JPH07502723A - 組み替えトランスフェリン、トランスフェリン半−分子、及びそれらの突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １５　請求の範囲９に記載のベクターを用いてトランスフェクションされたベビ ーハムスター腎臓細胞系。

１６　少なくともトランスフェリンの１個の突出部の金属−結合ドメインを含む トランスフェリンの組み替え半一分子を、金属の循環量を下げるのに十分な量て 患者に投与することを含む、金属キレート化治療の方法。

１７、金属が鉄である、請求の範囲１６に記載の方法。

１８　トランスフェリン半一分子が天然のトランスフェリンより激しく鉄と結合 する突然変異体である、請求の範囲１７に記載の方法。

１９　トランスフェリン半一分子が天然のトランスフェリンのりシン残基の代わ りに位置２０６にグルタミン残基を含む、請求の範囲１８に記載の方法。

２０、組み替えトランスフェリンを含む細胞培養培地のための非血清補足物。

明　細　書 組み替えトランスフェリン、トランスフェリン半一分子、及びそれらの突然変異 体 発明の背景 集合的にトランスフェリン又はシデロフイリンと呼ばれる鉄−結合プソイドグロ ブリンは、著しく類似の特徴を有するタン、＜り質の種類を含む。ヒトラクトフ ェリン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａ　 ｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、見旦Δ　旦迭：１７６９−１７７３）及びウサギ 血清トランスフェリン（Ｂａｉｌｅｙ。

０４−５８１．２）のＸ−線結晶学的分析は、これらのタンノくり質が短し１架 橋ペプチドにより連結された２個の類似した突出部を含み、各突出部は金属イオ ン及び共働アニオンのための結合部位を含む探し）裂は目を限定する２個のドメ インを含むことを明らかにしている。

ニワトリオボトランスフエリン遺伝子が形質転換マウス中で発現さ才１（ＭｃＫ ｎｉｇｈｔ、　Ｇ、　Ｓ、　ｅｔ　ａリ−，（１９８３）　Ｃｅ　ｌ　ｌ　（Ｃ ａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）３４：３３５−３４１）、う・ソトトランスフエリン の一部とガラクトシダーゼの融合タンパク質がＥ、ｃｏｌｉ中で発現された（Ａ ｌｄｒｅｄ、Ａ　且±　−ａｌ、（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１２２：９６０−９６５）。

この融合タンパク質を除き、原核系てトランスフェリン又は分子の一部を発現す る試みは不成功であった（Ａｌｄｒｅｄ、Δ　且±　見±（１９８４）Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ。

及び分子内の多数のジスルフィド架橋がバクテリア宿主中の発現に対する主要な 障害であろう。アルカリホスファターゼシグナル配列を付けてタンパク質をバク テリア膜輸送に向かわせることにより、天然のタンパク質の折り畳み環境を部分 的に最小にする試みは不成功であった。

発明の概略 本発明は組み替えトランスフェリン、少なくともトランスフェリンの１個の突出 部（アミノ−末端又はカルボキシ−末端）の金属−結合ドメインを含む組み替え トランスフェリン半一分子、及びトランスフェリンの発現のための安定な細胞培 養系に関する。組み替えトランスフェリンは安定な形質転換された真核細胞、例 えばベビーハムスター腎臓細胞中で発現して全−又は半一分子の形懇の基本的に 均一な（単分散）試料を与えることができる。本発明は又、天然（野生−型）の 形態のトランスフェリンと異なる金属−結合性又は他の性質を有する突然変異体 トランスフェリン及びトランスフェリン半一分子に関する。これらには鉄又は他 の金属への結合が天然のトランスフェリンより激しいかあるいは穏やかである突 然変異体トランスフェリン及びトランスフェリン半一分子が含まれる。

トランスフェリン半一分子は金属調節異常症又は金属中毒にかかった患者の処置 のための金属キレート化冶療に使用することができる。例えばトランスフェリン 半一分子、特に天然のトランスフェリンより激しく鉄と結合する突然変異体をサ ラセミアなどの鉄−過剰負荷患者に投与し、その体から過剰の毒性の鉄を除去す ることができる。さらに半−分子又は金属イオン選択性が変えられたその突然変 異体を用いて他の毒性金属、例えば鉛、水銀、カドミウム、銅又は亜鉛を体から 除去することができる。

図の説明 図１はｐＮＵＴにおけるｈＴＦ／２Ｎ発現ベクターの構築を示す。ヒト血清トラ ンスフェリンをコードする２、３−ｋｂのｃＤＮＡをヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ リから単離し、完全アミノ−末端ドメインコード配列を含む１．５−ｋｂのＰｓ ｔｌ／ＨａｌフラグメントをＭｌ　３ｍｐ　１８中にクローニングする。二重翻 訳停止コドン及びＨ４ｎｄｌｌ！認識配列を特定部位の突然変異誘発により導入 し、ＢａｍＨＩ／Ｈｉ　ｎｄ　ＩＩ＋フラグメントの単離を可能にし、それがＢ ａｍＨＩ／Ｈｐａ　Ｉ　１フラグメントと結合するとアミノ−末端ドメイン及び シグナル配列をコードした。このフラグメントを真核発現ベクターｐＮＵＴ中に クローニングし、ベクターｐＮＵＴ−ｈＴＦ／Ｎ２を得た。このプラスミドにお いてトランスフェリンｃＤＮＡはメタロチオネインプロモーター（ＭＴ−１ｐｒ ｏ）及びヒト成長ホルモン転写停止シグナル（ｈＧＨ３°）の制御下にあり；ｐ ＮＵＴはヒトＢ型肝炎ウィルスからの転写停止シグナルを用いて耐性Ｄ４−（Ｆ ＲｃＤＮＡ　（Ｄ）（ＦＲｃＤＮＡ）の発現を促進するＳＶ４０初期プロモータ ー（ＳＶ４０）も含む。

図２は、種々のベビーハムスター腎臓細胞系からの免疫沈降物のウェスターンプ ロットを示す。Ｚｎ−誘導細胞培養物からの細胞ライセード（ａ）及び培地（ｂ ）の試料を抗−ｈＴＦ抗血清を用いて沈降させた。

再懸濁したペレットの試料をＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ＜　ＰＡＧＥにより分 析し、ニトロセルロースに移し、抗−ｈＴＦ抗血清及びその後アルカリホスファ ターゼ複合抗−ＴｇＧを用いて発色させた。ｈＧ）（−ｐＮＵＴ及びｈＴＦ／Ｎ ２−ｐＮＵＴ細胞系を５００　μＭのＭＴＸ中でＪ択Ｌ、ＤＭＥＭ／１０％ウシ 胎児血清中ですべての細胞を培養した。１列、ＢＨＫ細胞；２列、ｈＧＨ−ｐＮ ＵＴ）ランスフェクションＢＨＫ細胞；３列、ｈＴＦ／Ｎ２−ｐＮＵＴ）ランス フエクションＢＨＫ細胞。分子量マーカー（ｘｌｏ””）の位置をプロットの右 に示し、追加のＭ、３７，０００のタンパク質バンドの位置もプロットの右に示 す（＜３７）。

図３はｈＴＦ／２Ｎの単離及びＰＡＧＥ分離を示す。（パネルＡ）組み替えｈＴ Ｆ／２Ｎ　（上線）及びタンパク質分解誘導ｈＴＦ／２Ｎ　（下線）のＰｏ１ｙ ａｎｉｏｎ　Ｓｌのカラム上におけるＦＰＬＣ単離。

（パネルＢ）分子量標準（Ｍｒ列）及びパネルＡからのピークａ−ｄの各３μｇ のＮａＤｏｄＳＯ４ＰＡＧＥ　（アクリルアミドの５−１２％勾配）。（パネル Ｃ）ＦＰＬＣピークａ−ｄ（組み替えｈＴＦ／２Ｎ［Ｉ）及びパネル八からのピ ークｅ−ｈ（タンパク質分解誘導ｈＴＦ／２Ｎ種）の非還元条件下におけるウレ ア−ＰＡＧＥ０アポ−タンパク質（ａｐｏ）及び鉄−結合タンパク質（Ｆｅ）の 位置を示す。ＦＰＬＣで用いられた条件は材料及び方法にて示す。ＦＰＬＣ留分 は以下のように集めた：ピークロ　（留分２３−２７）　、ピークｂ（２８−３ １）、ピークｃ（３２−３８）、ピークｄ　（３９−４５）　、ピークｅ（２８ −３１）、ピークｆ　（３２−３６）　、ピークｇ　（３８−４４）及びピーク ｈ（４６−５１）。

