JP6143209B1 - 自己免疫疾患用または難治性血管炎用の治療剤、および、これらの疾患の診断のためのデータの取得方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】その目的は、血液を材料として用いること無く人工的に製造される治療剤を用いた、従来のIVIG治療に代わる新たな治療を提供する。【解決手段】本発明は、免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤であって、フィコリンタンパク質とIgGとの結合を阻害する結合阻害剤を含有している治療剤を用いる。【選択図】図1
Description
本発明は、免疫不全用、自己免疫疾患用または難治性血管炎用の治療剤、および、これらの疾患の診断のためのデータの取得方法に関する。
免疫グロブリン大量療法(IVIG(intravenous immunoglobulin)治療)は、免疫不全(例えば、X連鎖無γグロブリン血症、低γグロブリン血症、および、低い抗体レベルを伴う獲得免疫障害など)、自己免疫疾患(例えば、特発性血小板減少性紫斑病など)および、難治性血管炎(例えば、川崎病など)の治療に広く用いられる方法であって、Fc活性を有する免疫グロブリンG(IgG)を大量に静脈に投与することによって、各種疾患を治療する方法である(例えば、非特許文献1〜3参照)。
例えば、川崎病(kawasaki disease:KD)は、乳幼児が患う、全身性の血管炎症候群である。川崎病では、全身に存在する中型の血管が炎症を起こすことで、乳幼児に、様々な症状(例えば、発熱、発疹、および、冠動脈病変など)を惹き起こす。0歳〜4歳の乳幼児が川崎病を患うケースが多く、その中でも、1歳前後の乳幼児が川崎病を患うケースが、特に多い。川崎病を患った乳幼児は死亡する場合もあり、乳幼児が川崎病を患っているか否かを定期的にチェックし、患っている場合には、早急に治療する必要がある。そして、川崎病の治療には、一般的に免疫グロブリン大量療法が用いられている。
上述したように、免疫グロブリン大量療法は様々な疾患の治療に用いられているが、当該治療の標的分子、換言すれば、製剤中の何れの免疫グロブリンが薬効を有しているのか、が判明していない。それ故に、免疫グロブリン大量療法では、ヒトの血液から製造された製剤を用い、当該製剤には、1000人を超える献血者から採取した血液に由来する、様々な抗原を認識する様々な免疫グロブリンが含まれている。
Wong PH, "Impact of Immunoglobulin Therapy in Pediatric Disease: a Review of Immune Mechanisms.", Clin Rev Allergy Immunol., 2015 July 4
Burns JC, Franco A., "The immunomodulatory effects of intravenous immunoglobulin therapy in Kawasaki disease.", Expert Rev Clin Immunol., 2015, 11(7), 819-25
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しかしながら、上述のような従来の製剤は、その材料として血液を必要とするが故に、血液に由来する様々な問題点を有していた。
より具体的に、従来の製剤は、(i)安価に、安定的に、かつ、大量に製造できない、(ii)ウイルスが混入する危険がある、(iii)患者に大量に投与する必要がある、(iv)薬効成分以外の不要な成分が含まれている、などの様々な問題点を有していた。
本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、血液を材料として用いること無く人工的に製造される治療剤を用いた、従来のIVIG治療に代わる新たな治療を提供することにある。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、従来不明であったIVIG治療の標的分子がFCN1(M−ficolin)であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤は、上記課題を解決するために、フィコリンタンパク質とIgGとの結合を阻害する結合阻害剤を含有していることを特徴としている。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記結合阻害剤は、IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチド、フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド、または、フィコリンタンパク質と結合する抗体であることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチドは、配列番号6、8〜13の何れかにて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するものであることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチドは、配列番号14にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有するものであることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記フィコリンタンパク質と結合する抗体は、配列番号16〜18の何れかにて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するものであることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記免疫不全は、X連鎖無γグロブリン血症、低γグロブリン血症、または、獲得免疫障害であることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記自己免疫疾患は、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、または、不明熱(UFO:Fever of Unknown Origin)であることが好ましい。
本発明の免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤では、上記難治性血管炎は、川崎病、高安病、顕微鏡的多発血管炎(MPA:Microscopic Polyangitis)、多発血管炎性肉芽腫症(GPA:Granulomatosis with Polyangitis、旧称ウェゲナー肉芽腫症:WG(Wegener))、アレルギー性肉芽腫性血管炎/Churg-Strauss症候群(AGA/CSS)、または、巨細胞性動脈炎(GCA:Giant cell arteritis)であることが好ましい。
本発明の免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の診断のためのデータの取得方法は、上記課題を解決するために、採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質を検出する工程を有することを特徴としている。
本発明の治療剤は、材料として血液を必要としないので、本発明の治療剤を、安価に、安定的に、かつ、大量に製造することができる。
本発明の治療剤は、材料として血液を必要としないので、ウイルス(例えば、エイズウイルス、C型肝炎ウイルスなど)が混入する危険が無い、安全な治療剤を実現することができる。
本発明の治療剤は、薬効成分を高濃度に含んでいるので、少量の治療剤によって、患者を効果的に治療することができる。それ故に、本発明の治療剤は、治療の際に患者の体にかかる負担を軽減することができる。
本発明の治療剤は、薬効成分以外の不要な成分が含まれていないので、副作用を抑えることができる。
本発明の治療剤は、IVIG治療の対象となる様々な疾患(例えば、自己免疫疾患、および、難治性血管炎など)を治療することができる。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「A〜B」は、「A以上、B以下」を意図する。
〔1.本発明の基本原理〕
まず、図1を用いて、本発明の基本原理を説明する。
まず、図1を用いて、本発明の基本原理を説明する。
図1(a)および図1(b)の矢印の左側に記載しているように、生体内において、フィコリンタンパク質1は、フィコリンタンパク質1の部分ペプチドである結合領域2を介して、結合対象5と結合していると考えられている。そして、生体内において、フィコリンタンパク質1は、結合対象5と結合した状態で、様々な機能を発揮していると考えられている。当該機能を必要としない局面で当該機能が発揮されると、様々な疾患を引き起こすことになる。
図1(a)の矢印の左側のように、フィコリンタンパク質1と結合対象5とが形成している複合体に、フィコリンタンパク質1と結合する物質10(例えば、IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチド、または、フィコリンタンパク質と結合する抗体)を加えると、図1(a)の矢印の右側のように、結合領域2に物質10が結合し、その結果、フィコリンタンパク質1から結合対象5が解離する。フィコリンタンパク質1から結合対象5が解離すると、フィコリンタンパク質は、血管炎などの疾患を発症する機能を発揮することができない。
つまり、本発明では、上述した物質10によってフィコリンタンパク質1の機能を抑制し、それによって、フィコリンタンパク質1が原因となる疾患を治療することができる。
