JPH10509317A

JPH10509317A - アスペルギルス中の融合体から得られるプロセッシングされた組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片

Info

Publication number: JPH10509317A
Application number: JP8515400A
Authority: JP
Inventors: コネリー，オーラ・エム; ヘドン，デニス・アール; オマリー，バート・ダブリュー
Original assignee: Agennix Inc
Current assignee: Agennix Inc
Priority date: 1994-11-02
Filing date: 1995-11-01
Publication date: 1998-09-14
Also published as: CA2204246A1; US5571697A; US5955316A; DE871724T1; EP0871724A4; CN1171815A; EP0871724A1; KR970707283A; KR100443307B1; AU4279896A; CN1230537C; ES2127164T1; US6080559A; WO1996014413A1; MX9703244A

Abstract

(57)【要約】本発明は新規プラスミド構築物と組合わせて宿主細胞アスペルギルス菌を使用するラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の製法を提供する。特に本発明はアスペルギルス宿主細胞中でラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片を生産することができる新規ベクター構築物を提供する。さらに本発明はアスペルギルス、特にアスペルギルス・アワモリ、ニガーおよびオリゼの宿主細胞とともに使用するために適切な組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の多量生産を可能にする新規プラスミド構築物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アスペルギルス中の融合体から得られるプロセッシングされた組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片この発明はナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスからＨＤ２７９６５号の下に与えられた政府援助の下に行われた。政府は本発明についてある種の権利を保有する。関連出願この出願は１９８９年５月５日に出願されて既に放棄された米国特許出願第０７／３４８２７０号の継続出願である、１９９２年１０月２７日に出願された米国特許出願第０７／９６７９４７号の部分継続出願である、１９９３年１０月２８日に出願された同時係属米国特許出願第０８／１４５６８１号の部分継続出願である。米国特許出願第０８／１４５６８１号はまた１９９２年４月２４日に出願されて既に放棄された米国特許出願第０７／８７３３０４号の部分継続出願である、１９９４年５月２７日に出願された米国特許出願第０８／２５０３０８号の継続出願でもある。前記すべての特許出願について記載内容、殊に図面および実施例、を参照して本明細書中に参考のために引用する。発明の分野本発明は一般的に鉄結合性糖蛋白質および関連ポリペプチド、すなわちラクトフェリンの分野に関する。殊に、本発明はアスペルギルス属菌、特にアスペルギルス・アワモリ、ニガーおよびオリゼにおける種々のラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の組換え生産に関する。背景に関する開示同時係属米国特許出願第０８／１４５６８１号ではヒトのラクトフェリンに対するｃＤＮＡ配列を開示した。これに加えて、同じ同時係属出願米国特許出願第０８／１４５６８１号ではヒトのラクトフェリンに対するｃＤＮＡ配列を、たとえばサッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニデュランスおよびアスペルギルス・オリゼのような種々の糸状菌を含む様々な各種生物中でヒト型ラクトフェリンを生産するために使用している。先行技術の開示ラクトフェリン（ＬＦ）は乳汁その他の分泌物および体液中に見出される鉄結合性糖蛋白質である。ＬＦは哺乳類における鉄の結合および放出に関わる構成員である。ＬＦは最初はミルク中に発見されたが、初乳に７ｇ／リットルまでのレベルで分泌されることがある。最初の発見以来、ＬＦはヒトその他の哺乳類の分泌液中に検出されている。これらの液には涙液、唾液および粘膜分泌物を含み、多形核白血球の二次顆粒中にも見出されている。ＬＦは７８キロダルトン（ｋＤａ）の糖蛋白質であって、アミノ酸配列および第三次元構造の両レベルにおいてＣ端の一半とＮ端の一半との間に明らかに高度な相同性のある双ローブ性構造を持つ。これらローブはおのおの高度な親和性で可逆的に第二鉄１個を結合できるが、同時に重炭酸イオンの結合も伴う。ラクトフェリンの生物学的機能には病原微生物に対する静菌的および殺菌的効果、鉄の輸送、細胞増殖の促進、免疫細胞機能および炎症性応答の調節、および骨髄形成の調節を包含する。脱グリコシル化された蛋白質は在来型ＬＦの全生物学的機能を保持していることが発見されている。ラクトフェリンからの殺菌ドメインは範囲の広い抗微生物作用スペクトルを示す。Ｂｅｌｌａｍｙ，Ｗ．Ｍ．など、Ｊ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔ．、７３巻：４７２〜４７９頁（１９９２年）。Ｂｅｌｌａｍｙらはペプシン消化によって牛乳から分離したウシのラクトフェリンを商業的な量でこのウシのポリペプチドが提供できると報告したが、両研究に使用した材料の最高純度は９５％であった。Ｂｅｌｌａｍｙなどはヒトまたはウシ型合成ラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドの大規模な生産に関する情報を提示しなかった。Ｂｅｌｌａｍｙなどは酵素消化によって入手できないペプチドを生産する性能を提供する方法も記載していない。細胞外糖蛋白質の工業的生産においては宿主として糸状菌が使用されている。ある種の工業的菌株は複数の蛋白質をグラム単位で分泌することができる。これに加えて、糸状菌は真核生物蛋白質の翻訳後修飾を正確に実行することができ、多数の蛋白質が米国食品医薬品庁の認可を得ている。さらにその上、大規模発酵技術および下流部門での処理の経験は入手できる。しかしながら、ラクトフェリンがある種の糸状菌に対して毒性があるとの報告があり（Ｖａｌｅｎｔｉなど、ＦＥＭＳ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、３３巻：２７１〜２７５頁（１９８６年）；Ｅｐｓｔｅｉｎなど、Ｒｅｖｉｅｗｓ・ｏｆ・Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ・Ｄｉｓｅａｓｅｓ、６巻：９６〜１０６頁（１９８４年）；Ｓｏｕｋｋａなど、ＦＥＭＳ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、９０巻：２２３〜２２８頁（１９９２年））、その結果、ラクトフェリンの生産については特に、研究者達は真菌を普遍的には使用しなかった。糸状菌、特にアスペルギルス属菌、中でのラクトフェリンの生産は本発明者が初めて報告した［以下全て参考のために引用するＷａｒｄなど、Ｇｅｎｅ、１２２巻：２１９〜２２３頁（１９９２年）；Ｗａｒｄなど、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７８４〜７８９頁（１９９２年）；Ｃｏｎｎｅｅｌｙなど、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・ｏｆ・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ・Ｈｕｍａｎ・Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ、ＰＣＴ／ＵＳ９３／２２３４８；優先日１９９２年４月２４日、公表日１９９３年１１月１１日の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３６１４；Ｃｏｎｎｅｅｌｙなど、１９９２年４月２４日に出願して放棄済の米国特許出願第０７／８７３３０４号の継続出願である、１９９４年５月２７日に出願した米国特許出願第０８／２５０３０８号］。しかしながら、これらの製法が明らかな躍進である一方、これらには商業的に多量のラクトフェリンを効率的に生産する性能に限界があった。現在、ラクトフェリンポリペプチド生産法に加え、ヒト、ウシまたはブタ、いずれの型のＬＦであれ、さらに効率的で経済的なＬＦ生産法が求められている。その結果、ヒトのラクトフェリン生産のため、栄養的および治療的利用のため、および作用機序の研究進展のため、効率的商業的製法の開発も求められている。本発明はアスペルギルス属宿主細胞を新規ベクター構築物とともに使用するラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の製造法、特に組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の商業的多量生産を可能にするアスペルギルス宿主細胞中でのラクトフェリン生産法を提供することによって、この要求を満たすものである。発明の要約本発明は新規プラスミド構築物と組合わせて宿主細胞アスペルギルス菌を使用するラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の製法を提供する。特に本発明はアスペルギルス宿主細胞中でラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片を生産することができる新規ベクター構築物を提供する。さらに本発明はアスペルギルス、特にアスペルギルス・アワモリ、ニガーおよびオリゼの宿主細胞とともに使用するために適切な組換えラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の多量生産を可能にする新規プラスミド構築物を提供する。本発明はまたラクトフェリンおよびラクトフェリンポリペプチド断片の生産を可能にする新規発現プラスミドベクター構築物を提供する。このプラスミドベクター構築物はかかる高レベルのラクトフェリン生産を提供する重要な成分２種を含有する。プロモーター、目的蛋白質をコードするｃＤＮＡ、シグナル配列、転写終結配列および選択マーカーに加え、このプラスミドベクター構築物は（ａ）高度に発現される内因性遺伝子の５’−一半であって、その生産物をアスペルギルス細胞が分泌するものおよび（ｂ）リンカー配列であって、そのリンカー配列に対して内因性プロテイン分解的酵素が存在するものを追加的に包含する。この新規プラスミドベクター構築物の生産物は高度に発現される遺伝子の一半がラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチド断片に融合してなる融合蛋白質である。この融合蛋白質は後に、好ましくはＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な、内因性蛋白質分解酵素によってプロセッシングされる。例えば、もしＡ．アワモリからのグルコアミラーゼプロモーターを使用すれば、このベクターはＡ．アワモリのグリコアミラーゼ遺伝子の５’−一半も含有することになる。生産されるラクトフェリンはグルコアミラーゼ遺伝子の一半に融合しており、そこでＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な内因性のＡ．アワモリ蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされることになる。別の一例としては、もしもＡ．ニガーからのグルコアミラーゼプロモーターを使用すれば、このベクターはＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子の５’−一半を含有することになる。次にこのベクター構築物によって生産される融合体（グルコアミラーゼ遺伝子の一半に融合したＬＦ）はＡ．ニガーのＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な内因性蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされて所期のラクトフェリン蛋白質またはＬＦポリペプチド断片を放出することとなる。また、もしＡ．オリゼ細胞を使用すれば、このベクター構築物はＡ．オリゼα−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターおよびＡ．オリゼα−アミラーゼ遺伝子の一部分を包含する。このベクターを使用してＡ．オリゼ細胞を形質転換すると、この融合体（α−アミラーゼ遺伝子の一半に融合したＬＦ）はＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的なＡ．オリゼの内因性蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされて、所期のＬＦまたはＬＦポリペプチド断片を得ることになる。かくして、本発明はアスペルギルス属のいずれかの株においてＬＦまたはＬＦポリペプチド断片を商業的に多量生産するための新規ベクタープラスミド構築物を提供する。本発明の別の一態様は５’から３’までに作動可能に結合して発現プラスミドベクターを形成する以下の成分を包含する：（ａ）プロモーター、（ｂ）シグナル配列、（ｃ）その生成物がアスペルギルス細胞から分泌される高度に発現される内因性遺伝子（すなわちグルコアミラーゼ遺伝子）の５’−部分、（ｄ）リンカー配列、および（ｅ）所期のラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチド断片に対応するヌクレオチド配列。前記（ａ）から（ｅ）までのＤＮＡ配列を次に共クローニングしてプラスミドを構成する。得られる発現プラスミドを用いてアスペルギルス細胞を形質転換すれば、その細胞は、例えばグルコアミラーゼ遺伝子など、発現の高度な内因性遺伝子の一半に融合したラクトフェリン蛋白質またはラクトフェリンポリペプチド断片（発現プラスミドに挿入したラクトフェリンヌクレオチド配列に対応するもの）を発現することとなろう。ＬＦまたはＬＦポリペプチド断片は内因性のＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされる。ここに請求する発明の別の一態様は組換えプラスミドを含有する形質転換したアスペルギルス糸状菌細胞を培養することからなるラクトフェリン生産法であって、そのプラスミドはラクトフェリン蛋白質またはラクトフェリンポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むものであり、その形質転換したアスペルギルス糸状菌細胞をラクトフェリン蛋白質が融合体として形成され、次にＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な内因性蛋白質分解的酵素によりプロセッシングされるまで適切な栄養培地中で培養するものであり、そのプロセッシングされたラクトフェリンが栄養培地中に分泌されるものであり、およびそのラクトフェリンを分離するか、栄養培地から回収するものである。本発明はさらに前記プラスミドベクターがさらに、プロモーター、シグナル配列、グルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分、リンカー配列、転写終結配列および選択マーカー遺伝子を含むものとして定義される。この発明の目的には「リンカー配列」と「プロテアーゼ認識配列」とは互換的に使用される。この発現ベクターはさらに、プロモーターがアルコール脱水素酵素、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびｂｅｎＡから構成される群の遺伝子から選択されるプロモーターであるとして、また、そのプロモーターがさらにＡ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであるとして定義される。