAAACCACGAGAGTGACAGTCATCTTTGCCCACCCA GTGTAATGTCACTGCTCAAATTACATTTCATTACCTTAAAAAGCCAGTCTCTTTTCATACTGGCTGTTGGCATTTCTGTA AACTGCCTGTCCATGCTCTTTGTTTTTAAACTTGTTCTTATTGAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 11 Secuencia de proteínas de sMAP humano (MApl9):

MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGA KVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNHLGGFYCS CRAGYVLHRNKRTCSEQSL

SEQ ID NO: 12 secuencia de ADNc de sMAP humano (MApl9):

GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGAAGT

GGCCTGAACCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCAATGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGAC

TGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCAAG

CTGAGCTCGGGGGCCAAGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCT

ACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGC

AGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTC

TACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTAACAAGCGCACCTGCTCAGAGCAGAGCCTCTAGCCTCCCCTGGAGCTCC

GGCCTGCCCAGCAGGTCAGAAGCCAGAGCCAGCCTGCTGGCCTCAGCTCCGGGTTGGGCTGAGATGGCTGTGCCCCAACTCCCAT

TCACCCACCATGGACCCAATAATAAACCTGGCCCCACCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Cebadores de ADN:

SEQ ID NO: 13: 5'-gcacccagagccacagtg-3'

SEQ ID NO: 14: 5'-gccttccagtgtgtgggc-3'

SEQ ID NO: 15: 5-gccttccagagtgtggtca-3'

SEQ ID NO: 16: 5'-cgatctggagagcgaactc-3'

SEQ ID NO: 17: 5'-ctgttcttcacactggctg-3'

SEQ ID NO: 18: 5'-ctgctgagatcatgttgttc-3'

SEQ ID NO: 19: 5'-TTATACGACTCACTA-3'

SEQ ID NO: 20 (secuencia de aminoácidos del Factor H humano):

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKR PCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDR EYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDA VCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKH GGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVA CHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSIRCGKDG WSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPD RKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEWEYYCNPRFL MKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAI DKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYR DGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENET TCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFE NAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRS PYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPK CLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

SEQ ID NO: 21 (Secuencia de aminoácidos de C4bp alfa humana):

MHPPKTPSGALHRKRKMAAWPFSRLWKVSDPILFQMTLIAALLPAVLGNCGPPPTLSFAAPMDITLTETRFKTGTTLKYTCLP GYVRSHSTQTLTCNSDGEWVYNTFCIYKRCRHPGELRNGQVEIKTDLSFGSQIEFSCSEGFFLIGSTTSRCEVQDRGVGWSHP LPQCEIVKCKPPPDIRNGRHSGEENFYAYGFSVTYSCDPRFSLLGHASISCTVENETIGVWRPSPPTCEKITCRKPDVSHGEM VSGFGPIYNYKDTIVFKCQKGFVLRGSSVIHCDADSKWNPSPPACEPNSCINLPDIPHASWETYPRPTKEDVYWGTVLRYRC HPGYKPTTDEPTTVICQKNLRWTPYQGCEALCCPEPKLNNGEITQHRKSRPANHCVYFYGDEISFSCHETSRFSAICQGDGTW SPRTPSCGDICNFPPKIAHGHYKQSSSYSFFKEEIIYECDKGYILVGQAKLSCSYSHWSAPAPQCKALCRKPELVNGRLSVDK DQYVEPENVTIQCDSGYGWGPQSITCSGNRTWYPEVPKCEWETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQL ELQRDSARQSTLDKEL

SEQ ID NO: 22 (secuencia de aminoácidos de C4bp beta humana):

MFFWCACCLMVAWRVSASDAEHCPELPPVDNSIFVAKEVEGQILGTYVCIKGYHLVGKKTLFCNASKEWDNTTTECRLGHCPD PVLVNGEFSSSGPVNVSDKITFMCNDHYILKGSNRSQCLEDHTWAPPFPICKSRDCDPPGNPVHGYFEGNNFTLGSTISYYCE DRYYLVGVQEQQCVDGEWSSALPVCKLIQEAPKPECEKALLAFQESKNLCEAMENFMQQLKESGMTMEELKYSLELKKAELKA KLL

SEQ ID NO: 23 (secuencia de aminoácidos de FI humano):

MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFP TYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQ RRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADVVCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGD QSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNR MHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTVVDWIHPDLKRIVIEYVDRI IFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKF YGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQY NV

SEQ ID NO: 24 (secuencia de aminoácidos de Cl-inh humano):

MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTT DEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETN MAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPR VLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPV AHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEK LEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDP RA

S E Q ID NO: 25 (se cu e n c ia de a m in o á c id o s de M A P 1 /F H hum ano):

HTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDT EQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTD NRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVL GPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKV LKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTEGGGGSGGGGSCVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSD QTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGY QLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGF WSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGD YSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKP

SEQ ID NO: 26 (secuencia de ácido nucleico de MAP-1/FH humano):

CACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGG TGACTTGGAATATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCT TTGTGAATATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACA GAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTCCAATG AGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGGGAGGACGAGGAGCT GTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACATCCTCCACACAGAC AACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAA ACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATCGAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGA CATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTG GGGCCTTTCTGTGGAGAGAAAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACA ACTCGGGAGAGAACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCA TGGGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTG CTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGTAACAAGATTCCCACCT GTAAAAAAAATGAAATCGATCTGGAGAGCGAACTCAAGTCAGAGCAAGTGACAGAGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGG CGGATCTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGAC CAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTAT GCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCC TTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTAT CAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGA AGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGG ACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTT TGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGA

AGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGT ATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGAC TACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCC GGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCT

SEQ ID NO: 27 (secuencia de aminoácidos de FH/MAP-1 humana):

CVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFG TFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQA VRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCT ESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPGGGGSGG GGSHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRET TDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYIL HTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGP KVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTG YKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE

S E Q ID NO: 28 (se cu e n c ia de á c id o n u c le ico de FH /M A P -1 hum ana):

TGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACAT ATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAA GGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGT ACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGC TAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTT ACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCA GTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTA AAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTAT TTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACT GAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCAC CTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAA TACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATC TCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAG GTGACTTGGAATATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACC TTTGTGAATATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACAC AGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTCCAAT GAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGGGAGGACGAGGAGC TGTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACATCCTCCACACAGA CAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCA AACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATCGAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGG ACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTT GGGGCCTTTCTGTGGAGAGAAAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGAC AACTCGGGAGAGAACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCC ATGGGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGT GCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGTAACAAGATTCCCACC TGTAAAAAAAATGAAATCGATCTGGAGAGCGAACTCAAGTCAGAGCAAGTGACAGAG

SEQ ID NO: 29 (secuencia de aminoácidos de MAP-1: CUB1, EGF; CUB2, CCP1, sin 17 aminoácidos únicos):

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVK VETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCH NYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDH PEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQ AKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCK

SEQ ID NO: 30 (secuencia de aminoácidos de MAP-1: CUB1, EGF, CUB2):

WLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVE TEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPE VPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAA

SEQ ID NO: 31 (secuencia de aminoácidos de MAP-1: CUB2, CCP1):

VECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCG EKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNV EMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE

SEQ ID NO: 32 (secuencia de aminoácidos de FH humano, SCR 1-4):

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRK CQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIV SSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKC NMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEE

SEQ ID NO: 33 (secuencia de aminoácidos de FH humano, SCR 7-20):

RKCYFPYLENGYNQNHGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQY TYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSIRCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNT GSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPIC KEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWA QLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRC RGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQS IPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISH GVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTC ATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWT EPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMEN YNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

SEQ ID NO: 34 (secuencia de aminoácidos de FH humano, SCR 7-14):

KTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSIRCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFT WFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTI VGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEWEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLP VCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIIL EEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQ ENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGK WSSPPQCEG

SEQ ID NO: 35 (secuencia de aminoácidos de FH humano, SCR 12-14):

ESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLK NKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLI QEGEEITCKDGRWQSIPLCVEK

SEQ ID NO: 36 (secuencia de aminoácidos de FH humano, SCR 19-20):

TGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWT AKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

SEQ ID NO: 37 (secuencia de aminoácidos de C4bp humana, cadena alfa, SCR 1-3):

NCGPPPTLSFAAPMDITLTETRFKTGTTLKYTCLPGYVRSHSTQTLTCNSDGEWVYNTFCIYKRCRHPGELRNGQVEIK TDLSFGSQIEFSCSEGFFLIGSTTSRCEVQDRGVGWSHPLPQCEIVKCKPPPDIRNGRHSGEENFYAYGFSVTYSCDPR FSLLGHASISCTVENETIGVWRPSPPTCEK

SEQ ID NO: 38 (secuencia de aminoácidos de C4bp humana, cadena alfa, SCR 1-3 cadena beta, SCR 2):