また、図1(b)の矢印の左側のように、フィコリンタンパク質1と結合対象5とが形成している複合体に、結合領域2(例えば、フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド)を加えると、図1(b)の矢印の右側のように、結合対象5が加えられた結合領域2に結合し、その結果、フィコリンタンパク質1から結合対象5が解離する。フィコリンタンパク質1から結合対象5が解離すると、フィコリンタンパク質は、血管炎などの疾患を発症する機能を発揮することができない。
つまり、本発明では、上述した結合領域2によってフィコリンタンパク質1の機能を抑制し、それによって、フィコリンタンパク質1が原因となる疾患を治療することができる。
以下に、本発明について、詳細に説明する。
〔2.治療剤〕
本実施の形態の治療剤は、免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤であって、フィコリンタンパク質とIgGとの結合を阻害する結合阻害剤を含んでいる治療剤である。
本実施の形態の治療剤は、免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤であって、フィコリンタンパク質とIgGとの結合を阻害する結合阻害剤を含んでいる治療剤である。
上述したフィコリンタンパク質は、あらゆる生物種のフィコリンタンパク質、または、当該フィコリンタンパク質の変異タンパク質であり得るが、ヒトの疾患を効果的に治療し得る治療剤を実現するという観点からは、ヒトのフィコリンタンパク質、または、ヒトのフィコリンタンパク質の変異タンパク質、または、これらのタンパク質とホモロジーが高いタンパク質、であることが好ましい。
具体的に、フィコリンタンパク質は、以下の(1)〜(3)のポリペプチドであってもよい:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または、付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フィコリンタンパク質としての活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、フィコリンタンパク質としての活性を有するポリペプチド。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または、付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フィコリンタンパク質としての活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、フィコリンタンパク質としての活性を有するポリペプチド。
所望のタンパク質が、フィコリンタンパク質としての活性を有するか否かは、所望のタンパク質が、N−アセチルグルコサミンに対する結合能を有しているか否かを確認することによって知ることができる。具体的に、所望のタンパク質がN−アセチルグルコサミンに対する結合能を有していれば、当該タンパク質はフィコリンタンパク質としての活性を有するものである、と判定することができる。より具体的に、生理食塩水中で、所望のタンパク質と過剰量のN−アセチルグルコサミン(例えば、所望のタンパク質の100倍の質量のN−アセチルグルコサミン)とを混合し、全所望のタンパク質の50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上がN−アセチルグルコサミンに結合すれば、当該タンパク質はフィコリンタンパク質としての活性を有するものである、と判定することができる。
本明細書における「1個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または、付加されたアミノ酸配列」では、置換、欠失、挿入、および/または、付加が生じる位置は特に限定されない。
また、「1個もしくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、20個以内のアミノ酸であることが好ましく、19個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、18個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、17個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、16個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、15個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、14個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、13個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、12個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、11個のアミノ酸であることが更に好ましく、10個以内のアミノ酸であることが好ましく、9個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、8個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、7個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、6個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、5個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、4個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、3個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、2個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、1個のアミノ酸であることが最も好ましい。
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および/または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度(疎水性および親水性)、電荷(中性、酸性および塩基性)が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
また、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、GENETYX−WIN(株式会社ゼネティックス社製)を、GENETYX−WINのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ(homology search)を行い、同一のアミノ酸の割合(%)として相同性を算出することができる。
更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合(%)として、相同性を算出することができる。
上述した(3)に記載のポリペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するものであるが、相同性は、91%以上であることが好ましく、92%以上であることがより好ましく、93%以上であることがより好ましく、94%以上であることがより好ましく、95%以上であることがより好ましく、96%以上であることがより好ましく、97%以上であることがより好ましく、98%以上であることがより好ましく、99%以上であることが最も好ましい。
上述したように、本実施の形態の治療剤は、フィコリンタンパク質とIgGとの結合を阻害する結合阻害剤を含有している。
フィコリンタンパク質と結合するIgGのサブクラスは、特に限定されず、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であってもよい。
上述した結合阻害剤は、特に限定されず、低分子化合物であってもよいし、高分子化合物(例えば、ポリペプチド、タンパク質)であってもよい。
任意の低分子化合物または高分子化合物が結合阻害剤であるか否かは、例えば、免疫沈降法およびウエスタンブロット法の組み合わせによって判定することができる。
具体的に、結合阻害剤の候補物質、フィコリンタンパク質、およびIgGを含む水溶液を、抗フィコリンタンパク質抗体を用いた免疫沈降に供し、得られた沈降物を沈降物Aとする。一方、フィコリンタンパク質、およびIgGを含む水溶液を、抗フィコリンタンパク質抗体を用いた免疫沈降に供し、得られた沈降物を沈降物Bとする。沈降物Aおよび沈降物Bを、抗IgG抗体を用いたウエスタンブロットに供し、沈降物Aにて観察されるバンド(水溶液中でフィコリンタンパク質に結合していたIgGに対応)と、沈降物Bにて観察されるバンド(水溶液中でフィコリンタンパク質に結合していたIgGに対応)とを比較して、沈降物Aにて観察されるバンドが、沈降物Bにて観察されるバンドよりも薄ければ、上述した候補物質は結合阻害剤であると判定することができる。
また、結合阻害剤の候補物質、フィコリンタンパク質、およびIgGを含む水溶液を、抗IgG抗体を用いた免疫沈降に供し、得られた沈降物を沈降物Cとする。一方、フィコリンタンパク質、およびIgGを含む水溶液を、抗IgG抗体を用いた免疫沈降に供し、得られた沈降物を沈降物Dとする。沈降物Cおよび沈降物Dを、抗フィコリンタンパク質抗体を用いたウエスタンブロットに供し、沈降物Cにて観察されるバンド(水溶液中でIgGに結合していたフィコリンタンパク質に対応)と、沈降物Dにて観察されるバンド(水溶液中でIgGに結合していたフィコリンタンパク質に対応)とを比較して、沈降物Cにて観察されるバンドが、沈降物Dにて観察されるバンドよりも薄ければ、上述した候補物質は結合阻害剤であると判定することができる。
