KR100443307B1 - 아스퍼질러스에서융합단백질로부터프로세스된락토페린과락토페린폴리펩티드단편의발현방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 숙주 세포 아스퍼질러스(Apergillus)와 신규 플라스미드 구조를 이용하여 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편 생산을 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스 숙주 세포에서 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있는 신규 벡터를 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스, 특히 아스퍼질러스 아와모리(awamori), 나이져(niger) 그리고 오리자(oryzae) 숙주세포에 이용하는데 적합한 신규 플라스미드를 제공한다. 이는 재조합 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산하는 것을 특징으로 한다.
Description
미국 공동 출원 08/145,681에서는 사람의 락토페린의 cDNA 서열에 대해 기술하고 있다. 또한, 동일 미국 연속 출원 08/145,681에서 사람 락토페린의 cDNA 서열이 사카라마이세스 세르비시에(Sccharomyces cerevisiae), 아스퍼질레스 니듈란(Aspergillus nidulans) 그리고 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae)와 같은 다양한 곰팡이를 포함한 상이한 유기체에서 사람 락토페린을 생산하는데 이용되었다.
선행기술의 설명
락토페린(LF)은 우유, 다른 분비물 그리고 체액에서 발견되는 철-결합된 당 단백질이다. LF는 포유류에서 철의 결함과 수송에 관계된 성분 중에 하나이다.
LF는 원래 우유에서 발견되었는데 이는 초유 1 l당 최고 7g까지 분비된다. 이와 같은 고유 발견 때문에 LF는 사람이나 다른 포유류의 분비물에서 감지되어 왔다. 이들 체액에는 눈물, 타액, 점막분비물 그리고 다형핵-백혈구체포 2차 입상을 포함한다.
LF는 아미노산 서열과 3차 구조에서 볼 수 있듯이 C와 N 단부 절반 정도에 상당한 유사성을 가지는 쌍엽(bilobal) 구조을 가지는 78 KDa 당단백질이다. 각 엽은 높은 친화성을 가지며 하나의 철-이온에 가역적으로 결합할 수 있고 중탄산염의 결합을 수반한다. 락토페린의 생물학적 기능의 예는 미생물 병원균에 대한 정적 치사효과, 철 수송, 세포 성장 촉진, 면역 세포기능과 염증 반응의 조절, 골수발생 조절을 포함한다. 탈-글리코실화된 단백질에는 고유 LF의 모든 생물학적 기능을 보유하고 있다는 사실도 발견하였다.
락토페린으로부터 박테리아를 죽이는 도메인은 광범위 항균 작용을 가진다(Bellamy, W.M. et al., J. App. Bact. 73, 472-479 (1992). Bellamy가 우유로부터 분리한 소의 락토페린이 펩신 절단에 의한 소의 폴리펩티드를 다량으로 제공할 수는 있으나 이들 연구에 사용된 물질의 최대 순도가 95%이다. Bellamy et al은 합성된 사람 또는 소의 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드를 대량 생산할 수 있는 정보는 제공할 수 없었다. Bellamy et al은 효소 처리할 수 없는 펩티드를 생산할 수 있는 방법 또한 제시하지 못했다.
필라멘트성 곰팡이는 세포외 당단백질의 산업적 규모 생산에서 숙주로써 이용되었다. 특정 산업적 균주는 다량의 단백질을 분비 시킬 수 있다. 또한, 필라멘트성 곰팡이는 진핵 단백질의 해독후 수정과정을 정확하게 실행할 수 있으며, 많은 단백질은 미국 FDA 승인을 받았다. 또한, 대규모 발효기술과 하류 진행 경험이 이용될 수 있다. 그러나, 락토페린은 특정 곰팡이에 독성이 있는 것으로 보고 되었다 (Valenti, et al, FEMS Microbiology Letters, 33:271-275 (1986); -Epstein, et al, Reviews of Infectious Diseases, 6:96-106 (1984); Soukka, et al, FEMS Microbiology Letters, 90:223-228 (1992)). 결과적으로, 락토페린 생산에 작업자들은 곰팡이를 이용하지 않는다.
필라멘트성 곰팡이, 특히, 아스퍼질러스(Aspergillus)에서 락토페린의 생산은 본원 발명자들에 의해 처음으로 보고되었다 (Ward, et al, Gene, 122:219-223(1992); Ward, et al., Biotechnology, 10:784-789 (1992); Conneely et al., Production of Recombinant Human Lactoferrin, PCT/US 93/22348, InternationalApplication Number PCT/US93/03614, having a priority date of April 24, 1992 and published on November 11, 93; and Conneely, et al., United States Serial No. 08/250,308 filed 5/27/94, which is a continuing application of United States Serial No. 07/873,304, filed 04/24/92, now abandoned, all of which are incorporated herein by reference). 그러나, 이들 과정이 상당히 발전하는 동안에도, 락토페린의 효과적인 대규모 생산을 하는 능력에는 한계가 있었다.
현재, 락토페린 폴리펩티드를 생산하는 방법에 추가하여 사람, 소 또는 돼지에서 LF를 경제적으로 생산하는 방법이 필요하다. 결국, 영양학적으로, 치료요법적으로, 그리고 이들 작용 기작에 대한 조사 등을 위해 사람 락토페린 생산의 효과적이고 상업적인 방법의 개발이 필요하다. 본 발명은 숙주 세포로 아스퍼질러스(Aspergillus)와 신규한 벡터 구조를 이용하여 그리고 아스퍼질러스 숙주세포에서 락토페린을 생산하는 효과적인 방법을 이용하여 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단백질의 생산함으로써 이와 같은 요구를 충족시키고 이로써 다량의 재조합 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있다.
발명의 요약
본원 발명은 신규한 플라스미드 구조가 복합된 아스퍼질러스(Aspergillus)를 숙주세포로 이용하여 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편생산을 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스 숙주 세포에서 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있는 신규한 플라스미드 구조를 제공한다. 좀더 특별하게는, 본원 발명은 아스퍼질러스, 특히, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori),나이져(niger)와 오리자(oryzae)를 이용하는데 적합한 신규한 플라스미드 구조를 제공하고 이로써 대량의 재조합 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있다.
본원 발명은 또한 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있는 신규한 발현 플라스미드 벡터 구조를 제공한다. 플라스미드 벡터 구조에는 상당수준으로 생산될 락토페린을 제공하는 두 가지 주요 성분을 포함하고 있다. 또한, 프로모터, 선택된 단백질을 코드하는 cDNA, 시그날 서열, 전사 종료 서열, 선택성 표식에 추가하여, 플라스미드 벡터 구조에는 a) 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 생성물의 5' 절반에서 발현된 내생 유전자 b) 링커서열, 즉 링커서열의 내생 단백질 분해성 효소를 포함한다. 이와 같은 신규 플라스미드 벡터 생성물은 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편에 융합된 절반 발현된 유전자로 구성된 단백질이다. 그 다음 융합 단백질은 Kex2 펩티다제 절단부위에 특이적인 내생 단백질 분해효소에 의해 처리된다. 예로써, A. 아와모리의 글루코아밀라제 프로모터가 이용되는 경우에, 벡터는 A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자의 5' 절반을 포함한다. 생산된 락토페린은 글로코아밀라제 유전자의 1/2에 융합되어 Kex2 펩티다제 절단부위에 특이적인 내생 A. 아와모리 단백질 분해 효소에 의해 처리된다. 또다른 예로써, A. 나이져의 글루코아밀라제 프로모터가 이용되는 경우, 벡터에는 A. 나이져 글로코아밀라제 유전자의 5' 절반을 포함한다. 벡터 구조에 의해 생산된 융합체(LF가 글루코아밀라제 유전자의 절반에 융합되어 있는)는 Kex2펩티다제 절단 부위에 특이적인 A. 나이져 내생 단백질 분해 효소에 의해 처리되어 소요의 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 방출한다. 또한, A. 오리자 세포가 이용되는 경우에 벡터 구조에는 α-아밀라제 유전자에서 기원된 A. 오리자 프로모터와 A. 오리자 α-아밀라제 유전자의 일부를 포함한다. 벡터는 A. 오리자 세포로 형질 도입될 수 있고 융합체 (LF가 α-아밀라제 유전자의 절반에 융합된)는 Kex2 펩티다제 절반부위에 특이적인 A. 오리자 내생 단백질 분해 효소에 의해 처리되어 소요의 LF 또는 LF 폴리펩티드 단편을 생산한다.
따라서, 본원 발명은 아스퍼질러스 임의 종에서 상업적인 량으로 LF 또는 LF 폴리펩티드 단편을 생산하는 신규한 벡터 플라스미드 구조를 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 발현 플라스미드 벡터를 만들기 위해 5' 에서 3'로 연결된 다음의 성분으로 구성되는데;
a) 프로모터;
b) 시그날 서열;
c) 아스퍼질러스 세포에서 분비되는 생성물의 5' 부분에서 발현되는 내생 유전자 (예로써 글로코아밀라제 유전자);
d) 링커 서열; 그리고
e) 소요의 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편에 상응하는 뉴클레오티드 서열.
전술한 (a))-(e) DNA 서열은 플라스미드를 만들기 위해 클론된다. 생성된 발현 플라스미드는 글루코아밀라제 유전자에 융합된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편 (발현 플라스미드내로 삽입된 락토페린 뉴클레오티드 서열에 상응하는)을 발현시킬 수 있는 아스퍼질러스 세포내로 형질도입시키는데 이용된다. LF 또는 LF 폴리펩티드 단편은 Kex2 펩티다제 절단부위에 특이적인 내생 단백질 분해효소에 의해 처리된다.
본 발명의 또다른 구체예에서는 재조합 플라스미드를 포함하는 형질도입된 아스퍼질러스 곰팡이를 배양하는 것으로 구성된 락토페린을 생산하는 공정인데 이때, 플라스미드는 락토페린 단백질 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되고 이때 형질 도입된 아스퍼질러스 곰팡이 세포는 락토페린 단백질이 융합체로 형성되고 Kex2 펩티다제 절단부위에 특이적인 내생 단백질 분해성 효소를 통하여 처리될 때까지 배양하고, 처리된 락토페린은 영양배지로 분비되고 락토페린을 영양배지로부터 분리하거나 회수한다.
본 발명에서 전술한 플라스미드 벡터 구조는 프로모터, 시그날 서열, 글로코아밀라제 유전자의 5' 부분, 링키서열, 전사 종료 서열 그리고 선택성 표식으로 구성된다. 본 발명의 목적에서 "링커서얼"과 "단백질 분해효소 인지 서얼"은 상호 호환성 있게 사용되었다.
이와 같은 발현 벡터는 알코올 디하이드로게나제, α-아밀라제, 글루코아밀라제, benA 유전자에서 선택된 프로모터로 구성되고 이때 프로모터는 A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된다.
전술한 과정은 상기 프로모터가 글루코아밀라제 유전자로부터 기인되고 이때 프로모터는 A. 나이져의 글루코아밀라제 유전자로 부터 기인되고, 시그날 서열은 A. 나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된다. 이 과정에서 또한, 전술한 시그날 서열은 A. 나이져로부터 기인된 글루코아밀라제 유전자의 5' 일부로 구성된다.
전술한 과정에서 프로모터는 α-아밀라제 유전자로부터 기인되고 이때 프로모터는 α-아밀라제 유전자로부터 기인되고 시그날 서열에 상응하는 cDNA 서열은 A. 오리자 α-아밀라제 유전자로부터 기인된다. 이 공정에서 또한 전술한 시그날 서열은 A. 오리자로부터 기인된 α-아밀라제 유전자의 일부로 구성된다.
전술한 공정에서 또한 링커서열은 펩티다제 인지 서열이 된다. 본 발명에서 링커서열은 Kex2 펩티다제 인지 서열을 인코드한다. 본 발명의 목적에서 Kex2 펩티다제 인지 서열과 Kex2 펩티다제 절단부위는 동일하다.
전술한 공정에서, 전사 종료 서열은 알파-아밀라제, 글루코아밀라제, 알코올 디하이드로게나제와 benA에서 선택된다. 본 발명에서 또한, 전사 종료서열은 글루코아밀라제 유전자로부터 기인되고 전사 종료 서열은 A. 나이져의 글로코아밀라제 유전자로부터 기인된다.
전술한 공정에서 또한 선택성 표식 유전자는 pyr4, pyrG, amdS, argB, trpC와 플레오마이신 저항 유전자에서 구성된 유전자로부터 선택된다. 이 공정에서 또한 선택성 표식은 폴레오마이신 저항 유전자로부터 기인된다.
본 발명에서 또한, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 사람, 돼지 또는 소 락토페린 단백질이다. 본 발명에서 임의 락토페린 생성물은 탈-글루코실화된다.
본 발명의 또다른 구체예에서 플라스미드는 사람 락토페린의 아미노산을 인코드하는 DNA와 세포에서 DNA 발현을 위한 플라스미드 벡터로 구성되고 이때 플라스미드는 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포에서 사람 락토페린의 DNA를 발현시키는데 이용된다. 특히 적절한 플라스미드는 ATCC 기탁번호 74290이고 Awa LF 24-1의 특징을 가지는 것으로 이때 Awa LF24-1은 사람 락토페린을 인코드하는 DNA 예로써 미국 출원 08/145,681의 Seg. I.D. Listing No. 1을 포함하는 발현 플라스미드 pPLF-19로 형질도입된 아스퍼질러스 아와모리이다. 본 발명의 또다른 구체예는 전술한 플라스미드를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 재조합 플라스미드를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리, 나이져와 오리자를 배양하는 공정인데 이때 플라스미드는 하기와 같은 플라스미드 벡터로 구성된다;
a) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자에서 기인된 프로머터;
b) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자에서 기인된 시그날 서열;
c) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자와 같은 5' 부분에서 발현된 내생유전자;
d) Kex2 펩티다제 절단 부위를 코딩하는 링커서열;
e) 사람 락토페린의 아미노산을 코딩하는 DNA;
f) A. 나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고
g) 플레오마이신 저항성 선택성 표식 유전자;
이때 형질 도입된 아스퍼질러스 아와모리, 나이져 그리고 오리자 곰팡이 세포는 적절한 영양 배지에 배양시켜 락토페린 단백질이 융합체로 형성되고 그다음 Kex2 펩티다제 절단부위에 특이적인 내생 단백질 분해성 효소에 의해 처리되고 이때 락토페린 단백질은 사람 LF의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 생성물이고 락토페린은 영양배지로부터 분비되고 따라서 여기에서 분리한다. 본 발명에서 "Kex2 펩티다제 절단부위"와 "Kex2 펩티다제 인지 서열"은 상호 호환성 있게 이용된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 재조합 플라스미드 벡터를 포함하는 형질도입된 아스퍼질러스 곰팡이 세포를 배양하는 것으로 구성된 곰팡이성 영양 배지로부터 락토페린을 분리하는 방법을 제공하는데 이때 플라스미드 벡터는 프로모터, 시그날 서열, 글루코아밀라제 유전자의 5' 부분, 링커서열, 사람 락토페린의 아미노산을 인코드하는 DNA, 전자 종료 서열, 선택성 표식 유전자로 구성되고 이때, 형질 도입된 아스퍼질러스 곰팡이는 적절한 영양배지에서 배양하고 락토페린 단백질이 융합 단백질로 형성되고 이는 내생 단백질 분해 효소에 의해 처리되고 락토페린은 영양배지로 분비되고, 이로부터 분리한다.