図４は１０ｍＭのＦｅ　（ｌ　Ｉ　Ｉ）（ＮＴＡ）２を用いた主要形態の組み替 えｈＴＦ／２Ｎの滴定を示す。タンパク質の量は１．００ｍＬの１０ｍＭ　Ｎａ ＨＣＯｓ中の３．　６８Ａ２１１゜単位であった。磁気撹拌容器に鉄をそれぞれ 加えた１５−１０分間可視スペクトルを走査した。

図５は組み替えｈＴＦ／２Ｎの核磁気共鳴スペクトルを示す。（ａ）２Ｈｚのラ インブロードニングを用いたフーリエ変換スペクトル。（ｂ）４Ｈｚのラインブ ロードニング及びＤＣ＝４．０、Ｎ５＝６８５００における回転差スペクトル（ ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ）ｏタンパ ク質試料は％ｏ中の領　ＩＭ　ＫＣＩ　Ｑ、１ｍＬ中で８ｍｇであった。

図６はｍ−Ｆ−Ｔｙｒ組み替えｈＴＦ／２Ｎの鵞９Ｆ核磁気共鳴スペクトルを示 す。図はｌ　Ｑ　Ｈｚのラインブロードニング、Ｎ５＝３，０００を用いたフー リエ変換を示す。タンパク質試料は２１１２０中の０．１ＭＫＣｌ　Ｑ、１ｍＬ 中で６ｍｇであり、：参照は”Ｈ，Ｏ中のＯ，ＩＭの三フッ化酢酸であった。

図７はｈＴＦ／２Ｃコード配列の創造のためにＰＣＲプライマーとして用いた２ つの別々のオリゴヌクレオチドを示す。全カルボキシ突出部のためのコード配列 を含むＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、２５巡のＰＣＲ増幅の鋳型として用いた 。オリゴヌクレオチド１はＳｍａ　Ｉ認識部位、及び天然のｈＴＦシグナル配列 をその５°末端に含み、その３′末端でｈＴＦのアミノ酸３３４−３４１のコー ド配列と合わさる。オリゴヌクレオチド２はｈＴＦ　ｃＤＮＡの３°非翻訳領域 の配列と合わさり、この部位に第２のＳｍａ　Ｉ認識配列を導入する。

発明の詳細な説明 本発明は組み替えトランスフェリン、組み替えトランスフェリン半一分子、及び 天然のトランスフェリン分子と比較して金属−結合能の向上など、性質が変化し た全−長トランスフェリン及びトランスフェリン半一分子の突然変異体を与える 。組み替えトランスフェリンは大量に、及び実質的に等質の（単分散）形態で製 造することができる。例えばヒト血清トランスフェリンの組み替え半一分子は、 他のヒト血清タンパク質を実質的に含まない基本的に等質の試料として製造する ことができる。

対照的にホロータンパク質のタンパク質分解により製造された半一分子は精製が 困難で、実際にヒトトランスフェリンのカルボキシ−末端半分をタンパク質分解 の手段により鳩尾に製造することはできない。組み替え法は、トランスフェリン の新規形態の設計及び製造に突然変異誘発を適用することも可能にする。

一般に本発明の組み替えトランスフェリンは、トランスフェリンをコードする核 酸構築物を用いて適した宿主細胞をトランスフェクションし、トランスフェクシ ョン宿主細胞を発現に適した条件下で培養し、細胞により発現された組み替えト ランスフェリンを回収することにより製造される。５種類のトランスフェリンの アミノ酸配列が報告された（Ｊｅｌｖｒａｙ、Ｒ，Ｔ、　Ａ、ｅ±　見↓、（１ ９８３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ旦旦：３５４３−３５５３　；Ｍｅｔｚ− Ｂｏｕｔ　ｉｇｕｅ、Ｍ。

−Ｍ、ｅ工　見±、（１９８４）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４５：６５９ −６７６；Ｒｏｓｅ、Ｔ、Ｍ、ｅｔ　ａ±、（１９８６）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：１２６１−１２６５：Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｇ、 Ｓ、ａｎｄ　Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ、Ｊ、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、１６：８７２０−８７３０）。ヒト血清トランスフェリンのＤＮＡ 配列が決定された（Ｙａｎｃｉ、ＵＳＡ　８１：２７５２−２７５６）。組み替 えトランスフェリンの製造のための全−長ＤＮＡ又はトランスフェリンあるいは その一部のアミノ−末端又はカルボキシ−末端突出部のいずれかをコードする切 断ＤＮＡを、利用できる供給源から得ることができるか、又は標準的方法により 既知の順序に従って合成することができる。組み替えトランスフェリンを細胞培 地中に分泌させるために、トランスフェリンシグナル配列（又は発現系に適した 他のシグナル配列）をコードするＤＮＡをトランスフェリンコードＤＮＡの上流 に置く。

トランスフェリン及びトランスフェリン半一分子の突然変異体を、特定部位の突 然変異誘発の標準的方法により製造することができる。Ｔａ８−５００を参照。

特に突然変異誘発を用いて天然のトランスフェリンと異なる金属結合性を有する 突然変異体トランスフェリンを製造することができる。例えば、天然のトランス フェリンより激しく鉄と結合することができる突然変異体を製造することができ る。そのような突然変異体の製造のためには、金属−結合ドメインの突然変異を 誘発し、結合に含まれる１個又はそれ以上のアミノ酸を別のアミノ酸と置換する 。ヒト血清トランスフェリンの場合の金属キレート化のためのリガンドであるア ミノ酸を下記に示す（アミノ酸の横の番号は一次配列中のアミノ酸残基の位置を 示し、その場合成熟タンパク質の第１バリンを位置１と指定する）。

アミノ末端突出部　カルボキン末端突出部（アミノ酸１−３３７）　（アミノ酸 ３４３−６７９）アスパラギン酸　６３　アスパラギン酸　３９２チロシン　９ ５　チロシン　４２６ チロシン　１８８　チロシン　５１９ ヒスチジン　２４９　ヒスチジン　５８４他の種類のトランスフェリンの場合、 番号が異なりリガンド（アミノ酸）は同一である。

トランスフェリンの他の領域は結合を制御し、これらも突然変位誘発の標的とな ることができる。通常これらは正に帯電したアミノ酸、例えばリシン、ヒスチジ ン又はアルギニンである。例えば天然のトランスフェリンより激しく鉄と結合す る突然変異体トランスフェリン半一分子は、２０６位のりシン残基をグルタミン で置換することにより（ＡＡＧ＋ＣＡＧ）製造することができる。

トランスフェリン−コードＤＮＡを、ＤＮＡの発現を指示するための適した調節 要素を含む真核発現ベクター中にクローニングすることかでプラスミドｐＮＵＴ である。このプラスミドはメタロチオネインプロモーターを含み、それは重金属 及びヒト成長ホルモンの転写停止シグナルの存在下におけるトランスフェリンコ ードＤＮＡの転写物を含む。さらにｐＮＵＴは、細胞培養物中における選択を可 能にするためのヒトＢ型肝炎ウィルスからの転写停止シグナルと共にＳＶ４０初 期プロモーターの制御下にあるジヒドロホレートレダクターゼ遺伝子を含む。遺 伝子は、競争的阻害剤メトトレキセートに対する親和力が２７０倍低い突然変異 体の酵素をコードする。これにより、トランスフェクションされた細胞を非常に 高濃度（０，５ｍＭ）のメトトレキセート中で直接選択することが可能になり、 ジヒドロホレートレダクターゼの不足した受容性細胞系の必要性を廃する。ｐＮ ＵＴはｐＵｃ１８誘導配列も含み、それによりｐＮＵＴがＥ、ｃｏｌｉ中で増幅 されて受容性細胞のトランスフェクションのために十分な量のプラスミドを与え ることができる。

トランスフェリンをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、適した宿主細胞中 に挿入される。好ましい宿主細胞は、ベクターを用いて形質転換され、機能的に 活性のトランスフェリン構築物を発現する安定な細胞系を与えることができる真 核細胞である。特に有用な細胞はベビーハムスター腎臓細胞である。ベビーハム スター腎臓細胞は、トランスフェリンをコードするＤＮＡ構築物を有するベクタ ー（例えばｐＮＵＴなど）を用いてトランスフェクションされ、機能的に活性な トランスフェリン（全又は半一分子）を発現し、分泌する安定な細胞培養系を与 えることができる。これらの細胞は経済的な大規模成育に十分適しており、容易 に利用できる供給源から得ることができる。

