JPH05505308A - アオパンカビ発現システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アオＪ＜シカヒ発現システム 几１トケ払」Ｌ矩Ｉ一 本発明は、タンパク質発現のためにアオパンカビ（（且−ｇユ）内で使用される ＤＮＡ構築体に関する。

１に１１ 分子生物学は、種々の異なる源から多様なタンパク質を産生する機会を提供して きた。様々な発現構築体、並びに種々の宿主を用いる発現システムの開発に伴い 、発現レベル、ＤＮＡ構築体の安定性、産生物の性質及び産生率に影響を及ぼす 様々な問題が考慮されるようになった。これらの事柄に加えて、所期の産生物を 分泌のためにシグナルペプチドと結合し得るという分泌の問題、並びに産生物を グリコジル化、アシル化、ホスホリル化、ペプチド開裂等によって更にプロセッ シングし得るという翻訳後プロセッシングの問題も注目されてきた。その他、通 常は生物学的又は生理学的活性と相関したものであり得るタンパク質産生物の折 りたたみの性質も考慮すべき事柄となっている。

現在多くの関心を集めているのは、（１）効果的に使用できる廉価な媒体を用い て容易に発酵し得、（２）産生物を高収率で産生し、（３）効率的な分泌を行う ことかでき、且つ（４）生物学的活性の高い産生物の単離及び精製が容易である 宿主を使用する異種タンパク質発現システムの開発である。

閏ｎぷ＝ 糸状菌形質転換システムに関する文献としては、米国特許第４，４８６，５３３ 号、ＥＰ＾（欧州特許量ＷＢ）第０．２１５，５３９号、ＥＰ八へ０．２１５， ５９４号、ＥＰ八へ０１７７２４３号、日本特許第６０２４８１８１号、ＥＰ八 へ０１７２５０６号、ＥＰ＾第０’２２０６８９号、−〇第８６０６０９７号、 ＥＰ＾第０２２５０７８号、ＥＰ八へ０２４９３５０号、英国特許第２，２００ ，１１８号及びＥＰ＾第０２７８３５３号が挙げられる。

Ｃｗｙｎｎｅらは（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、５，７１３−７１９で、ヒト インターフェロン及び細菌エンドグルカナーゼの産生に７−亘ｎ１ｄｕｌａｎｓ を使用することを開示しており、Ｕｐｓｈａｌｌらは（１９８７）同書５．１３ ０１−１３０４に、活性ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の産生に前記と同 じ菌類分備用することを記述している。Ｃｕ　ｌ　ｌ　ｅｎらは（１９８７）同 書５．３６９−３７６に、活性ウシキモシンの産生に前記と同じ菌類を使用する ことを記述している。Ｉ（ａｒｋｋ　ｉらは（１９８９）同書９，５９６−６０ ３で、活性ウシキモシンの産生に菌ＷＩＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ を使用することを提案している。

免ｉ二ＩＩＪＬ 本発明は、内在転写エレメントの転写調節下で異種読み取り枠のキメラ構築体を 含むＤＮＡを使用するアオバンカビ発現システムを提供する。前記構築体を、標 識遺伝子、特に独立栄養変異体の相補性を与えるｌ［遺伝子と共に同時形質転換 すると、異種タンパク質を効率的に産生する形質転換細胞が得られる。

の　゛　ｔ　； 第１図〜第６図は本発明で使用するプラスミドの製造分示す説明図である。

・　の＝ アイパンカビ宿主中で異種タンパク質を産生するための方法及び組成物を提供す る。ＤＮＡ構築体としては、異種読み取り枠と内在転写調節領域とを使用するも のを製造する。調節領域は、異種遺伝子が高レベルで発現されるように、且つ転 写終結及びポリアデニル化が行われるように選択され、異種読み取り枠は、異種 タンパク質の効率的な分泌及びプロセッシングな実施せしめるシグナルをコード する。

アオバンカビ宿主の形質転換はスフェロプラストな用いて達成し得、その場合は 同時形質転換ＤＮＡが、細胞壁を再生させた後で形質転換宿主細胞の選択を可能 にするマーカーを供給する。形質転換宿主は次いで培養し、異種産生物の産生及 び分泌に使用し得る。

宿主はアオバンカビ、特に卜ｃｒａｓｓａである。本発明では多くの転写プロモ ーターを使用し得る。アオパンヵビ由来の転写プロモーターには、トチューブリ ン遺伝子、１ｊＬ−１遺伝子、インベルターゼ等がある。これらの遺伝子は、転 写プロモーターと、翻訳開始及び終止コドンと、翻訳された配列と、転写停止シ グナルとポリアデニル化シグナルとを含む、翻訳された配列でコードされるタン パク質は分泌シグナルペプチドを任意に含み得る。使用し得る分泌シグナル配列 としては、アオパンカビがら分泌されたタンパク質、例えばインベルターゼ、グ ルコアミラーゼ、ヌクレアーゼ、セルラーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性 ボスファターゼ等をコードする遺伝子に由来するシグナル配列、並びに分泌シグ ナルがアオバンカビ内で機能する異種タンパク質、例えばウシキモシンに由来す るシグナル配列が挙げられる。このような異種分泌シグナルは、産生ずべき異種 タンパク質か、又は産生じたいタンパク質以外の第２の異種タンパク質に由来し 得る。異種遺伝子は任意の起源、特定的には哺乳動物起１に由来し得る。好まし い哺乳動物遺伝子としては、血液タンパク質、例えば因子ｖｍ、組織プラスミノ ーゲン活性化因子、補体因子、結成アルブミン等、成長因子、成長ホルモン、イ ンターロイキン等１表面膜タンパク質、酵素、構造タンパク質、合成タンパク質 等が挙げられる。