前記製法はさらに、そのプロモーターがグルコアミラーゼ遺伝子からのものであり、そのプロモーターがＡ．アワモリからのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであり、およびそのシグナル配列がＡ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであるとして定義される。この製法はさらに前記シグナル配列がさらにＡ．アワモリからのグルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分を含むものとして定義される。前記製法はさらに、そのプロモーターがグルコアミラーゼ遺伝子から誘導されるものであり、そのプロモーターがＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであり、およびそのシグナル配列がＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであるとして定義できる。この製法はさらに前記シグナル配列がさらにＡ．ニガーからのグルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分を含むものとして定義される。前記製法はなおさらに、このプロモーターがα−アミラーゼ遺伝子からのものであり、そのプロモーターがＡ．オリゼのα−アミラーゼ遺伝子からのものであり、およびシグナル配列に対応するｃＤＮＡ配列がＡ．オリゼのα−アミラーゼ遺伝子からのものであるとして定義される。この製法はさらに前記シグナル配列がさらにＡ．オリゼからのα−アミラーゼ遺伝子の５’−部分を含むものであるとして定義される。前記製法はさらにそのリンカー配列がペプチダーゼ認識配列であるとして定義される。この発明はさらにリンカー配列がＫｅｘ２ペプチダーゼ認識配列をコードするものとして定義される。この発明の目的では、Ｋｅｘ２ペプチダーゼ認識配列およびＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位は同じである。前記製法はさらに転写終結配列がアルファーアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコール脱水素酵素およびｂｅｎＡから構成される群の遺伝子から選択されるものとして定義される。この発明はさらにその転写終結配列がグルコアミラーゼ遺伝子からのものであり、その転写終結配列がＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からのものであるとして定義される。前記製法はさらにその選択マーカー遺伝子がｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣおよびフレオマイシン耐性遺伝子から構成される群の遺伝子から選択されるものであるとして定義される。この製法はさらに選択マーカーがフレオマイシン耐性遺伝子からのものであるとして定義される。この発明はさらにラクトフェリン蛋白質またはラクトフェリンポリペプチド断片がヒト、ブタまたはウシのラクトフェリン蛋白質であると定義される。本発明はさらに、いずれかのラクトフェリン生成物が脱グリコシル化されているものとして定義される。本発明の別の一態様は本質的にヒト型ラクトフェリンのアミノ酸をコードするＤＮＡから構成されるプラスミドおよびその細胞中でＤＮＡを発現するためのプラスミドベクターであって、そのプラスミドはアスペルギルス・アワモリ糸状菌細胞中でヒト型ラクトフェリンのＤＮＡを発現するために使用するものである。特定的に好適なプラスミドはＡＴＣＣ受託番号７４２９０の特性を持ち、Ａｗａ・ＬＦ２４−１と命名されたものであって、このＡｗａ・ＬＦ２４−１はここに参考のために引用する米国特許出願第０８／１４５６８１号の配列番号１に記載したヒトのラクトフェリンをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドｐＰＬＦ−１９で形質転換したアスペルギルス・アワモリのものであると定義される。この発明の他の態様は前記プラスミドを含有するアスペルギルス・アワモリ糸状菌細胞である。本発明の特定態様の別のものは組換えプラスミドを含有する形質転換したアスペルギルス・アワモリ、ニガーおよびオリゼの糸状菌細胞を培養することを含む製法であって、そのプラスミドが（ａ）Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのプロモーター、（ｂ）Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのシグナル配列、（ｃ）例えばＡ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子など、発現の高度な内因性遺伝子の５’−部分、（ｄ）Ｋｅｘ２ペプチダーゼ切断部位をコードするリンカー配列、（ｅ）ヒトのラクトフェリンのアミノ酸をコードするＤＮＡ、（ｆ）Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結配列、および（ｇ）フレオマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターを含むものであり、その形質転換したアスペルギルス・アワモリ、ニガーおよびオリゼの糸状菌細胞を適切な栄養培地中でラクトフェリン蛋白質が融合体として形成されて次にＫｅｘ２ペプチダーゼ切断部位に特異的な内因性蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされるまで培養するものであり、そのラクトフェリン蛋白質がヒト型ＬＦのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの生成物であり、およびラクトフェリンが栄養培地に分泌され、そこから分離されるものである。この発明の目的では、「Ｋｅｘ２ペプチダーゼ切断部位」および「Ｋｅｘ２ペプチダーゼ認識部位」は互換的に使用される。この発明の別の態様は組換えプラスミドベクターを含有する形質転換したアスペルギルス糸状菌細胞を培養することを含む糸状菌栄養培地からラクトフェリンを分離する方法であって、そのプラスミドベクターはプロモーター、シグナル配列、グルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分、リンカー配列、ヒト型ラクトフェリンのアミノ酸をコードするＤＮＡ、転写終結配列、および選択マーカー遺伝子を含むものであり、またその形質転換したアスペルギルス糸状菌細胞を適当な栄養培地中でラクトフェリン蛋白質が融合蛋白質として形成されて次に内因性蛋白質分解的酵素によってプロセッシングされるまで培養するものであり、またラクトフェリンが栄養培地中に分泌され、そこから分離されるものである。前記の糸状菌栄養培地からのラクトフェリン分離法はさらに、そのプラスミドベクターがＡ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのプロモーター、Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのシグナル配列、Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分、Ｋｅｘ２ペプチダーゼ切断部位をコードするリンカー配列、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結配列およびフレオマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含むものであるとして定義される。この発明の別の態様は５’から３’に向けて作動可能に下記の成分を含む新規な組換え発現プラスミドベクターである。１）Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのプロモーター、２）Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子からのシグナル配列、３）Ａ．アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分、４）Ｋｅｘ２ペプチダーゼ切断部位をコードするリンカー配列、５）ヒトのラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチド断片のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、６）Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子からの転写終結配列、および７）フレオマイシン耐性選択マーカー遺伝子。本発明はまたヒト、ウシまたはブタ型ラクトフェリンおよびその置換類縁体またはアレル変異体に対するｃＤＮＡの完全配列および部分配列の製法も包含し、それらのｃＤＮＡはラクトフェリンの一部分と相同性を持つ生物学的活性のあるポリペプチド、特に天然ラクトフェリンの酵素消化からは入手できないもの、をコードするｃＤＮＡであり、これには部分的ｃＤＮＡ配列の使用および発現によるポリペプチドの製造法、およびこの発明の方法により生産されたポリペプチド生成物も包含する。所期の部分配列は、例えば図１３、１４および１５に指摘した切断部位における、制限酵素切断によって生産できる。図１３から図１５はおのおのヒト、ウシおよびブタのＬＦに対するｃＤＮＡは配列の制限酵素切断部位を示す。ＰＣＲ増幅によって、切断、連結および合成の組合せによって、またはこの分野における熟練者に知られている他の方法によって、得られる部分配列も合成しうる。現在までにブタのラクトフェリン（Ｌｙｄｏｎ，Ｊ．Ｐ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ａｃｔａ、１１３２巻：９７〜９９頁（１９９２年）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｊ．など、Ａｎｉｍａｌ・Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２３巻：２５１〜２５６頁（１９９２年））およびウシのラクトフェリン（Ｍｅａｄ，Ｐ．Ｅ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８巻：７１６７頁（１９９０年）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ａ．など、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９６巻：１７７〜１８４頁（１９９１年））に対するｃＤＮＡ配列は既に決定されており、文献に報告されている。ウシおよびブタのラクトフェリンに対するｃＤＮＡ配列を記載するこれらの文献は本明細書中に参考のためにここに引用する。ラクトフェリンから誘導されるポリペプチドの断片が生物学的に活性であることも知られており、本発明の方法によって製造しうる。ｈＬＦの殺菌ドメインを含むヒトラクトフェリンのＮ−末端断片が無傷なｈＬＦのペプシン消化物から分離された。Ｂｅｌｌａｍｙ，Ｗ．Ｍ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡＣＴＡ、１１２１巻：１３０〜１３６頁（１９９２年）。合成的な２３および２５アミノ酸ポリペプチドが合成されて、ペプシン消化に由来する断片と類似の活性を持つことが発見された。合成の詳細、収率、および合成ペプチドの純度は報告されていない。Ｂｅｌｌａｍｙなどは天然産物からの分離に由来する夾雑物不含のウシまたはヒトのラクトフェリンポリペプチドを大量に製造する実際的な経路は提示していない。これらのポリペプチド断片は本発明の方法によって製造でき、その好適な態様を構成する。以下の開示におけるアミノ酸配列および対応するｃＤＮＡ配列は本明細書中に参考のために引用する。（ａ）Ｐｏｗｅｌｌなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８（１３）巻：４０１３頁（１９９０年；哺乳類）、（ｂ）Ｒｅｙなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８（１７）巻：５２８８頁（１９９０年；哺乳類）、（ｃ）Ｒａｄｏなど、Ｂｌｏｏｄ、７０（４）巻：９８９〜９９３頁（１９８７年；好中球）、（ｄ）Ｓｔｏｗｅｌｌなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７６（４）巻：３４９〜３５５頁（１９９１年）、（ｅ）Ｐａｎｅｌｌａなど、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻：３０３７〜３０４３頁（１９９１年；哺乳類）、および（ｆ）Ｊｏｈｎｓｔｏｎなど、Ｂｌｏｏｄ、７９（１１）巻：２９９８〜３００６頁（１９９２年；白血病）、これらの配列またはこれらの配列の修飾型は本発明の方法に使用してもよく、また、好適な配列は本発明者がＧｅｎＢａｎｋに報告した受理番号Ａ３１０００のポリペプチド配列を持つものであるが、これらはいずれも参考のためにここに引用する。図面の簡単な説明本発明の前記特性、進歩、目的その他の様式が明瞭となり、達成され、詳細に理解されるように、前記概略を本発明のさらに特定的態様を参照するため添付の図面に記載する。これらの図面は本明細書の一部を構成するものである。しかしながら、添付図面は本発明の好適な態様を図示するものであるからその範囲を限定するものと理解すべきでないことを指摘しておく。本発明にはその他の等しく効果的で均等な態様がある。図１は「ｐＰＬＦ−１９」と命名したｈＬＦ・ｃＤＮＡを含むアスペルギルス・アワモリ中での発現のためのプラスミドベクターの構築を示す。この図で使用する略号は次の通り：Ａｐｒ：アンピシリン耐性、ｈＬＦ：ヒトのラクトフェリン、ＧＡ：グルコアミラーゼ、ｐＧＡ：グルコアミラーゼからのプロモーター、ＧＡ−３’ＵＴＲ：グルコアミラーゼ・３’−非翻訳領域、ｓ．ｓ．：シグナル配列、ｐｈｌｅｏ・ｒ：フレオマイシン耐性遺伝子。実施例４はこのベクターの構築を詳記する。図２はｐＰＬＦ−１９を含有するアスペルギルス・アワモリ形質転換体の増殖培地から精製した組換えｈＬＦ（５００ｎｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図３はｐＰＬＦ−１９を含有するアスペルギルス・アワモリ形質転換体の増殖培地から精製したグリコシル化（１μｇ）および脱グリコシル化（１μｇ）組換えｈＬＦのウエスタンブロットである。図４はアスペルギルス・アワモリ中で組換え技術的に生産したｈＬＦのＮ−端１０アミノ酸配列の決定結果を示す。図５は標準および組換えｈＬＦでの鉄結合および飽和実験の結果を示す。図６は標準および組換えｈＬＦについて、鉄結合のｐＨ安定性比較実験の結果を示す。図７は大腸菌０１１１株に対する天然および組換えｈＬＦの抗菌作用を示す。図８は赤痢菌に対する天然および組換えｈＬＦの抗菌作用に関する研究から得られた結果を示す。図９は赤痢菌に対する天然および組換えｈＬＦの抗菌作用の時間−殺菌相関の研究結果を示す。図１０−Ａおよび図１０−Ｂは普遍的なアスペルギルス・アワモリ発現シャトルベクター、ｐＰＬＦ−２６の設計、中間体、および構築を略記する。これらの図は制限部位の全部を示すものではない。図１１はクローニングのために独特なＮｏｔ１およびＥｃｏＲＩ部位を包含する普遍的なシャトルベクター、ｐＰＬＦ−２６の詳細を提示する。図１２は独特なＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位の存在およびプラスミドの方向を確認するための様々な制限酵素によるｐＰＬＦ−２６およびｐＰＬＦ−１９の消化実験の結果を示す。図１３はヒトＬＦ・ｃＤＮＡ配列における制限酵素切断部位を示す。図１４はウシＬＦ・ｃＤＮＡ配列における制限酵素切断部位を示す。図１５はブタＬＦ・ｃＤＮＡ配列における制限酵素切断部位を示す。図１６ＡはＡ．オリゼ中に生産された組換えｈＬＦのウエスタン免疫ブロット分析を示す。