FI113272B - Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä - Google Patents

Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä Download PDF

Info

Publication number
FI113272B
FI113272B FI953705A FI953705A FI113272B FI 113272 B FI113272 B FI 113272B FI 953705 A FI953705 A FI 953705A FI 953705 A FI953705 A FI 953705A FI 113272 B FI113272 B FI 113272B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gly
asp
leu
ser
glu
Prior art date
Application number
FI953705A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI953705A (fi
FI953705A0 (fi
Inventor
Hans Christian Thoegersen
Thor Las Holtet
Michael Etzerodt
Original Assignee
Borean Pharma As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK13093A external-priority patent/DK13093D0/da
Priority claimed from DK13993A external-priority patent/DK13993D0/da
Priority claimed from PCT/GB1993/002492 external-priority patent/WO1994013804A1/en
Application filed by Borean Pharma As filed Critical Borean Pharma As
Publication of FI953705A publication Critical patent/FI953705A/fi
Publication of FI953705A0 publication Critical patent/FI953705A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI113272B publication Critical patent/FI113272B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
    • C12N2310/1241—Tetrahymena
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

113272
Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä Förbättrat förfarande för veckandet av proteiner Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-tekniikkaa ja erityisesti proteiinitekniikoita oikein laskostuneiden proteiinien muodostamiseksi ilmentämällä geenejä tai geenifragmentteja yhdistel-mäproteiinituotteina heterologisessa tai homologisessa isäntä-organismissa. Keksintö julkistaa uusia yleisperiaatteita ja menetelmiä väärin laskostuneiden ja/tai liukenemattomien proteiinien, mukaan luettuna disulfidisidoksia sisältävät proteiinit, laskostamiseen uudelleen tehokkasti in vitro. Tämä keksintö koskee myös laskostumattomien tai väärin laskostuneiden, mistä tahansa muusta lähteestä peräisin olevien poly-peptidien uudelleen laskostamista. Myös kaksi naudan hyytymistekijä Xa:n analogia, jotka sopivat pieniin, keskisuuriin ja suuren mittakaavan teknisiin sovelluksiin, joihin sisältyy kimeeristen proteiinien spesifinen katkaisu kohdista, jotka on laadittu tekijällä Xa katkaistaviksi, kuvataan. Keksinnössä voidaan käyttää palautuvasti disulfidisuojaavia reagentteja, jotka ovat käyttökelpoisia apuyhdisteinä kysteiiniä sisältä-: vien proteiinien uudelleen laskostamisessa. Myös yleinen tut- .··, kimusmenetelmä, jolla sellaisten disulf idinvaihtoreagenttien sopivuus tähän erityiseen tarkoitukseen voidaan määrittää, !. . kuvataan.
* » : Menetelmät käytännöllisesti katsoen minkä tahansa polypeptidin tuottamiseksi siirtämällä yhdistelmä-DNA-menetelmillä luonnollinen tai synteettinen, tätä erityistä polypeptidiä koodaava DNA-fragmentti sopivaan isäntään ovat kehittyneet voimakkaasti : viimeksi kuluneiden viidentoista vuoden aikana ja ovat tällä hetkellä olennaisen tärkeitä työkaluja biokemiallisessa tutki-. mustyössä ja monissa teollisuusprosesseissa, joissa tuotetaan » t · , korkealuokkaisia proteiinituotteita biolääketieteelliseen tai : ·' < muuhun teolliseen tarkoitukseen.
» » i
Neljä biologisten systeemien perustavaa ominaisuutta tekee heterologisen proteiinituotannon mahdolliseksi: 113272 (i) Proteiinin toiminnalliset ominaisuudet ovat kokonaan proteiinin kolmiulotteisen rakenteen määräämiä, ja tulevat esiin rakenteeseen sisältyvän molekulaarisen ympäristön vaikutuksesta kemiallisina ominaisuuksina, joita tämän rakenteen erityiset osat esittelevät.
(ii) Proteiinin kolmiulotteisen rakenteen puolestaan määrää sekvenssi-informaatio, jota edustaa aminohappotähteiden spesifinen sekvenssijärjestys lineaarisessa polypeptidiketjussa tai lineaarisissa polypeptidiketjuissa. Polypeptidin aminohapposekvenssin sisältämä rakenneinformaatio on, oikeissa olosuhteissa, sinänsä riittävä ohjaamaan laskostumisprosessia, jonka lopputuote on täysin ja oikein laskostunut proteiini.
(iii) Polypeptidiketjun aminohappotähteiden lineaarisen sekvenssin määrittää polypeptidiketjua rakentavaa solukoneistoa ohjaavan geneettisen materiaalin koodaavan alueen nukleotidi-sekvenssi. Nukleiinihapposekvenssi-informaation translaatiota aminohapposekvenssi-informaatioksi ohjaava muunnostaulukko tunnetaan. Se on melkein universaalinen tunnetuilla eliöillä ja siksi mitä tahansa polypeptidijaksoa koodaavat nukleiinihap-pojaksot voivat ohjata polypeptidituotteen kokoamista käytän- • · ·*; nöllisesti katsoen riippumatta siitä, esiintyykö jonkinlaisia laj ienvälisiä esteitä.
j 1 : (iv) Kunkin organismityypin omissa geeneissä on läsnä oma tyy- • pillinen sarjansa geneettisiä elementtejä, jotka toimivat vuo- :; rovaikutuksessa solun molekyylikoneiston kanssa, ja jotka sää televät tietyn geenin ekspressiota transkription ja translaation kautta vasteena spesifisiin solun sisäisiin ja solunulkoi-..·! siin tekijöihin.
Isäntäsolun tai isäntäeliön proteiinisynteesikoneiston hyväk- i”: sikäyttämiseksi siten, että saadaan tuotetuksi huomattava määrä haluttua yhdistelmäproteiinituotetta, on siksi tarpeen !!! viedä haluttua tuotetta koodaava DNA-jakso soluun liitettynä 1 · ” sellaisiin säätelysekvensseihin, jotka solun geneettinen sääte lyjärjestelmä tunnistaa.
3 113272
Isännässä ilmennettävän polypeptidin välittömään kohtaloon vaikuttavat polypeptidin ominaisuudet, isännän ominaisuudet sekä mahdolliset tietyn polypeptidin tuottamisen aikana aiheutuneet isäntäorganismin rasitustilat. Geenituote, joka ilmentyy kohtuullisessa määrin ja joka muistuttaa isäntäsolussa normaalisti esiintyvää proteiinia, käy usein läpi normaalin prosessoinnin ja kertyy asiaan kuuluvaan solun osastoon tai erittyy, sen mukaan, mikä kyseisen endogeenisen geenituotteen luonnollinen kohtalo olisi. Sitä vastoin solulle vieras tai suurina määrinä tuotettava yhdistelmägeenituote usein aktivoi solun puolustusmekanismeja, jotka muistuttavat lämpöshokin tai myrkyllisille aminohappoanalogeille altistumisen aiheuttamia puolustusmekanismeja, siis reittejä, jotka luonto on muovannut auttamaan solua pääsemään eroon "väärästä" polypeptidimateriaalista säädellyn solunsisäisen proteolyysin avulla tai eristämällä epätoivottua polypeptidimateriaalia inkluusiopallosiksi (storage particles, "inclusion bodies"). Yhdistelmäproteiini näissä inkluusiopallosissa on usein varastoituna väärin las-kostuneessa ja aggregoituneessa muodossa, missä tapauksessa on tarpeen liuottaa tuote denaturoivissa ja pelkistävissä oloissa ja laskostaa sitten yhdistelmäpolypeptidi in vitro -menetel- :· ' millä, jotta saadaan käyttökelpoinen proteiinituote.
» · » » : ·· Eukaryoottigeenien ekspressio eukaryoottisoluissa mahdollistaa j : usein oikein laskostuneen ja prosessoidun geenituotteen : eristämisen suoraan soluviljelmänesteistä tai soluaineksesta.
Tätä lähestymistapaa käytetään usein tuottamaan suhteellisen pieniä määriä proteiinia biokemiallisiin tutkimuksiin, ja ;y. nykyään sitä käytetään myös teollisesti useiden biolääketie- _ teellisten tuotteiden tuottamiseen. Eukaryoottinen ilmentämis- Ύ tekniikka on kuitenkin kallista tekniikan monimutkaisuuden, työvoima- ja materiaalikulujen takia. Lisäksi ilmentämisjärjes- telmän vakiinnuttaminen vaikka vain laboratoriomittakaavaiseen .tuotantoon vaatii ainakin muutamien kuukausien kehittelyvai-• * · ·’" heen. Yhdistelmätuotteen translaation jälkeisen modifikaation » · laatu ja laajuus ovat usein erilaiset kuin luonnollisella tuotteella, koska sellaiset modifioinnit ovat isäntäsolussa 4 113272 epäsuoran geneettisen säätelyn alaisia. Synteesin jälkeisen modifikaation laukaisevat sekvenssisignaalit ovat usein molemminpuolisesti tunnistettavia eri eukaryoottien välillä, mutta sopivan modifikaatioentsyymisarjan käytettävissä oleminen riippuu isäntäsolun laadusta ja tilasta.
On kehitetty useita erilaisia strategioita geenituotteiden ilmentämiseen prokaryoottisissa isännissä, jotka ovat eukary-oottisia isäntiä edullisempia pääoma-, työ- ja materiaalivaa-timusten suhteen. Eubakteeri Escherichia colin kantoja suositaan usein isäntäsolukantoina, koska E. coli on paljon paremmin karakterisoitu geneettisesti kuin mikään muu eliö, myös molekyylitasolla.
Prokaryoottisillä isäntäsoluilla ei ole translaation jälkeisen modifikaation suorittamiseksi tarvittavaa entsyymikoneistoa, ja siksi eukaryoottinen geenituote valmistuu välttämättä modifioimattomassa muodossaan. Lisäksi, tuotteeseen on synte-toitava mukana ainakin yksi N-pään lisäke, vähintään yksi ylimääräinen metioniinitähde, joka johtuu tarvittavasta translaation initiaatiokodonista, useimmiten lisäksi myös N-pään jakso, joka vastaa runsaasti ilmennettävän isäntäproteiinin • * · '·· : N-pään jaksoa. On kuvattu yleismenetelmiä sellaisten N-pään *...· lisäkkeiden poistamiseksi sekvenssispesifisellä proteolyysillä : ’· N-pään lisäkkeen ja halutun polypeptidituotteen väliin inser- • ’,· toitujen linkkerisegmenttien kohdista (enterokinaasilla : katkaistava linkkerisekvenssi: EP 035384, The Regents of the
University of California; tekijä Xa:lla katkaistava linkkerisekvenssi: EP 161937, Nagai & Th^gersen, patentin haltija:
Celltech Ltd.).
Vuosien kuluessa on ponnisteltu huomattavasti heterologisen * prokaryooteissa tapahtuvan ilmentämisen kehittämiseksi, jotta saataisiin yhdistelmäproteiinituotteita liukoisessa muodossa . ·. tai fuusioproteiinirakenteita, jotka solu pystyy erittämään aktiivisessa, mahdollisesti N-päästä prosessoidussa muodossa.
* »
Ponnistelu on tuottanut vain osittaista menestystä, huolimatta viimeaikaisista kaitsijaproteiini- eli chaperonialan edistys 113272 5 askelista. Yleensä tarvitaan paljon aikaa ja ponnisteluja ilmentämisjärjestelmän kehittämiseksi ja muokkaamiseksi, ennen kuin voidaan eristää pienikään määrä liukoista ja oikein laskostunutta fuusioproteiinituotetta. Useammin kaikki polypep-tidituote kertyy isäntäsolun sisään väärin laskostuneena inkluusiopallosiin. Tämä pitää paikkansa varsinkin ilmennettäessä disulfidisidoksia sisältäviä eukaryoottiproteiineja.
Kaikki proteiinien in vitro-laskostamiseen käytettävissä olevat menetelmät kuvaavat prosesseja, joissa proteiini joko liuoksessa tai epäspesifisesti ioninvaihtohartseihin tms. adsorboituna altistetaan liuottimelle, jonka koostumusta muutetaan asteittain, ajan kuluessa, voimakkaan denaturoivasta (ja mahdollisesti pelkistävästä) ei-denaturoivaksi yhdessä ainoassa ajossa. Tämä suoritetaan usein laimentamalla väkevä, 6-8 M guanidiinihydrokloridia tai ureaa sisältävä proteiiniliuos suureen tilavuuteen ei-denaturoivaa puskuria tai dialysoimalla denaturoivassa puskurissa oleva laimea proteiiniliuos ei-dena-turoivaa puskuria vastaan. Tästä perusmenettelystä on kuvattu lukuisia muunnoksia, mukaan luettuna spesifisten ligandien tai kofaktorien liittäminen aktiiviseen proteiiniin ja se, että . . käytetään polymeerisubstansseja, kuten polyetyleenioksidi *;; · (polyetyleeniglykoli) , joiden ajatellaan stabiloivan laskostu- nutta rakennetta.
113272 6 parhaana saavutettavissa olevana kyseiselle proteiinille.
Yleistä proteiinien laskostamistekniikkaa on esitelty vähän aikaa sitten ilmestyneessä, Thomas W. Creightonin toimittamassa kirjassa ("Protein folding", toim. Creighton T.E., Freeman 1992), ja spesifisemmän katsauksen käytännöllisistä proteiinin laskostamismenetelmistä julkaisivat 1989 Rainer Jaenicke & Rainer Rudolph (s. 191-223 teoksessa "Protein Structure, a practical approach", toim. T. E. Creighton, IRL Press 1989). Lukuisista yksityiskohtaisemmista julkaisuista saa tietoa alan tasoa kuvaavista, esimerkiksi Scheinin (Schein C. H., 1990,
Bio/Technology 8, 308-317) tai Buchnerin ja Rudolphin (Buchner J. ja Rudolph R, 1991 Bio/Technology 9, 157-162) katsauksista.
Yhteenvetona: on olemassa selvä tarve yleisesti sovellettavissa oleville, suuren saannon tuottaville laskostumattomien ja väärin laskostuneiden, useista erilaisista lähteistä, kuten prokaryoottisistä ilmentämissysteemeistä tai peptidisynteesis-tä saatujen proteiinien uudelleenlaskostamiseksi.
Keksinnön tekijät ovat saaneet selville, että uudelleenlaskos-. , tamissaantoja voidaan kasvattaa suuresti ottamalla huomioon, · että proteiinin laskostumisprosessi on kineettisesti säädelty *···’ prosessi, ja että proteiinin laskostuneiden, laskostumattomien : ** ja väärin laskostuneiden konformeerien toisikseen muuttumiseen i ’.· liittyy viivevaikutuksia (hystereesiä) ja ajasta riippuvia ·,: f ilmiöitä, joita voidaan käyttää hyväksi laadittaessa syklistä denaturointi-renaturointiprosessia, jossa uudelleen laskostu-nut proteiinituote kertyy lisääntyen joka kierroksella laskos-tumattomien ja väärin laskostuneiden konformeerien kustannuk-"·. sella, uuden, perinteistä perusmenettelyä paljon tehokkaamman uudelleenlaskostamismenettelyn luomiseksi.
'’ · Termillä "laskostunut proteiini" tarkoitetaan polypeptidiä (a) ; yhdessä tai useammassa konformaatiotilassa, joka vastaa tilaa i i » .···, tai tiloja, joissa proteiini on biologisesti aktiivisessa * · » muodossaan, tai uniikkeja pysyviä välitiloja, jotka voivat seuraavissa vaiheissa konvertoitua biologisesti aktiiviseksi 113272 7 tyypiksi. Laskostuneen proteiinin kovalenttinen rakenne polypeptidissä olevien kysteiinitähteiden välisten ristisidos-ten suhteen on täysin sama kuin biologisesti aktiivisessa muodossaan olevassa proteiinissa.
Vastaavasti, termi "laskostumaton proteiini" viittaa polypepti-diin löyhemmissä ja epämääräisemmissä konformaatiotiloissa kuin se tai ne, jotka vastaavat proteiinia sen biologisesti aktiivisessa, siis laskostuneessa tilassa. Laskostumattoman proteiinin kovalenttinen rakenne polypeptidin kysteiinitähde-parien välisten ristisidosten suhteen voi olla tai ei ole täsmälleen sama kuin proteiinilla biologisesti aktiivisessa muodossaan. Läheisesti laskostumattoman proteiinin kaltainen on "väärin laskostunut proteiini", joka on polypeptidi konfor-maatiotilassa, joka on käytännöllisesti katsoen vakaa termo-dynaamisesti, joskus jopa vakaampi kuin se tai ne tilat, jotka vastaavat proteiinia laskostuneessa muodossaan, mutta jotka eivät osoita yhtä paljon, jos ollenkaan, laskostuneen proteiinin biologista aktiivisuutta. Kuten laskostumattomassa proteiinissa, kovalenttinen rakenne polypeptidin kysteiinitähteiden välisten ristisidosten suhteen voi olla tai ei ole sama , , kuin laskostuneessa proteiinissa.
'·*·’ Termillä "uudelleenlaskostunut proteiini" tarkoitetaan polypep- : “ tidiä, joka on muutettu laskostumattomasta tilasta niin, että • se on saavuttanut biologisesti aktiivisen konformaationsa ja J : kovalenttisen rakenteensa siinä mielessä, että ristisidokset ovat polypeptidin oikeiden kysteiinitähdeparien välillä polypeptidissä.
»
Uusi, yleisesti sovellettavissa oleva proteiinien laskostamis-·’ strategia on laadittu seuraavien proteiinirakenteen yleisten ominaisuuksien pohjalta: I I » , (a) Laskostumattomien proteiinien alhainen liukoisuus ei- . ··. denaturoiviin liuottimiin on tärkeä vaikuttava tekijä, joka indusoi polypeptidin joko muodostamaan tiiviin, oikein laskostuneen rakenteen tai laskostumaan väärin ja tuottamaan "umpi 113272 8 kuja"-aggregaatteja tai sakkoja, jotka eivät pysty laskostu-maan uudelleen ja tuottamaan oikein laskostuneita rakenteita ei-denaturoivissa olosuhteissa kohtuullisen ajan kuluessa.
(b) Vastamuodostunut umpikuja-aggregaatti "denaturoituu" eli konvertoituu laskostumattomaan muotoon helpommin kuin oikein laskostunut proteiini, koska umpikuja-aggregaatin rakenne on järjestymättömämpi. Väärin laskostuminen on todennäköisesti yleisestikin kinetiikan kontrolloima prosessi.
(c) Laskostumaton proteiini ei usein pysty (tai pystyy vain hitaasti) laskostumaan oikein laskostuneeseen muotoon denaturoivan aineen sellaisissa pitoisuuksissa, jotka ovat tarpeen umpikuja-aggregaattien denaturoimiseksi kohtuullisen pituisen ajan kuluessa.
(d) Kohtaa (b) tukevaan todistusaineistoon sisältyy yksityiskohtaisia tutkimuksia useiden malliproteiinien laskostumis- ja avautumisreiteistä ja välivaiheista. Kuvaava on myös monista disulfidisidoksia sisältävistä proteiineista tehty huomio, että disulfidisidosten stabiilius pelkistämistä vastaan pel- . . kistävien ja denaturoivien tekijöiden rajoittavissa konsen- » · •y · traatioissa on usein merkitsevästi erilainen kullakin tietyn “···' proteiinin disulfidisidoksella ja että laskostuneen proteiinin • « .* ·* disulfidisidokset ovat yleensä paljon vähemmän herkkiä pelkis- : tymiselle tai disulfidin vaihtumiselle kuin "epänatiivit" | disulfidisidokset denaturoituneessa proteiinissa tai proteiini- aggregaatissa.
Uutta strategiaa laskostumisprosessille voidaan helpoiten *. kuvata seuraavan teoreettisen esimerkin avulla:
Ajatellaan hypoteettista proteiinia, joka on stabiilisti las-kostunut denaturoimattomassa puskurissa "A" ja stabiilisti laskostumaton voimakkaasti denaturoivassa puskurissa "B" , ·. (esim. puskuri, joka sisältää 6 M guanidiini-HCl:a) , altistet tuna puskurille A tai puskurille B ja sitten inkuboituna vä-litasoisesti denaturaturoivissa puskureiden A ja B seoksissa.
9 113272
Esim. 100-75% B:tä johtaa sekä laskostuneen että umpikuja-aggregoituneen proteiinin konvertoitumiseen laskostumattomaan muotoon lyhyessä ajassa.
Esim. 75-50% B:tä johtaa vastamuodostuneen umpikuja- aggregaatin konvertoitumiseen laskostumattomaan muotoon, kun taas lähes kaikki uudelleenlaskostunut proteiini pysyy natiivin kaltaisena rakenteena, stabiilina ainakin joidenkin tuntien ajan, mistä se voi hetkessä palata uudelleenlaskostuneeseen muotoon, kun denaturoiva aine poistetaan.
Yli 10% määrät B:tä ehkäisevät uudelleenlaskostuneen muodon nopean muodostumisen laskostumattomasta muodosta.
Liuottimen koostumuksen muutosaskel 100%:sta B:tä 0%:iin B:tä konvertoi laskostumattoman proteiinin umpikuja-aggregaatiksi (75%:n saanto) ja uudelleenlaskostuneeksi proteiiniksi (25%:n saanto).
Altistakaamme nyt näyte tätä proteiinia, alun perin laskostu-mattomassa muodossaan 100% B:ssä, aikasarjalle ohjelmoituja * · · denaturointi-renaturointikierroksia, kuten kuviossa 1 on esi- '·*·* tetty, siten että kukin kierroksista koostuu renaturointi - : ·· vaiheesta (Fn) (< 10% B) ja denaturointivaiheesta (Dn). Kier- * roksen (i) renaturointivaiheen lopussa denaturoijapitoisuutta ' : : muutetaan k^ % pienemmäksi kuin edeltävän kierroksen denatur- ; oijapitoisuus. Nopean inkuboinnin jälkeen denaturoi ja poisteta an jälleen, ja siirrytään seuraavaan renaturointivaiheeseen V. Fi+1· Olettaen, että denaturoijapitoisuus alkaa 100%:sta B:tä ,··, ja kunkin kierroksen ki on pysyvästi 4%, tämä ohje tuottaa ' heikkenevän sarjan denaturointivaiheita, joka loppuu 25 ' * kierroksen jälkeen.
» I * . 25 :n yllä kuvaillun kierroksen aikana uudelleenlaskostuneen .···, proteiinin kertyminen edistyisi seuraavallä tavalla: • »
Kierroksissa 1-5 kaikki proteiini, niin oikein kuin väärinkin 113272 10 laskostunut, avautuu laskoksistaan kussakin denaturointi-vaiheessa Dn.
Kierrokset 7-12: Umpikuja-aggregaatit konvertoituvat laskos- tumattomaksi proteeiniksi kussakin vaiheessa, kun taas uudel-leenlaskostuneeksi proteiiniksi palautuva proteiini kertyy kierros kierrokselta seuraavina määrinä: 25%, 44%, 58%, 68%, 76% ja 82%.
Lisäkonversioita ei tapahdu kierrosten 13-25 aikana.
Syklinen uudelleenlaskostumisprosessi tuottaisi siis yli 80%:n kokonaissaannon uudelleenlaskostunutta proteiinia, kun taas perinteinen kertarenaturaatio tuottaisi parhaimmillaan 25%: n saannon.
Ymmärretään, että on tehty suuri määrä yksinkertaistavia likimääräisoletuksia sen suhteen, että hypoteettisen proteiinin eri konformaatiotilojen kunkin piirteen vaihteluasteikko on "kaikki tai ei mitään". Perustoimintaperiaate pysyy kuitenkin samanlaisena, vaikka malliin sisällytettäisiin monimutkai- , . sempi joukko oletuksia.
» · » * . · ’·-·* Käytännölliset järjestelyt proteiinin uudelleenlaskostamiseen • " käytettävän syklisen denaturointi/renaturointiprosessin : .* perustamiseksi voidaan ajatella tehtävän monella tavalla.
• » • » · ♦ » « I I · · : Liuoksessa olevaa proteiinia voidaan esim. pitää ultrasuodatus- laitteessa tai dialyysilaitteessa tai se voidaan sulkea (be confined) sopivan vesipitoisen kaksifaasijärjestelmän toiseen faasiin. Kaikissa näissä vaihtoehdoissa voi olla mahdollista • ^ säädellä molekyylipainoltaan pienten liuenneiden kemikaalien • · » pitoisuuksia proteiiniliuoksessa sopivilla keinoilla.
» * · ; Vaihtoehtoisesti proteiini voitaisiin adsorboida sopivaan pintaan kosketuksessa nestefaasiin, jonka kemiallista koostu- • · · musta voitaisiin säädellä tarpeen mukaan. Sopiva pinta voisi olla esim. suodatin, onttokuituinen aine tai pallosista 113272 11 muodostuva kromatografiamassa. Proteiinin adsorbointi pintaan voidaan saada aikaan välillisesti esimerkiksi epäspesifisillä vuorovaikutuksilla, esim. kuten on kuvattu W0 86/05809:ssä (Thomas Edwin Creighton), laskostukseen sopivilla kovalentti-silla pinnan ja proteiinin välisillä sidoksilla tai spesifisesti laadittujen affiniteettikahvarakenteiden (tarttumakohtien, affinity handles) avulla proteiinin yhdistelmäproteiinijohdannaisessa, jolla on erityinen ja denaturoinnille resistentti affiniteetti sopivasti derivatisoituun pintaan.
Sykliseen denaturointiin ja renaturointiin perustuvan proteii-ninlaskostamisprosessin erityinen toteutus, joka otettiin käyttöön yleisen menetelmän käyttökelpoisuuden tutkimiseksi, perustui erityisesti laadittuihin katkaistaviin hybridiproteiinei-hin (EP 161937, Nagai & Th<£gersen, patentin haltija: Celltech Ltd.), jotka sisältävät metalliaffiniteettikahvamodulin [EP 0282042 (Heinz Döbeli, Bernhard Eggimann, Reiner Gentz, Erich Hochuli; Hoffmann-La Roche)] insertoituna erityisesti laaditun Xa-tekijä-katkaisukohdan N-päähän. Tätä tyyppiä olevia yhdis-telmäproteiineja voitiin sitten, nikkeliä kelatoiville agaroo-sipallosille adsorboituina, altistaa tälle sykliselle uudel- , . leenlaskostusprosessille "uudelleenlaskostumisreaktori"- kroma- * * i'·/ tografiapylväässä, jota perfusoitiin sopivien denaturoivien ja » · ’··*’ denaturoimattomien puskureiden seoksella, jota syötti sarja • ” kalibroituja pumppuja, joiden virtausnopeudet oli ajastettu : '.· tietokoneohjauksen avulla.
ί * i : : Yleiskaavio kiinteässä faasissa uudelleenlaskostamisesta sisäl- » tää immobilisoidun proteiinin altistamisen syklisesti, yllä kaavaillulla tai millä tahansa muulla keinolla ja toteutus- » tavalla, denaturoivia ja denaturoimattomia olosuhteita edisty- • » ^ västi vaihdellen, missä denaturoivan tekijän konsentraatiota • * · * vähennetään vähitellen korkeista alkuarvoista kohti nollaa mo- • nen peräkkäisen renaturointi-denaturointi -kierroksen kulues- ; sa. Tätä menettelytapaa käytettäessä ei ole tarpeen määrittää . *. tarkasti, mikä denaturoivan aineen rajakonsentraatio tar-
* I
* t > vitaan, jotta saataisiin rikastettua laskostumissaantoa kyseisen spesifisen proteiinin syklisen prosessin aikana, koska 113272 12 edistyvä perättäisten kierrosten sarja käy läpi (korkeintaan) kolme jaksoa: alkujakson, jossa kierroksen (i) lopussa läsnä oleva laskostunut proteiinituote denaturoituu täydellisesti kierroksen (i+1) denaturointivaiheessa, tuottavan välijakson, jonka aikana uudelleenlaskostunutta proteiinia kertyy enenevässä määrin, ja loppujakson, jonka aikana denaturoivan aineen konsentraatio on liian matala muuttaakseen uudelleenlaskostunutta proteiinia tai mitään jäljellä olevia väärin laskostunei-ta rakenteita. Proteiinin altistaminen kuvaillulle etenevälle sarjalle denaturointi-renaturointi -kierroksia sisältää siis useita tuottavia kierroksia.
Disulfidia sisältävien proteiinien edistyvää denaturointi-renaturointikiertoa voidaan tehostaa käyttämällä kehittynyttä kromatografialaitteistoa muistuttavaa tietokoneeseen kytkettyä laitteistoa laskostumisreaktorista ulos virtaavan nesteen pus-kurikoostumusten seuraamiseen. Tieto ulos virtaavan nesteen koostumuksesta pelkistävän aineen ja disulfideja uudelleen järjestävän reagentin pitoisuusprofiilien suhteen toisi esiin tuottavan kierron ja se voisi siis toimia syötteenä älykkääseen prosessoriyksikköön, joka vuorostaan feedback-säätelisi ; . t denaturoivan aineen konsentraation muutosta sen varmistamisek- si, että suurin osa syklisen prosessin työstä tehdään denatu-
* I
rointi-renaturointi -kiertosarjan tuottavassa jaksossa. Sei- • > • ’* lainen kierrätysolosuhteiden automaattinen optimointi olisi • * » • .* mahdollista, koska analysoivaa järjestelmää voidaan käyttää » 1 .· mittaamaan puskurivirran hapetus-pelkistystasapainon muutosten V ·* suuruutta ja suuntaa. Nämä mittaustulokset heijastavat suoraan tioliryhmien/ disulfidiekvivalenttien tiitteriä immobilisoi-' ‘; dussa proteiininäytteessä, ja voidaan siis suoraan muuntaa \ kierroksen eri vaiheissa katkenneiden tai muodostettujen t disulfidisidosten keskimääräksi.
’ Muita mahdollisia syötteitä kierrätyksen edistymistä kontrol- loivaan älykkääseen prosessoriin ovat muiden muassa mittaukset ; ligandien sitoutumisesta, substraatin konversiosta, vasta-ai neen sitomiskyvystä ja itse asiassa mistä tahansa muusta liukoisesta tekijästä, jotka ovat eri tavoin vuorovaikutuk 113272 13 sessa väärin ja oikein laskostuneen proteiinin kanssa, ja joita voidaan laskostuneisuusmittauksen määritysvaiheessa suodattaa uudelleenlaskostumisreaktorin läpi ja sitten jatkuvasti (in-line) monitoroida ulos virtaavasta nesteestä sopivilla analyysilaitteilla.
Älykäs monitorointi- ja säätelyjärjestelmä voisi lisäksi käyttää saatavilla olevaa tietoa suunnatakseen käyttökelpoisia annoksia reaktorista ulos virtaavaa nestettä talteenotto- ja kierrätysalijärjestelmiin minimoiden siten kustannukset suuren mittakaavan operaatioissa.
Laskostamisproseduurin jälkeen lopullinen tuote voidaan eluoi-da affiniteettimatriisista tiivistettynä, käsitellä siten, että kypsä autenttinen proteiini vapautetaan katkaisemalla laaditusta proteaasin katkaisukohdasta, ja viimeistellä sitten käyttäen tavanomaisia proteiinien puhdistus- ja käsittelytek-niikoita, jotka ovat hyvin tunnettuja proteiinikemian alalla.
Tämä keksintö koskee siis menetelmää käsitellyn po-lypeptidimolekyylijoukon tuottamiseksi, missä käsitellyssä joukossa esiintyvät konformaatiotilat sisältävät olennaisen osuuden polypeptidimolekyylejä yhdessä erityisessä laskostu- » neessa konformaatiotilassa, mikä käsitelty joukko tuotetaan alkuperäisestä joukosta polypeptidimolekyylejä, joilla on sama ,* aminohapposekvenssi kuin käsitellyllä joukolla polypeptidi- • molekyylejä, jolloin alkuperäisessä joukossa esiintyvät kon- : formaatiotilat sisältävät olennaisen osuuden polypeptidimo lekyylej ä laskostumattomissa tai väärin laskostuneissa konfor-maatioissa. Menetelmässä alkuperäiseen polypeptidimolekyyli-joukkoon kohdistetaan vähintään kolmen peräkkäisen kierroksen t sarja, joista kierroksista kukin käsittää peräkkäiset vaiheet 'Hl ' · ' * 1) vähintään yksi denaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on denaturoiva ja/tai laskokset avaava vaikutus polypeptidijoukon molekyyleihin siten, että osa joukon polypeptideistä t i denaturoituu ja/tai laskokset avautuvat, mitä seuraa 14 1 13272 2) vähintään yksi renaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on renaturoiva vaikutus polypeptidimolekyyleihin, joiden konformaatiot ovat tulosta edellisestä vaiheesta siten, että osa joukon denaturoituneista ja/tai laskostumattomista polypeptideistä renaturoituu, siten, että vähintään kolme peräkkäistä kierrosta on sovitettu niin, että vähintään yhden denaturoivan vaiheen olosuhteet johtavat denaturoitumiseen ja/tai laskosten avautumiseen pienemmässä osassa polypeptidijoukkoa kuin denaturoivat olosuhteet sarjan aikaisemmassa denaturoivassa vaiheessa ja että prosessoidussa polypeptidimolekyylijoukossa on suurempi osuus polypeptidi- molekyylejä erityisessä laskostuneessa muodossa kuin a) alkuperäisessä joukossa ja b) vastaavassa alkuperäisessä joukossa, johon on kohdistettu vain yksi kierros.
Tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa termiä "joukko" . , ("ensemble") käytetään sen ("ensemble") alalla saamassa mer- * · • · kityksessä, eli se tarkoittaa joukkoa molekyylejä, joilla on • · olennaisia yhteisiä piirteitä. Alun perin ("alkuperäinen ensem-: ble") ainakin niiden aminohapposekvenssi on yhteinen (ja tämä ; ,'· yhteinen piirre tietenkin säilyy). Kun polypeptidimolekyylien j : joukkoa on käsitelty keksinnön mukaisella menetelmällä (mistä : Y: on tuloksena "käsitelty joukko"), joukossa esiintyvien konfor- maatiotilojen olennainen osa mainitusta käsitellystä joukosta V. polypeptidimolekyylejä (osajoukko) on yhdessä erityisessä "t konformaatiossa. Kuten jäljempänä kerrottavasta ymmärretään, ’·* tämä käsitellyn joukon olennainen määrä polypeptidimolekyylejä ‘ ' yhdessä erityisessä konformaatiossa voi vaihdella keksinnön mukaisen menetelmän parametrien mukaan, erityisessä konformaa-. tiossa olevan proteiinin koon, molekyylien aminohapposekvens- lii ,···, sin pituuden ja identiteetin mukaan jne. Tässä kuvatuissa esimerkeissä, joissa prosessin parametrejä ei vielä ole optimoitu, yhdessä erityisessä konformaatiossa olevien polypep- 113272 15 tidimolekyylien määrä vaihteli ollen 15%-100% joukosta, mikä on kaikissa tapauksessa enemmän kuin mitä ennen tätä keksintöä pystyttiin saavuttamaan. Esimerkissä 13 havainnollistetaan edelleen, että polypeptidimolekyylien puhdistaminen ennen niiden altistamista keksinnön mukaiselle menetelmälle kasvattaa yhdessä erityisessä konformaatiossa olevien polypeptidimolekyylien osajoukkoa.
"Denaturointivaihe" viittaa polypeptidimolekyylijoukon altistamiseen joksikin ajanjaksoksi fysikaalisille ja/tai kemiallisille oloille, jotka kohdistavat polypeptidijoukkoon olosuhteet, joille on luonteenomaista voimakkaampi denaturointikyky kuin luonteenomaisilla olosuhteilla välittömästi ennen denaturoivaa vaihetta.
Sen mukaisesti termi "renaturointivaihe" viittaa polypeptidimolekyyli j oukon altistamiseen joksikin ajaksi fysikaalisille ja/tai kemiallisille oloille, jotka kohdistavat polypeptidi-joukkoon olosuhteet, joille on luonteenomaista vähemmän voimakas denaturointikyky kuin luonteenomaisilla olosuhteilla välittömästi ennen denaturoivaa vaihetta.
113272 16 ovat suuremmat saannot, kuten vähintään 5%, vähintään 10%, vähintään 20% ja vähintään 25% alkuperäisestä polypeptidimole-kyylien joukosta. Edullisempia ovat saannot vähintään 30%, kuten vähintään 40%, 50%, 60%, 70% ja vähintään 80%. Erityisesti edullisia ovat saannot vähintään 85%, kuten 90%, 95%, 97% ja jopa 99%. Joskus havaitaan lähes 100%:n saantoja.
Kun joukon polypeptidimolekyylit sisältävät kysteiiniä, käsitelty joukko sisältää olennaisen osajoukon polypeptidimolekyy-lejä yhdessä erityisessä yhdenmukaisessa konformaatiossa, jossa lisäksi on olennaisesti identtinen disulfidisidostopologia.
Useimmissa tapauksissa keksinnön mukaiselle menetelmälle altistetut polypeptidimolekyylit ovat molekyylejä, joiden aminohapposekvenssi on identtinen autenttisen polypeptidin aminohapposekvenssin kanssa, tai molekyylejä, joihin sisältyy autenttisen polypeptidin sekvenssiä vastaava polypeptidisek-venssi liitettynä yhteen tai kahteen lisäpolypeptidijaksoon.
Termillä "autenttinen proteiini tai polypeptidi" tarkoitetaan polypeptidiä, jonka primäärirakenne, mukaan lukien N- ja C- . , pään rakenteet, on identtinen vastaavan luonnollisen proteii- • # ‘ · nin kanssa. Termi viittaa myös polypeptidiin, jolla on tunnet- * · tu primäärirakenne, joka ei välttämättä ole identtinen luonnol-: ·· lisen proteiinin vastaavalle rakenteelle, mutta joka polypep-
.· I
; / tidi on proteiinisynteesin tarkoituksellinen lopputuote.
: Termillä "luonnollinen proteiini" tarkoitetaan proteiinia eristettynä biologisesti aktiivisessa muodossa organismista, jossa se' on läsnä muuten kuin geenimanipulaation seurauksena.
Sitävastoin termin "keinotekoinen proteiini tai polypeptidi" tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytettynä tarkoi- * tetaan koskevan proteiinia tai polypeptidiä, joka ei ole saa- :"· tavissa mistään luonnollisesta lähteestä, mikä tarkoittaa, . että sitä ei voida eristää ja puhdistaa mistään luonnollisesta ,>·>, lähteestä. Keinotekoinen proteiini tai polypeptidi on siten * · ihmisen tekemän käsittelyn tulos, ja voi olla esimerkiksi 113272 17 tulos yhdistelmä-DNA-käsittelystä tai jonkinlaisesta in vitro -peptidisynteesistä. Edellisten määritelmien mukaisesti sellainen keinotekoinen proteiini voi olla autenttinen proteiini, muttei luonnollinen proteiini.
Siten keksintö koskee myös menetelmää, jossa niin luonnollisia kuin keinotekoisiakin proteiineja altistetaan tässä kuvatuille uudelleenlaskostusprosesseille.
Kuten jäljempänä kuvataan yksityiskohtaisemmin, voi monista eri syistä olla edullista, että autenttinen polypeptidi liitetään polypeptidijaksoihin, joilla on syklien ja muiden niitä edeltävien tai niiden jälkeisten käsittelyjen aikana avustavia tehtäviä, esimerkiksi "kahvoihin" (handles) polypep-tidin sitomiseksi kantajaan, liukoisuuden säätelijöihin, ilmentymisen tehostajiin (boosters), jotka ovat toimineet edistävästi lähetti-RNA:n translaation aikana jne. Edullisesti sellainen avustava polypeptidijakso liitetään autenttiseen poly-peptidiin katkaistavan liitoskohdan välityksellä, ja kun kaksi sellaista avustavaa polypeptidijaksoa liitetään autenttiseen polypeptidiin, tämä voi tapahtua samanlaisten katkaistavien , . liitoskohtien välityksellä, jotka normaalisti katkaistaan ‘ / samanaikaisesti, tai erilaisilla katkaistavilla liitoskohdil- 1 · la, jotka voidaan katkaista missä aikajärjestyksessä tahansa.
* · » ,· Yllä selitetyn mukaisesti uskotaan olevan tämän keksinnön | huomattava uusi tunnusomainen piirre, että kierrätys (johon, kuten edellä on selitetty, sisältyy ainakin kaksi peräkkäistä kierrosta) tuottaa vähintään yhden tapahtuman, jossa renatu-rointivaihetta seuraa denaturointivaihe, jossa ainakin olennainen osajoukko uudelleenlaskostuneita polypeptidejä denaturoituu uudelleen.
‘•Il ’ ’ Useimmissa tapauksissa käsittelyyn sisältyy vähintään 5 kier- ; rosta ja tavallisimmin vähintään 8 kierrosta, kuten vähintään . 10 kierrosta, joissakin tapauksissa vähintään 25 kierrosta.
* »
Toisaalta kierrossarja ei normaalisti ylitä 2000 kierrosta, ja usein se koostuu enintään 1000 kierroksesta ja tavallisimmin 18 113272 enintään 500 kierroksesta. Käytettävä kierrosmäärä valitaan osittain sen mukaan, millaisia mahdollisuuksia antaa laitteisto, jolla kierrätys suoritetaan.
Näin ollen, jos kierrätyskäsittely tehdään niin, että polypep-tidimolekyylit ovat immobilisoituina kantajapylvääseen, kuten jäljempänä selitetään yksityiskohtaisemmin, nopeus, jolla pylvään kanssa kosketuksissa oleva nestefaasi voidaan vaihtaa, muodostaa yhden rajan sille, mitä on realistisesti mahdollista saavuttaa. Toisaalta korkean suorituskyvyn nestekromatografiän (HPLC) laitteisto mahdollistaa nesteympäristön hyvin nopean vaihtamisen, ja mahdollistaa niin ollen sellaisten kierros-lukujen käytön, jotka kierrosluvut ovat satojen tai tuhansien kierroslukujen rajoissa.
Muita huomioon otettavia seikkoja, jotka vaikuttavat toivottavaan kierroslukumäärään, ovat esimerkiksi sisäiset kineettiset parametrit, kuten proliinitähteiden sisäiset cis- ja trans-isomeerien toisikseen muuttumiset, jotka pyrkivät monimutkaistamaan osittain laskostuneiden tilojen jakaumaa ja jotka siksi on yleensä otettava ajoituksessa asianmukaisesti huomioon.
. . Toinen ajan suhteen kriittinen piirre on disulfidien uudelleen- * ’ järjestymisen kinetiikassa (ks. selitys disulfidien uudelleen- järjestämissysteemeistä, jäljempänä).
~ .·' Kun edellä kerrottu otetaan asianmukaisesti huomioon, kierrä- : tyssarja käsittää tavallisesti enintään 200 kierrosta, tavalli- ; semmin enintään 100 kierrosta ja tavallisimmin enintään 50 kierrosta.
*. Yllä todetun mukaisesti kunkin denaturointivaiheen kesto voi . ··. olla kyseessä olevissa erityisissä olosuhteissa vähintään yksi ·” millisekunti ja enintään yksi tunti, ja kunkin renaturointi- ' * vaiheen kesto voi olla kyseessä olevissa erityisissä olosuh- ·”· teissä vähintään 1 sekunti ja enintään 12 tuntia.
» i » * * · ,···, Useimmissa menetelmän suoritusmuodoissa kunkin yksittäisen de- • t naturointivaiheen denaturoivat olosuhteet pidetään olennaisesti vakaina jokin ajanjakso, ja kunkin yksittäisen renaturoivan 113272 19 vaiheen renaturoivat olosuhteet pidetään olennaisesti vakaina jokin ajanjakso niin, että ajanjaksoja, joina olosuhteet pidetään olennaisesti vakaina, erottavat siirtymävaiheet, joiden aikana olosuhteita muutetaan. Siirtymävaiheen kesto niiden vaiheiden välissä, joissa olosuhteita pidetään olennaisesti vakaina, voi vaihdella laajalla asteikolla, esimerkiksi välillä 0,1 sekuntia-12 tuntia, ja on yleensä läheisesti sovitettu varsinaisten denaturointi- ja renaturointivaiheiden kestoon.
Tämän mielessä pitäen, ajanjaksolla, joka denaturoivan vaiheen denaturoivat olosuhteet pidetään olennaisesti vakioina, voi olla kesto esim. vähintään yksi millisekunti ja enintään yksi tunti, usein enintään 30 minuuttia, ja ajanjaksolla, jona renaturoivan vaiheen renaturoivat olosuhteet pidetään olennaisesti vakioina, on kesto vähintään 1 sekunti ja enintään 12 tuntia, ja usein enintään 2 tuntia.
Käytännössä, ajanjakson, jona denaturointivaiheen denaturoivat olosuhteet pidetään olennaisesti samoina, kesto on usein 1-10 minuuttia, ja ajanjakson, jona renaturointivaiheen renatu-, , rointiolosuhteet pidetään olennaisesti samoina, kesto on usein / 1-45 minuuttia.
: ·* Edellä kerrotusta ymmärretään, että yllä kuvattuja ajanjaksoja , tulisi säätää siten, että otetaan huomioon kinetiikan muutok- | set, jotka seuraavat muutoksista fysikaalisissa olosuhteissa, : jotka polypeptideihin kohdistetaan. Esimerkiksi paine voi olla hyvin suuri (jopa 5000 bar), kun keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa käytetään HPLC-järj estelmää, ja sellaisissa ,···. olosuhteissa hyvin nopeat vaiheet voivat olla mahdollisia ’·’ ja/tai tarpeellisia. Edelleen, kuten esimerkeistä nähdään, • · * » · * * lämpötilaparametri on merkityksekäs, koska jotkin proteiinit ’·”· uudelleenlaskostuvat asianmukaisesti vain kaukana fysiologi- . seita asteikolta olevissa lämpötiloissa. Sekä lämpötila että • * * .··*. paine tietenkin vaikuttavat keksinnön mukaisen uudelleenlaskos- tumisprosessin kinetiikkaan, ja siksi edellä mainitut renatu-rointi- ja denaturointivaiheiden kestojaksot ovat realistisia 113272 20 rajoituksia keksinnön monille suoritusmuodoille.
Sopivat olosuhteet tietylle keksinnön käyttötavalle pystyy ammattilainen määrittelemään esim. edeltävien kokeiden perusteella.
Kuten edellä on mainittu, polypeptidimolekyylit ovat normaalisti kontaktissa nestefaasiin denaturointi- ja renaturointi-vaiheiden aikana, ja nestefaasi on tavallisesti vesifaasi. Tämä merkitsee, että mitkä tahansa menetelmässä käytettävät reagentit tai apuaineet ovat tavallisesti liuenneina nestefaasiin, tavallisesti vesifaasiin. Nestefaasi voi kuitenkin tarvittaessa koostua myös yhdestä tai useammasta orgaanisesta liuottimesta.
Proteiinien renaturoimisen yhteydessä on hyvin tunnettua käyttää niin sanottua "chaperonia" tai "chaperonikompleksia".
Chaperonit ovat ryhmä vastikään kuvattuja proteiineja, joilla on se yhteinen piirre, että ne kykenevät edistämään osittain tai kokonaan laskostumattomien proteiinien uudelleenlaskostu- mista. Usein chaperonit ovat monimolekyylisiä komplekseja.
, , Monet näistä chaperoneista ovat lämpöshokkiproteiineja, mikä · tarkoittaa, että ne toimivat in vivo trauman destabiloimien * » proteiinien posttraumaattisina korjaajina. Voidakseen täyttää : ’· tämän tehtävän, chaperonit ovat yleensä kestävämpiä vahingoit- ',· tavia tapahtumia vastaan kuin monet muut proteiinit ja proteii- : nikompleksit. Vaikka keksinnön mukainen menetelmä ei vaadi ; chaperonimolekyylien tai chaperonimolekyylikompleksin käyttöä, on tietenkin mahdollista että sopiva chaperonimolekyyli tai chaperonimolekyylikompleksi on läsnä ainakin yhden renaturoin--·, tivaiheen aikana, ja voi olla edullista, että chaperonimole- '·’ kyyli tai chaperonimolekyylikompleksi on läsnä olennaisesti kaikkien kierrosten aikana.
, Kuten edellä on mainittu, polypeptidimolekyylit saavat mielel- , '·, lään olla olennaisesti suljettuina ympäristöön, joka sallii
* I
nestefaasin muuttamisen tai vaihtamisen olennaisesti viemättä mukana polypeptidimolekyylejä. Tämä voidaan saavuttaa useilla 21 113272 tavoilla. Polypeptidimolekyylit voivat esimerkiksi olla dia-lyysilaitteen sisällä tai ne voivat olla "suljettuina" (confined to) toiseen sopivan neste-kaksifaasisysteemin faaseista. Sellainen sopiva vesipitoinen kaksifaasisysteemi voi esim. sisältää polymeerin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu polyetyleenioksidista (polyetyleeniglykoli), polyvinyyli-asetaatista, dekstraanista ja dekstraanisulfaatista. Yhdessä kiinnostavassa järjestelyssä yksi faasi sisältää polyetyleeni-oksidia (polyetyleeniglykolia) ja toinen faasi sisältää dekstraania, jolloin polypeptidimolekyylit pysyvät suljettuina dekstraania sisältävään faasiin.
Toinen tapa estää polypeptidiä kulkeutumasta mukaan on polypep-tidimolekyylien pitäminen sitoutuneina kiinteään tai puolikiin-teään kantajaan, kuten suodattimen pintaan, onttoon kuituun tai pallosia sisältävään kromatografia-aineeseen, esim. agaroosiin tai polyakryyliamidigeeliin, kuituiseen selluloosa-matriisiin tai HPLC- tai FPLC- (Fast Performance Liquid Chromatography, nopean suorituskyvyn nestekromatografia) -matriisiin. Toinen keino on, että kantaja voi olla aine, jonka molekyylien koko on sellainen, että liuenneet tai dispergoitu-. . neet molekyylit, kun polypeptidimolekyylit ovat sitoutuneina ' t* niihin, voidaan pidättää suodattimeen, tai kantaja voi olla misellejä muodostamaan tai misellien muodostumiseen osallistu-! *’ maan pystyvä aine, joka mahdollistaa, että nestefaasia muute- ; .· taan tai vaihdetaan olennaisesti ilman, että misellit kulkeutu- | vat mukaan. Tapauksissa, joissa misellejä muodostavat komponen- ; , : tit pyrkisivät karkaamaan järjestelmästä monomeereina, esim.
kun ne pystyisivät jossakin määrin läpäisemään järjestelmän rajoittamiseen käytettävän ultrasuodattimen, tämä kompensoitaisiin täydentämällä lisää miselliä muodostavaa monomeeriä.
* * * ·
Kantaja voi myös olla vesiliukoinen polymeeri, jonka molekyy-'* · lit ovat kokoa, joka ei olennaisesti pysty läpäisemään suodat- ; timen huokosia tai muuta järjestelmän rajoittamiseen käyt ett ä- vää keinoa.
» »
I I I
22 113 2 7 2
Polypeptidimolekyylit ovat sopivalla tavalla adsorboituneina kantajaan epäkovalenttisesti sellaisen osan tai ryhmän (moiety) välityksellä, jolla on affiniteettia kantajan komponenttiin. Sellainen osa voi olla esim. yhteen polypeptidin aminohappo-osaan sitoutunut biotiiniryhmä tai sen analogi, jolloin kantajaan on kiinnittetty avidiini, streptavidiini tai jokin niiden analogi, jotta muodostuu järjestelmä, jossa näin modifioitujen polypeptidimolekyylien ja näin modifioidun kantajan välillä on voimakas affiniteetti. Ymmärretään, että modifioidun polypeptidin ja modifioidun kantajan välisen affiniteetin pitäisi olla riittävän vakaa, jotta denaturoivat olosuhteet eivät olennaisesti vaikuta adsorptioon, ja polypeptidimolekyylien irroittaminen kantajasta kierrätyksen jälkeen tulisi suorittaa käyttäen spesifistä katkaisua, kuten jäljempänä on kuvattu.
Sopiva aminohappotähde, johon biotinyyliryhmä voi olla sitoutunut, on esimerkiksi lysiini.
Yksi kiinnostava tapa tuoda mukaan aminohappo, jossa on ryhmä, jolla on affiniteettia kantajaan, on CPY-synteesi. CPY:n (kar-boksipeptidaasi Y) tiedetään pystyvän lisäämään mikä tahansa i > • · aminohappoamidi riippumatta aminohappoamidin sivuketjun !t : laadusta.
• * • c • > · • ·'. Yhdessä kiinnostavassa suoritusmuodossa osa, jolla on affini- ; . ·. teettiä kantajaan, on polypeptidisegmentti SEK ID NO:47, missä tapauksessa sopii kantaja, joka sisältää nitrilotrietikkahappojohdannaista (NTA) varattuna Ni++-,, . ioneilla, esimerkiksi NTA-agaroosimatriisi, jota on pidetty t »
Ni++:ä sisältävässä liuoksessa.
· > t ;* i Yksi tärkeä keksinnön piirre koskee sitä, että polypeptidimole- kyydissä on läsnä sopiva väline molekyylin valmistamiseksi myöhempään katkaisuun kahdeksi tai useammaksi segmentiksi, * * * missä yksi segmentti on yllä määritellyn mukainen autenttinen * · ’*··’ polypeptidi. Sellaiset yhdistetyt polypeptidimolekyylit (fuu- siopolypeptidimolekyylit) voivat tätä tarkoitusta varten käsit- 113272 23 tää polypeptidisegmentin, joka pystyy suuntaamaan spesifisen katkaisevalla tekijällä katkaisun tiettyyn peptidisidokseen. Kyseinen polypeptidijakso voi olla sellainen, joka suuntaa katkaisua, koska jakson konformaatio toimii kohtana, jonka katkaiseva tekijä tunnistaa.
Katkaisun suuntaava polypeptidisegmentti voi esimerkiksi pys-tyä suuntaamaan tietyn peptidisidoksen kohdalle suosivan katkaisemisen, kun katkaiseva tekijä on valittu ryhmästä, johon kuuluvat syaanibromidi, hydroksyyliamiini, jodosobensoe-happo ja N-bromosukkinimidi.
Katkaisun suuntaava polypeptidisegmentti voi olla sellainen, joka pystyy suuntaamaan preferentaalisen eli suosivan katkaisemisen spesifisen peptidisidoksen kohdalle, kun katkaisutekijä on entsyymi, ja yksi mahdollinen sellainen entsyymi on naudan enterokinaasi tai sen analogi ja/tai homologi.
Eräältä tärkeältä keksinnön kannalta katkaiseva tekijä on naudan hyytymistekijä Xa -entsyymi tai sen analogi ja/tai sen homologi (sellaisista analogeista kerrotaan yksityiskohtaisem-, , min jäljempänä), ja preferentiaalista katkaisua suuntaava » i ·; · polypeptidisegmentti on sekvenssi, jonka naudan hyytymistekijä '* .* Xa tai sen analogi ja/tai homologi olennaisesti tunnistaa : ** selektiivisesti. Tärkeitä sellaisia segmenttejä ovat polypepti- : '.«* disegmentit, joilla on ryhmästä SEK ID NO-.38, SEK ID NO-.40, : .* SEK ID NO:41 and SEK ID NO:42 valittu sekvenssi.
t
Yksi tärkeä keksinnön piirre on mahdollisuus peittää ja ·.·. paljastaa polypeptidisegmenttien kyky suunnata katkaisu . *. tiettyyn peptidisidokseen, millä saavutetaan se, että eri < » ·’ segmenttejä polypeptidissä voidaan katkaista kierrosten eri * ' * vaiheissa.
* » . .·. Näin ollen, kun polypeptidimolekyyleihin sisältyy polypeptidi- ,*>, segmentti, joka on in vitro konvertoitavissa derivatisoiduksi • $ polypeptidijaksoksi, joka pystyy suuntaamaan suosivalla katkaisijalla tehtävän katkaisemisen tiettyyn peptidisidok- 113272 24 seen, mainittu piilotus/paljastusvaikutus on käytettävissä. Erityisen kiinnostava versio tästä strategiasta on se, jossa in vitro konvertoitavissa oleva polypeptidigmentti on konvertoitavissa derivatisoiduksi polypeptidijaksoksi, jonka naudan hyytymistekijä Xa tai sen analogi ja/tai homologi tunnistaa olennaisesti selektiivisesti.
Ajatellaan, että sekä kysteiini- että metioniinitähteet voidaan konvertoida modifioiduiksi tähteiksi, jotka modifioidut tähteet tekevät segmentit, joissa on aminohapposekvenssi, joka on valittu ryhmästä SEK ID NO:43, SEK ID NO:44, SEK ID NO:45 ja SEK ID NO:46, in vi tro-konvertoitavaksi segmenteiksi, jotka naudan hyytymistekijä Xa tai sen analogi ja/tai homologi tunnistaa.
Keksinnön mukaisesti yksi mahdollinen ratkaisu, jossa kysteii-nitähde on mukana, on, että polypeptidisegmentti, jonka aminohapposekvenssi on SEK ID NO: 43 tai SEK ID NO:44, konvertoidaan derivatisoiduksi polypeptidiksi, jonka naudan hyytymistekijä Xa tunnistaa olennaisen selektiivisesti, saattamalla kysteiinitähde reagoimaan N-(2-merkaptoetyyli)mor-folyyli-2-tiopyridyylidisulfidin tai merkaptotioasetaatti-2- * · : : tiopyridyylidisulfidin kanssa.
> · : "·· Yksi mahdollinen keksinnön mukainen strategia, jossa mukana on ' t’ metioniini, on polypeptidisegmentin, jonka aminohapposekvenssi : on SEK ID NO: 45 tai SEK ID NO: 46 konvertoiminen naudan * . hyytymistekijän Xa olennaisen selektiivisesti tunnistamaksi johdannaispolypeptidiksi hapettamalla metioniinisivuketjun tio-eetteriosa sulfoksidi- tai sulfonijohdannaiseksi.
Edullisia keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuotoja ovat > * * ne, joissa katkaisemista ohjaavat segmentit, joiden aminohappo- sekvenssit ovat SEK ID NO:38, SEK ID NO:40, SEK ID NO:41 tai , SEK ID NO: 42 tai piilotetut katkaisua ohjaavat segmentit, » I t f*.-( joiden aminohapposekvenssit ovat SEK ID NO:43, SEK ID NO:44, SEK ID NO:45 ja SEK ID NO-.46 on liitetty autenttisen polypep-tidin N-päähän, koska silloin ei tarvita valikoivan katkaisun 113272 25 lisäksi muuta käsittelyä, jotta saadaan autenttista polypepti-diä liuoksessa. Toisaalta yksi mahdollinen syy katkaisemista ohjaavien sekvenssien liittämiseksi autenttisen polypeptidin C-päähän on, jos polypeptidimolekyylien oikein laskostuminen vaatii vapaan N- pään polypeptidimolekyyleihin. Sellaisessa tapauksessa katkaisemisen jälkeen jäljelle jäävä katkaisemista suuntaava sekvenssi voidaan irroittaa käyttämällä sopivalla tavalla karboksipeptidaaseja A ja B.
Olosuhteiden muutos vaiheiden välisenä siirtymäaikana voidaan keksinnön mukaan tuottaa muuttamalla nestefaasin, jonka kanssa polypeptidimolekyylit ovat kosketuksissa, kemiallista koostumusta. Polypeptidimolekyylit voidaan näin ollen denaturoida saattamalla polypeptidimolekyylit kosketuksiin sellaisen nestefaasin kanssa, johon on liuenneena ainakin yhtä denaturoivaa yhdistettä, ja polypeptidimolekyylit renaturoidaan saattamalla polypeptidimolekyylit kosketuksiin sellaisen nestefaasin kanssa, joka joko sisältää vähintään yhtä liuennutta denaturoivaa yhdistettä sellaisena pitoisuutena, että kontakti neste-faasin kanssa ennemmin renaturoi kuin denaturoi polypeptidi-joukon molekyylejä niiden eri konformaatiotiloissa, jotka ovat seurausta edeltävästä vaiheesta, tai ei sisällä olennaisesti ; · mitään denaturoivaa yhdistettä.
• » f * ; Ilmaus "denaturoiva yhdiste" viittaa yhdisteeseen, joka ollessaan läsnä yhtenä liuenneena aineena polypeptidimolekyy-lejä sisältävässä nestefaasissa voi destabiloida polypeptidi- » molekyylien laskostuneita muotoja niin, että se johtaa polypep- u · tidiketjujen laskostumisen aukeamiseen osittain tai kokonaan.
, , Denaturoivan yhdisteen tuottama denaturoiva vaikutus kasvaa ;* denaturoivan tekijän pitoisuuden kasvaessa liuoksessa, mutta voi myös vahvistua tai vähentyä muiden liuoksessa liuenneina * ! olevien aineiden tai fysikaalisten parametrien, esim. lämpö- *>· tilan tai paineen muutosten takia.
> ·
Esimerkkeinä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäviksi » · ‘ sopivista denaturoivista yhdisteistä voidaan mainita urea, guanidiini-HCl, di-Ci-galkyylformamidit, kuten dimetyyli- formamidi ja di-Ci-g-alkyylisulfonit.
26 113 2 7 2
Ainakin yhdessä denaturoivista vaiheista ja/tai ainakin yhdessä renaturoivista vaiheista käytettävä nestefaasi voi keksinnön mukaisesti sisältää ainakin yhden disulfideja uudelleen järjestävän systeemin.
"Disulfideja uudelleen järjestävät systeemit" ovat hapetus-pelkistyssysteemejä, jotka sisältävät pelkistävien ja hapettavien tekijöiden seoksia, joiden läsnäolo helpottaa polypepti-din sisäisten tai polypeptidien välisten disulfidisidosten katkaisemista ja muodostamista. Näin ollen "disulfideja uudelleen järjestävät tekijät" tai "disulfideja uudelleen järjestävät yhdisteet" ovat sellaisia pelkistäviä ja hapettavia tekijöitä, jotka helpottavat polypeptidin sisäisten tai polypeptidien välisten disulfidisidosten katkaisemista ja muodostamista. Yhdeltä tärkeältä keksinnön kannalta proteiinien kanssa kontaktissa olevan nestefaasin sisältämä disulfi-dien uudelleenjärjestämissysteemi käsittää seoksen merkaptaa-nia ja sen vastaavaa disulfidiyhdistettä.
Esimerkiksi, kaikki polypeptidimolekyylien kysteiinitähteet on * · saatettu konvertoida joko glutationin, tiokoliinin, merkapto- i : etanolin tai merkaptoetikkahapon sekadisulfidituotteiksi aina- •' kin yhden denaturointi/renaturointisyklin aikana. Sellaisesta j . konvertoidusta polypeptidistä käytetään termiä "täysin disulfi- ; disuojattu polypeptidi tai proteiini" ja näin ollen tämä termi viittaa polypeptidiin tai proteiiniin, jossa kysteiinitähteet on konvertoitu sekadisulfideiksi, joissa jokainen kysteiini-tähde on liitetty disulfidisidoksella merkaptaaniin, esim. glutationiin. Kysteiinitähteiden konvertointi sekadisulfidi-tuotteiksi voidaan suorittaa antamalla täysin denaturoidun ja : · täysin pelkistetyn joukon polypeptidimolekyylejä reagoida yli- määrän kanssa reagenttia, joka on runsasenerginen sekadisul- ·, fidiyhdiste kuten alifaattis-aromaattiset disulfidiyhdisteet, i * · ‘;y‘ esim. 2- tiopyridyyliglutationyylidisulfidi, tai millä tahansa ’··>* muulla sopivalla menetelmällä.
27 113272
Esimerkkeinä runsasenergista sekadisulfideista (toisin sanoen disulfideista, joiden S-S-sidos on suhteellisen epävakaa) voidaan mainita sekadisulfidit, joilla on seuraava yleinen kaava: i2
Ri -S-S-C-R-d r4 missä R4 on 2-pyridyyli ja R2, R3 ja R4 kukin on vety tai valinnaisesti substituoitu lyhytketjuinen aromaattinen tai alifaattinen hiilivetyryhmä. Esimerkkejä tällaisista sekadisulf ideista ovat glutationyyli-2-tiopyridyylidisulfidi, 2-tio-kolyyli-2-tiopyridyylidisulfidi, 2-merkaptoetanoli-2-tiopyri- dyylidisulfidi ja merkaptoasetaatti-2-tiopyridyylidisulfidi.
Kiinnostavissa suoritusmuodoissa disulfidien uudelleenjärjestä-missysteemi sisältää glutationia, 2-merkaptoetanolia tai tioko-liinia, kutakin seoksena vastaavan symmetrisen disulfidinsa kanssa.
; ; Tietyn tioliseoksen sopivuus käytettäväksi valikoivana pelkis- : : tys- ja/tai disulfidien uudelleenjärjestämissysteeminä tietyn *' t> proteiinituotteen syklisessä uudelleenlaskostamis/uudelleen- 1’ oksidaatiomenettelyssä voidaan määrittää suoraan inkuboimalla * · ; ·, laskostuneiden ja väärin laskostuneiden proteiinien näyte- . sarjoja sarjalla tioliseoksia muutamassa erilaisessa denaturoi- ? » japitoisuudessa, jolla on proteiiniin heikosti, keskinkertaisesti tai voimakkaasti denaturoiva vaikutus. Inkuboinnin jälkeen kunkin näytteen disulfiditopologia lukitaan reaktiolla ylimäärällä tiolisuojaavaa reagenttia (esim. jodoasetamidi) •j ennen kuin kullekin näytesarjalle tehdään SDS-PAGE pelkistämät- tömissä olosuhteissa. Oikeat disulfidisidokset sisältävä aines * ja epätoivottavissa kovalenttisissa topologisissa muodoissa ‘ :·' oleva aines tulevat esiin erillisinä juovina, ja siksi on mahdollista määrittää kvantitatiivisesti proteiinin laskostu- 113272 28 mistila tiolisuojaushetkellä, koska vain ainoalla oikealla tavalla disulfidisidoksinen topoisomeeri voi vastata oikein laskostunutta proteiinia, joka on läsnä tioli/disulfidi- ja denaturoivilla tekijöillä tapahtuneen inkuboinnin lopussa. Tämän koesarjan avulla on mahdollista määrittää denaturoija-pitoisuuksien asteikon laajuus, jolla tiettyä tioli/disulfidi-reagenttia voidaan edullisesti käyttää disulfidien uudelleen-järjestelytekijänä, mikä tulee esiin väärien disulfidisidok-sien pelkistämisenä suosivasti ja uudelleenjärjestämisenä ja alhaisena pyrkimyksenä pelkistää täysin laskostuneiden proteiinien sidoksia. Tätä reagentintestausmenettelyä voidaan käyttää yleisenä menettelynä edullisten pelkistys- ja/tai tioli/disul-fidi-uudelleenjärjestelyreagenttien valitsemiseen. Esimerkki 12 kuvaa tämän analyyttisen menettelyn sovellusta 5:n eri tiolireagentin sopivuuden testaamiseksi malliproteiinin väärin laskostuneiden muotojen valikoivaan pelkistämiseen ja osoittaa siten edellä selostetun menettelyn käyttökelpoisuuden.
Ymmärretään, että yllä mainittua menettelyä sopivien disulfidien uudelleenjärjestämissysteemien valitsemiseksi voidaan myös käyttää muiden koostumusten kuin tioliseosten valitsemiseen. Mikä tahansa seos, joka sisältää sopivia pelkistys/hape-tustekijöitä, voidaan arvioida yllä mainitun menettelyn avulla, ja keksinnön mukaiseen menetelmään valitaan koostumus, ; '* joka osoittaa suurinta kykyä pelkistää ensisijaisesti väärin ; .·’ muodostuneita disulfidisidoksia.
* S » » Näin ollen hyvin tärkeä keksinnön piirre on menetelmä proteiinin uudelleenlaskostamiseksi tässä kuvatulla tavalla, missä ;v. ainakin yksi nestefaasin ainakin yhden renaturointi- ja/tai ,···, denaturointivaiheen aikana sisältämä disulfidien uudelleen- j ärj estämissysteemi on sellainen, joka pystyy pelkistämään ·’· ja/tai järjestämään uudelleen väärin muodostuneita disulfidi- sidoksia denaturoijapitoisuuksissa, joissa laskostumattomat . ja/tai väärin laskostuneet proteiinit ovat denaturoituneita ja
» t I
• » > ,···. joissa (pitoisuuksissa) ei esiinny olennaisesti lainkaan • i oikein muodostuneiden disulfidisidosten pelkistymistä ja/tai uudelleen järjestymistä.