곰팡이 영양배지로부터 락토페린을 분리하는 방법에 대해 상술하고 있는데 이때, 플라스미드 벡터는 A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터, A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 서열, A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자의 5' 부분, Kex2 펩티다제 절단부위를 인코드하는 링커 서열, A. 나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열과 플레오마이신 저항성 선택성 표식 유전자를 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 5'에서 3'로 연결되는 다음의 성분으로 구성된 신규한 재조합 발현 프라스미드 벡터에 관계하는데;
1) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자에서 기인된 프로모터;
2) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자에서 기인된 시그날 서열
3) A. 아와모리 글루코아밀라제 유전자와 같은 5' 부분에서 발현된 내생유전자;
4) Kex2 펩티다제 절단 부위를 코딩하는 링커서열;
5) 사람 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
6) A 나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고
7) 플레오마이신 저항성 선택성 표식 유전자.
본 발명은 또한, 사람, 소 또는 돼지 락토페린과 이의 치환 유사체 또는 락토페린의 일부, 특별하게는 천연 락토레린의 효소 절단으로부터 이용될 수 없는 부분과 유사성을 가지는 생물학적 활성 폴리펩티드를 코드하는 대립 유전자 변이체의 cDNA의 완전한 서열과 부분 서열을 생산하는 것으로 구성되는데 그 방법은 부분적인 cDNA 서열 발현을 이용하여 폴리펩티드를 만들고 이 발명의 방법에 의해 생산된 폴리펩티드 산물이다. 바람직한 부분 서열은 도 13, 14, 15에서 나타낸 바와 같은 절단부위에서 제한 효소 절단에 의해 생산될 수 있다. 도 13내지 15에서는 각 사람, 소와 돼지 LF cDNA 서열의 제한 효소 절단 부위를 나타낸다. 부분 서열은 또한 PCR증폭, 절단, 연결, 합성에 의해 또는 본 기술 분야에 공지인 다른 방법을 이용하여 합성, 수득될 수 있다.
돼지 락토페린 (Lydon, J. P., et al., Biochem. ACTA, 1132:97-99 (1992); Alexander, L.J., et al., Animal Genetics, 23:251-256 (1992)과 소락토페린(Mead, P. E., et al., Nucleic Acids Research, 18:7167 (1990); Pierce; A., et al., Eur: J. Biochem., 196:177-184 (1991)의 cDNA 서열은 이미 결정되어 문헌에서 보고된 바 있다. 돼지와 소 락토레인의 cDNA 서열을 포함하는 참고문헌이 본 출원에 참고문헌으로 제시되어 있다.
락토페린으로부터 유도된 폴리펩티드 단편은 생물학적 활성이 있는 것으로 알려져 있고 이는 본 발명의 방법에 의해서도 생산될 수 있다. hLF의 살균도메인을 포함하는 N-단부 사람 락토페린 단편은 고유 hLF의 펩신 절단으로 분리할 수 있다 (Bellamy, W.M., et al., Biochem. Biophys. ACTA, 1121:130-136 (1992). 합성 23 과 25개 아미노산 폴리펩티드가 합성되었고 펩신 절단에 의해 유도된 단편과 유사한 활성을 가지는 것을 알 수 있다. 합성 펩티드의 상세한 합성, 수득률과 순도는 보고된 바 없다. Bellamy et al은 천연 산물로부터 분리한 오염물질이 없는 소 또는 사람 락토페린 폴린펩티드의 대량 생산 과정을 제공하지 못하였다. 이와 같은 폴리펩티드 단편은 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있고 이는 구체예에서도 볼 수 있다.
다음의 설명에서 아미노산 서열과 이에 상응하는 cDNA 서얼은 다음 참고 문헌에 있다:
(a) Powell, et al., Nucleic Acids Research, 18(13) : 4013 (1990: mammary);
(b) Rey, et al., Nucleic Acids Research, 18(17): 5288 (1990: mammary);
(c) Rado, et al., Blood, 70(4): 989-993 (1987; neutrophil);
(d) Stowell, et al., Biochem, J., 276-349-355 (1991);
(e) Panella, et al., Cancer Research, 51:3037-3043 (1991; mammary); and
(f) Johnston, et al., Blood, 79(11): 2998-3006 (1992; leukemic).
상기 서열 중에 하나 또는 이들 서열 중에 변형된 형태 역시 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 적절한 서열은 본 발명자에 의해 GenBank에서 보고된 폴리펩티드 서열을 가지는 것으로써 모두 여기에서 보고된 바 있다.
본원발명은 보건 국에서 제공하는 Grant No. HD27965하에 정부의 지원 하에 이루어졌다. 따라서, 정부는 본원 발명에 특정권리를 가진다.
관련출원
본 출원을 1993년 10월 28일자 출원된 연속 출원 U.S. 08/145,681의 연속출원이고 이는 1992년 10월 27일자 출원된 연속출원 07/967,947의 연속출원이며 이는 1989년 5월 5일자 출원된 07/348,270의 연속출원이나 이는 현재 포기되었다. 미국출원 08/145,681 또한 1994년 5월 27일자 출원된 미국 출원 08/250,308의 연속출원이고 이는 1992년 4월 24일자 출원된 07/873,304의 연속출원이나 포기되었다. 전술한 모든 특허 문서는 이들 출원의 도면과 실시예에 특히 참고되어 여기에 기술하고 있다.
본 발명은 철-결합된 당단백질과 관련 폴리펩티드 즉 락토페린에 관계한다.좀더 구체적으로는 본 발명은 아스퍼질러스 특별히 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 나이져(niger)와 오리자(oryzae)에서 다양한 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편의 재조합 생산에 관계한다.
첨부된 도면과 이를 설명하는 실시예에서 전술한 본 발명의 특징, 장점, 목적 그리고 다른 것들이 명백하게 설명하고 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부이다.
그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 특정 구체예에서 설명하나 본원 발명을 이에 한정하지는 않는다. 본 발명은 다른 동등한 구체예도 인정한다.
도 1 에서는 "pPLF-19"로 지정한 아스퍼질러스 아와모리에서 발현할 수 있는 hLF cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 구조를 나타낸다. 이 도면에서 사용된 약어는 다음과 같다: Apr: 암피실린 저항성, hLF: 사람 락토페린, GA: 글루코아밀라제, PGA: 글루코아밀라제의 프로모터; GA 3'UTR: 글루코아밀라제 3' 해독안된 부분; s.s.:시그날 서열; phleo r: 플레오마이신 저항성 유전자. 실시예 4에서 이 벡터의 구조를 상세히 설명한다.
도 2 에서는 pPLF-19를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리의 생장 배지로부터 정제한 재조합 hLF(500 ng)의 SDS-PAGE이다.
도 3 에서는 pPLF-19를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리 형질도입체의 성장 배지로부터 정제한 글리코실화된 (1 ㎍) 그리고 탈-글리코실화된 재조합 hLF (1㎍) 그리고 탈-글리코실화된 재조합 hLF(1㎍)의 웨스턴 블랏이다.
도 4 에서는 A. 아와모리에서 재조합으로 생산된 hLF의 처음 10개 아미노산의 N-단부 서열을 나타낸 것이다.
도 5 에서는 표준과 재조합 hLF연구에서 철 결합과 포화 결과를 나타낸 것이다.
도 6 에서는 표준과 재조합 hLF의 철-결합에 대한 pH안정성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 은 대장균 0111에 대한 천연과 재조합 hLF의 항균작용을 나타낸 것이다.
도 8 은 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri)에 대한 천연과 재조합 hLF의 항균작용에 대한 연구결과이다.
도 9 는 시간에 따른 치사연구에서 쉬겔라 플렉네리 (Shigella flexneri)에 대한 천연과 재조합 hLF의 항균작용 결과를 나타낸 것이다.
도 10A 와 10B 에서는 아스퍼질러스 아와모리 발현 셔틀 벡터 pPLF-26의 고안, 중간 생성물 그리고 구조의 대략적인 것을 나타내었다. 이들 도면에서 모든 제한효소 부위를 나타낸 것은 아니다.
도 11 에서는 클로닝을 위해 유일한 Not1와 EcoRI부위를 가지는 공통적인 셔틀 벡터 pPLF-26을 상세히 설명한 것이다.
도 12 에서는 유일한 NotI와 EcoRI 부위 존재를 확인하기 위해 다양한 제한 효소로 pPLF-26과 pPLF-19를 절단한 결과와 플라스미드 방향을 나타낸 것이다.
도 13 에서는 사람 LF cDNA서열의 제한 효소 절단 부위를 나타낸 것이다.
도 14 에서는 소 LF cDNA서열의 제한 효소 절단 부위를 나타낸 것이다.
도 15 에서는 돼지 LF cDNA서열의 제한 효소 절단 부위를 나타낸 것이다.
도 16A 에서는 A. 오리자에서 생산된 재조합 hLF의 웨스턴 면역 블랏 분석을 나타낸다.
도 16B 에서는 16A에서와 같은 중복 샘플의 은-착색된 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 16C 에서는 A. 오리자에서 생산된 재조합 hLF의 N-단부 아미노산 서열을 나타낸다.
정의
본 발명의 설명을 위해, 다음의 용어들을 본 발명의 이해에 도움이 되고자 정의한다.
"트랜스페린 족"은 혈청 트랜스페린, 오보트랜스페린과 락토페린을 포함하는 철 결합 단백질 집단을 의미한다. 이들 단백질을 모두 구조적으로 연관되어 있다.
"락토페린"은 우유나 다른 분비물에서 발견될 수 있는 트랜스페린 족의 구성분이다. 락토페린은 78 KDa 철-결합 단백질이다.
또한 "도메인"은 철-결합, 살균성, 수용체 결합, 면역자극과 같은 특정기능에 영향을 주는 분자의 전부 또는 일부를 포함하는 락토페린 단백질 또는 락토페린폴리펩티드의 기능적 단편을 의미한다.
"폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드들"은 작은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하기 위해 몇 개의 아미노산이 서로 결합된 것을 의미한다.
"치환 유사체" 또는 "대립 형질 변이체" 등은 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산을 나타내는 하나 이상의 코돈이 상이한 DNA 서열로 동일한 아미노산 서열을 가지는 또다른 코돈에 의해 대체될 수 있는 것을 말한다. 여기에서 "치환 유사체" 또는 "대립형질 변이체"는 단백질의 생물학적 활성을 유지하면서 사람과 다른 포유류 단백질에서 대립형질 변이를 발생시키는 것으로 알려진 소수, 일반적으로 5 이하의 아미노산 구조의 단백질 또는 폴리펩티드이다. 아미소산 치환체는 대립형질 변이 때문에 몇 가지 공지의 hLF cDNA의 서열에서 보고된 바있다. 도 16에서 이와 같은 것을 상세히 설명하고 있다.
"벡터"는 락토페린 cDNA의 삽입, 증식 그리고 발현을 시키는 플라스미드, 코스미드, 파아지 또는 다른 담체를 의미한다.
"숙주"는 락토페린 발현을 허용하는 임의 세포를 말한다.
"프로모터"는 락토페린 cDNA의 전사를 제어하는 조절 DNA서열을 의미한다.
"다중 클로닝 카세트"는 다양한 cDNA의 삽입을 허용하는 다양한 효소의 독특한 제한 효소 절단 부위를 포함하는 DNA단편을 말한다.
"형질도입"이란 세포에 의해 이형 DNA서열의 발현을 허용하기 위한 결합이다.
"철 결합 능력"이란 Fe에 결합할 수 있는 능력을 말한다. 완전한 기능상 사람 락토페린은 LF 분자당 2개의 철원자가 결합할 수 있다.
"생물학적 활성"은 철에 결합할 수 있는 능력 또는 미생물을 죽이는 능력 또는 미생물의 성정을 지연시키는 능력 또는 철을 단백질로 이동시키는 능력 또는 특이적 수용체에 결합하는 능력, 면역 반응을 자극하는 능력 또는 골수 형성을 조절하는 능력에 의해 측정된 락토페린의 기능활성을 의미한다.
본 발명에 유용한 프로모터는 락토페린 cDNA의 전사를 조절할 수 있는 것이면 된다. 적절하게는 프로모터는 알코올 디하이드로게나제, α-아밀라제와 글루코아밀라제 유전자에서 선택된다. 따라서, 본 기술분야에서 많은 상이한 프로모터가 이용될 수 있으나, 본 발명에서는 A. 아와모리에서 분리한 글루코아밀라제 프로모터를 이용하였다.
많은 상이한 시그날 서열과 이의 소스가 본 기술 분야에 공지되어 있으나 본 발명에서는 A. 아와모리에서 유도된 글루코아밀라제 유전자의 5' 부분과 글루코아밀라제 시그날 서열을 사용하였다.
본 방법에 유용한 시그날 서열은 바로 발현되는 내생 유전자의 코딩 부분의 일부와 함께 해독 개시 코돈과 분비 시그날을 포함하는 것이면 된다.