図１６Ｂは図１６Ａと同じ試料の銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。図１６ＣはＡ．オリゼ中に生産された組換えｈＬＦのＮ−末端アミノ酸配列を示す。本発明の詳細な記載定義本出願の目的で本発明の理解を促進するために以下の用語を定義する。用語「トランスフェリン族」は血清トランスフェリン、オボトランスフェリンおよびラクトフェリンを包含する鉄結合蛋白質の一族を意味する。これら蛋白質には全て構造的な関連がある。用語「ラクトフェリン」は乳汁その他の分泌物に見出されるトランスフェリン族の一員を意味する。ラクトフェリンは７８ＫＤの鉄結合性蛋白質である。これに加えて、用語「ドメイン」はこの分子のエレメントの全体または一部を含み、たとえば鉄結合性、殺菌性、受容体結合性、免疫刺激性などのような特定の機能を発揮する、ラクトフェリン蛋白質またはラクトフェリンポリペプチドの機能的な断片を定義するために使用する。用語「ポリペプチド」または「複数のポリペプチド」は小さなペプチドまたはポリペプチドを形成する、相互に結合した複数のアミノ酸を意味する。用語「置換類縁体」または「アレル変異」または「アレル変異体」は全てラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドのアミノ酸１個またはそれ以上を決定するコドン１個またはそれ以上が異なるＤＮＡ配列であるが同一のアミノ酸配列を決定する別のコドンに置換されたＤＮＡ配列を示す。「置換類縁体」または「アレル変異体」が蛋白質またはポリペプチドを示す時にはヒトおよびその他の哺乳類の蛋白質におけるアレル変異に見出されることが知られているように、その蛋白質の生物学的活性が維持されるアミノ酸少数、一般的には５個またはそれ以下、の置換を意味する。文献記載にされた数種のｈＬＦ・ｃＤＮＡの配列において、おそらくアレル変異に起因すると推測すべきアミノ酸置換が報告されている。図１６およびこの図に関連する検討を参照。用語「ベクター」はプラスミド、コスミド、ファージ、その他ラクトフェリンｃＤＮＡの挿入、増殖および発現を可能にする伝達体のいずれかを意味する。用語「宿主」はラクトフェリンの発現を可能にする細胞いずれかを意味する。用語「プロモーター」はラクトフェリンｃＤＮＡの転写を制御する調節ＤＮＡ配列を意味する。用語「多重クローニングカセット」は種々のｃＤＮＡの挿入を可能にする種々の酵素に対する独特な制限酵素切断部位を包含するＤＮＡ断片を意味する。用語「形質転換」は細胞による異種ＤＮＡ配列の発現を可能にする挿入を意味する。用語「鉄結合能」はＦｅを結合する性能を意味する。完全に機能的な、ヒトのラクトフェリンはＬＦ一分子当り鉄２原子を結合できる。用語「生物学的活性または生物学的に活性」は、鉄と結合し、または微生物を殺し、または微生物の増殖を遅延させ、または鉄輸送蛋白質として機能し、または特定の受容体に結合して免疫応答を刺激するか骨髄形成を調節する、各性能によって測定したラクトフェリンの機能的な作用を意味する。本発明で有用な「プロモーター」はラクトフェリンｃＤＮＡの転写の調節を可能にするものいずれであってもよい。好ましくは、このプロモーターは、アルコール脱水素酵素、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの遺伝子の群から選択する。なお、この技術分野における熟練者には種々の異なる「プロモーター」が知られているが、本発明者にはＡ．アワモリから分離したグルコアミラーゼのプロモーターを使用することが望ましいと思われる。この技術分野における熟練者には多数の異なる「シグナル伝達配列およびこれらのシグナル配列源」が知られているが、本発明者にはグルコアミラーゼのシグナル配列プラスＡ．アワモリから誘導したグルコアミラーゼ遺伝子の５’−部分を使用することが望ましいと思われる。本方法に有用な「シグナル配列」は翻訳開始コドン、分泌シグナルおよび高度に発現される内因性遺伝子のいずれかに対するコード領域の部分を包含するものいずれでもよい。本方法に有用な「リンカー配列」は蛋白質分解的酵素のいずれかに対する認識配列、好ましくはＫｅｘ２ペプチダーゼ認識配列、を含有する本方法に有用な「転写終結配列」はラクトフェリンｍＲＮＡ転写の安定化と正確な終結を可能にするいかなるものでもよい。好ましくは、この転写終結配列は α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコール脱水素酵素またはｂｅｎＡの遺伝子から誘導する。なお、この技術分野における熟練者には多数の異なる「転写終結配列」が知られているが、本発明者にはＡ．ニガーからのグルコアミラーゼ遺伝子からの３’−非翻訳領域を使用することが望ましいと思われる。本発明の方法に有用な「選択マーカー」遺伝子はラクトフェリンｃＤＮＡプラスミドで形質転換した細胞の分離を可能にするいかなるものでもよい。好ましくはこの選択マーカー遺伝子は、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐｃ、ａｍｄＳまたはフレオマイシン耐性の遺伝子から選択される。なお、この技術分野における熟練者には多数の異なる「選択マーカー」が知られているが、本発明者にはフレオマイシン耐性遺伝子を使用することが望ましいと思われる。これに加えて、ラクトフェリン蛋白質の組換え生産を好適な態様で上述した。ＬＦはアスペルギルス、サッカロミセス・セレビシアエ、クルイベロミセス・ラクチス、またはピチア・パストルシスのような細胞；ＳＦ９のような昆虫細胞；およびＣｏｓ細胞のような哺乳類細胞；など多数の材料から生産できる。これらの細胞は、好ましくは真核生物細胞であるが、本発明に有用であって、好ましくはラクトフェリンｃＤＮＡを含み、ラクトフェリンｃＤＮＡを発現するベクターの導入が可能ないずれのものでもよい。好ましくは、この真核生物細胞は糸状菌細胞または昆虫細胞である。ＳＦ９のような昆虫細胞は本発明の方法に有用である。さらに好ましくは、この細胞はアスペルギルス真菌の細胞である。もっとも好ましくは本発明に有用なこの真核生物細胞は、たとえばＡ．オリゼ、Ａ．ニガー、Ａ．ニデュランスおよびＡ．アワモリのようなアスペルギルス属株である。ｈＬＦをコードするｃＤＮＡ配列および演繹したアミノ酸の確認は多重な確認手段で証明された。これらは：１．多重配列分析、２．抗−ｈＬＦ抗体を使用するポジティブアイデンティフィケーションによるｃＤＮＡからのｈＬＦ蛋白質の転写および翻訳である。ｈＬＦをコードするｃＤＮＡ配列は組換えヒト型ラクトフェリンを調製するため使用でき、治療的および栄養的利用のための蛋白質源を入手可能にする。この確認されたｃＤＮＡ配列は適当なクローニング伝達体中でそのｃＤＮＡ配列を複製するために使用できる。また、このｃＤＮＡはヒト型ラクトフェリンを生産するためにベクター系に導入できる。その他のラクトフェリンＤＮＡ配列もウシ、ブタ、ウマまたはその他のラクトフェリンを提供するためにヒト型ラクトフェリンｃＤＮＡ配列と交換できる。部分的ｃＤＮＡ配列も所期のラクトフェリン誘導ポリペプチドを得るための採用できる。本発明の発現系は天然起源ラクトフェリンの酵素消化では入手不能なラクトフェリン誘導ポリペプチドを提供するために使用できる。本発明はさらにアスペルギルス細胞中でラクトフェリンおよびラクトフェリン関連ポリペプチドを生産するための発現系を提供する。本発明は乳汁またはその他の天然起源から分離したラクトフェリンの夾雑物であるラクトペルオキシダーゼ、リゾチーム、その他の蛋白質不含のラクトフェリンの生産を可能にする。この発明はヒトｃＤＮＡ配列の特定的使用または適当なＤＮＡ配列からの他種のラクトフェリンの生産のいずれにも限定されるものではない。組換え技術により誘導されたプロテインである組換えＬＦは様々な応用に使用できる。ヒトの遺伝子は牛その他の農業的に重要な動物のような哺乳類系に転移させ、乳汁中に発現できる。ラクトフェリン遺伝子の導入および動物の乳汁中への発現で、子豚に典型的な鉄欠乏症を処置できる。発現を伴うラクトフェリン遺伝子の導入は細菌およびウイルス感染症に対する動物の疾患抵抗性を改善する筈である。例えば、ヒト型ラクトフェリンの乳腺中での組織特異的な発現は発現される遺伝子の殺菌的および殺ウイルス的な利益を授乳期の給餌に与え、また治療目的のためのこの分泌プロテイン生産の手段を提供する。本発明の組換え法により生産されたＬＦはヒトまたは動物の食料を含む様々な生産物中で、鉄輸送および分配を強化するためおよび殺ウイルス的および殺菌的性質のための治療的添加物として、および点眼液、コンタクトレンズその他の眼保護液剤、局所的皮膚保護製品、点耳剤、口腔洗浄剤、チューインガムおよび歯磨への添加剤として、使用できる。組換えＬＦは安全で局所的に適用でき、ならびに安全に摂取される天然起源生産物を提供することとなる。この殺菌的ラクトフェリンポリペプチドは前記生産物中の保存剤および治療的抗感染症剤として有用である。この鉄結合ポリペプチドは栄養的および治療的使用のための鉄またはその他の金属イオン輸送蛋白質として、および静菌剤および殺菌剤として、特に前記の型の生産物に、有用である。各蛋白質はまた栄養添加剤としておよびアミノ酸および金属の源泉として有用である思われる。組換えヒト型ラクトフェリンを生産するために使用したプラスミド発現ベクターの種々の成分を以下に提示するが、どの形も本発明の限定を意味するものではない。この分野の熟練者には多数の種々の「プロモーター」が知られているが、本発明者にはＡ．アワモリから分離したグルコアミラーゼのプロモーターを使用するのが望ましいと思われる。この分野の熟練者には多数の種々の「シグナル配列およびこれらのシグナル配列の源泉」が知られているが、本発明者にはグルコアミラーゼのシグナル配列プラスＡ．アワモリから誘導したグルコアミラーゼの５’−部分を使用するのが望ましいと思われる。この分野の熟練者には多数の様々な「リンカー配列」が知られているが、本発明者にはＫｅｘ２ペプチダーゼの切断部位をコードする合成リンカーを使用するのが望ましいと思われる。この分野の熟練者には多数の種々の「転写終結配列」が知られているが、本発明者にはＡ．ニガーからのグルコアミラーゼ遺伝子からの３’−非翻訳領域を使用するのが望ましいと思われる。この分野の熟練者には多数の種々の「選択マーカー」が知られているが、本発明者にはフレオマイシン耐性遺伝子を使用するのが望ましいと思われる。この分野における通常の熟練者は本発明によって生産されるラクトフェリンの量および質に影響せずに様々な各種のパラメーターを修正できることを理解し、認識するものである。以下に、変更はできるが、生産されるラクトフェリンの量および質に影響のないパラメーターを列挙する：温度、ｐＨ、必要な栄養、規模拡大の考慮、使用する装置の型、使用する酸素／空気の比率、撹拌対静置系の使用、収集時期、その他。アスペルギルス・アワモリ中での組換えヒト型ラクトフェリンの発現には各種の増殖および生産条件を使用できる。以下の記載はアスペルギルス・アワモリ中でのｈＬＦの発現に使用できる例示の目的で種々な条件を示すが、いかなる形でも本発明の限定を意味するものではない。以下に発酵生産工程および生産されたラクトフェリンを回収するために使用する工程の一般的な概略を提示する。この分野の熟練者はラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドの生産を増強するためにプロトコールを微妙に変更し、修正できることを理解し、認識するものである。以下に本発明の様々な態様を例示する目的で実施例を記載するが、いかなる形でも本発明の限定を意味するものではない。実施例１アスペルギルス・アワモリにおける組換えヒトラクトフェリンの発現のための発現ベクターpＰＬＦ−１９の構築この実施例では、アスペルギルス・アワモリにおいて、組換えヒトラクトフェリンを発現させるのに使用する発現ベクターの構築を示す。Ｉ．株、プラスミド、酵素および培地Ａ．細菌および真菌の株アスペルギルス・アワモリ株（ＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号）をヒトラクトフェリンの異種発現の宿主株として使用した。大腸菌ＤＨ５α株をヒトラクトフェリン発現ベクター、pＰＬＦ−１９の構築に使用した。Ｂ．プラスミドプラスミドpＵＣ１９およびpＧＥＭ４（プロメガ（Ｐromega）、マディソン（Ｍadison）、ウィスコンシン）を様々なクローニング工程において使用し、最終的にヒトラクトフェリン発現プラスミド、pＰＬＦ−１９を構築した。フレオマイシン（phleomycin）耐性ベクター、pＬＯ−３は、酵母シトクロムＣ１ターミネーターに結合したフレオマイシン耐性遺伝子（ストレプトアロティカス・ヒンダスタヌス（Ｓtreptoalloteichus hindustanus）からのフレオマイシン結合タンパク質遺伝子）を含み、プラスミドpＵＴ７１３（ＣＡＹＬＡ、トゥロウズ−セデックス（Ｔoulose−Ｃedex）、フランス）由来のものであった。それはアスペルギルス・ニゲル（Ａ．niger）からのβ−チューブリンプロモーターによって真菌中で発現する。Ｃ．酵素制限酵素をニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs）（ビバリー（Ｂeverly）、マサチューセッツ）から入手した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩからのＴ４リガーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ４キナーゼおよびクレノウフラグメントをベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories）（ＢＲＬ、ゲイザーズバーグ（Ｇaithersburg）、メリーランド）から購入した。ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍung Ｂean Ｎuclease）をストラタジーン（Ｓtratagene）（ラ・ホラ（Ｌa Ｊolla）、カリフォルニア）から入手した。Ｔaqポリメラーゼをプロメガ社（マディソン、ウィスコンシン）から入手した。プラスミド構築物のＤＮＡシークエンシングをシークエナーゼ・バージョン・２.０（Ｓequenase Ｖersion ２.０）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ酵素およびキット（ユナイテッド・ステイテッド・バイオケミカルズ（Ｕnited Ｓtate d Ｂiochemicals）、クリーブランド（Ｃleaveland）、オハイオ）を用いて達成した。ノボザイム（Ｎovozym）２３４、スフェロプラストにする（spheroplasti ng）酵素をノボ・バイオラブズ（Ｎovo ＢioＬabs）（バグスバード（Ｂagsvaer d）、デンマーク）から購入した。Ｄ．一般的な増殖培地大腸菌株をＬ−ブロス（ディフコ（Ｄifco）、デトロイト、ミシガン）中で増殖させた。細菌の形質転換体を１.５％アガーおよび１２５ug／ml アンピシリンを含むＬ−ブロスプレート上で増殖させた。液体中でのアスペルギルス・アワモリの増殖のための完全培地（ＣＭ）は：５０ml ２０×クラッターバック塩（Ｃlutterbuck's salts）（１２０g Ｎa₂ＮＯ₃、１０.４g ＫＣl、１０.４g Ｍg ＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ、３０.４g ＫＨ₂ＰＯ₄）、２.０mlＶogel's Ｔrace Ｅlements（蒸留水１l中、０.３Ｍクエン酸、０.２ＭＺnＳＯ₄、２５mＭＦe［ＮＨ₄］₂［ＳＯ₄］₂６Ｈ₂Ｏ、１０mＭＣuＳＯ₄、３mＭＳＯ₄ ^-3、８mＭホウ酸、２mＭＮ a₂ＭoＯ₄・２Ｈ₂Ｏ）、５.０g トリプトン、５.０g 酵母エキス、１０g グルコース）よりなる。１.５％アガーをＣＭスラント（slant）に添加した。ＰＤＡスラントは３９.０ｇ／Ｌ水に溶かしたポテトデキストロースアガー（ディフコ、デトロイト、ミシガン）、１０.０g／Ｌグルコース、１０.０g／Ｌアガー、０.１g／ＬＭgＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ、０.１２g／ＬＫＨ₂ＰＯ₄、０.２５g／Ｌ（ＮＨ₄ ）₂ＨＰＯ₄を含んだ。アスペルギルス・アワモリラクトフェリン産生形質転換体をＫＴ−４培地で増殖させた：１５０g／Ｌマルトース、６０g／Ｌソイファイン・ソイミルク・ＬＦ（Ｓoyfine soymilk ＬＦ）、７９.