29 113272
Kiinnostava keksinnön suoritusmuoto on edellä kuvatun mukainen menetelmä, jossa disulfidien uudelleenjärjestämissysteemiä käytetään vähintään yhdessä denaturointi/renaturointivaihees-sa, ja se tuottaa pelkistyneiden/uudelleen järjestyneiden, alun perin väärin muodostuneiden disulfidisidosten suhteellisen määrän ja pelkistyneiden/uudelleen järjestyneiden, alun perin oikein muodostuneiden disulfidisidosten suhteellisen määrän väliseksi suhteeksi vähintään 1,05. Edullisesti suhde on suurempi, kuten 1,1, 1,5, 2,0, 3,0, 5,0, 10, 100 tai 1000, mutta jopa suuremmat suhteet ovat mahdollisia ja siten keksinnön mukaisesti erityisen edullisia.
Termeillä "alussa oikein/väärin" disulfidisidosten järjestykseen viitatessa tarkoitetaan disulfidisidostopologiaa juuri ennen kuin disulfidien uudelleenjärjestämissysteemi vaikuttaa.
Ymmärretään, että suhteen on oltava suurempi kuin 1, jotta oikein muodostuneiden disulfidisidosten nettomuodostus proteii- ninäytteessä on mahdollista. Yleensä suhteen tulisi olla niin suuri kuin mahdollista, mutta myös suhteet, jotka ovat juuri , . ja juuri yli 1, mahdollistavat oikein muodostuneiden disulfidi- * · sidosten muodostumisen keksinnön mukaisessa menetelmässä, ja t tärkein parametri suuren saannon varmistamisessa on denaturoin-’· ti/renaturointikierrosten lukumäärä. Jos suhde on vain vähän suurempi kuin yksi, on suoritettava loppuun monta kierrosta, ennen kuin saavutetaan huomattava määrä oikein muodostuneita ; disulfidisidoksia. Jos taas suhde on suuri, kierroksia tarvi taan vain rajoitetusti.
» · .*·. Tapauksissa, joissa aiotaan käyttää vain yhtä disulfidien * · ·” uudelleenjärjestämissysteemiä, sellainen disulfidien uudelleen- » * * « · ' ‘ järjestämissysteemi voidaan keksinnön mukaisesti valita » » * t · i · . .1) inkuboimalla näytteitä laskostunutta ja väärin laskostunut- ,··*, ta proteiinia, jonka aminohapposekvenssi on sama kuin proteii- • » nin, jota aiotaan käsitellä keksinnön mukaisella menetelmällä, sarjan disulfidien uudelleenjärjestämissysteemejä kanssa 113272 30 valitun denaturoivan tekijän muutamissa eri konsentraatioissa, 2) määrittämällä kussakin denaturoivan tekijän eri konsentraa-tiossa kunkin disulfidien uudelleenjärjestämissysteemin kyky-pelkistää ja/tai järjestää uudelleen alun perin väärin muodostuneita disulfidisidoksia olennaisesti pelkistämättä ja/tai järjestämättä uudelleen alun perin oikein muodostuneita disulf idisidoksia laskemalla pelkistyneiden/uudelleen järjestyneiden, alun perin väärin muodostuneiden disulfidisidosten suhteellisen määrän ja pelkistyneiden/uudelleen järjestettyjen, alun perin oikein muodostuneiden disulfidisiltojen suhteellisen määrän välinen suhde, ja 3) valikoimalla disulfididen uudelleenjärjestämissysteemiksi X, disulfidien uudellelleenjärjestämissysteemi, joka osoittaa kykyä pelkistää alun perin väärin muodostuneet disulfidisidok-set olennaisesti pelkistämättä ja/tai järjestämättä uudelleen alun perin oikein muodostuneita disulfidisidoksia laajimmalla valitun denaturoijän pitoisuusasteikolla.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää useampaa kuin yhtä disulfidien uudelleenjärjestämissysteemiä, esimerkiksi eri kierrok-•:· sissa keksinnön mukaisessa syklisessä uudelleenlaskostamis- järjestelmässä, mutta myös samanaikaisesti samoissa kierrok-i ’·· sissa. Näin tehdään esim. silloin, kun on todennäköistä tai on ‘/· osoitettu esim. edellä kuvaillulla menetelmällä, että kokonais- ' !| saanto oikein laskostunutta proteiinia, jossa on oikea disulfi- disidostopologia, on korkeampi, jos keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään erilaisia disulfidien uudelleenjärjestä-missysteemej ä.
!* Seuraavaa menetelmää voidaan käyttää edellä mainitun pelkisty- ““· neiden/uudelleen järjestettyjen, alun perin väärin muodostu- neiden disulfidisidosten suhteellisen määrän ja pelkistynei- , .·. den/uudelleen järjestettyjen, alun perin oikein muodostuneiden ,·>, disulf idisidosten suhteellisen määrän välisen suhteen laskemi- * * seen: alkuperäiseen reaktanttiseokseen vaiheessa 1) lisätään tunnettu määrä radioaktiivisesti leimattua oikein laskostunut- 113272 31 ta proteiinia. Kun oikein ja väärin laskostuneen proteiinin määrät on määritetty vaiheessa 2) (esimerkiksi pelkistämättö-mällä SDS-PAGE:11a) , määritetään myös oikein laskostuneen proteiinin fraktion radioaktiivisuus. Tällä voidaan määrittää nyt väärin laskostuneen (mutta alun perin oikein laskostuneen) proteiinin määrä rinnan oikein/väärin laskostuneen proteiinin kokonaisjakauman määrityksen kanssa. Yllä mainittu suhde voidaan siten laskea kaavalla c2 ~ · ci *- Ai...
ui' — missä ja C2 ovat alkuperäinen ja lopullinen oikein laskostuneen proteiinin määrä, tässä järjestyksessä. Ui on alun perin väärin laskostuneen proteiinin määrä ja Ai ja A2 ovat alun perin oikein laskostuneen proteiinin fraktion ja lopullisen oikein laskostuneen proteiinin radioaktiivisuudet, tässä j ärj estyksessä.
Yllä mainittujen denaturointikeinojen lisäksi denaturointi voidaan saavuttaa tai sitä voidaan tehostaa myös pienentämällä • 1 ·’··' ·* nestefaasin pH: ta tai suurentamalla nestefaasin pH: ta.
1 » « • *·· Renaturoimisessa käytettävän nestefaasin polaarisuus voi olla : 1 : keksinnön mukaisesti muunnettu lisäämällä suolaa, polymeeriä : ja/tai fluorivety-yhdistettä, kuten trifluorietanolia.
Keksinnön mukaisesti polypeptidimolekyylien denaturointi ja ·, renaturointi voidaan myös tuottaa suoranaisilla muutoksilla fysikaalisissa parametreissä, joille polypeptidimolekyylit ovat altistettuina, kuten lämpötilassa tai paineessa, tai näitä keinoja voidaan käyttää muista yllä mainituista keinois-ta seuräavan denaturoitumisen tai renaturoitumisen tehostami-, [*t seksi tai hillitsemiseksi.
• ·
Ymmärretään kuitenkin, että erittäin tärkeä keksinnön käytännön suoritusmuoto tehdään tuottamalla kemiallisia muutoksia 113272 32 nestefaasissa vaihtelemalla denaturoivan liuoksen B ja renatu-roivan liuoksen A välillä. Tässä tapauksessa yhden tai useamman B:ssä olevan denaturoivan yhdisteen konsentraatioita säädetään usein kunkin kierroksen jälkeen. Yhdessä tärkeässä esimerkissä yhden tai useamman B:ssä olevan denaturoivan yhdisteen pitoisuutta B:ssä pienennetään kunkin kierroksen jälkeen, mutta toisessa tärkeässä suoritusmuodossa yhden tai useampien aineessa B olevan denaturoivan yhdisteen pitoisuus pidetään vakiona kaikissa kierroksissa.
Tämä keksinnön suoritusmuoto, jossa aineen B denaturoivien yhdisteiden pitoisuus/pitoisuudet pidetään vakiona/vakioina, on erityisen kiintoisa, kun kierrätysprosessin tuottoisin vaihe on tunnistettu (oikein laskostuneen proteiinin suhteen), ja halutaan tuottaa suuria määriä oikein laskostunutta proteiinia. Kuten ymmärretään, denaturoivan yhdisteen tai denaturoivien yhdisteiden edullinen pitoisuus/ edulliset pitoisuudet aineessa B tässä suoritusmuodossa ovat se tai ne pitoisuudet, jonka/joiden on osoitettu takaavan maksimituottavuuden keksinnön mukaisessa kierrätysprosessissa.
Polypeptidimolekyylit joukossa, johon keksinnön mukainen : : : menetelmä kohdistetaan, ovat yleensä ainakin 25 aminohappotäh- • » teen pituisia, esimerkiksi ainakin 30 aminohappotähteen tai : ’·· ainakin 50 aminohappotähteen pituisia. Toisaalta joukon ; polypeptidimolekyylit ovat yleensä enintään 5000 aminohappo- : ': tähteen pituisia, esimerkiksi enintään 2000 aminohappotähteen ; tai enintään 1000 tai 800 aminohappotähteen pituisia.
Kuten esimerkistä 10 nähdään, keksinnön mukainen menetelmä on mahdollistanut oikein laskostuneiden diabody-mokyylien tuotan-!' non (diabodyt on kuvattu lähteessä Holliger et ai., 1993).
“· Yksi keksinnön tärkeä puoli koskee siksi oikein laskostuneiden diabody-molekyylien tuottamismenetelmää, jossa alkuperäiseen . polypeptidimolekyylijoukkoon, joka käsittää laskostumattomia
• F I
ja/tai väärin laskostuneita polypeptide j ä, joilla on samat * » aminohapposekvenssit kuin diabody-molekyylien monomeerifragmenteilla, kohdistetaan vähintään kahden peräkkäisen kier 33 113272 roksen sarja, jossa kumpikin kierros käsittää peräkkäiset vaiheet 1) vähintään yksi denaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on denaturoiva ja/tai laskokset avaava vaikutus polypeptidijoukon molekyyleihin siten, että osa joukon polypeptideistä denaturoituu, mitä seuraa 2) vähintään yksi renaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on renaturoiva vaikutus polypeptidimolekyyleihin, joiden konfirmaatiot ovat seurausta edellisestä vaiheesta siten, että osa joukon denaturoituneista ja/tai laskostumattomista polypeptideistä renaturoituu siten, että kierrossarja on sovitettu niin, että olennainen osajoukko alkuperäisestä polypeptidimolekyylijoukosta konvertoituu osajoukoksi oikein laskostuneita diabodymolekyylejä.
Sellaista menetelmää diabodyjen oikeaksi laskostamiseksi voidaan ajatella missä tahansa yllä mainituista skenaarioista ja keksinnön mukaisen laskostamismenetelmän piirteissä, sekä fysi-. , kaalisten ja kemiallisten olosuhteiden että kiertojen suunnit- · telun suhteen. Tärkeä piirre menetelmässä diabodyjen oikeaksi • · ’* ’ laskostamiseksi on kuitenkin yllä identifioidun kaltainen mene- : ·* telmä, jossa polypeptidimolekyylit ovat kontaktissa nestefaa-
I · I
• siin, joka sisältää ainakin yhden disulfidien uudelleenjärjes- : .· tämissysteemin ainakin yhdessä denaturointi- tai renaturointi- vaiheessa. Edullinen denaturoi ja sellaisessa nestefaasissa käytettäväksi on urea, ja edullinen disulfidien uudelleenjärjestä-,·. missysteemi sisältää glutationia tärkeimpänä pelkistävänä teki- •. j änä.
Yksi keksinnön erityinen piirre koskee edellä kuvatuissa • menetelmissä käytettävää polypeptidiä, joka on seriini-» proteaasin proentsyymi, mutta joka on kuitenkin erilainen kuin , /. mikään luonnossa esiintyvä seriiniproteaasi, ja jossa » , ··, erityisesti on erilainen aminohapposekvenssi kuin naudan • » hyytymistekijässä X (Protein Identification Resource (PIR), National Biomedical Research Foundation, Georgetown Univer- 113272 34 sity, Medical Center, U.S.A., entry: P1;EXB0) ja joka voidaan aktiivisen seriiniproteaasin tuottamiseksi aktivoida proteo-lyyttisesti inkuboimalla polypeptidin liuosta denaturoimattomassa puskurissa sellaisen aineen kanssa, joka katkaisee polypeptidin vapauttaen uuden N-pään tähteen, siten, että seriiniproteaasin substraattispesifisyys on identtinen tai parempi kuin naudan veren hyytymistekijällä Xa, määritettynä sen perusteella, että kumpikin suhteista (k(I)/k(Vj ja k (III)/k(V) kummankin substraateista I ja III: I: Bensoyyli--Vai-Gly-Arg-paranitroanilidi, III: Tosyyli-Gly-Pro-Arg-paranitroanilidi, katkaisunopeuden ja substraatin V: Bensoyyli-Ile-Glu-Gly-Arg-paranitroanilidi katkaisunopeuden välillä, 20°C:ssa, pH=8, puskurissa, jonka koostumus on 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, on sama tai pienempi kuin vastaava olennaisesti kontaminoivista proteaa-seista puhtaalle naudan hyytymistekijälle Xa määritetty suhde.
* · * t * · > • · ' .* Edellä tunnistettujen polypeptidien karakterisointi seriini- i ’·· proteaaseiksi on "seriiniproteaasit"-termin tavanomaisen i * j \> nomenklatuurisen käytön mukainen. Kuten alalla on tunnettua, ;: seriiniproteaasit ovat entsyymejä, joilla uskotaan olevan katalyyttinen järjestelmä, joka koostuu aktiivisen kohdan seriinistä rinnan histidiinitähteen kanssa, ja uskotaan, että entsyymien aktivointi vastaavista proentsyymeistä perustuu siihen, että vapautuu uusi N-pään tähde, jonka a-aminoryhmä pystyy asettumaan uuteen kohtaan polypeptidirakenteessa siten, » * että muodostuu ionisidos aktiivisen kohdan seriinitähdettä edeltävään aspartaattitähteeseen, muodostaen siten seriini- . proteaaseille tunnusomaisen katalyyttisen kohdan.
• · • · t ·
Yllä määritellyt "keinotekoiset" seriiniproteaasit ovat äärimmäisen arvokkaita polypeptidien katkaisuvälineitä käytet- 113272 35 taviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä ja muissa menetelmissä, joissa on ratkaisevaa, että käytössä on katkaisuväline, joka katkaisee proteiineja valikoivasti, myös suuria laskostaneita proteiineja. Kuten naudan hyytymistekijä Xa, yllä määritellyt keinotekoiset seriiniproteaasit pystyvät aktivoidussa muodossaan tunnistamaan valikoivasti katkaisemista suuntaavan polypeptidisegmentin SEK ID NO:38, mutta toisin kuin naudan hyytymistekijässä Xa, niiden aminohapposekvenssit voidaan tehdä sellaisiksi, että niitä voidaan helposti tuottaa yhdis-telmä-DNA-tekniikalla. Näin ollen edulliset keinotekoiset seriiniproteaasit ovat sellaisia, joiden aminohapposekvenssit sallivat ne syntetoitavan yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, erityisesti prokaryoottisoluissa, kuten E. coli. Kuten seuraa-vasta selvityksestä ja esimerkeistä käy ilmi, keinotekoisille seriiniproteaaseille voidaan, kun ne on tuotettu proka-ryootissa, keksinnön mukaisella kierrätyksellä antaa entsymaattisesti aktiivinen konformaatio, jossa katalyyttisesti aktiiviset domeenit ovat sopivasti paljastettuina.
Kvantitatiivisessa testissä keinotekoisten seriiniproteaasien valikoivuuden tutkimiseksi käytetään katkaisunopeutta k, joka määritetään 405 nm:sen (vapaan paranitroaniliinin absorptio- » » ·' ·* maksimi) valon absorpoitumiskäyrästä 20°C:ssa ajan suhteen * » ’ .* käyrän alkuosan kulmakertoimena.
* · · : 't' Kvantitatiivisesti ilmaistuna, keinotekoisten seriiniproteaa- : sien valikoivuus pitäisi tuntea siitä, että osamäärän ; (k(I)/k(V) arvo on enintään 0,06, ja osamäärän k(III)/k(V) arvo on enintään 0,5. On edullista, että (k(I)/k(V) on enin-,·. tään 0,05 ja k(III)/k(V) enintään 0,4, ja edullisempaa, että ^ (k(I)/k(V) on enintään 0,04 ja k(III)/k(V) enintään 0,15.
"· Kattavammassa spesifisyyden karakterisoinnissa käytetään » '•“ί useampia mallisubstraatteja: substraattispesifisyys voitaisiin , siis määrittää samaksi tai paremmaksi kuin naudan veren > · t .·_ hyytymistekijällä Xa sillä perusteella, että kukin suhteista (k (I) /k (V) , k (II) /k (V) , k (III) /k (V) ja k(IV)/k(V)) kunkin substraateista I - IV: 113272 36 I: Bensoyyli-Val-Gly-Arg-paranitroanilidi, II: Tosyyli-Gly-Pro-Lys-paranitroanilidi, III: Tosyyli-Gly-Pro-Arg-paranitroanilidi, IV: (d,1)Val-Leu-Arg-paranitroanilidi katkaisunopeuden ja substraatin V: Bensoyyli-Ile-Glu-Gly-Arg-paranitroanilidi katkaisunopeuden välillä 20°C:ssa, pH=8 puskurissa, jonka koostumuus on 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, on sama tai pienempi kuin vastaava olennaisesti kontaminoivista proteaa-seista puhtaalle naudan hyytymistekijälle Xa määritetty suhde.
Tässä karakterisoinnissa (k(I)/k(V) pitäisi olla enintään 0,06, k(II)/k(V) pitäisi olla enintään 0,03, k(III)/k(V) pitäisi olla enintään 0,5, ja k(IV)/k(V)) pitäisi olla enintään 0,01, ja on edullista, että (k(I)/k(V) on enintään 0,05, k(II)/k(V) on enintään 0,025, k(III)/k(V) on enintään 0,4, ja k(IV)/k(V)) on enintään 0,008, ja edullisempaa, että (k (I)/k (V) on enintään 0,04, k(II)/k(V) on enintään 0,015, » c ‘ : k(III)/k(V) on enintään 0,15 ja k(IV)/k(V)) on enintään 0,005.
» · » '·· Yllä määritellyn seriiniproteaasityypin polypeptidin molekyylini paino Mr on yleensä enintään 70 000 ja vähintään 15 000.
; Yhdellä sellaisella polypeptidillä on aminohapposekvenssi SEK
ID NO:2 tai se on sille analoginen ja/tai homologinen. Muilla : tärkeillä keksinnön mukaisen polypeptidin suoritusmuodoilla on aminohapposekvenssi, joka on SEK ID NO:2:n osasekvenssi tai » sellaisen osasekvenssin analogi ja/tai homologi.
Termin "DNA-sekvenssin -- koodaaman polypeptidin analogi" tai , ,·, "polypeptidin, jolla on aminohapposekvenssi --, analogi" ) · » ,·)·. tarkoitetaan mitä tahansa polypeptidiä, jolla on kyky toimia > · naudan hyytymistekijä Xa:n tavoin edellä mainituissa testeissä. Mukaan kuuluu siis myös muista lähteistä, kuten eri 113272 37 nisäkkäistä tai selkärankaisista, peräisin olevia polypeptide-jä, jotka poikkeavat esim. tietyssä määrin aminohappokoostumuksensa tai translaation jälkeisten modifikaatioidensa, esim. glykosylaation tai fosforylaation, suhteen esimerkeissä kuvatusta keinotekoisesta seriiniproteaasista.
Termiä "analogi" käytetään siis tässä yhteydessä proteiinista tai polypeptidistä, jolla on samanlainen aminohappokoostumus tai sekvenssi kuin karakterisoiva aminohapposekvenssi SEK ID NO:2, joka on johdettu keinotekoisesta esimerkissä 5 kuvatusta seriiniproteaasista, missä sallitaan pienet aminohapposekvenssiä muuttavat variaatiot, esim. deleetiot, kohdennetut mutaatiot, ylimääräisten aminohappojen insertiot tai näiden yhdistelmät keinotekoisten seriiniproteaasianalogien luomiseksi.
Siksi tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa (polypepti-din) analogi tarkoittaa polypeptidin muunnosta, jossa yksi tai muutamia aminohappoja voi olla poistettu tai vaihdettu, ja/tai aminohappoja on voitu lisätä, sillä edellytyksellä, että yllä määritellysti spesifinen entsyymiaktiivisuus säilyy, mikä voidaan määrittää edellä kuvatulla tavalla.
« ' : Homologian suhteen, keksinnön mukaisen polypeptidin analogin » 1 sekvenssihomologia polypeptiditasolla saa olla vähintään : ’· 60%:nen identtisyys verrattuna SEK ID N0:2:n fragmentin I sekvenssiin, siten että enintään 50 aminohappotähteen deleeti- ot ja/tai insertiot sallitaan.
*
Sellaiset polypeptidisekvenssit tai niiden analogit, jotka V. ovat vähintään 60%:sesti homologisia jonkin SEK ID NO:2:ssa t esitetyn sekvenssin fragmentin kanssa, jota koodaa keksinnön > mukainen DNA-sekvenssi SEK ID NO:l tai sen analogi ja/tai t '"· homologi, muodostavat tärkeän tämän keksinnön suoritusmuodon.
' I 1 i | > . ,·, Termillä "sekvenssihomologia" tarkoitetaan joko aminohappojen I 1 ,*>, identtisyyttä kahden tai useamman aminohapon jaksoina amino- I i happosekvenssissä tai nukleotidien identtisyyttä kahden tai useamman nukleotidin jaksoina nukleotidisekvenssissä. Polypep- 113272 38 tideistä käytettyinä termeillä tarkoitetaan siis homologiaa niiden kyseisten aminohappojen välillä, joiden välinen homologia on tarkoitus osoittaa, polypeptidien aminohappojen yhtenevyydessä identiteetin ja aseman suhteen.
Termiä "homologinen" käytetään siis tässä kuvaamaan samanlaisuuden astetta tietyn polypeptidin aminohapposekvenssin ja SEK ID N0:2:ssa esitetyn aminohapposekvenssin välillä. SEK ID N0:2:ssa esitetyn aminohapposekvenssin kanssa verrattava aminohapposekvenssi voi olla johdettu deduktiolla nukleotidisekvenssistä, kuten DNA- tai RNA-sekvenssistä, joka saadaan esim. hybridisoimalla jäljempänä määriteltävällä tavalla, tai voidaan saada perinteisillä aminohappojen sekvensointimenetelmillä.
Toinen suoritusmuoto koskee polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssistä 20 peräkkäisen aminohapon ketju on ainakin 40%:sesti homologinen samanpituisen aminohappoketjun kanssa, joka on valittu SEK ID N0:2:ssa esitetystä sekvenssistä.
Yhdellä seriiniproteaasipolypeptidillä on SEK ID NO:2:n tähteiden 82-484 aminohapposekvenssi, tai se on tämän jakson ‘ analogi tai homologi. Toisella keksinnön mukaisella seriini- proteaasipolypeptidillä on SEK ID N0:2:n aminohapposekvenssi, ; '-· tähteet 166-484, tai se on tämän analogi ja/tai homologi.
: Monet tässä esitettyjen sekvenssien muunnokset ovat erityisen
kiinnostavia: katkaisemista suuntaavien sekvenssien SEK ID
NO:38 tai 40-42 insertointi SEK ID NO:2:n tähteiden 230-233 :v, tilalle, yhdistettynä kysteiinitähteen 245 korvaamiseen edullisesti tähteellä Gly, Ser tai Arg SEK ID NO:2:ssa. Toinen kiinnostava mahdollisuus on SEK ID NO:38:n tai 40- 42 :n : insertointi tähteiden 179-182 tilalle SEK ID NO:2:ssa. Aivan yleisesti, missä tahansa yllä määritellyistä keinotekoisista , seriiniproteaaseista SEK ID NO:2:n tähteitä 230-233 vastaavan katkaisusekvenssin korvaaminen yhdellä yllä määritellyistä katkaisua suuntaavista kohdista tuottaa äärimmäisen käyttökelpoisia katkaisuentsyymejä keksinnön mukaisessa menetel 113272 39 mässä käytettäviksi, sikäli että ne voidaan valikoivasti ja hyvin tehokkaasti katkaista entsyymeillä, joilla on naudan hyytymistekijän Xa spesifinen entsyymiaktiivisuus, ja näin ollen siis edellä määritellyn mukaisilla seriiniproteaaseilla, mukaan luettuna niille itselleen identtiset molekyylit. Jälkimmäinen seikka tarkoittaa, että sellaisella spesifisten katkaisua suuntaavien sekvenssien insertoinnilla muokatut keinotekoiset seriiniproteaasit ovat äärimmäisen tehokkaasti aktivoitavissa, koska ensimmäiset katkaistut ja aktivoidut molekyylit pystyvät katkaisemaan muita molekyylejä ja aloittavat siten ketjureaktion.
Kuten edellä mainittiin, on erittäin tärkeä piirre, että keinotekoiset seriiniproteaasit voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Sellaiset tekniikat käyttävät nukleiini-happofragmenttia, joka pystyy koodaamaan edellä määritellyn mukaista polypeptidiä, erityisesti DNA-fragmenttia, joka pystyy koodaamaan yllä määritellyn mukaista keinotekoista seriiniproteaasipolypeptidiä.
Yhdeltä kannaltaan keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, joka koodaa keksinnön mukaista yllä määriteltyä polypeptidiä.
t · ·· : Erityisesti keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, jossa on
nukleotidisekvenssi, joka on esitetty DNA-sekvenssissä SEK ID ; ’** N0:1, tai sen analogia, jonka homologisuus minkä tahansa SEK
ID NO:1:ssä esitetyistä DNA-sekvensseistä kanssa on ainakin 60%, ja/tai joka koodaa polypeptidiä, jonka aminohapposekvens-si on ainakin 60%:sesti homologinen SEK ID NO:2:ssa esitettyjen aminohapposekvenssien kanssa.
Yleisesti, verrattaessa nukleotidisekvenssejä niiden välisen homologian määrittämiseksi otetaan huomioon vain koodaavat • alueet.
> > I * , ,·, Termiä "analogi" käytetään keksinnön mukaisten DNA-fragment- * · tien yhteydessä tarkoittaen nukleotidisekvenssiä, joka koodaa » · polypeptidiä, joka on sama tai olennaisesti sama kuin keksinnön mukaisen DNA-fragmentin koodaama polypeptidi. On hyvin 113272 40 tunnettua, että erilaiset kodonit voivat koodata samaa aminohappoa, ja kodoninkäyttö liittyy muun muassa kyseisten nukleo-tidisekvenssiä ilmentävien eliöiden preferensseihin. Siispä yksi tai useampia keksinnön mukaisen DNA-fragmentin nukleotideja tai kodoneja voidaan vaihtaa toisiin, jotka ilmennettyinä tuottavat samanlaisen tai olennaisesti samanlaisen poly-peptidin kuin kyseisen DNA-fragmentin koodaama polypeptidi.
Lisäksi termin "analogi" tarkoitetaan sallivan sekvenssissä muunnelmia, kuten substituutio, insertio (mukaan lukien intronit), additio ja yhden tai useamman nukleotidin uudelleen järjestäminen, joilla muunnelmilla ei olennaisesti ole vaikutusta DNA-fragmentin koodaamaan polypeptidiin, esimerkiksi muunnettu nukleotidisekvenssi, joka eroaa SEK ID NO: l:ssä esitetystä DNA-sekvenssistä sikäli, että vähintään yksi nukleotidi on substituoitu, lisätty, insertoitu, deletoitu ja/tai siirretty.
Termin "substituutio" ajatellaan tarkoittavan yhden tai useampien nukleotidien korvaamista kokonaisessa nukleotidisek-venssissä yhdellä tai useammalla eri nukleotidilla, "addition" ymmärretään tarkoittavan yhden tai useamman nukleotidin » · :·' I lisäämistä kokonaisen nukleotidisekvenssin jompaan kumpaan *...· päähän, "insertion" ajatellaan tarkoittavan yhden tai useamman ’ · : nukleotidin siirtämistä kokonaisen nukleotidisekvenssin > * * j ’ : sisään, "deleetion" ajatellaan tarkoittavan, että yksi tai : useampia nukleotidejä on poistettu kokonaisesta nukleotidisek- .w » venssistä, joko sekvenssin jommasta kummasta päästä tai mistä tahansa sopivasta kohdasta sen sisällä, ja "uudelleenjärjestä-misen" ajatellaan tarkoittavan, että kaksi tai useampia nuk-leotidejä on vaihdettu keskenään DNA- tai polypeptidisekvens- * · sin sisällä, vastaavasti. DNA-fragmenttia voidaan kuitenkin myös muuntaa mutageneesillä joko ennen tai jälkeen sen siir-*:*'ϊ tämistä eliöön. Keksinnön mukaista DNA- tai proteiinisekvens- , |*t siä voidaan muuntaa siten, ettei se menetä mitään biofysikaa- lisistä, biokemiallisista eikä biologisista ominaisuuksistaan,
» I
“ tai osan sellaisista ominaisuuksista (yhdestä ja/tai kaikista) tai kaikkia sellaiset ominaisuudet (yhden ja/tai kaikki).
4i 113272
Esimerkki erityisestä analogista on DNA-sekvenssi; johon sisältyy SEK ID NO:l:ssä esitetty, erityisesti E. colissa ilmennettäväksi muokattu DNA-sekvenssi. Tämä DNA-sekvenssi on sellainen, joka E. coliin yhdessä sopivien säätelysekvenssien kanssa insertoituna ilmentää polypeptidiä, jolla on olennaisesti SEK ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi. Tämä DNA-sekvenssi sisältää siis erityisiä E. colin tunnistamia kodonej a.
Termien "fragmentti", "sekvenssi", "homologi" and "analogi", käytettyinä tässä kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa keksinnön mukaisista fragmenteista, sekvensseistä, homologeista ja analogeista ei tietenkään pidä ymmärtää käsittävän näitä ilmiöitä luonnollisessa ympäristössään vaan sen sijaan esim. eristettyinä, puhdistettuina, in vitro- tai (rekombinantti-eli) yhdistelmämuodossa.
Yksi sellainen nukleiinihappofragmentti on yllä määritellyn mukainen nukleiinihappo, jossa ainakin 60% koodikolmikoista koodaa samoja aminohappoja kuin nukleiinihappofragmentti naudan hyytymistekijä X:ää koodaavasta nukleiinihaposta, siten • · ·· I että (yhteensä) enintään 150 nukleotidin insertiot ja/tai deleetiot sallitaan. Esimerkki sellaisesta nukleiinihappo- • ·. fragmentista on SEK ID NO:l, nukleotidit 76-1527, ja tämän : ‘ : analogit ja/tai homologit. Toinen esimerkki on SEK ID NO: 1, : nukleotidit 319-1527 ja tämän analogit ja/tai homologit. Vielä i yksi esimerkki on SEK ID NO:l, nukleotidit 571-1527 ja tämän analogit ja/tai homologit.
! Yllä kuvattu DNA-fragmentti voidaan saada suoraan genomisesta DNA:sta tai eristämällä mRNA ja konvertoimalla se vastaavaksi DNA-sekvenssiksi käänteiskopiointientsyymiä käyttäen ja tuot-tamalla siten cDNA. Kun DNA-fragmentti hankitaan genomisesta )·, DNA:sta, se saadaan suoraan seulomalla genomisia sekvenssejä, kuten alan ammattilaiset hyvin tietävät. Se voidaan tehdä * · hybridisoimalla tässä kuvatun sekvenssien tuntemuksen tai puhdistetun seriiniproteaasin aminohapposekvensoinnilla saadun 113272 42 sekvenssitiedon perusteella laaditun DNA-koettimen kanssa. Kun DNA on cDNA-peräistä (complementary DNA), se voidaan saada valmistamalla cDNA-kirjasto keinotekoista seriiniproteaasia sisältävien solujen mRNA:sta. Hybridisointi voidaan suorittaa DNA-koettimellä, joka on laadittu cDNA:n sekvenssin tuntemisen tai puhdistetun keinotekoisen seriiniproteaasin aminohappo-sekvensoinnilla saadun sekvenssi-informaation perusteella.
DNA-fragmentti tai sen analogi ja/tai homologi voidaan kopioida liittämällä se vektoriin ja siirtämällä yhdistelmä sopivaan mikro-organismiin tai nisäkässolukantaan. Vaihtoehtoisesti, DNA-fragmentti voidaan valmistaa syntetoimalla kemiallisesti. Voidaan myös syntetoida polymeraasiketjureaktion (PCR) alukkeita SEK ID NO:l:ssä esitettyn nukleotidisekvenssin perusteella. Näiden alukkeiden avulla voidaan sitten monistaa koko keinotekoista seriiniproteaasi-polypeptidiä koodaava sekvenssi tai osa siitä.
Sopivia keksinnössä käytettäviä polypeptidejä voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. Erityisesti polypeptidit voidaan valmistaa menetelmällä, jossa viljellään tai kasvatetaan eliötä, joka kantaa SEK ID NO:l:ssä esitettyä DNA-sek- * · ' · venssiä tai sen keksinnön mukaista analogia tai homologia, olosuhteissa, joista seuraa mainitun DNA-fragmentin ilmenty-: ’·· minen, ja sen jälkeen kerätään ilmennetty polypeptidi maini- : tusta eliöstä.
» » : Eliö, jota polypeptidin tuottamiseen käytetään, voi olla kehittynyt eliö, esim. eläin, tai vähemmän kehittynyt eliö, :\·. esim. mikro-organismi. Riippumatta käytettävän eliön tyypistä, keksinnön mukainen DNA-fragmentti (kuvattu edellä) pitäisi siirtää eliöön joko suoraan tai sopivan vektorin avulla.