본 발명에 유용한 링커서열은 임의 단백질 분해성 효소, 적절하게는 Kex2 펩티다제 인지서열에 대한 인지서열을 포함하는 것이면 된다.
본 발명의 방법에 유용한 전사 종료 서열은 락토페린 mRNA 전사체를 정확하게 종료하고 안정화시키는 것을 허용하는 것이면 된다. 적절하게는 전사 종료 서열은 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 알코올 디하이드로게나제 또는 benA 유전자로부터 유도된다. 따라서 많은 상이한 전사 종료 서열이 이 분야에 공지되어 있으나 발명자는 A. 나이져로부터 기인된 3' 해독안된 부분을 이용한다.
본 발명의 방법에 유용한 선택성 표식 유전자는 락토페린 cDNA 플라스미드로 형질도입된 세포의 분리를 허용하는 것이면 된다. 적절하게는 선택성 표식유전자는 pyr4, pyrG, argB, trpC, amdS 또는 플레오마이신 저항 유전자에서 선택된다. 따라서, 많은 상이한 선택성 표식이 본 기술분야에 공지되어 있으나 본 발명에서는 플레오마이신 저항성 유전자를 이용하였다.
또한, 락토페린 단백질의 재조합 생산은 적절한 구체예에서 설명된다. LF는 여러 방법으로 생산될 수 있는데; 아스퍼질러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 세르비시에 (Saccharomyces cerevisias), 클루베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactic) 또는 피치아 파스토르시스 (Pichia pastorsis); SFP와 같은 곤충 세포; 그리고 Cos 세포와 같은 포유류 세로에서 생산될 수 있다.
본 발명에서 유용한 세포, 적절하게는 진핵 세포는 벡터, 적절하게는 락토페린 cDNA로 구성된 플라스미드의 삽입과 락토페린 cDNA의 발현을 허용하는 것이면 된다. 적절하게는 진핵 세포는 필라멘트성 곰팡이 세포 또는 곤충세포가 된다. 본 발명의 방법에는 SF9와 같은 곤충 세포가 유용하다. 더욱 적절하게는 세포는 곰팡이 아스퍼질러스 세포이다. 더욱 적절하게는 본 발명에 유용한 진핵 세포는 A. 오리자, A. 나이져, A. 니듈란과 A. 아와모리와 같은 아스퍼질러스 균주가 된다.
hLF와 유추된 아미노산을 인코드하는 cDNA서열의 확인은 다중 확인 과정에 의해 증명된다 이는
1. 다중 서열 분석.
2. 항-hLF항체를 이용하여 양성 확인하는 cDNA로부터 hLF단백질의 전사와 해독이 된다.
hLF를 인코드하는 cDNA서열은 재조합 사람 락토페린을 준비하는데 이용될 수 있고 따라서, 치료요법적 그리고 영양학적 응용을 위해 단백질원으로 이용될 수 있다. 확인된 cDNA 서열은 cDNA 서열을 복제하기 위해 적절한 클로닝 담체에 이용된다. 또한, cDNA은 사람 락토페린 생산용 벡터 시스템내에 결합될 수 있다. 다른 락토페린 DNA서열은 소, 돼지, 말 또는 다른 락토페린을 제공하기 위해 사람 락토페린 cDNA 서열에 대체될 수 있다. 부분적인 cDNA 서열은 바람직한 락토페린 유도된 폴리펩티드를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 발현 시스템은 자연발생적인 락토페린의 효소 절단에 의해 이용할 수 없는 락토페린 유도된 폴리펩티드를 제공하는데 이용된다. 본 발명은 또한 아스퍼질러스 세포에서 락토페린과 락토페린 관련된 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 우유 또는 다른 천연 원으로부터 분리된 락토페린 오염물질인 락토페옥시다제, 라이소자임 또는 다른 단백질이 없는 락토페린의 생산을 허용한다. 본 발명은 사람 cDNA 서열의 특정 용도 또는 적절한 DNA 서열로부터 다른종의 락토페린 생산에 제한하지는 않는다.
재조합 기술에 의해 유도된 단백질인 재조합 LF는 다양한 용도에 이용될 수 있다. 사람 유전자는 소와 다른 농업적으로 중요한 동물과 같은 포유류에 전달되고 우유에서 발현된다. 동물의 우유에서 락토페린 유전자의 결합과 발현은 돼지새끼에서 철 결핍과 싸우게 된다. 발현에 락토페린 유전자의 함유는 박테리아와 바이러스 감염에 저항성이 있는 동물질병을 개선할 수 있다. 포유류에서 사람 락토페린의 조직 특이적 발현은 우유를 공급받는 어린 동물에서 발현된 유전자의 정균과 바이러스 제거 장점을 제공하고 치료요법적 용도를 위해 분비된 단백질의 생산수단을 제공한다.
본 발명의 재조합 방법에 의해 생산된 LF는 철 운반과 수송을 강화하기 위해 치료요법적 첨가제로써 사람 또는 동물 식품을 포함한 다양한 생성물에 이용되거나 그리고 안약, 콘택트 렌즈 그리고 다른 눈을 보호하는 용액, 국소 피부 보호 생성물, 귀약, 구강세척액, 추잉검과 치약에 첨가제로써 바이러스 제거와 살균물질에 이용될 수 있다. 제조합 LF는 국소적으로 이용되거나 안전하게 섭취할 수 있는 안전하고 자연 발생적인 생성물을 제공한다. 살균성 락토페린 폴리펩티드는 전술한 생성물에서 방부제로써 치료요법적 항-감염제로써 유용한다. 철 결합 폴리펩티드는 철 또는 다른 금속 이온 운반 단백질로 영양과 치료요법적 용도로 유용하고 전술한 형태의 생성물에 특히 정균과 살균제로써 이용될 수 있다. 각 단백질은 영양보충과 아미노산과 금속 원으로 이용될 수 있다.
재조합 사람 락토페린을 생산하는데 이용되는 플라스미드 발현 벡터의 상이한 성분들은 하기에 제시하고 있으나 이에 특정형에 한정하지는 않는다. 많은 상이한 프로모터가 본 기술 분야에 공지되어 있으나 본 발명에서는 A. 아와모리에서 분리된 글루코아밀라제 프로모터를 이용하였다. 많은 상이한 시그날 서열과 이와 같은 시그날 서열의 소스에 대해서 본 발명에서는 공지된 바 있으나 본 발명에서는A. 아와모리에서 유도된 글루코아밀라제 유전자의 5' 부분과 글루코아밀라제 시그날 서열을 이용한다. 많은 상이한 링커 서열이 본 발명에서 공지되어 있으나 본 발명에서는 Kex2 펩티다제 절단부위를 코드하는 합성 링커를 이용한다. 많은 상이한 전사종료서열이 본 기술분야에 공지되어 있으나 본 발명에서는 A. 나이져에서 기인된 글루코아밀라제 유전자의 3' 해독 안된 부분을 이용한다. 많은 상이한 선택성 표식은 본 기술분야에 공지되어 있으나 플레오마이신 저항 유전자를 본 발명에서는 이용한다.
본 기술에 숙지된 자는 다양한 상이한 변수가 본 발명에서 생산된 다량의 양질 락토페린에 영향을 주지 않으면서 변형될 수 있다. 다음에서는 생산될 락토페린의 질과 양에 영양을 주지 않으면서 변경될 수 있다; 온도; pH; 요구되는 영양소; 대량 생산 고려; 사용된 자비형태; 이용된 산소/공기 비율; 교반된 시스템과 정적 시스템의 이용; 수득 시간 등이 된다.
상이한 성장과 생산조건은 아스퍼질러스 아와모리에서 재조합 사람 락토페린의 발현에 이용될 수 있다. 다음의 설명에서 아스퍼질레스 아와모리에서 hLF의 발현에 이용될 수 있는 다양한 조건을 설명하기 위한 목적이나 본 발명은 어떠한 형태에 한정시키지는 않는다. 하기에는 배양 생산과정과 생산된 락토페린을 회수하는데 이용되는 공정의 일반적인 과정을 나타낸다. 본 기술에 숙지된 자는 소요의 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드의 생산을 강화시키기 위해 약간의 방식으로 수정되거나 변화될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 설명하기 위함이나 이에 본 발명을 어떤 형태로는 제한하지는 않는다.
실시예 1
아스퍼질러스 아와모리에서 재조합 사람 락테페린의 발현을 위한 발현 벡터 pPLF19 의 작제
이 실시예는 아스퍼질러스 아와모리에서 재조합 사람 락토페린을 발현하는데 이용되는 발현벡터의 작제를 설명하는 것이다.
I. 균주. 플라스미드, 효소와 배지
A. 박테리아와 곰팡이 균주
아스퍼질러스 아와모리 균주 ATCC 22342 는 사람 락토페린의 이형 발현에 대한 숙주 균주이다. 사람 락토페린 발현벡터, pPLF=19 를 작제하는데 대장균 DH5α를 이용하였다.
B. 플라스미드
플라스미드 pUC119 와 pGEM4(Promega, Medison, WI)는 사람 락토페린 발현 플라스미드 pPLF-19 의 최종 작제를 위해 다양한 클로닝 단계를 이용한다.
이스트 사이토크롬 C1 종료물질과 결합된 플레오마이신 저항 유전자(스트렙토알로테이쳐스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus))으로 부터 플레오마이신 결합 단백질 유전자)를 포함하는 플레오마이신 저항벡터 pLO-3는 플라스미드 pUT713 (CAYLA, Toulouse-Cedex, FR)로 부터 유도하였다.
이는 A. 나이저로 부터 β-튜블린 프로모터에 의해 곰팡이에서 발현된다.
C. 효소
제한 효소는 New England Biolabs(Berely, MA)에서 구하고, T4 라이가제, T4 폴리머라제, T4 카이나제 그리고 대장균 DNA 폴리머라제, T4 카이나제 그리고 대장균 폴리머라제 I 으로부터 클리나우 단편은 Bethesda Research Laboratories(BRL, Gaithersbur, MD)에서 구입하였다. Mung Bean 뉴클레아제(Nuclease)는 Stratagene(La Jolla, CA)애서 수득하였다. Tag 중합효소는 Promega Corporation (Medison, WI)에서 구입하였다. 플라스미드의 DNA 서열화는 Sequence Version 2.0 T7 DNA 중합효소와 키트를 이용한다. (United Stated Biochemicals, Cleveland, OH). Novozym 234, 스페로플라스트 효소는 Novo BioLabs (Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였다.
D. 일반적인 성장배지
대장균 균주는 L-배지 (Difco, Detroit, MI)에서 생장시켰다. 박테리아 형질변환체는 1.5% 한천과 125㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 L-배지 플레이트에서 생장시킨다. 액체에서 A. 아와모리의 성장을 위한 완전 배지(CM)는 50㎖ 20×Clutterbuck's dua(120g Na2NO3, 10.4g KCl, 10.4g MgSO4, 7H2O, 30.4g KH2PO4), 2.0ml Vogel 잔류원소(1ℓ증류수내에 0.3M 스트르산, 0.2M ZnSO4, 25mM Fe[NH4]2[SO4]2, 6H2O, 10mM CuSO4, 3mM SO4 2-, 8mM 보린산, 2mM Na2MoO4, 2H2O), 5.g 트립톤, 5.0g 이스트 추출물, 10g 포도당)로 구성된다. 1.5% 한천은 CM 슬랜트에 첨가된다. PDA 슬랜트에는 물에 39.0g/L 감자 덱스트로스 한천, (Difco, Detroit,MI), 10.0g/L 포도당, 10.0g/L 한천, 0.1g/L MgSO47H2O, 0.12g/L KH2PO4, 0.25g/L(NH4)2HPO4를 포함한다.
A. 아와모리 락토페린-생산 형질변환체는 KT-4 배지에서 생장시킨다; 150g/L 말토즈, 60g/L 두유, LF, 79.8g/L C6H5O7Na2.2H2O, 15g/L [NH4]2SO4, 1.0 g/L NaH2PO4, 2.05g/L MgSO47H2O, 1.0ml/L 트윈80, 2.0ml/L 안티포옴 204; Dunn-Coleman et al., 1991, Bio/technology 9: 967-981.
E. ATCC 세포기탁
다음의 형질 도입된 균주는 특허 출원을 목적으로 미생물 기탁의 국제적인 승인을 위한 부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection 에 1994년 7월 8일 출원인이 기탁하였다;
"Awa LF 24-1"은 사람 락토페린을 인코드하는 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pPLF-19로 형질도입된 아스퍼질러스 아와모리이다.
기탁번호는 ATCC 74290이다. 출원인은 또한 본 출원에서 청구하는 출원인의 권리에 밀착된 제 3 자를 제외하고 제한없이 기존의 법률과 규약에 부응하는 미국특허 출원의 특허를 받기위한 제 3 자에 제한없이 이와같은 기탁물의 이용을 제한하지 않는다.
II. 방법.
A. 사람 락토페린 발현 플라스미드의 작제
다음의 플라스미드는 최종 발현 플라스미드 pPLF-19의 선구물질로 작제된다.pPLF-19 구조의 다이아그램은 도 1 에 나타내었다. 도면에 사용된 약어는 다음과 같다; Apr: 암피실린 저항성; hLF; 사람 락토페린 ; GA: 글루코아밀라제: pGA; 글루코아밀라제의 프로모터; GA 3'UTR; 글루코아밀라제 3'해독안된 부분: S.S; 시그날 서열; phleo r; 플레오마이신 저항 벡터.
pPLF-1
hLF cDNA 는 pGEM4hLFc 로 부터 2.3kb Sac/Hind III 단편을 떼어내어 벡터 pUC-19내에 서브클론한다. 서브클론은 원치않은 NgOMI 부위를 포함하는 pGEM4 로부터 cDNA를 제거하기 위해 만들어진다.
pPLF-2
hLF 의 5'단부는 글루코아밀라제(GA)프로모터와 시그날 서열의 추가에 사용될 수 있는 유일한 NgoMI 부위를 유도하기 위해 수정될 수 있다. 유일한 ACCI 부위에 성숙한 락토페린 코딩 서열의 5' 단부까지 이어지는 270 bp 단편의 PCR 증폭을 통하여 이루어진다. 프라이머는 아래와 같고, 각각 SEQ ID NO 1 와 2 에서 나타내었다.