８g／ＬＣ₆Ｈ₅Ｏ₇Ｎa₃・２Ｈ₂Ｏ、１５g ／Ｌ［ＮＨ₄］₂ＳＯ₄、１.０g／ＬＮa₂ＰＯ₄、２.０５g／ＬＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１.０ml Ｔween ８０、２.０ml／Ｌ消泡剤２０４；ダン−コールマン（Ｄunn-Ｃoleman）ら、１９９１、Ｂio／technology ９：９７６−９８１。Ｅ．ＡＴＣＣ細胞の寄託以下の形質転換した株を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection、１２３０１パークローン・ドライブ（Ｐarklawn Ｄrive）、ロックビル（Ｒockville）、メリーランド、２０８５２）に、１９９４年７月８日に出願人が寄託した：「Ａwa ＬＦ２４−１」は、ヒトラクトフェリンをコードするcＤＮＡを含む発現プラスミドpＰＬＦ−１９で形質転換したアスペルギルス・アワモリである。この寄託には、ＡＴＣＣ受託番号第７４２９０号が付与された。さらに、出願人は信頼できる第三者が米国において本件出願からの特許の付与と同時に制限ましに本寄託を利用可能とすること、および本件出願からの発行特許の請求の範囲によって規定された出願人の権利に固執する第三者に関するものを除いて、制限なく現行法およびその規約に従うことに同意している。 II．方法Ａ．ヒトラクトフェリン発現プラスミドの構築以下のプラスミドを最終発現プラスミド、pＰＬＦ−１９の先祖として構築した。図１にpＰＬＦ−１９の構造の図を示す。この図において使用する略語は、以下のとおりである：Ａpr：アンピシリン耐性；hＬＦ：ヒトラクトフェリン；ＧＡ：グルコアミラーゼ；pＧＡ：グルコアミラーゼからのプロモーター；ＧＡ３'ＵＴＲ：グルコアミラーゼ３'非翻訳領域；ｓ.ｓ.：シグナル配列；phleo r ：フレオマイシン耐性ベクター。 p ＰＬＦ−１ hＬＦ cＤＮＡを２.３kb ＳacＩ／ＨindIII断片としてpＧＥＭ４hＬＦcから除去し、ベクターpＵＣ−１９にサブクローニングした。このサブクローニングにより、望ましくないＮgoＭＩ部位を含むpＧＥＭ４骨格からcＤＮＡを除去した。 p ＰＬＦ−２ hＬＦの５'端を修飾して、グルコアミラーゼ（ＧＡ）プロモーターおよびシグナル配列の継ぎ目のない添加に使用することができる、単独のＮgoＭＩ部位を導入した。成熟ラクトフェリンコーディング配列の５'端と単独のＡccＩ部位に及ぶ２７０bp断片のＰＣＲ増幅によって修飾した。以下にプライマーを列挙し、それぞれ配列番号：１および２に示す。２７０bpの断片をプロメガのＴaq ポリメラーゼを使用して以下の条件で増幅する：１.２５〜５mＭＭgＣｌ₂；各０.５μＭのプライマー(５hＬＦＦＷおよび５hＬＦＲＶ)；鋳型としての１０ng pＧＥＭ４hＬＦc。パーキン・エルマー９６００サーモサイクラー（Ｐerkin Ｅlmer ９６００Ｔhermocycler）にて循環した：９６℃ ２分を１回；９６℃ ２０秒／５５℃ ２０秒／７２℃ ２０秒を３０回；７２℃ ５分で１回。断片をアガロースから単離し、酵素により平滑末端化し、リン酸化し、ＳmaＩで切断したpＵＣ１９にサブクローニングして、プラスミドpＰＵＣ２７０を得た。増幅産物の配列をＭ１３普遍的順方向および逆方向プライマーを使用して確認した。ついで、その断片をＫpnＩＡccＩ断片としてpＰＵＣ２７０から除去し、pＰＬＦ−１のＫpn／ＡccＩ断片と取り換えるのに使用した。得たプラスミドをpＰＬＦ−２と称した。 p ＰＬＦ−６ hＬＦの終わりの１７bpおよびＧＡ３'非翻訳領域（ＵＴＲ）の１６０bpを有する２８０bpのＥcoＲＩ／ＰstＩ断片をベクターpＡhＬＦＧ（＋１）からＥcoＲＩ／ＰstＩ切断pＵＣ１９にサブクローニングした。 p ＰＬＦ−７ pＰＬＦ−２の修飾したhＬＦ遺伝子をＥcoＲＩ断片としてベクターpＰＬＦ− ６にサブクローニングした。正確に方向づけられたプラスミド（pＰＬＦ−７）は成熟hＬＦ配列の全長を、すぐ上流に単独のＮgoＭＩ部位、すぐ下流に１６０b p ＧＡ３'ＵＴＲと共に含む。ＧＡプロモーターおよびシグナル配列（以下を参照）はこのベクターに添加される。ＧＡプロモーターおよびシグナル配列をアスペルギルス・アワモリ株ＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により得た。その順方向プライマーはＧＡシグナル配列の約１.１kb上流のＳacＩ部位に及ぶ。このプライマーの配列は、ＡＴＣＣ受託番号第１０８６４号（ジーンバンク（ＧenＢank）受託番号第Ｘ５６４４２号）の公開された配列から設計し、それぞれ配列番号：３および４に示す。逆方向プライマーはhＬＦへの接着にＮgoＭＩ部位を包含する。正確な大きさの断片（１.１kb）をＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号ゲノムＤＮＡから以下の条件を用いて増幅した：２.５mＭＭgＣl₂：各０.５μＭのプライマー(ＧＡＦＷおよびＧＡＲＶ)および１００ng ゲノムＤＮＡ。循環パラメーターを、９５℃ ２分を１回；９５℃ ３０秒／６０℃ ３０秒／７２℃ ４５秒を３０回；７２℃ ５分を１回に設定した。増幅した産物を平滑末端化し、リン酸化し、ついでＳmaＩで切断したpＵＣ− １９にサブクローニングした。ＤＮＡ配列を増幅した断片の３'端から産生し、ＧＡシグナル配列領域に及ぶ増幅の忠実度をチェックした。確認した配列を有するクローンをＧＡプロモーターおよびｓ.ｓ.断片の保存源として使用した。 p ＰＬＦ−９ＰＣＲ増幅したＧＡプロモーターおよびシグナル配列をＳacＩ／ＮgoＭＩ断片としてベクターpＰＬＦ−７にライゲーションしてベクターpＰＬＦ−９を得た。一方向での連結により産生した配列は完全なライゲーションであることを確認した。 p ＰＬＦ−１８最終的なＧＡ発現プラスミドはＧＡプロモーター、シグナル配列およびhＬＦに融合したプロ−グルコアミラーゼの４９８アミノ酸をコードする配列を含む。二塩基性ＫＥＸ−２認識配列Ｌys−Ａrgに終わるグルコアミラーゼのプロ−ヘキサペプチドをＧＡおよびhＬＦ配列の間に入れた。多分、そのキメラタンパク質をhＬＦの一層高い分泌力価となる内在性のＧＡ分泌経路によって一層よく認識されるだろう。ＫＥＸ−２リンカーはＧＡ不在でhＬＦの正確なプロセッシングを可能にすべきである。 pＰＬＦ９を最初にＮgoＭＩで切断した。その末端をクレノウフラグメントを用いてｄＣＴＰで充填した。ついでムング・ビーン・ヌクレアーゼを使用して、残存５'突出部分を除去し、インフレームタンパク質融合のために準備した平滑末端を得た。ついでそのベクターをＮsiＩで切断し、以下に記載するようにＰＣＲ増幅したＧＡ配列を受け入れた。目的のＧＡ断片をコードする断片をＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号の株から以下のプライマーのセット（それぞれ配列番号：５、６および７に示す）を用いてＰＣＲ増幅した。この順方向プライマーは公開されたＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号（ＮＲＲＬ受託番号第３１１２号）のＧＡ上流の配列の１−１８塩基（ナンバーグ（Ｎun berg）ら、Ｍol Ｃell Ｂio １９８４，２３０６−２３１５頁）に及ぶ。この配列は構築に使用した単独のＮstＩ部位の約５０bp上流に存在する。この逆方向プライマーは、挿入したプロ−ヘキサペプチド（下線）コーディング配列に相補的であり、４９２−４９８をコードするプロ−ＧＡ配列補足物が続く。２.０kbの断片をＴaqポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。２.５mＭＭgＣl₂ を経験的に決定して最良の増幅を得た。断片を酵素によりクレノウで平滑末端化して、増幅から潜在的にでこぼこな残余末端をきれいにした。ついで平滑末端化した断片をＮsiＩで切断し、ついでＮsiＩ／平滑断片として操作したベクター pＰＬＦ−９（上記参照）にサブクローニングして、プラスミドpＰＬＦ−１８を得た。配列をジ−デオキシシークエンシングによりＧＡ／ＫＥＸ−２／hＬＦ連結で確認した。 p ＰＬＦ−１９ＣＡＹＬＡベクターpＵＴ７１３（ストレプトアロティカス・ヒンダスタヌス ble 遺伝子）由来およびアスペルギルス・ニゲルチューベリンプロモーター（p ＰＬＯ−３）から発現したフレノマイシン耐性マーカーを２.３kb ＨindIII断片としてpＰＬＦ−１８に添加して、最終的な発現プラスミドpＰＬＦ−１９を得た。Ｂ．ＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号のアスペルギルス・アワモリ株のＤＮＡ形質転換ＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号のアスペルギルス・アワモリ株をスフェロプラストにし、ティルバーン（Ｔilburn）ら、１９８３、Ｇene ２６：２０５−２２１の手法を改良することによって形質転換した。完全培地（ＣＭ）スラント上で３０℃、４〜７日間増殖したＡＴＣＣ受託番号第２２３４２号のアスペルギルス・アワモリ株の分生胞子化した培養（conidating culture）を２mlのＮＰ４０水（０.００５％Ｎonidet−４０）でこすり取り、胞子懸濁液を得た。１mlの胞子懸濁液（約１×１０⁸胞子）を５０mlのＣＭに添加し、３０℃で２２時間、２００rpmで増殖させた。菌糸体をチーズクロス（cheesecloth）の２層を通して濾過により収集し、５mg／mlのＮovozym ２３４（ノボ・バイオラブズ、バグスバード、デンマーク）を含む５０mlのＫＣＭバッファー（キャントラル（Cantoral ）ら、１９８７、Ｂiotechnology ５：４９４−４９７；ＫＣＭ：０.７ＭＫＣl 、１０mＭＭＯＰＳ、pＨ５.８）を添加し、ついで３０℃で一夜、９０rpmでインキュベートしてスフェロプラストを産生させた。スフェロプラストをミラクロス（miracloth）（カルバイオケム（Ｃalbiochem ）；ラ・ホラ、カリフォルニア）を詰め、チーズクロスで覆ったロートを通して、４つの１５mlのコニカル遠心チューブに濾過して回収し、ついでベンチ−トップ（bench-top）遠心で１０分間１８００rpmで回転させた。そのペレットを総量１５mlのＫＣＭバッファーに穏やかに再懸濁し、ついで再度遠心した。そのペレットを再度１５mlのＫＣＭフバッファーで洗浄し、ついでＫＣＭＣバッファー（ＫＣＭ＋５０mＭＣaＣl₂）に再懸濁して最終密度５×１０⁷細胞／mlとした。２０μl ＴＥバッファー（１０mＭトリス−ＨＣl、１mＭＥＤＴＡ、pＨ８. ０）中５ug pＰＬＦ１９プラスミドＤＮＡを２００μlのスフェロプラストに添加し、５０μlのＰＣＭ（キャントラルら；ＰＣＭ：４０％ＰＥＧ８０００、１０mＭＭＯＰＳ、pＨ５.８、５０mＭＣaＣｌ₂［ＣaＣl₂は使用前に添加した］）をＤＮＡ−スフェロプラスト混合物に穏やかにピペッティングして氷上で３０分間インキュベートした。１mlの新鮮に調製したＰＣＭを形質転換混合物に添加し、その混合物を５０ml 再分化アガー（ＣＭ＋１.３Ｍマンニトール、３％アガー）にピペッティングし５枚のペトリ皿に分割して５０℃に冷却した。スフェロプラストを、等量のＯＬ＋１２０ug／mlのフレオマイシン（ＯＬ：１％ペプトン、１％アガー；フレオマイシン［ＣＡＹＬＡ；トゥロウズ、フランス］）で覆う前に３０℃で３〜５時間再分化させた。推定形質転換体を１２５−１５０ug／mlのフレオマイシンを含むＰＤＡスラントにトランスファーした。Ｃ．アスペルギルス・アワモリにおけるヒトラクトフェリンの発酵条件推定のＨＬＦ−産生形質転換体からの胞子を選択的ＰＤＡスラントからＣＭスラントへトランスファーし、ついで３０℃で４日間増殖させた。分生胞子を１. ５mlのＮＰ４０水でスラントをこすり取ることによって回収し、１×１０⁸胞子アリコートを２５０mlフラスコ中の３０ml ＫＴ−４培地に添加した。培養物を３０℃で６日間２００rpmで発酵させた。ラクトフェリンサンプルを発酵ブロス１mlを３０００rpmで１５分間遠心することによって回収し、保有上清をアッセイする。Ｄ．ヒトラクトフェリンアッセイラクトフェリンをビルジャ（Ｖilja）ら、１９８５、Ｊ．of Ｉmm．Ｍethods ７６：７３−８３によって発展された非競合アビジン−ビオチンイムノアッセイの修飾によって定量した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｕ底マイクロテストIII；バクスター（Ｂaxter）、シカゴ、イリノイ）をコーティングバッファー（０.１Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、pＨ９.６）中、０.１μg ／mlウサギ抗血清ラクトフェリン抗体（シグマ、（Ｓigma）、セントルイス、モミズーリ）の１００μlでコートし、４℃で一夜振盪した。その翌日、コーティング溶液を除去し、ついでそのプレートを３度洗浄バッファー（１×ＰＢＳ pＨ７.４、０.５％Ｔween２０）で洗浄し、その後希釈バッファー２５０μlの（１×ＰＢＳ pＨ７.４、１％ＢＳＡ×Ｆraction Ｖ、ＲＩＡグレード、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ］、０.０５％Ｔween２０）で室温で少なくとも１時間ブロッキングした。希釈バッファーを捨て、１００μlの希釈した発酵サンプルおよび公知のラクトフェリン標準を皿に添加し、ついで３７℃で１時間インキュベーションした。発酵サンプルから回収した上清を１：１０００で希釈バッファーにて希釈し、その後マイクロタイタープレートに添加した。ラクトフェリン標準はヒトラクトフェリン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）からなり、希釈バッファー中で１〜１０００ng ／mlに希釈した。３７℃での反応の後、サンプルを捨てて、皿を３度洗浄バッファーで洗浄した。１mg／mlのストックから希釈バッファー中で１：７５００に希釈した１００ul のビオチン化抗ＨＬＦ抗体（ビオチン−ＳＰ−ウサギ−抗−hＬＦＩgＧ、ジャクソンイムノ−リサーチ・ラブズ（Ｊackson Ｉmmuno-Ｒesearch Ｌabs）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。溶液を捨てて、その皿を３度洗浄バッファーで洗浄し、１００μlのＡＢＣ剤( ベクタスティン（Ｖectastain）ＡＢＣキット、ベクターラブズ(Ｖector Ｌabs) 、バーリンゲイム(Ｂurlingame)、ＧＡ)を添加し、ついで３７℃で１時間プレートをインキュベートした。ベクタステイン剤Ａを１：２００に希釈し、Ｂ剤を希釈バッファー中で１：４００に希釈して、ブロス溶液を合わせ、ついで使用前に室温で１時間前もってインキュベートした。ＡＢＣ溶液を捨て、そのプレートを５回洗浄バッファーで洗浄した。１００ul のＯＰＤ基質溶液（１０ml基質バッファー［２５mＭクエン酸、５０mＭＮa₂ＨＰＯ₄７Ｈ₂Ｏ、pＨ５.０］、８mg ｏ−フェニレンジアミン［ベセスダ・リサーチ・ラブズ、ゲイザーズバーグ、メリーランド］、１００μl ３０％Ｈ₂Ｏ₂［シグマ、セントルイス、ミズーリ］を添加し、ついでそのプレートを暗所で、室温で穏やかに撹拌しながら２０分間インキュベートした。発色後、１００ulの２ＭＨ₂ＳＯ₄を添加して反応を停止した。ついでそのプレートを４９０nmにて解読し、公知の標準と比較することによりラクトフェリンの濃度を決定した。実施例２アスペルギルス・アワモリにおけるhＬＦ（pＰＬＦ−１９）の発現およびプロセッシングヒトラクトフェリン発現カセットpＰＬＦ−１９をアスペルギルス・アワモリ２２３４２号に形質転換した場合に、分泌ラクトフェリンをＥＬＩＳＡアッセイおよびウエスタンブロット解析の両者によって培地中で検出した。１つの形質転換体、＃１９−２５４は約２５０mg／lのヒトラクトフェリン（hＬＦ）を産生した。より好ましい形質転換体であるＡwa ＬＦ２４−１（ＡＴＣＣ受託番号第７４２９０号；＃１９−２４.１）は約５００mg／lのヒトラクトフェリンを産生する。収量および株の増殖を改良する実験は、アスペルギルス・アワモリ中の組換えhＬＦの産生を増加するために行われる。現在まで、本発明はＡwa ＬＨ２４ −１株を含むアスペルギルス・アワモリ形質転換体中で産生される９００mg／ｌ hＬＦを超える力価を得た。