Vaihtoehtoisesti, polypeptidit voidaan tuottaa nisäkässolukan- ;“ί noissa siirtämällä niihin keksinnön mukainen DNA-fragmentti , .·. tai sen analogi ja/tai homologi joko suoraan tai ilmentämis- ,···. vektorin avulla.
• » 113272 43 DNA-fragmentti voidaan myös kloonata sopivassa vakaassa il-mentämisvektorissa ja siirtää sitten sopivaan solukantaan. Haluttuja polypeptidejä ilmentävät solut valikoidaan sitten vektorille ja käytettävälle solukannalle sopivien olosuhteiden avulla. Valikoituja soluja kasvatetaan sitten edelleen, ja ne muodostavat hyvin tärkeän ja jatkuvan haluttujen polypeptidien lähteen.
Siten tässä kuvataan myös ilmentämisjärjestelmä, joka käsittää edellä määritellyn mukaisen, keinotekoista edellä määritellyn mukaista seriiniproteaasipolypeptidiä koodaavan nukleiini-happofragmentin. Järjestelmä käsittää 5'-reunustavan sekvenssin, jolla on kyky auttaa mainitun nukleiinihappofragmentin ilmentymistä. Ilmentämisjärjestelmä voi olla kyseisen nukleiinihappof ragmentin sisältävä replikoituva ilmentämis-vektori, jolla on kyky replikoitua isäntäorganismissa tai solukannassa. Vektori voi olla esim. plasmidi, faagi, kosmidi, pienoiskromosomi tai virus. Vektori voi olla sellainen, joka isäntäsoluun siirrettynä integroituu isäntäsolun genomiin.
Lisäksi kuvataan eliö, joka kantaa ja kykenee replikoimaan yllä määritellyn mukaista nukleiinihappofragmenttia. Eliö voi * · ·' · olla mikro - organi smi, kuten bakteeri, hiiva, alkueläin tai ·,,,· solu, joka on peräisin monisoluisesta eliöstä, kuten sienestä, j ’· hyönteissolu, kasvisolu, nisäkässolu tai solukanta. Erityisen i i · I ’ : kiinnostavia isäntäeliöitä ovat mikro-organismit, kuten ; sukujen Escherichia, Bacillus ja Salmonella bakteerit.
I i · · * * · * · ·
Yllä määritelty keinotekoinen seriiniproteaasipolypeptidi voidaan tuottaa menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: 1. edellä määritellyn mukaisen nukleeniinihapon siirtämi- Γ nen ilmentämisvektoriin, 2. edellä määritellyn mukaisen isäntäeliön transformoimi- , nen vaiheessa a tuotetulla vektorilla, t i » • · 3. vaiheessa b tuotetun isäntäorganismin viljeleminen polypeptidin ilmentämiseksi, « 113272 4. polypeptidin kerääminen, 5. valinnaisesti polypeptidin translaation jälkeinen modifikaation suorittaminen 6. jos tarpeen, keksinnön mukaisen denaturointi/renaturoin-ti-kierrätysmenetelmän kohdistaminen polypeptidiin ja 7. valinnaisesti polypeptidin lisämodifioinnin suoritta minen yllä määritellyn mukaisen autenttisen polypeptidin saamiseksi.
Polypeptidien lisämodifioinnit voidaan suorittaa esimerkiksi altistamalla polypeptidimolekyylit karboksipeptidaasille A tai B, millä voidaan irroittaa valikoituja aminohappotähteitä polypeptidimolekyylien C-päästä. Tämä on toivottavaa olosuhteissa, joissa autenttisten polypeptidimolekyylien optimaalinen laskostuminen saavutetaan vain, kun N-pää on vapaa ja katkaisemista suuntaava polypeptidi (kuten SEK ID NO:37) on siis sijoittunut autenttisen polypeptidin C-päähän. Kuten tunnettua, karboksipeptidaasi B katkaisee peräkkäisesti t · : C-päästä, ja irroittaa vain emäksisiä aminohappoja, kun taas ,· karboksipeptidaasi A irroittaa aminohappoja, jotka eivät ole • · emäksisiä. Suunnittelemalla huolellisesti, mikä aminohappo tähde liitetään autenttisen polypeptidin C-päähän, on mahdol-: h lista varmistaa, että karboksipeptidaasit irroittavat kaiken . muun paitsi autenttista polypeptidiä. Jos autenttisen polypep tidin C-pää on emäksinen aminohappotähde, tulisi varmistaa, ; että C-päähän liittyvä tähde, joka aiotaan poistaa, ei ole ' emäksinen, ja vice versa. Jos aminohappotähteiden sekvenssi I · ;* C-päästä autenttisen polypeptidin C-päähän on tiedossa, on ' mahdollista vuorotella käsittelyjä kahdella karboksypeptidaa- ·!’·: silla, kunnes jäljellä on vain paljas autenttinen polypeptidi.
Käytännöllinen suoritusmuoto olisi immobilisoitujen karboksi- » < · peptidaasien käyttäminen.
> · • » * 113272 45
Tuotettu polypeptidi voidaan eristää menetelmällä, joka käsittää yhden tai useampia vaiheita, kuten affiniteettikroma-tokrafia, jossa käytetään mainitun polypeptidin kanssa reaktiivista immobilisoitua polypeptidiä tai vasta-aineita ja/tai muu kromatografinen tai elektroforeettinen menettely.
Ymmärretään myös, että keksinnössä käytettävä polypeptidi voidaan valmistaa hyvin tunnetuilla neste- tai kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmillä, joissa aminohappoja liitetään polypeptidisekvenssiin peräkkäin aminohappo kerrallaan. Vaihtoehtoisesti polypeptidi voidaan syntetoida liittämällä yhteen yksittäisiä aminohappoja siten, että muodostuu poly-peptidisekvenssin fragmentteja, jotka sitten liitetään yhteen niin, että muodostuu haluttu polypeptidi. Nämä menetelmät muodostavat siis vielä yhden kiinnostavan keksinnön piirteen.
Keksintö koskee myös edellä määritellyn mukaisen keinotekoisen seriiniproteaasipolypeptidin käyttöä polypeptidien katkaisemiseen naudan hyytymistekijän Xa katkaisukohdasta, jonka aminohapposekvenssi on valittu ryhmästä SEK ID NO:38, SEK ID NO:40, SEK ID NO:41 ja SEK ID NO:42 ja edellä määritellyn mukaisen keinotekoisen seriiniproteaasipolypeptidin käyttöä polypep-: · tidien katkaisemiseen naudan hyytymistekijän Xa katkaisu- t · ' kohdasta, kun katkaisukohdassa on modifioitu muunnos ryhmästä : · SEK ID NO: 4 3, SEK ID NO:44, SEK ID NO:45 ja SEK ID NO:46 J .* valitusta aminohapposekvenssistä joka on konvertoitu : katkaistavaan muotoon kuten jäljempänä kuvataan.
Kuvio 1: Kaavakuva osasta syklistä denaturointi / renaturointi -aikataulua.
Liuotinkoostumus on ilmaistu kahden puskurin seoksena, ei- denaturoivan 'puskurin A' ja denaturoivan 'puskurin B', puskurin B suhteellisena osuutena. On esitetty kolme peräk- '•“I käistä kierrosta, joista kukin koostuu renaturointivaiheesta . 'F' ja denaturointivaiheesta 'D' . Muutokset liuotinseoksen • · !! denaturointikyvyn voimakkuudessa perättäisten kierrosten » · denaturointivaiheiden aikana on merkitty 'k':11a.
113272 46
Kuvio. 2: Ilmentämisplasmidien pT7HgFX-hS2m ja pT7HgFX-mS2m rakentaminen.
Monistetut DNA-fragmentit, joihin sisältyi ihmis- ja hiiri-&2-mikroglobuliinien lukukehykset tähteestä Ile^ tähteeseen Metgg liitettyinä 5'-päästään nukleotidisekvensseihin, jotka koodaavat FXa:n katkaisukohtaa (SEK ID NO:37), katkaistiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja ligatoitiin DNA-ligaasilla T4 DNA (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI :11a ja Hind 111:11a katkaistuun pT7Hg:teen standardimenettelyjä käyttäen.
Kuvio 3: Ihmisen ja hiiren S2-mikroglobuliinin DNA-sekvenssit. A: Ihmisen &2-mikroglobuliinia koodaavan täyspitkän lukukehyksen ennustettu aminohapposekvenssi (SEK ID NO:49). Prosessoidun kypsän proteiinin aminohappotähde yksi (Ile) on osoitettu. B: Hiiren &2-mikroglobuliinia koodaavan täyspitkän lukukehyksen ennustettu aminohapposekvenssi (SEK ID NO:50). Prosessoidun kypsän proteiinin aminohappotähde yksi (Ile) on osoitettu.
Kuvio 4: Ilmentämisplasmidin pT7HgFX-hGH rakentaminen. Monistettu DNA fragmentti, joka sisältää ihmisen kasvuhormonin lukukehyksen aminohappotähteestä Phe^ aminohappotähteeseen * ·
: : Phe]_9]_ liitettynä 5'-päästään FXa:n katkaisukohtaa IEGR (SEK
.· ID NO:38) koodaavaan nukleotidisekvenssiin, katkaistiin ; ·. restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu : Boehringerilta, Saksa) ja ligatoitiin DNA-ligaasilla T4 • *; (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind III :11a . katkaistuun pT7Hg:een standardimenettelyjä käyttäen.
Fig. 5:' Ihmisen kasvuhormonin (somatotropiinin) aminohappo-! sekvenssi.
1' Ihmisen kasvuhormonia koodaavan täyspitkän lukukehyksen ’”! ennustettu aminohapposekvenssi (SEK ID N0:51). Prosessoidun kypsän proteiinin ensimmäinen aminohappotähde (Phe^) on \ osoitettu.
Kuvio 6: Plasmidien pT7HgFX-#l, #2, ja #3, jotka ilmentävät
ihmisen a2-makroglobuliinireseptoriproteiinin (a2MR) (SEK ID
113272 47 NO:52) aminohappotähteitä nro 20 (Ala)-109 (Arg), aminohappotähteitä nro 20 (Ala)-190 (Ala) ja aminohappotähteitä nro 20 (Ala)-521 (Lys), rakentaminen.
Monistetut DNA-fragmentit, peräisin o^MRm lukukehyksestä #1: aminohappotähde nro 20 (Ala)-109 (Arg), #2: aminohappotähde nro 20 (Ala)-190 (Ala) ja #3: aminohappotähde nro 20 (Ala)-521 (Lys), jotka olivat 51-päästään liitettyinä FXa:n katkaisu-kohtaa IEGR (SEK ID NO:38) koodaavaan nukleotidisekvenssiin katkaistiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja ligatoitiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam Hiillä ja Hind 111:11a katkaistuun pTyHgieen standardimenettelyjä käyttäen.
Kuvio 7: Plasmidien pLcIIMLCHgFX-#4, -#5, ja -#6, jotka ilmentävät aminohappotähteitä nro 803 (Gly)-1265 (Asp), aminohappotähteitä nro 849 (Vai)-1184 (Gin) ja aminohappotähteitä nro 1184 (Gin)-1582 (Lys) ihmisen o^-makroglobuliini- reseptoriproteiinista (o^MR) (SEK ID NO:52), rakentaminen. Monistetut DNA-fragmentit, peräisin c^MRin lukukehyksestä, alkaen fragmentista #4: aminohappotähteet nro 803 (Gly)-1265 (Asp), #5: aminohappotähteet nro 849 (Vai)-1184 (Gin) ja #6: aminohappotähteet nro 1184 (Gin)-1582 (Lys), liitettyinä ' 5'-päistään nukleotidisekvenssiin, joka koodaa FXa-katkaisu- * ,* kohtaa IEGR (SEK ID NO:38), katkaistiin restriktioendonukleaa- : ·· seilla Bam HI tai Bcl ja Hind III (ostettu Boehringerilta,
Saksa) ja kytkettiin (ligate) T4-DNA-ligaasilla (ostettu : Boehringerilta, Saksa) Bam Hiillä ja Hind 111:11a leikattuun pLcIIMLCHgFX: ään standardimenetelmillä.
·,·, Kuvio 8: Plasmidien pLcIIMLCHgFX-#7, #8, ja #9, jotka ilmentä- vät aminohappotähteitä nro 803 (Gly)-1582 (Lys), aminohappo-tähteitä nro 2519 (Ala)-2941 (Ile) ja amonohappotähteitä nro 3331 (Vai)-3778 (Ile) ihmisen 012- makroglobuliinireseptori-F’.· proteiinista (c^MR) (SEK ID NO:52), rakentaminen.
, .·, Monistetut DNA-fragment it, jotka ovat peräisin o^MRin luku- • * · kehyksestä, alkaen jaksosta #7: aminohappotähteet nro 803 (Gly)-1582 (Lys), #8: aminohappotähteet nro 2519 (Ala)-2941 (Ile) ja #9: aminohappotähteet nro 3331 (Vai)-3778 (Ile), 113272 48 jotka olivat liitettyinä 5'-päistään nukleotidisekvenssiin, joka koodaa FXa:n katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38), leikattiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja kytkettiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind III :11a leikattuun pLcIIMLCHgFX:ään käyttäen standardimenettelyjä.
Kuviot 9a ja 9b: Ihmisen <22-makroglobuliinireseptoriproteiinin (o^MR) aminohapposekvenssi (SEK ID NO:52).
Täyspitkän of2MR:ää koodaavan lukukehyksen ennustettu aminohapposekvenssi . Yhdistelmäproteiineissa N- tai C-pään tähteinä läsnä olevat aminohapot on merkitty numeroillaan o^MR-sekvenssin yläpuolelle.
Kuvio 10: Ilmentämisplasmidin pLcIIMLCHgFX-FXAV· rakentaminen. Monistettu DNA-fragmentti, joka sisältää naudan hyytymistekijä X:n lukukehyksen aminohappotähteet Serg2-Trp4g4, (FXA'T ) liitettyinä 5'-päistään nukleotidisekvenssiin, joka koodaa FXa:n katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38), leikattiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja kytkettiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind III :11a leikattuun ! pLcIIMLCHgFX:ään standardimenettelyjä käyttäen.
Kuvio 11: Naudan veren hyytymistekijän X (FX) aminohapposek-venssi.
*; Naudan FX:ää (SEK ID NO:53) koodaavan lukukehyksen ennustettu *. sekvenssi. N-pään aminohappotähde Serg2 ja C-pään Trp4Q4 tähde FXAlf - rakenteessa on merkitty.
! Kuvio 12: Ilmentämisplasmidin pLcIIMLCHgFX-ΚΙ rakentaminen.
Monistettu DNA-fragmentti, joka sisältää ihmisen plasminogee- * ·”: nin rinkilän (kringle) 1 (Kl) lukukehyksen aminohappotähteestä
Ser82 tähteeseen Gluig2 (numerointi, kuten "Glu"-plasminogee-[·' nissä) , liitettyinä 5'-päästään nukleotidisekvenssiin, joka >,! koodaa FXa:n katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38), leikattiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boeh- 113272 49 ringerilta, Saksa) ja kytkettiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind III :11a leikattuun pLcIIMLCHgFX:ään standardimenettelyjä käyttäen.
Kuvio 13: Ilmentämisplasmidin pLcIIHgFX-K4 rakentaminen. Monistettu DNA-fragmentti, joka sisältää ihmisen plasminogeeni-rinkelin 4 (K4) aminohappotähteet Val354 - Ala439 (numerointi kuten "Glu"-plasminogeenissä), joka oli 5'-päästään liitettynä FXa:n katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38) koodaavaan nukleoti-disekvenssiin, leikattiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja kytkettiin T4 DNA-ligaasilla (ostettu Boehringerilta, Saksa) entsyymillä Bam HI ja Hind III katkaistuun pLcIIHgFX:ään standardimenetelmillä.
Kuvio 14: Ihmisen "Glu"-plaminogeenin (SEK ID NO:54) amino happosekvenssi. Kl- ja K4-konstruktien N- ja C-pään aminohappotähde on merkitty sekvenssiin numerollaan.
Kuvio 15: SDS-PAGE-analyysi ihmisen yhdistelmä-S2-mikroglobu-liinin tuotannosta ja in vitro -laskostumisesta.
Raita 1: Raaka proteiiniuute ennen viemistä Ni2+NTA-agaroosi-: : pylvääseen (pelkistynyt näyte) .
: ,,· Raita 2: Pylvään läpi virrannut näyte, kun raaka proteiiniuute : vietiin Ni2+NTA-agaroosipyvääseen (pelkistynyt näyte)
Raita 3: Ihmisen &2-mikroglobuliini, joka eluoitui Ni2+NTA- •agaroosipylväästä ei-denaturoivalla eluutiopuskurilla syklisen laskostusmenettelyn jälkeen (pelkistynyt näyte) .
Raita 4: Proteiinimarkkerit (Pharmacia, Ruotsi): Geelin
yläpäästä: 94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20,1 kD ja 14,4 kD
(pelkistynyt näyte)
Raita 5: Kuten raita 3 (pelkistymätön näyte)
Raita 6: Ihmisen yhdistelmä-62-mikroglobuliini FXa:lla katkai-’:·*· sun ja lopullisen puhdistamisen jälkeen (pelkistymätön näyte) ;;;* Kuvio 16: SDS-PAGE-analyysi ihmisen yhdistelmäkasvuhormonin in ’···’ vitro -laskostumisesta: hGH (somatotropiini) .
113272 50
Raita 1: Proteiinimarkkerit (Pharmacia, Ruotsi): Geelin
yläpäästä: 94 kD, 67 kD, 43 kD, 3 0 kD, 2 0,1 kD ja 14,4 kD
(pelkistynyt näyte)
Raita 2: Ihmisen hGH, eluoitu Ni2+NTA-agaroosipylväästä syklisen laskostamismenettelyn jälkeen ei-denaturoivalla eluointipuskurilla.
Raita 3: Ihmisen hGH, eluoitu Ni2+NTA-agaroosipylväästä syklisen laskostamismenettelyn jälkeen laskostamismenettelyn denaturoivalla eluointipuskurilla B (pelkistymätön näyte). Raidat 4-18: Fraktioita, jotka on kerätty syklisen laskosta mismenettelyn jälkeen erotettaessa monomeerista hGH-fuusio-proteiinia dimeeri- ja multimeerifuusioproteiineista ioninvaih-tokromatografiällä Q-Sepharosella (Pharmacia, Ruotsi). Monomee-rinen proteiini eluoitui piikkinä, joka erottui selvästi dimeeri- ja multimeeriproteiinit sisältävästä piikistä (pel-kistymättömät näytteet).
Kuvio 17: SDS-PAGE analyysi ihmisen plasminogeenin yhdistelmä-rinkelidomeenien 1 ja 4 ja ihmisen ot2~ makroglobuliiniresepto-riproteiinista (o^MR) johdetun fuusioproteiinin #4 laskostumisesta in vitro.
Raita 1: Proteiinimarkkerit (Pharmacia, Ruotsi): Geelin * ·
; ; : yläpäästä: 94 kD, 67 kD, 43 kD, 3 0 kD, 2 0,1 kD, ja 14,4 kD
(pelkistetty näyte) .
f Raita 2: Raaka Kl-fuusioproteeiniuute ennen Ni2+NTA-agaroosi- : ·’: pylvääseen viemistä (pelkistetty näyte) .
• Raita 3: Kl-fuusioproteiini, eluoitu Ni2+NTA-agaroosipylväästä « ♦ » » syklisen laskostamismenettelyn jälkeen ei-denaturoivalla eluointipuskurilla (pelkistetty näyte.)
Raita 4:· Kuten raita 3 (pelkistämätön näyte) .
» »
Raita 5: Lysiini-agaroosipylvään läpi virrannut näyte, kun ·;*’ pylvääseen vietiin Kl-fuusioproteiinia (pelkistymätön näyte) .
* G’': Raita 6: Kl-fuusioproteiini, eluoitu lysiini-agaroosipylvään ;“! läpi (pelkistämätön näyte) .
Raita 7: K4-fuusioproteiini, eluoitu Ni2+NTA-agaroosipylväästä • * · (!! syklisen laskostamismenettelyn jälkeen ei-denaturoivalla ’··' eluointipuskurilla (pelkistetty näyte) .
Raita 8: Kuten raita 7 (pelkistymätön näyte).
113272 51
Raita 9: £X2MR#4-fuusioproteiini, eluoitu Ni^+NTA-agaroosipyl-väästä syklisen laskostusmenettelyn jälkeen ei- denaturoivalla eluutiopuskurilla (pelkistetty näyte).
Raita 10: Kuten raita 9 (pelkistymätön näyte).
Kuvio 18: Ilmentämisplasmidin pT7HgFX-a2MRBDv rakentaminen. Monistettu DNA-fragmentti, joka sisältää ihmisen «2-makroglo-buliinin lukukehyksen aminohapot Val4299-Alaasi, 5'-päästään liitettynä FXa-katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38) koodaavaan nukleotidisekvenssiin, leikattiin restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringerilta, Saksa) ja liga-toitiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind III :11a leikattuun pT7Hg:een standardi-menettelyjä käyttäen.
Kuvio 19: Ihmisen a^-makroglobuliinin reseptoriin sitoutuvan domeenin aminohapposekvenssi (tähteestä Val;L299 tähteeseen 1451) (SEK ID NO:55) .
Kuvio 20: Ilmentämisplasmidin PT7H5FX-TETN rakentaminen. Monistettu DNA-fragmentti, joka sisältää ihmisen kypsän, monomeerisen tetranektiinin aminohapposekvenssin lukukehyksen .1 Glu]_-Val]_s]_ liitettynä 5 '-päästään nukleotidisekvenssiin, joka ,· koodaa FXa:n katkaiusukohtaa IEGR (SEK ID NO:38), leikattiin I ·· restriktioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu ; : Boehringerilta, Saksa) ja ligatoitiin DNA-ligaasilla T4 : (ostettu Boehringerilta, Saksa) Bam Hiillä ja Hind III :11a leikattuun pT7Hg:een standardimenettelyjä käyttäen.
·# Kuvio 21: Ihmisen monomeerisen tetranektiinin aminohapposek- venssi.
Ihmisen täyspitkän tetranektiiniä (SEK ID NO: 56) koodaavan lu-kukehyksen ennustettu aminohapposekvenssi. Prosessoidun kypsän ·;·1: proteiinin ensimmäinen aminohapposekvenssi (Glu^) on merkitty.
t I · il; Kuvio 22: Ilmentämisplasmidin pT7HgFX-DB32 rakentaminen.
Monistettu DNA fragmentti, joka sisältää keinotekoisen diabodyn DB32 lukukehyksen aminohappotähteestä Gln^ tähteeseen 52 1 13 2 7 2
Asri246 liitettynä 5'-päästään FXa-katkaisukohtaa IEGR (SEK ID NO:38) koodaavaan nukleotidisekvenssiin, leikattiin restrik-tioendonukleaaseilla Bam HI ja Hind III (ostettu Boehringeril-ta, Saksa) ja ligatoitiin DNA-ligaasilla T4 (ostettu Boehrin-gerilta, Saksa) Bam HI:llä ja Hind 111:11a leikattuun pI^Hg : een standardimenettelyjä käyttäen.
Kuvio 23: Keinotekoisen diabodyn DB32 aminohapposekvenssi (SEK ID NO:57).
Kuvio 24: Ilmentämisplasmidi pT7HgFX-PS.4.
Ihmisen psoriasiinia aminohaposta Ser2 aminohappoon Gln^Q^ ilmentävän pT7HgFX-PS.4:n rakentaminen on kuvattu aikaisemmin (Hoffmann, 1994).
Kuvio 25: Ihmisen psoriasiinin aminohapposekvenssi.
Ihmisen psoriasiinia (SEK ID NO:58) koodaavasta täyspitkästä lukukehyksestä ennustettu aminohapposekvenssi.
Kuvio 26: SDS-PAGE-analyysi fuusiodiabodyn Mab 32 puhdistamisesta ja FXa:lla katkaisemisesta, a: Puhdistamisen eri vaiheita 1 · ' .* Raidat 1 ja 2: Raakatuotetta laskostamisesta.
Raita 3: Lopullinen, puhdistettu diabody Mab 32 -fuusioproteii- « · • ’·. nituote : * : Raita 4: Supernatantti raa'asta laskostumistuotteesta 50- * kertaisen tiivistämisen ja sentrifugoinnin jälkeen.
·*:. Raita 5: Pelletti raa'asta laskostumistuotteesta 50-kertaisen 1 » · tiivistämisen ja sentrifugoinnin jälkeen.
I-,·' b: Mab 32 diabody -fuusioproteiinin FXa-katkaisu.
♦ »
Raidat 1 ja 5: Lopullinen, puhdistettu Mab 32 diabody -fuusio-proteiini.
t
Raita 2: Moolisuhde 1:5 FXa:Mab 32 -diabodyfuusioproteiini h": 37°C:SSa 20 tuntia
Raita 3: Moolisuhde 1:2 FXa:Mab 32 -diabodyfuusioproteiini » t · !!! 37°C:ssa 20 tuntia ’** Raita 4: Moolisuhde 1:1 FXa:Mab 32 -diabodyfuusioproteiini 37°C:ssa 20 tuntia 53 113272
Kuvio 27: Glutationin sopivuus pelkistäjäksi ihmisen β>2~ mikroglobuliinifuusioproteiinin syklisessä laskostamisessa. Raita 1: Pelkistetty näyte kokeesta nro 1.
Raita 2: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 1.
Raita 3: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 2.
Raita 4: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 3.
Raita 5: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 4.
Raita 6: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 5.
Raita 7: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 6.
Raita 8: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 7.
Raita 9: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 8.
Raita 10: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 9.
Raita 11: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 10.
Raita 12: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 11.
Kuvio 28: L-kysteiinietyyliesterin sopivuus pelkistäjäksi ihmisen &2-mikroglobuliinifuusioproteiinin syklisessä laskostamisessa .
Raita 1: Pelkistetty näyte kokeesta nro 1.
Raita 2: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 1.
Raita 3: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 2.
' · Raita 4: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 3.
v Raita 5: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 4.
Raita 6: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 5.
’ : Raita 7: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 6.
Raita 8: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 7.
• * ·
Raita 9: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 8.
Raita 10: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 9.
4 f · 4 ·
Kuvio 29: 2-merkaptoetanolin sopivuus pelkistäj äksi ihmisen *; &2-mikroglobuliinifuusioproteiinin syklisessä laskostamisessa.
Raita 1: Pelkistetty näyte kokeesta nro 1.
Raita 2: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 1.
, ’·, Raita 3: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 2.
Raita 4: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 3.
Raita 5: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 4.
Raita 6: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 5.
113272 54
Raita 7: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 6.
Raita 8: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 7.
Raita 9: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 8.
Raita 10: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 9.
Kuvio 30: Merkaptosukkinaatin sopivuus pelkistäjäksi ihmisen S2-mikroglobuliinifuusioproteiinin syklisessä laskostamisessa. Raita 1: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 1.
Raita 2: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 2.
Raita 3: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 3.
Raita 4: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 4.
Raita 5: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 5.
Raita 6: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 6.
Raita 7: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 7.
Raita 8: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 8.
Raita 9: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 9.
Kuvio 31: N-asetyyli-L-kysteiinin sopivuus pelkistäjäksi ihmisen &2-mikroglobuliinifuusioproteiinin syklisessä laskostamisessa .
Raita 1: Pelkistetty näyte kokeesta nro 1.
Raita 2: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 1. i : Raita 3: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 2.
: ,·’ Raita 4: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 3.
j .. Raita 5: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 4.
*: Raita 6: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 5.
Raita 7: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 6.
, Raita 8: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 7.
* * ·
Raita 9: Pelkistymätön näyte kokeesta nro 8.
. . Raita 10 : Pelkistymätön näyte kokeesta nro 9.
» * * ;·* Kuvio 32: SDS-PAGE-analyysi ihmisen S2~mikroglobuliinifuusio- proteiinin syklisestä laskostamisesta.
:··· Raita 1: Raaka proteiiniuute ennen viemistä Ni2+NTA-agaroosi- pylvääseen (pelkistetty näyte).
;;; Raita 2: 8 μ1:η näyte uudelleenlaskostetun Ih^rtun liukoisesta ·*’ fraktiosta, kuten kuvattu esimerkissä 1.
113272 55
Raita 3: 4 μ1:η näyte uudelleenlaskostetun liukoisesta fraktiosta, kuten kuvattu esimerkissä 1.
Raita 4: 2 μ1:η näyte uudelleenlaskostetun hd^min liukoisesta fraktiosta, kuten kuvattu esimerkissä 1.
Raita 5: 8 μ1:η näyte uudelleenlaskostetun hS2m:n liukenemattomasta fraktiosta, kuten kuvattu esimerkissä 1.
Raidat 6 ja 7: Id^m, valmis tuote ioninvaihtokromatografiällä puhdistettuna.
Raidat 8 ja 9: Uudelleenlaskostettu Id^m esimerkissä 13 kuvatun mukaisen optimoidun uudelleenlaskostusmenettelyn jälkeen.
Kuvio 33: SDS-PAGE-analyysi ihmisen 1¾-mikroglobuliinifuusio-proteiinin uudelleenlaskostamisesta puskurin vaihegradientilla ja lineaarigradientilla.
Raita 1: Näyte uudelleenlaskotetun td^rrun liukoisesta frak tiosta, laskostettu vaiheittaisella puskurimenettelyllä, kuten on kuvattu esimerkissä 13.
Raidat 2 ja 3: Näyte uudelleenlaskostetun td^nun liukenemattomasta fraktiosta, laskostettu vaiheittaisella puskurimenettelyllä, kuten on kuvattu esimerkissä 13.
Raita 4: Proteiinien molekyylipainomarkkereita (Pharmacia,
i Ruotsi) : Geelin yläpäästä: 94 kD, 67 kD, 43 kD, 30 kD, 20,1 kD
ja 14,4 kD (pelkistetty näyte) .
: Raita 5: Näyte uudelleenlaskostetun td^m-.n liukoisesta frak- tiosta, laskostettu lineaarigradienttimenettelyllä, kuten on j kuvattu esimerkissä 13.
. Raidat 6 ja 7: Näyte uudelleenlaskostetun hS2m:n liukoisesta fraktiosta, laskostettu lineaarigradienttimenettelyllä, kuten ... on kuvattu esimerkissä 13.
;* Kuvio 34: Esimerkeissä kuvattujen fuusioproteiinien mallien V’: pääpiirteinen kaavio.
•j··: Fuusioproteiinin N-päähän voidaan valinnaisesti insertoida tehostajasegmentti ("booster segment"), joka runsastaa fuusio- t · proteiinin ilmentymistä fuusioproteiinia koodaavaa DNA:ta il- » · ·*·’ mentävässä solussa. "6H" tämän C-puolella merkitsee kuutta his- 113272 56 tidinyylitähdettä, jotka muodostavat ioneja kelatoivan kohdan, jota käytetään "affiniteettikahvana" fuusioproteiinien puhdistamisen ja uudelleenlaskostamisen aikana. "FX" 6:n histidinyy-lin C-puolella on FXa:n katkaisukohta. Lopuksi, fuusioproteii-nin sanalla "proteiini" merkitty osa esittää proteiinia, joka on määrä uudelleenlaskostaa keksinnön mukaisella menetelmällä.
Esimerkkejä Tässä osassa annetut esimerkit 1-11, joita käytetään havainnollistamaan "syklistä laskostusmenettelyä", kuvaavat kukin E. colissa tuotetun katkaistavan (cleavable) yhdistelmähybridi-proteiinin (fuusioproteiinin), joka on puhdistettu raakapro-teiiniuutteesta, laskostamista ilman lisäpuhdistamista, yhdellä yleismenettelyllä.
Nukleotidisekvenssi, joka koodaa yhdistelmäproteiinia, jota aiotaan tuottaa, on 5'-päästään liitetty nukleotidisekvenssiin, joka koodaa FXa:n katkaisukohtaa (FX), joka on vuorostaan N-päästään liitetty kuusi histidinyylitähdettä sisältävään segmenttiin (SEK ID NO:47). FXa:n katkaisukohta saadaan yleensä liittettyä sellaissa polymeraasiketjureaktiossa, jossa 5'-pään aluke käsittää tätä sekvenssiä koodaavat nukleotidit. '· : Kuuden histidinyylitähteen liittäminen suoritetaan yleensä :käyttämällä vektoria, joka käsittää SEK ID N0:47:ää koodaavan • ’·. nukleotidifragmentin. Kuusi histidinyylitähdettä muodostavat : metalli-ioneja kelatoivan kohdan, jota käytetään affiniteetti- : *; kahvana fuusioproteiinin puhdistuksen aikana ja sen jälkeen . .syklisen laskostamisprosessin aikana kontaktikohtana kiinteään matriisiin. Joskus affiniteettikahvan N-puolelle insertoidaan : v< tehostajasegmenttejä ('booster segments') (esim. ΛοΙΙ- ,! proteiinin N-päästä otettu jakso, ja joissakin tapauksissa sen perässä myosiinin kevyestä ketjusta otettu jakso) fuusiopro-"· teiinin ilmentymisen tehostamiseksi E. colissa.
- > I · •
Kaikki fuusioproteiinit on laadittu saman yleiskaavion mukaan !'.! (katso kuvio 34) . Tehostajajaksojen, af f initeettikahvojen ja “* FXa:n katkaisukohdan läsnäolo saattaa monimutkaistaa halutun yhdistelmäproteiinin laskostumista. Lisäksi, syklinen laskos- 113272 57 tusprosessi aloitetaan välittömästi fuusioproteiinin affini-teettipuhdistuksen jälkeen. Tämä tarkoittaa, että fuusiopro-teiinimateriaali, jonka E. coli -isäntä on osittain hajottanut, jää pylvään affiniteettimatriisiin täyspitkän fuusioproteiinin lisäksi. On hyvin mahdollista, että tämä hajotettu fuusioproteiini häiritsee vakavasti täyspitkän fuusioproteiinin laskostumista ja vähentää siten prosessin ilmenevää tehokkuutta. Esimerkeissä 1-11 esitettyjä laskostumistehok-kuustuloksia ei siksi voi suoraan verrata puhdistetun fuusio-proteiinin uudelleenlaskostamisprosessin tehokkuuteen.