結合阻害剤の具体例として、IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチド、フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド、および、フィコリンタンパク質と結合する抗体を挙げることができる。以下に、各構成について説明する。
<A.フィコリンタンパク質と結合する抗体>
上述したように、結合阻害剤は、フィコリンタンパク質と結合する抗体であってもよい。
上述したように、結合阻害剤は、フィコリンタンパク質と結合する抗体であってもよい。
フィコリンタンパク質と結合する抗体は、当該抗体の何れの部分でフィコリンタンパク質と結合してもよい。上記抗体は、自身の抗原結合部位(Fab)を介してフィコリンタンパク質と結合してもよいし、自身の抗原結合部位以外の部分(例えば、ヒンジ領域、および、Fcなど)を介してフィコリンタンパク質と結合してもよい。より高い治療効果を実現するという観点からは、フィコリンタンパク質と抗体とが強く結合することが好ましく、上述した抗体の中では、自身の抗原結合部位(Fab)を介してフィコリンタンパク質と結合する抗体がより好ましい。なお、本明細書では、自身の抗原結合部位(Fab)を介してフィコリンタンパク質と結合する抗体を、特に、抗フィコリンタンパク質抗体と呼ぶ。
上記抗体は、フィコリンタンパク質と結合するものであれば特に限定されないが、フィコリンタンパク質のアミノ末端領域(実施例に記載のFCN1−Ntに対応する配列番号14)と結合するものであってもよいし、配列番号16、17または18(実施例に記載のモノクローナル抗体作製時の抗原に対応)にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するものであってもよい。
上記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましく、配列番号18にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するもの(例えば、配列番号18にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原とするもの)が最も好ましく、配列番号16にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するもの(例えば、配列番号16にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原とするもの)が2番目に好ましく、配列番号17にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するもの(例えば、配列番号17にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原とするもの)が3番目に好ましい。
フィコリンタンパク質と結合する抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、または、IgEであり得る。より簡便に治療剤を作製するという観点からは、フィコリンタンパク質と結合する抗体のクラスは、IgGであることが好ましい。
フィコリンタンパク質と結合する抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいが、より簡便に治療剤を作製するという観点、および、安定した治療効果を発揮する治療剤を作製するという観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
フィコリンタンパク質と結合する抗体は、より安全性の高い治療剤を作製するという観点から、ヒト抗体とマウス抗体とのキメラ抗体であることが好ましく、完全ヒト抗体であることが更に好ましい。キメラ抗体の場合には、キメラ抗体のできるだけ多くの部分がヒト抗体に由来するものであることが好ましく、50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の部分が、ヒト抗体に由来するものであることが好ましい。
上記抗体の作製方法は、特に限定されず、周知の方法にしたがって作製すればよい。例えば、HarLowらの「Antibodies:A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1988)」、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」に記載の方法にしたがって、抗体を作製すればよい。
本実施の形態の治療剤に含まれる抗体の量は、特に限定されないが、1ng〜100mgであってもよいし、10ng〜100mgであってもよいし、100ng〜100mgであってもよいし、1mg〜100mgであってもよいし、10mg〜100mgであってもよい。
<B.フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド>
上述したように、結合阻害剤は、フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド、または、フィコリンタンパク質の部分ペプチドからなるポリペプチドであってもよい。
上述したように、結合阻害剤は、フィコリンタンパク質の部分ペプチドを含有するポリペプチド、または、フィコリンタンパク質の部分ペプチドからなるポリペプチドであってもよい。
上記部分ペプチドは、フィコリンタンパク質の何れの部分を含むものであってもよい。例えば、上記部分ペプチドは、フィコリンタンパク質の全長の、90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、または、1%以下の領域からなるペプチドであり得る。より簡便に治療剤を作製するという観点、および、安定した治療効果を発揮する治療剤を作製するという観点から、上記部分ペプチドは、小さいほど好ましい。
上記部分ペプチドを構成するアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、100個以下、90個以下、80個以下、70個以下、60個以下、50個以下、40個以下、30個以下、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、または、10個以下であり得る。より簡便に治療剤を作製するという観点、および、安定した治療効果を発揮する治療剤を作製するという観点から、上記部分ペプチドは、小さいほど好ましい。
上述したように、上記部分ペプチドはフィコリンタンパク質の何れの部分であってもよいが、フィコリンタンパク質のアミノ末端領域に対応するペプチドであることが好ましく、配列番号14にて示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることがより好ましい。
本実施の形態の治療剤に含まれる部分ペプチドの量は、特に限定されないが、1ng〜100mgであってもよいし、10ng〜100mgであってもよいし、100ng〜100mgであってもよいし、1mg〜100mgであってもよいし、10mg〜100mgであってもよい。
<C.IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチド>
上述したように、結合阻害剤は、IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチドであってもよい。また、結合阻害剤は、IgGの部分ペプチドからなるポリペプチドであってもよい。
上述したように、結合阻害剤は、IgGの部分ペプチドを含有するポリペプチドであってもよい。また、結合阻害剤は、IgGの部分ペプチドからなるポリペプチドであってもよい。
上述したIgGのサブクラスは、特に限定されず、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であってもよい。
上記部分ペプチドは、IgGタンパク質の何れの部分を含むものであってもよい。例えば、上記部分ペプチドは、IgGタンパク質の全長の、90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、または、1%以下の領域からなるペプチドであり得る。より簡便に治療剤を作製するという観点、および、安定した治療効果を発揮する治療剤を作製するという観点から、上記部分ペプチドは、小さいほど好ましい。
上記部分ペプチドを構成するアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、100個以下、90個以下、80個以下、70個以下、60個以下、50個以下、40個以下、30個以下、20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、または、10個以下であり得る。より簡便に治療剤を作製するという観点、および、安定した治療効果を発揮する治療剤を作製するという観点から、上記部分ペプチドは、小さいほど好ましい。
上述したように、上記部分ペプチドはIgGタンパク質の何れの部分であってもよいが、配列番号6、8〜13の何れかにて示されるアミノ酸配列からなるペプチドあることが好ましい。
本実施の形態の治療剤に含まれる部分ペプチドの量は、特に限定されないが、1ng〜100mgであってもよいし、10ng〜100mgであってもよいし、100ng〜100mgであってもよいし、1mg〜100mgであってもよいし、10mg〜100mgであってもよい。