270 bp 단면은 다음의 조건하에 Promega's Tag 중합효소를 이용하여 증폭하였다. 1.25 내지 5mM MgCl2; 0.5μM 각 프라이머(5hLFFW 와 5hLFRV); 주형으로 10ng pGEM4hLFc. Perkin Elmer 9600 Thermocycler에서 순환: 1 @ 2 min, 96℃; 30 @ 20 sec, 96℃/20sec, 55℃/20sec 72℃; 1 @ 5 min, 72℃.
단편은 아가로즈로부터 분리하고, 효소적으로 절두하고 포스포릴화하고 그리고 SmaI 으로 절단된 pUC19 에 서블클론하여 플라스미드 pPUC270 을 만든다. 증폭된 생성물의 서열은 M13 보편적인 전방 그리고 후방 프라이머를 이용하여 확인할 수 있다. 단편은 Kpn/AccI 단편으로써 pPUC270 에서 제거하고 pPLF-1 의 Kpn/AccI 다편을 대체하는데 이용된다. 생성된 플라스미드는 pPLF-2 로 명명한다.
pPLF-6
hLF 의 마지막 176p 와 GA 3' 해독안된 부분(UTR)의 160bp를 가지는 280 bp EcoRI/PstI 단편은 벡터 PAhLFG(+1)으로 부터 pUC19로 절단된 EcoRI/PstI 내로 서브클론한다.
pPLF-7
pPLF-2 의 변형된 hLF 유전자는 EcoRI 단편으로써 벡터 pPLF-6 로 서브클론한다. 정확한 방향의 플라스미드(pPLF-7)은 전체 길이의 성숙한 hLF 서열과 GA 3'UTR 바로아래 160bp 와 유일한 NgOMI 부위를 바로위에 가진다. GA 프로모터와 시그날 서열은 이와같은 벡터에 첨가될 수 있다.
GA 프로모터와 시그날 서열은 A. 아와모리 균주 ATCC 22342 로 부터 분리한 게놈 DNA 로 부터 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
전방 프라이머는 GA 시그날서열의 약 1.1kb 상류 SacI 부위까지 연장된다. 이와같은 프라이머 서열은 ATCC 1084 의 공지서열로부터 만들 수 있고 각 SEQ ID NO 3 와 4 에서 볼 수 있다.
역 프라이머는 hLF 에 부착하기 위해 NgoMI 부위에 결합된다.
정확한 크기의 단편(1.1kb)는 다음의 조건을 이용하여 ATCC 22342 게놈 DNA에서 증폭시킬 수 있다; 2.5mM MgCl2; 0.5μM 각 프라이머(GAFW 와 GARV) 그리고 100ng 게놈 DNA. 순환 파라메트는 1@2 min, 95℃; 30@30 sec, 95℃/30 sec 60℃/45 sec, 72℃; 그리고 1 @5 min 72℃ 로 조정하였다.
증폭된 생성물은 절두하고, 포스포릴화하고 SmaI 으로 절단한 pUC-19 로 서블클론한다. DNA 서열은 GA 시그날 서열로 이어지는 증폭의 충실성을 체크하기 위해 증폭된 단편의 3'단부로 부터 만들어진다. 증명된 서열로의 클론은 GA 프로모터와 s.s. 단편의 원액으로 이용된다.
pPLF-9
pPLF-9 벡터를 제공하기 위해 SacI/NgoMI 단편으로써 벡터 pPLF-7 에 PCR 증폭된 GA 프로모터와 시그날 서열을 연결한다. 한 방향으로된 결합에 의해 발생된서열은 분명한 결합을 증명하여 준다.
pPLF-18
최종 GA 발현 플라스미드는 GA 프로모터, 시그날 서열, hLF에 융합된 프로-글루코아밀라제의 498 a.a.을 코딩하는 서열을 포함한다. 이가-염기 KEX-2 인지 서열에서 종료되는 글루코아밀라제 프로-헥사펩티드는 GA 와 hLF 서열사이에서 만들어진다. 내생 GA 분비과정에 의해서는 키메라 단백질이 더 잘 인지되어 상당히 높은 분비역가를 가지는 hLF 를 만들게 된다. KEX-2 링커는 GA 로 부터 hLF 의 정확한 처리를 허용한다.
pPLF9는 NgoMI 우선 절단된다. 단부는 클리나우 단편을 이용하여 dCTP 로 채운다. Mung bean 뉴클레아제는 인-프레임 단백질 융합을 할 수 있도록 절두형 단부를 제공하기 위해 나머지 5'부분을 제거하는데 사용된다. 벡터는 하기에서 상술하는 것과 같이 PCR 증폭된 GA 서열을 수리하기 위해 NSiI 으로 절단한다.
소요의 GA 단편을 인코드하는 단편은 SEQ ID NO. 5,6,7 에서 각각 볼 수 있는 프라이머와 함께 균주 ATCC 22342 로 부터 PCR 증폭시킨다.
이와같은 전방 프라이머는 공지의 ATCC 22342 (NRRL 3112) GA 상류 서열의 염기 1-18로 연장된다(Nunberg et al. Mol Cell Bio 1984, p 2306-2315). 이와 같은 서열은 작제에 이용되는 독특한 NstI 부위의 약 50bp 상류에 있다.
이와 같은 역 프라이머 서열은 492-498을 인코드하는 pro-GA 서열의 상보체와 서열을 인코드하는 pro-헥사펩티드(밑줄 부분)에 삽입된 상보체이다.
2.0kb 단편은 Tag 중합효소를 이용하여 PCR 증폭된다. 2.5mM MgCl2는 최상의 증폭을 제공하기 위해 결정된다. 단편은 클리나우로 절두형으로 만들고 증폭으로 부터 남겨진 꼬리 단부를 제거하게 된다. 절두형 단편은 NsiI 으로 절단하고 NsiI/절두 단편으로써 조작된 벡터 pPLF-9 (상기)내로 서브클론시켜 플라스미드 pPLF-18을 제공한다. 서열은 디-데옥시 서열화 작업을 통하여 GAf/KEX-2/hLF 결합을 통하여 증명한다.
pPLF-19
CAYLA 벡터 pUT713(스트렙토알로 타쳐스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus) ble 유전자)로 부터 유도된 그리고 A. 나이져 튜블린 프로머터(pPLO-3)으로 부터 발현된 플레오마이신 저항표식은 2.3kb HindIII 단편인 pPLF-18에 첨가하여 최종 발현 플라스미드 pPLF-19를 제공한다.
B. 아스퍼질러스 아와모리 균주 ATCC 22342 의 DNA 형질도입
아스퍼질러스 아와모리 ATCC 22342 는 Tilburn et al, 1983, Gene 26: 205-221의 수정된 과정에 의해 원형질화화고 형질도입시킨다. 30℃ 4 내지 7일간 완전 배지(CM) 슬랜트에서 생장시킨 A. 아와모리 ATCC 22342 의 조건 배양물은 2ml NP40 물(0.005% Nonidet - 40)으로 문질러 포자현탁액을 만든다. 1ml 포자현탁액(1×108포자)는 50ml CM을 첨가하고, 30℃ 200rpm 22시간동안 배양시킨다. 균사체는 올이 성긴 이중 무명층을 통하여 여과에 의해 수득하고 5mg/ml 노보자임 234(Novo Biolabs, Bagsvaerd, Denmark)과 함께 50ml KCM 완충액(Cantoral, et MOPS, pH 5.8)에 첨가하고 원형질체 형성을 위해 30℃, 90rpm 12시간 배양하였다.
원형질체는 miracloth(Calbiochem; La Jolla, GA)로 채워진 그리고 올이 성긴 무명천으로 덮은 깔데기를 통하여 여과시키고 4개의 15ml 원뿔형 원심분리 튜브에 넣고 벤취-탑 원심분리기에서 10분간 1800 rpm 으로 회전시킨다. 펠렛은 15ml KCM 완충액으로 서서히 재현탁 시키고 다시 원심분리시킨다. 펠렛은 다시 15ml KCM 완충액으로 세척하고 KCMC 완충액(KCM+50mM CaCl2)에 재현탁시켜 최종 밀도가 5×107세포/ml 이 되게 한다.
20㎕ TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 5㎍ pPLfF19 플라스미드 DNA 는 200㎕ 원형질액에 첨가하고 그리고 50㎕ PCM(Canoral et al; PCM: 40% PEG 8000, 10mM MOPS, pH 5.8, 50mM CaCl2는 사용전에 첨가한다)는 DNA -원형질체 혼합물에 피펫하고 30분간 얼음에서 배양시킨다.
새로 준비한 PCM 1ml 은 형질 도입된 혼합물에 첨가하고 혼합물은 50ml Regeneraton Agar (CM + 1.3M Mannitol, 3% agar)에 넣고 50℃로 냉각하여 5개 배양접시로 나눈다.
원형질체는 동량의 OL+120㎍/ 플레오마이신(OL; 1% 펩톤, 1% 한천; 120㎍/㎖ 플레오마이신 (OL; 1% 펩톤, 1% 한천; 플레오마이신 [CAYLA; Tonlouse, FR])으로 깔기전에 30℃에서 3 내지 5시간 동안 재생시킨다. 가상 형질변환체는 125-150㎍/㎖ 플레오마이신을 포함하는 PDA 슬랜트로 옮긴다.
C. 아스퍼질러스 아와모리에서 사람 락토페린 발현의 배향 조건
가상 HLF-생산 형질 도입체로 부터의 포자는 선택성 PDA 슬랜트로 부터 CM 슬랜트로 옮기고 30℃에서 4일간 생장시킨다. 분생자기는 슬랜트를 1.5ml NP40 물로 긁어내어 수득하고 몇방울의 1×108포자는 250ml 플라스크에 KT-4 배지 30ml 에 첨가한다. 배양물은 30℃ 200rpm 에서 6일간 배양한다. 락토페린 샘플은 15분간 3000 rpm 에서 1ml 발효배지에서 원심분리하여 수득하고 보유된 상층액을 검사한다.
D. 사람 락토페린 검사
락토페린은 Vilja et al, 1985, J. of Imm. Methods 76: 73-83 에 의해 개발된 비-경쟁적 아비딘-바이오틴 면역검사의 변형방법에 의해 정량화할 수 있다. 96-웰 미량적정 플레이트(U-바닥 마이크로 테스트 III; Baxter, Chicago, IL)는 코팅 완충액(0.1M 탄산나트륨/중탄산염, pH9.6)에서 100㎕ 0.1㎍/㎖ 토끼 항-사람 락토페린 항체(Sigma, St. Louis, MO)로 피복하고 4℃ 12시간 동안 교반한다.
그 다음날. 코팅용액을 제거하고, 플레이트는 실온에서 적어도 4시간 동안 250㎕ 희석 완충액 (1×PBS pH 7.4, 1% BSA [Fraction V. RIA grade, United States Biochemicals, Cleveland, OH] 0.05% 트윈 20) 으로 차단하기 전에 세척 완충액(1×PBS pH 7.4, 0.5% 트윈 20)으로 3회 세척한다. 희석 완충액은 제거하고, 100㎕ 희석된 발효샘플과 공지의 락토페린 표준은 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 발표 샘플로 부터 수득된 상충액은 미량적정 플레이트에 첨가하기전에 희석 완충액으로 1:1000 으로 희석한다. 락토페린 표준은 락토페린 완충액에 사람 락토페린(Sigma, St. Louis, MO) 1:1000ng로 희석되어 있다.
37℃에서 반응후에, 샘플을 버리고 플레이트는 세척 완충액으로 3회 세척한다. 1㎎/ml 원액으로 부터 희석 완충액과 1:7500으로 희석된 100㎕ 바이오티닐화된 항-HLF 항체, (Biotin-SP-Rabbit anti-hLF IgG, Jackson Immuno-Research Labs)는 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
용액은 버리고 플레이트는 100㎕ ABC시약(Vectastain ABC Kit, Vectro Labs, Burlingame, GA)을 첨가하고 1시간동안 37℃에서 플레이트를 배양하기전에 세척 완충액으로 3회 세척한다. Vectastain 시약 A 는 1:200 으로 희석하고, 시약 B는 두 용액을 복합하고 이들을 사용하기 전에 실온에서 1시간 선배양하기 전에 희석 완충액으로 1:400 희석한다.
용액은 버리고, 플레이트는 세척 완충액으로 5회 세척한다. 100㎕ OPD 기질용액(10㎖ 기질 완충액 [25mM 시트르산, 50mM Na2HPO47H2O, pH 5.0] 8㎎ O-페닐렌디아민 [Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD] 100㎕ 30% H2O2[Sigma, St. Louis, MO])를 첨가하고 플레이트는 실온에서 부드럽게 교반하면서 20분간 암배양시킨다. 발색후에 100㎕ 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 플레이트는 490nm 에서 읽고 락토페린 농도는 공지 표준과 비교하여 결정하였다.
실시예 2
아스퍼질러스 아와모리에서 hLF (pPLF-19)의 발현과 처리
사람 락토페린 발현 카세트 pPLF-19 는 A. 아와모리 22342 로 형질 도입시킬때 분비된 락토페린은 ELISA 검사와 웨스턴 블랏 분석에 의해 배지에서 감지한다. 하나의 형질 변환체, #19-254는 약 250㎎/ℓ 사람 락토페린(hLF)를 생산한다. 더욱 절절한 형질 변환체, Awa LF 24-1(ATCC 기탁번호 74290; #19-24.1)은 약 500㎎/ℓ 사람 락토페린을 생산한다. 수득률과 균주 발생을 개선하는 실험을 지속하여 A. 아와모리에서 재조합 hLF 생산을 증가시킨다. 최근에 발명자는 균주 Awa LF 24-1 을 포함하는 A. 아와모리 형질변환체에서 생산된 > 900㎎/ℓ hLF 역가를 수득한다. 결과를 하기 비교 생산표에서 볼 수 있다.
pPLF-19 발현 생성물은 글루코아밀라제 498개 아미노산과 KEX-2 절단부위에 의해 분류되는 hLF 의 완전한 코딩 부분으로 구성된 키메라 단백질이기 때문에 SDS-PAGE, 은-착색, 웨스턴 블랏 분석과 N-단부 서열화을 실시하여 단백질이 정확하게 프로세싱 되었는지를 확인하였다.