その結果を以下の比較産生表に示す。 pＰＬＦ−１９発現産物が、グルコアミラーゼの４９８アミノ酸およびＫＥＸ −２分解切断部位により分離されたhＬＦの完全なコーディング領域からなるキメラタンパク質であるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および銀染色法、ウエスタンブロット解析およびＮ−末端シークエンシングを行って、そのタンパク質が正確にプロセッシングされたかどうかを決定した。Ａ．アスペルギルス・アワモリ形質転換体から精製された組換えヒトラクトフェリンの銀染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析組換えヒトラクトフェリンをＣＭ−セファデックスＣ５０（ＣＭ−Ｓephadex Ｃ５０）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ストウェル（Ｓtowell，Ｋ. Ｍ.）ら、Ｂiochem Ｊ.、２７６：３４９−３５５）によってアスペルギルス・アワモリの増殖培地から精製した。標準ヒト胸乳ＬＦ（human breast milk ＬＦ）(Ｓtd hＬＦ)および精製した組換えhＬＦ（Ｒec ＬＦ）を７.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよび銀染色法で解析した。この分析結果を図２に示す。組換えhＬＦタンパク質はプロセッシングしたhＬＦ（レーン２）の期待された大きさで移動し、標準hＬＦ（レーン１）の大きさと同一である。分子量マーカーの位置は左に示す。Ｂ．アスペルギルス・アワモリ形質転換体から精製されたグリコシル化および脱グリコシル化された組換えヒトラクトフェリンのウエスタンブロット分析アスペルギルス・アワモリ形質転換体の増殖培地から精製した組換えヒトラクトフェリン、Ｎ−グリコシダーゼＦで処理したものおよび非処理のものをＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、ニトロセルロースにトランスファーし、ついでヒトラクトフェリン（シグマ）に直接対する特異的なＩｇＧを用いてプローブとした。この分析結果を図３に示す。非処理組換えｈＬＦと非処理標準胸乳hＬＦの比較は、これら両者タンパク質は共に移動することを示す（それぞれ図３レーン３および１）。Ｎ−グリコシダーゼＦは一層小さな分子量の炭水化物遊離ペプチドを産生するグリコシラミン結合を加水分解する酵素である。Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した後の組換えhＬＦと標準hＬＦとの比較は両タンパク質は同様に移動することを示し、それによって両タンパク質は同様に炭水化物にＮ−結合することを示唆する（それぞれ図３、レーン４および２）。実施例３Ｎ末端配列分析により、アスペルギルス・アワモリにおいて組換えヒトラクトフェリンが正しくプロセッシングされていることを確認するアスペルギルス・アワモリにおいて産生された組換えhＬＦが正しくプロセッシングされていることを確認するために、組換えにより産生されたhＬＦのＮ末端部分を配列決定した。まず最初に、アスペルギルス・アワモリにおいて、組換えhＬＦを、アスペルギルス・ニゲルのグルコアミラーゼの触媒ドメイン(４９８ＡＡ)への融合タンパク質として発現させるが、これは、ＫＥＸ−２タンパク質分解切断部位をコードする合成リンカーにより分離される。次に、ＣＭ−セファデックスＣ５０を用いて、組換えhＬＦを増殖培地から精製した(Ｓtowellら、Ｂ iochem Ｊ、２７６；３４９−５９（１９９１）により、以前に記載されている) 。組換えhＬＦがそのＮ末端で正しくプロセッシングされているかどうかを測定するために、自動化エドマン分解法を利用して、精製されたタンパク質の最初の１０個のＮ末端アミノ酸を配列決定した(５ug)。この分析の結果を第４図に概説する。組換えタンパク質の配列は、ヒト胸乳ラクトフェクチン中の対応するアミノ酸と同一である。従って、組換えhＬＦは、アスペルギウス・アワモリにおけるＫＥＸ−２タンパク質分解切断部位で正しくプロセッシングされている。実施例４ Aspergillus awamori において産生したヒトラクトフェリンの機能分析Ａ.標準及び組み換えｈＬＦの鉄結合及び飽和ラクトフェリンは、ラクトフェリン１モル当たりに鉄２モルを結合する能力を有する鉄結合性糖タンパクである。組み換えラクトフェリンによる鉄の結合が飽和的なものであるかどうかを調べるために、鉄結合アッセイを行った。アポ−ラクトフェリンを得るために、精製ＲｅｃｈＬＦと人乳を０.１Ｍクエン酸（pＨ２.０）に対して透析し、次いでＨ₂Ｏに対して充分に透析した。溶液のpＨを５m Ｍリン酸ナトリウムを用いてpＨ７.６にゆっくりと上げた。ＦeＣl₃：⁵⁹ＦeＣl₃ ：ＮＴＡ（４００：１：８）の濃度を増加させたもの（０.５〜４.０モル過剰））を、結合緩衝液（０.０２５Ｍトリス、pＨ７.８；０.０１Ｍ炭酸水素ナトリウム；０.１ＭＮaＣl）１ｍL中のｈＬＦ（５００μg）に加えた。試料を室温で３０分間インキュベーションした。結合緩衝液１５ｍLで平衡化したＮＡＰ− １０カラムに通すことにより、鉄が結合したｈＬＦを、結合しなかった鉄とＮＴＡとから分離した。ＬＦに結合した鉄の量をリキッドシンチレーション計測を用いて測定した。この分析の結果を第５図にまとめた。組み換え及び標準ｈＬＦは、同じ様に鉄に結合する。この鉄の結合は用量依存性である。さらに標準及び組み換えｈＬＦによる鉄の結合はどちらも、鉄のラクトフェリンに対する比率が２：１モルで飽和する。典型的には、飽和レベルは９２.５％の最大結合に達する。これは、始めの７.５％の鉄が透析後も依然としてラクトフェリンに結合していることを示すものである。本発明においては、“標準ｈＬＦ”又は“組み換えｈＬＦ”は、人乳から単離したヒトラクトフェリンであって、シグマ社から購入したものである。Ｂ.標準及び組み換えｈＬＦに対する鉄結合のpＨ安定性標準及び組み換えｈＬＦに対する鉄結合のpＨ安定性を測定するために、⁵⁹Ｆe で飽和した標準及び組み換えｈＬＦ（５００μｇ）を，pＨ７.０〜pＨ２.０の範囲の緩衝液に対して、４℃で４８時間透析して、結合しなかった鉄を除去した（ Stowell，Biochem J，276；349〜59（1991））。透析後の、ｈＬＦ試料に結合した鉄をリキッドシンチレーション計測を用いて測定した。この分析の結果を第６図に示した。標準及び組み換えｈＬＦからの鉄のpＨ依存性の放出については、両者は同じである。標準及び組み換えｈＬＦは両者ともpＨ７〜４の範囲にわたっては鉄の大部分を保持しており、pＨ２.０では本質的に鉄を含まない。Ｃ.Ｅ.coli 0111に対する天然及び組み換えｈＬＦの抗菌作用Ｅ.coli 0111に対する天然（標準）及び組み換えｈＬＦ双方の抗菌活性を、イン・ビトロマイクロ滴定プレートアッセイ（Nonnecker及びSmith.，J.Dairy Sci ，67；606〜613（1984））を用いて測定した。簡潔に説明すれば、対数増殖期の細胞（１×１０⁶ＣＦＵ／ｍL）の標準接種量を、１％ Basal Bactopeptone培地（１００μl）中、Ａpo−Ｓtd又はＡpo−Ｒec ｈＬＦの濃度を増加させ又は増加させないでインキュベートした。試料を３７℃／２００ＲＰＭで４時間培養した。計測のために、一部を取り、連続希釈をして、MacConkey寒天プレート上で一晩平面培養をした。この分析の結果を第７図に示した。試験したすべての濃度において、天然及び組み換えｈＬＦは、Ｅ.coli 0111に対し、同様の抗菌作用を示した。Ｄ.Shigella flexneriに対する天然及び組み換えｈＬＦの抗菌作用天然（標準）及び組み換えｈＬＦ双方のＳ.flexneriに対する抗菌作用を実施例４（Ｃ）に記載したように測定した。この分析の結果を第８図に示した。天然及び組み換えｈＬＦは両者とも、試験したすべての濃度において、同様なＳ.fle xneriの用量依存性の阻害を示した。Ｅ.Shigella flexneriに対する天然及び組み換えｈＬＦの抗菌作用（死滅時間試験）天然及び組み換えｈＬＦの抗菌活性の時間経過を調べた。簡潔に説明すれば、対数増殖期（１×１０⁶ＣＦＵ／ｍL）のＳ.flexneri細胞の標準接種量を、１％B asal Bactopeptone培地（１００μl）中、Ａｐｏ−Ｓｔｄ又はＡｐｏ−ＲｅｃｈＬＦ（３００μg）の非存在下又は存在下でインキュベートした。試料を３７℃ ／２００ＲＰＭで培養した。計測のために、種々の時間間隔（０、１、４及び２０時間）をおいて一部を取り、連続希釈をして、MacConkey寒天プレート上で一晩平面培養をした。この分析の結果を第９図に示す。組み換え天然及び組み換えｈＬＦはＳ.flexneriに対して時間依存的に同様の抗菌作用を示し、４時間後には生存するＳ.flexneriＣＦＵは検出されなかった。実施例５ｃＤＮＡのフレーム内サブクローニングできるユニバーサルシャトルベクターｐＰＬＦ−２６の構築本実施例では、Aspergillus種においてｈＬＦ変異体を発現することが可能なヒトラクトフェリンシャトルベクターの設計と構築を記載する。ベクターへのラクトフェリンの改変体のクローニングを容易にするために、ユニークなＮotＩ及びＥcoＲＩ部位を作成した。タンパク質は、グルコアミラーゼ：ｈＬＦキメラのようなグルコアミラーゼプロモーターとシグナル配列の指令の下に発現し、そのキメラはＫＥＸ−２開裂部位の認識によってイン・ビボでプロセシングされる。双方のベクターは、ｍＲＮＡ安定性を増強するためのグルコアミラーゼ３'非翻訳領域とAspergillusにおける選択のためのフレオマイシン耐性遺伝子も含んでいる。Ｉ.ヒトラクトフェリン発現ベクター構築Ａ.ｐＰＬＦ−２６の構築ラクトフェリンの変異体を受容可能な発現ベクターを作成するために、幾つかの制限部位を、ユニークなクローニング部位を許容するように改変した。ラクトフェリンの変異体をプラスミドへ置換するために、ｈＬＦ遺伝子の５'末端でＮＯＴＩ部位の付加を設計した。ｈＬＦ遺伝子の３'末端でのユニークなクローニング部位としてＥcoＲＩ部位を選択した；そしてこの部位をユニークなにするために他の存在するＥcoＲＩ部位を除去する必要がある。ｐＰＬＦ−２６は、ユニークなクローニング部位に加えて、Aspergillus awam oriグルコアミラーゼ（ＧＡ）プロモーター、シグナル配列、及びＫＥＸ−２認識部位によりｈＬＦから分離されるグルコアミラーゼタンパクの４９８アミノ酸を含む。このベクターはAspergillus niger ＧＡ３'非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びＡ.nigerベーターチューブリンプロモーターによって発現されるStreptoallot etchus hindustanus（ＣＡＹＬＡベクターｐＵＴ７１３）由来のフレオマイシン耐性遺伝子も含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択と複製のために、このプラスミドはＣolＥＩ複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。ｈＬＦ発現ベクターｐＰＬＦ−２６の構築を、第１０−Ａ図及び第１０−Ｂ図に概説し、中間体の構築についての記載は以下に示す通りである。ｐＰＬＦ１８Ｓp.Ａlt プロモーター、シグナル配列及びＫＥＸ−２認識部位によってｈＬＦから分離されたグルコアミラーゼの部分的なタンパク配列を含むプラスミドｐＰＬＦ−１８を、所望の部位修飾のための出発プラスミドとして選択した。ｐＰＬＦ−１８をＳｐｈＩで消化して２つのフラグメントに分離した；ｈＬＦを含む３.３ｋbのフラグメントをイン・ビトロ突然変異誘発ベクターｐＡＬＴＥＲに正しい方向にサブクローンしてｐＰＬＦ１８Ｓp.Ａltを得た。ｐＲ１８.２ｐＰＬＦ−１８から４.４ｋｂのＳｐｈフラグメントを除去してｐＲ１８.２を得た。ｐＮot.９ＫＥＸ−２開裂部位とｈＬＦ開始部位にまたがるＮotＩ制限部位を、ベクターｐＰＬＦ１８Ｓp.Ａltのイン・ビトロ突然変異誘発によって作成した。ＮotＩ部位は、ヌクレオチド“Ｔ”をヌクレオチド“Ｃ”に変えたものであるが、イン− フレームであり、いずれのアミノ酸も変化しない。（配列番号Ｎo.８に示した）以下の２１マーのオリゴヌクレオチドを突然変異誘発に使用した。小文字は塩基の変化を意味する。オリゴＨＬＦＮotＩ：変異誘発性オリゴＨＬＦＮotＩをアンピシリン修復オリゴ（Promega）と一緒に使用して、１本鎖のｐＰＬＦ１８Ｓp.Ａlt ＤＮＡにアニーリングし、次いで、これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してフィルイン（ fill in）させた。修復不能株ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔ及びＪＭ１０９を形質転換すると、選択された形質転換体の５０％が新しいＮotＩ部位を含んでおり、その１つをｐＮot.９と命名した。ｐ△Ｅ１２プラスミドｐＲ１８.２をＥcoＲＩで消化し、２つのフラグメントをゲル電気泳動により単離した。双方のフラグメンをそれぞれクレノウ（Klenow）でフィルインさせ、大きい方の３.６ｋｂのフラグメントをウシ胎児腸管フォスファターゼ（ＣＩＰ）により５０℃で１時間脱リン酸化した。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、フィルインした両フラグメントを、互いにブラントライゲートした。形質転換の前にライゲーション混合物をＥcoＲＩで消化してＥcoＲＩ部位を依然として含んでいるベクターをすべて直線化した。１６個の内３個のクローンは、依然としてＥcoＲＩ部位を含んでいるいずれのベクターをも直線化する両方のＥcoＲＩを有していた。１６の内の３つのクローンは両方のフィルインされたＥ coＲＩ部位を有しており、正しい方向であった。これらの内の１つをｐ△Ｅ１２と命名した。ｐＰＬＦ−２５ｐ△Ｅ１２をＳｐｈＩで消化し、ＣＩＰで脱リン酸化した。新しいＮotＩ部位を含んでいる３.３ｋｂのＳｐｈＩフラグメントをｐＮot.９から単離しｐ△Ｅ１２／Ｓｐｈにライゲートした。正しい方向性のＳｐｈＩフラグメント有するクローンをｐＰＬＦ−２５と命名した。これはユニークなＥcoＲＩとＮotＩ部位の両方及び、ＧＡプロモーターによって発現するグルコアミラーゼ配列と融合したｈＬＦを含んでいる。ｐＬＯ３△ＲＩ Aspergillusにおける選択に有用なｐＰＬＦ−２５を作成するために、フレオマイシン耐性カセットを加えた。カセットの前に、除去する必要のある２つのＥ coＲＩ部位を含んでいるプラスミドｐＬＯ３中のカセットを加えることができる。プラスミドｐＬＯ３をＥcoＲＩで消化し、４.３及び０.９ｋｂのフラグメントを単離し、それぞれクレノウでフィルインさせた。フィルイン反応の後、４.３ｋｂのフラグメントをＣＩＰで処理し、次いで精製して沈殿させた。両フィルインしたフラグメントを、お互いに一晩ライゲートさせた。細菌の形質転換の後に選択したコロニーは、２４個の内５個がフィルインしたＥcoＲＩ部位を有し、正しい方向性であったことが示された。これをｐＬＯ３△ＲＩと命名した。ｐＰＬＦ−２６Ｂ−チューブリンプロモーターによって転写されるフレオマイシン耐性遺伝子を含んでいるｐＬＯ３△ＲＩ由来の２.３ｋｂのＨind IIIフラグメントを、Ｈin d IIIで消化したｐＰＬＦ−２５にライゲートし、ＣＩＰで脱リン酸化した。１６個の内９個のクローンは、両方向にＨind IIIフラグメントを有していた。このプラスミドを“ｐＰＬＦ−２６”と命名した。これはｈＬＦ遺伝子と同じ方向に転写されるフレオマイシン耐性遺伝子を有している。第１１図は、クローニングのためのユニークＮotＩとＥcoＲＩ部位を含んでいるユニバーサルシャトルベクターｐＰＬＦ−２６を詳細に記載したものである。グルコアミラーゼ（ＧＡ）プロモーター領域に先在するＥcoＲＩ部位をフィルインによって除去した。ベクターは、ＧＡ非翻訳領域、Ｋｅｘ−２開裂部位、及びＡ.awamoriにおける選択のためのフレオマイシン耐性も含んでいる。既知の制限部位のすべてをこの図に示したことに注意。第１２図は、ユニークＮotＩ及びＥcoＲＩ部位の存在とプラスミドの方向性を確認するための、種々の制限酵素によるｐＰＬＦ−２６及びｐＰＬＦ−１９の消化から得られた結果を示すものである。ｐＰＬＦ−２６又はｐＰＬＦ−１９ＤＮＡのいずれか一方１μgを、記載した制限酵素により、２０μLの体積中で３７℃ にて１時間消化した。