本発明の構築体は通常の方法で容易に製造し得る０種々のＤＮＡフラグメントは 天然の起源から取得し得、合成し得、又はこれらを組合わせたものであり得る。

フラグメントは、適当な配列を得るなめに、適当な操作方法により、制限エンド ヌクレアーゼ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応等を用い て操作し得る。付着端もしくはプラント末端を有するか、又は尾部に相補的配列 を有するフラグメントは連結反応によって結合し得る。

本発明のＤＮＡ構築体は、転写開始調節領域と、５′末端の転写されたが翻訳は されていない領域と、翻訳開始コドンと、分泌シグナルをコードする配列と、タ ンパク質の産生をコードする配列と、翻訳終止コドンと、転写終結領域と３順に 含んでいる。転写開始調節領域は、プロモーター及びエンハンサ−に関連した配 列を含むのが適当である。

５′末端の未翻訳領域は、通常アオパンカビプロモーターに隣接している配列に 由来するか、異種読み取り枠に対して５′末端側の配列に由来するか、又はこれ ら２つの組合わせであり得る。次は、翻訳読み取り枠内で異種読み取り枠又は遺 伝子に接している分泌シグナルをコードする配列である。終結コドンを有する読 み取り枠には、３゛末端の未翻訳領域、通常はポリアデニル化シグナル配列と、 アオパンカビ内で機能する終結調節配列とが続く。シグナル配列が存在しない場 合には、読み取り枠は固有の開始コドンを有する。他のＤＮＡも、便益性、形質 転換及び発現の効率に関するこれら他のＤＮＡの効果等に応じて任意に存在させ 得る。

転写調節領域は、特に物理的又は化学的物質を使用する場合には、構成的又は誘 発性であり得る０例えば、調節タンパク質が温度変化に反応する場合には、温度 感受性転写開始調節配列を使用し得る。あるいは、炭水化物（例えばグルコース 、スクロース、ガラクトース）のような化学物質ト調節に作用させてもよい。

本発明のＤＮＡ構築体は通常、該構築体の種々の製造段階でその構造又は部分を 分析ご行うことが可能なベクター中に形成する。有利には、複製システムと、形 質転換細胞を選択するためのマーカー、特に抗生物質のような殺生物質に対して 耐性のあるマーカーとを含み、且つＤＮＡ配列の挿入及び除去を容易にするため の１つ以上のポリリンカーを含み得る一般的なりローニングベクターを用いて、 大腸菌中でクローニングを行う。

本発明の構築体は、同時形質転換を用いてアオパン力ビスフェロプラストに形質 転換する。有利には、アオパンカビが本質的代謝物、例えばアミノ酸を合成する ことができない突然変異体であり得、同時形質転換ＤＮＡが原栄養体に栄養要求 体を補足する。例えばｈ　ｉ　ｓ　−２（ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ　５ｔ ｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｎｏ、２１）のような様々な栄養要求アオパンカビ突然 変異体が入手可能である。

形質転換は、適当な炭水化物を含んでいる等張培地中で、ポリエチレングリコー ルの存在下でスフェロプラストを使用して実施することができる。ＤＮＡの使用 量は通常約１〜５μｇ／１０’細胞である。形質転換後は、原栄養体を選択する 培地中で細胞を増殖させる。これらの細胞は、所望の読み取り枠の存在と異種タ ンパク質の発現とを調べるために更にスクリーニングにかけ得る。

以下に、非限定的好適実施例を挙げる。

び　゛ □ 組換えＤＮＡ操作では、大腸菌株Ｄ　Ｈ５ａ　（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［ＢＲＬ］）及びＮＭ５２２を使用した。

Ｎ、ｃｒａｓｓａ株ｈ　ｉ　ｓ　−２：　ｍ　ｔ　ｒ　（ＳＬｕａｒｔら、１９ ８８　Ｇｅｎｅ　３０：１９８−２０３＞は総ての操作で使用した。

１４東先 大腸菌に関する標準的な条件（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２　Ｍｏ１ｅ−ｃｕ ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、＾　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）及びＮ、ｃｒａｓｓａに関する標準的条件（Ｄａｖ ｉｓ及びＤｅＳｅｒｒｅｓ、　１９７０Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ＩＩｏ ｌｏ　２３：８Ｏ−１４３）を使用したが、相異点として、生、旺■」３質転換 細胞は、細胞外プロテアーゼの発現を抑制するためにトリプトンを２％含むブイ ヨンで培養しくＤｒｕｃｋｅｒ、　１９７２．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　１ １０：１０４１−１０４９）、またＮ、ｃｒａｓｓａ培養のための炭水化物炭素 源を除去するか、又はＬＬＬ−１プロモ一ター構築体の場合にはスクロースに代 えてフル２ドース？用いるかのいずれかにした。

ｔＡＪＬＬ匹ΣＫ ＤＮＡ操作は総て、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの前述の文献（１９８２）及びＡｕ５ ｕｂｅｌら著、　１９８７．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓに記 載されているような標準的方法に従って行った。制限酵素及びＤＮＡ修飾酵素は 、ＢＲＬ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂ ｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉ３　ＩＩＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ及 びＰｒｏｍｅｇａといった製造業者から入手した。ＤＮＡ配列の分析は、５ｅｑ ｕｅｎａｓｅ（ＩＪＳ　Ｂｉｏｅｈｅｍｉ−ｃａｌｓ社の登録商標）とその製造 業者によって推奨されているプロトコルとを用いて、ジデオキシヌクレオチド法 （Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ Ａ、７４：５４６３−５４６７＞により実施した。

Ｎ、ｃｒａｓｓａの′ Ｎ、ｃｒａｓｓａの形質転換は、Ｖｏ　ｌ　１ｅｅｒ及びＹａｎｏｆｓｙの方法 （１９８６Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、　８３：４８６９ −４８７３）で行った。