IVIG治療は、様々な疾患に適用することができる治療方法である。それ故に、本実施の形態の治療剤は、IVIG治療の対象である疾患(例えば、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎)の治療に用いることができる。
免疫不全の具体例は、特に限定されないが、X連鎖無γグロブリン血症、低γグロブリン血症、または、獲得免疫障害を挙げることができる。
自己免疫疾患の具体例は、特に限定されないが、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、または、不明熱を挙げることができる。
難治性血管炎の具体例は、特に限定されないが、川崎病、高安病、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎/Churg-Strauss症候群、または、巨細胞性動脈炎を挙げることができる。
〔3.免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の診断のためのデータの取得方法〕
本実施の形態のデータの取得方法は、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の診断のためのデータの取得方法であって、採取された血清(具体的には、被検者から採取された血清)に含まれるフィコリンタンパク質を検出する工程を有している。
本実施の形態のデータの取得方法は、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の診断のためのデータの取得方法であって、採取された血清(具体的には、被検者から採取された血清)に含まれるフィコリンタンパク質を検出する工程を有している。
フィコリンタンパク質を検出する方法としては、特に限定されず、タンパク質を検出するための周知の方法を用いることができる。例えば、ウエスタンブロット法、または、ELISA法(enzyme linked immunosorbent assay)にて、採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質を検出すればよい。
以下に、データの取得方法の2つの態様について説明する。
<態様1>
健常者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が多ければ、当該被検者は、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎を患っていると判定することができる。
健常者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が多ければ、当該被検者は、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎を患っていると判定することができる。
それ故に、本実施の形態のデータの取得方法は、健常者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と、被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と、を比較する工程を含んでいてもよい。
<態様2>
血清として、IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清と、IVIG治療が行われた後(例えば、IVIG治療を行ってから、1日〜3日後)に同じ被検者から採取された血清とを用いることが可能である。IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が少なければ(例えば、治療前の、80%以下、好ましくは70%以下、好ましくは60%以下、更に好ましくは50%以下、更に好ましくは40%以下、更に好ましくは30%以下、更に好ましくは20%以下、最も好ましくは10%以下の量)、当該被検者を、IVIG治療が有効な被検者であると判定することができる。一方、IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が同等、または、多ければ(例えば、治療前の80%よりも多い量)、当該被検者を、IVIG治療が有効でない被検者であると判定することができる。
血清として、IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清と、IVIG治療が行われた後(例えば、IVIG治療を行ってから、1日〜3日後)に同じ被検者から採取された血清とを用いることが可能である。IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が少なければ(例えば、治療前の、80%以下、好ましくは70%以下、好ましくは60%以下、更に好ましくは50%以下、更に好ましくは40%以下、更に好ましくは30%以下、更に好ましくは20%以下、最も好ましくは10%以下の量)、当該被検者を、IVIG治療が有効な被検者であると判定することができる。一方、IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と比較して、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量が同等、または、多ければ(例えば、治療前の80%よりも多い量)、当該被検者を、IVIG治療が有効でない被検者であると判定することができる。
それ故に、本実施の形態のデータの取得方法は、(i)採取された血清として、IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清と、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清と、を用い、かつ、(ii)IVIG治療を行う前に被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と、IVIG治療が行われた後に同じ被検者から採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質の量と、を比較する工程を含んでいてもよい。
<1.マイクロアレイによるmRNAの発現解析>
本試験では、川崎病の患者にIVIG治療を行い、治療の前後において、当該患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でmRNAの発現が変化する遺伝子を、マイクロアレイによって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、川崎病の患者にIVIG治療を行い、治療の前後において、当該患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でmRNAの発現が変化する遺伝子を、マイクロアレイによって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、IVIG治療の前に、川崎病の患者から血液細胞(PBMC)を採取し、更に、当該血液細胞からmRNAを採取した。次いで、IVIG治療を行った後に、当該川崎病の患者から血液細胞(PBMC)を採取し、更に、当該血液細胞からmRNAを採取した。
なお、mRNAの採取は、PAXgene Blood RNA Kit(Qiagen)を用いて行い、具体的な採取方法は、当該キットに添付のプロトコールにしたがった。また、採取されたmRNAの品質を、RNA 6000 Nano LabChip Kit(p/n 5065-4476)、および、Agilent 2100 Bioanalyzer(G2940BA; Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA)を用いて解析し、採取されたmRNAが純度高くmRNAを含有したものであることを確認した。
次いで、IVIG治療前後の各mRNAを、Agilent Whole Human Genome Microarray (4×44K G4112F)にて解析し、様々な遺伝子の発現強度を測定した。なお、発現強度の測定の具体的な方法は、当該マイクロアレイに添付のプロトコールにしたがった。
上述した試験を複数の川崎病患者に対して行い、各遺伝子の発現強度として、複数の測定値を得た。そして、複数の測定値の平均値を算出し、当該平均値を以後の解析に用いた。
各遺伝子に関して「IVIG治療前の発現強度の平均値/IVIG治療後の発現強度の平均値」の値を算出し当該値に基づくスキャッタープロットを作成した。スキャッタープロットを、図2に示す。なお、図2において、対角線よりも下側にプロットされた遺伝子は、IVIG治療を行った後でmRNAの発現量が減少した遺伝子、換言すれば、IVIG治療の標的分子(具体的には、IVIG治療で投与されたIgGが結合すると考えられるタンパク質をコードしている遺伝子)である。
図2に示すように、IVIG治療の標的分子として、FCN1(M−ficolin)を見出すことに成功した。
<2.RT−PCRによるmRNAの発現解析>
本試験では、複数の川崎病の患者(KD01〜KD05、KD11〜KD16、KD18〜25)にIVIG治療を行い、治療の前後において、これらの患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でFCN1(M−ficolin)のmRNAの発現が変化するか否かを、RT−PCRによって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、複数の川崎病の患者(KD01〜KD05、KD11〜KD16、KD18〜25)にIVIG治療を行い、治療の前後において、これらの患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でFCN1(M−ficolin)のmRNAの発現が変化するか否かを、RT−PCRによって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