レーン１、１μgラムダＨind III標準。レーン２、ＥcoＲＩで消化したｐＰＬＦ−２６。レーン３、ｐＰＬＦ−１９／ＥcoＲＩ。レーン４、ｐＰＬＦ−２６／ＥcoＲＩ及びＮotＩ。レーン５、ｐＰＬＦ−１９／ＥcoＲＩ及びＮotＩ。レーン６、ｐＰＬＦ−２６／ＢamＨＩ。レーン７、ｐＰＬＦ−１９／ＢamＨＩ。レーン８、ｐＰＬＦ−２６／Ｈind III。レーン９、ｐＰＬＦ−１９／Ｈind III。レーン１０、ｐＰＬＦ−２６／ＳｐｈＩ。レーン１１、ｐＰＬＦ −１９／ＳｐｈＩ。レーン１２、ｐＰＬＦ−２６／Ｘｂａ（注：不完全な消化）。レーン１３、ｐＰＬＦ−１９／Ｘｂａ。このユニバーサルベクターは、様々な異なる所望のタンパク質を発現するように容易に適合させることができる。例えば、公表されたｈＬＦ'ｓの配列をこのベクター内に挿入して発現させ、ここから単離することができる。実施例６ Asepergillus awamori におけるウシ及びブタラクトフェリンの発現実施例５で構築されたユニバーサルＡ.awamori発現ベクターは、目的のいずれのｃＤＮＡをインフレームでサブクローニングするために使用し得る。このベクター、ｐＰＬＦ−２６は、Ａ.awamoriにおけるヒトラクトフェリンの発現に利用されるｐＰＬＦ−１９と類似している。５'及び３'オリゴヌクレオチドプライマーは、ＮotＩとＥcoＲＩ末端それぞれを含むように設計することができ、成熟ブタ及びウシラクトフェリンの既知のＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いて、成熟ブタ及びウシラクトフェリンをコードする完全長のｃＤＮＡ配列を得るために使用することができる。ＰＣＲフラグメントはＮotＩで消化でき、Mung Bean ヌクレアーゼ（Stratagene）を用いて修復でき、そしてＥcoＲＩで全て消化できる。これによって、ＮotＩにインフレームサブクローニングでき、修復でき、ＥcoＲＩはｐＰＬＦ−２６を消化する。次いで、ヒトラクトフェリンについて前記したように、このプラスミドでＡ.awamoriを形質転換し、これらのｃＤＮＡから発現させて分泌させることができる。実施例７種々のアスペルギルス菌株におけるヒトラクトフェリンの発現：比較実験この実施例では、種々のベクターから構築した種々のアスペルギルス、特にアスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス・ニデュランスにおけるｈＬＦの発現濃度の差異を比較した。これらのデータを前述のアスペルギルス・アワモリで得られたｈＬＦの発現データと比較した。Ａ．アスペルギルス・オリゼにおけるヒトラクトフェリンの発現ヒトラクトフェリンをコードする完全ｃＤＮＡ配列を含み、アスペルギルス・オリゼにおける該ラクトフェリンの発現に用いられるように発現プラスミド、ｐＡｈＬＦＧを設計した。ｐＡｈＬＦＧの設計、構築および図示的表現は、同時係属特許出願である１９９４年５月２７日出願のＵ.Ｓ.０８／８７３，３０４（現在放棄されている１９９２年４月２４日出願のＵ.Ｓ．０７／８７３，３０４の一部継続出願である）に記載した。同時係属特許出願である１９９４年５月２７日出願のＵ.Ｓ.０８／８７３，３０４は本発明の引用文献である。発現プラスミドｐＡｈＬＦＧは、α−アミラーゼプロモーター、分泌シグナル配列および成熟α−アミラーゼの第１コドンをコードするアスペルギルス・オリゼのＡＭＹＩＩ遺伝子の６８１ｂｐの５'フランキング配列を含む。成熟ヒトラクトフェリンをコードするｃＤＮＡを、これらの配列から下流のフレームにおいてサブクローニングし、増殖培地にデンプンを添加することによって組換えタンパク質を産生させる。アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼの３'非翻訳領域は、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルを提供する。該プラスミドは、ニューロスポラ・クラッサのｐｙｒ４の選択可能マーカーおよびアンピシリン耐性遺伝子も含んでいる。形質転換したアスペルギルス・オリゼ菌株においてサザンブロット分析を行い、そのデータは同時係属特許出願である１９９４年５月２７日出願のＵ.Ｓ.０８／８７３，３０４（現在放棄されている１９９２年４月２４日出願のＵ．Ｓ．０７／８７３，３０４の一部継続出願である）に記載した。簡単に述べると、別の形質転換体由来のゲノムＤＮＡおよびコントロールＡＯ７を、放射標識したｈＬＦのｃＤＮＡプローブ（２．１ｋｂ）とハイブリダイズした。結果から、全形質転換体（＃１〜９）中に存在するが、コントロールである非形質転換体ＡＯ７には存在しない発現プラスミドのＥｃｏＲＩ消化によってできた放射標識されたフラグメント（２．８ｋｂ）の形成がわかった。発現プラスミドの調節コントロール要素の下でラクトフェリンｍＲＮＡがアスペルギルス・オリゼに正確かつ効率的に転写されるかどうかを決定するためにノーザンブロット分析を行った。そのデータは同時係属特許出願である１９９４年５月２７日出願のＵ.Ｓ.０８／８７３，３０４（現在放棄されている１９９２年４月２４日出願のＵ.Ｓ．０７／８７３，３０４の一部継続出願である）に記載した。簡単に述べると、その結果から、ヒトラクトフェリンのｍＲＮＡが、³²Ｐ標識ヒトＬＦのｃＤＮＡ（２．０ｋｂ）プローブを用いて検出されることがわかった。ヒトＬＦの放射標識したｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、形質転換体ではラクトフェリンｍＲＮＡ（２．３ｋｂ）に対して正確なサイズで特異的放射標識バンドが検出されたが、コントロールである非形質転換菌株では検出されなかった。ドットアッセイによってｍＲＮＡ濃度を定量したところ、コントロールＡＯ７と被検形質転換体（＃１）との間で、外来性α− アミラーゼのｍＲＮＡの発現が、比較できる濃度であることがわかった。アスペルギルス・オリゼで発現し、分泌された組換えＬＦの濃度を測定するために、３％デンプンの存在下で、３０℃にて７２時間、形質転換体（＃１）を増殖させた。増殖培地を収穫し、菌糸体をｐＨ１０で洗浄し、細胞壁にゆるく結合したタンパク質をすべてはずした［ヒュージ−ジェンセンらのLipidｓ，２４：７８１〜７８５(１９８９年)］。結果を図１６に示す。ヒトラクトフェリンに対する特異的ＩｇＧを用いるウエスタンブロット分析を行ったところ、形質転換体では、ラクトフェリンの大きさに対応する７８ｋＤのタンパク質が検出されたが、コントロールＡＯ７では検出されなかった(図１６Ａのレーン２および３)。図１６Ａ：レーン１は乳汁ｈＬＦスタンダードである；レーン２および３は誘導コントロールＡＯ７および形質転換体＃１フラクション由来の増殖培地（４０ｎｇタンパク質）のサンプルである；レーン４〜６は増殖培地から得た組換えｈＬＦのＣＭ−セファデックス精製において採取された溶出フラクション（それぞれ＃３５，４０および４５）の２５μｌのアリコートである。２回行った銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析からも、形質転換体中には７８ｋＤタンパク質が存在するが、コントロールＡＯ７には存在しないことがわかった（図１６Ｂのレーン２および３）。ｈＬＦに対して特異的ビオチン化したＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡ分析［ヴィルジャらのJ．Immunol．Methods,７６：７３〜８３（１９８５年）］には、組換えｈＬＦが濃度５〜２５mg／リットルで分泌され、誘発培養由来の総増殖培地タンパク質の約５％の量で存在することが示されている。組み込まれたコピー数と組換えタンパク質の分泌濃度との間には、相関関係はなかった。ベクターの設計と産生濃度については後記の表を参照せよ。ＣＭ−セファデックスＣ５０２６［ストウェルらのBiochem．J.,２７６：３４９〜３５５（１９９１年）］を用いるイオン交換クロマトグラフィーによって、形質転換体＃１の増殖培地から、組換えラクトフェリンを精製した。直線塩勾配を用いてカラムからヒトラクトフェリンを溶離した。ｈＬＦに対する特異的ＩｇＧを用いるウエスタンイムノブロット分析を行い、フラクション３５〜４５においてｈＬＦのサイズに対応する免疫反応性バンドを検出した（図１６Ａのレーン４〜６）。銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でサンプルを２回分析したところ、この免疫反応性ｈＬＦが、これらのフラクションにおける主タンパク質バンドに対応することがわかった（図１６Ｂのレーン４〜６）。これらの結果から、組換えｈＬＦが、このシングルイオン交換ステップで約９５％の純度に精製されることが示される。図１６Ｂ：銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析で、図１６Ａに示されるサンプルを２回分析したものである。ｈＬＦが正確にそのＮ末端で切断されたかどうかを審査するために、自動エドマン分解操作によって、組換えタンパク質のＮ末端から１０残基のシーケンシングを行った。シグナルペプチドの成熟α−アミラーゼへの結合を正確にまねるためにプラスミド構築物に導入されたアラニン残基がＮ末端に追加されている（図１６Ｃ）以外は、この物質の大部分が、天然のヒト乳ＬＦにおける対応するアミノ酸と一致した［メッツ−ブティーグらのEur．J．Biochem.,１４５：６５９〜６７６（１９８４年）］。Ｎ末端のＡｌａ−Ｇｌｙ−ＡｒｇトリペプチドまたはＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇテトラペプチドが失われているものが少しあった。先に行われた天然のｈＬＦの分析から、この切断パターンが、ｈＬＦタンパク質それ自体に本質的なものであるという可能性［ハッチンズらのProc．Natl． Acad．Sci．U.S.A.,８８：２９９４〜２９９８（１９９１年）］またはアスペルギルス・オリゼのシグナルペプチダーゼのＮ末端切断能力の不均質性によるものである可能性［クリステンセンらのBio/Technology,６：１４１９〜１４２２（１９８８年）；ヒュージ−ジェンセンらのLipidｓ，２４：７８１〜７８５（１９８９年）］が示唆される。Ａ．アスペルギルス・ニデュランスにおけるヒトラクトフェリンの発現アスペルギルス・ニデュランスにおけるｈＬＦのｃＤＮＡの発現のためのプラスミドを構築した。このベクターの設計および構築についての詳細は、前述の同時係属特許出願である１９９３年１０月２８日出願のＵ.Ｓ.０８／１４５，６８１に記載した。簡単に述べると、アスペルギルス・ニデュランスのための発現プラスミド、ｐＡＬ３ｈＬＦＴには、制御された遺伝子発現に必要な全調節要素を含むアスペルギルス・ニデュランスのａｌｃＡ遺伝子の３００ｂｐの５'フランキング配列を含む。このベクターは、アスペルギルス・ニデュランス由来のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、天然のｈＬＦのシグナル配列、ｈＬＦをコードするｃＤＮＡ、アスペルギルス・ニデュランス由来のＢｅｎＡ３７非翻訳配列およびニューロスポラ・クラッサのｐｙｒ４選択可能マーカーを含む。形質転換したアスペルギルス・ニデュランス菌株においてサザンブロット分析を行い、そのデータは同時係属特許出願である１９９３年１０月２８日出願のＵ .Ｓ.０８／１４５，６８１に記載した。簡単に述べると、形質転換体がｈＬＦのｃＤＮＡを組み込まれたプラスミドを含むことを確認するためにサザンブロット分析を行った。レーン１〜１０において、ｈＬＦ特異的放射標識バンドが、予想されるサイズ（２．３ｋｂ）で検出されたがコントロール胞子由来のＤＮＡでは検出されなかった。これらの結果から、ｈＬＦのｃＤＮＡが全被検アスペルギルス・ニデュランス形質転換体のゲノムに組み込まれ、その数がランダムに１細胞あたり１コピーから２０コピーの値で変化することがわかった。アスペルギルス・ニデュランスへのプラスミドの組込み部位は、ベクターを特定の部位へ標的化するための相同配列がないゆえにランダムである。アスペルギルス・ニデュランスにおけるｈＬＦの産生の詳細は、同時係属特許出願てある１９９３年１０月２８日出願のＵ.Ｓ.０８／１４５，６８１に記載した。簡単に述べると、炭素源として酢酸ナトリウムを含む最小培地中、１．２％エタノールの存在あるいは不在下にて、分生子（１×１０⁶／ｍｌ）を培養し、ｈＬＦのｃＤＮＡの転写を誘発した。培地および菌糸を収穫し、Miracloth（カルボバイオケム、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて分離した。菌糸(２００mg)を凍結し、一夜吸引乾燥した。フッ化フェニルメチルスルホニルの存在下、リン酸塩緩衝食塩水を用いてガラス・テフロン・ホモジェナイザー中でホモジェナイズして全細胞抽出物を調製した。ホモジェネートを遠心分離し、可溶分画を含む上清を回収した。増殖培地を濃縮し、凍結乾燥し、ＰＢＳに再懸濁した。説明書に従ってブラッドフォード試薬（バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ）を用い、タンパク質濃度を測定した。タンパク質４０μｇおよび可溶抽出物（タンパク質５０ μｇ）を含む濃縮培地サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。精製ラクトフェリンをスタンダードとして（ｈＬＦスタンダード）用いた。ウエスタンブロット法により電気泳動でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写した。２％乾燥乳を含むトリス緩衝食塩水に膜を浸し、次いで、ｈＬＦに対する特異的ポリクローナルＩｇＧ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）１μｇ／ｍｌを添加した同緩衝液中でインキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％NonidetＰ−４０で膜を洗浄し、次いで、［¹²⁵Ｉ］タンパク質Ａとともにインキュベートした。次いで、膜を洗浄し、乾燥し、コダックＸＡＲ５フィルムを−７０℃で一夜感光させた。次いで、フィルムをオートラジオグラフィー装置にかけた。オートラジオグラフ写真は、ｈＬＦの産生を示している。ａｌｃＡプロモーターの制御下においてアスペルギルス・ニデュラス形質転換体にｈＬＦのｃＤＮＡが発現するかどうかを検定するために、ウエスタンブロット分析を行った。組み込まれたｈＬＦのｃＤＮＡの最高数のコピーを含む、ひとつの形質転換体（Ｎo.５）由来の分生子（１×１０⁶／ｍｌ）を培養した。培養物を収穫し、洗浄し、エタノールを加えた最小培地に再度植え込み、培養物を収穫する前に、さらに１２あるいは２４時間増殖させた。細胞抽出物および増殖培地のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、ニトロセルロース膜に転写し、ｈＬＦに対する特異的ポリクローナルＩｇＧを用いて免疫ブロットを行った。天然のｈＬＦとは分離不可能の免疫反応性バンドが、エタノール導入後１２および２４時間増殖させた後の形質転換体Ｎo．５由来の細胞および増殖培地に現れた。これらの結果は、ａｌｃＡプロモーターの制御下において、形質転換されたアスペルギルス・ニデュラスにｈＬＦが発現することを示す。残りの形質転換体すべての細胞内にｈＬＦが発現することがウエスタンブロット分析によりわかった（データ示さず）。一般に、プラスミドのコピー数および得られる発現濃度の間には、相関関係がある。該培地では、ｈＬＦは、組み込まれた発現プラスミドのコピー数が多い形質変換体のみに検出された（Ｎo．１、５、７および１０）。形質転換体Ｎo.５の試験的発酵を行って、産生されたｈＬＦのおよその量を測定した。ｈＬＦに対する特異的ビオチン化ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡから、産生された組換えｈＬＦの総濃度が５ｍｇ／ｌであり、この物質の約３０％（１．５〜２．０μｇ／ｍｌ）が培地に分泌されることが示された。ベクターの設計および産生濃度については後記の表を参照せよ。このように、この実施例は、発現ベクターであるプラスミド構築物の設計を修飾することおよび使用する宿主細胞を変更することによって、出願人がヒトラクトフェリンの発現を改良し、強化したことを説明するものである。