要約すれば、５〜７日の培養物から分生子を回収し、１Ｍソルビトールの存在下 でＮｏｖｏｚｙｍｅ　（Ｎｏｖｏｌａｂｓ社）で消化してスフェロプラストに変 換した。これらのスフェロプラストを、５０μＭのスペルミジン、５ｍｇ／ｍｌ のヘパリン、４０％のＰＥ　Ｇ　”　４０００　”及びＩＭのソルビトールの存 在下で１〜５μｇのＤ　Ｎ　Ａと混合し、２．８％の寒天と、ＩＭのソルビトー ルと、２％のソルボースと、０．０２％のイノシトールと、０．０５％のフルク トースと、０．０２％のグルコースとを含むＶｏ　ｌ　ｇｅ　ｌのトップ寒天に プレートした。

ＶｏｌＬｎｅｒコスミド遺伝子ライブラリー（Ｖｏｌ　１ｅｅｒ及びＹａｎｏ− ｆｓｋｙ、１９８６．Ｇｅｎｅ）から単離した野性型ｈｉｓ−２一対立遺伝子を 含むコスミド６　：　１１　Ｅ　（Ｓｔｕａｒｔら、　１９８８．　Ｇｅｎｅ　 ３０：１９８−２０３　）を用いてｈｉｓ−２Ｈｍｔｒ株の形質転換細胞を得、 最少限のＶｏｇｅ　ｌ培地で原栄養体に関して選択することにより検出した。

凝１Ｌア」−女／− Ｆｏ　ｌ　ｔｍａｎｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　１９ ：４２１−４３６（１９７０）　）を少し変えて、キモシンの凝乳活性を調べた 。試ｆ４０．２ｍｌと、５０ｍＭのＣａＣ］２中１０％（Ｗ／Ｖ）のＣａｒｎａ ｔｉｏｎ社製脱脂乳０．２ｍｌとを１．５ｍｌのマイクロ遠心管内で混合し、３ ０℃でインキュベートした。凝固が初めて観察されるまでの時間を記録した。非 処理培養培地及び酸処理培養培地で凝乳活性を検査した０、　Ｐ　Ｈ２で処理す るとプロキモシンが擬キモシン（ｐｓｅｕｄｏｃｈｙｓｏｓｉｎ）に迅速に変換 され、ｐＨ−４，５で処理するとプロキモシンからキモシンに変換される（　Ｆ ｏ　ｌ　ｔｍａｎｎ、１９７０、前記文献）。

擬キモシン及びキモシンは両方とも凝乳活性を示す、ｐＨ計を用いてｐＨ調整を モニターした。０．１ＭのＮａＣ１を含む試料にＨＣＩを加え、室温で１０分間 インキュベートし、５ＮのＮａＯＨを加えて中和し、且つｐＨ６，８リン酸塩Ｍ Ｉｒ液を濃度５０ｍＭまで加えることによって、試料を酸性化し且つ中和した。

凝乳に要した時間を精製キモシン（Ｓｉｇｍａ、　２３．６単位ｈａｇタンパク 質）を用いて作成した標準曲線と比較することにより、所与の試料の単位を決定 した。１単位は、３０℃、１公開で１ｍｌの乳汁を凝固させるのに必要なキモシ ン量であると決定された。

九創彪４ アオバンカビ培養培地中の凝乳活性物質を、ウサギポリクローナル抗プロキモシ ン血清（Ｍ、ＭｅＣａｍａｎ、Ｃｏｄｏｎより寄贈）で沈降させた。１ｍｌアリ コートに、３．８ｍｇ／ｍｌのＩ　ｇＧ　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定）を含む抗 プロキモシン血清か、又は、陰性対照として、１９．６μｌの正常ウサギＩ　ｇ 　Ｇ　（Ｐｉｅｒｃｅ、１．０２ｍ８／ｍｌ（最終ＩｇＧ濃度〜２０μ５７ｍ１ ））を含む抗プロキモシン血清を５．２μｌ加えた。第３のアリコートには血清 を全く加えなかったが、他の操作は総て行った（偽試料〉。４℃で一晩インキユ ベートした後、リン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７＞中１０％の１い」上Ｌｂ匹至ｌ翠 ｉユａｕｒｅｕｓ細胞懸濁液（Ｓｉｇｓａ、結合力１３０μｓ　ＩｇＧ）を１０ ０μｌ加え、４℃で１時間インキュベートした。Ｓ、ａｕｒｅｕｓ細胞を２００ ０ｒｐｍで１０分間遠心処理してベレット化し、上清を新しい管に移した。

ウェス　−ンプロット Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉの方法、（１９７０）２２７　：６８０−６８５、に従って ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。タンパク質をニトロセルロー スに電気移動させ（ｅｌｅｅｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）、Ｔｏｗｂｉｎら の方法、（１９７９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、ＵｓＡ　７６ ：４３５０−４３５１、により免疫学的に検出した。アルカリ性ホスファターゼ （ＡＰ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて一次抗体を検出し、次いでＡＰ 基質と共にインキュベートした（ＡＰ基質Ｉ！衝液１５ｍ１当たり５ｍｇのＮ１ ｔｒｏ　ＢｌｕｅＴｅｔｒａｚｏｌｕ＋ｉ及び２．５ｍｇの５−ブロモ−４−ク ロロ−３−インドイル−ホスフェート）、ニトロセルロース上の非特異的結合部 位を５％（ｗ／ｖ）のＣａｒｎａｔｉｏｎ社製脱脂乳でブロックした。