RT−PCRによる解析は、<1.マイクロアレイによる解析>にて採取したmRNA、および、FCN1(M−ficolin)遺伝子を増幅させるためのプライマーを用いて行った。
まず、上記mRNA、プライマー、および、High Capacity cDNA Archive Kit(ABI)を用いて各mRNAを逆転写し、cDNAを合成した。次いで、鋳型として当該cDNAを用い、更に、上記プライマーを用いて、PCRを行った。なお、PCRの反応条件としては、まず95℃にて10分間の変性反応を行った後、95℃にて15秒間のアニーリング反応、および、60℃にて1分間の伸長反応からなる反応サイクルを40サイクル繰り返す反応条件を採用した。
図3〜図5に試験結果を示す。なお、図3〜図5において、「KD01〜KD25」は、各患者を示し、「1d」は、IVIG治療前のデータを示し、「2d」は、IVIG治療を行ってから2日〜3日後のデータを示し、「7d」は、IVIG治療を行ってから6日〜8日後のデータを示している。なお、IVIG治療を行ってから6日〜8日後には、川崎病患者の炎症は元の正常な状態に戻っていた。それ故に、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行ってから2日〜3日後にmRNAの発現が少なくなっている遺伝子が、IVIG治療の標的分子と考えられる。
図3〜図5に示すように、KD2、KD15、KD16以外の大多数の患者においては、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行ってから2日〜3日後に、FCN1のmRNAの発現量が低下していた。
川崎病患者には、IVIG治療が有効である患者と、IVIG治療が有効でない患者とが存在することが知られている。KD2、KD15、KD16は、IVIG治療が有効でない患者であると考えられ、これらの患者では、IVIG治療を行っても、FCN1のmRNAの発現量が低下しないことが明らかになった。
<3.血液細胞内におけるタンパク質の発現解析>
本試験では、複数の川崎病の患者(KD01〜KD04、KD11、KD12、KD14〜KD16、KD18〜25)にIVIG治療を行い、治療の前後において、これらの患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でFCN1(M−ficolin)のタンパク質の発現が変化するか否かを、ウエスタンブロット法によって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、複数の川崎病の患者(KD01〜KD04、KD11、KD12、KD14〜KD16、KD18〜25)にIVIG治療を行い、治療の前後において、これらの患者に由来する血液細胞(PBMC(Peripheral Blood Mononuclear cell)、主として白血球を含む細胞群)内でFCN1(M−ficolin)のタンパク質の発現が変化するか否かを、ウエスタンブロット法によって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
血液細胞の溶解物の調製は、LeukoCatch(登録商標)(BioAcademia)を用いて、当該キットに添付のプロトコールにしたがって行った。そして、周知の方法にしたがって、血液細胞の溶解物をウエスタンブロット法による解析に供し、血液細胞内におけるタンパク質の発現を解析した。
図6および図7に試験結果を示す。
なお、図6において、「SE」は、ウエスタンブロット法において、検出対象であるタンパク質に結合した発光物質を、検出用フィルムに対して短時間露光したときの検出結果であり、「LE」は、ウエスタンブロット法において、検出対象であるタンパク質に結合した発光物質を、検出用フィルムに対して長時間露光したときの検出結果である。
また、図6および図7において、「H1」〜「H8」は、健常人の試験結果である。
また、図6および図7において、「1d」は、IVIG治療前のデータを示し、「2d」は、IVIG治療を行ってから2日後のデータを示し、「3d」は、IVIG治療を行ってから3日後のデータを示し、「4d」は、IVIG治療を行ってから4日後のデータを示し、「6d」は、IVIG治療を行ってから6日後のデータを示し、「7d」は、IVIG治療を行ってから7日後のデータを示し、「8d」は、IVIG治療を行ってから8日後のデータを示している。
図6から明らかなように、大多数の患者においては、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行った直後に、血液細胞内におけるFCN1タンパク質の発現量が低下していた。
一方、図6および図7から明らかなように、大多数の患者においては、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行った直後に、血液細胞内におけるFCN1以外のタンパク質(例えば、HSP90、HpR、α−Tubulinなど)の発現量に有意な変化(具体的には、タンパク質の量の減少)が認められなかった。例えば、HpRに関しては、全ての患者において、略等量発現していた。
<4.血清内におけるタンパク質の発現解析>
IVIG治療において患者の静脈に投与されたIgGは、主として、患者の血清中に存在することになる。それ故に、IVIG治療の標的分子は、主として、患者の血清中に存在すると考えられる。
IVIG治療において患者の静脈に投与されたIgGは、主として、患者の血清中に存在することになる。それ故に、IVIG治療の標的分子は、主として、患者の血清中に存在すると考えられる。
そこで、本試験では、複数の川崎病の患者(KD26〜KD44:19名)にIVIG治療を行い、治療の前後において、これらの患者に由来する血清内でFCN1(M−ficolin)のタンパク質の発現が変化するか否かを、ウエスタンブロット法によって調べた。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
周知の方法にしたがって、各患者の血清(10μL)をウエスタンブロット法による解析に供し、血清内におけるタンパク質の発現を解析した。
図8に試験結果を示す。
図8から明らかなように、試験した全ての患者において、IVIG治療前(図8における「IVIG−」)と比較してIVIG治療を行った直後(図8における「IVIG+」)に、血清内におけるFCN1タンパク質の発現量が大幅に低下していた。
一方、大多数の患者においては、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行った直後に、血清内におけるFCN1以外のタンパク質(例えば、C1q、HpRなど)の発現量に有意な変化が認められなかった。例えば、HpRに関しては、全ての患者において、略等量発現していた。一方、C1qに関しては、一部の患者(具体的には、KD28、KD29およびKD34)を除いては、IVIG治療前と比較してIVIG治療を行った直後に、発現量に有意な変化が認められなかった。
<5.FCN1タンパク質内における、IgGタンパク質が結合する部位の特定>
本試験では、IgGタンパク質が、FCN1タンパク質内のどの箇所に結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、IgGタンパク質が、FCN1タンパク質内のどの箇所に結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、周知の方法にしたがって、FCN1タンパク質の全長(FCN−Fs)を発現するベクター、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクター、および、FCN1タンパク質のカルボキシル末端側の部分(FCN1−Ct)を発現するベクターを作製した(図9(A)参照)。なお、FCN−Fsの具体的なアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対応する。FCN1−Ntの具体的なアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて1番目〜120番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する(配列番号14に対応)。FCN1−Ctの具体的なアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて98番目〜326番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する(配列番号15に対応)。また、上述した3種類のタンパク質は、Flagタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、各ベクターを設計した。
次いで、周知の方法にしたがって、IgGタンパク質の全長(IgG−Fs)を発現するベクターを作製した。なお、IgG−Fsの具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示される塩基配列を翻訳したアミノ酸配列に対応する。また、上述したタンパク質は、Mycタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、各ベクターを設計した。