後記の表に記載されているように、数種の異なるベクター構築物を用い、少なくとも４種の異なるアスペルギルス菌株においてヒトラクトフェリンを産生した。産生されたヒトラクトフェリンの量は、１リットル当たりのｈＬＦのミリグラム数で示す。便宜上、各ベクター成分は、そのベクター構築物内で方向的に左から右へ位置する順序で記載する。発現プラスミドベクターに含まれる成分として、プロモーターおよびその由来；シグナル配列およびその由来、リンカー配列、ヒトラクトフェリンをコードするＤＮＡ、転写終結配列および選択可能マーカーが挙げられる。実施例８対立変異体を含む公表されたＤＮＡ配列を用いるラクトフェリンの産生これまでに引用した公表文献および特許出願において同定されているラクトフェリン類をコードする幾つかの公知のＤＮＡ配列のいずれかひとつを使用することもできる。さらに、ラクトフェリンの特徴を保持しているラクトフェリンのポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡ配列を使用することもできる。当業者であれば、ヒト、ブタあるいはウシラクトフェリンの種々の公知あるいは公知のものから明らかな対立変異体を用いてラクトフェリンを産生することが、本発明の範囲に含まれることを理解しうるであろう。幾つかの対立変異体が、文献に報告されており、それらは、本発明の製造方法によって産生しうるラクトフェリン類の菌型に含まれることを意図されるものである。実施例９発酵実験プロトコル種々の増殖および産生条件を用いて、アスペルギルス・アワモリにおいて組換えヒトラクトフェリンを発現することができる。以下の記載内容は、アスペルギルス・アワモリにおけるｈＬＦの発現に使用しうる種々の条件を説明する目的のために提出されるものであり、本発明にいかなる形体の制限をも加えるものではない。以下の記載は、発酵産生プロセスおよび産生したラクトフェリンの回収に用いたプロセスの一般的な概略である。当業者であれば、所望のラクトフェリンあるいはラクトフェリンポリペプチドの産生を強化するために、該実験プロトコルに多少の変更あるいは修飾を加えてもよいことを理解しうるであろう。以下に、発酵法によるラクトフェリンの製造の簡単な概略を示す。Ｉ．発酵工程Ａ．培地成分１）播種培地（Seed Medium）Ｒoquette Ｃorn Ｓteep Ｐowder １００ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／ＬＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ１ｇ／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄−２Ｈ₂Ｏ１ｇ／Ｌオートクレーブ処理前にｐＨを５.８に調節し、１５分間オートクレーブ処理する。２）生産培地(Production medium)濃縮物は接種後(post-innoculation)) Amaizo Lodex-5 部分的に加水分解されたコーンスターチ１７５ｇ／ＬＲoquette Ｃorn Ｓteep Ｐowder (Soluly^R A ST) ６０ｇ／Ｌクエン酸三ナトリウム８０ｇ／ＬＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ２ｇ／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄−２Ｈ₂Ｏ１.３ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム１５ｇ／Ｌ Antifoam 204 ２mｌ／Ｌオートクレーブ処理前にｐＨを６.２に調節し、１５分間オートクレーブ処理する。本発明者らは、部分的に加水分解された澱粉（スターチ）を発酵工程に用いることにより、ラクトフェリンの生産を高めることができることを見いだした。しかしながら、未修飾コーンスターチとデキストロースの組合せでラクトフェリンの適度の生産が得られた。日常的な実験によって、ラクトフェリンの生産を適切にするために、より少量の澱粉の使用、またはより高価な澱粉に置き換えることもできる。Ｂ．発酵工程今日までのところ、発酵はバッチ法で行われている。約５−６日で生成物濃度は最高となる。１）Seed Stage １：ａ）２Ｌエーレンマイヤーフラスコ中、播種培地４５０mｌ。ｂ）播種培地１mｌあたり１×１０⁶個の胞子を播種。ｃ）３３℃、相対湿度７０％において２４０rpm(50mm スローシェーカー)で２４時間］インキュベート。２）Seed Stage ２：ａ）２つの１２cmの６枚刃のrushton羽根車(impeller)を備えたＮＢＳ Micr os30 ファーメンター中、播種培地２０Ｌ。ｂ）３０分間の滅菌。 Stage１の種（２％）を播種かきまぜ５００rpm。通気(流速) ０.７５ＶＶＭ圧力３００mbar ｐＨ非調節ＤＯ非制御３）生産パイロット容器は、アスペクト(aspect)比３：１のB.Braun Biotech UD100である。２つの１６cmの６枚刃のRushton羽根車(impeller)をかきまぜに用いた。発酵はpost-innoculation ８０Ｌで行った。かきまぜ４５０rpm。入力は調べていない。温度３３℃。通気(流速) ０.７５ＶＶＭ変動の可能性は、調べていない。圧力３００mbar ｐＨ非調節ＤＯ非制御変動の可能性は、調べていない。消泡剤(Antifoam) 不要容器条件は上記の通りである。容器に培地成分８０Ｌを入れ、脱イオン水で容量を７２Ｌにする。それを３０分間滅菌する。Stage２の種８０Ｌ（１０％ＣＶ）を３６−４８時間の増殖により転移させる。最適な播種工程は現在開発中である。ラクトフェリン生産は２４時間までに見られ、生成物の蓄積は５−６日で最大になる。ＩＩ．ダウンストリームプロセッシング（Downstream processing）Ａ．ろ過発酵により非-ペレット状の外観を示す３０−４０％充填細胞が得られる。ブロスを清澄にするためにろ過を用いる場合には、フィルター補助材が必要である。プロセス量の低さから、３，０００cm²支持体(support)以上の直真空ろ過を用いるとよい。基材としてポリプロピレンフィルターマットが用いられる。最初の試験ではフィルター補助材としてけい藻土を用いた。しかしながら、直 −焼成、またはフラックス−焼成けい藻土は、ラクトフェリンに結合するので、フィルター補助材として用いることができない。酸−洗浄けい藻土のみがラクトフェリンと結合しないであろう。酸−洗浄けい藻土（ＤＥ）は非処理製品の価格の４０−５０倍で購入することができる。他の選択肢は製造者側でＤＥを酸処理することである。予備的な試験では、それを３ＮＨＣlでスラリーとし、４５分間混合し、洗浄水のｐＨが４.０になるまで、脱イオン水で洗浄した。このようにして処理された物質には、ラクトフェリンは結合しなかった。処理ＤＥを全ブロスと一緒に１：５w/v比で用いた。ブロスと混合する前にＤＥを脱イオン水でスラリー処理した。比率が１：１０ではろ過できないことが分かった。別の製品はセルロースファイバーである。本発明者らは、Solkafloc 10IND（P rotein Technologies International Urbana，IL; 1-800-258-0351）が、ラクトフェリンと結合せずに良く機能することを見いだした。本発明者らは、Solkaflo cをろ過の補助材としてのフィルターに用いる。発酵ブロス１００Ｌにつき、脱イオン水１００ＬにSolkafloc２０ｋｇをスラリー化する。ブロスをスラリーに混合する。次いで、混合物は容易にろ過される。この段階で清澄に達しているので、さらにろ過することなく、以後のダウンストリームプロセッシング（限外ろ過及びカラムクロマトグラフィー）を進めることができる。一回のバッチろ過におけるSolkaflocの、ブロスおよび脱イオン水に対する割合は至適化されつつある。ラクトフェリンの回収はろ過ケーキを洗浄すれば、ほぼ定量的である。連続ろ過工程装置を用いることにより、Solkaflocをろ過補助材として用いる方法は変化する。流動学及びろ過特性が改善されている既存の種(strains)又は開発された種を用いても良い。例えば、撹拌されているタンク発酵内でペレット化する変種(mut ants)は、プロセッシングの間にろ過ケーキをより分厚くし、フィルタープレコートとして以外には、フィルター補助材を必要としないであろう。Ｂ．限界ろ過清澄化したブロスを限界ろ過で濃縮する。３０，０００ＭＷメンブランを持つ、２つのAmicon S10Y30（それぞれ、0.93 m²）スパイラルカートリッジをAmicon ＤＣ−３０システムと一緒に用いる。このメンブランは、低−タンパク質結合性セルロースに基づく物質である。還流（フラックス）速度は、プロセッシングの段階に応じて１−１.８rpmである。最少の操作工程の容量に達すれば、濃縮液を５倍量の、０.１ＭＮaＣl、１ｍＭＥＤＴＡ及び２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ７.５を含有する緩衝液で連続的に透析する。次いで、緩衝液を４℃に冷却し、透析液を可能な限り少量まで濃縮し、回収する。この工程での収率はほぼ１００％であった。最終の限外ろ過（ＵＦ）濃縮物の全タンパク質は５−８mg／mlであり、ラクトフェリンは全タンパク質中１０％である。回収率は、新しい種が開発されれば、最適なものとなるであろう。発酵バッチ８０Ｌに対し、このシステムでは、濃縮及び透析に約２時間かかる。Ｃ．クロマトグラフィー分離 Pharmacia CM Sepharose Fast Flow ゲルを用いる。この樹脂の清澄ブロス中のラクトフェリンへの結合能力は約２０mg／mlである。カラムにＵＦ濃縮物を適用する。負荷したカラムをまず、０.２ＭＮaＣl ２５ｍＭＴＲＩＳｐＨ７.５で洗浄する。カラムに過剰に負荷しなければ、ラクトフェリンの放出はないであろう。０.５ＭＮaＣl／２５ｍＭＴＲＩＳｐＨ７.５でラクトフェリンを溶離する。ラクトフェリンを含有する溶出フラクションの容量は、通常、樹脂ベッドの２倍である。Ｄ．アポラクトフェリンへの変換ラクトフェリンを含有する０.５ＭＮaＣlフラクションを合する。１Ｍクエン酸アンモニウムを加えて最終濃度を０.１Ｍクエン酸アンモニウムとする。１０ＮＨＣlでｐＨをゆっくり２.０に調節する。溶液を、３０，０００ＭＷメンブランを用いて適当な大きさの限外ろ過ユニットに移すが、そこで溶液は適当な容量に濃縮され、次いで、０.５ＭＮaＣl／０.１Ｍクエン酸アンモニウム、ｐＨ２.０で連続的に透析する。鉄の放出および透析が完了した後、ｐＨを中性に調節して次工程での沈殿を防止する。もしも残留鉄が存在すれば、中性ｐＨでラクトフェリンに再結合する。透析緩衝液を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７.８）に代え、溶液を５倍量の緩衝液で連続的に透析する。次いで、溶液を最少量まで濃縮し、回収し、凍結乾燥する。工程の最適化は現在進行中である。用いる種に応じて、ケース・バイ・ケースで具体的な因子を考察している。そのような因子には、（１）ｐＨ制限、（２）鉄を除去するための装置の予備処理、及び（３）痕跡量の鉄を除去するためのCh elex樹脂による緩衝液の予備処理がある。ラクトフェリンの沈殿および残存鉄の再結合を避けるために、０.２ＭＮaＣl ５０ｍＭ重炭酸アンモニウムのような中間体緩衝液を検討することも必要かもしれない。実施例１０アスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガー細胞内での、融合タンパク質としてのラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントの製造Ａ．ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントのアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)内での発現アスペルギルス・オリザエ内で、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク生成物として発現させるために、前記と同様の発現ベクターを構築することができる。Ａ．オリザエ発現ベクターは、５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Aspergillus oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｆ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含んでおり、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができる。次いで、このベクターを用いてＡ．oryzaeを形質転換する。この新規なプラスミドベクター構築物の生成物は、上記のステップ（ｅ）におけるヌクレオチド配列に対応するラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントと融合した、高度に発現されたＡ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子の半分を含む融合タンパク質である。次いで、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント融合生成物は、Ｋｅｘ２ペプチダーゼ部位に特異的な内因性Ａ．oryzae タンパク質分解酵素によりプロセッシングされる。Ｂ．ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)内での発現アスペルギルス・ニガー内で、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク生成物として発現させるために、前記と同様の発現ベクターを構築することができる。Ａ．ニガー発現ベクターは、５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Aspergillus nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それ配列に対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｆ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含んでおり、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができる。次いで、このベクターを用いてＡ．niger細胞を形質転換する。この新規なプラスミドベクター構築物の生成物は、上記のステップ（ｅ）におけるヌクレオチド配列に対応するラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントと融合した、高度に発現されたＡ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子の半分を含む融合タンパク質である。次いで、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント融合生成物は、Ｋｅｘ２ペプチダーゼ部位に特異的な内因性Ａ． nigerタンパク質分解酵素によりプロセッシングされる。結論として、本発明及び本明細書に開示した実施態様は、本願に記載した目的を実行し、最終目的を達成するのに、十分に適合できることが分かる。本発明の思想及び範囲から外れることなく、方法及び装置にある種の変化をもたらすことができる。変化は可能であり、さらに本願の任意のクレームで統轄されている各要素又はステップは、実質上同一又は同等の手段で、基本的に同一の結果を導くようなあらゆる同等の要素又はステップを意図しているということが分かる。本発明は、その基本原理がいかなる形で利用されていても、それらを包含することを意図している。従って、本発明は、目的を実行し、最終目的物と言及した利益およびそれに固有のものを得る上で十分に適合する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:665） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オマリー，バート・ダブリューアメリカ合衆国77079テキサス州ヒューストン、ランブルウッド639番