晴」１ ニープリン　ベクター 大腸菌プラスミドベクターｐＴｚ　１８Ｒ誘導体（Ｌ、Ａ。

Ｒｏｋｅａｃｈら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Δｃｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾（１９８８） 、　８５：４８３２）内で、トチニープリンプロモーターと５゛末端未翻訳ｍＲ ＮＡリーダーのコーディング部分とを含むゲノムＤＮＡフラグメントを、トチュ ープリンカルボキシル末端読み取り枠の小部分と翻訳終止コドンと転写終結シグ ナルとｍＲＮＡポリアデニル化シグナルとを含む第２のゲノムＤＮＡフラグメン トと組合わせて、Ｎ、Ｃｒａｓｓａ発現ベクターｐＴＰＴ１を形成した。前述の ２つのトチユーズリンゲノムＤＮＡフラグメントは、予めプラスミドｐｓＶ５０ 中でクローニングしたベノミル（ｂｅｎｏＢｌ　）耐性を有するトチニープリン 対立遺伝子から得た（Ｖｏｌｌｍｅｒ及びＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ　ｉ　、ＵＳＡ（１９８６）　８３：４８６９−４８７３） 、。

トチニープリンの発現に必要な配列は総て、ｐｓＵ５０のゲノムＳａ　ｌ　Ｉ　 −Ｈｉ　ｎｄｌ［［ＤＮＡフラグメント上に存在する（　Ｖｏｌ　１ｅｅｒ及び Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、Δｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓΔ（１９８ ６）　８３：４８６９−４８７３＞、プロモーターと５゛末端未翻訳ＲＮＡリー ダーをコードする配列とをクローンするために、まずｐｓＶ５０由来のＳａｌ　 Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＴｚ　１８Ｒにサブクローンした（ｐＴｔ２０ ．第１図）。プロモーターを含み且つ５′末端未翻訳ＲＮＡリーダーをコードす るｐＴｔ２０由来のより小さい５ａＩＩ−ＳｆａＮＩフラグメント（３５２塩基 対（ｂｐ））をｐＵＣ１９の５ａｌＩ及びＸｍａＩ部位にサブクローンした（　 Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ　、及びＭｅｓｓｉ ｎｇ、Ｊ、　Ｇｅｎｅ（１９８５）　３３：１０３−１１９）　、　Ｓ　ｆ　ａ 　Ｎ　１は翻訳開始ＡＴＧの１０ヌクレオチド５′末端を開裂し、この部位に４ ヌクレオチド（５’　ＰＯ，−ＧＧＴＴ）オーバーハングを残す。

５ｆａＮ１は、非対称ＤＮＡ認諏配列の側面に位置する複数の配列に切断する制 限エンドヌクレアーゼ類の１つである。従って、５ｆａＮ１によって形成される 付着端は側面のＤＮＡの配列に応じて異なる。５ｆａＮ１消化によって形成され た末端を、ｄＡＴＰのみの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメン トにより処理し、チュープリンプロモーターフラグメントの３′末端にジヌクレ オチド５°Ｐ○、−ＧＧ付着端を残した。

ＸｍａＩで消化し、フレノウ及びｄＣＴＰのみで処理し、フレノウを熱不活性化 し且つ５ａｌＩ消化を行って、ｐＵＣ１９ベクターと製造した。ｄＣＴＰのみを 存在させてＸｍａＩ付着端のフレノウ処理を行うと、５’　ＰＯ４−ＣＣＧＧが ５°Ｐ○、−ＣＣに変換される。これは、チューブリンプロモーターの修飾５ｆ ａＮＩ端に対して相補的なものである。このようにして製造したｐＵＣ１９にチ ューブリンプロモーターフラグメントを連結させると、ｐＵＣ５’　Ｔ　（第１ 図）が得られる。これは、ジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。

Ｎ、ｃｒａｓｓａ　８−チューブリン翻訳及び転写終止と転写ポリアデニル化シ グナルとを含むゲノムＤＮＡフラグメントを最初にＢａｍＨｒ〜Ｈｉｎｄｎ［フ ラグメントとしてｐｓＶ５０からｐＴｚ　１８Ｒにサブクローンした（ｐｔ３’ 　ＢＨ１第２図）、この６２０ｂｐフラグメントは、６−チューブリンのカルボ キシル末端１０３アミノ酸のコドンを含んでいる。

ｐｔ３’　ＢＨのエキソヌクレアーゼｍ　（ＥｘｏＩ［ｌ　）処理を行うことに より、前記アミノ酸のうち７つのアミノ酸のコドンを除去し、カルボキシル末端 ２４アミノ酸のみをコードする配列を残した。プラスミドｐｔ３’　ＢＨを制限 エンドヌクレアーゼ（ＬＬ■及びＢａｍＨＩで消化し、Ｅｘｏｌ［ｌと共にイン キュベートし、単一鎖ヌクレアーゼＳ１で処理して端部をプラントにし、Ｔ４　 ＤＮＡリガーゼで再び環状にした（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ）　、得られ たプラスミドｐｔ３’　Ｃａ５ｓ　Ｉ　（第２図）は、ＤＮＡジデオキシヌクレ オチド配列決定によって調べると、６−チューブリンゲノムクローンの３′末端 から３８１ｂｐ挿入物を含んでいる。

このチューブリン３′フラグメントの５′末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を 更に与えるために、ｐｔ３”−ＣａｓｓＩ由来のＳａｃ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｌフラ グメントをｐ’ｒｚ１８ＲのＸｂａＩ及びＨｉ　ｎｄｌ［部位に移した。

ｐｔ３’　Ｃａ５ｓＩをＳａｃ　Ｉで消化し、４ヌクレオチド３°−ＯＨ尾部を 除去する３°→５°エキソヌクレアーゼ活性と有するＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ で処理し、且つＨｉｎｄｌｌ［で消化した。ベクターｐＴＺ１８ＲをＸｂａＩで 消化し、フレノウで処理してプラント末端を形成し、Ｈｉｎｄｌｌで消化した。