NCGPPPTLSFAAPMDITLTETRFKTGTTLKYTCLPGYVRSHSTQTLTCNSDGEWVYNTFCIYKRCRHPGELRNGQVEIK TDLSFGSQIEFSCSEGFFLIGSTTSRCEVQDRGVGWSHPLPQCEIVKCKPPPDIRNGRHSGEENFYAYGFSVTYSCDPR FSLLGHASISCTVENETIGVWRPSPPTCEKGHCPDPVLVNGEFSSSGPVNVSDKITFMCNDHYILKGSNRSQCLEDHTW APPFPICKS

SEQ ID NO: 39 (secuencia de aminoácidos de C4bp humana, cadena alfa, SCR 1-3 cadena beta, SCR 12):

NCGPPPTLSFAAPMDITLTETRFKTGTTLKYTCLPGYVRSHSTQTLTCNSDGEWVYNTFCIYKRCRHPGELRNGQVEIK TDLSFGSQIEFSCSEGFFLIGSTTSRCEVQDRGVGWSHPLPQCEIVKCKPPPDIRNGRHSGEENFYAYGFSVTYSCDPR FSLLGHASISCTVENETIGVWRPSPPTCEKEHCPELPPVDNSIFVAKEVEGQILGTYVCIKGYHLVGKKTLFCNASKEW DNTTTECRLGHCPDPVLVNGEFSSSGPVNVSDKITFMCNDHYILKGSNRSQCLEDHTWAPPFPICKS

S E Q ID NO: 40 (secu en c ia de a m in o á c id o s de C 4 bp hum ana , ca d e n a a lfa , S C R 1-8 ca d e n a beta, S C R 13): NCGPPPTLSFAAPMDITLTETRFKTGTTLKYTCLPGYVRSHSTQTLTCNSDGEWYNTFCIYKRCRHPGELRNGQVEIK TDLSFGSQIEFSCSEGFFLIGSTTSRCEVQDRGVGWSHPLPQCEIVKCKPPPDIRNGRHSGEENFYAYGFSVTYSCDPR FSLLGHASISCTVENETIGVWRPSPPTCEKITCRKPDVSHGEMVSGFGPIYNYKDTIVFKCQKGFVLRGSSVIHCDADS KWNPSPPACEPNSCINLPDIPHASWETYPRPTKEDVYWGTVLRYRCHPGYKPTTDEPTTVICQKNLRWTPYQGCEALC CPEPKLNNGEITQHRKSRPANHCVYFYGDEISFSCHETSRFSAICQGDGTWSPRTPSCGDICNFPPKIAHGHYKQSSSY SFFKEEIIYECDKGYILVGQAKLSCSYSHWSAPAPQCKALCRKPELVNGRLSVDKDQYVEPENVTIQCDSGYGVVGPQS ITCSGNRTWYPEVPKCEWEHCPELPPVDNSIFVAKEVEGQILGTYVCIKGYHLVGKKTLFCNASKEWDNTTTECRLGHC PDPVLVNGEFSSSGPVNVSDKITFMCNDHYILKGSNRSQCLEDHTWAPPFPICKSRDCDPPGNPVHGYFEGNNFTLGST ISYYCEDRYYLVGVQEQQCVDGEWSSALPVCKL

SEQ ID NO: 41 (secuencia de aminoácidos de FI humano, SRCR, LDLRal, LDLRbl, SP):

KFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGL ETSLAECTFTKRRTMGYQDFADWCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKS GVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLL PKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQ LGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTY QNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYE KEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

SEQ ID NO: 42 (secuencia de aminoácidos de FI humano, LDLRal, LDLRbl, SP):

KADS PMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGF ASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWI LTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACV PWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMD ANNVTYVWGVVSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

SEQ ID NO: 43 (secuencia de aminoácidos de FI humano, LDLRbl, SP):

KACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHI RRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDR IIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLIS NCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGVVSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYH VGRPFISQYNV

SEQ ID NO: 44 (secuencia de aminoácidos de FI humano, SP):

VAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILT AAHCLRASKTHRYQIWTTVVDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPW

SPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDAN NVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoácidos de Cl-inh humano, dominio serpina):

HSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFT TKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAI YLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQ ALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTE TGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA

Secuencia de aminoácidos de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 1 (SEQ ID NO 46)

MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSR EEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFC LCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEA RCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCE DILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLAL RAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLN LTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSL DYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHT ALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVP VTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA

Secuencia de ácido nucleico de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 1 (SEQ ID NO 47)

gccacctgcgtgcaaaacctgcctgaccagtgcacgcccaacccctgcgataggaaggggacccaagcctgccaggacctcatgg gcaacttc ttctgcctgtg taaagctggctgggggggccggctctgcgacaaagatgtcaacgaatgcagccaggagaacggggg ctg cctcca gatctgccacaacaagccgggtag cttccactg ttcc tg cea ca g cg g cttcg a g c tc tcctctg atg g ca g g a cctg cc aagacatagacgagtgcgcagactcggaggcctgcggggaggcgcgctgcaagaacctgcccggctcctactcctgcctctgtgac gagggctttgcgtacagctcccaggagaaggcttgccgagatg tggacgagtg tctgcagggccgctg tgagcaggtctgcgtgaa ctccccagggagctacacctgccactg tgacgggcgtgggggcctcaagctg tcccaggacatggacacctgtgaggacatcttgc cg tgcg tgcccttcagcg tggccaagagtg tgaagtccttg tacctgggccggatg ttcag tgggacccccgtgatccgactgcgctt caagaggctgcagcccaccaggctggtagctgag tttg a cttccg g a cc tttg accccg a g g g ca tcctcctc tttg ccggaggccac caggacagcacctggatcgtgctggccctgagagccggccggctggagctgcagctgcgctacaacggtgtcggccgtgtcaccag cagcggcccggtcatcaaccatggcatg tggcagacaatctctg ttgaggagctggcgcggaatctggtcatcaaggtcaacaggg a tgctg tca tgaaaa tcgcgg tggccggggacttg ttccaaccggagcgaggactg ta tca tctgaacctgaccgtgggaggta ttc ccttcca tgagaaggacctcgtgcagccta taaaccctcgtctggatggctgcatgaggagctggaactggctgaacggagaagac accaccatccaggaaacggtgaaagtgaacacgaggatgcagtgcttctcggtgacggagagaggctctttctaccccgggagcg gcttcgccttctacagcctggactacatgcggacccctctggacgtcgggactgaatcaacctgggaagtagaagtcg tggctcacat

ccg ccca g ccg ca g a ca ca g g cg tg ctg t t tg cg etetg g g cccccg acctccg tg ccg tg cctctc tc tg tg g ca ctg g ta g a cta tc actccacgaagaaactcaagaagcagctggtggtcctggccgtggagcatacggccttggccctaatggagatcaaggtctgcgac ggccaagagcacgtggtcaccgtctcgctgagggacggtgaggccaccctggaggtggacggcaccaggggccagagcgaggt g a g cg ccg cg ca g ctg caggagaggctggccgtgctcgagaggca cctg cggagccccgtg ctcacctttg ctg g cg g cctg cea gatg tgccggtgacttcagcgccagtcaccgcgttctaccgcggctgcatgacactggaggtcaaccggaggctgctggacctgga cgaggcggcgtacaagcacagcgacatcacggcccactcctgcccccccgtggagcccgccgcagcctaggcccccacgggacgc ggcaggcttctcagtctctg tccgagacagccgggaggagcctgggggctcctcaccacgtggggccatgctgagagctgggctttc ctctg tgaccatcccggcctg taacata tctg taaatag tgagatggacttggggcctctgacgccgcgcactcagccgtgggcccgg gcgcggggaggccggcgcagcgcagagcgggctcgaagaaaa taa ttc tc ta tta ttttta ttaccaagcgcttc tttc tgactc taa aata tggaaaataaaata tttacagaaagctttg taaaaaaaaaaaaaaaaaa

Secuencia de aminoácidos de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 2 (SEQ ID NO 48)

MDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDST WIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPER GLYHLNLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGS GFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLV VLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFA GGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA

Secuencia de ácido nucleico de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 2 (SEQ ID NO 49)