Claims

【特許請求の範囲】１．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）プロモーター；（ｂ）シグナル配列；（ｃ）その生成物がAspergillus の細胞から分泌される高度に発現された内因性遺伝子の５'部分；（ｄ）リンカー配列であって、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；を含む新規な組換え発現プラスミドベクターであって、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができるベクター。２．該プロモーターがアルコールデヒドロゲナーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びbenＡからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項１記載のベクター。３．該プロモーターがグルコアミラーゼ遺伝子由来のものである請求項２記載のベクター。４．グルコアミラーゼ遺伝子がＡ．awamori又はＡ．nigerに由来するものである請求項３記載のベクター。５．該プロモーターがα−アミラーゼ遺伝子由来のものである請求項２記載のベクター。６．α−アミラーゼ遺伝子がＡ．oryzae由来のものである請求項５記載のベクター。７．該シグナル配列が、グルコアミラーゼ及びα−アミラーゼからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項１記載のベクター。８．該シグナル配列が、Ａ．awamori又はＡ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項７記載のベクター。９．該シグナル配列が、Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項７記載のベクター。１０．該高度に発現された内因性遺伝子が、α−アミラーゼ遺伝子及びグルコアミラーゼ遺伝子からなる群から選択されるものである請求項１記載のベクター。１１．該高度に発現された内因性遺伝子が、Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子である請求項１０記載のベクター。１２．該高度に発現された内因性遺伝子が、Ａ．awamori又はＡ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子である請求項１０記載のベクター。１３．該リンカー配列が、ペプチダーゼ開裂部位である請求項１記載のベクター。１４．該リンカー配列が、Kex2 ペプチダーゼ開裂部位をコードしている請求項１３記載のベクター。１５．さらに、転写終止配列及び選択可能マーカーをも含んでいる請求項１記載のベクター。１６．該転写終止配列がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、及びbenＡからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項１５記載のベクター。１７．該転写終止配列が、Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項１６記載のベクター。１８．該選択可能マーカー遺伝子が、pyr4、pyrG、amdS、argB、trpC、およびフレオマイシン耐性からなる群の遺伝子から選択されるものである請求項１５記載のベクター。１９．該選択可能マーカーが、フレオマイシン耐性遺伝子に由来するものである請求項１８記載のベクター。２０．該ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが、ヒト、ウシ又はブタから導かれたものである請求項１記載のベクター。２１．請求項１記載のベクターを用いてAspergillus 属の菌を形質転換して生産されるラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント。２２．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含む新規な組換え発現プラスミドベクターであって、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができるベクター。２３．請求項２２記載のベクターを用いてAspergillus awamoriの菌を形質転換したとき生産され、プロセッシングされるラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント。２４．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含む新規な組換え発現プラスミドベクターであって、該ベクターによりＡ．ni ger細胞を形質転換した後、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができるベクター。２５．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含む新規な組換え発現プラスミドベクターであって、ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントを融合タンパク質として生産させ、該タンパク質をプロセッシングされたタンパク質として発現させることができるベクター。２６．請求項２５記載のベクターを用いてＡ．oryzaeの菌を形質転換して生産され、プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント。２７．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）プロモーター；（ｂ）シグナル配列；（ｃ）その生成物がAspergillus の細胞から分泌される高度に発現された内因性遺伝子の５'部分；（ｄ）リンカー配列であって、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；を含む組換えプラスミドを含有するAspergillus属の菌を培養することを含むラクトフェリンの製造方法であって、ここに、該形質転換されたAspergillus属の菌は適当な栄養培地でラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントは栄養培地に分泌され、それから単離されるものであるラクトフェリンの製造方法。２８．該プラスミドが、さらに、転写終止配列及び選択可能マーカー遺伝子をも含んでいる請求項２７記載の方法。２９．該プロモーターがアルコールデヒドロゲナーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びbenＡからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項２７記載の方法。３０．該プロモーターがグルコアミラーゼ遺伝子由来のものである請求項２９記載の方法。３１．グルコアミラーゼ遺伝子がＡ．awamori又はＡ．nigerに由来するものである請求項３０記載の方法。３２．該プロモーターがα−アミラーゼ遺伝子由来のものである請求項２９記載の方法。３３．α−アミラーゼ遺伝子がＡ．oryzae由来のものである請求項３２記載の方法。３４．該シグナル配列が、グルコアミラーゼ及びα−アミラーゼからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項２７記載の方法。３５．該シグナル配列が、Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項３４記載の方法。３６．該シグナル配列が、Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項３４記載の方法。３７．該高度に発現された内因性遺伝子が、α−アミラーゼ遺伝子及びグルコアミラーゼ遺伝子からなる群から選択されるものである請求項２７記載の方法。３８．該高度に発現された内因性遺伝子が、Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子である請求項３７の方法。３９．該高度に発現された内因性遺伝子が、Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子である請求項３７記載の方法。４０．該リンカー配列が、ペプチダーゼ開裂部位である請求項２７記載の方法。４１．該リンカー配列が、Kex2 ペプチダーゼ開裂部位をコードしている請求項４０記載の方法。４２．該転写終止配列がα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、及びbenＡからなる群の遺伝子から選択されるものである請求項２８記載の方法。４３．該転写終止配列が、Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来するものである請求項４２記載の方法。４４．該選択可能マーカー遺伝子が、pyr4、pyrG、amdS、argB、trpC、およびフレオマイシン耐性からなる群の遺伝子から選択されるものである請求項２８記載の方法。４５．該選択可能マーカーが、フレオマイシン耐性遺伝子に由来するものである請求項４４記載の方法。４６．請求項２７記載の方法で製造されたラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント。４７．ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが、ヒト、ブタ又はウシラクトフェリンである、請求項４６記載のラクトフェリンタンパク質。４８．該ラクトフェリンタンパク質が、脱グリコシル化されている請求項４７記載のラクトフェリンタンパク質。４９．該ヒトラクトフェリン生成物が、脱グリコシル化されている請求項４７記載のラクトフェリンタンパク質。５０．該Aspergillusの菌がラクトフェリンを発現する、請求項２７記載の方法。５１．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それ配列に対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ヒトラクトフェリン又はヒトラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子；を含み、Aspergillusの菌内でのヒトラクトフェリン又はヒトラクトフェリンポリペプチドフラグメントの発現に用いられる発現プラスミドベクター。５２．ＡＴＣＣの受託番号が７４２９０であり、Awa LF 24-1と呼称される請求項５１記載のプラスミド。５３．請求項５１記載のプラスミドを含有するAspergillus awamori。５４．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ヒトラクトフェリン又はヒトラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を含む組換えプラスミドを含有する、形質転換されたAspergillus awamoriの菌を培養することを含むラクトフェリンの製造方法であって、ここに、該形質転換されたAspergillus awamoriの菌は適当な栄養培地でラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが栄養培地に分泌され、それから単離されるものであるラクトフェリンの製造方法。５５．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．oryzaeα−アミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を含む組換えプラスミドを含有する、形質転換されたAspergillus oryzaeの菌を培養することを含むラクトフェリンの製造方法であって、ここに、該形質転換されたAspergillus oryzaeの菌は適当な栄養培地でラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントは栄養培地に分泌され、それから単離されるものであるラクトフェリンの製造方法。５６．組換えプラスミドを含有する形質転換されたAspergillus awamoriの菌を培養することを含むラクトフェリン製造法によって製造されたラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントであり、ここに、該プラスミドは、５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を含有しており、該形質転換されたAspergillus awamoriの菌は適当な栄養培地でラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントは栄養培地に分泌され、それから単離される。５７．菌の栄養培地からラクトフェリンポリペプチドフラグメントを単離する方法であって、Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；Ａ．awa moriグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；Ａ．awamoriグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であって、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在しているリンカー配列；ラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及びフレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を含む組換えプラスミドベクターを含有する形質転換されたAspergillus awamoriの菌を培養することを含む方法、ここに、該形質転換されたAspergillus awamoriの菌は適当な栄養培地でラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして、該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメント栄養培地に分泌され、そこから単離される。５８．５'から３'方向に機能的に結合した以下の成分：（ａ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター；（ｂ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子由来のシグナル配列；（ｃ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子の５'部分；（ｄ）Kex２ペプチダーゼ開裂部位をコードするリンカー配列であり、それに対する特異的な内因性タンパク質分解酵素が存在するリンカー配列；（ｅ）ヒトラクトフェリン又はヒトラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）Ａ．nigerグルコアミラーゼ遺伝子に由来する転写終止配列；及び（ｇ）フレオマイシン耐性選択可能マーカー遺伝子を含む組換えプラスミドを含有する、形質転換されたAspergillus nigerの菌を培養することを含むラクトフェリンの製造方法であって、ここに、該形質転換されたAspergillus nigerの菌の細胞は適当な栄養培地でラクトフェリンタンパク質又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合生成物として生産され、次いで該リンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素でプロセッシングされるまで培養され、そして該プロセッシングされたラクトフェリン又はラクトフェリンポリペプチドフラグメントは栄養培地に分泌され、それから単離されるものであるラクトフェリンの製造方法。