A. 아스퍼질러스 아와모리 형질변환체로 부터 정제된 재조합 사람 락토페린의 은-착색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석
재조합 사람 락토페린은 CM-세파덱스 C50을 이용하여 이온-교환 크로마토그래피(Stowell, K.M. et al., Biochem J., 276:349-355)에 의해 아스퍼질러스 아와모리의 생장배지로 부터 정제한다. 표준 사람 포유 LF(Std hLF)와 정제된 재조합 hLF(Rec hLF)는 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 은-착색한다. 이와 같은 분석결과는 도 2 에 나타내었다. 재조합 hLF 단백질은 프로세스된 hLF(라인 2)의 예상 크기부위로 이동되고 표준 hLF(라인 1)의 크기와 동일하였다. 좌측에는 분자량 표식의 위치한다.
B. 아스퍼질러스 아와모리 형질 변이체로 부터 정제된 글리코실화된 그리고 탈-글리코실화된 재조합 사람 락토페린의 웨스턴 블랏 분석
N-글리코시다제 F 처리안된 그리고 처리된 아스퍼질러스 아와모리 형질변이체의 생장 배지로 부터 재조합 사람 락토페린은 SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오즈에 옮기고 사람 락토페린(Sigma)에 대한 특이적 IgG를 이용하여 프로브한다. 이 분석 결과는 도 3 에 나타내었다. 처리안된 표준 모유 hLF 와 처리안된 재조합 hLF 의 비교에서 이들 단백질 모두 다 동시 이동한 것을 볼 수 있다. (도 3 라인 3과 1). N-글리코시다제 F는 탄수화물이 없는 작은 분자량의 펩티드를 만들기 위해 글리코실아민 결합을 가수분해하는 효소이다. N-글리코시다제 F 로 처리한 뒤에 표준 hLF 와 재조합 hLF 의 비교에서 이들 두 단백질이 똑같이 이동하는 것을 볼 수 있는데 이는 이들 두 단백질이 탄수화물에 유사하게 N-연결된 것이라는 것을보여준다.(도 3, 라인 4와 2)
실시예 3
N-단부 서열 분석에서 재조합 사람 락토페린이 아스퍼질러스 아와모리에서 정확하게 프로세스되었음을 확인하였다.
A.아와모리에서 생성된 재조합 hLF 가 정확하게 프로세스 되었다는 것을 확인하기 위해 재조합으로 생성된 hLF 의 N-단부 부분을 서열화하였다. 우선, 재조합 hLF 는 KEX-2 단백질 분해 절단부위를 코드하는 합성 링크에 의해 분리될 수 있는 A.나이져 글리코아밀라제 유전자(498-AA)의 촉매 부분에 융합 단백질로써 A.아와모리에서 발현된다. 그다음 재조합 hLF 는 CM-세파덱스 C50을 이용하여 생장 배지로 부터 정제하였다(Stowell, K.M. et al., Biochem J., 276-349-355). 재조합 hLF 가 N-단부에서 정확하게 프로세스되었는지를 결정하기 위해, 정제된 단백질의 처음 10개 N-단부 아미노산을 자동화된 Edman 분해과정(5㎍)을 이용하여 서열화한다. 이 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 재조합 단백질 서열은 사람의 젖 락토페린에서 이에 상응하는 아미노산과 동일하다. 여기에서 재조합 hLF 는 A.아와모리에서 KEX-2 단백질 분해 절단 부위에서 정확하에 프로세스되었다.
실시예 4
아스퍼질러스 아와모리에서 생산된 사람 락토페린의 기능적 분석
A. 표준과 재조합 hLF의 철 결합과 포화
락토페린은 LF 분자당 2몰 철이 결합할 수 있는 능력을 가지는 철이 결합된 당단백질이다. 재조합 락토페린에 의해 철의 결합이 포화되었는지를 알아보기 위해철-결합 검사를 실행하였다. 아포-락토페린을 만들기 위해 정제된 Rec hLF 와 사람 젖은 0.1M 시트르산, pH 2.0으로 그리고 H2O 에 대해 투석시킨다. 용액의 pH는 5mM 인산 나트륨을 사용하여 pH 7.6으로 서서히 상승시킨다. Fecl3;59Fecl3;NTA(400:1:8)의 농도를 증가시켜(0.5 에서 4.0 몰) 1㎖ 결합 완충액(0.025M 트리스, pH 7.8: 0.01M 중탄산 나트륨; 0.1m NaCl)에서 hLF(500㎍)에 첨가한다. 샘플은 30분간 실온에서 배양시킨다. 15ml 결합 완충액으로 균등화시킨 NAP-10 칼럼으로 통과시켜 철-결합된 hLF 를 결합안된 철과 NTA로 부터 분리한다. LF 에 결합된 철의 양은 액체 신틸레이션 카운트를 이용하여 정량화하였다. 이와 같은 분석결과는 도 5 에 나타내었다. 재조합과 표준 hLF 는 유사한 방식으로 철에 결합한다. 이와같은 철의 결합은 약량에 따라 달라진다. 또한 표준과 재조합 hLF 에 의한 철의 결합은 철과 락토페린이 2:1 몰비에서 포화된다. 일반적으로, 포화수준은 92.5% 최대결합이 된다. 이는 투석후에 락토페린에 결합이 이루어질때까지 초기 7.5% 철을 나타낸다. 본 발명을 위해, "표준 hLF" 또는 "전연 hLF "는 사람 젖으로 부터 분리된 또는 Sigma 로 부터 구입한 사람 락토페린이다.
B. 표준과 재조합 hLF의 철-결합에 대한 pH 안정성
표준과 재조합 hLF 에 철-결합의 pH 안정성을 결정하기 위해 59Fe-포화된 표준과 재조합 hLF(500㎍)은 결합안된 철을 제거하기 위해 4℃에서 48시간 동안 pH 7.0 내지 pH 2.0 범위의 완충액에 대해 투석시킨다(Stowell et al; Biochem J, 276: 349-59 (1991)). 투석후에 철이 결합된 hLF 샘플은 액체 산틸레이션 카운트를이용하여 정량화한다. 이 분석의 결과는 도 6 에 나타낸다. 표준과 재조합 hLF 로 부터 철의 pH-의존성 방출이 동일하다. 표준과 재조합 hLF 는 pH7-4 범위에서 대부분 철을 보유하고 pH 2.0에서는 기본적으로 철이 없었다.
C. 대장균 0111 에 대한 천연과 재조합 hLF 의 항균 작용
대장균 0111 에 대한 천연(표준)과 재조합 hLF 의 항균 활성은 시험관의 미량 적정 플레이트 검사를 이용하여 결정한다(Nonnecker and smith., J. Dairy Sci, 67: 606-613 (1984)). 간략하면, 로그상태 세포 (1×106CFU/㎖)표준 접종액을 1% 염기성 박토펩톤 배지(100㎕)에서 Apo-Std 또는 Apo-Rec hLF 의 증가된 농도 존재하에 또는 없이 배양시켰다. 샘플은 4시간동안 37℃/200RPM 에서 배양시켰다. 소량의 액을 빼내어, 연속 희석시키고, 수를 헤아리기위해 MacConkey 한천 플레이트에서12시간 플레이트시킨다. 이와같은 분석 결과는 도 7 에 나타내었다. 천연 그리고 재조합 hLF 는 테스트된 모든 농도에서 대장균 0111에 대해 약량 의존성 항균 활성을 가진다.
D. 쉬겔라 플렉네리에 대해 천연과 재조합 hLF의 항균 작용
S. 플렉네리에 대한 천연(표준)과 재조합 hLF 의 항균작용은 실시예 4에서 상술한 것과 같이 결정한다. 이 분석 결과는 도 8 에 나타내었다. 천연과 재조합 hLF 는 테스트된 모든 농도에서 S. 플렉네리의 약량 의존성 저해를 나타낸다.
E. 쉬겔라 플렉네리에 대한 천연과 재조합 hLF 의 항균활성 (치사 시간 연구)
재조합과 천연 hLF 의 항균 활성의 시간에 대한 과정을 실시하였다. 간략하면, 로그상 S. 플렉네리 세포(1×106CFU/㎖)의 표준 접종체는 1% 염기성 박토펩톤 배지(100㎕)에서 Apo-Std 와 Apo-Rec hLF (300㎍) 유무하에 배양시켰다. 샘플은 37℃/200RPM 에서 배양하였다. 소량의 액을 다양한 시간대(0,1,4,20 시간)에서 빼내어 연속 희석하고 수를 헤아리기 위해 MacConkey 한천 플레이트에서 12시간 플레이트한다. 이 분석의 결과는 도 9 에 나타내었다. 재조합과 천연 hLF 는 4시간 후에 S. 플렉네리 CFUs 없이 시간에 대해 S. 플렉네리에 대해 유사한 항균 활성을 나타내었다.
실시예 5
임의 cDNA의 인-프레임 서브클로닝을 위해 공통적인 셔틀 벡터 pPLF-26의 작제
이 실시예에서는 아스퍼질러스 종에서 hLF 돌연변이형을 발현시킬 수 있는 사람 락토페린 셔틀 벡터의 고안과 작제에 대해 상술하고 있다. 벡터내로 또다른 락토페린 클로닝을 실행시키기 위해 유일한 NotI 과 EroRI 부위를 만든다. 단백질은 글루코아밀라제 프로모터의 방향에서 글루코아밀라제로써 시그날 서열하에 발현된다. hLF 키메라, 이는 KEX-2 절단부위의 인지를 통하여 생체내에서 프로세싱 된다. 모든 벡터는 강화된 mRNA 안정성을 위한 글루코아밀라제 3' 해독안된 부분과 아스퍼질러스에서 선택을 위해 플레오마이신 저항 유전자를 포함한다.
I. 사람 락토페린 발현벡터 작제.
A. pPLF-26의 작제.
락토페린 돌연변이형을 수용할 수 있는 발현 벡터를 만들기 위해 유일한 클로닝 부위가 생길 수 있도록 몇가지 제한 효소부위를 변경시킨다. 플라스미드내로 락토페린 돌연변이형을 치환시키기 위해 hLF 유전자의 5'단부에 NOTI 부의를 첨가하도록 고안하였다. EcoRI 부위는 hLF 유전자의 3'단부에서 유일한 클로닝 부위가 되도록 선택되고 이것이 유일한 부위가 되도록 하기위해 다른 기존의 EcoRI 부위를 제거할 필요가 있다.
유일한 클로닝부위에 추가하여, pPLF-26 에는 아스퍼질러스 아와모리 글루코아밀라제 (GA) 프로모터, 시그날 서열 그리고 KEX-2 인지 부위에 의해 분리되는 글루코아밀라제 단백질의 498개 아미노산을 포함한다. 벡터에는 또한 아스퍼질러스 나이져 GA 3' 해독안된 부분(UTR)과 A.나이져 베타-튜브린 프로모터에 의해 발현되는 스트렙토알로테튜스 힌듀스타누스(CAYLA vector pUT713)로 부터 기인된 플레오마이신 저항성 유전자를 또한 포함하고 있다. 대장균에서 선택과 복제를 위해 플라스미드에는 복제를 하기 위한 ColE1 원점과 암피실린 저항성 유전자를 포함한다. hLF 발현벡터 pPLF-26 의 작제는 도 10-A 와 10-B에 나타내었고 작제 중간 생성물은 하기에서 설명한다.
pPLE18Sp. Alt
프로모터, 시그날 서열과 KEX-2 인지부위에 의해 hLF로 부터 분리된 글루코아밀라제 일부 단백질 서열을 포함하고 있는 플라스미드 pPLF-18 은 바람직한 부위 수정을 위해 시작 플라스미드로 선택되었다. pPLF-18은 두 개 단편을 분리하기 위해 SphI으로 절단하고; hLF를 포함하는 3.3kb 단편은 pPLF18Sp.Alt 를 제공하기 위해 정확한 방향에서 시험관내 벡터 pALTER로 서브클론된다.
pR18.2
pPLF-18로 부터 4.4kb Sph 단편은 다시 연결하여 pR18.2를 제공한다.
pNot 9
KEX-2 절단부위와 hLF 시작부위를 포함하는 NotI 제한효소 부위는 벡터 pPLF18Sp.Alt 의 시험관내 돌연변이에 의해 만들어진다. "T" 뉴크레오티드가 "C" 뉴클레오티드로 바뀐 NotI 부위는 인-프레임이 되고 임의 다른 아미노산을 바꾸지는 못한다. 다음 21 21-mer 뉴클레오티드(SEQ ID No 8)은 돌연변이에 이용되는데 작은 문자 염기 변화를 나타낸다.
돌연변이 올리고 HLF NotI 은 단일가닥 표준 pPLF18Sp.Alt DNA 에 어닐(anneal)시키기 위해 암피실린 수복 올리고(promega)와 연결하여 이용되고 T4 DNA 중합효소와 T4 DNA 라이게이즈에 의해 채워진다.