ttga ttgaa acca g taa a tg c ttc tc tttg gg g ttg gg g tttta g tttcaa a tgcccccg gg gg g tta c tttttacg gccccg tg tcc tg t agcaccgtcatttaaatggaacagcacagcgtgcaccgccgccccccacccctccaccaagcagggcccttcccagctctccacctg ctgggctgaagtcagccttcccagccgggccttgatcagaagcgtgcaccaacaccccgggagctgcccggtcaggggaggaggg cagggaaatggggccagggcgcgctggccccacagagtctggatgcgacctctgggtggtgccctggccagtccctgcagccgcct gccccagccccgtc tgaga tgccgctg tgctgcgg ttggccggtttttttttgc ttgcagaca tagacgag tgcgcagactcggaggc ctgcggggaggcgcgctgcaagaacctgcccgg ctccta ctcctg cctctg tg a cg a g g g c tttg cgtacagctcccaggagaagg cttgccgagatg tggacgagtg tctgcagggccgctg tgagcaggtctgcg tgaactccccagggagctacacctgccactg tgacg ggcgtgggggcctcaagctg tcccaggacatggacacctg tgaggacatcttgccg tgcgtgcccttcagcgtggccaagagtg tg aagtccttg tacctgggccggatg ttcagtgggacccccgtga tccgactgcgcttcaagaggctgcagcccaccaggctgg tagct g a g tt tg a cttccg g a cc tttg accccg a g g g catcctcct c tttg ccggaggccaccaggacagcacctggatcgtgctggccctga gagccggccggctggagctgcagctgcgctacaacggtgtcggccgtg tcaccagcagcggcccggtcatcaaccatggcatgtgg cagacaa tc tc tg ttgaggagctggcgcggaatctggtcatcaaggtcaacagggatgctg tca tgaaaatcgcggtggccgggga cttg ttccaaccggagcgaggactg ta tca tctgaacctgaccg tgggaggta ttcccttcca tgagaaggacctcg tgcagccta ta aaccctcgtctggatggctgcatgaggagctggaactggctgaacggagaagacaccaccatccaggaaacggtgaaagtgaac acgaggatgcagtgcttc tcggtgacggagagaggctctttc taccccgggagcggcttcgccttc tacagcctggactacatgcgg

acccctctggacgtcgggactgaatcaacctgggaagtagaagtcgtggctcacatccgcccagccgcagacacaggcgtgctg ttt gcgctctgggcccccgacctccgtgccgtgcctctctctgtggcactggtagactatcactccacgaagaaactcaagaagcagctgg tggtcctggccgtggagcatacggccttggccctaatggagatcaaggtctgcgacggccaagagcacgtggtcaccgtctcgctga gggacggtgaggccaccctggaggtggacggcaccaggggccagagcgaggtgagcgccgcgcagctgcaggagaggctggc cg tg ctcg a g a g g cacctg cg g a g ccccg tg ctca cctttg ctg g cg g cctg cea g a tg tg ccg g tg a cttca g cg cea g tea ccg c gttctaccgcggctgcatgacactggaggtcaaccggaggctgctggacctggacgaggcggcgtacaagcacagcgacatcacg g ccca ctcctg cccccccg tg g a g cccg ccg ca g ceta ggcccccacgggacgcggcaggcttctcagtctctgtccgagacagccg ggaggagcctgggggctcctcaccacgtggggccatgctgagagctgggctttcctctgtgaccatcccggcctgtaacata tctg ta aatagtgagatggacttggggcctctgacgccgcgcactcagccgtgggcccgggcgcggggaggccggcgcagcgcagagcgg g c tcga ag a aaa taa ttc tc ta tta ttttta ttaccaagcgcttc tttc tgac tc taaaa ta tggaaaa taaaa ta tttacagaaagcttt gtaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Secuencia de aminoácidos de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 3 (SEQ ID NO 50)

MFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSS GPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTVGGIPFHEKDLVQPINPRL DGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEV VAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTV SLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVN RRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA

Secuencia de ácido nucleico de GAS6 humano específico de detención del crecimiento 6, variante de transcrito 3 (SEQ ID NO 51)