上述したベクターを様々な組み合わせでヒト腎臓細胞(HEK293T)に導入し、当該ヒト腎臓細胞内で目的のタンパク質を発現させた。当該ヒト腎臓細胞を溶液(20mM Tris−HCl[pH7.5]、200mM NaCl、1mM EDTA[pH8.0]、0.2% NP−40)中で破砕した後、当該溶液を遠心分離処理して上清を得た。抗Myc抗体を用いて、上清から免疫沈降物を回収した。次いで、回収された免疫沈降物を、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図9(B)に示す。図9(B)の左側は、通常のウエスタンブロット解析の結果を示し、図9(B)の右側は、Wes機器を用いた自動ウエスタンブロット解析の結果を示している。図9(B)から、IgG−Fsは、FCN−Fs、および、FCN1−Ntと結合することが明らかになった。
<6.IgGタンパク質内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>
本試験では、IgGタンパク質内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、IgGタンパク質内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、周知の方法にしたがって、IgGタンパク質を5つに分割した各部分(IgG−1、IgG−2、IgG−3、IgG−4、および、IgG−5)を発現するベクターを作製した(図10(A)参照)。なお、IgG−1の具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて1番目〜120番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−2の具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて121番目〜240番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−3の具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて241番目〜340番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−4の具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて341番目〜440番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−5の具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて441番目〜544番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。また、上述した5種類のタンパク質は、Mycタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、各ベクターを設計した。
更に、本試験では、<5.FCN1タンパク質内における、IgGタンパク質が結合する部位の特定>の欄で説明した、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクターを用いた。なお、当該タンパク質は、Flagタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。
上述したベクターを様々な組み合わせでヒト腎臓細胞(HEK293T)に導入し、当該ヒト腎臓細胞内で目的のタンパク質を発現させた。当該ヒト腎臓細胞を溶液(20mM Tris−HCl[pH7.5]、200mM NaCl、1mM EDTA[pH8.0]、0.2% NP−40)中で破砕した後、当該溶液を遠心分離処理して上清を得た。抗Myc抗体を用いて、上清から免疫沈降物を回収した。次いで、回収された免疫沈降物を、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図10(B)に示す。図10(B)から、FCN1−Ntは、IgG−2、IgG−3、および、IgG−4と結合することが明らかになった。
更に、上述した試験結果の再現性を確認するために、免疫沈降に使用した抗Myc抗体と混ぜる細胞抽出液のタンパク質量を4倍に増やして、免疫沈降を行った。当該試験の結果を図10(C)に示す。図10(C)から、IgG−2、IgG−3、および、IgG−4のうちでは、IgG−3が最も強くFCN1−Ntと結合することが明らかになった。そこで、今後は、IgG−3内の結合領域を狭めることを目的として、更なる実験を行うことにした。
<7.IgG−3内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>
本試験では、IgG−3内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、IgG−3内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、周知の方法にしたがって、IgG−3を4つに分割した各部分(IgG−3a、IgG−3b、IgG−3c、および、IgG−3d)を発現するベクターを作製した(図11(A)参照)。なお、IgG−3aの具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて228番目〜260番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−3bの具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて261番目〜292番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−3cの具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて293番目〜320番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。IgG−3dの具体的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されるアミノ酸配列における、アミノ末端側から数えて321番目〜355番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列に対応する。また、上述した4種類のタンパク質は、Mycタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、各ベクターを設計した。
更に、本試験では、<5.FCN1タンパク質内における、IgGタンパク質が結合する部位の特定>の欄で説明した、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクターを用いた。なお、当該タンパク質は、Flagタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。
上述したベクターを様々な組み合わせでヒト腎臓細胞(HEK293T)に導入し、当該ヒト腎臓細胞内で目的のタンパク質を発現させた。当該ヒト腎臓細胞を溶液(20mM Tris−HCl[pH7.5]、200mM NaCl、1mM EDTA[pH8.0]、0.2% NP−40)中で破砕した後、当該溶液を遠心分離処理して上清を得た。抗Myc抗体を用いて、上清から免疫沈降物を回収した。次いで、回収された免疫沈降物を、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図11(B)に示す。図11(B)から、FCN1−Ntは、IgG−3dと結合することが明らかになった。
<8.IgG−3内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定−2>
GST−FCN1−Ntと、Myc−Hs IgG−3と、を混合した後、当該混合物にグルタチオンセファロースビーズを加えて、混合および撹拌した。その後、混合物を遠心分離することによって、沈殿物(具体的には、グルタチオンセファロースビーズ、および、当該グルタチオンセファロースビーズに結合しているタンパク質)を回収した。次いで、回収された沈殿物を、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。なお、ポジティブコントロールとしては、「CH1+CH2」を用いた。
GST−FCN1−Ntと、Myc−Hs IgG−3と、を混合した後、当該混合物にグルタチオンセファロースビーズを加えて、混合および撹拌した。その後、混合物を遠心分離することによって、沈殿物(具体的には、グルタチオンセファロースビーズ、および、当該グルタチオンセファロースビーズに結合しているタンパク質)を回収した。次いで、回収された沈殿物を、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。なお、ポジティブコントロールとしては、「CH1+CH2」を用いた。
試験結果を図12に示す。図12より、IgGとFCN1とは、IgG−3dを介して結合していることが明らかになった。
<9.IgG−3d内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>
本試験では、IgG−3d内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