このようにして形成したベクターに６−チューブリン３′フラグメントを連結す ると、ｐｔ３’　Ｃａ５ｓＩ　（第２図）が得られた。

ｐＵｃ５’　Ｔ由来のチューブリンプロモーターフラグメントと、チューブリン 転写終止シグナル及びポリアデニル化シグナルと有するフラグメント（ターミネ ータ−フラグメント）とを組合わせて、チューブリン発現ベクターｐＴＰＴ１　 （第３図）′５：形成した。ｐＴＰＴｌはｐＴＺ−１８Ｒの誘導体ｐＴＺ１８Ｒ ａｔ２中に形成した。この誘導体のマルチプルクローニング部位からは、エキソ ヌクレアーゼ消化によって、Ｈｉｎｄｌ［ｉ、影り垣■及びＰｓｔＩ以外の総て の制限エンドヌクレアーゼ部位を除去しておいた。ｐ”ｒｚ　１８ＲＡＴ２はＨ ｉｎｄＩ［［で消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理して再環状化を防止した 。Ｈｉｎ−ｄｍ−反ＬＬｒチューブリンプロモーターフラグメント及びに工ｎｌ −Ｈ１ｎｄｎｒチューブリンターミネータ−フラグメントを、アガロースゲル精 製によって、それぞれｐＵｃ５’　Ｔ及びｐｔ３’　Ｃａ５ｓＩ［から単離し、 これら２つのチュープリンフラグメントをｐＴＺ１８ＲＡＴ２のＨｉｎｄｌｌＩ 部位に連結した。得られたプラスミドｐＴＰＴ１（第３図）は、チューブリンプ ロモーターとターミネータ−との開に３つの非反復制限エンドヌクレアーゼ部位 （ＫＬＸＬＩ　、　Ｓ　ｍ　ａ　ｒ及びＢａｍＨＩ）を有する。これらのチュー ブリンエレメントのＤＮＡ配列を第４図に示した。

モシンｃＤＮＡ ウシキモシンｃＤＮＡ含有プラスミドｐＢＣ８（ＤＮＡ及び配列情報はＤｒ、Ｍ 、ＭｃＣａｍａｎ−Ｃｏｄｏｎにより寄贈された）ミドｐＢＣ８は翻訳開始ＡＴ Ｇ５’末端を３つ有しており、ｐＢＣ８配列のコンピュータ分析の結果、ｃＤＮ Ａ挿入物の最初の１４８ｂＰは実際にはキモシンの９番目（最ｆ＆　）のエキリ ンの一部分の逆方向重複（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）である ことが判明した。この逆方向反復の最後の７つのヌクレオチドは、キモシンｍＲ ＮＡのｃＤＮＡ配列（Ｈａｒｒｉｓ。

Ｔ、Ｊ、Ｒ，、Ｌｏｖｅ、Ｐ、＾、、Ｌｙｏｎｓ、＾、、Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ、Ｇ 、、Ｅａｔｏｎ、Ｍ、＾、Ｎ、。

Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　１ｃａｎ　、Ｔ、）１．　、Ｐａｔｅｌ　、Ｔ、Ｐ、　、　Ｂｏ ｓｅ　、Ｃ、Ｃ，、Ｃａｒｅｙ　、Ｎ、Ｈ，、及びＤｏｅｌ　、Ｍ、Ｔ、、Ｎｕ ｃｌ　、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、（１９８２）　１０：２１７７−２１８７）の６番 目〜１２番目のヌクレオチドと相同である。従って、ｃＤＮＡ挿入物の最初の１ ４１のヌクレオチドは外来のものであり、ｍＲＮＡの最初の５つのヌクレオチド はｐＢＣ８には存在しない。

重複エキジン９配列分除去するために、ｃＤＮＡ挿入物の５′末端をＥｘｏｌ及 びＳＩヌクレアーゼで消化した。

エキソヌクレアーゼ反応を様々な時点で停止させ、ＤＮＡと更にＨｉｎｄｌｌ） で消化した。このＨｉｎｄｌｌはｃＤＮＡの３゛末端で切断する。ＥｘｏＩＩ［ 消化の種々の時点で得られたＤＮＡをゲル精製し、ｐＴｚｌ　８ＲのＨｉｎｃＩ Ｉ及びＨｉｎｄｌ１１部位にサブクローンした（第５図）、これらプラスミドＤ ＮＡの一部の挿入サイズを、制限酵素で消化したＤＮＡのアガロースゲル電気泳 動によって測定し、３つの候補クローンの正確な終結点をジデオキシヌクレオチ ド配列決定によって調べた。これらのクローンの１っｐＢＣ−１８ＨＨは、１４ １の重複ヌクレオチドを、そのうち３つを除いて総て欠失していた。

ア　パン　ビ　ベ　−　への　モシンｃＤＮＡ　ブ且：二弘乙グー ２つの異なる発現ベクター、即ち前述のｐＴＰＴｌ及び後述のｐＭＴＦ５２を用 いて、ウシキモシンｃＤＮＡクローンｐＢＣ１８ＨＨをＮ、ｃｒａｓｓａ中に発 現させた。ｐ’ｒｃＴ中のトチニープリン／キモシン融合体の構造を第６図に示 した。キモシンｃＤＮＡフラグメントをｐＴＰＴｌ中に挿入するために、ｍＩで の部分消化とＨｉｎｃＩＩでの完全消化とによって前記フラグメントをｐＢｃ１ ８ＨＨがら除去した。キモシン読み取り枠内にはＬＩＬＩ部位が１っ存在する。