Esimerkit 1-11 kuvaavat uudelleenlaskostamisprosessia 21:lie eri proteiinille, proteiinidomeenille tai domeeniryhmälle, 82 aminohapon kokoisesta (Kl, esimerkki 6) 780 aminohapon kokoi seen (u2MR#7, esimerkki 4) , ja disulfidisidosten lukumäärä proteiineissa vaihtelee nollasta (c^MRAP, esimerkki 3) 33:een (a2MR#4, esimerkki 4) ja 36:een (a2MR#7, esimerkki 4).
Proteiinien uudelleenlaskostumisen tehokkuus vaihtelee 15:stä 95%:iin, ja aktiivisen proteiinin saanto on suuruusluokkaa 10-100 mg laskostettaessa 40 ml:n Ni+NTA-agaroosipylväässä (NTA tarkoittaa substituoitua nitrilotriasetaattia).
Seuraavat taulukot 1-5 esittävät esimerkeissä käytettyjen ; '·· gradienttien muotoja. "Aika" on annettu minuuteissa ja "vir- 1 : taus" ml/min.
* · t · t · ‘ » · I I I < I » · ► » · « t · tl» I · • · » · · 113272 58 TAULUKKO 1
Vaihe Aika Virtaus^ %g Vaihe Aika Virtaus %8 1 0 2 100 0 SI 900 2 100 0 2 45 2 100 0 62 945 2 100 0 3 4S 2 o 100 63 946 2 60 40 4 52 2 O 100 64 952 2 60 40
5 60 2 100 O 65 960 2 100 O
S 105 2 100 "O 65 1005 2 100 O
2 106 2 4 95 67 1006 2 62 38 3 Π3 2 - 4 96 63 101 2 2 62 38
9 120 2 100 O 69 1020 2 100 O
10 165 2 100 O 70 1065 2 100 O
11 156 2 . . 3 92 71 1066 2 64 36 12 172 2 3 92 72 1072 2 64 35
13 180 2 100 O 73 1080 2 100 O
14 225 2 100 O 74 112S 2 100 O
15 226 2 1 2 88 75 1126 2 66 34 15 232 2 1 2 88 75 1132 2 56 34
17 240 2 100 O 77 1140 2 100 O
13 28S - 2 100 O 73 118S 2 100 O
19 286 2 1 6 84 79 1 186 2 63 32 20 292 216 84 80 1192 2 63 32
21 300 2 100 O 81 1200 2 100 O
22 345 2 100 O 32 1245 2 100 O
23 346 2 20 80 83 1246 2 70 30 24 352 2 20 80 84 12S2 2 70 30
25 360 2 100 O 3S 1260 2 100 O
25 405 2 100 O 86 1305 2 100 O
27 406 2 24 76 87 1306 2 72 28 23 412 2 24 76 38 1312 2 72 28
23 420 2 100 O 39 1319 2 100 O
• 30 465 2 100 O 90 1364 2 100 O
; 31 466 2 23 72 91 1365 2 74 26 32 472 2 28 72 92 1371 2 74 25
33 480 2 100 O 93 1378 2 100 O
34 525 2 100 O 94 1423 2 100 O
; 35 526 2 32 63 95 1424 2 76 24 36 532 2 32 68 95 1430 2 76 24
37 540 2 100 O 97 1437 2 100 O
38 585 2 100 O 98 1482 2 100 O
.'· 39 586 2 35 64 99 1483 2 78 22 40 592 2 36 64 100 1489 2 73 22
41 600 2 100 O 101 1496 2 100 O
42 645 2 100 O 102 1541 2 100 O
’· 43 646 2 40 60 103 1542 2 80 20 • 44 652 2 40 60 104 1548 2 80 20
45 660 2 100 O 105 1555 2 100 O
46 705 2 100 O 106 1556 2 82 18 47 706 2 44 56 107 1562 2 82 18
>' v 48 713 2 44 56 108 1569 2 100 O
49 720 2 100 O 109 1614 2 100 O
l /· SO 765 2 100 O 110 161 5 2 84 16 T 51 766 2 48 52 111 1621 2. 84 16
52 772 2 48 52 112 1628 2 100 O
S3 780 2 100 O 113 1673 2 100 O
, 54 825 2 100 O 11 4 1674 2 88 12 ’···* 55 826 2 52 48 1 15 1732 2 88 12
55 832 2 52 48 11 6 1733 2 100 O
57 840 2 100 O 1171778 2 100 O
58 885 2 100 O
59 886 2 55 44 60 892 2 56 44 TAULUKKO 2 59 113272
Vaihe Aika Virtaus %A %3 Vaihe Aika Virtaus %A %B
' 0 2 100 0 49 720 2 100 0 2 45 2 100 0 SO 7SS 2 100 0 3 46 2 0 TOO 51 7SS 2 74 25 4 52 2 0 100 52 772 2 74 25 5 SO 2 100 0 53 780 2 100 0 S 105 2 100 Q 54 825 2 100 0 ? 106 2 8 92 55 825 2 75 24 3 Π3 2 8 92 55 832 2 75 24 9 120 2 100 0 57 840 2 100 0 10 165 2 100 0 58 885 2 100 0 Π 155 2 20 80 59 886 2 78 22 12 172 2 20 80 SO 892 2 73 22 ! 13 180 2 100 0 SI 900 2 100 0 14 225 2 100 0 S2 945 2 100 0 1 5 225 2 23 72 S3 945 2 80 20 13 232 2 23 72 54 952 2 80 20 17 240 2 100 Q 55 960 2 100 0
I 13 235 2 100 0 55 1005 2 100 O
19 235 2 34 SS 67 1006 2 82 18 20 292 2 34 65 58 1012 2 82 18
21 300 2 100 O 59 1020 2 100 O
22 345 2 100 O 70 1065 2 100 O
23 345 2 42 58 71 1065 2 84 15 24 352 2 42 53 72 1072 2 84 1 5
25 350 2 100 O 73 1080 2 100 O
25 405 2 100 O 74 1125 2 100 O
27 406 2 SO 50 75 1125 2 86 14 28 412 2 50 SO 76 1132 2 85 14
29 420 2 100 O 77 1140 2 100 O
30 465 2 100 O 78 1185 2 100 O
* 31 466 2 54 46 79 1186 2 88 12 32 472 2 54 46 80 1192 2 88 12
33 480 2 100 O 81 1200 2 100 O
34 525 2 100 O 82 1245 2 100 O
: 35 526 2 58 42 33 1246 2 90 10 36 532 2 58 42 84 1252 2 90 10
37 540 2 100 O 85 1260 2 100 O
. 38 585 2 100 O 85 1305 2 100 O
39 536 2 62 33 87 1306 2 95 S
40 592 2 62 38 88 1312 2 95 S
; 41 600 2 100 O 89 1319 2 100 O
42 645 2 100 O 90 1364 2 100 O
43 646 2 66 34 44 652 2 65 34
45 660 2 100 O
‘ ; 46 70S 2 100 o : 47 706 2 70 30 48 713 2 70 30 k » > ! f 60 113272 TAULUKKO 3
Vaihe Aika Virtaus %a %8 Vaihe Aika Virtaus 1 0.0 1,0 0,0 100.0 25.0 420.5 1.0 60.0 40.0 2 10.0 1.0 0,0 100.0 26.0 430.0 1.0 60,0 40.0 3 40.0 1.0 100,0' 0.0 27,0 460.0 1.0 100.0 0.0 4 70.0 1,0 100,0 0.0 28,0 490,0 1.0 100.0 0.0 5 70,5 1.0.- 10,0 90,0 29.0 490,5 1,0 70.0 30.0 5 80,0 1,0 10.0 90.0 30.0 500.0 1.0 70.0 30.0 7 110,0 1,0 100.0 0.0 31.0 530.0 1.0 100.0 0.0 3 140,0 1,0 100,0 0,0 32.0 560.0, 1.0 100.0 0.0 9 140.5 1,0 20.0 80.0 33.0 560.5 1,0 80.0 20.0 10 1S0.0 1,0 20.0 30,0 34,0 570,0 1,0 80.0 20.0 11 180,0 1,0 100.0 0,0 35.0 600.0 1.0 100.0 0.0 12 210,0 1,0 100.0 0.0 36.0 630.0 1,0 100.0 0.0 13 210.5 1,0 30.0 70,0 37,0 630,5 1,0 85.0 15,0 14 220,0 1,0 30.0 70.0 38.0 640.0 1,0 85.0 15.0 15 250.0 1.0 100.0 0,0 39.0 670.0 1,0 100,0 0.0 16 280,0 1,0 100.0 0.0 40.0 700.0 1,0 100.0 0.0 17 280,5 1.0 40,0 60.0 41,0 700,5 1,0 88.0 12.0 j 13 290,0 1.0 40.0 60,0 42.0 710.0 1,0 88.0 12.0 19 320.0 1,0 100.0 0,0 43,0 740.0 1,0 100.0 0.0 20 350,0 1,0 100,0 0.0 44.0 770.0 1,0 100.0 0,0 21 350.5 1,0 50.0 50,0 45,0 770.5 1,0 90.0 10,0 22 360.0 1,0 50,0 50,0 46.0 780,0 1.0 90,0 10.0 23 390.0 1,0 100.0 0,0 47,0 810,0 1,0 100,0 0,0 24 420,0 1,0 100.0 0,0 48.0 850.0 1.0 100.0 0,0 TAULUKKO 4 61 1 13272
Vaihe Aika Virtaus %a %3 Vaihe Aika Virtaus %a %b
1 0 2 ICO 0 AB 720 2 100 O
2 45 2 100 O SO 755 2 100 O
3 45 2 O 100 SI 755 2 48 S2 4 52 2 O TOO S2 772 2 48 52
5 60 2 100 O S3 730 2 100 O
S 105 2 100 O 54 82S 2 100 O
7 106 2 4 95 SS 825 2 52 48 8 113 2 4 95 SS 832 2 52 48
9 120 2. 100 O 57 840 2 100 O
10 155 ‘2 100 O S3 885 2 100 O
Π 155 2 8 92 59 886 2 55 44 12 172 2 3 92 60 892 2 55 44
13 180 2 100 O 51 900 2 100 O
14 225 2 100 O 62 945 2 100 O
1 5 226 2 1 2 83 63 946 2 60 40 1 6 232 2 1 2 88 64 952 2 60 40
17 240 2 100 O SS 950 2 100 O
18 285 2 100 O 65 1005 2 ICO O
19 286 2 1 5 84 67 1006 2 64 36 20 292 2 1 6 84 63 1012 2 64 36
21 300 2 100 O 69 1020 2 100 O
22 345 2 100 O 70 1065 2 100 O
23 346 2 20 80 ' 71 1066 2 S3 32 24 352 2 20 80 72 1072 2 63 32
25 350 2 100 O 73 1080 2 100 O
26 405 2 100 O 74 1125 2 100 O
27 406 2 24 75 75 1125 2 70 30 28 412 2 24 75 75 1132 2 70 30
29 420 2 100 O 77 1140 2 100 O
30 465 2 100 O 73 1 185 2 100 O
31 465 2 23 72 79 1 186 2 72 28 32 472 2 23 72 30 1 192 2 72 23
33 480 2 100 O 81 1200 2 100 O
IV. 34 525 2 100 O 32 1245 2 100 O
: 35 526 2 32 68 33 1246 2 7S 25 ; .·. 36 532 2 32 68 84 1252 2 7S 25
: 37 540 2 100 O 85 1250 2 100 O
38 585 2 100 O 86 1305 2 100 O
·.’ ’ 39 586 2 35 64 87 1306 2 80 20 40 592 2 36 64 88 1312 2 80 20
41 600 2 100 O 89 1319 2 100 O
: ,·. 42 645 2 100 O 90 1364 2 100 O
: 43 646 2 40 60 91 1355 2 85 is 44 652 2 40 60 92 1371 2 85 15
‘ 45 660 2 100 O 93 1378 2 100 O
46 705 2 100 O 941423 2 100 O
47 706 2 *4 56 48 713 2 44 S6 : « 113272 TAULUKKO 5
Vaihe Aika Virtaus %A %Z Vaihe Aika Virtaus ISA %3
1 O 2 100 O ·*9 720 2 100 O
2 45 2 100 O 50 755 2 100 O
3 45 2 O 100 SI 755 2 52 43 4 52 2 · · O 100 52 772 2 52 43
5 60 2 100" O S3 730 2 100 O
S 105 . 2 100 O 54 825 2 100 O
7 105 2 1 3 87 55 325 2 54 46 8 113 2 13 87 55 832 2 54 45
9 120 2 100 O 57 840 2 100 O
10 155 2 . 100 O 53 885' 2 100 O
Π 165 2 25 75 59 886 2 55 44 12 172 2 25 75 60 892 2 55 44
13 180 2 100 O 51 900 2 100 O
14 225 2 100 O 52 945 2 ICO O
15 225 2 29 71 S3 946 2 53 42 1 5 232 2 29 71 54 952 2 S3 42
17 240 2 100 O S3 960 2 100 O
18 285 2 100 O 55 1005 2 100 O
19 286 2 34 65 57 1006 2 60 40 20 292 2 34 65 S3 1012 2 60 40
21 300 2 100 O 69 1020 2 100 O
22 345 2 100 O 70 1065 2 100 O
23 346 2 38 62 71 1065 2 62 38 24 352 2 33 62 72 1072 2 62 38
25 350 2 100 O 73 1080 2 100 O
26 405 2 100 O 74 1125 2 100 O
27 406 2 40 60 7S 1126 2 65 34 28 412 2 40 60 75 1132 2 66 34
29 420 2 100 O 77 1140 2 100 O
30 465 2 100 O 73 1185 2 100 O
; 31 466 2 *2 58 79 1 186 2 70 30 32 472 2 42 S3 30 1 192 2 70 30
'· 33 480 2 100 O 81 1200 2 100 O
34 525 2 100 O 82 1245 2 100 O
35 526 2 44 56 83 1245 2 74 26 : ·’ 36 532 2 44 56 84 1252 2 74 26
• 37 540 2 100 O 8 S 1260 2 100 O
· 33 535 2 100 O 86 130S 2 100 O
39 586' 2 46 54 87 1306 2 78 22 V * 40 592 2 46 54 88 1312 2 78 22
41 600 2 100 O 89 1319 2 100 O
42 645 2 100 O 90 1364 2 100 O
43 646 2 48 52 91 1365 2 82 18 : 44 652 2 48 52 92 1371 2 82 18
j“.‘· 45 650 2 100 O 93 1378 2 100 O
·’ ’ 46 705 2 100 O 94 1423 2 100 O
47 706 2 50 50 : · 48 713 2 50 50 » * « 113272
Esimerkki 1
Ihmisen ja hiiren gz-mikroqlobuliinin tuotanto ja laskostaminen Tämä esimerkki kuvaa sekä ihmisen βa-mikroglobuliinin että hiiren Pa-mikroglobuliinin tuottamista E. coli: ssa FXa: 11a katkaistavina fuusioproteiineina ja ihmisen ja hiiren yhdis-telmä-32-mikroglobuliinin puhdistamista FXÄ:11a katkaisemisen j älkeen.
Plasmidiklooneja, jotka sisältävät ihmisen ja hiiren β2-mikroglobuliiniproteiineja koodaavat täyspitkät cDNA: t (joita tri. David N. Garboczi ystävällisesti luovutti tri. Soren Buusille) käytettiin mallineina polymeraasiketjureaktiossa (PCR) (Saiki et ai., 1988), joka laadittiin tuottamaan kypsää ihmisen (aminohappotähteitä Hei - Metes vastaava) ja kypsää hiiren (aminohappotähteitä Hei - Metss vastaava) Oz-mikroglo-buliiniproteiinia vastaavia cDNA-fragmentteja, alukkeiden SEK ID NO: 3 ja SEK ID NO: 4 (ihmisen β2-mikroglobuliinia varten) ja SEK ID NO: 5 ja SEK ID NO: 6 (hiiren β2-mikroglobuliinia varten) avulla. Monistetut koodaavat lukukehykset olivat ; 5' -päistään liitetyt PCR-reaktiolla nukleotidisekvensseihin, : jotka sisältyvät SEK ID NO: 3: een ja 5: een ja koodaavat . aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisu- kohdan naudan restriktioproteaasille FXa (Nagai ja Thogersen, : 1987). Monistetut DNA-fragmentit alakloonattiin E. colin ilmentämi s vektori in pTvHe (Christensen et ai., 1991). Saatujen plasmidien rakenne ρΤτΗβΡΧ-Ιιβζΐη (ilmentää ihmisen 32-mikroglo-. buliinia) ja pTvHeFX-mBzm (ilmentää hiiren βζ- mikroglobulii-
nia) on hahmoteltu pääpiirtein kuviossa 2, ja kuviossa 3 ·* * esitetään ilmennettävien proteiinien aminohapposekvenssit [SEK
: : ID NO: 49: ssä (ihmisen) ja SEK ID NO: 50: ssä (hiiren) esite- tään täyspitkien lukukehysten koodaamat aminohapposekvenssit].
t * *,,* Ihmisen ja hiiren 32-mikroglobuliinej a tuotettiin kasvattamal- ’*··’ la ja ilmentämällä plasmideja pTvHeFX-hBzm ja -m32m E. coli BL21-soluissa keskisuuressa mittakaavassa (2 xl litra) kuten ovat kuvanneet Studier ja Moffat, J. Mol. Biol. , 189: 113 130, 1986. Eksponentiaalisesti kasvavat viljelmät 37 ‘C:ssa 113272 64 infektoitiin, kun 0D6oo oli 0, 8, bakteriofagi /\CE6: 11a noin 5-kertaisesti. Viljelmiä kasvatettiin vielä kolme tuntia 37 *C:ssa, ennen kuin solut kerättiin sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoinnilla, ja kaikki soluproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8:aan Trisma-emäksellä). Proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2,5 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla. Pro-teiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guani-diinikloridia, 50 mM Tris-HCl:a, pH 8, ja 0,1 M ditioerytrio-lia. Kun proteiini oli geelisuodatettu Sephadex G-25:ssä (Pharmacia, LKB, Ruotsi) puskuriin 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 3 mM metioniini, raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2*-aktivoituihin NTA-agaroo-sipylväisiin, jotta fuusioproteiinit, MGSHHHHHHGSIEGR- ihmis -ja -hiiri -02-mikroglobuliini, (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) saatiin kumpikin erikseen puhdistettua (Hochuli et ai., 1988. ) ja sen jälkeen laskostettua syklisellä laskostamis-menettelyllä.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
: V Ni2-:11a aktivoitu NTA-agaroosimatriisi (Ni2~NTA-agaroosi) on j j | kaupallisesti saatavilla Diagen GmbH: sta, Saksa. Tätä työtä : ; : tehtäessä huomattiin kuitenkin, että tämä kaupallinen tuote ei toiminut niin hyvin kuin odotettiin. Havaitsimme, että kaupal-: .·. linen Ni2-NTA-agaroosimatriisi tukkeutui helposti, kun siihen _··,·, vietiin denaturoitu ja pelkistetty kokonaisproteiiniuute, että sen fuusioproteiinin vastaanottokyky oli pienempi kuin odotet-tu ja että matriisi voitiin regeneroida onnistuneesti vain •>t.: muutama kerta.
···, Ni2-NTA-agaroosin toiminnan parantamiseksi päätettiin suorit taa karbodi-imidillä N-(5-amino-l- karboksipentyyli)iminodi-etikkahapon metalliligandin [synteesireitin kuvanneet Döbeli & Hochuli (EPO 0253 303)] paritusreaktio jäykempään agaroosimat-riisiin (esim. Sepharose CL-6B, Pharmacia, Ruotsi): „ 113272 65 8 grammaa N-(5-amino-1-karboksipentyyli)iminodietikkahappoa 50 ml:n synteesiprosessista säädettiin pH 10: een lisäämällä 29 grammaa Na2CO3(10 H20):a ja lisättiin sekoituksessa olevaan aktivoidun Sepharose CL-6B: n 1 M NazCOa-suspensioon. Reaktion annettiin toimia yön yli.
Sepharose CL-6B (alussa 100 ml:n suspensio) aktivoitiin, kun vesi oli poistettu asetonilla, 7 g: 11a 1, 1' -karbonyyli-di-imidatsolia sekoituksessa 15 - 30 min. Heti aktivoinnin jälkeen Sepharose CL-6B huuhdottiin asetonilla ja sen jälkeen vedellä ja 1 M Na2C03: 11a. NTA-agaroosimatriisi pakattiin pylvääseen ja "varattiin" Ni2-:lla viemällä 5 pylvään tilavuutta 10%: sta NiSO-»-liuosta hitaasti pylvään läpi. Ni2*: n määrä tällä tavoin valmistetussa NTA- agaroosimatriisissa on määritetty 14 pmooliksi per ml matriisia. Ni2*NTA-agaroosimatriisi pakattiin tavalliseen nestekromatografian lasipylvääseen (sisähalkaisij a: 2,6 cm) tilavuuteen 40 ml. Varaamisen jälkeen
Ni2*NTA-agaroosipylväs huuhdottiin kahdella pylvään tilavuudella vettä, yhdellä pylvään tilavuudella 1 M Tris-HCl:a, pH ·; ’ 8, ja kahdella pylvään tilavuudella aloituspuskuria ennen raa' an proteiiniuutteen viemistä pylvääseen.
: ’.· Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2H-NTA- agaroosipylvää- j ' \ seen, fuusioproteiinit MGSHHHHHHGSIEGR-h3am ja lY: MGSHHHHHHGSIEGR-m32m (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) puhdistettiin kumpikin coli- ja ?i-faagi -proteiineista huuhte-: ·. lemalla yhdellä pylvään tilavuudella aloituspuskuria ja sitten , ·. 6 M guanidiumkloridi, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanoli % ! t ja 3 mM metioniinia, kunnes pylvään eluaattien optinen tiheys V.· (OD) 280 nm: ssa oli vakaa.
i”:
Fuusioproteiinit uudelleenlaskostettiin Ni2-NTA-agaroosipyl-,···. väässä käyttäen taulukossa 1 kuvattua gradientinhallintapro- fiilia (gradient manager profile) ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 1,2 mM/0,4 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutatio-nia puskurina A ja 8 M ureaa, 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 3 mM metioniinia ja 6 mM pelkistynyttä glutationia puskurina 66 11327? B. Pelkistyneen/hapettuneen glutationin liuos oli juuri valmistettu 200-kertaiseksi kantaliuokseksi lisäämällä 9, 9 M H2O2:a sekoituksessa olevaan 0, 2 M pelkistyneeseen glutatio-niin ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen laskostusprosessi oli valmis, hB2m- ja m02m- fuu-sioproteiinit eluoitiin Ni2*NTA-agaroosipylväistä puskurilla, joka sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl ja 20 mM EDTA pH 8.
Ni2*NTA-agaroosipylvääseen aggregoituneet ja sakkautuneet fuusioproteiinit eluoitiin puskurissa B. Noin 75% fuusiopro-teiinimateriaalista eluoitiin ei-denaturoivalla eluutiopus-kurilla (katso kuvio 16, raidat 2 ja 3).
Ei-pelkistävän SDS-PAGE-analyysin perusteella noin 70 % liukoisesta h02m-fuusioproteiinimateriaalista (vastaa 40 mg: aa h(32m-fuusioproteiinia) esiintyi monomeerisena (katso kuvio 15, raidat 5 ja 3), kun taas m02m-fuusioproteiinista 25 % esiintyi monomeerisena (vastaa 20 mg: aa mB2m-fuusioproteiinia). Laskos- tumismenettelyn kokonaistehokkuus on siis noin 50 % h(32m-fuu-sioproteiinilla ja alle 20 % m02m-fuusioproteiinilla.
' Monomeeriset h02m- ja mB2m-fuusioproteiinit puhdistettiin di- : ,* meereistä ja moniosaisemmista multimeereista ioninvaihtokroma- »t; · tografialla S-Sepharosessa (Pharmacia, Ruotsi): ei-denaturoi- t :: valla eluutiopuskurilla eluoituneet fuusioproteiinit (noin 70 % fuusioproteiinimateriaalista) geelisuodatettiin puskuriin, : joka sisälsi 5 mM NaCl ja 5 mM Tris-HCl pH 8 Sephadex G-25: ssä ,··. ja laimennettiin vedellä 1:1 ennen S-Sepharose-ioninvaihto- pylväisiin viemistä. Fuusioproteiinit eluoitiin 5:llä pylväs-.* tilavuudella lineaarigradienttia 2, 5 mM NaCl, 2, 5 mM Tris-HCl 1...* pH 8 - 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8. Monomeeriset h02m- sekä mB2m-fuusioproteiinit eluoituivat aivan gradientin alus-. ·. sa, kun taas dimeerit ja moniosaisemmat multimeerit eluoitui vat myöhemmin. Fraktiot, jotka sisälsivät monomeeriset fuusio-proteiinit, laimennettiin vedellä ja vietiin uudelleen S-Sep-harose-pylväisiin ja eluoitiin yhdellä puskurivaiheella 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.
67 113272
Monomeeriset fuusioproteiinit katkaistiin restriktioproteaa-silla FXa yön yli huoneenlämmössä paino/painosuhteessa noin 200: 1.
Katkaisemisen jälkeen yhdistelmä-hösm- ja m02m-proteiinit puhdistettiin N-pään fuusiohännistä, vapautettiin katkaistusta fuusioproteiinista ja FX»: sta ioninvaihtokromatografialla Q-Sepharose-pylväissä (Pharmacia, Ruotsi): Heti Sephadex
G-25:ssa liuokseen 5 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 8 geelifiltraa-tion ja veteen 1: 1 laimentamisen jälkeen yhdistelmä-h02in ja -m02in eluoitiin lineaarigradientilla (5 pylvästilavuutta) 2,5 mM NaCl, 2,5 mM Tris-HCl pH 8 - 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH
8. Fraktiot, jotka sisälsivät katkaistut yhdistelmäproteiinit, laimennettiin vedellä ja vietiin uudelleen Q-Sepharose-pyl väisiin ja eluoitiin yhdellä vaiheella puskurissa 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8. Yhdistelmä-hBam- ja m02m-proteiinit geelisuodatettiin juuri valmistettuun 20 mM NH4HCO3: iin ja lyofilisoitiin kahdesti.
* SDS-PAGE-analyysi ihmisen yhdistelmä-02-mikroglobuliinin tuottamisesta on esitetty kuviossa 15.
I I · i ,· Tällä menettelysarjalla tuotetun, täysin prosessoidun ihmis- I '· \ peräisen yhdistelmä-Ba-mikroglobuliinin saanto oli 30 mg.
! ; : Tällä menettelysarjalla tuotetun, täysin prosessoidun hiiri- ; .·. peräisen yhdistelmä-β2-mikroglobuliinin saanto oli 10 mg.
> » ·
Ihmisen yhdistelmä-82-mikroglobuliinin ja ihmisen puhdistetun luonnollisen 02-mikroglobuliinin välisen vertailun suoritti 1 ystävällisesti tri. Soren Buus kahdella eri tutkimusmenetel- mällä: 1. Havaittiin, että ihmisen yhdistelmä-02-mikroglobuliini ja luonnollinen ihmisen 02-mikroglobuliini reagoivat sekä mono-klonaalisen että monospesifisen vasta-aineen kanssa samalla affiniteetilla.
113272 68 2. Ihmisen yhdistelmä-0a-mikroglobuliinin ja luonnollisen ihmis-β2-mikroglobuliinin havaittiin sitoutumisen inhibointi-kokeessa, jossa käytettiin radioleimattuja ligandeja, sitoutuvan luonnollisiin affiniteettipuhdistettuihin raskas ketju -luokan I Kd molekyyleihin samalla affiniteetilla.
Hiiren yhdistelmä-βz-mikroglobuliinin havaittiin sitoutuvan luonnollisiin raskas ketju -luokan I molekyyleihin viidesosalla ihmisen Ba-mikroglobuliinin affiniteetista. Tämä tulos sopii hyvin aikaisempiin kirjallisuudessa esitettyihin luonnollisella materiaalilla saatuihin tuloksiin.
Esimerkki 2
Ihmisen kasvuhormonin (somatotropiinin) tuottaminen ja laskostaminen Tämä esimerkki kuvaa ihmisen kasvuhormonin (hGH) tuottamista E. colissa FXÄ: 11a katkaistavana fuusioproteiinina sekä yhdistelmä-hGH: n puhdistamista FX«: 11a katkaisemisen jälkeen.
Plasmidikloonia, joka sisälsi hGH: ta koodaavan cDNA: n [jonka tri Henrik Dalboge ystävällisesti luovutti (Dalboge et ai., 1987)] käytettiin mallineena polymeraasiketjureaktiossa (PCR)
: ,* (Saiki et ai., 1988) käyttäen alukkeita SEK ID NO: 7 ja SEK ID
j,· · NO: 8, jotka oli laadittu tuottamaan kypsää hGH-proteiinia i ; : vastaava DNA-fragmentti (joka vastaa aminohappotähteitä Phei
Pheigi). Monistettu koodaava lukukehys oli 5' -päästään lii-
; tetty PCR-reaktiossa nukleotidisekvenssiin, joka sisältyy SEK
< · ;·. ID NO: 7: ään ja koodaa aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisukohdan naudan restriktioproteaasille *·* FXa (Nagai ja Th0gersen, 1987). Monistettu DNA-fragmentti ...· alakloonattiin E. colin ilmentämisvektoriin pTvHe (Christensen et ai., 1991). Saadun plasmidin pT7H6FX-hGH (joka ilmentää '·. ihmisen kasvuhormonia) rakenne on kuvattu pääpiirtein kuviossa 4, ja kuviossa 5 esitetään ilmennettävän proteiinin aminohappo-sekvenssi (SEK ID NO: 51:ssä esitetään täyspitkän lukukehyksen koodaama aminohappos ekvenssi).
113272 69
Ihmisen yhdistelmäkasvuhormonia tuotettiin kasvattamalla ja ilmentämällä plasmidia pT-zHeFX-hGH E. coli BL21-soluissa keskisuuressa mitassa (2 x 1 litraa), kuten ovat kuvanneet Studier ja Moffat, J. Mol. Biol. , 189: 113-130, 1986. Eksponen
tiaalisesti kasvavat viljelmät 37*C:ssa, kun ODeoo oli 0,8, infektoitiin bakteriofagilla /\CE6 noin 5-kertaisesti. Viljelmiä kasvatettiin 37’C:ssa vielä kolme tuntia ennen solujen keräämistä sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoinnilla ja kokonaissoiuproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8:aan Trisma-emäksellä). Proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2,5 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla. Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 50 mM ditioerytriolia. Sephadex G-25: ssä (Pharmacia, LKB, Ruotsi) seokseen 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM
2- merkaptoetanolia ja 1 mM metioniinia geelisuodatettu raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2+-aktivoituun NTA-agaroosipylvää-seen (Ni2-NTA-agaroosi), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988) fuusioproteiini, MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) ja sen jälkeen sykliseen 1 as kost amis menettelyyn.
Ni2-*NTA-agaroosipylvään valmistaminen ja "varaaminen" on : kuvattu esimerkissä 1.
. - * : Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin kaasu tyhjiössä ennen pelkistäjän lisäämistä * ja/tai käyttöä.
; , : ·
Kun raakaproteiiniuute oli viety Ni2~NTA-agaroosipylvääseen, V.: fuusioproteiini, MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (missä MGSHHHHHHGSIEGR on *,,SEK ID NO: 48) puhdistettiin suurimmasta osasta coli- ja ; λ-faagiproteiineja huuhtelemalla yhdellä pylvään tilavuudella ,*··, aloituspuskuria ja sen jälkeen seoksella 6 M guanidiiniklori- • · di, 50 mM Tris-HCl, 5 mM 2-merkaptoetanoli ja 1 mM metioniini, kunnes eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssa oli vakaa.
113272 70
Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2-NTA-agaroosipyl-väässä käyttäen taulukossa 2 kuvattua gradientinhallintapro-fiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 1,0 mM/0, 1 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia puskurina Aja 8 M ureaa, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM metioniinia ja 5 mM pelkistynyttä glutationia puskurina B. Pelkistynyt/hapettu-nut glutationiliuos oli juuri valmistettu 200-kertaiseksi kantaliuokseksi lisäämällä 9, 9 M H2O2:a sekoituksessa olevaan 0,2 M pelkistyneeseen glutationiliuokseen ennen lisäämistä puskuriin A.
Syklisen laskostamismenettelyn suorittamisen jälkeen hGH-fuusioproteiini eluoitiin Ni2-NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8. Ni2~NTA-agaroosipylvääseen aggregoitunut ja sakkautunut fuusioproteiini eluoitiin puskurissa B.
Noin 80% fuusioproteiinimateriaalista eluoitui ei-denaturoi-valla eluointipuskurilla (katso kuvio 16, raidat 2 ja 3). Pelkistämättömän SDS-PAGE -analyysin perusteella 90 % liukoi sesta fuusioproteiinimateriaalista (vastaa noin 70 mg fuusio-proteiinia) esiintyi monomeerisena (katso kuvio 16, raita 2). Laskostusproseduurin kokonaistehokkuus oli noin 70 %.
» » » » · * Momomeerinen hGH-fuusioproteeini puhdistettiin dimeerisistä ja i/ - moniosaisemmista multimeereistä ioninvaihtokromatografialla
Q-Sepharosessa (Pharmacia, Ruotsi): Geelisuodatuksen 25 mM
NaCl ja 25 mM Tris-HCl pH 8 sisältävään puskuriin Sephadex G-25: ssä jälkeen ei- denaturoivalla puskurilla eluoitunut proteiinimateriaali vietiin Q-Sepharose-ioninvaihtopylvääseen. '«'·* Fuusioproteiini eluoitiin 5: n pylvään tilavuudella lineaarigra-
dienttia 25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 - 200 mM NaCl, 50 mM
»
Tris-HCl pH 8. Monomeerinen hGH-fuusioproteiini eluoitui gra- * · dientin alussa, kun taas dimeerit ja moniosaisemmat multi- » 1 * meerit eluoituivat myöhemmin. Fraktioihin, jotka sisälsivät puhdasta monomeeristä fuusioproteiinia, lisättiin NiSCU:ta ja iminodietikkahappoa (IDA, säädetty pH 8: aan NaOH: 11a) pitoisuuteen 1 mM ja katkaistiin restriktioproteaasilla FXÄ 5 113272 71 tuntia 37’ C: ssa paino/painosuhteessa noin 100: 1. Katkaisemisen jälkeen FXa. inhiboidaan lisäämällä bentsamidiinihydrokloridia pitoisuuteen 1 mM.