リン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーションなどの標準的方法を用い、真 核宿主細胞をベクターでトランスフェクションすることができる。その後細胞を 、トランスフェリンの発現を誘導するのに適した条件下で培養する。例えばｐＮ ＵＴベクターを用いてトランスフェクションしたベビーハムスター腎臓細胞を、 重金属の存在下で刺激し、トランスフェリン構築物を発現させることができる。

ベビーハムスター腎臓細胞は、血清基質Ｕｌｔｒａｓｅｒ　ＧＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ）を約１％で含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地−Ｈａｍ’５Ｆ−１２ 栄養剤混合物の培地中で培養するのが好ましい。

適した培養期間の後、発現され、分泌されたトランスフェリンを培地から回収す ることができる。標準的精製法を用いて組み替えトランスフェリンの実質的に等 質の試料を得ることができる。１つの具体化の場合、培地中のトランスフェリン に鉄を飽和させ、その後アニオン交換クロマトグラフィーにより精製する。

本発明の組み替えトランスフェリンは、鉄又は他の毒性金属とキレート化し、体 から除去するのに用いることができる。生体内の鉄キレート化の通常の方法は、 微生物起源の天然に存在する多様なシデロフォア及び合成鉄キレート剤を、その 生理学的効果、主に鉄と結合して体から除去する能力につき評価することであっ た。このような化合物の多くが研究され、鉄の除去の能力は様々であり、多くの 場合許容し得ない副作用ら過剰の鉄を除去するために用いられるキレート剤とし て、ストレプトミセス　ピロシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｉｌｏｓｉｓ ））がらの環状ペプチドであるデフエロキサミンのみが残っている。

鉄キレート化治療に好ましいトランスフェリンは、天然のトランスフェリンより 激しく鉄と結合する突然変異体トランスフェリン半一分子である。突然変異体半 一分子の使用により、金属のより有効なキレート化及び除去が可能になる。特に 好ましい突然変異体半一分子は、下記の実施例に記載するに２０６Ｑであり、こ れは２０６位にリジンではなくグルタミンを含む。トランスフェリン半一分子は 、ホロータンパク質と異なり腎臓の糸球体を通過し、尿中に排泄され、従って金 属がキレート化されるのみでなく体から除去されるので有利である。さらに単独 の半一分子は組繊細胞の膜上のトランスフェリンレセプターと結合しないので、 これらの組織に鉄を輸送しない。さらにヒトトランスフェリンの半一分子はおそ らくヒトの体により“自己”と認識され、従って免疫学的応答を引き出さない。

さらに突然変異体半一分子は、金属イオン選択性が変わるように設ε１すること ができる。キレート化剤を用いて他の毒性金属、例えば鉛、水銀、カドミウム、 銅及び亜鉛を体から除去することができる。

キレート化治療の場合、金属をキレート化して循環量を毒性型以下に下げるのに 十分な量で組み替えトランスフェリンを患者に投与する。一般にこれは生理学的 に許容し得るビヒクル、例えば食塩水中で、非経口的経路で（典型的に静脈内） 投与する。

組み替え全−長ヒトドランスフェリンは、細胞培養培地のための非血清補足物中 で使用することができる。トランスフェリンは成長細胞による鉄吸収に必要であ る。組み替えトランスフェリンの使用により、ヒト血清から精製したｌ・ランス フェリンに伴う汚染物（例えばＨＩ　Ｖ又は肝炎ウィルス）の危険を避けること ができる。

本発明を以下の実施例によりさらに例示する。

衷塵例 ■　アミノ−末端突出部を含む組み替えｌ・ランスフェリン半一分子の製造 朋 Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメント）及び Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ−ＰＬＢｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。制限エンドヌクレアーゼはＰｈａｒｍａｃｉ ａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ及びＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。

オリゴデオキシリボヌクレアーゼは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　 ３８０Ａ　ＤＮＡ合成機上で合成した。ニトロセルロースフィルターは、５ｃｈ ｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌから、３２ｐ−標識ヌクレオチドはＮ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから、ヒツジ抗−ヒトドランスフェリン 抗血清はＳｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　Ｃｏｍｐａｒｒｙから、ホルマリン− 固定スタフィロコックス　アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ ｅｕｓ））細胞は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓから、プロトプロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔ）免疫スクリーニング検出系 はＰｒｏｍｅｇａから、オリゴヌクレオチド−指示（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ 　１ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発キットはＡｍｅｒｓｈａｍから、Ｄ ｕ　Ｉ　ｂｅｃｃｏの修正必須培地及びウシ胎児血清はＧｉｂｅＯから、及び抗 −ヒトドランスフェリンモノクローナル抗体ＨＴＦ−１４はＣｚｅｃｈｏｓｌｏ ｖａｋｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅから得た。他の試薬はす べて分析用か又はそれ以上の純度であった。

ｕａｒｔ　０ｒｋｉｎ、　（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｊｔｙ）提供によ るＥ、ｃｏｌｉ発現ベクターｐＫＴ−２１８（Ｐｒｏｃｈｏｗｎ５８　：　８３ ８９−８３９４）中に構築されたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリを、血清ｈＴＦの アミノ−末端８アミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチドをハイブリッド形 成プローブとして用いてスクリーニングし５６により報告されたｈＴＦ　ｃＤＮ Ａ配列のヌクレオチド８８−１１１に対応した。オリゴヌクレオチドはＴ４ポリ ヌクレオチドキナーゼ及び”Ｐ−ＡＴＰを用いて末端−標識しくＣｈａｃｏｎａ ｓ、Ｇ、ａｎｄ−ニングに用いた。陽性のクローンの制限エンドヌクレアーゼマ ツピング及びＤＮＡ配列分析を、それぞれｐＵｃ１９及びＭ１３ｍｐ１９ベクｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＩＴａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、　（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｌｏｌ：２０−７８；Ｓａ ｎｇｅｒ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、（１９７７）Ｐ発現ベクター及び細胞培養、　真核 発現ベクターｐＮＵＴ　（Ｐａ　１ｍ）−（Ｋ　）細胞はＤｒ、Ｒｉｃｈａｒｄ 　Ｄ、Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　（Ｈｏｗａｒｄ　Ｈｕｇｈｅｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）の提 供による。合成後、オリゴヌクレオチドをｃｐｓ逆相カラム上で精製した（Ｓｅ ｐ−Ｐａｋ。

Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ；Ａｔｋｉｎｓｏｎ、Ｔ、ａｎｄｉｔ、Ｍ 、Ｊ、、Ｅｄ、）ｐｐ３５−８１．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ）ｏ　Ｔ ａｙｌｏｒ、　Ｊ、　Ｗ、旦ａ　１．　（１９８５）　Ｎｕｃ。

１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８７４９−８７６４の方法を用いること により、特定部位の突然変異誘発を行った。プラスミドＤＮＡは、Ｅ、ｃｏ　Ｉ 　ｉ　ＪＭ１０５から調製し、塩化セシウム密度勾配を用いた２連続遠心段階に より生成した。

ＢＨＫ細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修正必須培地（ ＤＭＥＭ）中で１０−ｃｍの皿当たり約１０７細胞に成長さム共沈法により１０ μｇのプラスミドを用いてトランスフェクションした。２４時間後、培地を１０ ０μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含むＤＭＥＭに変え、生存細胞を５００ μＭまで厳重に選択した。いくつかの実験では５００μＭのＭＴＸを直接用いて 細胞を選択した。大規模の回転類培養は、１００ｍＬのＤＭＥＭ−ＭＴＸを含む それぞｔＬ８５０ｃｍ２の回転瓶中に約５Ｘ１０’個の細胞を播種して開始した 。Ｚｎ５Ｏ。

を０．０８ｍＭの最終濃度まで培地に加えることにより８０％の集密度にて培養 物を誘導した。培地を４０時間後に収穫した。

免疫−沈降及びウェスターンブロッティング、　細胞培養培地及び細胞ライセー ドの免疫−沈降を、Ｖａｎ　０ｏｓｔ、Ｂ、Ａ、ｅｔ　ａｔ。

（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６４５、：６９９−７０ ５の方法により行った。沈降物をＮａＤｏｄＳＯ４の存在下における１２％ポリ アクリルアミドゲル上の電気泳動により分析しくＬａｅｍｍｌ　ｉ、Ｕ、に、（ １９７０）Ｎａ　ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）λ又ユニ６８０−６８５Ｌ、その 後ニトロセルロース膜上にブロッティングした。