Ｌと工工での部分消化及びアガロースゲル精製の結果、前記内部部位で切断され ていないＤＮＡ分子が選択された。

ベクターｐＴｐＴ１は、プロモーターとターミネータ−との間の単−ＫＬＸＬＩ 部位及びＢａｍＩ部位を消化することにより、前記キモシンフラグメントを受け 取るように形成した。キモシンｃＤＮＡフラグメントをこのベクターと混合し、 相補的ＬＩＬ１部位を連結した０次いで、４つのデオキシヌクレオチドトリホス ファターゼを総て存在させてフレノウで処理することにより、ベクターのＢ　ａ ｍＨＩ付着端をプラントにし、その後連結を続けてプラントＨｉｎｃｆｆ末端を プラント化ＢａｍＨＩ末端に連結した。

トチスーブリン／キモシン融合遺伝子のＤＮＡ配列は第７図に示す。

これらの検査に使用した第２のＬｅｒａｓｓａ発現ベクターは１１Ｌ−１遺伝子 をベースとする（ＭｅＮａｌｌｙ及びＦｒｅｅ、　（１９８８）Ｃｕｒｒ、Ｃｅ ｎｅｔ、１４（６）　：５４５−５５２）　。

ＧＲＧ−１は、グルコースを欠失した細胞内のアバンダント（ａｂｕｎｄａｎｔ ）ｍ　ＲＮ　Ａをコードするグルコース抑制遺伝子である（ＭｃＮａｌｌｙ、Ｍ 、Ｊ、及びＦｒｅｅ、Ｓ、Ｓ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８８ ）１４（６）　：５４５−５５１）。提案されている７、０００ダルトンのタン パク質の機能はまだ解明されていない。転写プロモーターと、２つのイン１〜ロ ンによって中断された読み取り枠と含む転写配列と、潜在的ポリアデニル化シグ ナルを含む３つの側面配列とを含んでおり、最初はｃＤＮＡとしてクローンされ たゲノムフラグメントを幾つかの発現ベクター中にクローンし成長させた（　Ｆ ｒｅｅ、個人的通信）。この検査で使用したｐＭＴＦ５２は、ＧＲＧ−１読み取 り枠と、大腸菌トグルクロニダーゼをコードする配列と、ＧＲＧ−１ポリアデニ ル化部位とに先行する単−ＸｈｏＩ部位の前の未翻訳リーダー配列の６７個のヌ クレオチドを含んでいる。ｘ」二１−−Ｌベースの発現ベクターｐＭＴＦ５２中 へのサブクローニングを容易にするために、ｐＢｃ１８ＨＨ中のキモシンｃＤＮ Ａ配列のＸｂａ１部位５°にＸｈ。

Ｉリンカ−を挿入してｐＢｃ１８ＸＨを得たく第８図）。

ＸｈｏＩリンカ−（配列５°ＣＣＴＣＧＡＧＧ３°）の付加には５ｅｔｈの方法 （Ｓｅｔｈ、＾、、１９８４．Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈ、、１：９９−１ ０３）を使用した。ｐ　ＢＣ，１８ＨＨｅＸｂ　ａ　Ｉで消化し、フレノウで処 理して末端をプラントにし、非ホスホリル化し、過剰な非連結リンカ−を５ｅｐ ｈａｄｅｘ　（登録商標）［；５０でのスピンカラムクロマトグラフィーによっ て除去した０次いて、１分間９０°Ｃに加熱し、急冷し、ポリヌクレオチドキナ ーゼ及びＡＴＰを用いてＤＮＡの５°○Ｈをホスホリル化することにより、非連 結リンカ−ストランドを除去した。

次いで、プラスミドの８つのヌクレオチド単一鎖尾部をアニールし、Ｔ４　ＤＮ Ａリガーゼで連結した０次いで、ｐＢｃ１８ＸＨ由来の５ａｌＩ−ＸｈｏＩフラ グメントをｐＭＴＦ５２のＸｈｏＩ部位にサブクローンしてｐＧＲＣ５２を得な く第８図）。

このプラスミドからのキモシンの発現には、翻訳開始ＡＴＧとキモシン分泌シグ ナルペプチドとを使用する。未翻訳リーダーとプレプロキモシンの最初の３７個 のアミノ酸とを包囲するｍＲＮＡの配列は下記の通りである：ＧＲＣ５２の ５′末端未翻訳１！ｊＬ−１リーダーを含むｍ−上／キモシン融合転写体の一部 分、並びにキモシン読み取り枠の最初の１１０８のヌクレオチドを下に示す０位 ’ｌ−１０６での想定上の転写開始は、ＭｃＮａｌｌｙ及びＦｒｅｅにより前述 の文献（１９８８）で提案されている。ｍ　ｉ配列は下方枠内に示し、Ｘｈｏｌ リンカ−配列は下方枠内で下線を付けて示し、ウシキモシン配列は上方枠内に示 した。プレプロキモシンのアミン末端Ｓ７アミノ酸は、プロキモシンの頭部を明 示しながら示した。

ｃａｕｃａｕｃ　ａｇｃｃａａｃａａａ　ｇｃａａｕｃａｃａｕ　ｃｕｕｃａｃ ｕａｃｕ　ｕｃａａａｕｃａａＣ−５ｏ　−４０−３０ ａｃａａｃａｃｕｃａ　ａａｃｅａｃｕｕｕｃ　匹五坦弘ＣＵｐｒｅゆ ＡＧＡＧＵＣＵＣＣＣＧＧＣＵＧＧＡＣＣＣＡＧＡＵＣＣＡＡＧ　ＡＵＣＡＧＧ ＵＧＵＣＵＣＧＵＧＧＵＧＣＵＭｅｔＡｒ（ｌｃｙｓ　ＬｅｕＶａｌＶａｌＬｅ ｕｐｒｏ吟 ＡＣｔＪＵＧＣ１）ＧｔＪＣＵＵＣＧＣＵＣＵＣＵ　ＣＣＣＡＧＧＧＣＧＣＵＧ ＡＧＡＵＣＡＣＣＡＧＧＡＵＣＣＣｌＪＣＬｅｕＡｌａＶａｌ　ＰｈｅＡｌａＬ ａｕ　５ｅｒＧｌｎＧｌｙＡｌａ　Ｇｌｕ工１ｅＴｈｒ　Ａｒｇ工１ｅＰｒ。