cacaccgacctg tcacaccggtgcctg tcacaccactgcctgtcacactgacttg tcaccggtg tctg tcacaccgacctg tcacactg gtgcctgtcacactggtgcctgtcacaccgacctgtcacaccggtgcctgtcacaccgacctg tcacactgacctgtcacaccggtag g a a tg ca g taccca catg tg g a cg tttc tg g g ca g g g cg g c tcttg tc tttc c tc ttca g cctg g g cctg tgcc tggggg ttga tgaga gtgagcatttatttaaaaagcaaaaccacaggtggaaagagtcaccaggacagcttc tcggagtcgcagacctgggatgcagccgt g g g g c tc ttg g g tc tg g g ctg cg a cg ttca g g g cttcca g cea g ccctcg ccttg a g g ttc t t tg cctcg ctg cctca tg ta ctca tg ca gagggtg tcggacccctgcgagatgtccagctcaccctggctgcccacggtgggcagggcaggcctggctcagccccagcccctcc atcttccaggggtg tcagctcacaccggctttggttc tg tcccccttcgggcagcgtggagaaaccacagcccagaacagggaacttt cca g g a ca g cca tc ttcaa gg ca tcca ta tc ta tttca ta a tag tg ta ta c ttttta a tga ttc tc tg ta a tttttg ta tg c ttg aa a ta tttc ataatttaaaaataaagggtcaagggaaatgagcagggaaggagatgacggggacccccgagaagccctgtgggaagcggctg ctgcaagcccgcccttcacctgggagtcccagtggggcaggtgtgacagcctctggggtctcagcagctagaggcggggtggccac tcccgaggcacaggagggacagtggacccgctgcgcggccggggcgtggggctcaggggagcaggagtgaaggccacatcccc gaccggcgtggcccccgtccgtggcaggacatcttgccgtgcgtgcccttcagcgtggccaagagtg tgaagtccttg tacctgggc cggatg ttcag tgggacccccgtgatccgactgcgcttcaagaggctgcagcccaccaggctgg tagctgagtttgacttccggacct ttgaccccgagggcatcctcctctttgccggaggccaccaggacagcacctggatcgtgctggccctgagagccggccggctggag

ctgcagctgcgctacaacggtg tcggccgtg tcaccagcagcggcccggtcatcaaccatggcatg tggcagacaatctctgttgag gagctggcgcggaatctggtca tcaaggtcaacagggatgctg tca tgaaaatcgcggtggccggggacttg ttccaaccggagc gaggactg ta tca tc tgaacctgaccgtgggaggta ttcccttcca tgagaaggacctcgtgcagccta taaaccctcgtctggatgg ctgcatgaggagctggaactggctgaacggagaagacaccaccatccaggaaacggtgaaagtgaacacgaggatgcagtgctt eteg g tg a cg g a g a g a g g e tettte ta ccccg g g a g cg g cttcg ccttc ta cagcctggactacatgcgga cccctctg g a cg teg g gactgaatcaacctgggaagtagaagtcgtggctcacatccgcccagccgcagacacaggcgtgctg tttgcgctctgggcccccg acctccgtgccgtgcctctctctg tggcactggtagacta tcactccacgaagaaactcaagaagcagctgg tggtcctggccgtgga gcatacggccttggccctaatggagatcaaggtctgcgacggccaagagcacgtggtcaccgtctcgctgagggacggtgaggcc accctggaggtggacggcaccaggggccagagcgaggtgagcgccgcgcagctgcaggagaggctggccgtgctcgagaggca cctgcggagccccgtgctcacctttgctggcggcctgccagatg tgccggtgacttcagcgccagtcaccgcgttctaccgcggctgc atgacactggaggtcaaccggaggctgctggacctggacgaggcggcgtacaagcacagcgacatcacggcccactcctgccccc ccgtggagcccgccgcagcctagg ccccca cgggacgcggcagg c ttc tca g tetetg tccg agacagccgggaggagcctgggg gctcctcaccacg tggggcca tgctgagagctgggctttcctctg tgacca tcccggcctg taaca ta tctg taaatag tgagatgga cttggggcctctgacgccgcgcactcagccgtgggcccgggcgcggggaggccggcgcagcgcagagcgggctcgaagaaaata a ttc tc ta tta ttttta ttaccaagcgcttc tttc tgac tc taaaa ta tggaaaa taaaa ta tttacagaaagctttg taaaaaaaaaaaa aaaaaa

Secuencia de aminoácidos de la proteína S humana (PROS1)(alfa) (SEQ ID NO 52)

MRVLGGRCGALLACLLLVLPVSEANFLSKQQASQVLVRKRRANSLLEETKQGNLERECIEELCNKEEAREV FENDPETDYFYPKYLVCLRSFQTGLFTAARQSTNAYPDLRSCVNAIPDQCSPLPCNEDGYMSCKDGKASFT CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCSQICDNTPGSYHCSCKNGFVMLSNKKDCKDVDECSLKPSI CGTAVCKNIPGDFECECPEGYRYNLKSKSCEDIDECSENMCAQLCVNYPGGYTCYCDGKKGFKLAQDQK SCEWSVCLPLNLDTKYELLYLAEQFAGWLYLKFRLPEISRFSAEFDFRTYDSEGVILYAESIDHSAWLLIA LRGGKIEVQLKNEHTSKITTGGDVINNGLWNMVSVEELEHSISIKIAKEAVMDINKPGPLFKPENGLLETK VYFAGFPRKVESELIKPINPRLDGCIRSWNLMKQGASGIKEIIQEKQNKHCLVTVEKGSYYPGSGIAQFHI DYNNVSSAEGWHVNVTLNIRPSTGTGVMLALVSGNNTVPFAVSLVDSTSEKSQDILLSVENTVIYRIQAL SLCSDQQSHLEFRVNRNNLELSTPLKIETISHEDLQRQLAVLDKAMKAKVATYLGGLPDVPFSATPVNAFY NGCMEVNINGVQLDLDEAISKHNDIRAHSCPSVWKKTKNS