수복 마이너스 균주 BMH 71-18mutS 와 JM109의 형질 도입후에 선택된 형질 도입체의 50%가 신규한 NotI 부위를 가지며 이중 하나를 pNot.9 라 명한다.
p△E12
플라스미드 pR18.2 는 EcoRI으로 절단하고 겔 전기영동에 의해 두 개의 다편을 분리한다. 이들 단편 모두 별도로 클리노우에 의해 채우고 큰 3.6kb 단편은 송아지 내장 포스포타제(CIP)로 1시간 동안 50℃ 에서 탈-포스포릴화한다. 페놀 추출과 에탄올 침전후에 두 단편은 서로 블런트-단부 연결된다. 형질 도입전에, 라이게이션 혼합물은 EcoRI으로 절단하고 여전히 EcoRI을 포함하는 벡터를 직선화한다. 16개중 세 개 클론은 모든 EcoRI을 가지고 있어 EcoRI 부위를 포함하는 벡터를 직선화한다. 16개중 세 개 클론은 EcoRI 부위가 채워져 있고 정확한 방향을 하고 있다. 이들중 하나가 p△E12 이다.
pPLF-25
p△E12는 SphI으로 절단하고 CIP로 탈-포스포릴화하였다. 새로운 NotI 부우를 포함하는 3.3kb SphI 단편을 pNot.9 로 부터 분리하고 p△E12/Sph 에 연결한다. 정확한 방향의 SphI 단편을 가진 클론은 pPLF-25 로 명명하고 이는 유일한 EcoRI과 NotI 부위를 가지고 hLF는 GA 프로모터에 의해 발현되는 글루코아밀라제 서열에 융합된다.
pLO3△RI
아스퍼질러스에서 선택을 위해 용이한 pPLF-25를 만들기 위해 플레오마이신 저항성 카세트를 첨가하였다. 플라스미드 pLO3 카세트에는 카세트를 첨가하기전에 제거되어야 할 두 개 EcoRI 부위를 포함한다. 플라스미드 pLO3는 EcoRI으로 절단하고 4.3과 0.9kb 단편을 분리하고 클리노우를 사용하여 별도로 채운다. 채우는 반응후에, 4.3kb 단편은 CIP로 처리하고 정제하고 침전시킨다. 채워진 단편은 각 12시간 동안 서로 연결된다. 박테리아 형질도입후에 선택된 콜로니에서 24개중 5개가 EcoRI 부위가 채워져 있으며 정확한 방향을 하고 있었고 이를 pLO3△ROI이라 하였다.
pPLF-26
B-튜블린 프로모터에 의해 전사된 플레오마이신 저항 유전자를 포함하는 pLO3△RI으로 부터 2.3kb Hind III 단편을 HindIII로 절단한 pPLF-25와 연결시키고 CIP로 탈-포스포릴화시킨다. 16클론 중 9개가 양방향에서 HindIII 단편을 가졌다. "pPLF-26"으로 지정된 플라스미드는 hLF 유전자와 같은 동일 방향에서 전사되는 플레오마이신 유전자를 가졌다.
도 11 에서는 클로닝을 위한 유일한 NotI와 EcoRI을 포함하는 보편적인 셔틀 벡터 pPLF-26의 상세한 설명을 나타낸다. 글루코아밀라제(GA) 프로모터 부분에서 기존의 EcoRI 부위는 필-인(fill-in)에 의해 제거된다. 벡터는 또한 GA 해독안된 부분, Kex-2 절단부위, A.아와모리에서 선별을 위한 플레오마이신 저항 유전자를 또한 포함하고 있다. 이 도면에서는 모든 공지의 제한효소 부위를 나타내었다.
도 12 에서는 유일한 NotI 과 EcoRI 부위의 존재와 플라스미드의 방향을 확인하기 위해 다양한 제한 효소와 함께 pPLF-26 와 pPLF-19를 절단한 결과를 나타낸다. pPLF-26 또는 pPLF-19 DNA 1㎍은 지적한 제한효소와 37℃에서 1시간 동안 20㎕용량으로 절단한다. 라인 1 은 1㎍ 람다 Hind III 표준이다. 라인 2 는 EcoRI으로 처리한 pPLT-26. 라인 3은 pPLF-19/EcoRI. 라인 4는 pPLF-26/EcoRI 그리고 NotI.라인 5는 pPLF-19/EcoRI 와 NotI. 라인 6은 pPLF-26/BamHI. 라인 7은 pPLF-19 /BamHI. 라인 8은 pPLF-26/HindIII. 라인 9는 pPLF-19/HindIII. 라인 10은 pPLF-26/ShhI. 라인 11은 pPLF-19/SphI. 라인 12는 pPLF-26/튬 (불완전한 절단). 라인 13은 pPLF-19/Xba.
이와 같은 보편적인 벡터는 다양한 상이한 소요 단백질을 발현시키는데 채택된다. 예로써, 공고된 hLF의 서열도 이 벡터에 삽입되어 발현되고 분리할 수 있다.
실시예 6
아스퍼질러스 아와모리에서 소와 돼지 락테포린의 발현
실시예 5 에서 작제된 보편적인 A.아와모리 발현벡터가 관심이 있는 임의의 cDNA 인-프레임 서브 클로닝을 위해 이용되었다. 이 벡터, pPLF-26은 A.아와모리에서 사람 락토페린의 발현에 이용된 pPLF-19 유사하다. 5' 와 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 Not1 와 EcoRI을 포함하도록 고안되고 공지의 DNA 서열의 중합 효소 사슬 반응(PCR) 증폭을 이용하여 성숙한 돼지가 소 락토페린을 인코드하는 전체 길이의 cDNA 서열을 얻는데 이용된다. PCR 단편은 Not1 으로 Mung Bean 뉴클레아제를 이용해 수복하고 EcoR1 으로 절단된 모든 것은 Not1 에 인-프레임 서브클로닝시키고, 수복시키고, EcoR1 절단된 pPLF-26이 된다. 플라스미드는 A.아와모리내로 형질 도입시켜 사람 락토페린에 대해 전술한 것과 같이 이들 cDNAs 로 부터 발현되게 분비된 것을 얻을 수 있다.
실시예 7
상이한 아스퍼질러스 균주에서 사람 락토페린의 발현 : 비교연구
이 실시예에서는 상이한 벡터 구조에서 수득된 아스퍼질러스 특히 아스퍼질러스 오리자와 A. 니듈란스의 상이한 균주에서 상이한 수준으로 hLF 발현된다는 것을 비교한 것이다. 이들 데이터에서는 A. 아와모리에서 hLF 발현을 위해 전술한 데이터와 비교될 수 있다.
A. 아스퍼질러스 오리자에서 사람 락토페린의 발현
발현 플라스미드 pAhLFG는 사람 락토페린을 인코드하는 완전한 cDNA 서열을 포함하고 A.오리자에서 이를 발현하는데 이용된다. pAhLFG의 고안, 작제, 구조적 특징은 1994년 5월 27일자 출원된 미국특허출원 08/250,308 에 제시되어 있고 이는 또한 1992년 4월 24일자 출원되었으나 현재 포기된 07/873,304의 연속출원이다. 미국특허출원 08/250,308 의 내용은 참고문헌으로 기재한다.
발현 플라스미드 pAhLF는 α-아밀라제 프로모터, 분비성 시그날 서열 그리고 성숙한 α-아밀라제의 제 1 코돈을 인코드하는 A.오리자 AMY II 유전자의 5'에 인접한 681 bp 를 포함한다. 성숙한 사람 락토페린을 코드하는 cDNA는 이들 서열의 하류에 인-프레임 서브클론되고 성장배지에 전분을 추가하여 재조합 단백질을 생산하게 된다. 아스퍼지러스 나이져 글루코아밀라제 3' 해독안된 부분은 전사종료와 폴리아데닐화 시그날을 제공한다. 플라스미드는 또한 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) pyr4 선택성 표식과 암피실린 저항성 유전자를 포함하고 있다.
형질도입된 아스퍼질러스 오리자 균주에서 서던 블랏 분석을 실시하고 데이터는 1994년 5월 27일자 출원된 미국연속출원 08/250,308 에 제시되어 있고 이는현재 포기되었으나 1992년 4월 24일 출원된 07/873,304 의 연속출원이다. 간력하면, 개별 형질 전환체와 콘트롤 A07 에서 게놈 DNA를 방사능 라벨된 hLF cDNA 프로브(2.1kb)와 하이브리드 시킨다. 결과에서 모든 형질도입체(#1-9)에 있는 발현 플라스미드의 EcoRI 절단에 의해 방사능 라벨된 단편(2.8kb)가 형성되었으나 콘트롤인 형질 도입안된 A07에서는 없었다.
노던 분석은 락토페린 mRNA가 발현 플라스미드의 제어 요소하에 A.오리자에 효과적으로 그리고 정확하게 전사되었는지를 결정하기 위해 실행하였다. 이 데이터는 1994년 5월 27일자 출원된 미국특허출원 08/250,308 연속출원에 이미 제시된 바 있고 또한 이는 1992년 4월 24일자 출원되었으나 현재 포기된 07/873,304 의 연속출원이다. 간략하면, 결과에서 사람 락토페린 mRNA 는32P 라벨된 사람 LF cDNA(2.0kb)프로브를 이용하여 감지된다는 것을 설명하고 있다. 사람 LF 방사능라벨된 cDNA 프로브와 하이브리드는 형질 변이체에서는 락토페린 mRNA(2.3kb)가 정확한 크기의 위치에서 특이적 방사능 라벨된 밴드로 감지되나 컨트롤인 형질 변환안된 균주에서는 감지되지 않는다. 도트 검사에서 mRNA 수준의 정량화에서 컨트롤 A07 와 테스트된 형질도입체(#1) 사이에 내생 α-아밀라제 mRNA 의 비교할만한 발현수준을 나타낸다.
A.오리자로 부터 발현되고 분비되는 재조합 LF 의 수준을 검사하기 위해 재조합체(#1)은 72시간동안 30℃에서 3% 전분 존재 하에 생장시킨다. 생장배지는 수득하고 균사체는 pH 10에서 세척하여 세포벽과 느슨하게 연합된 임의 단백질을 떼어낸다(Huge-Jensen, et al., Lipids, 24:781-785 (1989)). 결과는 도 16 에서 나타내었다. 사람 락토페린에 대한 특정 IgG 를 이용한 웨스턴 이뮤노블랏 분석에서 컨트롤 A07에는 없는 형질전환체에서 락토페린의 크기에 상응하는 78kD 단백질이 감지되었다.(도 16A, 라인 2와 3)
도 16A ; 라인 1 에는 젖 hLF 표준(500mg)을 포함한다; 라인 2 와 3 에는 유도된 컨트롤 A07과 형질변이체 #1에서 성장배지(40㎍단백질) 샘플을 포함한다; 라인 4-6 에는 생장 배지로 부터 재조합 hLF 의 CM-세파덱스 정제에 의해 수득한 용출 단편(# 35, 40, 45) 25㎕를 포함한다.
이중은 착색된 SDS-PAGE 겔 분석에서 AO7 컨트롤에는 없고 형질전환체에는 78kD 단백질이 존재함을 나타내었다(도 16B 라인 2 와 3). hLF 에 대한 특정 바이오틴화된 IgG를 이용한 ELISA 분석(Vilja, et al. J. Immunol. Metods 76:73-83(1985))에서는 재조합 hLF 는 5-25㎎/ℓ로 분비되고 유도된 배양물로 부터 총 생장배지 단백질의 약 5%가 된다. 복사 수와 재조합 단백질 분비수준 사이네는 상관관계가 없다. 하기 표에서는 벡터고안과 생산수준을 나타낸다.
재조합 락토페린은 CM-세파덱스 C5026을 이용한 이온-교환 크로마토그래피에 의해 (Stowell, et al. Biochem. J. 276:349-355 (1991)) 형질도입체 #1의 생장 배지로 부터 정제된다. 사람 락토페린은 선형 염 농도를 이용하여 칼럼으로 부터 용출한다. hLF 에 대한 특정 IgG를 이용한 웨스턴 이뮤노블랏팅에 의한 분설 35-45에서 hLF 의 크기에 상응하는 면역반응성 밴드가 감지되었다(도 16A, 라인 4-6). 은-착색 SDS-PAGE에 의해 이중 샘플분석에서 이와 같은 면역반응성 hLF 는 이들 분설에서 주요 단백질 밴드와 상응하다는 것을 나타낸다(도 16B 라인 4-6). 이들 결과에서 이와같은 단일 이온 교환 크로마토그래피 단게는 재조합 hLF 의 95% 정제를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 16B; 도 16A 에서는 설명한 것과 같은 중복 샘플의 실버-착색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석.
hLF가 이의 단부에서 정확하게 프로세싱 되었는지를 결정하기 위해, 재조합 단백질은 자동화된 Edman 분해과정을 이용하여 10개 잔기를 통해 N-단부로 부터 서열화환다. 대량의 이와같은 물질은 성숙한 α-아밀라제에 시그날 펩티드의 연결과 지극히 유사한 유리의 플라스미드 구조내로 유도된 N-단부의 추가 알라닌 잔기(도 16C)를 제외하고는 고유 사람 젖 LF 에 상응하는 아미노산과 동일하다(Metz-Boutigue, et al. Eur J. Biochem. 145:659-676). 소량 생산시에는 N-단부 Ala-Gly-Arg 트리펩티드 또는 Ala-Gly-Arg-Arg 테트라펩티드를 상실하게 된다. 고유 hLF이 이전분석에서는 이와 같은 프로세싱 패턴이 hLF 단백질 자체와 그의 동일하다는 것이나(Hutchens, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:2994-2998)(1991)) 또는 A.오리자 시그날 서열의 N-단부 프로세싱 능력에 이형성에 기인하다는 것을 제시한다(Christensen, et al. Bio/Technology 6:1419-1422(1988); Huge-Jensen et al. Lipids 24:781-783 (1989)).
A. 아스퍼질러스 니듈란에서 사람 락토페린의 발현
A.니듈란에서 hLF cDNA 의 발현을 위해 플라스미드를 고안하고 작제하였다. 이와 같은 벡터고안과 작제(모든 중간생성 벡터를 포함하는)에서 상세한 설명은 1993년 10월 28일자 출원한 08/145,681 에서 이미 설명되었다.
간략하면, A.니듈란 발현 플라스미드, pAL3hLFT는 제어된 유전자 발현에 필수적인 모든 조절 요소들을 포함하는 A.니듈란 alcA 유전자의 5'인접 서열 300 bp를 포함한다. 이와 같은 벡터에는 A.니듈란에서 기인된 알코올 디하이드로게나제, 고유 hLF 시그날 서열, hLF 코딩 cDNA, Ben A A.니듈란의 3'-해독안된 서열, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)pyr4 선택성 표식을 포함한다.