プロットをＱ、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含むＰＢＳ中でインキュベートし、そ の後ヒツジ抗−ｈＴＦ抗血清（ＰＢＳ中で２５０−倍希釈）を用いて処理し、最 後にアルカリホスファターゼ−複合ウサギ抗−ヒツジＩｇＧ抗体を用い、供給者 の指示に従って発色した。

アミノ酸置換、３−フルオロチロシンを組み替えｈＴＦ／２Ｎ中に１’Ｆ　ＮＭ Ｒプローブとして挿入するために、培養培地に培地中１６％の！、−チロシン濃 度でり、Ｌ−ｍ−フルオロチロシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）を補足した。細胞はり、Ｌ−ｍ−フルオロチロシンのない培地と同様に この培地上でも十分に成長した。

組み替えｈＴＦ／２Ｎの単離　収穫した培養培地をフェニルメチルスルホニルフ ルオリド中で０．０１％としてプロテアーゼを阻害し、培地中のトランスフェリ ンのすべてを飽和させるのに十分なＦｅ（ＩＩＩ）（ＮＴＡ）２を加えた。室温 で撹拌した後、溶液を冷水道流水に対して２４時間、そのｉ＆Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ −Ｑ精製水に対して数時間透析した。濃トリスーＨＣｌ緩ｉｔｉ液、ｐ）Ｉｓ、 ４を５ｍＭの最終濃度まで加え、試料を遠心して破片を除去し、ｌＱｍＭのトリ ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，４で平衡化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｃｅｌ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（２，５ｘ８０ｃｍ）に負荷した。

その後カラムを同緩衝液中のＮａＣ＋の直線勾配（０−０，３Ｍ）を用いて溶離 した。ピンク色を示す留分をＮａＤｏｄＳＯ４ＰＡＧＥにより分析し、組み替え タンパク質（Ｍｒ３７，０００）を含む留分を集めた。そのような留分け、組織 培養培地中のウシ胎児血清からのウシトランスフェリン及びアルブミンも含む。

集めた留分をＡｍ１ｃｏｎ　ＰＭ−１０膜上で５ｍＬに濃縮した後、タンパク質 を、１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムで平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７ ５Ｓｕｐｅｒｆｊｎｅ（Ｐｂａｒｍａｃｉａ−ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）のカラム（２，５ｘ９０ｃｍ）上のクロマトグラフィーにかけた。

ウシタンパク質からｈＴＦ／２Ｎを完全に分離するために、このカラムを通して ２回目のクロマトグラフィ一段階が必要な場合がある。この段階でＡ４．５／Ａ ４１０は通常く１０であり、汚染ヘム−タンパク質（おそらくヘモベキシン）の 存在を示している。ｈＴＦ／２Ｎは、５０ｍＭのトＩＪス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０ 中のＮａＣ］（７）直線勾配（０−０，３Ｍ）を用いたＰｏ１ｙａｎｉｏｎ　Ｓ ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（１ｘｌＯｃｍ）上で１ｍ１／分の流量に て１時間かけたＦＰＬＣにより最終的に精製して等質にした。１ｍＬの留分を集 めた。タンパク質の鉄−結合状紗に依存して２−４個のタンパク質バンドがカラ ムから現れた。

５％−１２％勾配ゲルを用いてＮａＤｏｄＳＯｎ−ＰＡＧＥを行い、の修正法（ Ｂｒｏｗｎ−Ｍａｓｏｎ、Ａ、ａｎｄ　Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ。

８７３）に従ってウレア−１”ＡＧＥを行った。１１０ｍＬのガラスカラム（Ｌ ＫＢ）中の０−５０％スクロース勾配上で領　８％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ、ｐ Ｈ５−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて焦点電気泳動を行った。カラムは１０ ０ＯＶにて２ｍＡの最終電流に終夜予備集中させた。

０．２ｍＬ中の試料を勾配の半ばから回収した５ｍＬの溶媒で希釈した。その後 試料をカラムの等密度領域に再注入し、集中を２４時間続けた。勾配をカラムの 底から１．５ｍＬの留分て集めた。各留分を八２１１１１及びｐＨに関して分析 した。最高Ａ２１゜を有する留分を、アポ−及び鉄−飽和タンパク質のｐ■を示 すとして選択した。

鉄は、１ｍＭのＮＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、領　５Ｍの酢酸ナトリウムを含む緩 衝液、ｐ＋−１４，９中でインキュベートすることにより、鉄−タンパク質から 容易に除去できた。アポ−タンパク質をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０　（Ａｍｉ　 ｃｏｎ）上て最小体積に濃縮し、その復水を用いて２回、及び０．ＩＮのＫＣＩ を用いて２回希釈して再濃縮した。アポ−タンパク質は純水中で沈澱する傾向が あるが、０．１ＭのＫＣＩ中に容易に再溶解した。アポ−タンパク質をＮ　ａ　 ＨＣＯｊ中で１０ｍＭとし、４６５ｎｍで吸収を監視しながら適した濃度のＦｅ 　（ＮＴＡ）２で滴定した。

組み替えｈＴＦ／２Ｎの定量的免疫検定　競争的固相免疫検定を用い、精製の種 々の段階で培養液中の組み替えｈＴＦ／２Ｎの濃度を評価／２Ｎ（Ｌｉｎｅｂａ ｃｋ−Ｚｉｎｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、に、（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、２５５ニア０８−７１３）をＩｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて放射ヨウ素化しくＦｒａｋｅｒ、Ｐ、Ｊ、 ａｎｄ　５ｐｅｃｋ、Ｊ。

Ｃ，、Ｊｒ、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、８０　：　８４９−８５７）　、標準として用いた。モノクロー ナル抗−ｈＴＦ抗体であるＨＴＦ−１４をプローブとして用いた（Ｂ端突出部の みを認識しくＭａｓｏｎ、Ａ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、（１９８８）Ｂｒ、Ｊ、Ｈａｅ ｒｒｉａｔｏｌ、６８：３９２−３９３）ウシトランスフェリンを認識しない（ Ｐｅｎｈａｌｌｏｗ、Ｒ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、（１９８６）Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、１２８：２５１−２６０）。

アミノ−末端配列分析、　組み替えｈＴＦ／２Ｎの非主要形態及び主要形暢両方 のアミノ−末端配列をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｅｒｍｏｎｔｃ７）Ｇｉ ｖｅｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＦａｃｉｌｉｔｙにてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ上で決定した。

過ヨー素酸−ンンフ染色　組み替えｈＴＦ／２Ｎ中のオリゴ糖の存在を、タンパ ク質を過ヨー素酸−シッフ試薬で染色することにより決定した（Ｆａｉｒｂａｎ ｋｓ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、（１９７１）Ｂｉｏｃｈｅｙｆｕｓ　ＮＭＲＬａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｅｒｍ。

ｎｔにおける５、８７２　Ｔｅ５ｉａ　Ｂｒｕｋｅｒ　ＷＭ　ＮＭＲスペクトロ メーターにて請求積検出（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を用い たフーリエ変換モードで操作してプロトン及びフッ素ＮＭＲスペクトルを得た。

ＩｏＦプローブはその部門のＤｒ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｗ、Ａｌ１ｅｎに より提供された。プロトンスペクトルの場合、スペクトロメーターの設定は前記 の通りであった（Ｖａｌｅｏｕｒ、Ａ、Ａ、　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ、Ｒ ，Ｃ，（１９３７）Ｗ±−正−ｇ−Ｗ−魚更一り糺ｊｒ　ｙ　λ６：３１２０　 ３１２５）。１９Ｆスペクトルの場合、掃引幅は３０．０００Ｈｚであり、アク イジション時間は０２７９秒であり、アクイジシヨンと１５．０１ｓ　（９０° ）のパルスノ間に２．０秒ルンーバーデレー（ｒｅｃｉｅｖｅｒ　ｄｅｌａｙ） が介在し、試料は３０３”Ｋてあった。ｌｉｍＦ化学シフトは２［（２０中のＯ ｌＬＭの三フッ化酢酸に対する。タンパク質試料は０．１ｍＬの９９．８原子％ ’４１．０中の６−８ｍｇであり、スペクトルは’　１１　、　Ｏを含む標準的 Ｓｍｍ　ＮＭＲ管に挿入された領　１ｍＬのカプセル中のこれらの試料につき走 査した。ｌｉＦスペクトルの自由誘導減衰（ｆ　ｒｅｅ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　 ｄｅｃａｙ）につき、フーリエ変換の前に１．　Ｑ　Ｈｚのライヒｌ−Ｔ　Ｆ　 ｃ　Ｉ）　Ｎへの単離　ハイブリッド形成プローブとしてヒトＴＦ　ｃＤＮＡの ５°配列への２４塩基オリゴヌクレオチドを用い、ヒト肝臓ｃＤＢＡライブラリ （Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ、Ｅ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２５８：８３８９−８３９４）の約１００，０００個のコロニーをスク リーニングした。１個の陽性のコロニーを得た。このコロニーから単離されたプ ラスミドの広範囲８１　：２７５２−２７５６により同一のライブラリから単離 されたヒトＴＦ　ｃＤＮＡから予想されたパターンと完全に一致した。このクロ ーンの５°　−及び３°−末端のＤＮＡ配列分析は、それがＹａｎｇ　ｅｔａｌ 、により単離された全−長クローンと同一であることを確証した。