Secuencia de ácido nucleico de la proteína S humana (PROS1)(alfa) (SEQ ID NO 53)

tttggaaacgtcacactgtggaggaaaagcagcaactagggagctgg tgaagaaggatg tctcagcagtg tttactaggcctccaa cactagagcccatcccccagctccgaaaagcttcctggaaatg tccttg tta tcacttcccctctcgggctgggcgctgggagcgggc ggtctcctccgcccccggctgttccgccgaggctcgctgggtcgctggcgccgccgcgcagcacggctcagaccgaggcgcacagg ctcg ca g ctccg cg g cg ceta g cg ctccg g tccccg ccg cg a cg cg cea ccg tccctg ccg g cg cctccg cgcgcttcgaaatgagg g tcctggg tgggcgctgcggggcgctgctggcgtg tctcctcctag tgcttcccg tctcagaggcaaactttttg tcaaagcaacagg cttcacaagtcctggttaggaagcgtcgtgcaaattc tttacttgaagaaaccaaacagggtaa tcttgaaagagaatgcatcgaag aactgtgcaataaagaagaagccagggaggtctttgaaaatgacccggaaacggattatttttatccaaaatacttagtttgtcttcg ctcttttcaaactgggttattcactgctgcacgtcagtcaactaatgcttatcctgacctaagaagctgtgtcaatgccattccagacca gtgtagtcctctgccatgcaatgaagatggatatatgagctgcaaagatggaaaagcttcttttacttgcacttgtaaaccaggttggc aaggagaaaagtgtgaatttgacataaatgaatgcaaagatccctcaaatataaatggaggttgcagtcaaatttgtgataatacac ctggaagttaccactgttcctgtaaaaatggttttgttatgctttcaaataagaaagattgtaaagatgtggatgaatgctctttgaagc caagcatttgtggcacagctgtgtgcaagaacatcccaggagattttgaatgtgaatgccccgaaggctacagatataatctcaaat caaagtcttgtgaagatatagatgaatgctctgagaacatgtgtgctcagctttgtgtcaattaccctggaggttacacttgctattgtg atgggaagaaaggattcaaacttgcccaagatcagaagagttgtgaggttgtttcagtgtgccttcccttgaaccttgacacaaagta tgaattactttacttggcggagcagtttgcaggggttgttttatatttaaaatttcgtttgccagaaatcagcagattttcagcagaattt gatttccggacatatgattcagaaggcgtgatactgtacgcagaatctatcgatcactcagcgtggctcctgattgcacttcgtggtgg aaagattgaagttcagcttaagaatgaacatacatccaaaatcacaactggaggtgatgttattaataatggtctatggaatatggtg tctgtggaagaattagaacatagtattagcattaaaatagctaaagaagctgtgatggatataaataaacctggacccctttttaagc cggaaaatggattgctggaaaccaaagtatactttgcaggattccctcggaaagtggaaagtgaactcattaaaccgattaaccctc gtctagatggatgtatacgaagctggaatttgatgaagcaaggagcttctggaataaaggaaattattcaagaaaaacaaaataag cattgcctggttactgtggagaagggctcctactatcctggttctggaattgctcaatttcacatagattataataatgtatccagtgctg agggttggcatgtaaatgtgaccttgaatattcgtccatccacgggcactggtgttatgcttgccttggtttctggtaacaacacagtgc cctttgctgtgtccttggtggactccacctctgaaaaatcacaggatattctgttatctgttgaaaatactgtaatatatcggatacaggc cctaagtctatgttccgatcaacaatctcatctggaatttagagtcaacagaaacaatctggagttgtcgacaccacttaaaatagaa accatctcccatgaagaccttcaaagacaacttgccgtcttggacaaagcaatgaaagcaaaagtggccacatacctgggtggcctt ccagatgttccattcagtgccacaccagtgaatgccttttataatggctgcatggaagtgaatattaatggtgtacagttggatctgga tgaagccatttctaaacataatgatattagagctcactcatgtccatcagtttggaaaaagacaaagaattcttaaggcatcttttctct gcttataataccttttccttgtgtgtaattatacttatgtttcaataacagctgaagggttttatttacaatgtgcagtctttgattattttgtg gtcctttcctgggatttttaaaaggtcctttgtcaaggaaaaaaattctgttgtgatataaatcacagtaaagaaattcttacttctcttgc tatctaagaatagtgaaaaataacaattttaaatttgaatttttttcctacaaatgacagtttcaatttttgtttgtaaaactaaattttaat tttatcatcatgaactagtgtctaaatacctatgtttttttcagaaagcaaggaagtaaactcaaacaaaagtgcgtgtaattaaatact attaatcataggcagatactattttgtttatgtttttgtttttttcctgatgaaggcagaagagatggtggtctattaaatatgaattgaat ggagggtcctaatgccttatttcaaaacaattcctcagggggaacagctttggcttcatctttctcttgtgtggcttcacatttaaaccag tatctttattgaattagaaaacaagtgggacatattttcctgagagcagcacaggaatcttcttcttggcagctgcagtctgtcaggat gagatatcagattaggttggataggtggggaaatctgaagtgggtacattttttaaattttgctgtgtgggtcacacaaggtctacatt acaaaagacagaattcagggatggaaaggagaatgaacaaatgtgggagttcatagttttccttgaatccaacttttaattaccaga gtaagttgccaaaatgtgattgttgaagtacaaaaggaactatgaaaaccagaacaaattttaacaaaaggacaaccacagaggg atatagtgaatatcgtatcattgtaatcaaagaagtaaggaggtaagattgccacgtgcctgctggtactgtgatgcatttcaagtgg cagttttatcacgtttgaatctaccattcatagccagatgtgtatcagatgtttcactgacagtttttaacaataaattcttttcactgtattt tatatcacttataataaatcggtgtataattttaaaatgcatgtgaatatctttattatatcaactgtttgaataaaacaaaattacataat agacatttaactcttcaaaaaaaaaaaaaaaa