ＵＧＵＡＣＡＡＡＧＧ　ＣＡＡＧＵＣＵＣＵＧ　ＡＧＧＡＡＧＧＣＧＣＵＣＡＡ ＧＧＡＧＣＡＬｅｕＴｙｒＬｙｓＧｌｙ　ＬｙｓＳｅｒＬｅｕ　ＡｒｇＬｙｓＡ ｌａ　ＬｅｕＬｙｓＧｌｕＨｉｓＮ、ｃｒａｓｓａによるウシキモシンのウシキ モシンを、子ウシの第四胃内で、分子量（ＭＷ）４２．０００ダルトンのプレプ ロ酵素として合成する。これを分泌中に処理してプロ酵素（４０，４００ＭＷ） とし、酸性条件（ｐＨ５以下）で自己触媒的に活性酵素（３５，６０００ＭＷ） に変換する。これらのウシキモシンの発現検査には、Ｎ、ｃｒａｓｓａ株ｈｉｓ −２；ｍｔｒを使用した。　Ｎ、ｃｒａｓｓａ株ｈｉｓ−２：ｍｔｒの形質転換 は、コスミド６：１１Ｅ　ｈｉｓ−２−＋との同時形質転換及び原栄養体に関す る選択によって達成した。形質転換したコロニーを傾斜培養し、安定な６：１１ Ｅ形質転換を意味する正常な増殖率を示すものだけを更に分析した。２１の安定 な形質転換細胞からの分生子を用いて５ｍｌのＶｏｇｅ　Ｉ　トリプトンブイヨ ン培養物を接種し、２日目の培養培地を凝乳活性について定性分析した。６：１ １Ｅのみを含む細胞（株６　：　１１Ｅ）の培養物は乳汁を凝固させなかったが 、ｐＧＲＧ５２及び６：１１Ｅを両方とも含む１４の細胞培養物は乳汁を確実に 凝固させた。これら１４の細胞培養物のうち７つは乳汁を１４時間以内に凝固さ せ、残りの７つは６時間以内に凝固させた。ρＧＲＣ５２形質転換細胞の１つで ある株６３は他の形質転換細胞よりも遥かに大きい凝乳力を示し、乳汁を６分以 内で凝固させることができた。

残りの検査はこの株６３だけを対象に行った。

株６３の凝乳力は免疫沈降性であることが判明した。株６３及び６：１１Ｅを５ 日間培養した後の培養培地を凝乳活性検査にかけたところ、この活性を示したの は株６３の培養培地だけであった０株６：１１Ｅの培地は活性を全く示さなかっ た１株６３培養培地の３つの１ｍｌアリコートを、１）ウサギ抗プロキモシン血 清の存在下、２）ウサギ非免疫血清の存在下、又は３）無血清のいずれかで一晩 インキユベートし、その翌日に、固定Ｓ、ａｕｒｅｕｓ細胞を用いて抗体−タン パク質複合体を沈降させた。試料２）及び３）並びに非処理培養培地の上清は凝 乳力を保持していたが、抗プロキモシン抗体と共にインキュベートした試料１） は凝乳力を完全に喪失していた１株６３が示した凝乳力はアオバンカビプロテア ーゼではなくキモシンに起因するものであり、また可溶性キモシンは細胞から分 泌されると結論された。

キモシンが自己の分泌シグナルペプチドを用いて分泌する効率を測定するために 、株６３の細胞内及び細胞外タンパク質のウェスターンプロットで検出された抗 原性物質３調べた。その結果、キモシンの大部分は細胞から分泌されることが判 明した。ウサギ抗プロキモシン血清でプローブしたこれらのゲルのウェスターン プロットでは、所期のキモシン分子量（３５，６００ダルトン）を有するバンド が特異的に同定された。このバンドは、非処理培養培地と、ｐＨ４，５及びｐＨ ２の処理培養培地とに見られた。これは、プロキモシンが分泌後にキモシンに変 換されることを示唆するものである。これは、アオバンカビ培養物の増殖中に観 察されるｐＨ低下に起因し得、非処理培養培地における凝乳活性の観察に合致す る。ｐＨ２処理試料では、前記バンドよりやや大きい第２のバンドが観察される 。これは、前述の低ＰＨで発生する擬キモシンによるものと考えられる。

アオバンカビ培養培地中のキモシンの比活性を測定すべく、ウェスターンプロッ ト分析によってキモシン量を測定した。培養５日の増殖培地では、０．０３単位 ／ｍｌの凝乳活性が見られ、キモシン量は６０単位／　ｍ　ｇタンパク質の比活 性で５００ｎｇ／ｍ　（２，５μｌの４０Ｘ濃縮試料当たり〜５０ｎｇ）と推算 された。これは、Ｓｉｇｅ＋ａ社がら入手し得る最高比活性のキモシン（製品＃ Ｒ４８７９，６０単位／ｍｇタンパク質）を凌ぐ結果である。

株ｈｉｓ−２，ｍｔｒのｐＴＣＴ形質転換細胞について得られた凝乳活性は株６ ３から得られた活性と比肩し得るものであった０分生子単離体は分泌キモシンを 様々なレベルで示した１株１１を、形質転換に次いで明らかなホモ接合度が得ら れるまで継代培養した。継代培養株１１／３は、静止培養で増殖させると、生物 学的に活性のキモシンを１！当たりｍｇの量で産生できると評価された。