このｃＤＮＡの突然変異誘発及びサブクローニングの間に行われるその後の配列 分析はすべて以前に報告された配列に正確に従った。

ベクター構築及び発現　２個の翻訳停止コドン及び１個のＨ玉ｎｄＩＩＩ認識部 位をｈＴＦ　ｃＤＮ八配列配列ミノ−及びカルボキン−末端ドメインの間のリン カ−領域に、オリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発により導入した。この構築 物からの推定翻訳配列は、血清ｈＴＦ番号付は配列に従いΔ５ｐ−３３７で終わ る（ＭａｃＧｉ　ｌ　Ｉ　１ｖｒａｙ、　Ｒ，Ｔ、　Ａ、旦　且↓、（１９８３ ）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５８　：　３５４３−３５５３）。

発現ベクターｐＮＵＴ　（Ｐａ　Ｉｍｉ　ｔ　ｅ　ｒ、　Ｒ，Ｄ、旦　見上、（ １９８７）Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　（Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ、ＭＡ）５０　：４３５−４ ４３）はマウスメタロチオネイン−１／ヒト成長ホルモン遺伝子融合物を含み、 これは形質転換マウスにおいて多量のヒト成長ホルモンを指示することが示され た（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、Ｒ，Ｄ、ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　（ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，）　２２２：８０９−８１４）。このベク ターの重要な機能的特徴には、マウスメタロチオネイＣＯ±土中でｐＵｃ１８配 列の複製及び選択を可能にし、ＳＶ４０初期プロモーターにより誘導されたンヒ ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡの細胞培養物における選択を可能に することが含まれる。ＤＨＦＲｃＤＮＡは、競争的阻害剤メトトレキセート（Ｎ Ｍ）に対する親和力が２７０−倍低い酵素の突然変異体をコードする（Ｓｉｍｏ ｎｓｅｎ、Ｃ，Ｃ，ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、Ｄ、（１９８３）Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：２４９５　２４９９）。

これは、トランスフェクションされた細胞を非常に高濃度（領　５ｍＭ）のＮｊ ＴＸ中で直接選択することを可能にし、Ｄ　Ｉ（Ｆ　Ｒの不足した受容性細胞系 の必要性を廃する。

発現ベクターｐＮＵＴ−ｈＴＦ／２Ｎの構築のために、バクテリア発現ベクター からＢａｍＨＴ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　＋フラグメントを単離した（図１）。最初 のトランスフェリンｃＤＮＡクローンからのＩｌｐａｌｌ−Ｂａｍｌｌ＋フラグ メントも単離した（図１）。その後これらの２つのフラグメントを、Ａｃｃｌ及 びＨｉｎｄｌＩＩを用いて切断したＭ１３ｍｐ１８複製可能形Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ａ中 に連結した。得られたＭ１３ファージからの複製可能形管ＤＮＡを単離し、Ｘｂ ａｌ及びＨｉｎｄｌ　ｌ　１を用いて切断することにより挿入片を放出させ、末 端を平滑末端とした。これらの段階は、フラグメントが１訳停止シグナルを含み 、タンノ々り質のための天然のノブナル配列を保持し、最初のベクター中にある ｄ　Ｇ／ｄ　Ｃ尾部を含まないことを保証する（図１）。このフラグメントをＳ ｍａ　Ｉ−切断ｐＮｔＪＴ中に挿入し、かくしてヒト成長ホルモン遺伝子はｈＴ Ｆ／２ＮコードｃＤＮＡと置換されるが成長ホルモン遺伝子からの転写停止／グ ナルはそのまま残った。このプラスミドをＢＨＫ細胞中にトランスフェクション し、得られた形質転換物をＭＴＸの存在下で選択した。

トランスフェクションされたＢＨＫ細胞により製造されたｍＲＮＡ転写物の分析 のために、ホルムアルデヒドの存在下のアガロースゲル上でｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）ｏ＝ニトロセルロースに移した後、 ノ＼イブリッド形成プローブとしてｈＧＨ遺伝子の３゛非翻訳領域に対するオリ ゴヌクレオチドを用いてプロットを分析した。トランスフェクションされた細胞 系で約１．４ｋｂの誘導ｍＲＮＡが検出されたが、疑似−感染ＢＨＫ細胞では検 出されなかった（データは示していない）。これはｈＧＨ３’非翻訳配列及びポ リ（Δ）尾部を含むｂＴＦ／２Ｎ　ｍＲＮへの推定サイズと一致した。

形質転換されたＢＩＩＫ細胞により製造されたポリペプチドの分析のために、種 々の細胞系の細胞ライセード及び培地の両方につきウェスターンプロット分析を 行った（図２）。ＢＨＫ細胞、ｈＧＨ−ｐＮＵＴプラスミドを含むＢ　ＨＫ細胞 及びｈＴＦ／２Ｎ−ｐＮＵＴプラスミドを含むＢＨＫ細胞の試料をＤＭＥＭ　（ ＢＨＫ細胞）又はＤＭＥＭ−ＭＴＸ　（１）ＮＵＴベクターを含むＢＨＫ細胞） 中で成育した。細胞が集密に達したら培地の試１を採取し、細胞ライセードを調 製した。これらの試料を順にヒツジ抗−ｈＴＦ抗血消及びホルマリン−固定Ｓ、 アウレウス（旦工ａｕｒｅｕｓ）細胞と共にインキュベートした（Ｖａｎ　０ｏ ｓｔ、Ｂ。

Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

６４・６９９−７０５）。

ＮａＤｏｄＳＯ，と共にインキュベートし、ポリアクリルアミドゲル」二で電気 泳動させ、ニトロセルロース膜に移すことにより結合タンパク質を溶離した。そ の後膜をヒツジ抗−ｈＴＦ抗血清及びアルカリホスファターゼと複合化したつづ ギ抗−ヒツジ免疫グロブリンと共にインキュベートした。Ｂ　ＨＫ細胞からの細 胞ライセード又は培地（図２．１８列及びｌｂ列）、あるいはｈＧＨ−ｐＮＵＴ プラスミドを含むＢＨＫ細胞からの細胞ライセード又は培地（図２．２ａ列及び ２ｂ列）を分析すると、最初のヒツジ抗−ｈＴＦ抗体から予想されるヒツジ免疫 グロブリンバンド（Ｍｒ　２５，０００及び５０．０００）及び少量の交叉反応 物質のみが観察された。しかしｈＴＦ／２Ｎ−ｐＮＵＴプラスミドを含むＢＨＫ 細胞の細胞ライセード（図２．３ａ列）又は培地（図２．３ｂ列）中に、さらに Ｍｒ　３７．０００のバンドが観察された。このポリペプチド鎮の分子量は、ア ミノ酸配列から算出されたｈＴＦ／２Ｎ分子の分子量（３７，８３３）と非常に 一致している。

ｈＴＦ／２Ｎ生成物の等質性は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で細胞ライセード及び分泌 試料が共移動した際のシグナル配列の除去の成功を示す。沈澱物中にウシＴＦが ほとんど現れないので抗−血清はヒトＴＦ種に特異性が高いことがわかる。

回転瓶で成育されるｈＴＦ／２Ｎ細胞系の大規模培養の場合、培地中のｈＴＦ／ ２Ｎの濃度はラジオイムノアッセイにより検出して約１０−１５μｇ／ｍｌであ った。

組み替えｈＴＦ／２Ｎの単離及び特性化、　組み替えｈ　Ｔ　Ｆ　／　２　Ｎを ３段階法により精製し、それはラジオイムノアッセイに基づいて８０％の収率の 主要形態のタンパク質を日常的に与える。Ｐｏ１ｙａｎｉｏｎＳＩ上の最終的精 製は、ウレア−ＰＡＧＥ　（図３、パネルＣ）により確証される通り、タンパク 質の非主要成分（く５％）及び主要成分（図３、パネルＡ）の両方のアポ−及び 鉄−飽和形態を定量的に分離した。