Secuencia de aminoácidos de la variante 1 de transcrito de MAP-1/GAS6 humano (SEQ ID NO 54) HTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATF CGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHN YIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDI FDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECP ELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESEL KSEQVTEGGGGSGGGGSALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFEND PETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGR

SCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSV AKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLR YNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTVGGIPFHE KDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDV GTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVC DGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFY RGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA

Secuencia de aminoácidos de la variante 1/MAP1 de transcrito de GAS6 humano (SEQ ID NO 55)

ALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGS PYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCL QICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACR DVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPV IRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHG MWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTVGGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRS WNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPA ADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEA TLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDE AAYKHSDITAHSCPPVEPAAAGGGGSGGGGSHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFR IKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFT GFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITS PDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQS HSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVE MDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE

Secuencia de aminoácidos de MAP-1/Proteína S humano (SEQ ID NO 56)

HTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATF CGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHN YIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDI

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula quimérica de un polipéptido asociado a ficolina que comprende:

a) un polipéptido asociado a ficolina que comprende la secuencia de aminoácidos 20-380 de SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde la región C-terminal del polipéptido asociado a ficolina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y

b) un inhibidor de la actividad del complemento seleccionado del grupo que consiste en Factor H (FH) o un fragmento funcional del mismo que comprende al menos los primeros cuatro dominios SCR del Factor H, GAS6, Proteína S, inhibidor de C1 (C1-inh), proteína de unión del componente 4 del complemento (C4bp), Factor I (FI), CR1, DAF(CD55), CD59, CR2 y una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma;

molécula quimérica que es capaz de inhibir la activación del complemento.

2. La molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha molécula de inmunoglobulina o parte de la misma se selecciona del componente Fc de las IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 humanas.

3. La molécula quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor de la activación del complemento es el factor H o un fragmento funcional del mismo.

4. La molécula quimérica de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en donde dicho polipéptido asociado a ficolina y dicho inhibidor de la actividad del complemento se fusionan directa o indirectamente entre sí en forma de una proteína de fusión.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula quimérica de la reivindicación 4.

6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un método para producir la molécula quimérica como se define en la reivindicación 4, comprendiendo el método cultivar una célula como se define en la reivindicación 5 en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresión de la construcción polinucleotídica y recuperar el polipéptido resultante del medio de cultivo.

9. Una composición que comprende la molécula quimérica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

10. Una composición farmacéutica que comprende la molécula quimérica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

11. Una molécula quimérica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso como un medicamento.