本試験では、IgG−3d内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、周知の方法にしたがって、IgG−3dを6つに分割した各部分ペプチド(iViep1、iViep2、iViep3、iViep4、iViep5、および、iViep6)を化学合成した(図13(A)および(B)参照)。なお、図13中、iViep1、iViep2、iViep3、iViep4、iViep5、および、iViep6の各々を、3d−1、3d−2、3d−3、3d−4、3d−5、および、3d−6にて示している。
各ペプチドの具体的なアミノ酸配列を、以下に示す。つまり、
IgG−3d:EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA (配列番号3)、
iViep1:EEQYNS (配列番号4)、
iViep2: TYRVVS (配列番号5)、
iViep3: VLTVLH (配列番号6)、
iViep4: QDWLNG (配列番号7)、
iViep5: KEYKCK (配列番号8)、
iViep6: KVSNKA (配列番号9)。
IgG−3d:EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA (配列番号3)、
iViep1:EEQYNS (配列番号4)、
iViep2: TYRVVS (配列番号5)、
iViep3: VLTVLH (配列番号6)、
iViep4: QDWLNG (配列番号7)、
iViep5: KEYKCK (配列番号8)、
iViep6: KVSNKA (配列番号9)。
次いで、周知の方法にしたがって、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクターを作製した。なお、上述したタンパク質は、GST(Glutathione S-transferase)タンパク質と融合したGST融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。そして、周知の方法にしたがって、当該ベクターを用いて、GST融合タンパク質を精製した。
更に、本試験では、<7.IgG−3内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>の欄で説明した、IgG−3dを発現するベクターを用いた。なお、当該タンパク質は、Mycタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。当該ベクターをヒト腎臓細胞(HEK293T)に導入し、当該ヒト腎臓細胞内で目的のタンパク質を発現させて、IgG−3dタンパク質を取得した。
iViep1、iViep2、iViep3、iViep4、iViep5、または、iViep6の存在下で、GST融合タンパク質とIgG−3dタンパク質とを混合および撹拌した後、更に、グルタチオンセファロースビーズを加えて、混合および撹拌した。その後、混合物を遠心分離することによって、沈殿物(具体的には、グルタチオンセファロースビーズ、および、当該グルタチオンセファロースビーズに結合しているタンパク質)を回収した。次いで、回収された沈殿物を、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図13(C)に示す。なお、図13(C)にて、「NC」は「negative control」を意図し、「NP」は「no peptide added」を意図している。図13の(C)から、iViep3、iViep5、および、iViep6は、IgG−3dとFCN1−Ntとの結合を阻害することが明らかになった。
<10.IgG内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>
図14の「A」に示す断片化部位とは異なる断片化部位を発現するプラスミド(図14の「B」参照)を、ヒト腎臓細胞(HEK293T)細胞に遺伝子導入して発現させた後、細胞抽出液とGST−FCN1−Ntとを混ぜ、グルタチオンセファロースを加えて遠心沈降し、沈降物をウエスタンブロット解析に供した。
図14の「A」に示す断片化部位とは異なる断片化部位を発現するプラスミド(図14の「B」参照)を、ヒト腎臓細胞(HEK293T)細胞に遺伝子導入して発現させた後、細胞抽出液とGST−FCN1−Ntとを混ぜ、グルタチオンセファロースを加えて遠心沈降し、沈降物をウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図14に示す。図14より、CH1+CH2とCH1+15aa(CH1にリンカー領域の15アミノ酸を付加したペプチド断片)とがFlag−FCN1−Ntと結合することが明らかになった。
<11.IgG−2内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>
上述した<6.IgGタンパク質内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>では、IgG−2のみならず、CH1を含むIgG−2もFCN1−Ntと結合することが明らかになった。そこで、本試験では、CH1内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
上述した<6.IgGタンパク質内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>では、IgG−2のみならず、CH1を含むIgG−2もFCN1−Ntと結合することが明らかになった。そこで、本試験では、CH1内のどの箇所にFCN1タンパク質が結合するか、特定した。以下に、試験方法、および、試験結果について説明する。
まず、周知の方法にしたがって、CHを11個に分割した各部分ペプチドを化学合成した(図15の(A)および(B)参照)。なお、各部分ペプチドの具体的なアミノ酸配列を、以下に示す。つまり、
CH1−1 :ASTKGPSVFP (配列番号19)
CH1−2 :LAPSSKSTSG (配列番号20)
CH1−3 :GTAALGCLVK (配列番号10)、
CH1−4 :DYFPEPVTVS (配列番号21)
CH1−5 :WNSGALTSGV (配列番号11)、
CH1−6 :HTFPAVLQSS (配列番号22)
CH1−7 :GLYSLSSVVT (配列番号23)
CH1−8 :VPSSSLGTQT (配列番号12)、
CH1−9 :YICNVNHKPS (配列番号24)
CH1−10:NTKVDKKVEP (配列番号13)、
CH1−11:KSCDKTHTCPPCP (配列番号25)
次いで、周知の方法にしたがって、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクターを作製した。なお、上述したタンパク質は、GST(Glutathione S-transferase)タンパク質と融合したGST融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。そして、周知の方法にしたがって、当該ベクターを用いて、GST融合タンパク質を精製した。
CH1−1 :ASTKGPSVFP (配列番号19)
CH1−2 :LAPSSKSTSG (配列番号20)
CH1−3 :GTAALGCLVK (配列番号10)、
CH1−4 :DYFPEPVTVS (配列番号21)
CH1−5 :WNSGALTSGV (配列番号11)、
CH1−6 :HTFPAVLQSS (配列番号22)
CH1−7 :GLYSLSSVVT (配列番号23)
CH1−8 :VPSSSLGTQT (配列番号12)、
CH1−9 :YICNVNHKPS (配列番号24)
CH1−10:NTKVDKKVEP (配列番号13)、
CH1−11:KSCDKTHTCPPCP (配列番号25)
次いで、周知の方法にしたがって、FCN1タンパク質のアミノ末端側の部分(FCN1−Nt)を発現するベクターを作製した。なお、上述したタンパク質は、GST(Glutathione S-transferase)タンパク質と融合したGST融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。そして、周知の方法にしたがって、当該ベクターを用いて、GST融合タンパク質を精製した。
更に、本試験では、<6.IgGタンパク質内における、FCN1タンパク質が結合する部位の特定>の欄で説明した、IgG−2を発現するベクターを用いた。なお、当該タンパク質は、Mycタグと融合した融合タンパク質として発現されるように、ベクターを設計した。当該ベクターをヒト腎臓細胞(HEK293T)に導入し、当該ヒト腎臓細胞内で目的のタンパク質を発現させて、IgG−2タンパク質を取得した。
各ペプチドの存在下で、GST融合タンパク質とIgG−2タンパク質とを混合および撹拌した後、更に、グルタチオンセファロースビーズを加えて、混合および撹拌した。その後、混合物を遠心分離することによって、沈殿物(具体的には、グルタチオンセファロースビーズ、および、当該グルタチオンセファロースビーズに結合しているタンパク質)を回収した。次いで、回収された沈殿物を、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。
試験結果を図15(C)に示す。図15(C)において、Lane6、8、11および13は、各々、CH1−3、CH1−5、CH1−8、および、CH1−10を用いた試験の結果を示す。図15(C)から、CH1−3、CH1−5、CH1−8、および、CH1−10は、IgG−2とFCN1−Ntとの結合を阻害することが明らかになった。
<12.抗フィコリンタンパク質・マウスモノクローナル抗体の作製>
3種類のポリペプチドを抗原として、周知の方法にしたがって、抗フィコリンタンパク質・マウスモノクローナル抗体を作製した。なお、各抗原に対し、各々2種類の抗体を作製した。抗原として用いたポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった。つまり、