ウレア−ＰＡＧＥ上で最も移動の遅いバンドはアポ−ｈＴＦ／２Ｎであり、移動 の速いバンドはＦｅ−ｈＴＦ／２Ｎであることに注意してほしい。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル（図３、パネルＢ）は、主要形態及び非主要形態の組み替えｈＴＦ／２ Ｎが、等分子量の単分散であり、主要成分がＰＡＳ染色により炭水化物を含まな い（データは示していない）ことを示した。

一般にこれらの試料は、原核的誘導ｈＴＦ／２Ｎより優れた単分散性を有するよ うである（Ｌｉｎｅｂａｃｋ−Ｚｉｎｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、に、（１９８ ０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ５５　：　７０８−７１３）（図３）。例えば クロマトグラフィーのピークは前者の場合の方がより規則的であり、ウレア−Ｐ ＡＧＥ上のバンドの数は後者の方が多い。鉄−飽和組み替えタンパク質の場合の スペクトル比は、典型的にＡ　２１１０／　Ａ　４ｇ５＝　２１及びＡ４６Ｓ／ 　Ａ４１０＝　１．３８であり、これはヒト血漿から単離された純粋なトランス フェリンニ鉄の場合に優るとも劣らない。

Ｆｅ（ＮＴＡ）ｚを用いたアポ−タンパク質の３．６８Ａ２１１゜単位の滴定は 、Ｅ４６ｓｍＭ＝２．１に対応する傾斜を与え、アポ−タンパク質のＥ２１１゜ ｍＭ＝３８．８を示しく図４）、両方共、半一トランスフェリン分子として合理 的な値である（Ｌｉｎｅｂａｃｋ−Ｚｉｎｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、に、（１ ９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５＋７０８−７１３；Ｚａｋ、０．ｅｔ 　ａ±、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　７４２：４９０−４９５）、アポ−及びＦｅ−ｈＴＦ／２ Ｎの場合のｐ■はそれぞれ６．５及び５．４であった。

非主要及び主要形態の両方の組み替えｈＴＦ／２Ｎのアミノ−末端配列分析は、 血清からのポローｈＴＦの場合に見いだされた結果と同一の結果を与えた（Ｍａ ｃＧｉ　Ｉ　Ｉ　１ｖｒａｙ、Ｒ，Ｔ、Ａ、ｅコ、ａ±（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ　λ且旦：　３５４３−３５５３）（表１）。

組み替えタンパク質のプロトンＮＭＲスペクトル（図５）は、タンパク質分解− 誘導ｈＴＦ／２Ｎのスペクトルと非常に似ている（Ｖａｌｃｏｕｒ、Ａ、Ａ、ａ ｎｄ　Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ、Ｒ，Ｃ，（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 λ６　：　３１２０−３１２５）が、組み替えタンパク質の場合の方が共鳴線は 鋭い。ｍ−Ｆ−チロシンを補足した培地上で成育した細胞培養物から誘導したタ ンパク質の１９Ｆ　ＮＭＲスペクトル（図６）は、４つの十分に分離した共鳴を 示し、２つはおそらく未分離ンヨルダーを有する。

人１ ヒトトランスフェリン及び組み替えヒトトランスフェリンアミノ−末端半一分子 のアミノ−末端配列 タンパク質　アミノ酸配列　参照 ヒト血ｉｌｌ　Ｖ−Ｐ−Ｄ−に−Ｔ−Ｖ−Ｒ−Ｗ−Ｃ−Ａ−Ｖ−３−ＭａｃＧｉ ｌｌｉｖｒａｙトランスフェリン　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）組ミｔＪ工Ｖ− Ｐ−Ｄ−に−Ｔ−Ｖ−Ｒ−Ｗ−Ｘ−＾−Ｖ−Ｓ−本報告ｈＴＦ／２Ｎ（主要） 組み替え　Ｖ−Ｐ−Ｄ−に−Ｔ−Ｖ−本報告ｈＴＦ／２Ｎ　（非主要） °組み替えｈＴＦ／２Ｎ配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７ ０Ａ　タンパク質シーケンサー上で決定した。約２００ｐモルの各試料を分析し た。５１２ソーケンサーサイクルを分析した。′サイクル９で残基は同定されな かった：しかじ分析の前にシスティン残基は修飾しなかった。６６ンーケンサー サイクルを分析した。

組み替えＤＮＡ法を用いることにより、いくつかの独立した基準で判断してタン パク質分解により誘導された種と同一の機能を果すｈＴＦ／２Ｎ分子を製造する 。これは、この重要な鉄輸送タンパク質の機能的活性形態の、安定な細胞培養系 における発現の初めての報告となる。

本文に記載のｐＮＵＴに基づ＜ｈＴＦ／２Ｎ構築により、ＤＨＦＲ−不足細胞系 又は冗長な耐性増幅法を必要とせずに多量の組み替えタンパク質が製造された。

Ｂ　■（Ｋ細胞は経済的大規模成育に十分適しており、現在我々はバイオリアク ター容器中の微量担体上の成育特性を試験中である。数リットルの容量を有する 回転瓶又は発酵器のいずれかを用いることにより、従来高濃度のタンパク質を必 要としてきたＮＭＲのような方法にさえ十分な組み替えタンパク質を容易に製造 することができる。

Ｐｏ１ｙａｎｉｏｎ　Ｓｌ上で単離された非主要形態の組み替えｈＴＦ／２Ｎは 、ウレア−ＰＡＧＥ上の移動が主要形態より遅い（図３、パネルＣ）が、５ＤＳ −ＰＡＧＥ　（図３、パネルＢ）上では同速度である。

従って見掛けの分子量は同一であるが６Ｍウレア中の変性の相対的程度が異なる 。タンパク質分解−誘導アポーｈ　Ｔ　Ｆ　／　２　Ｎは６Ｍウレア中でも移動 の速い種を示すことに注意してほしい（図３、パネルＣ１留分ｇ及びｈ）。

これらのゲル上でのＦｅ−ｈＴＦ／２Ｎによるアポ−ｈＴＦ／２Ｎの汚染及びそ の逆は、ＦＰＬＣ留分の収集法、ウレアゲル上における結合鉄のいくらかの損失 、及びＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃ試料の仕上げの間の汚染鉄の結合から生ずる。同一のＮ− 末端配列（表１）は、シグナルペプチドが非主要及び主要形態の組み替えタンパ ク質の両方から除去されたことを示す。

ヒト血清からのｈＴＦ／２Ｎの場合と同様に（Ｌｉｎｅｂａｃｋ−Ｚｉｎｓ、Ｊ 、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、に、（１９８０）Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ５５　：　 ７０８−７１３）　、組み替えｈＴＦ／２Ｎは非−グリコシル化である。ｈＴＦ ／２Ｎの主要形態及び非主要形態の差の理由は現在未知である。非主要形態は合 計の組み替えタンパク質の５％以上とならず、通常１％以下である。従って単分 散組み替えｈＴＦ／２Ｎ　（主要形態）の単離の目標は達成された。

組み替えｈＴＦ／２Ｎの鉄結合挙動、ｐｉ、Ｎａ　Ｄｏ　ｄ　５Ｏ４−ＰＡＧＥ 及びウレア−ＰＡＧＥ上の移動、ならびにプロトンＮＭＲスペクトルは、サーモ リンンを用いたタンパク質分解によるアミノ末端ｈＴＦ−鉄から誘導されたｈＴ Ｆ／２Ｎのものと、上記の点を除いて十分合理的に一致する（１，１ｎｅｂａｃ ｋ−Ｚｉｎｓ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｒｅｗ、Ｋ。

（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５旦：　７０８−７１３　：ＶａＩｃ ｏｕｒ、Ａ、Δ、ａｎｄ　Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ、Ｒ，Ｃ，（１９８７）Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓ工■　２６：３１２０−３１２５）。タンパク質分解により誘導され たｈＴＦ／２Ｎより主要形態の組み替えタンパク質は単分散性が高く　（図３） 、そのプロトンＮＭＲスペクトルは鋭い共鳴線を示す。非主要形態の量はＮＭＲ による分析には不十分であった。