前述の結果から明らかなように、アオパンカビは異種遺伝子の発現及びプロセッ シングを行うための効果的且つ効率的なシステムを提供する。従って、異種遺伝 子を生物学的に活性な形態で高効率で産生ずるための市販のシステムを開発し得 る。これらの産生物は単離及び精製が容易であり、タンパク質産生物を経済的に 供給し得る。

本明細書で引用した発行物及び特許出願明細書はそれぞれ個々に、本明細書に参 考として包含される。

以上、実施例を挙げて本発明の詳細な説明してきたが、当業者には明らかなよう に、本発明はこれらの実施例には限定されず、様々な変形をその範囲内に含む。

１）ｃ會１ ＦＩＧ、　３ 日Ｇ、４ 特表平５−５０５３０８　（１０） ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ 要約書 異種のタンパク質の産生にＮ＋ｕ＋ｏ＋ｐｏ＋ｘ　ｅ＋ａ＋ｓｘ形賀転換体を使 用する。ＤＮ人構築体は、Ｎｅｕ＋ｏ＋ｐｏ＋ｚ内で機能する転写調節領域と翻 訳調節領域下で異種遺伝子を使用して産生される。機能性シグナル配列が異ｌ遺 伝子産物の分泌のために提供される。栄養要求性！１ｅｕｔｏｌｐｏｒａ宿主が 使用され、前記構築物と相補性遺伝子の組合わせにより形質転換される。得られ た形質転換体は異種産生物の効果的分泌を提供する。

補正音の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年９月１１日 濁

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．アオパンカビ菌類に対して異種のペプチドを産生する方法であって、 コンピテントアオパンカビ宿主細胞を、該宿主内で機能する転写開始調節領域と 、この開始調節領域の転写調節下の異種遺伝子と、前記宿主細胞内で機能する転 写終結調節領域とを含むＤＮＡ構築体、並びに前記構築体を含む宿主細胞を選択 するために前記宿主細胞中で発現できる標識遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換 し、前記標識遺伝子によって前記構築体を含む細胞を選択し、 前記宿主細胞を増殖させて前記遺伝子を発現させ、前記ペプチドを産生する ことからなる方法。
2. ２．前記アオパンカビがＮ．ｃｒａｓｓａである請求項１に記載の方法。
3. ３．前記形質転換を、前記宿主細胞のスフェロプラストによるＤＮＡ取り込みに よって行う請求項１に記載の方法。
4. ４．前記転写開始調節領域が前記アオパンカビ宿主細胞にとって外因性のもので ある請求項１に記載の方法。
5. ５．前記転写開始調節領域がＢ−チューブリン又はｇｒｇ−１遺伝子の調節領域 である請求項４に記載の方法。
6. ６．前記異種遺伝子がキモシンをコードする請求項１に記載の方法。
7. ７．前記構築体が更に、読み取り枠内で前記遺伝子の読み取り枠に接している分 泌用配列をコードするシグナル配列をも含んでいる請求項１に記載の方法。
8. ８．アオパンカビ菌類に対して異種のペプチドを産生する方法であって、 コンピテントＮ．ｏｒａｓｓａ宿主細胞を、該宿主内で機能する転写開始調節領 域と、この開始調節領域の転写調節下でシグナル配列の無いペプチドを発現する 異種遺伝子に読み取り枠内で接する分泌用シグナル配列を含む読み取り枠と、前 記宿主細胞内で機能する転写終結調節領域とを含むＤＮＡ構築体、並びに前記構 築体を含む宿主細胞を選択するために前記宿主細胞内で発現できる標識遺伝子を 含むＤＮＡ配列で形質転換し、 前記標識遺伝子によって前記構築体を含む細胞を選択し、 前記宿主細胞を増殖させて前記遺伝子を発現させ、前記ペプチドを産生する ことからなる方法。
9. ９．前記シグナル配列及び前記異種遺伝子が同一遺伝子に由来するものである請 求項８に記載の方法。
10. １０．前記開始調節領域がＢ−チューブリン又はｇｒｇ−１アオパンカビ遺伝子 に由来するものである請求項８に記載の方法。
11. １１．前記読み取り枠がキモシンをコードする請求項８に記載の方法。
12. １２．アオパンカビＢ−チューブリンもしくはｇｒｇ−１転写開始調節領域と、 この開始調節領域の転写調節下にありアオパンカビに対して異種である遺伝子と を含むＤＮＡ構築体。
13. １３．前記遺伝子がキモシンである請求項１２に記載のＤＮＡ構築体。
14. １４．ＤＮＡ構築体とＤＮＡ配列とを含むアオパンカビ細胞であって、前記ＤＮ Ａ構築体が、当該細胞内で機能する転写開始調節領域と、この転写開始調節領域 の転写調節下の異種遺伝子と、当該細胞内で機能する転写終結調節領域とを含ん でおり、前記ＤＮＡ配列が、当該細胞中で発現できる標識遺伝子を含んでいるア オパンカビ細胞。
15. １５．前記異種遺伝子がキモシンをコードする請求項１４に記載のアオパンカビ 細胞。
16. １６．前記開始調節領域がアオパンカビＢ−チューブリン又はｇｒｇ−１転写開 始調節領域である請求項１４に記載のアオパンカビ細胞。
17. １７．前記異種遺伝子の転写と、その結果得られたＲＮＡの翻訳との結果として 、異種タンパク質を産生する請求項１４に記載のアオパンカビ細胞。
18. １８．前記異種タンパク質がキモシンである請求項１７に記載のアオパンカビ細 胞。