서든 블랏 분석은 형질 변환된 아스퍼질러스 니듈란 균주에서 실행하였고 데이터는 1993년 10월 28일자 출원된 공동 출원 08/145,681 에 이미 기술된 바 있다. 간략하면, 서든 블랏 분석은 hLF cDNA 와 삽입된 플라스미드를 형질 변환체가 포함하는 지를 확인하기 위해 실시한다. hLF-특정 방사상 라벨된 밴드는 라인 1-10에서 예상크기 (2.3kb)에서 감지되었으나 컨트롤 포자에서의 DNA 에서는 감지되지 않았다. 이들 결과로 부터 hLF cDNA 는 테스트된 모든 A.니듈란 형질변환체의 게놈에 삽입되고 세포당 1 내지 20개 복사체가 된다. A.니듈란 게놈내에 플라스미드의 삽입위치는 특정 부위에 벡터가 표적을 하는 유사서열이 없기 때문에 무작위성이 된다.
A.니듈란에서 hLF의 생산에 대한 특정 설명은 1993년 10월 28일자 출원한 미국출원 08/145,681에 기술되어 있다. 간략하면, 탄소워으로써 Na 아세테이트와 hLF cDNA 의 전사를 유도하기 위해 최소배지에서 코니디아(1×106/㎖)를 배양하였다. 배지와 균사체를 수득하고 Miracloth(Calbiochem, San Diego, CA)를 이용하여 분리하였다. 균사체(200mg)을 동결-건조시키고 12시간 동안 건조시킨다. 총 세포 추출물은 폐닐메틸설포니플로라이드 존재하에 인산-완충 염을 이용하여 유리 테플론 균질화기를 이용하여 균질화시킨다. 균질화물은 원심분리하고 가용성 분설을 포함하는 상충액을 회수한다. 생장 배지는 냉동-건조에 의해 농축시키고 PBS 에 재현탁시킨다.
단백질 농도는 제조업자의 지시에 따라 Bradford 시약을 이용하여 결정한다(BioRad, Richmomd, CA). 40㎍ 단백질과 가용성 추출물(50㎍ 단백질)을 포함하는 농축된 배지 샘플은 SDS-PAGE 한다. 정제된 락토페린은 표준으로 이용한다(hLF std). 용해된 단백질은 웨스턴 블랏 과정을 이용하여 정전기적으로 니트로셀룰로오즈 필터에 옮긴다. 필터는 2% 건조된 우유를 포함하는 트리스-완충염으로 차단하고 hLF에 대한 특정 단클론 IgG 1㎍/㎖를 첨가한 동일 완충액에 배양한다(Sigma, St. Louis, MO). 필터는 TBS/0.05% Nonidet P-40으로 세척하고 [125I] 단백질 A로 배양한다. 필터는 세척하고, 건조하고 -70℃ 에서 코닥 XAR5 필름에 12시간 노출시킨다.
그 다음 필름을 자가방사 그래프에 의해 현상한다. 자가 방사 그래프에서 hLF 의 생산을 볼 수 있다.
웨스턴 분석은 alcA 프로모터 제어하에 A. 니듈란 형질 변환체에서 hLF cDNA가 발현되었는지를 결정하기 위해 실행한다. 하나의 형질변이체(No 5)로 부터의 코니디아(1×106/㎖)에는 삽입된 hLF CDNA가 가장 많이 포함되어 있다.
배양물은 수득하고, 세척하고, 에탄올이 보충된 최소배지에 재접종시키고 배양물 수득전에 추가 12시간 또는 24시간 동안 배양시킨다. 세포 추출물과 생장 배지 샘플은 SDS-PAGE에 의해 해리하고, 니트로셀룰로오즈에 옮기고 hLF 에 대한 특정 다클론 IgG를 이용하여 면역 블랏팅시킨다. 고유 hLF 와 구분할 수 없는 면역 반응성 밴드가 에탄올 유도후 12와 24시간 생장후에 세포와 형질 변환체 No5의 생장 배지에서 볼 수 있다. 이들 결과에서 hLF 는 alcA 프로모터 제어하에 형질변환된 A.니듈란에서 발현된다는 것을 설명하였다.
웨스턴 분석에서는 모든 남아있는 형질 변이체의 세포에서 hLF 가 나타났다(데이타에는 나타내지 않음). 일반적으로, 수득된 발현 수준과 플라스미드 복제수 사이에 상관관계가 있다. 배지에서 hLF 는 집적된 발현 플라스미드 다중 복사체를 포함하는 형질 변환체에만 감지된다(1, 5, 8, 10).
형질변환체 5 의 파일롯 발효는 hLF에 대한 특정 바이오틴화된 IgG를 이용하여 적정량의 hLF 가 생산되는지를 결정하기 위해 실행하였다. 여기에서 총 생산된 재조합 hLF 는 배지에 분비된 이들 물질의 약 30% (1.5-2.0㎍/㎖)인 5㎎/ℓ이다. 벡터 고안과 생산 주순의 하기 표 참조.
따라서, 이 실시예에서는 출원인은 발현 벡터 플라스미드 구조의 수정과 이용된 숙주 세포를 바꾸어 사람 락토페린의 발현을 개선하고 강화시켰음을 설명한다. 하기표에서 설명한 것과 같이, 몇 가지 상이한 벡터 구조가 적어도 4개 상이한 아스퍼질러스 균주에서 사람 락토페린을 생산하는데 이용된다. 생산된 사람 락토페린의 양은 ℓ당 hLFmg으로 나타내었다.
편리를 위해, 각 벡터 성분은 좌에서 우측으로 벡터 구조에 있는 성분들 순서대로 나열하였다. 발현 플라스미드 벡터에 포함된 성분은; 프로모터와 프로모터 원천; 시그날 서열과 시그날 서열원천; 링커서열; 사람락토페린을 인코드하는 DNA; 전사 종료부위; 선택성 표식을 포함한다.
실시예 8
대립형질 변이를 포함하는 공지의 DNA 서열을 이용한 락토페린 생산
여기에서 참고문헌으로 제시된 것과 같은 락토페린을 인코드하는 몇 가지 공지의 DNA 서열중 하나를 이용할 수 있다. 또한, 사람, 돼지 또는 소 락토페린의 대립형질 변이의 생산도 본 기술분야에 숙지의 지식을 가진을 가진자는 본 발명에 속함을 인지할 것이다. 일부 대립형질 변이가 문헌에 보고된 바 있으며 본 발명에 공정에 의해 생산될 수 있는 락토페린 형을 포함할 수도 있다.
실시예 9
발효공정
아스퍼질러스 아와모리에서 재조합 사람 락토페린의 발현에 상이한 성장과 생산조건이 이용될 수도 있다. 아스퍼질러스 아와모리에서 hLF 의 발현에 사용될 수 있는 다양한 조건을 설명하기 위해 다음의 설명을 제시하나 이에 한정 하고자 함은 아니다. 하기에는 발효 생산 공정과 생산된 락테페린을 회수하는데 이용되는 공정의 일반적인 개요를 제시하고 있다. 본 기술에 숙지된 자는 이와같은 과정이 소요의 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드의 생산을 강화하기 위해 약간의 수정이 가할 수도 있다는 것을 인지할 것이다.
다음은 발효공정을 이용한 락토페린 생산하는 개요이다.
I. 발효공정
A. 배지성분
1) 접종배지
로케트 옥수수 분말(Roquette Corn Steep Powder) 100 g/L
포도당 10 g/L
MgSO4-7H2O 1 g/L
NaH2PO4-2H2O 1 g/L
증가멸균하기전에 pH는 5.8로 조정하고, 15분간 중기 멸균시킨다.
2) 생산 배지 (농도는 접종후 농도임)
Amaizo Lodex-5 일부
가수분해된 옥수수 전분 175 g/L
로퀘트 옥수수 분말 (Solulys A ST) 60 g/L
시트레이트 삼-나트륨염 80 g/L
MgSO4-7H2O 2 g/L
NaH2PO2-2H2O 1.3 g/L
암모늄 설페이트 15 g/L
안티포움 204 2 ml/L
증가멸균하기전에 pH는 6.2로 조정하고, 15분간 증기 멸균시킨다.
발명자는 발효공정에서 부분적으로 가수분해된 전분을 이용하는 경우 락토페린 생산이 강화된다는 발견을 하였다. 그러나, 변형안된 옥수수 전분과 테스트 로즈를 복합사용할 때 락토페린 생산이 적절하게 된다. 지속적인 실험을 통하여 락토레닌 생산을 최적화하기 위해 좀더 소량의 전분 생성물 또는 좀더 고가의 전분 생성물을 이용할 수도 있다.
B. 발효공정
최근까지 발효는 배치 공정으로 실시된다. 최대 생산 농도는 5-6일 경에 이루어진다.
1) 접종단계 1 :
a) 2L 엘렌마이어 플라스크에서 450㎖ 접종배지.
b) 접종배지 1㎖ 당 1×106포자 접종.
c) 33℃, 70%, 상대습도, 240rpm (50mm throw shaker) 24시간 동안 배양.
2) 접종단계 2 :
a) 2개 12cm 6개 날 임펠라가 있는 NBS Micros 30 발효기에 20L 접종배지.
b) 30분간 살균.
단계 1 씨의 2% 접종.
교반 500rpm
공기흐름 0.75 VVM
압력 300mbar
pH 조절안함
DO 조절안함
3) 생산
파일롯트 용기는 3:1의 종횡비를 가진 B. Braun Biotech UD100이다. 교반에는 두 개 16cm 6개 날 Rushton 임펠러가 이용되었다. 배양은 80L 후-접종에서 시작된다.
용기 조건은 전술한 것과 같다. 용기에는 80L 배양 성분이 채워지고 탈이온수 72L를 채운다. 30분간 멸균한다. 단계 2씨 8L (10% CV)를 36-48 시간 생장시에 옮긴다. 최적 접종 과정은 현재 개발중이다.
락토페린 생산은 24시간경에 볼 수 있으며 5-6 일에 최대 생산이 이루어진다.
II. 하류공정
A. 여과
발효는 펠렛을 형성하지 않으면서 30-40% 세포용적에 도달한다. 배지를 깨끗이 하기 위해 여과를 이용하는 경우 여과 보조제가 요구된다. 낮은 공정 용적으로 인해 3000㎠서포트의 직립 진공 여과가 이용될 수 있다. 베이스에는 폴리프로필렌 필트 매트가 이용된다.
초기 테스트에는 필터 보조제로써 규조토를 이용하였다. 그러나, 직립-석회로된 또는 플럭스-석회로된 규조토는 이들이 락토페린에 결합하기 때문에 필터 보조제로 이용할 수 없다. 일단 산-세척된 규조토는 락토페린에 결합하지 않는다. 산-세척된 구조토(DE)는 처리안된 물질의 가격에 40-50배에 구입할 수 있다. 또다른 선택은 생산부위에서 DE 를 산-세척하는 것이다. 예비테스트에서 3N HCl 로 슬러리화하고 45분간 혼합하고 그다음 세척수가 pH 4.0이 될 때까지 탈이온수로 세척해닌다. 락토페린은 이와같이 처리된 물질에는 결합하지 않는다. 처리된 DE는 전체 배지에 1:5 W/V 비로 이용된다. DE는 배지와 혼합하기 전에 탈이온수로 슬러리화한다. 1:10 비율은 여과되지 않는다는 것을 발견하였다.
또다른 산물은 세룰로오즈 화이버이다. 발명자는 Solkafloc 10IND(Protein Technologies International in Urbana, IL; 1-800-258-0351)이 락토페린에 결합없이 잘 작용한다는 것을 알았다. 발명자는 여과를 보조하기 위해 필터로 Solkafloc를 이용하였다. 100L 발효배지에서 20kg Solkagloc가 100L 탈이온수로 슬러리화되었다. 배지는 슬러리와 혼합한다. 혼합물은 용이하게 여과될 수 있다. 이 단계에서 이루어진 투명도가 추가 여과과정의 요구없이 하류 과정(한외여고와 칼럼 크로마토그래피)을 진행할 수 있게 한다. 단일 배취 여과에서 Solkafloc와 배지 그리고 탈이온 수의 비율은 공정에 따라 최적화시킬 수 있다. 필터 케익을 세척할때 락토페린이 정량적으로 회수된다. 연속 필터 공정장비로 필터로 Solkafloc를 이용한 방법을 변화시킬 수 있다.
기존의 균주를 이용하거나 개선된 유동학과 여과 특징을 가진 균주를 개발할 수 있다. 예로써, 교반된 탱크 발효에서 펠렛을 이루는 돌연변이는 공정동안에 두꺼운 필터 케익을 만들고 필터 프리코트를 제외한 필터 보조제를 요구하지 않는다.
B. 한외여과법
맑아진 배지는 한외여과법을 이용하여 농축된다. 30,000MW 막의 두 개 Amicon S10Y30(각 0.93㎡) 나선 카트릿지가 Amicon DC-30 시스템에 이용된다. 막은 단백질 결합이 적은 셀룰로오즈계 물질이다. 유동 속도는 공정 단계에 따라 1-1.8rpm이다. 최소 작동 공정용적에 다다르면, 농축된 용액은 0.1M Nacl, 1mM EDTA와 25mM 트리스 pH7.5 를 포함하는 완충액 5 배 용적으로 연속적으로 투석한다. 그 다음 완충액은 4℃로 냉각하고 투석된 용액은 가능한한 최소 용적으로 농축하고 회수한다. 수득률은 이 공정에서 거의 100%가 된다.
최종 한외여과(UF) 농도는 총 단백질의 10%에서 락토페린은 5-8mg/ml이 된다. 회수률은 새로운 균주가 개발될 때 적정화한다. 80L 발효배지에서 이 시스템의 농도와 투석은 약 2 시간 소요된다.
C. 크로마토그래피 분리
Pharmacia CM Sepharose Fast Flow Gel 이 이용된다. 맑은 배지에서 락토페린에 대한 이 수지의 결합 능력은 약 20㎎/ml 이다.
UF 농축물을 칼럼에 얹는다. 적하된 칼럼은 우선 0.1M NaCl/25mM 트리스 pH 7.5 로 세척하고 그 다음 0.2M NaCl 25mM 트리스 pH 7.5로 세척한다. 칼럼에 과적하될때까지 방출되는 락토페린은 없다. 락토페린을 포함하는 용출분설의 용적은 수지 베드의 용적의 통상 두배가 된다.