Ｅ、ｃｏｌｉからのアルカリホスファターゼ中へのｍ−フルオロチロシンの挿入 の以前の研究は、タンパク質中のチロシル残基を特異的に精査するためのＩ’Ｆ 　ＮＭＲの有効性を確立した（Ｓｙｋｅｓ、Ｂ、Ｄ。

ｅｔ　ａｌ、（１９７４）Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ ↓：４６９−４７３；Ｈｕｌ　Ｉ、Ｗ、Ｅ、ａｎｄ　５ｙｋｅｓ。

Ｂ、Ｄ、（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：３４３１−３４３７） 。組み替えｈ　Ｔ　Ｆ／２　Ｎ中へのｍ−Ｆ−チロシンの挿入により、この細胞 培養系において選択的アミノ酸置換が可能であり、チロシル側鎖の特異的ＮＭＲ プローブへの方法を与えることが証明された。この試料は非−置換組み替え体に 関して上記で記載した通り、非−修飾タンパク質とすべての点で同様に挙動する 。多量の挿入の達成のために細胞培養条件を最適化した場合、常磁性及び反磁性 金属を添加した時、及びｐＨを変化させた時の”Ｆ　ＮＭＲスペクトルの変化は 、金属結合に特異的に含まれるチロシル残基の研究に有用であろう。選択的にジ ューチリウム化した芳香族アミノ酸の挿入は、日本ウズラからのリゾチームに関 する研究と同様の方法でタンパク質のプロトンＮＭＲスペクトルの芳香族領域の 分析を可能にするであろう（Ｂｒｏｗｎ−Ｍａｓｏｎ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、（１９ ８１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６：１５０６−１５０９）。

ＩＩ　カルボキン末端突出部を含む組み替えトランスフェリン半一分子の製造 ｈＴＦのカルボキシ突出部のコード配列を含むＥｃｏＲｒ制限フラグメントを、 全長ｈＴＦ、ｃＤＮＡから単離し、ＰＣＲ−指示突然変位誘発の鋳型として用い た（図２）。ＰＣＲプライマーとして用いるために２個のオリゴヌクレオチドを 合成した。オリゴ１は、Ｓｍａ　Ｉ認識部位をコードし、ｈＴＦの天然のシグナ ル配列をコードする配列が続き、アミノ酸３３４−３４１のコード配列と合わさ る配列が続いた。第２のオリゴヌクレオチドはｈＴＦ　ｃＤＮＡの３“非翻訳領 域の相補体と合わさり、正常な翻訳停止部位にＳｍａ　Ｉ認識配列３°を導入す る。（Ｙａｎｇ、Ｆ、ｅ去−ａｌ、（１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦↓：　２７５２−２７５６による番号付けを用いてヌクレオ チド２１．２５　２１２７）。Ｔａｇポリメラーゼ（ｐｅｒｋｉｎＥｌｍｃｒ） を用いた２５巡のＰＣＲ増幅は、所望のＤＮＡフラグメントを与え、それはｈ　 Ｔ　Ｆの天然のシグナル配列をＣ突出部コード配列にスプライシングする。この フラグメントをそのＢＳｒｎａ　Ｔで消化し、ｈ　Ｔ　Ｆ　／　２　Ｎ発現研究 の場合と同様にｐＮＵＴの大Ｓｍａ　Ｉフラグメントと連結した。

ＩＩ＋　組み替え全長トランスフェリンの製造ヒト血清トランスフェリンのため のコード配列を、上記のヒト肝臓ライブラリから単離した全−長ｃＤＮΔクロー ンから誘導した制限酵素消化フラグメントから組み立てた。最初のクローンの基 となるプラスミド（ｐＫＴ−２１８）のユニーク制限酵素認識部位の数が限られ ていたので、簡便なベクター中にコート配列を挿入するために一系列のクローニ ング段階が必要であった。この過程は、ｃＤＮＡの５′末端からのＨｐａ　Ｔ　 Ｉ／ｎａｍＨＩフラグメ〉；−のベクターｐＵＣ１８へのクローニングにより開 始された（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８３）Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ−１１ 旦１−：２Ｏ−２８）ｏ得られたプラスミドをＢａｍＬｌ■及びＨｉｎｄｌｌｒ で消化し、ヒトトランスフェリンｃＤＮＡからのＢａｍＨＩ／Ｈ４ｎｄｌｌｌフ ラグメントを最初のフラグメントに隣接してクローニングした。得られたプラス ミドをその後）（ｉｎｄｌｌｌ及びＰｓｔｌで消化し、トランスフェリン　ｃＤ ＮＡの３゛末端からの最終的Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメン トをクローニングし、全−長コード配列の組み立てを完了した。Ｎ−及びＣ−末 端トランスフェリン半一分子コード配列の場合に記載した通り、得られたプラス ミドを５ａｃｌ及びＳｐｈ　ｒで消化すると、１個の制限フラグメントとして全 −長コード配列を放出し、続いてそれを７４　ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ を用いて平滑化し、その後ｐＮｕＴの大ＳｍａｌフラグメントにクプラスミドＤ ＮＡはＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５から調製し、塩化セシウム勾配を用いた２連続 遠心段階により精製した。　ベビー１１ムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、１０％ の牛胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地−Ｈａｍ’５Ｆ−１ ２栄養剤混合物（ＤＭＥＭ−Ｆ−１２）（Ｇｉｂｃｏ；Ｓｉｇｍａ）中で１００ −ｍｍの皿当たり約１０”細胞に成育腰続いて５ｅａｒ！ｅ、Ｐ、Ｆ、旦　１（ １９８５）Ｍｏ　１．Ｃｅ　！　１．Ｂｉｏｌ、５　：１４８０−１４８９に記 載のリン酸カルシウム共沈法により１０μｇのプラスミドを用いてトランスフエ フシコンした。２４時間後、培地を５００１ｚＭのメトトレキセート（ＭＴＸ） を含むＤＭＥＭ−Ｆ−１２に変え、プラスミド含有細胞を選択した。選択したら 、Ｅｌ）ＴＡ　（０，２ｇｍ／Ｉ）を含むリン酸塩緩衝食塩水を用い、細胞を約 ８０％の実密度にて５個の１００ｍｍ皿に、（の後５個のＴ−１７５フラスコに 、最後に５個の広表面積回転瓶（そ第１ぞれ２００　ｎ１１　）に厳重に通過さ せた。Ｔ−１７５通過の際に、フエ２ノール赤を含まないＤＭＥＭ−Ｆ−１２中 のウシ胎児血清の代わりに血清基質、Ｌｌｌｔｒａｓｅｒ　Ｇ（Ｇｉｂｃｏ）を １％の量で用いた。

１度生産量が高くなると（約１００μｇ／ｍｌ培地）、Ｕｌｔｒａｓｅｒ　Ｇを 含まない培地が少な（とも２回通過の間、組み替えタンパク質の製造を維持でき ることが見いだされた。これは発現された全−長組み替えヒ１−血清トランスフ ェリンの単離を非常に簡略化した。組み替えタンパク質の単離のために、収穫し 、た培養培地をフェニルメタンスルポニルフルオリド及びナトリウ１、アジドに 関して０．０１％とし、それぞれプロテアーゼ及びバクテリア成長を阻害する。

存在するトランスフェリンの飽和に寸分なＦｅ”にトリロトリ酢酸）２を加える 。培地の体積を＜ｌＱｍｌに減少させ、組み替えアミノ末端ヒトトランスフェリ ン半一分子に関して記載したアニオン交換カラム（Ｐｏ　ｌ　ｙａｎ　ｉ　ｏｎ ＳＩ＝　１−ｘｌＯｃｍ）上を通過させることにより精製する。上記参照。

単離された組み替え全−長ヒト血清トランスフェリンはこのカラム上で、グリコ ノル化パターンの変動によるいくらかの異質性を示す。タンパク質はＮａＤｏｄ ＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に関して単分散であり、精製ヒト血清 トランスフェリンと同等のスペクトル及びスペクトル比を有する。

ＩＶ突然変異体トランスフェリンの製造野生型（本来）の残基の従来の単一文字 アミノ酸記号、それに続いて一次配列中の置換の位置番号、（この場合成熟タン パク質のバリンを位ｒＰＩｔ１と指定する）、及びそれに続く置換残基の記号を 用いることにより置換突然変異体を指定する。例えば位置６３のアスパラギン酸 残基がセリン残基により置換さ枠た変異体は、Ｄ６３Ｓと指定される。