Katkaisun jälkeen hGH-yhdistelmäproteiini eristettiin katkaise-mattomasta fuusioproteiinista ja vapautetusta fuusiohännästä, heti Sephadex G-25: ssä puskuriin 8 mM ureaa, 50 mM Tris-HCl pH 8 geelisuodattamisen jälkeen, Ni^IDA: n ja bents amidiini n poistamiseksi antamalla kulkea pienen Ni2-NTA-agaroosipylvään ja sitä suoraan seuraavan pienen Nd3-NTA-agaroosipylvään ja sen jälkeen Ni2-:lla aktivoimattoman NTA-agaroosipylvään läpi, jotta sekä FX«. ja Ni2- ja Nd3- poistuvat varmasti täysin. Yhdistelmä-hGH puhdistettiin pienestä fraktiosta yhdistelmä-proteiinin hajoamistuotetta ioninvaihtokromatografialla Q-Se-pharosessa: hGH eluoitiin lineaarigradientilla (5:llä pylvään tilavuudella) 8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8 - 8 M urea, 250 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8. Katkaistua, puhdistettua yhdistelmä-proteiinia sisältävät fraktiot geelisuodatettiin juuri valmistettuun 20 mM NH4HCO3: een ja lyofilisoitiin kahdesti.
' SDS-PAGE-analyysi ihmisen yhdistelmä-kasvutekijän tuottamises- ’* ta j a laskostamisesta esitetään kuviossa 16.
: Tällä menettelysarjalla täysin prosessoidun ihmisperäisen I yhdistelmäkasvuhormonin saanto oli 10 mg.
1 : : Tällä menettelysarjalla tuotettu ihmisen yhdistelmäkasvuhormo- I ni kulki sekä pelkistävässä että ei- pelkistävässä SDS-PAGE- , analyysissä ja ei-denaturoivassa PAGE- analyysissä yhdessä • ihmisen biologisesti aktiivisen kasvuhormonin kanssa, jonka » · oli ystävällisesti luovuttanut Novo-Nordisk A/S.
» ·
Esimerkki 3
• —— II- I— I
.···, Ihmisen ctaMRAP: n tuottaminen ja laskostaminen I · *
Plasmidin, jota käytettiin ihmisen a2-makroglobuliinin reseptoriin liittyvän proteiinin (Receptor Associated Protein) (ciaMRAP) ilmentämiseen E. coli BL21-soluissa, pT7H6FX-a2MRAP, 113272 72
ja fuusioproteiinin tuotannossa käytetyt olosuhteet olemme kuvanneet aikaisemmin artikkelissa Nykjaer et ai. , J. Biol. Chem. 267: 14543-14546, 1992. Alukkeita SEK ID NO: 9 ja SEK ID
NO: 10 käytettiin PCR: ssä, jolla monistettiin C(2mRAP: tä koo- daava DNA.
Raaka proteiiniuute, joka oli sakkautettu proteiiniuuton fenolifaasista 2 litran soluviljelmistä MGSHHHHHHGSIEGR-(X2MRAP: tä (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) ilmentäviä E. coli BL21-soluja, liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 50 mM ditioerytrio-lia. Sephadex G-25: llä (Pharmacia, Ruotsi) puskuriin 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 1 mM metioniinia geelisuoda-tuksen jälkeen raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2--aktivoituun NTA-agaroosimatriisiin (Ni2-NTA-agaroosi), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai. , 1988) fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-daMRAP (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48), ja sen jälkeen sykliseen laskostamismenettelyyn.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista ; poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ’·* ' ja/tai käyttöä.
• V Ni2-NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu j * * esimerkissä 1.
! : :
Kun raakaproteiiniuute oli viety Ni2-NTA-agaroosipylvääseen,
I fuusioproteiini MGSHHHHHHGSI EGR-CI2MRAP (missä MGSHHHHHHGSI EGR
,··,·, on SEK ID NO: 48) puhdistettiin suurimmasta osasta colin ja λ-faagin proteiineja huuhtelemalla yhdellä pylvään tilavuudel- I » *
V.‘ la aloituspuskuria ja sen jälkeen 6 M guanidiinikloridi, 50 mM
1 i > i.,.' Tris-HCl ja 1 mM metioniinilla, kunnes eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssä oli vakaa.
I » ft ft
Fuusioproteiini laskostettiin Ni2~NTA-agaroosipylväässä käyttäen taulukossa 3 kuvattua gradientinhallintaprofiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCla ja 1 mM 2-mer- 113272 73 kaptoetanolia puskurina A ja 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 ja 1 mM 2-merkaptoetanolia puskurina B.
Syklisen laskostamismenettelysarjan jälkeen daMRAP-fuusiopro-teiini eluoitiin Ni2~NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8.
Havaittiin, että fuusioproteiinia aggregoitui tai sakkautui tuskin ollenkaan Ni^NTA-agaroosipylvääseen. Arvioitu 02MRAP-fuusioproteiinin saanto oli 60 mg ja laskostamismenettelysar-j an tehokkuus lähellä 95 %: a.
Fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-CCaMRAP (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) katkaistiin naudan restriktioproteaasilla FXa yön yli huoneenlämmössä paino/painosuhteessa 200: 1 eluoin-tipuskurissa. Geelisuodatettuna Sephadex G-25: ssä puskuriin 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8, proteiiniliuos vietiin Ni2~NTA-agaroosipylvään läpi poistaen siten katkaisematon fuusioproteiini ja katkaistuista fuusioproteiineista peräisin oleva vapautettu N-pään fuusiohäntä. Lopuksi proteiiniliuos laimennettiin 1:4 vedellä ja ctzMRAP proteiini puhdistettiin FX«: sta ioninvaihtokromatografialla Q-Sepharosessa (Pharmacia, i Ruotsi). Q-Sepharose-pylvästä eluoitiin 6: n pylvään tilavui- * ’ | · sella lineaarigradientilla 25 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 - : ί 250 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8. aaMRAP-proteiini eluoitui aivan lineaarigradientin alussa, kun taas FX» eluoitui myö- ; hemmin.
» 1 - · Tällä menettelysarjalla tuotetun ja uudelleenlaskostetun < · cizMRAP-proteiinin saanto oli 40 mg.
Ligandinsitomisominaisuudet (eli sitoutuminen a2-makroglobu-"·, liinireseptoriin ja vaikutus ihmisen urokinaasiplasminogeeni- aktivoija - plasminogeeniaktivoijan estäjä -tyypin I kompleksiin c(2-M-reseptoriin) on tri Nykjserin mukaan havaittu samoiksi kuin puhdistetun luonnollisen proteiinin ligandinsitomisominaisuudet.
113272 74
Esimerkki 4 aa-M-reseptorin domeenien ja domeeniryhmien tuottaminen ja laskostaminen
Ihmisen a2-makroglobuliinireseptori/LDL-reseptoriin liittyvä proteiini (Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein) (ciaMR) on 600 kD: n solunsisäinen membraanireseptori. aa-MR syntetoituu yksiketjuisena 4524: n aminohapon prekursoriproteii-nina. Prekursori prosessoituu membraanin läpäiseväksi 85 kD:n α-ketjuksi ja 500 kD α-ketjuksi, joka on sitoutunut epäkova-lenttisesti α-ketjun solunul koi seen domeeniin. aa-MR: n tiedetään sitovan Ca2*·. a rakenteesta riippuvalla tavalla (s. o. pelkistynyt proteiini ei sido Ca2~:a), ja aa-MR: n uskotaan olevan monitoimintoinen siinä mielessä, että se sitoo eri luokkiin kuuluvia ligandeja.
α-ketjun koko aminohapposekvenssi voidaan esittää ryhminä kolmen tyyppisiä toistojaksoja, joita esiintyy myös muissa kalvoon kiinnittyneissä proteiineissa ja useissa erilaisissa soluliman proteiineissa: A: Tämän tyyppisten toistojaksojen pituus on noin 40 aminohappotähdettä, ja niille luonteenomaista on toistojakson sisältä-! V mien kuuden kysteinyylitähteen esiintyminen peräkkäin. Jotkut : kirjoittajat ovat nimittäneet tätä toistuvaa jaksoa komplementit ti tyyppiseksi domeeniksi.
; ·. B: Tämän tyyppisten toistoj aksoj en pituus on myös noin 40 I * ! * ·;·, aminohappotähdettä, ja niille luonteenomaista on toistoj akson * » * sisältämien kuuden kysteinyylitähteen esiintyminen peräkkäin.
t · V,‘ Kirjallisuudessa tätä toistoa on nimitetty EGF-typpisiksi * * * domeeneiksi.
. I ·
* t * t I
..>t C: Tämän tyyppisten tois toj aksoj en pituus on myös noin 55 i > aminohappotähdettä, ja niille luonteenomaista on konsensus-sekvenssin SEK ID NO: 39 läsnäolo.
113272 75 Tämä esimerkki kuvaa useiden a2-MR-proteiinista FX«:11a katkaistavina fuusioproteiineina johdettujen domeenien ja domeeniklustereiden tuottamista E. colissa, sekä näiden yhdistelmäproteiinien puhdistamista, in vitro -laskostamista, FXa: 11a katkaisemista ja prosessointia.
Ihmisen a2-MR-proteiinia koodaavan täyspitkän cDNA: n sisältävää plasmidikloonia (jonka ystävällisesti luovutti Dr. Joachim Herz; Herz et ai., EMBO J. , 7: 4119-4127, 1988) käytettiin mallineena sarjassa polymeraasiketjureaktioita (PCR), jotka oli laadittu tuottamaan cDNA-fragmentteja, jotka vastaavat useita a2-MR-proteiinista johdettuja domeeneja ja domeeniklus-tereita edustavia polypeptidejä.
#1: Sisältää kaksi A-tyypin domeenia, jotka vastaavat a2-MR- proteiinin aminohappotähteitä 20 - 109. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 11 ja SEK ID NO: 12.
#2: Sisältää kaksi A-tyyppistä domeenia, joita seuraa kaksi B-tyyppistä domeenia ja vastaa a2-MR-proteiinin aminohappotähteitä 20 - 190. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 11 ja SEK ID NO: 13.
#3: Sama kuin #2, jota seuraa YWTD-toistoj a sisältävä alue.
; Vastaa aminohappotähteitä 20 - 521. PCR: ssä käytettiin aluk- : keitä SEK ID NO: 11 ja SEK ID NO: 14.
#4: Sisältää yhden B-tyyppisen domeenin, jotta seuraa 8 A- * tyypin domeenia ja lopuksi kaksi B-tyypin domeenia ja vastaa i · a2-MR-proteiinin aminohappotähteitä 803 - 1265. PCR: ssä ·..· käytettiin alukkeita SEK ID NO: 15 ja SEK ID NO: 16.
III * · f * » #5: Sisältää ainoastaan ne 8 A-tyypin domeenia, jotka ovat t · ,*··, läsnä #4: ssä ja vastaa a2-MR-proteiinin aminohappotähteitä 849 > »
- 1184. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 17 ja SEK ID
NO: 18.
#6: Sisältää #4:n kaksi C-terminaalista B-tyypin domeenia, 113272 76 joita seuraa 8 YWTD -toistoa ja yksi B-tyypin domeeni. Vastaa a^-MR proteiinin aminohappotähteitä 1184 - 1582. PCR:ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 19 ja SEK ID NO: 20.
#7: Sisältää konstrukteihin #4 - #6 sisältyvän alueen kokonai suudessaan. Vastaa aa-MR-proteiinin aminohappotähteitä 803 -1582. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 15 ja SEK ID NO: 20.
#8: Sisältää 10 A-tyyppistä domeenia ja vastaa aa-MR-proteii-nin aminohappotähteitä 2520 - 2941. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 21 ja SEK ID NO: 22.
#9: Sisältää 11 A-tyyppistä domeenia ja vastaa aa-MR-proteii-nin aminohappotähteitä 3331 - 3778. PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 23 ja SEK ID NO: 24.
Monistetut domeeneja ja domeeniklustereita koodaavat nukleoti-disekvenssit liitettiin PCR-reaktiolla 5' -päistään nukleotidi-: sekvensseihin (sisältyvät SEK ID NO: 11, 15, 17, 19, 21 ja 23), jotka koodaavat aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka • ·· muodostaa katkaisukohdan naudan restriktioproteaasille FX» : ' : (Nagai ja Thogersen, Methods in Enzymology, 152: 461-481, : 1987). Monistetut DNA-fragmentit alakloonattiin joko E. coli:n :’j’; ilmentämisvektoriin ρΤτΗβ (Christensen et ai. , FEBS Letters.
295: 181-184, 1991) tai ilmentämisplasmidiin pLcIIMLCHe, joka ·, ,·. on muunnettu pLcIIMLC: sta (Nagai et ai. , Nature, 332: 284-286, • * · 1988) insertoimalla kuutta histidinyylitähdettä koodaava • t · oligonukleotidi myosiinin kevyt ketju -fragmentin C-puolelle. Tuotettujen plasmidien pT-7H6FX-#l - #3 ja pLcIIMLCH6FX-#4 - #9 * Λ > : rakenne on esitetty pääpiirtein kuvioissa 6 - 8 ja kuviossa 9 esitetään ilmennettävän proteiinin aminohapposekvenssi (SEK ID NO: 52: ssa esitetään täyspitkän lukukehyksen koodaama amino- happosekvenssi).
pT7HeFX-sarjassa alakloonattuja domeeneja ja domeeniklustereita kasvatettiin ja ilmennettiin E. coli BL21 -soluissa keskikokoisessa mitassa (2 litraa), kuten ovat kuvanneet Studier ja 113272 77
Moffat, J. Mol. Biol., 189: 113-130, 1986. Eksponentiaalisesti kasvavat viljelmät infektoitiin, kun ODeoo oli 0,8, 37 ’C: ssa bakteriofagi ÄCE6: 11a noin 5- kertaisesti. Viljelmiä kasvatettiin 37 ‘C: ssa vielä kolme tuntia ennen kuin solut kerättiin sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoimalla, ja kokonaissoluproteiini uutettiin fenoliin (pH säädetty 8: aan Trisma-emäksellä).
pLcIIMLCHe-sarjassa alakloonattuja domeeniryhmiä kasvatettiin ja ilmennettiin E. coli QY13 -soluissa Nagain ja Thogersenin kuvaamalla tavalla. Methods in Enzymology, 152: 461-481, 1987.
Eksponentiaalisesti 30‘C:ssa kasvavat viljelmät (4 litraa) siirrettiin, kun ODeoo oli 1,0, 42'C: seen 15 minuutiksi. Tämä lämpöshokki indusoi fuusioproteiinien synteesin. Viljelmiä inkuboidaan edelleen 37'C:ssa kolmesta neljään tuntia ennen kuin solut kerätään sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoimalla ja kokonaissoluproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8: aan Trisma-emäksellä).
: Raaka proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2,5
tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla. Proteiinipelletti ·· liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 0,1 M ditioerytriolia. Sephadex G- 25: ssä (Pharmacia, Ruotsi) seokseen 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM
, «*. Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 2 mM metioniinia geelisuodatetut raa'at proteiinivalmisteet vietiin Ni2~-aktivoituun NTA-agaroosipylvääseen (Ni2~NTA-agaroosi), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988) fuusioproteiinit, , ja sen jälkeen sykliseen laskostamismenettelyyn.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin kaasu tyhjiössä ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
Ni2*NTA-agaroosipylvään valmistaminen ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
113272 78
Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2~NTA-agaroosipylvää-seen, fuusioproteiinit puhdistettiin suurimmasta osasta coli-ja λ-faagiproteiineja huuhtelemalla yhdellä pylvään tilavuudella aloituspuskuria, ja sen jälkeen 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 2 mH metioniinilla, kunnes eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssa oli vakaa.
Kukin fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2~NTA-agaroosi-pylväässä käyttäen taulukossa 4 kuvattua gradientinhallinta-profiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaClz, 0,33 mM metioniini.a ja 2,0 mM/0, 2 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia puskurina A ja 4 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCla, 2 mM metioniinia ja 3 mM pelkistettyä glutationia puskurina B. Pelkistetty/hapetettu glutationi-liuos oli juuri valmistettu 100-kertaiseksi kantaliuokseksi lisäämällä 9, 9 M H2O2 sekoituksessa olevaan 0,2 M pelkistettyyn glutationiin ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen laskostusprosessi oli valmis, cta-MR-proteiinista * 1 johdettuja domeeneja ja domeeniryhmiä edustavat fuusioproteii-.* nit eluoitiin Ni2~NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka * ·· sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl ja 5 mM EDTA pH 8. Ni2-NTA- : agaroosipylväisiin aggregoituneet ja sakkautuneet fuusiopro- : teiinit eluoitiin puskurissa B.
!
Noin 75% plasmideista pT7H6FX-#l ja #2 ilmennetystä fuusiopro-: ,·, teiinimateriaalista, joka edusti a2-MR proteiinin N-pään kaksi- ja nelj ä-kysteiinipitoista domeenia eluoitui Ni2-NTA-agaroosipylväästä ei-denaturoivalla puskurilla. Pelkistämättö-: ,V män SDS-PAGE-analyysin perusteella suurin osa tästä fuusiopro- ' t » teiinimateriaalista esiintyi monomeerisenä. Monomeerisen V, fuusioproteiini #1: n ja #2: n saanto arvioitiin noin 50 mg: ksi.
Noin 50% kaikista muista ilmentämisplasmideista ilmennetystä, aa-MR-proteiinista johdettuja domeeniklustereita edustavasta fuusioproteiinimateriaalista eluoitui Ni2-NTA- agaroosipylvääs-tä denaturoimattomalla puskurilla. 30% (fuusioproteiineista #5 ja #7) - 65% (fuusioproteiinista #4) näistä fuusioproteiineis- 113272 79 ta esiintyi pelkistämättömän SDS- PAGE-analyysin perusteella (katso kuvio 17, raidat 9 ja 10) monomeerisinä.
Kukin denaturoimattomalla eluointipuskurilla eluoitunut fuusio-proteiini katkaistiin restriktioproteaasilla FX«. yön yli huoneenlämpötilassa, paino/painosuhteessa arviolta 100:1.
Sephadex G-25:llä 100 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8 -puskuriin tehdyn geelisuodatuksen jälkeen proteiiniliuos vietiin Ni2-NTA-agaroosipylvääseen, millä poistettiin katkeamaton fuusiopro-teiini ja vapautunut N-pään fuusiohäntä, joka oli peräisin katkaistuista fuusioproteiineista. FX« poistettiin liuoksesta viemällä yhdistelmäproteiiniliuokset pienen SBTI-agaroosi-pylvään [Soy Bean Trypsin Inhibitor, soijapavun trypsiinin estäjä immobilisoituna Sepharose CL-6B: hen (Pharmacia, Ruotsi ) ].
SDS-PAGE-analyysi uudelleenlaskostuneesta fuusioproteiinituot-teesta #4 esitetään kuviossa 17, raidat 9 ja 10, joissa : nähdään pelkistetty ja pelkistämätön näyte, tässä järjestyk- sessä. Pelkistämättömän näytteen havaittu liikkuvuuden kasvu heijastaa polypeptidin tiiviyttä, jonka aiheuttaa 33 disulfi-j ·* di sidoksen läsnäolo.
i i · I Kunkin yhdistelmäproteiinin havaittiin sitovan Ca2"·: a raken teesta riippuvalla tavalla.
Tri. S0ren Moestrup havaitsi, että monoklonaalinen vasta-aine A2MRa-5, joka on johdettu luonnollisesta ihmisen ot2-MR: stä, .·’ sitoutui konstruktien #4, #6 ja #7 ilmentämiin yhdistelmäpro- teiineihin, kun taas monospesifisen vasta-aineen A2MRa-3, joka on myös johdettu luonnollisesta a2-MR: stä, havaittiin sitoutu-van konstruktin #8 ilmentämään yhdistelmäproteiiniin. Kummankin vasta-aineen sitoutumisspesifisyys määräytyy rakenteen mukaan (s.o. vasta-aineet eivät reagoi pelkistyneen a2-MR: n eivätkä myöskään pelkistymättömän yhdistelmäproteiinin kanssa) 113272 80
Esimerkki 5
Naudan hyytymistekijä X»: n tuottaminen ja laskostaminen (FXa) Tämä esimerkki kuvaa naudan FXa:sta johdetun yhden fragmentin tuottamista FXa: 11a katkaistavana fuusioproteiinina E. coli: ssa ja tämän yhdistelmäproteiinin puhdistamista, in vitro -laskostamista ja prosessoimista.
Naudan FX: ää koodaava cDNA kloonattiin monistamalla spesifisesti polymeraasiketjureaktiolla (PCR) nukleotidisekvenssit, jotka koodaavat naudan FX: ää aminohappotähteestä Sers2 tähteeseen Trp48< (SEK ID NO: 2, tähteet 82 - 484) (FxAif, aminohap pojen numerointi viittaa kokonaiseen koodaavaan lukukehykseen) käyttäen mallineena naudan maksan kokonais-RNA: sta syntetoitua ensimmäisen juosteen oligo-dT-alukkeista cDNA:ta (lsfc strand oligo-dT primed cDNA). PCR: ssä käytetyt alukkeet olivat SEK ID NO: 25 ja SEK ID NO: 26. RNA: n uuttaminen ja cDNA-synteesi suoritettiin standardimenettely!n.
Monistettu FXAtf:aa koodaava lukukehys liitettiin 5' -päästään * PCR-reaktiolla nukleotidisekvenssiin, joka koodaa aminohappo- .* sekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisukohdan naudan - ·· restriktioproteaasille FXa (Nagai ja Thogersen. Methods in ; : Enzymology, 152: 461-481, 1987). Monistetut DNA-fragmentit ί kloonattiin E. coli: n ilmentämisvektoriin pLcIIMLCHe, joka on , ·’. muunnettu pLcIIMLC: sta (Nagai et ai. , Nature, 332: 284-286, 1988) insertoimalla kuutta histidinyylitähdettä koodaava ; ,·φ oligonukleotidi myosiinin kevyt ketju -fragmentin C-puolelle.
Saadun plasmidin pLcIIMLCHeFX-FXAlf rakenne on esitetty pää- I 1 » piirtein kuviossa 10, ja kuviossa 11 esitetään ilmennettävän proteiinin aminohapposekvenssi (SEK ID NO: 53: ssa esitetään i : täyspitkän lukukehyksen koodaama aminohapposekvenssi).
Plasmidia pLcIIMLCHe-FXA'f viljeltiin ja ilmennettiin E. coli ·· QY13 -soluissa, kuten kuvattu lähteessä Nagai & Thogersen (Methods in Enzymology, 152: 461-481, 1987). 30* C: ssa ekspo nentiaalisessa kasvuvaiheessa olleita viljelmiä, 0D6oo 1,0, inkuboitiin 42* C: ssa 15 minuutin ajan. Tämä lämpöshokki indusoi fuusioproteiinien synteesin. Viljemiä inkuboidaan 113272 81 edelleen 37’C:ssa kolmesta neljään tuntia ennen kuin solut kerätään sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoinnilla ja kokonaissoluproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8: aan Trisma-emäksellä).
Raaka proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2, 5 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimallla. Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 0,1 M ditioerytriolia. Geeli f iltraation Sephadex G-25:llä (Pharmacia, LKB, Ruotsi) 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanoliin jälkeen raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2~ -aktivoituun NTA-agaroosimatrii-siin, jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988. ) FXAi?--fuusioproteiini, ja sen jälkeen sykliseen laskostamis-menettelyyn.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistimen lisäämistä . ja/tai käyttöä.
Ni2-NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
| : Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2~NTA-agaroosipylvää- ! seen, fuusioproteiinit puhdistettiin suurimmasta osasta colin ja λ-faagin proteiineja pesemällä yhdellä pylvään tilavuudella aloituspuskuria ja sen jälkeen 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl ja 10 mM 2-merkaptoetanolilla, kunnes eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssä oli vakaa.
Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2-NTA-agaroosipyl-väässä käyttäen taulukossa 5 kuvattua gradientinhallintaprofii-lia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 ja 2,0 mM/0,2 mM pelkistettyä/hapetettua glutationia puskurina A ja 8 M urea, 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 ja 3 mM pelkistettyä glutationia puskurina B. Pelkistetty/hapetettu glutationiliuos oli juuri valmistettu 100-kertaiseksi kanta- 113272 82 liuokseksi lisäämällä 9,9 M H2O2 sekoituksessa olevaan 0, 2 M pelkistyneeseen glutationiin ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen laskostusproseesi oli valmis, ρ-ΧΔΫ -fuusiopro-teiini eluoitiin Ni2-NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl ja 5 mM EDTA pH 8. Ni2~NTA-agaroosipylväisiin aggregoituneet ja sakkautuneet fuusiopro-teiinit eluoitiin puskurissa B.
Noin 33% ΡΧΔΊ$· -fuusioproteiinimateriaalista eluoitui Ni2-NTA-agaroosipylväästä ei-pelkistävällä puskurilla. ΡΧΔΥ -fuusio-proteiinin määrä arvioitiin 15 mg: ksi. Pelkistämättömän SDS-PAGE-analyysin perusteella vain noin kolmannes tästä fuusioproteiinimateriaalista esiintyi monomeerisena, mikä vastaa laskostamismenettelyn kokonaistehokkuutta noin 10%.
FXÄIf-fuusioproteiini ei-denaturoivassa puskurissa aktivoitiin viemällä yhdistelmäproteiiniliuos pienen trypsiini-agaroosi-pylvään läpi [trypsiini immobilisoitu Sepharose CL-6B:hen : ; (Pharmacia, Ruotsi)].
’·· Aktivoitu yhdistelmä-FXAY-fuusioproteiini tutkittiin proteo- : ·’: lyyttisen aktiivisuuden ja substraattispesifisyysprofiilin suh- i teen standardimenettelyin kromogeenisiä substraatteja käyt- täen. Aktiivisuus ja substraattispesifiysprofiili eivät olleet erotettavissa luonnollisella naudan FX«: 11a saaduista tulok- . s is ta.
* · · • » · • » · ·, Esimerkki 6 » t
Ihmisen plasminogeenin rinkelidomeenien 1 ja 4 tuottaminen ja Γ'*: 1 as kos t ami nen Tämä esimerkki kuvaa lysiiniä sitovien ihmisen plasminogeenin • · rinkelidomeenien 1 ja 4 (K1 ja K4, tässä järjestyksessä) ···’ tuottamista E. colissa FXÄ: 11a katkaistavina fuusioproteiinei-na sekä näiden Kl- ja K4-proteiinien laskostamista in vitro.
Plasmidikloonia, joka sisältää ihmisen plasminogeeniä koodaa-van täyspitkän cDNA: n kloonattuna yleiseen kloonausvektoriin 113272 83
pUC18 (jonka luovutti ystävällisesti tri Earl Davie, Seattle, USA) käytettiin mallineena polymeraasiketjureaktiossa (PCR), joka oli laadittu tuottamaan cDNA-fragmentteja, jotka vastaavat Kl:tä (vastaa niin sanotun Glu-plasminogeenin aminohappotähteitä Sersi - G1uie2) ja K4: ää (vastaa niin sanotun Glu-plasminogeenin aminohappotähteitä Valas-» - Ala-ias). Kl: tä tuottaneessa PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 27 ja SEK
ID NO: 28 ja K4: ää tuottaneessa PCR: ssä käytettiin alukkeita SEK ID NO: 29 ja SEK ID NO: 30.
Monistetut, Kiitä ja K4: ää koodaavat lukukehykset liitettiin 5' -päistään PCR-reaktiolla SEK ID NO: 27: ään ja SEK ID NO: 29: ään sisältyviin nukleotidisekvensseihin, jotka koodaavat aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisu-kohdan naudan restriktioproteaasille FX» (Nagai ja Thogersen. Methods in Enzymology, 152: 461-481, 1987). Monistettu Kl-DNA- fragmentti kloonattiin E. colin ilmentämisvektoriin pLcIIMLCHe, joka on muunnettu pLcIIMLC:sta (Nagai et ai., Nature, 332: 284-286, 1988) insertoimalla kuutta histidinyyli- : : tähdettä koodaava oligonukleotidi myosiinin kevyt ketju ' -fragmentin C-puolelle. Saadun plasmidin pLcIIMLCHeFX-Kl '· rakenne on kuvattu pääpiirtein kuviossa 12. Monistettu K4-DNA- I fragmentti kloonattiin E. colin ilmentämis vektoriin pLcIIHe, j joka on muunnettu pLcII-.sta (Nagai and ThOgersen. Methods in j‘j’; Enzymology, 152: 461-481, 1987) insertoimalla kuutta histidi- nyylitähdettä koodaava oligonukleotidi eli-fragmentin C-puolelle. Saadun plasmidin pLcIIH6FX-K4 rakenne on kuvattu • · V pääpiirtein kuviossa 13, ja kuviossa 14 esitetään ihmisen "Glu-plasminogeenin" aminohapposekvenssi (SEK ID NO: 54).
* · s Sekä pLcIIMLCHe-Kl-plasmidia että pLcIIH6FX-K4-plasmidia X viljeltiin ja ilmennettiin E. coli QY13 -soluissa, kuten kuvattu lähteessä Nagai ja Thogersen. Methods in Enzymology, 152: 461-481, 1987. 30' C: ssa eksponentiaalisesti kasvaneet viljelmät siirrettiin, kun ODeoo oli 1,0, 42'C: seen 15 minuutiksi. Tämä lämpöshokki indusoi fuusioproteiinien synteesin. Viljelmiä inkuboidaan edelleen 37'C: ssa kolmesta neljään tuntia ennen kuin solut kerätään sentrifugoimalla. Solut 113272 84 hajotettiin osmoottisella shokilla ja sonifikoinnilla, ja kokonaissoluproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8:aan Trisma-emäksellä. )
Raakaproteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2,5 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla. Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 0,1 M ditioerytriolia. Geelisuodatuksen Sephadex G-25:llä (Pharmacia, Ruotsi) 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 2 mM metioniiniin raakaproteiinivalmiste vietiin Ni2*- aktivoituun NTA-agaroosi-matriisiin, jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988. ) Kl- ja K4-fuusioproteiinit ja sen jälkeen sykliseen laskosta-mi s menettelyyn.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
• Ni2--NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
; Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2-NTA-agaroosipylvää- i seen, fuusioproteiinit puhdistettiin suurimmasta osasta colin i‘;‘; ja λ-faagin proteiineja huuhtelemalla yhdellä pylvään tilavuu della aloituspuskuria ja sen jälkeen 6 M guanidiinikloridi, 50 : ^ mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanoli, 2 mM metioniinillä, kunnes pylvään eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssä oli vakaa.
« : Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2-NTA-agaroosipylvääs- sä käyttäen taulukossa 4 kuvattua gradientinhallintaprofiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 6-aminoheksanoiini- “* happo (t-aminokapronihappoa 8-ACA), 0,33 mM metioniini, 2,0
mM/0,2 mM pelkistettyä/hapetettua glutationia puskurina A ja 4 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM £-ACA, 2 mM
metioniini, 3 mM pelkistettyä glutationia puskurina B. Pelkis-tetty/hapetettu glutationiliuos oli juuri valmistettu 100- 113272 85 kertaiseksi kantaliuokseksi lisäämällä 9, 9 M H2O2 sekoituksessa olevaan 0,2 M pelkistettyyn glutationiin ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen 1 as kos tus prosessi oli valmis, Kl- ja ^-fuusio-proteiini eluoitiin kumpikin Ni2-NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA pH
8. Ni2--NTA-agaroosipylvääseen aggregoituneet ja sakkautuneet fuusioproteiinit eluoitiin puskurissa B.
Käytännöllisesti katsoen kaikki Kl- ja K4-fuusioproteiinimate-riaali eluoitui Ni2~NTA-agaroosipylväistä ei-denaturoivalla puskurilla. Kl-fuusioproteiinin ja K4-fuusioproteiinin arvioitu saanto oli noin 60 mg. Pelkistämättömän SDS-PAGE-analyysin perusteella käytännöllisesti katsoen kaikki Kl-fuusioproteii-ni, kuten myös K4-fuusioproteiini, esiintyi monomeerisenä, mikä vastaa laskostamisprosessin tehokkuutta yli 90%.
SDS-PAGE-analyysi yhdistelmä-plasminogeenirinkeleistä 1 ja 4 : esitetään kuviossa 17.
• '·· Kl-fuusioproteiini ja K4-fuusioproteiini puhdistettiin edel- • '/· leen af f ini teettikromatografialla lysiini-Sepharose CL- 6B: ssä i :’: (Pharmacia, Ruotsi). Fuusioproteiinit eluoitiin affiniteetti- »*·’: pylväistä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM ε-ACA.
• * * 1 · '·.[ Lysiini-Sepharoseen sitoutuminen hyväksytään tavallisesti osoi- • 1 · tukseksi lysiiniä sitovien rinkelidomeenien oikeasta laskostu-v.: misesta.
Γ Tällä syklisellä laskostusmenettelyllä tuotettujen ja N-pään fuusiohäntä vapauttamalla täysin prosessoitujen ja sen jälkeen '** ioninvaihtokromatografialla puhdistettujen yhdistelmäproteiini- domeenien Kl ja K4 kolmiulotteinen rakenne on varmistettu röntgendiffraktiolla (suoritti tri Robert Huber) ja kaksiulotteisella NMR-analyysillä (suorittivat stud. scient. Peter Reinholdt ja tri Flemming Poulsen).
ee 113272 Täysin prosessoitujen yhdistelmäproteiinidomeenien K1 ja K4 kokonaissaanto tällä menettelyllä on 5 mg/litra viljelmää.
Esimerkki 7
Ihmisen ctz-makroglobuliinista ja kanan ovostatiinista johdettujen yhdistelmäfraqmenttien tuotanto E. colissa ja uudelleen-laskostaminen Tämä esimerkki kuvaa ihmisen ct2-makroglobuliinin reseptoriin sitoutuvan domeenin (a2-MRBDv) tuottamista E. coli: ssa FXa: 11a katkaistavana fuusioproteiinina sekä yhdistelmä-a2-MRBDv: n puhdistamista FXÄ: 11a katkaisemisen jälkeen.