D. 아포-락토페린으로 전이
락토페린을 포함하는 0.5M NaCl 분설이 복합된다. 1M 암모늄 시트레이는 최종농도가 0.1M 암모늄 시트레이트가 되도록 첨가한다. pH 는 10N HCl 로 2.0으로 서서히 조정한다. 용액은 30,000 MW 막을 이용하여 적정 크기의 한외여과로 이동시키고 여기에서 적정 용적으로 농축시키고 그다음 0.5M NaCl/0.1M 암모늄 시트레이트 pH 2.0의 5배 용적으로 연속적으로 투석하였다. 철의 방출과 투석이 완료된 후에, pH는 중성으로 조정하여 다음 단계에서 침전을 막는다. 잔류철이 있는 경우 중성 pH에서 락토페린에 재결합할 것이다. 투석 완충액이 50mM 중탄산 암모늄(pH 7.8)로 변경되고 용액은 5배 용적의 완충액으로 계속 투석된다. 그 다음 용액은 최소 용적으로 농축시키고, 회수하고, 냉동 건조시킨다.
공정은 현재 적정화되었다. 특정 인자는 사용된 균주에 따라 고려한다. 인자들 중 일부는 1) pH 한계, 2) 철을 제거하기 위한 장비의 선 처리, 3) 잔류 철을 제거하기 위해 Chelex 수지로 완충액의 선처리 등을 포함한다. 락토페린의 침전과 잔류 철의 재결합을 피하기 위해 50mM 중탄산 암모늄, 0.2M NaCl와 같은 중간 완충액을 통과시키는 것이 필요하다.
실시예 10
아스퍼질러스 오리자 또는 아스퍼질러스 나이져 세포에서 융합 생성물로써 락토페린 또는 락토레린 폴리펩티드의 생산
A. 아스퍼질러스 오리자에서 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현.
이미 설명한 것과 같은 유사 발현 벡터는 아스퍼질러스 오리자에서 융합 단백질 생성물로 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현을 위해 만들어질 수 있다. 아스퍼질러스 오리자 발현 벡터는 5' 에서 3' 방향으로 연결된 다음의 성분을 포함할 수 있다;
a) 아스퍼질러스 오리자 α-아밀라제 유전자로 부터 기인한 프로모터;
b) A.오리자 α-아밀라제 유전자로 부터 기인한 시그날 서열;
c) A.오리자 α-아밀라제 유전자의 5' 부분;
d) Kex 2 펩티다아제 절단부위를 인진하는 링커서열, 이로써 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해성 효소가 있고;
e) A.나이져 글루코아밀라제 유전자로 부터 기인된 전사종료 서열; 그리고
f) 플레오마이신 저항성 선택 표식 유전자; 이때 벡터는 융합 단백질로써 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산하고 프로세스된 단백질로 발현시킬 수 있다.
벡터는 A.오리자 세포를 형질변환시키는데 이용되고; 신규의 플라스미드 벡터 구조의 생성물은 상기 e) 단계에 뉴클레오티드 서열에 상응하는 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편과 발현된 A.오리자 α-아밀라제 유전자 절반과 융합된 구성된 융합 단백질이다. 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 융합 단백질은 Kex2 펩티다제 부위에 특이적인 내생 A.오리자 단백질 분해 효소에의해 프로세스 될 수 있다.
B. 아스퍼질러스 나이져에서 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현.
이미 설명한 것과 같은 유사 발현 벡터는 아스퍼질러스 나이져에서 융합 단백질 생성물로 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현을 위해 만들어질 수 있다. 아스퍼질러스 나이져 발현 벡터는 5' 에서 3' 방향으로 연결된 다음의 성분을 포함할 수 있다;
a) 아스퍼질러스 나이져 글루코아밀라제 유전자로 부터 기인한 프로모터;
b) A.나이져 글리코아밀라제 유전자로 부터 기인한 시그날 서열;
c) A.나이져 글루코아미라제 유전자의 5' 부분;
d) Kex 2 펩티다아제 절단부위를 인진하는 링커서열, 이로써 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해성 효소가 있고;
e) A.나이져 글루코아밀라제 유전자로 부터 기인된 전사종료 서열; 그리고
f) 플레오마이신 저항성 선택 표식 유전자; 이때 벡터는 융합 단백질로써 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산하고 프로세스된 단백질로 발현시킬 수 있다.
벡터는 A.나이져 세포를 형질변화시키는데 이용되고; 신규의 플라스미드 벡터 구조의 생성물은 상기 e) 단계에 뉴클레오티드 서열에 상응하는 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편과 발현된 A.나이져 글루코아밀라제 유전자 절반과 융합된 구성된 융합 단백질이다. 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 융합 단백질은 Kex 2 펩티다제 부위에 특이적인 내생 A.오리자 단백질 분해 효소에 의해 프로세스 될 수 있다.
결론으로, 여기에서 상술된 본 발명의 구체예는 본 출원에서 제시한 목적을이루기에 적합한 것임을 알 수 있다. 본 발명의 범위와 영역을 벗어나지 않고 방법과 장치에 변화가 있을 수 있다. 이와같은 변화는 가능한 것이며, 각 단계 또는 요소 동일한 또는 등가의 방식으로 동일한 결과를 수득하기 위해 모든 단계나 요소로 이해될 수 있다. 어떠한 형태의 원리를 이용하건 간에 본 발명에 포함된다. 따라서본 발명은 전술한 목적과 생성물을 얻는데 적합한다.
Claims (39)
- 5'에서 3'방향으로a) 알코올 디하이드로게나제 유전자, α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자, ben-A 유전자에서 선택되는 곰팡이 프로모터 서열;b) 글루코아밀라제 유전자, α-아밀라제 유전자에서 선택된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자에서 선택된 내생성 분비되는 아스퍼질러스의 유전자 아미노 단부를 인코드 하는 서열로 구성된 플라스미드 벡터에d) 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 5'에서 3' 방향으로 삽입된 것을 특징으로 하는 신규한 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 아스퍼질러스(Aspergillus) 폴리펩티드의 아미노 단부 부분을 고유 락토페린 폴리펩티드의 아미노 단부에 연결시키기 위한 펩티드 링커를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 추가로 포함되고 이때, 펩티드 링커는 곰팡이 펩티다제 절단 부위로 구성된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 프로모터는 글루코아밀라제 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 3 항에 있어서, 글루코아밀라제 유전자는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 또는 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger)에 내생하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 프로모터는 α-아밀라제 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 5 항에 있어서, α-아밀라제 유전자는 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae)에 내생하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 시그날 펩티드 인코딩 서열은 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 또는 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus Niger) 글루코아밀라아제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 7 항에 있어서 시그날 펩티드 서열은 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자에서 선택된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 내생 분비된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유전자는 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 내생 분비된 아스퍼질러스(Aspergillus) 유전자는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 또는 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 2 항에 있어서, 링커 펩티드 인코딩 서열은 Kex2 펩티다제 절단부위로 구성된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자, 알코올 디하이드로게나제, ben A 유전자에서 선택된 전사 종료 서열이 추가로 포함되고, pyr4, pyrG, amdS, argB, trpC, 플레오마이신 저항성 유전자에서 선택된 선택성 표식 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 12 항에 있어서, 전사 종료 서열은 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자에서 기인된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 12 항에 있어서, 선택성 표식 유전자는 플레오마이신 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 고유 락토페린은 사람 락토페린, 소 락토페린, 돼지 락토페린에서 선택된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 5' 에서 3'방향으로a) 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다제 절단 부위로 구성된 펩티드 링커를 인코드하는 서열, 이로써 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있고;e) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 유전자 서열로 구성된 플라스미드벡터에 있어서, d)와 e)사이에 5'에서 3' 방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 배열된 것을 특징으로 하는 신규한 플라스미드 DNA 서열.
- 5'에서 3' 방향으로a) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다제 절단 부위로 구성된 펩티드 링커를 인코드하는 서열, 이로써 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있고;e) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 유전자로 구성된 플라스미드 벡터에 있어서, d)와 e)사이에 5'에서 3' 방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 삽입한 것으로 배열된 것을 특징으로 하는 신규한 플라스미드 DNA 서열.
- 5'에서 3' 방향으로a) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자의 아미노단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다제 절단 부위로 구성된 펩티드 링커를 인코드하는 서열, 이로써 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있고;e) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 유전자로 구성된 플라스미드 벡터에 있어서, d)와 e) 사이에 5'에서 3' 방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하여 배열된 것을 특징으로 하는 신규한 플라스미드 DNA 서열.
- 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 방법에 있어서, 이때 플라스미드 벡터의 구조는 다음의 서열들이 5'에서 3' 방향으로a) 알코올 디하이드로게나제, α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자, ben-A 유전자에서 선택된 프로모터;b) 글루코아밀라제 유전자, α-아밀라제 유전자에서 선택된 시그날 서열;c) 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 생성물의 내생 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열로 구성되고, 이어서, 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 것으로 구성되며,이때, 형질 변환된 아스퍼질러스 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 성숙한 고유 락토페린 융합 단백질을 생산하고, 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱시켜, 이때 프로세싱된 성숙한 고유 락토페린은 영양배지로 분비되어 영양배지로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 아스퍼질러스(Aspergillus) 폴리펩티드의 아미노 단부 부분을 고유 락토페린 폴리펩티드의 아미노 단부에 연결시키는 펩티드 링커를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고 이때, 펩티드 링커는 곰팡이 펩티다제 절단 부위로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자, 알코올 디하이드로게나제 유전자, benA 유전자에서 선택된 전사종료 서열과, pyr4 유전자, pyrG 유전자, amdS 유전자, argB 유전자, trpC 유전자, 플레오마이신 저항성 유전자에서 선택된 표식 유전자가 플라스미드 서열에 추가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 프로모터는 글루코아밀라제 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 글루코아밀라제 유전자는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 유전자 또는 아스퍼질러스나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 프로모터는 α-아밀라제 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 24 항에 있어서, α-아밀라제 유전자는 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 시그날 서열은 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제 유전자에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 시그날 서열은 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 생성물의 발현된 내생 유전자의 아미노 부분을 인코드하는 서열은 α-아밀라제 유전자와 글루코아밀라제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 생성물의 발현된 내생 유전자의 아미노 부분을 인코드하는 서열은 아스퍼질러스 오리자(Aspergillusoryzae) α-아밀라제 유전자와 글루코아밀라제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 생성물의 발현된 내생 유전자의 아미노 부분을 인코드하는 서열은 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 펩티드 링커는 Kex2 펩티다제 절단부위로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 전사 종료 서열은 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 선택성 표식은 플레오마이신 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, ATCC에 기탁번호 74290를 가지고, Awa LF 24-1으로 정의되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 서열.
- 제 16 항에 따른 플라스미드 DNA 서열을 가지는 특징으로 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 곰팡이 세포.
- 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 방법에 있어서,이때 플라스미드 벡터는 다음의 성분들이 5'에서 3' 방향으로a) A. 아와모리 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) A. 아와모리 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) A. 아와모리 글루코아밀라아제 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다아제 절단 부위를 인코드하는 펩티드 링커를 인코딩하는 서열, 이때 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있고;e) A. 나이져 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료인자; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 표시인자로 구성되며,플라스미드 벡터의 d)와 e)사이에 5'에서 3'방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 있고, 이때 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 성숙한 고유 락토페린 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱 되고 이때 프로세싱된 성숙한 고유 락토페린은 영양배지로 분비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamorri) 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 방법에 있어서, 이때 플라스미드 벡터는 다음의 서열들이 5'에서 3' 방향으로a) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드-인코드 서열;c) 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae) α-아밀라제 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다아제 절단 부위를 인코드하는 펩티드 링커를 인코딩하는 서열, 이때 링커 서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소가 있고;e) A. 나이져 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료인자; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며,플라스미드 벡터의 d)와 e)사이에 5'에서 3'방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 것을 특징으로 하고,이때 형질 변환된 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus awamori) 곰팡이 세포를 적절한 배지에 배양하여, 성숙한 고유 락토페린 융합 단백질로 생산하고, 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱시키며, 이때 프로세싱된 성숙한 고유 락토페린을 영양배지로 분비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 곰팡이를 배양하는 것으로 구성된 곰팡이 영양배지로부터 성숙한 고유 락토페린을 분리하는 방법에 있어서,플라스미드 벡터의 구성은 5'에서 3'방향으로a)아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드-인코딩 서열;c) 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라아제의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다아제 절단부위로 구성된 펩티드 링커를 인코딩하는 서열로 구성되고; 이때 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있으며,e)아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료서열;f) 플레오마이신 선택성 표식을 포함하는 것으로 구성되고;플라스미드 벡터의 d)와 e)사이에 5'에서 3' 방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 있고,이때 형질 도입된 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 곰팡이 세포를 적절한 배지에 배양하여, 성숙한 고유 락토페린 융합 단백질을 생산하고, 링커서열에 특이적인 내생 단백질 효소에 의해 프로세싱되며, 이때 프로세싱된 성숙한 고유 락토페린이 영양배지로 분비되어 배지로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 곰팡이를 배양하여 성숙한 고유 락토페린를 생산하는 방법에 있어서, 이때 플라스미드 벡터는 다음의 서열들이 5'에서 3' 방향으로a) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터;b) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 펩티드를 인코드하는 서열;c) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루코아밀라제 유전자의 아미노 단부를 인코드하는 서열;d) Kex2 펩티다제 절단 부위로 구성된 펩티드 링커를 인코드하는 서열, 이로써 링커 서열에 특이적인 내생 단백질분해 효소가 있고;e) 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 글루카아밀라제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열; 그리고f) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며,플라스미드 벡터의 d)와 e)사이에 5'에서 3' 방향으로 성숙한 고유 락토페린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 있고;이때 형질 변환된 아스퍼질러스 나이져아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 곰팡이 세포를 적절한 배지에 배양하여, 성숙한 고유 락토페린 융합 단백질을 생산하고, 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱시키고, 이때 프로세싱된 성숙한 고유 락토페린이 영양배지로 분비되어, 배지로부터 락토페린 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 성숙한 고유 락토페린을 생산하는 방법.
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