ポリペプチド1:GDRGEKGMRGEKGDC (配列番号16)、
ポリペプチド2:CGSSELRVDLVDFEG (配列番号17)、
ポリペプチド3:CQFAKYKSFKVADEA (配列番号18)。
3種類のポリペプチドを抗原として、周知の方法にしたがって、抗フィコリンタンパク質・マウスモノクローナル抗体を作製した。なお、各抗原に対し、各々2種類の抗体を作製した。抗原として用いたポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりであった。つまり、
ポリペプチド1:GDRGEKGMRGEKGDC (配列番号16)、
ポリペプチド2:CGSSELRVDLVDFEG (配列番号17)、
ポリペプチド3:CQFAKYKSFKVADEA (配列番号18)。
IVIG治療を行う前、およびIVIG治療を行った後の川崎病患者の血清を、作製した抗フィコリンタンパク質・マウスモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。試験結果を図16に示す。
図16の「♯1」および「♯2」は、ポリペプチド1を抗原として作製された2つの抗体の試験結果であり、図16の「♯3」および「♯4」は、ポリペプチド2を抗原として作製された2つの抗体の試験結果であり、図16の「♯5」および「♯6」は、ポリペプチド3を抗原として作製された2つの抗体の試験結果である。
図16の「♯6」から明らかなように、ポリペプチド3を抗原として作製された抗体は、川崎病患者のフィコリンタンパク質を感度良く検出した。
<13.マウスモノクローナル抗体に関する検討−1>
Candida Albicans Water Soluble Fraction(CAWS)をマウスに腹腔内投与すると川崎病に類似した血管炎を起こすことが知られている(Nagi-Miura N, Okuzaki D, Torigata K, Sakurai MA, Ito A, Ohno N, Nojima H: CAWS administration increases the expression of interferon gamma and complement factors that lead to severe vasculitis in DBA/2 mice. BMC Immunol, 14(1): 44, 2013参照)。
Candida Albicans Water Soluble Fraction(CAWS)をマウスに腹腔内投与すると川崎病に類似した血管炎を起こすことが知られている(Nagi-Miura N, Okuzaki D, Torigata K, Sakurai MA, Ito A, Ohno N, Nojima H: CAWS administration increases the expression of interferon gamma and complement factors that lead to severe vasculitis in DBA/2 mice. BMC Immunol, 14(1): 44, 2013参照)。
マウスにCAWS投与後、0、2、3、4、5日後の各々に、CAWSを投与した同一のマウスから少量の血液を採取し、当該血液から血清を調製してウエスタンブロット解析に供した。
マウスのFcnb(ヒトのFCN1に相当する)に対するポリクローナル抗体を作製してウエスタンブロット解析に用いたところ、CAWS投与後、2日後から5日後にかけて、Fcnbの量が徐々に増えていることが観察された(図17の上図参照)。
一方、FCN1に対するマウスモノクローナル抗体(具体的に、図16における♯6のマウスモノクローナル抗体に対応)を用いたところ、抗Fcnbポリクローナル抗体よりもマウスのFcnbを感度高く認識し、やはりCAWS投与後、2日後から5日後にかけて、Fcnbの量が徐々に増えていることが観察された(図17の下図参照)。
この結果は、CAWS惹起型血管炎においても、Fcnb(FCN1)の増加が重要な働きをしていることが示唆している。さらには、マウスモノクローナル抗体(具体的に、図16における♯6のマウスモノクローナル抗体に対応)が、IVIGの代替品として血管炎(例えば、CAWS惹起型血管炎)の治療に有用である可能性を示唆している。
<14.マウスモノクローナル抗体に関する検討−2>
川崎病に類似した血管炎を生じることが知られているCandida Albican培養上清由来の可溶性多糖画分(Albicans Water Soluble Fraction:CAWS)をマウスに腹腔内投与した。その後、CAWSを投与してから1週間後(wk1)または3週間後(wk3)に、当該マウスに対して、ヒト由来のIVIG製剤、または抗FCN1モノクローナル抗体(具体的に、図16における♯1〜♯6のマウスモノクローナル抗体に対応)を腹腔内投与し、1、2、3、4、5週間目の体重変化を測定した(図18のA参照)。
川崎病に類似した血管炎を生じることが知られているCandida Albican培養上清由来の可溶性多糖画分(Albicans Water Soluble Fraction:CAWS)をマウスに腹腔内投与した。その後、CAWSを投与してから1週間後(wk1)または3週間後(wk3)に、当該マウスに対して、ヒト由来のIVIG製剤、または抗FCN1モノクローナル抗体(具体的に、図16における♯1〜♯6のマウスモノクローナル抗体に対応)を腹腔内投与し、1、2、3、4、5週間目の体重変化を測定した(図18のA参照)。
血管炎を発症すると、マウスの体重が減少することが知られている。特定の抗FCN1モノクローナル抗体が投与されたマウス(図18のAに示す「♯5 mAb wk1」および「♯6 mAb wk3」参照)では、マウスの体重減少が観察されなかった。
なお、図18において、「A」は、CAWSマウス治療実験の結果を示す折れ線グラフであり、「B」は、「A」の折れ線グラフのデータを実験群毎に分けて体重変化を統計解析した結果であり、「C」は、「B」の結果に、血管炎発症実験(CAWSマウス3匹分)を生食群として加えた上で統計解析した結果である。
実験群ごとに分けて統計解析をすると、特定の抗FCN1モノクローナル抗体(図16における♯5および♯6のマウスモノクローナル抗体に対応)が投与されたマウスで体重減少が見られなかった事実は歴然としていることが判明した(図18のBおよびC参照)。この結果は抗FCN1モノクローナル抗体を大量培養して製剤化すれば、IVIGよりも優れた医薬品に成る可能性が示唆された。
本発明は、免疫不全、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の治療に用いることができる。また、本発明は、免疫不全用、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤の製造に用いることができる。
1 フィコリンタンパク質
2 結合領域
5 結合対象
10 物質
2 結合領域
5 結合対象
10 物質
Claims (4)
- フィコリンタンパク質と結合する抗体を含有し、
上記フィコリンタンパク質と結合する抗体は、配列番号18にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するものであることを特徴とする、自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤。 - 上記自己免疫疾患は、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、または、不明熱であることを特徴とする、請求項1に記載の自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤。
- 上記難治性血管炎は、川崎病、高安病、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎/Churg-Strauss症候群、または、巨細胞性動脈炎であることを特徴とする、請求項1に記載の自己免疫疾患用、または、難治性血管炎用の治療剤。
- 採取された血清に含まれるフィコリンタンパク質を、配列番号18にて示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体によって検出する工程を有することを特徴とする、自己免疫疾患、または、難治性血管炎の診断のためのデータの取得方法。
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WO2006077248A1 (en) * | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Innogenetics N.V. | Nucleic acid variants in the ficolin genes associated with altered innate immunity |
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JP2013520979A (ja) * | 2010-03-05 | 2013-06-10 | リグショスピタレト | 補体活性化のキメラ抑制分子 |
JP2014520765A (ja) * | 2011-06-28 | 2014-08-25 | リグショスピタレト | フィコリン−3の治療標的 |
-
2016
- 2016-10-31 JP JP2016213697A patent/JP6143209B1/ja active Active
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