462: n bp: n DNA-fragmentti, joka koodaa ot2-makroglobuliinin lukukehystä aminohappotähteestä Val12S9 tähteeseen Alaasi (ct2-MRDv) monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR), noudattaen olennaisesti Saikin et ai. , ( 1988) menettelyä.
Plasmidia pA2M (jonka tri T. Kristensen ystävällisesti luovutti), joka sisältää ihmisen a2-makroglobuliinin täyspitkän ' * cDNA: n, käytettiin mallineena ja alukkeina oligonukleotideja .* SEK ID NO: 31 ja SEK ID NO: 32. Monistettu koodaava lukukehys *· liitettiin 5' -päästään PCR-reaktiolla nukleotidisekvenssiin, joka sisältyy SEK ID NO: 7: ään ja koodaa aminohapposekvenssiä I SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisukohdan naudan restriktio- i proteaasille FXÄ (Nagai ja Thogersen, 1987). Monistettu DNA-fragmentti alikloonattiin E. coiin ilmentämisvektoriin : ·, pT7H6 (Christensen ym. , 1991). Saadun plasmidin pT7HeFX-a2MRDv > ‘ * (ilmentää ihmisen a2-MRDv: tä) rakenne on esitetty pääpiirtein • · kuviossa 18 ja ilmennettävän proteiinin aminohapposekvenssi \ ,· esitetään kuviossa 19 (SEK ID NO: 55).
t I · 1 :
Ihmisen yhdistelmä-a2MRDv: tä tuotettiin viljelemällä ja ilmentämällä plasmidia pT7HsFX-a2MRDv E. coli BL21-soluissa keskisuuressa mitassa (2 x 1 litra), kuten ovat kuvanneet Studier ja Moffat, J. Mol. Biol. , 189: 113-130, 1986.
37 'C:ssa eksponentiaalisesti kasvavat viljelmät infektoitiin, kun ODeOO oli 0, 8, bakteriofagi ÄCE6:llä noin 5-kertaisesti. Viljelmiä kasvatettiin 37* C: ssa vielä kolme tuntia ennen 67 1 13272 solujen keräämistä sentrifugoimalla. Solut hajotettiin osmoottisella shokilla ja soni fikoimalla, ja kokonaissoluproteiini uutettiin fenoliin (säädetty pH 8: aan Trisma-emäksellä. Proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta lisäämällä 2,5 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla. Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guani di ini kloridi a, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 50 mM ditioerytriolia. Sephadex G-25:11a (Pharmacia, LKB, Ruotsi) 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanoliin geelisuodatuksen jälkeen raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2+: llä aktivoituun NTA-agaroosi-pylvääseen (Ni2+NTA-agaroosi), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988) fuusioproteiini, MGSHHHHHHGSIEGR-ctaMRDv (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48), ja sen jälkeen sykliseen laskostamismenettelyyn.
Ni2-NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
. Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista [’· poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
i V Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2~NTA-agaroosipylvää- j * ; seen, fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-aaMRDv (missä Γι': MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) puhdistettiin suurimmasta osasta colin ja Λ-faagin proteiineja huuhtelemalla yhdellä : *. pyivästilavuudella aloituspuskuria ja sen jälkeen 6 M guanidii- i · • * nikloridi, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanolilla, kunnes * · eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssä oli vakaa.
1Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2+NTA-agaroosipylvääs-sä käyttäen taulukossa 4 kuvattua gradientinhallintaprofiilia ,>·, ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 2,0 mM/0, 2 mM pelkisty- nyttä/hapettunutta glutationia puskurina A ja 8 M urea, 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM pelkistettyä glutationia puskurina B. Hapettunut/pelkistynyt glutationiliuos oli juuri 113272 88 valmistettu 200-kertaisena kantaliuoksena lisäämällä 9, 9 M H2O2 sekoituksessa olevaan liuokseen 0,2 M pelkistynyttä glutationia ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen laskostamismenettely oli valmis, 2MRDv-fuusio-proteiini eluoitiin Ni2+NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA pH 8. Ni2 + NTA-agaroosipylvääseen aggregoitunut ja sakkautunut fuusioproteii-ni eluoitiin puskurissa B.
Noin 50% fuusioproteiinimateriaalista eluoitui vesipohjaisella eluointipuskurilla. Pelkistämättömän SDS-PAGE-analyysin perusteella puolet tästä fuusioproteiinimateriaalista esiintyi monomeerisena.
Yhdistelmä-aaMRDv-proteiini vapautettiin N-pään fuusiohännästä katkaisemalla restriktioproteaasilla FXa huoneenlämmössä paino/painosuhteessa noin 50: 1 neljän tunnin ajan. Katkaisemisen jälkeen a2MRDv-proteiini eristettiin katkeamattomasta i fuusioproteiinista, vapautetusta fuusiohännästä ja FXa: sta geelisuodattamalla Sephadex G-25: llä puskuriin 10 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja sen jälkeen ioninvaihtokromatografialla Q-Sepharosessa: a2MRDv eluoitiin lineaarigradientilla (10
: pylvään tilavuudella) 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 - 500 mM
NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8. ciaMRDv-proteiini eluoitui 150 mM NaCl: s s a.
»
Yhdistelmä-ot2MRDv-domeeni sitoutuu a2M-reseptoriin samalla , * reseptoriaffiniteetilla, jota osoittaa kokonainen a2-makroglo- » '1 buliinimolekyyli [viittaamme arvioituun KD: hen yhden ligandin ja yhden reseptorin sitoutumisessa (Moestrup ja Gliemann Λ 1991)]. Sitoutumisanalyysin suorittivat tri. Soren K. Moestrup ja stud, scient. Kare Lehmann).
► *
Esimerkki 8
Taimenen VHS-viruksen kuoriglykoproteiinista G johdettujen yhdistelmäfragmenttien tuottaminen E. colissa ja uudelleen-laskostaminen 113272 89
Taimenen VHS-viruksen kuoriglykoproteiinista G johdettujen ydistelmäfragmenttien ilmentäminen E. colissa. FX«: 11a katkaistavina fuusioproteiineina sekä in vitro -uudelleenlaskostami-nen suoritetaan käyttäen yleisstrategioita ja menetelmiä, jotka vastaavat "syklisen uudelleenlaskostusmenettelyn" yleisessä kuvauksessa pääpiirtein kuvattuja ja esimerkeissä 1-6 kerrottuj a.
Esimerkki 9
Ihmisen yhdistelmätetranektiinin ja ihmisen yhdistelmätetra-nektiinistä johdettujen yhdistelmäfraqmenttien tuottaminen E. colissa
Tetranektiini on tetrameerinen proteiini, joka koostuu neljästä identtisestä, epäkovalenttisesti liittyneestä yksiketjui-sesta, 181: n aminohappotähteen (17 kD) alayksiköstä. Kukin alayksikkö sisältää neljä disulfidisidosta ja sitooo Ca2+:a. Tetranektiiniä on plasmassa ja se liittyy solunulkoiseen matriisiin. Tetranektiini sitoutuu spesifisesti plasminogeenin rinkelidomeeniin 4. Tämä sidos voidaan titrata spesifisesti t * ’ '· lysiinillä tai O-aminohapoilla.
Kypsän tetranektiinin yksisäikeistä alayksikköä vastaavaa ' lukukehystä koodaava cDNA kloonattiin monistamalla spesifises-ti polymeraasiketjureaktiolla (PCR) (Saiki et ai. , 1988) nukleotidisekvenssit aminohappotähteestä Glui tähteeseen Vali81 käyttäen mallineena ihmisen istukan kokonais-RNA: sta syntetoitua ensimmäisen juosteen oligo-dT- alukkeista cDNA: ta (1 sStrand oligo-dT primed cDNA). PCR: ssä käytettiin alukkei-ta SEK ID NO: 33 ja SEK ID NO: 34. RNA: n uuttaminen ja cDNA- synteesi suoritettiin standardimenettelytavoilla.
Monistettu tetranektiinin monomeerialayksikköä koodaava lukukehys liitettiin 5' -päästään PCR-reaktiolla nukleotidisek-vensseihin, jotka koodaavat aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisukohdan naudan restriktioproteaasil-le FXa (Nagai ja Thogersen, 1987). 5' -PCR-alukkeen erityisen mallin takia (SEK. ID NO. 33), insertoitiin glysiinitähde FXa: n katkaisukohdan (SEK ID NO. 37) C-pään arginiinitähteen 113272 90 ja tetranektiinin Glui-tähteen väliin. Monistettu DNA-frag-mentti alikloonattiin E. colin ilmentämisvektoriin pT7Hs (Christensen et ai., 1991). Saadun plasmidin pT7HeFX-TETN (ilmentää tetranektiinimonomeeriä) rakenne on esitetty pääpiirtein kuviossa 20, ja ilmennettävän proteiinin aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 21 (SEK ID NO: 56: ssa esitetään täyspitkän lukukehyksen koodaama aminohapposekvenssi).
Tetranektiinimonomeerin valmistamiseksi kasvatettiin plasmidia pT7HeFX-TETN keskisuuressa mitassa (4x1 litraa: 2xTY kasva tusalustaa, 5 mM MgSO* ja 100 ug ampisilliiniä) E. coli BL21 -soluissa, kuten ovat kuvanneet Studier ja Moffat, J. Mol. Biol. , 189: 113-130, 1986. Eksponentiaalisesti 37'C:ssä kasvavat viljelmät infektoitiin, kun ODeOO oli 0,8, bakteriofagilla ACE6 noin 5-kertaisesti. Viljelmiä kasvatettiin 37’C: ssa vielä kolme tuntia ja solut kerättiin sentrifugoimal-la. Solut lietettiin uudelleen 150 ml: aan puskuria 0, 5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8. Lisättiin fenolia (100 ml, säädetty pH 8: aan) ja seos sonifikoitiin kokonaisproteii-’ nin uuttamiseksi. Proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta 2,5 .* tilavuudella etanolia ja sentrifugoimalla.
I I
! '/ Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M
: j' guani di ini kloridi a, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 0, 1 M ditioerytrio- lia. Geelisuodatuksen Sephadex G-25: llä (Pharmacia, LKB,
Ruotsi) 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10 mM
.·. 2-merkaptoetanoliin jälkeen raaka proteiinivalmiste vietiin ;>, Ni2+-aktivoituun NTA-agaroosipylvääseen (75 ml Ni2+NTA-agaroo- > · siä, esihuuhdeltu 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanolilla), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988) fuusioproteiini, MGSHHHHHHGSIEGR-TETN (missä V, MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48).
»
Ni2*NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
91 11327?
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
Pylväs pestiin 200 ml:11a puskuria I: 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 100 ml: 11a puskuria II: 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10
mM 2-merkaptoetanoli. Fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-TETN
eluoitiin puskurilla II, joka sisälsi 10 mM EDTA pH 8, ja eluaatti geelisuodatettiin Sephadex G25:ssä käyttäen eluantti-na puskuria I.
Eluoitunut proteiini uudelleenlaskostettiin sitten. Fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-TETN (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) sekoitettiin 100 ml: aan Ni2+NTA-agaroosia. Hartsi,
joka sisälsi sitoutuneen proteiinin, pakattiin halkaisijaltaan 5 cm: seen pylvääseen ja huuhdeltiin puskurilla I täydennettynä CaCl2: 11a pitoisuuteen 2 mM. Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2+NTA-agaroosipylväässä lämpötilassa 11 - 12 "C
1 käyttäen taulukossa 4 esitettyä gradientinhallintaprofiilia ja ,ί 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaClz ja 2,0 mM/0, 2 mM
.. pelkistynyttä/hapettunutta glutationia puskurina A ja 8 M
'· urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2, 3 mM pelkisty- nyttä glutationia puskurina B. Pelkistynyt/hapettunut gluta-tioniliuos oli juuri valmistettu 200-kertaiseksi kantaliuok-seksi lisäämällä 9,9 M H2O2 sekoituksessa olevaan 0,2 M pelkistettyyn glutationiin ennen lisäämistä puskuriin A.
» »
Kun syklinen laskostusmenettely oli suoritettu loppuun, tetranektiinifuusioproteiini eluoitiin Ni2+NTA-agaroosipyl-‘j väästä puskurilla, joka sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8. Tetranektiinifuusioproteiini katkaistiin FXÄ: 11a lämpötilassa 4 *C yön yli moolisuhteessa 1:300. FX«: 11a katkaisemisen jälkeen proteiininäyte tiivistettiin 10: sosaan ultrasuodattamalla YM10-kalvon läpi (Amicon). Kun proteiini-näyte oli laimennettu 10-kertaisesti 2 mM CaCl2:11a, yhdistel-mätetranektiini eristettiin ioninvaihtokromatografiällä Q-Sepharosessa (Pharmacia, Ruotsi) 10 pylvästilavuuden lineaa- 113272 92
rigradientilla 10 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCla - 10 mM
Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCla, 0, 5 M NaCl.
Tällä menetelmällä tuotetun yhdistelmätetranektiiniproteiinin analysoi tri Inge Clemmensen, Rigshospi talet, Kööpenhamina. Tri Clemmensen havaitsi, että yhdistelmätetranektiini käyttäytyi plasminogeenin rinkelidomeeniin 4 sitoutumisen ja antigee-nikohtien esittämisen suhteen identtisellä tavalla luonnosta eristetyn ihmistetranektiinin kanssa.
Alustavat tutkimukset, joissa verrataan Ni2+NTA-agaroosipylvää- ' seen sitoutuneen yhdistelmätetranektiini-fuusioproteiinin ja dialyysipussissa olevan tetranektiinin uudelleenlaskostumisen tehokkuutta “syklisellä uudelleenlaskostusmenettelyllä" osoittavat merkitsevästi parantunutta liukoisen monomeerin saantoa liuoksessa laskostamis -strategialla. Kuitenkin, jos kumpi tahansa kierrätysmenettelyn tuote altistetaan disulfi-dien uudelleenjärjestämiselle liuoksessa 5 mM CaCla: n läsnäollessa, käytännöllisesti katsoen kaikki polypeptidimateriaali ; konvertoituu oikein laskostuneeksi tetranektiinitetrameeriksi.
»
Dialyysipussissa oleva denaturoitunut ja pelkistynyt autent-.. tinen tetranektiini uudelleenl as kostettiin 15 syklisellä
* ; altistamisella puskuri B:lie (6 M urea, 100 mM NaCl, 50 mM
: Tris-HCl pH=8, 2 mM/0, 2 mM pelkistynyttä/hapettunutta gluta- *·* * tionia, 2 mM CaCla ja 0,5 mM metioniinia) ja puskurille A (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM/0,2 mM pelkistynyttä/hapet-•i tunutta glutationia, 2 mM CaCla, 0,5 mM metioniinia).
, · ’ ·. Esimerkki 10 .1^ E. colissa solunsisäisesti ilmennettävän diabodyn tuottaminen 'ja laskostus: Mab 32 diabody, joka on suunnattu kasvainnek-: V roositekijää vastaan
Diabodyt (kuvanneet Holliger et ai., 1993) ovat keinotekoisia kahdenarvoisia ja kaksoisspesifisiä vasta-ainefragmentteja.
Tämä esimerkki kuvaa kasvainnekroositekijä alfaa (TNF-a) vastaan suunnatun, hiiren monoklonaalisesta vasta-aineesta Mab 113272 93 32 johdetun diabodyn (Rathjen et ai., 1991, 1992; Australialainen patenttihakemus 7 576; EP-A-486,526) tuottamista E.
colissa.
Fagemidikloonin pCANTAB5-myc-Mab32-5, joka sisältää Mab32: n koodattuna diabodymuodossa (PCT/GB93/02492), luovutti ystävällisesti tri G. Winter, Cambridge Antibody Technology (CAT) Ltd. , Cambridge, UK. pCANTAB5-myc-Mab32-5-DNA: ta käytettiin mallineena polymeraasiketjureaktiossa (PCR) (Saiki et ai. , 1988) käyttäen alukkeita SEK ID NO: 35 ja SEK ID NO: 36, jotka on laadittu tuottamaan kokonaista keinotekoista diabodya vastaava cDNA-fragmentti. Monistettu, koodaava lukukehys liitettiin 5' -päästään PCR-reaktiolla nukleotidisekvenssiin, joka sisältyy SEK ID NO: 35: een ja koodaa aminohapposekvenssiä SEK ID NO: 37, joka muodostaa katkaisukohdan naudan restriktio- proteaasille FXÄ (Nagai ja Thogersen, 1987). Monistettu DNA-fragmentti alikoonattiin E. coli: n ilmentämisvektoriin pT7He (Christensen et ai., 1991). Saadun plasmidin pT7HeFX-DB32 (ilmentää Mab32-diabodya) rakenne on esitetty , pääpiirtein kuviossa 22 ja ilmennetyn proteiinin aminohappo- sekvenssi esitetään kuviossa 23 (SEK ID NO: 57:ssä esitetään täyspitkän lukukehyksen koodaama aminohapposekvenssi. ) : ’ Diabodyfragmentin valmistamiseksi plasmidia pT7H®FX-DB32 · kasvatettiin keskisuuressa mitassa (4x1 litraa: 2xTY- I 1 · ’·.· · kasvatusalustaa, 5 mM MgSCU ja 100 ug ampisilliinia) E. coli BL21 -soluissa, kuten ovat kuvanneet Studier ja Moffat, J.
: Mol. Biol. , 189: 113-130, 1986. Eksponentiaalisesti 37’C:ssa kasvavat viljelmät, ODeOO 0,8, infektoitiin bakteriofagi ACE6:11a noin 5-kertaisesti. Neljäkymmentä minuuttia infektoin- < ♦ nin jälkeen listattiin rifampisiiniä (0,2 g 2 ml: ssa metanolia ’·;·* per litra kasvatusalustaa). Viljelmiä kasvatettiin 37* C: ssa vielä kolme tuntia ja solut kerättiin sentrifugoimalla. Solut uudelleensuspendoitiin 150 ml: aan 0, 5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8. Fenolia (100 ml, säädetty pH 8: aan) lisättiin ja seos sonikoitiin kokonaisproteiinin uuttamiseksi. Proteiini sakkautettiin fenolivaiheesta 2, 5 tilavuudella etanolia ja sentrifugoimalla.
94 113272
Proteiinipelletti liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guanidiinikloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 0, 1 M ditioerytrio-lia. Geelisuodatuksen Sephadex G-25: llä (Pharmacia, LKB,
Ruotsi) 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-mer- kaptoetanoliin jälkeen raaka proteiinivalmiste vietiin Ni2 + -aktivoituun NTA-agaroosipylväseen (Ni2+NTA-agaroosia, 75 ml,
esihuuhdeltu 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM
2-merkaptoetanolilla), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., 1988) fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48).
Ni2~NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
. Pylväs huuhdeltiin 200 ml: 11a 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM
Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkaptoetanolilla (puskuri I) ja 100 ! ' ml 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM 2-merkap- ,, , toetanolilla (puskuri II). Fuusioproteiini ; MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 eluoitiin puskurilla II, joka sisälsi 10 • * ‘ mM EDTA: a pH 8, ja eluaatti geelisuodatettiin Sephadex G25:ssa V * käyttäen eluenttina puskuria I.
i ; : Eluoitunut proteiini uudelleenlaskostettiin sitten. Fuusiopro- teiini MGSHHHHHHGSI EGR-DB32 (missä MGSHHHHHHGSI EGR on SEK ID NO: 48) sekoitettiin 100 ml: aan Ni2+NTA-agaroosia. Sitoutuneen proteiinin sisältävä hartsi pakattiin halkaisijaltaan 5 '•y" cm: seen pylvääseen ja huuhdeltiin puskurilla I. Fuusioprote- : iini uudelleenlaskostettiin Ni2+NTA-agaroosipylväässä lämpö- tilassa 11-12* C käyttäen taulukossa 4 kuvattua gradientin-hallintaprofiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2,0 mM/0, 2 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia puskurina A, ja 8 M urea, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 3 mM pelkistynyttä glutationia puskurina B. Hapettunut/pelkistynyt glutatio- 113272 95 niliuos oli juuri valmistettu 200-kertaiseksi kantaliuokseksi lisäämällä 9, 9 M H2O2: a sekoituksessa olevaan 0, 2 M pelkistyneeseen glutationiliuokseen ennen lisäämistä puskuriin A.
Kun syklinen 1askostusmenettely oli valmis, DB32-fuusiopro-teiini eluoitiin Ni2+NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8, säädettiin pitoisuuteen 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG ja inkuboitiin 12 - 15 tuntia 20"C:ssa. Fuusioproteiini tiivistettiin sitten 50-ker-taisesti ultrasuodattamalla YMlO-kalvojen läpi ja kirkastettiin sentri fugoimalla.
DB32-yhdistelmäproteiinidimeeri puhdistettiin geelisuodatuk-sella Superose 12 -pylväässä (Pharmacia, Ruotsi), eluanttina PBS.
Kokonaissaanto oikein laskostunutta DB32-fuusioproteiinia tästä menettelysarjasta oli 4 mg per litra.
Pelkistämättömällä SDS-PAGE:11a tehty analyysi puhdistuksen eri vaiheista esitetään kuviossa 26.
'* N-pään fuusiopeptidi MGSHHHHHHGSIEGR (SEK ID NO: 48) leikat- : ·' tiin irti DB32-proteiinista katkaisemalla restriktioproteaasil-; : la FX» (moolisuhde 1:5 FXe: DB3 2- fuusioproteiini) 37*C:ssa 20 V · tuntia. Tämä näkyy· pieni molekyylipa! noi s emman juovan esiinty misenä juuri katkeamattoman fuusioproteiinin alapuolella : kuviossa 26.
Uudelleenlaskostetun DB32-proteiinin analysoi Cambridge Anti- t ♦ · body Technology Ltd. (CAT). DB32: n havaittiin sitoutuvan l·;·' spesifisesti TNF-α: aan ja kilpailevan kokonaisen Mab32-vasta- aineen kanssa sitoutumisesta TNF-α: aan. Lisäksi sekä DB32: a • · että Mab32: a kilpailutettiin TNF-α: aan sitoutumisessa lampaan anti-301-antiseerumin kanssa, joka oli tuotettu immunisoimalla lampaita peptidillä, joka koodaa ihmisen TNF-α: n ensimmäistä 18 aminohappoa ja käsittää ainakin osan hiiren Mab32: n tunnistamasta epitoopista.
96 113 2 7 2
Esimerkki 11
Ihmisen psoriasiinin tuottaminen E. colissa ja uudelleenlaskos-taminen
Psoriasiini on yksidomeenineen Ca2 + :a sitova 100 aminohappotähteen (11/5 kD) proteiini. Psoriasiini sisältää yhden disulfidisidoksen. Proteiinin, jonka uskotaan kuuluvan S100-proteiiniperheeseen, tuotanto on hyvin suuri psoriaattisessa ihossa ja ihmisen primäärikeratinosyyteissä, jotka ovat erilaistumassa poikkeavasti.
Plasmidin pTvHeFX-PS. 4 (jonka ystävällisesti luovutti tri P. Madsen, Lääketieteellisen biokemian laitos, Aarhusin yliopisto, Tanska) ovat aikaisemmin kuvanneet Hoffmann et ai., ( 1994). Psoriasiiniproteiinia Ser2: sta GlniOl: een koodaava nukleotidisekvenssi on 5' -päästään liitetty nukleotidisekvens-siin, joka koodaa aminohapposekvenssiä MGSHHHHHHGSIEGR (SEK ID NO: 48). pTvHeFX-PS. 4: n kartta on annettu kuviossa 24, ja ihmisen psoriasiinin aminohapposekvenssi lueteltu kuviossa 25 (SEK ID NO: 5.8: ssa esitetään täyspitkän lukukehyksen koodaama ami nohappos ekvens s i).
Ihmisen yhdistelmäpsoriasiinia viljeltiin ja ilmennettiin : ·' plasmidista pT7H6FX-PS. 4 E. coli BL21 -soluissa, ja kokonais- ! :: soluproteiini uutettiin, kuten on kuvattu (Hoffmann et ai., . » 1· 1994). Etanolilla sakkautettu kokonaisproteiini liuotettiin puskuriin, joka sisälsi 6 M guani dii ni kloridi a, 50 mM Tris-HCl : pH 8 ja 50 mM ditioerytriolia. Sephadex G-25: ssä (Pharmacia, LKB, Ruotsi) 8 M urea, 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 5 mM 2-merkaptoetanoliin geelisuodatuksen jälkeen raaka proteiini-; valmisete vietiin Ni2+ -akti voituun NTA-agaroosipylvääseen !-··' (Ni2+NTA-agarose), jotta saatiin puhdistettua (Hochuli et ai., I '·*: 1988) fuusioproteiini MGSHHHHHHGSI EGR-psoriasiini (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48), ja sen jälkeen sykliseen laskos tus menettelyyn.
Ni2*NTA-agaroosipylvään valmistus ja "varaaminen" on kuvattu esimerkissä 1.
Kaikista nestekromatografiaa varten valmistetuista puskureista poistettiin tyhjiössä kaasu ennen pelkistäjän lisäämistä ja/tai käyttöä.
97 113272
Kun raakaproteiiniuutteet oli viety Ni2~NTA-agaroosipylvää-seen, fuusioproteiini MGSHHHHHHGSIEGR-psoriasiini (missä MGSHHHHHHGSIEGR on SEK ID NO: 48) puhdistettiin suurimmasta osasta colin ja λ-faagin proteiineja huuhtelemalla yhdellä pylvään tilavuudella aloituspuskuria ja sen jälkeen 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl ja 5 mM 2-merkaptoetanolil-la, kunnes eluaatin optinen tiheys (OD) 280 nm: ssä oli vakaa.
Fuusioproteiini uudelleenlaskostettiin Ni2+NTA-agaroosipylvääs-sä käyttäen taulukossa 4 kuvattua gradientinhallintaprofiilia ja 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl2 ja 1,0 mM/0, 1
mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia puskurina A ja 8 M urea, 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCla, 5 mM
pelkistynyttä glutationia puskurina B. Hapettunut/pelkistynyt glutationiliuos oli juuri valmistettu 200-kertaisena kanta-liuoksena lisäämällä 9, 9 M H2O2 sekoituksessa olevaan 0,2 M pelkistyneeseen glutationiliuokseen ennen lisäämistä puskuriin ; a.
i : Kun syklinen laskostusmenettely oli valmis, psoriasiinifuusio- i : proteiini eluoitiin Ni2+NTA-agaroosipylväästä puskurilla, joka sisälsi 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8. Ni2+NTA- * agaroosipylvääseen aggregoitunut ja sakkautunut fuusioproteii- t · . ni eluoitiin puskurilla B.
Noin 95% fuusioproteiinimateriaalista eluoitui ei-denaturoi - 1 valla eluointipuskurilla. Pelkistämättömän SDS-PAGE-analyysin • perusteella 75% liukoisesta fuusioproteiinimateriaalista > · . “·. esiintyi monomeerisena, mistä saatiin laksostamismenettelylle kokonaistehokkuus noin 70%. Aikaisemmin kuvatun uudelleen-laskostusmenettelyn tehokkuuden ihmisen yhdistelmäpsoriasiinin tuottamisessa (Hoffman et ai., 1994) arvioitiin olevan alle 25%.
113272 98
Psoriasiinifuusioproteiini katkaistiin FXÄ: 11a moolisuhteessa 100: 1 48 tunnin ajan huoneenlämmössä. Kun näyte oli geelisuoda-tettu Sephadex G-25: n läpi puskuriin, joka sisälsi 20 mM Na-asetaattia pH 5 ja 20 mM NaCl, proteiininäyte vietiin S-Sepharose-ioninvaihtopylvääseen (Pharmacia). Monomeerinen yhdistelmäpsoriasiini eluoitiin 5:llä pylvään tilavuudella lineaarigradientilla 20 mM Na-asetaatti pH 5, 20 mM NaCl - 0, 5 M NaCl. Monomeerinen psoriasiini eluoitui 150 mM NaCl:ssa. Dimeeriset ja moniosaisemmat psoriasiinimultimeerit sekä katkeamaton fuusioproteiini eluoituivat gradientin myöhemmässä vaiheessa. Fraktiot, jotka sisälsivät puhdistunutta yhdistelmä-proteiinia, geelisuodatettiin Sephadex G25:ssä puskuriin, joka sisälsi 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,4 ja varastoitiin 4* C: ssä.
Esimerkki 12
Arviointimenettely, jolla testataan tioliyhdisteiden sopivuutta käytettäviksi pelkistävinä tekijöinä syklisessä uudelleen-laskostamisessa ja optimipitoisuuksien määritys denaturoiville ja disulfideja uudelleen järjestäville tekijöille syklisten uudelleenlaskostamismenettelyjen optimoimiseksi
Oikein laskostuneen syklisestä laskostuksesta saatavan proteii-.* .’ nin saannon parantamiseksi tuottavien kierrosten määrä olisi S i maksimoitava (katso keksinnön yhteenveto). Tuottavat kierrok- i :· set tunnetaan denaturaatiovaiheista, joissa väärin laskostunut proteiini, joka on joutumassa lopullisesti aggregoituviin I (dead-end aggregate) konformaatiotiloihin, otetaan talteen . ·;*; laskostumattomaan konformaatiotilaan ja samalla suurin osa jo oikein laskostuneesta proteiinista jää konformaatiotiloihin, ·/ joista se voi nopeasti siirtyä uudelleenlaskostuneeksi kier-1 ·>' roksen uudelleenlaskostusvaiheen aikana.
f »
Useiden disulfidisidoksia sisältävien proteiinien, kuten Pami kroglobulii nin, tiedetään laskostuvan hyvin tehokkaasti (>95%) altistettaessa suurille pitoisuuksille pelkistäviä tekijöitä, jos niiden disulfidisidokset ovat pysyneet muuttumattomina.
113272 99 Tämä esimerkki kuvaa kuinka tioliyhdisteen sopivuutta syklisessä uudelleenlaskostuksessa käytettäväksi voidaan arvioida sen perusteella, kuinka se kykenee erottamaan oikeat disulfidi-sidokset vääristä, ja kuinka voidaan optimoida denaturointi-vaiheissa käytettävän denaturoivan tekijän ja/tai pelkistävän tekijän pitoisuudet tuottavien kierrosten määrän maksimoimiseksi. Mallijärjestelmäksi valitsimme seoksen ihmisen puhdistetun yhdistelmä-Ba-mikroglobuliinin mono-, di- ja multimee-rimuotoja. Erityisenä tarkoituksenamme oli analysoida ihmisen 82-mikroglobuliinin erilaisten topologisten muotojen vakautta viidellä erilaisella pelkistävällä tekijällä pelkistämistä vastaan useissa eri pelkistävän tekijän pitoisuuksissa.
Ihmisen Ba-mikroglobuliini (tuotettu esimerkissä 13 kuvatulla tavalla) puskurissa 6 M guanidiinikloridi, 50 mM Tris-HCl, 10 mM 2-merkaptoetanoli, pH 8 geelisuodatettiin denaturoimattomaan puskuriin (50 mM Tris-HCl, 0, 5 M NaCl pH 8). Vain osa näytteen proteiinista oli liukoista ei- denaturoivaan puskuriin. 48 tunnin ilmalle altistuksen jälkeen proteiiniliuos näytti samealta. Pelkistämätön SDS- PAGE-analyysi osoitti, että suurin osa proteiinista oli hapettunut multimeerisiin . , muotoihin ja vain pieni osa oli hapettunutta ja monomeeristä ;1 (kuvio 27, raita 1).
: Proteiiniliuos jaettiin eriin useisiin putkiin ja niihin lisättiin eri määriä ureaa, kun taas proteiini- ja suolapitoi- : suudet pidettiin vakiotasolla.
Pelkistävää tekijää, joko glutationia, kysteiinietyyliesteriä, N-asetyyli-L-kysteiiniä, merkaptosukkinaattia tai 2-merkapto- i : ;· etanolia lisättiin proteiininäytteisiin, joissa oli erilaisia : ·: ureapitoisuuksia. Kutakin pelkistävää tekijää lisättiin siten, että lopullinen konsentraatio oli 4 mM. Proteiininäytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä 10 min, ja sitten vapaat tioli-ryhmät suojattiin lisäämällä jodoasetaattia, kunnes sen pitoisuus oli 12 mM. Lopuksi proteiininäytteet analysoitiin pelkistämättömällä SDS-PAGE:11a (kuviot 27 - 32). Ei-pelkis- «o 113272 tävässä SDS-PAGE: ssa käytettyjen koenäytteiden koostumukset sekä tulokset esitetään jäljempänä seuraavissa taulukoissa. Riveillä, jotka kuvaavat valitun pelkistävän tekijän kykyä pelkistää disulfidisidoksia, merkintä "+++" tarkoittaa hyvää kykyä, "++" tarkoittaa keskinkertaista kykyä, "+" tarkoittaa heikkoa kykyä, kun taas merkinnän puuttuminen osoittaa, että mitattavissa olevaa vaikutusta ei havaittu.