ｈＴＦ／２Ｎ変異体の製造は、２通りの方法で行った。Ｄ８１Ｓ置換体は、Ｎｅ １ｓｏｎ、Ｒ，Ｍ、ａｎｄ　Ｌｏｎｇ、Ｇ、Ｌ、（１９８９）Δ旦」すｙｔ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、↓ｙ旦：　１４７−１．５１の方法を用いて製造した。簡単に述 べると、ｈＴＦ／２Ｎコード配列の５゛末端からのＨｐａ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ フラグメントをｐＵｃ１８中にサブクローニングし、その後ＰＣＲに基づく２段 階突然変異誘発法の鋳型として使用した。得られたＤＮＡフラグメントをそのｆ ｆ１Ｍ１３ｍｐ１８中に再クローニングし、突然変異体構築物の配列をジデオキ シ配列分析により確認した。そのｉ＆フラグメントを、Ｘｂａｌ及びＢ　ａ　ｍ 　ＨＩで消化することにより２本鎖形態の配列決定ベクターから放出し、最初の ｈＴＦ／２Ｎ構築物からのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌ＋フラグメントに連結して 全長Ｄ８１Ｓ−ｈＴＦ／２Ｎコード配列を製造し、このスプライシングの忠実度 を制限消化分析により確認し、その後前と同様にｐＮＵＴ中にクローニングした 。

全ｈＴＦ／２Ｎ＝＋−ド配列をＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングし、その後そ れをオリゴヌクレオチド−指示突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ。

Ｍ、Ｊ、ａｎｄ　Ｓｍｉ　ｔｈ、Ｍ、（１９８３）Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ旦±　 上旦旦二４５８−５００）の鋳型として用い、ｄｕ　ｔ−１ｕｎｇ−′選択法（ Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、Ａ、（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Δｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８２：４８８−４９２）を用いることにより、置換突然変異体Ｇ６５Ｒ ，Ｄ６３Ｃ，に２０６Ｑ及びＨ２０７Ｅを製造した。突然変異誘発の後、突然変 異体配列のための全コード配列を、２５０ｂｐ間隔でコード配列の長さに沿って 標的設定した配列決定プライマーを用いたジデオキシ配列分析により確認した。

その後所望のコード配列を、制限消化により放出し、平滑化し、前記の通りｐＮ ＵＴ中に挿入した。

ａ）全−長ヒト血清トランスフェリン（ｈＴＦ）及びｂ）アミノ−末端半一分子 （ｈＴＦ／２Ｎ）の種々の特定部位の突然変異体のためのＣＤＮΔを含むｐＮＵ Ｔプラスミドが構築された。これらの突然変異体は、１）ヒトメラノフエリンの Ｃ−末端半分に見られる天然に起こる突然変異に基づ＜Ｄ６３Ｓ、２）英国の患 者からのｈＴＦのＣ−末端半分に見られる天然に起こる突然変異体に基づ＜Ｇ６ ５Ｒ，ｃ）ニワトリの卵白変える試みとしてのＤ６３Ｃを含む。これらの構築物 はすべてベビーハムスター腎臓細胞の安定な形質転換物中で、１０−１００ｍｇ の組み替えタンパク質の量で発現された。さらにｏＴＦのための全長ｃＤＮＡ及 びｈ　Ｔ　Ｆ　／　２　Ｎ　−ｏ　Ｔ　Ｆ　／　２　Ｃならびにｏ　Ｔ　Ｆ　／ 　２　Ｎ　−ｈ　Ｔ　Ｆ　／　２　ＣＯ）ためのキメラｃＤＮＡを含むｐＮＵＴ プラスミドが構築された。

特定部位の突然変異体の特性には　Ｄ６３Ｓ突然変異体は鉄と結合するが（文献 中の推測に反して）野生型タンパク質よりずっと穏やかであることが含まれる。

例えばこの突然変異体は、８Ｍウレアを含むＰＡＧＥゲルにおける電気泳動にて その結合鉄を失うが、野生型はその結合鉄を保持している。可視スペクトルの最 大は４２２ｎｍにあり、野生型の４７０ｎｍと対照的である。Ｇ６５Ｒ突然変異 体は、野生型より鉄との結合が弱く、４７０ｎｍに可視スペクトルの最大を有す る。Ｋ２Ｏ６Ｑ突然変異体は、そのモデルであるｏＴＦ／２Ｃと同様に野生型よ りずっと激しく鉄と結合する。野生型鉄タンパク質の赤色は、それぞれ］、ｍＭ のＥＤＴＡ及びＮＴＡを含む０．５Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ４，９中で非常に急速 に消えるが、突然変異体は全く色を失わず、その結合鉄を放出するためにはｐ　 Ｈ４及び１ｍＭのデフエロキサミンが必要である。アポ−突然変異体は、鉄との 再結合が野生型タンパク質より遅いようである。

この突然変異体の場合の可視スペクトルの最大は４６０ｎｍにある。

全長組み替えｈ　Ｔ　Ｆは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で血清−誘導タンパク質と同速 度で移動する。

殿笠狗 当該技術における熟練者は、本文に記載の特定の方法に関する多数の同等物を日 常的実験のみを用いて認識する、又は確かめることができるであろう。そのよう な同等物は本発明の範囲内であり、以下の請求の範囲に含まれると考えられる。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３Ａ Ｍ、ａｂｃｄ　ａｂｃｄｅ　ｆｇ　ｈ ９９ヤ■ ＰＰＭ ＦＩＧ、５Ａ ＰＰＭ ＦＩＧ、　７ 補正口の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成５年８月６日−

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．組み替えトランスフェリン。
2. ２．組み替えヒト血清トランスフェリン。
3. ３．少なくともトランスフェリンの１個の突出部の金属−結合ドメインを含む、 トランスフェリンの組み替え半−分子。
4. ４．１個の突出部がヒト血清トランスフェリンのアミノ末端突出部である、請求 の範囲３に記載のトランスフェリン半−分子。
5. ５．１個の突出部がヒト血清トランスフェリンのカルボキシ末端突出部である、 請求の範囲３に記載のトランスフェリン半−分子。
6. ６．少なくともトランスフェリンの１個の突出部の金属−結合ドメインを含み、 突然変異体の金属に対する結合力が天然のトランスフェリンより強い、突然変異 体トランスフェリン半−分子。
7. ７．鉄に対する結合力が天然のトランスフェリンより強い、請求の範囲６に記載 の突然変異体トランスフェリン半−分子。
8. ８．少なくともトランスフェリンの１個の突出部の金属−結合ドメインを含み、 天然のトランスフェリンの位置２０６のリシン残基がグルタミンにより置換され ている、請求の範囲７に記載の突然変異体トランスフェリン半−分子。
9. ９．トランスフェリン、又は少なくともトランスフェリンの１個の突出部の結合 ドメインを含むトランスフェリン半−分子をコードする核酸を、真核細胞中の発 現に適した遺伝的調節要素と結合させて含む核酸構築物を含む、真核発現ベクタ ー。
10. １０．核酸構築物がトランスフェリン又はトランスフェリン半−分子をコードす る核酸に結合したトランスフェリンシグナル配列をコードする核酸を含む、請求 の範囲９に記載の真核発現ベクター。
11. １１．１個の突出部がヒト血清トランスフェリンのアミノ末端突出部である、請 求の範囲１０に記載の真核発現ベクター。
12. １２．１個の突出部がヒト血清トランスフェリンのカルボキシ末端突出部である 、請求の範囲１０に記載の真核発現ベクター。
13. １３．トランスフェリン半−分子が天然のトランスフェリンのリシン残基の代わ りに位置２０６にグルタミン残基を含む、請求の範囲９に記載の真核発現ベクタ ー。
14. １４．請求の範囲９に記載のベクターを用いてトランスフェクションされた真核 細胞系。
15. １５．請求の範囲９に記載のベクターを用いてトランスフェクションされたベビ ーハムスター腎臓細胞系。
16. １６．少なくともトランスフェリンの１個の突出部の金属−結合ドメインを含む トランスフェリンの組み替え半−分子を、金属の循環量を下げるのに十分な量で 患者に投与することを含む、金属キレート化治療の方法。
17. １７．金属が鉄である、請求の範囲１６に記載の方法。
18. １８．トランスフェリン半−分子が天然のトランスフェリンより激しく鉄と結合 する突然変異体である、請求の範囲１７に記載の方法。
19. １９．トランスフェリン半−分子が天然のトランスフェリンのリシン残基の代わ りに位置２０６にグルタミン残基を含む、請求の範囲１８に記載の方法。
20. ２０．組み替えトランスフェリンを含む細胞培養培地のための非血清補足物。