• · • · i : t ; : I · * » * · 1 · < k i : I t »
Fig. 27: ssä esitetyn SDS-PAGE: n näytteiden koostumus
Testi no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ιοί 113272 μΐ prote- 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 iiniliuos μΐ pus- 160 160 140 120 100 80 70 60 50 40 20
kuri A
μΐ pus- 0 0 20 40 60 80 90 100 110 120 140
kuri B
μΐ GSH 04444444444 M urea 00 1 2 3 4 4, 55 5, 5 6 7 Väärien + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ disulfidi- siltojen vähentämis - kyky
Oikeiden + +++ disulfidi-siltoj en vähentämis-: kyky .‘ Puskuri A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl _ Puskuri B: 10 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl GSH: 0, 2 M glutationi ; ’ : Proteiiniliuos: 2 mg/ml hPzm, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl * » » i : I ‘ * « · » ·
Fig. 28:ssa esitetyn SDS-PAGE: n näytteiden koostumus
Testi no. 1 234 5 6 7 89 102 113272 μΐ proteiini- 36 36 36 36 36 36 36 36 36 liuos μΐ pus- 160 160 140 120 100 80 60 40 20
kuri A
μΐ pus- 0 0 20 40 60 80 100 120 140
kuri B
μΐ CE 044444444 M urea 001234567 Väärien ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ disulfidi- siltoj en vähentämis- kyky
Oikeiden ++ +++ +++ di s ulf i di- siltojen vähentämis - kyky
Puskuri A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl
Puskuri B: 10 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl CE: 0,2 M L-kysteiinietyyliesteri , Proteiiniliuos: 2 mg/ml hBam, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl tr 1 ! : : » i t
t I
Fig. 29: ssä esitetyn SDS-PAGE: n näytteiden koostumus
Testi no. 123456789 103 113272 μΐ proteiini- 36 36 36 36 36 36 36 36 36 liuos μ.1 pus- 160 160 140 120 100 80 60 40 20
kuri A
Ui pus- 0 0 20 40 60 80 100 120 140
kuri B
μΙΜΕ 04444 4444 M urea 001234567 Väärien ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ disulfidi- siltoj en vähentämis- kyky
Oikeiden + ++ +++ +++ disulfidi- siltoj en vähentämis - kyky * 1
Puskuri A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl . Puskuri B: 10 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ME: 0, 2 M merkaptoetanoli
Proteiiniliuos: 2 mg/ml hBam, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl r · f * - « t I « « * i t I j $ » f * * » f * * * t * t t t * % « » I i 1 ' * 104 113272
Fig. 30:ssa esitetyn SDS-PAGE: n näytteiden koostumus Testi no. 1234 5 6789 μΐ proteiini- 36 36 36 36 36 36 36 36 36 liuos μΐ pus- 160 160 140 120 100 80 60 40 20
kuri A
μΐ pus- 0 0 20 40 60 80 100 120 140
kuri B
μΐ MSA 044444444 M urea 001234567 Väärien ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ disulfidi- siltoj en vähentämis - kyky
Oikeiden ++ + + + +++ disulfidi- siltoj en , vähentämis- * kyky * -- — — — -- — _ — *
Puskuri A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl
Puskuri B: 10 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl MSA: 0,2 M merkaptosukkinaatti ' Proteiiniliuos: 2 mg/ml h02m, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl » * * f * ' *
! I
t * > # t 1 » S 1 I * » · } * * * t * I * !>·
Fig. 31:ssa esitetyn SDS-PAGE: n näytteiden koostumus
Testi no. 1 234 5 6 7 89 105 113272 μΐ proteiini- 36 36 36 36 36 36 36 36 36 liuos μΐ pus- 160 160 140 120 100 80 60 40 20
kuri A
μΐ pus- 0 0 20 40 60 80 100 120 140
kuri B
μΐ AC 044444444 M urea 001234567 Väärien + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ di s ui f i di - siltoj en vähentämis- kyky
Oikeiden + + + + + + + + + +++ disulfidi- siltoj en vähentämis- kyky
Puskuri A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl
Puskuri B: 10 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl AC: 0, 2 M N-asetyyli-L-kysteiini
Proteiiniliuos: 2 mg/ml hB^m, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl 02-m: n eri topologiset muodot voidaan erottaa ei-pelkistävällä SDS-PAGE-geelielektroforeesilla. Nopeimmin liikkuva juova edustaa hapettunutta monomeerista muotoa. Välittömästi tätä juovaa seuraa pelkistynyt 02-m hiukan pienemmällä liikkumisnopeudella, kun taas proteiinin multimeeriset muodot liikkuvat paljon hitaammin geelissä.
Tässä analyysissä kokeilemme kunkin viiden testattavan pelkis-täjän kykyä pelkistää Ba-mikroglobuliinin multimeeristen muotojen disulfidisidoksia pelkistämättä merkitsevästi mono-meerisen hapettuneen muodon oikein muodostunutta disulfidi-sidos ta.
,„β 113272 106
Analyysien (kuviot 27 - 32) tulokset ovat yhteenvetona seuraa-vat: N-asetyyi-L-kysteiini ja merkaptosukkinaatti ovat käytetyissä olosuhteissa olennaisesti kykenemättömiä erottamaan oikeita ja vääriä disulfidisidoksia. Glutationi, kysteiini-etyyliesteri ja 2-merkaptoetanoli pystyvät kukin - 10 minuutin aikana ja yksilöllisissä/ luonteenomaisissa ureakonsentraatio-alueissa - merkitsevästi pelkistämään multimeeristen muotojen disulfidisidoksia, kun taas suurin osa hapettuneesta monomeeri-sestä 0a-m:stä jää hapettuneeseen muotoon. Glutationilla on selvästi kyky selektiivisesti pelkistää vääriä disulfidisidoksia suuremmissa ureapitoisuuksissa kuin kysteiinietyyliesteri ja 2-merkaptoetanoli, ja siksi glutationi olisi testatusta tiolivalikoimasta ihmisen 02-mikroglobuliinin sykliseen laskostamiseen valittava pelkistäjä. Näiden kokeiden seurauksena esimerkissä 13 käytettävän laskostusmenettelyn pelkistävän puskurin B ureapitoisuus pienennettiin 8 M: sesta (esimerkki 1) 6 M: seksi, minkä ansiosta ihmisen 02-mikroglobuliinin kokonaislaskostumissaanto parani 53 %: sesta 87 %: seksi.
Esimerkki 13
Ihmisen puhdistetun 02-mikroqlobuliinin uudelleenlaskostami-nen: vertaileva analyysi kolmesta uudelleenlaskostamismenette-lystä
Seuraava koesarja tehtiin, jotta saataisiin vertailukelpoista kvantitatiivista tietoa kierrättämisen (syklisyyden) tärkeyden arvioimiseksi laskostusmenettelyssä verrattuna yksinkertaisiin laskostamismenettelyihin, joissa käytetään vaiheittaista (stepwise) tai asteittaista (gradual) yhdessä ajossa (one-pass) siirtymistä voimakkaasti denaturoivista olosuhteista denaturoimattomiin ja ei-pelkistäviin olosuhteisiin.
Puhdistettu uudelleenlaskostettu ihmisen yhdistelmä-02-mikro-globuliinifuusioproteiini, joka oli saatu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, pelkistettiin ja denaturoitiin, jotta saatiin lähtöaineita, joissa ei ole epäpuhtauksia, kuten proteo-lyyttisen hajottamisen tuotteita tai pieniä fraktioita palautumattoman hapettumisen tai muun kemiallisen derivatisoitumisen vahingoittamaa fuusioproteiinia.
ιοί 113272
Ensimmäisessä vaiheessa käytettiin esimerkissä 12 kuvattua optimointimenettelyä syklisen uudelleenlaskostusmenettelyn muuntamiseksi tuottavien kierrosten lukumäärän lisäämiseksi. Optimoitu uudelleenlaskostusprosessi oli sama kuin esimerkissä 1 kuvattu, niin myös puskurit ja muut tutkimuksen parametrit, paitsi että puskuri B on näissä tutkimuksissa 6 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl, 4 mM glutationia.
Kolme erää puhdasta fuusioproteiinia uudelleenlaskostettiin kiinnittyneinä Ni*+:llä varattuun NTA-agaroosiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla käyttäen tässä kuvattua uutta puskuri B:n koostumusta. Yhdelle erälle tehtiin esimerkissä 1 kuvatun mukainen puskurikierrätys, erällä kaksi kierrätys korvattiin monotonisella lineaarisella puskurigradientilla (100% B - 0% B 24 tunnin kuluessa) ja erällä kolme vaihegradientilla (100% B - 0% B yhdellä askeleella, minkä jälkeen 0% puskuria B 24 tunnin ajan). Kussakin uudelleenlaskostamiskokeessa kaikki polypeptidimateriaali kerättiin esimerikissä 1 kuvatulla tavalla liukoisena, ei-denaturoivissa oloissa eluoituvana fraktiona, ja liukenemattomana jäännös fraktiona, joka eluoitui ainoastaan denaturoivissa ja pelkistävissä oloissa. Oikein laskostuneen fuusioproteiinin saannot mitattiin sitten kvantitatiivisella tiheydenmittausanalyysillä (Optical scanner HW ja GS-370 Densitometric Analysis SW -pakkaus, Hoeffer Scientific, Kalifornia, USA) Coomassiella värjätyistä SDS-PAGE-geeleistä, joilla oli erotettu sopivasti laimennettuja eriä liukoisista ja liukenemattomista fraktioista pelkistävissä tai pelkistämät-tömissä olosuhteissa, kuten on tarpeen oikean disulfidisidok-sen sisältävän monomeerin erottamiseksi liukoisista polymeereistä liukoisissa fraktioissa. Kun tarvittiin luotettavaa densitometristä tietoa geeliraidan sekä voimakkaista että heikoista juovista, skannattiin ja analysoitiin useampia näyte-laimennoksia, jotta saatiin mittaussarjoja eri pitoisuuksista (to obtain rescaled data sets).
Tutkimuksien yksityiskohtia ja tulokset
Puhdistettu denaturoitu ja pelkistettu fuusioproteiini: 113272 108
Erä ihmisen Pa-mikroglobuliini-fuusioproteiinia uudelleen], as -kostettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. 96% fuusioproteii-nista saatin talteen liukoisessa fraktiossa (kuvio 32, raidat 2 - 5). 56% tästä liukoisesta fraktiosta oli monomeerisessä, disulfidisidoksisessa muodossa. Näin ollen saavutettu kokonais-1askostumistehokkuus oli 53%. Monomeerinen fuusioproteiini puhdistettiin multimeereistä ioninvaihtokromatografialla S-Sepharosessa (Pharmacia, Ruotsi). Uudelleenlaskostamisen jälkeen saatu liukoinen fraktio geelisuodatettiin Sephadex G-25:ssä (Pharmacia, Ruotsi) puskuriin, joka sisälsi 5 mM NaCl ja 5 mM Tris-HCl pH 8, laimennettiin kaksinkertaiseen tilavuuteen vedellä ja vietiin sitten S-Sepharose-pylvääseen, jota eluoitiin sitten gradienttia käyttäen (5 pylvään tilavuutta, 2,5 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM NaCl - 25 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl). Monomeerinen, oikein laskostunut >95% puhtaaksi puhdistettu fuusioproteiini (kuvio 32, raidat 6 ja 7) tehtiin sitten 6 M: seksi guanidiinivetykloridisn suhteen ja 0,1 M: seksi DTE: n suhteen, geelisuodatettiin puskuriin, joka sisälsi 8 M ureaa, 50 mM Tris-HCl pH 8, IM NaCl ja 10 mM 2-merkaptoetanolia ja jaettiin sitten eriin käytettäväksi jäljempänä kuvatun laskostusmenettelyn lähtömateriaalina.
Puhdistetun fuusioproteiinin syklinen uudelleenlaskostus Erä denaturoitua, pelkistynyttä fuusioproteiinia vietiin Ni"- + :llä varattuun NTA-pyl vääseen, joka huudeltiin sitten yhdellä pylvään tilavuudella puskuria, joka sisälsi 6 M guanidiinivetykloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10 mM 2-merkaptoetanolia.
Fuusioproteiiniin kohdistettiin sitten taulukossa 1 esitetty puskurikierrätys käyttäen puskuria A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl ja 3,2 mM/0,4 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia ja puskuria B: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl, 6 M ureaa ja 4 mM pelkistynyttä glutationia. Kun puskurikierrätys oli tehty, fuusioproteiini kerättiin kvantitatiivisesti liukoisessa muodossa eluoimalla pylvästä puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ja 20 mM EDTA. 87% saatiin oikeassa 113272 109 monomeerisessä disulfidisidoksisessa muodossa (kuvio 32, raidat 8 ja 9).
Puhdistetun fuusioproteiinin kerääminen lineaarigradientilla Erä denaturoitunutta, pelkistynyttä fuusioproteiinia vietiin Ni*+: 11a varattuun NTA-pylvääseen, jota sitten huuhdeltiin yhdellä pylvään tilavuudella puskuria, joka sisälsi 6 M guanidiinivetykloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10 mM 2-merkaptoetanolia, mitä seurasi 1 pylvään tilavuus puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl, 6 M ureaa ja 4 mM pelkistynyttä glutationia.
24 tunnin lineaarigradienttia 100% B - 100% A käytettiin sitten 2 ml/min, käyttäen puskuria A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ja 3,2 mM/0,4 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia ja puskuria B: 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl, 6 M ureaa ja 4 mM pelkistynyttä glutationia. Kun gradientti oli käytetty, liukoinen fuusioproteiinifraktio eluoitiin puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ja 20 mM EDTA. Jäl jelle jäänyt liukenematon fraktio uutettiin pylväästä puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, IM NaCl, 8 M ureaa, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 20 mM EDTA.
48% fuusioproteiinista saatiin kerättyä liukoiseen fraktioon ja 60% liukoisesta fraktiosta saatiin talteen oikeassa monomeerisessä disuifidisidoksen sisältävässä muodossa. Saavutettu laskostumisen kokonaistehokkuus oli siis 29% (kuvio 33, raidat 5 - 7).
Puhdistetun fuusioproteiinin uudelleenlaskostus puskurivai-heella
Erä denaturoitua, pelkistynyttä fuusiproteiinia vietiin Ni-+:llä varattuun NTA-pylvääseen, joka huuhdeltiin sitten yhdellä pylvään tilavuudella puskuria, joka sisälsi 6 M guanidiinivetykloridia, 50 mM Tris-HCl pH 8 ja 10 mM 2-merkaptoetanolia.
113272 110
Puskuri, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ja 3,2 mM/0, 4 mM pelkistynyttä/hapettunutta glutationia vietiin sitten pylvääseen nopeudella 2 ml/min 24 tuntia ennen fuusio-proteiinin liukoisen fraktion keräämistä puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 5 M NaCl ja 20 mM EDTA. Jäl jelle jäänyt liukenematon fraktio uutettiin pylväästä puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl pH 8, IM NaCl, 8 M urea, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 20 mM EDTA.
34% fuusioproteiinista saatiin kerättyä liukoisessa fraktiossa ja 28% liukoisesta fraktiosta saatiin kerättyä oikeassa monomeerisessä, disulfidisidoksisessa muodossa. Saatu laskos-tuksen kokonaistehokkuus oli siten 9. 5% (kuvio 33, raidat 1 - 3).
J ohtopäätöks et
Yhteenvetona, ihmisen p2-mikroglobuliinia malliproteiinina käytettäessä voidaan todeta, että (a) suoraviivainen puskurin optimointi ja entistä parempi fuusioproteiinin puhdistaminen ennen syklistä uudelleenlaskostusta kasvatti uudelleenlaskos-tussaantoa merkitsevästi (53%:sta 87%: iin) ja (b) progressiivinen denaturointi - renaturointi -kierrätys on yksivaiheista uudelleenlaskostamista moninkertaisesti parempi (87% versus 29% tai 9,5% saanto) muuten verrattavissa koeolosuhteissa.
113272
Ill
Kirj allisuusviitteet:
Christensen, J.H., Hansen, P.K., Lillelund, 0., and Thager-sen, H.C. (1991) . Sequence-specific binding of Che N-terminal three-finger fragment of Xenopus transcription factor IIIA to the internal control region of a 5S RNA gene. FEBS Letters, 295: 181 - 184.
Dalbage, H., Dahl, H.-H., M., Pedersen, J., Hansen, J., W., and T., Kristensen (1987). A Novel Enzymatic Method for Production of Authentic hGH From an Eschericia coli Produced hGh-Precursor. Bio/Technology, 5: 161-164.
Datar, R., V., Cartwright, T., and C.-G. Rosen (1993). Process Economics of Animal Cell and Bacterial Fermentations: A Case Study Analysis of Tissue Plasminogen Activator.
Bio/Technology, 11: 349 - 357.
Herz, J., Hanmann, U., Rogne, S., Myklebost, 0., Gausepohl, H.( and Stanley, K.K. (1988), Surface location and high affinity for calcium of a 500 Jed liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological : ·* role as lipoprotein receptor. EMBO J., 7: 4119-4127.
* · * *·· Hoffmann, H. J., Olsen, E., Etzerodt, M., Madsen, P., Theger- : sen, H. C., Kruse, T. , and Celis J. E. (1994). Psoriasin : Binds Calcium and Is Differentially Regulated With Respect to
Other Members of the S100 Protein Family. J. Dermatol.
»
Invest. In press.
i » » * *
Hochuli, E., W. Bannwarth, H. Dobeli, R. Gentz, and D. Stu-i' ber. 1988. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent.
Bio/Technology, 6: 1321-1325.
* I I
* · * ,··*. Holliger., P., Prospero, T., and G. Winter (1993). "Diabo-dies": Small bivalent and bispecific antibody fragments.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444 - 6448.
113272 112
Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning·. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Nagai, K., and H.C. Thagersen. 1987. Synthesis and Sequence-Specific Proteolysis of Hybrid Proteins Produced in Escherichia coli. Methods in Enzymology, 152: 461-481.
Nagai, K., Nakaseko, Y., Nasmyth, K., and Rhodes, D. (1988). Zinc-finger motifs expressed in E. coli and folded in vitro direct specific binding to DNA. Nature, 332: 284 - 286.
Nykjar A., Petersen C.M., Mailer B., Jensen P.K., Moestrup S.K., Holtet T.L., Etzerodt M., Thagersen H.C., Munch M., Andreasen P.A., and Gliemann J. (1992). Purified ^-Macro-globulin Receptor/LDL Receptor-related Protein Binds Urokinase-Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 Complex. J. Biol. Chem. 267: 14543-14546.
Rathjen, D. et al. (1991), Mol. Immunol. 28, p29.
Rathjen, D. et al. (1992), Brit. J. Cancer 65, 852-856.
» · t * » I · » :*·*: Saiki, R.K., Gelfant, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higu- ! chi, R., Horn, G.T., Mullis, K. B., and Erlich, H. A. (1988).
•j*. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487 -491.
I » * · .1 Studier, F.W. and Moffat, B.A. 1986. Use of Bacteriophage T7 ;* RNA Polymerase to Direct Selective High-level Expression of
Cloned Genes. J. Mol. Biol., 189 : 113 - 130.
» I * > » * · . ]·. The Regents of the University of California. Enterokinase-- • » · cleavable linker sequence. EP 035384.
• I
• · · 5C29PCT-sel-95.07/Denzyme/03..11/sivut 113-156 113 113272
SEKVENSSILISTAUS
(1) YLEINEN INFORMAATIO: (i) HAKIJA:
(A) NIMI: Denzyme ApS
(B) KATU: Gustav Wieds Vej 10
(C) KAUPUNKI: Aarhus C
(E) MAA: Denmark (F) POSTIKOODI (ZIP): 8000 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Parannettu proteiinien laskostamismene- telmä (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 58 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 1: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 1554 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPI: cDNA (lii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ
(iii) ANTI-SENSE: EI
* · (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Bos taurus • * * ! · jv, (ix) PIIRTEET:
: (A) NIMI/AVAIN: CDS
; (B) SIJAINTI: 76..1551 • * · · V*: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 1: AGCCTGGGCG AGCGGACCTT GCCCTGGAGG CCTGTTGCGG CAGGGACTCA CGGCTGTCCT 60 f CGGAAGGGCC CCACC ATG GCG GGC CTG CTG CAT CTC GTT CTG CTC AGC ACC 111
Met Ala Gly Leu Leu His Leu Vai Leu Leu Ser Thr 1 5 10 • » » I t GCC CTG GGC GGC CTC CTG CGG CCG GCG GGG AGC GTG TTC CTG CCC CGG 159
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Arg Pro Ala Gly Ser Vai Phe Leu Pro Arg 15 20 25 > · · ;··*. GAC CAG GCC CAC CGT GTC CTG CAG AGA GCC CGC AGG GCC AAC TCA TTC 207 *“ Asp Gin Ala His Arg Vai Leu Gin Arg Ala Arg Arg Ala Asn Ser Phe 30 35 40 113272 114 TTG GAG GAG GTG AAG CAG GGA AAC CTG GAG CGA GAG TGC CTG GAG GAG 255
Leu Glu Glu Val Lys Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu 45 50 55 60 GCC TGC TCA CTA GAG GAG GCC CGC GAG GTC TTC GAG GAC GCA GAG CAG 303
Ala Cys Ser Leu Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ala Glu Gin 65 70 75 ACG GAT GAA TTC TGG AGT AAA TAC AAA GAT GGA GAC CAG TGT GAA GGC 351
Thr Asp Glu Phe Trp Ser Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Gly 80 85 90 CAC CCG TGC CTG AAT CAG GGC CAC TGT AAA GAC GGC ATC GGA GAC TAC 399
His Pro Cys Leu Asn Gin Gly His Cys Lys Asp Gly lie Gly Asp Tyr 95 100 105 ACC TGC ACC TGT GCG GAA GGG TTT GAA GGC AAA AAC TGC GAG TTC TCC 44 7
Thr Cys Thr Cys Ala Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Phe Ser 110 115 120 ACG CGT GAG ATC TGC AGC CTG GAC AAT GGA GGC TGC GAC CAG TTC TGC 495
Thr Arg Glu lie Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Asp Gin Phe Cys 125 130 135 140 AGG GAG GAG CGC AGC GAG GTG CGG TGC TCC TGC GCG CAC GGC TAC GTG 543
Arg Glu Glu Arg Ser Glu Val Arg Cys Ser Cys Ala His Gly Tyr Val 145 150 155 CTG GGC GAC GAC AGC AAG TCC TGC GTG TCC ACA GAG CGC TTC CCC TGT 591
Leu Gly Asp Asp Ser Lys Ser Cys Val Ser Thr Glu Arg Phe Pro Cys 160 165 170 :. : GGG AAG TTC ACG CAG GGA CGC AGC CGG CGG TGG GCC ATC CAC ACC AGC 639
Gly Lys Phe Thr Gin Gly Arg Ser Arg Arg Trp Ala lie His Thr Ser ':··* 175 180 185 jv, GAG GAC GCG CTT GAC GCC AGC GAG CTG GAG CAC TAC GAC CCT GCA GAC 687 ·* .* Glu Asp Ala Leu Asp Ala Ser Glu Leu Glu His Tyr Asp Pro Ala Asp f .·. 190 195 200 t » I · CTG AGC CCC ACA GAG AGC TCC TTG GAC CTG CTG GGC CTC AAC AGG ACC 735
Leu Ser Pro Thr Glu Ser Ser Leu Asp Leu Leu Gly Leu Asn Arg Thr 205 210 215 220 GAG CCC AGC GCC GGG GAG GAC GGC AGC CAG GTG GTC CGG ATA GTG GGC 783 • t Glu Pro Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ser Gin Val Val Arg lie Val Gly ;·: 225 230 235 • GGC AGG GAC TGC GCG GAG GGC GAG TGC CCA TGG CAG GCT CTG CTG GTC 831
Gly Arg Asp Cys Ala Glu Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Val 240 245 250 '··* AAC GAA GAG AAC GAG GGA TTC TGC GGG GGC ACC ATC CTG AAC GAG TTC 879
Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Asn Glu Phe 113272 115 255 260 265 TAC GTC CTC ACG GCT GCC CAC TGC CTG CAC CAG GCC AAG AGG TTC ACG 927
Tyr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu His Gin Ala Lys Arg Phe Thr 270 275 280 GTG AGG GTC GGC GAC CGG AAC ACA GAG CAG GAG GAG GGC AAC GAG ATG 975
Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Asn Glu Met 285 290 295 300 GCA CAC GAG GTG GAG ATG ACT GTG AAG CAC AGC CGC TTT GTC AAG GAG 1023 Ala His Glu Val Glu Met Thr Val Lys His Ser Arg Phe Val Lys Glu 305 310 315 ACC TAC GAC TTC GAC ATC GCG GTG CTG AGG CTC AAG ACG CCC ATC CGG 1071
Thr Tyr Asp Phe Asp lie Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro lie Arg 320 325 330 TTC CGC CGG AAC GTG GCG CCC GCC TGC CTG CCC GAG AAG GAC TGG GCG 1119
Phe Arg Arg Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Lys Asp Trp Ala 335 340 345 GAG GCC ACG CTG ATG ACC CAG AAG ACG GGC ATC GTC AGC GGC TTC GGG 1167
Glu Ala Thr Leu Met Thr Gin Lys Thr Gly He Val Ser Gly Phe Gly 350 355 360 CGC ACG CAC GAG AAG GGC CGC CTG TCG TCC ACG CTC AAG ATG CTG GAG 1215
Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Leu Ser Ser Thr Leu Lys Met Leu Glu 365 370 375 380 GTG CCC TAC GTG GAC CGC AGC ACC TGT AAG CTG TCC AGC AGC TTC ACC 1263 - · Val Pro Tyr Val Asp Arg Ser Thr Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Thr t ί 385 390 395 • · V,· ATT ACG CCC AAC ATG TTC TGC GCC GGC TAC GAC ACC CAG CCC GAG GAC 1311 • · He Thr Pro Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Gin Pro Glu Asp ·· ·, 400 405 410 • » : GCC TGC CAG GGC GAC AGT GGC GGC CCC CAC GTC ACC CGC TTC AAG GAC 13 59 V',’ Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp v : 415 420 425 ACC TAC TTC GTC ACA GGC ATC GTC AGC TGG GGA GAA GGG TGC GCG CGC 1407
Thr Tyr Phe Val Thr Gly He Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg \ ; 430 435 440 * AAG GGC AAG TTC GGC GTC TAC ACC AAG GTC TCC AAC TTC CTC AAG TGG 1455 Lys Gly Lys Phe Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Asn Phe Leu Lys Trp 445 450 455 460 « · , ;.t ATC GAC AAG ATC ATG AAG GCC AGG GCA GGG GCC GCG GGC AGC CGC GGC 1503 :.l.: He Asp Lys He Met Lys Ala Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly .**·. 465 470 475
• I
tit CAC AGT GAA GCC CCT GCC ACC TGG ACG GTC CCG CCG CCC CTC CCC CTC 1551 His Ser Glu Ala Pro Ala Thr Trp Thr Val Pro Pro Pro Leu Pro Leu 113272 116 480 485 490 TAA 1554 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 2: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 492 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSINKUVAUS: SEK ID NO: 2:
Met Ala Gly Leu Leu His Leu Vai Leu Leu Ser Thr Ala Leu Gly Gly 15 10 15
Leu Leu Arg Pro Ala Gly Ser Vai Phe Leu Pro Arg Asp Gin Ala His 20 25 30
Arg Vai Leu Gin Arg Ala Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Vai 35 40 45
Lys Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu Ala Cys Ser Leu 50 55 60
Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu Asp Ala Glu Gin Thr Asp Glu Phe 65 70 75 80
Trp Ser Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Gly His Pro Cys Leu 85 90 95
Asn Gin Gly His Cys Lys Asp Gly Ile Gly Asp Tyr Thr Cys Thr Cys ' 100 105 110 * · , Ala Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Phe Ser Thr Arg Glu Ile : : 115 120 125 * Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Asp Gin Phe Cys Arg Glu Glu Arg ·* 130 135 140
Ser Glu Vai Arg Cys Ser Cys Ala His Gly Tyr Vai Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160
Ser Lys Ser Cys Vai Ser Thr Glu Arg Phe Pro Cys Gly Lys Phe Thr 165 170 175 < » · ·
Gin Gly Arg Ser Arg Arg Trp Ala Ile His Thr Ser Glu Asp Ala Leu 180 185 190
Asp Ala Ser Glu Leu Glu His Tyr Asp Pro Ala Asp Leu Ser Pro Thr 195 200 205 • ·
Glu Ser Ser Leu Asp Leu Leu Gly Leu Asn Arg Thr Glu Pro Ser Ala 210 215 220 117 113272
Gly Glu Asp Gly Ser Gin Vai Vai Arg Ile Val Gly Gly Arg Asp Cys 225 230 235 240
Ala Glu Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Val Asn Glu Glu Asn 245 250 255
Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Asn Glu Phe Tyr Val Leu Thr 260 265 270
Ala Ala His Cys Leu His Gin Ala Lys Arg Phe Thr Val Arg Val Gly 275 280 285
Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Asn Glu Met Ala His Glu Val 290 295 300
Glu Met Thr Val Lys His Ser Arg Phe Val Lys Glu Thr Tyr Asp Phe 305 310 315 320
Asp lie Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro lie Arg Phe Arg Arg Asn 325 330 335
Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Lys Asp Trp Ala Glu Ala Thr Leu 340 345 350
Met Thr Gin Lys Thr Gly lie Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu 355 360 365
Lys Gly Arg Leu Ser Ser Thr Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val 370 375 380
Asp Arg Ser Thr Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Thr lie Thr Pro Asn • 385 390 395 400 ’·* Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Gin Pro Glu Asp Ala Cys Gin Gly . 405 410 415 : .* Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val : 420 425 430 I ' » * » 1 » : : : Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Phe 435 440 445 e.'. Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Asn Phe Leu Lys Trp lie Asp Lys lie 450 455 460 * ·
Met Lys Ala Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly His Ser Glu Ala ·:*! 465 470 475 480 • • * Pro Ala Thr Trp Thr Val Pro Pro Pro Leu Pro Leu 485 490 (i) SEKVENSSIN PIIRTEET: ’···* (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 3: 118 113272 (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 3: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGAATCCAG CGTACTCCAA AG 42 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 4: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 4: GCGAAGCTTG ATCACATGTC TCG 23 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 5: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 44 emäsparia . . (B) TYYPPI: nukleiinihappo • (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; ·,. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 5: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGAATCCAG AAAACCCCTC AAAT 44 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 6: : (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: !ι>(ί (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·;·: (C) SÄIKEISYYS: yksi ii(<. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) .···. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 6: • · * » » GCGAAGCTTA CATGTCTCGA TC 22 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 7: 119 113272 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (DJ TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 7: CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GTTCCCAACC ATTCCCTTAT 40 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 8: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 8: CCGAAGCTTA GAAGCCACAG CTGCCC 26 . (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 9: * · - (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 39 emäsparia : . (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi : * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN TYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 9: I'·’; CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGTACTCG CGGGAGAAG 39 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 10: » · (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ' * (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 MOLEKYYLITYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 10: 120 113272 CGACCGAAGC TTCAGAGTTC GTTGTG 26 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 11: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) LENGTH: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 11: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGCTATC GACGCCCCTA AG 42 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ ID NO: 12: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 12: : : CGACCGAAGC TTATCGGCAG TGGGGCCCCT 30 i' *· (2) INFORMAATIO FOR SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 13: : C (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: : (A) PITUUS: 2 9 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo v : (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I'·': (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 13: :··: CGACCGAAGC TTAGGCCTTG CAGGAGCGG 2 9 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 14: * » · > «
< I I
(i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: *··’ (A) PITUUS: 32 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi »1 113272 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 14: CGACCGAAGC TTACTTCTTG CATGACTTCC CG 32 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 15: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 15: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGGCACC AACAAATGCC GG 42 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 16: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen : ; : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) ’ .'·* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 16: i ,·. CGACCGAAGC TTAGTCCAGG CTGCGGCAG 29 • · ' (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 17: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 41 emäsparia : (B) TYYPPI: nukleiinihappo ' (C) SÄIKEISYYS: yksi : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 17: l.: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTGCCT CCACCCCAGT G 41 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 18: 122 113 2 7 2 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 29 emäsparit (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 18: CGACCGAAGC TTACTGGTCG CAGAGCTCG 29 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 19: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 46 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 19: CCTTGATCAA TCGAGGGTAG GGGTGGTCAG TGCTCTCTGA ATAACG 46 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 20: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ; ·' (A) PITUUS: 29 emäsparia : : (B) TYYPPI: nukleiinihappo . (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; ·, (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 20: » t CGCAAGCTTA CTTAAACTCA TAGCAGGTG 2 9 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 21: ' » ·' (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ', (A) PITUUS: 44 emäsparia ' (B) TYYPPI: nukleiinihappo ____· (C) SÄIKEISYYS: yksi ‘ ' (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) » · '"** (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 21: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGCGGTG AATTCCTCTT GCCG 44 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 22: 123 113 2 7 2 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 22: CGACCGAAGC TTAGATGTGG CAGCCACGCT 30 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEQ ID NO: 23: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 42 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEYYLITTYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 23: CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTGTCC AACTGCACGG CT 42 : I (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 24: ! * (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: l ·· (A) PITUUS: 3 0 emäsparia : ·. (B) TYYPPI: nukleiinihappo • (C) SÄIKEISYYS: yksi : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen v : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 24: ' CGACCGAAGC TTAGATGCTG CAGTCCTCCT 31 ‘"i (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 25: _ 1 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 47 emäsparia .· (B) TYYPPI: nukleiinihappo : '·; (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 25: 113272 CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGAGTAAA TACAAAGATG GAGACCA 47 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 26: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 26: CGACCGAAGC TTACCAGGTG GCAGGGGCTT 30 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 27: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 62 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) : ·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 27: : *; CTGCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGAAAGTG TATCTCTCAT CAGAGTGCAA GACTGGGAAT GG 6 t ; ·. (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 28: * · : (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 33 emäsparia V : (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen '^ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 28: 1 > * · CGACCGAAGC TTATTCACAC TCAAGAATGT CGC 33 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 29: *···’ (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 41 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 125 113272 (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 29: CTGCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTCCAG GACTGCTACC AT 42 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 30: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 31 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 30: CGACCGAAGC TTACGCTTCT GTTCCTGAGC A 31 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 31: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 40 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi ; (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) i I''·. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 31: : CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGTCTACCTC CAGACATCCT 40 » ν’ί (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 32: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ; (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo • ,l (C) SÄIKEISYYS: yksi * , (D) TOPOLOGIA: lineaarinen » » · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) , *·, (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 32: » CCGAAGCTTC AAGCATTTCC AAGATC 2 6 * » (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 33: 113272 126 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 33: CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGGCGAGCCA CCAACCCAG 39 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 34: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 34: CCGAAGCTTA CACGATCCCG AACTG 25 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 35: ; (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ' (A) PITUUS: 38 emäsparia ; 1 (B) TYYPPI: nukleiinihappo ‘ ’* (C) SÄIKEISYYS: yksi j '· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i (ii) MOLEKYYLITYPPI: DNA (synteettinen) ' / (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 35: * · > CCGAGATCTA TCGAGGGTAG GCAGGTCAAA CTGCAGCA 38 f (2) INFORMAATIO SKEVENSSISTÄ SEK ID NO: 36: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ' "ί (A) PITUUS: 29 emäsparia , (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · ; ·. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 36: 113272 127 GCCAAGCTTA ATTCAGATCC TCTTCTGAG 29 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 37: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 37:
Gly Ser Ile Glu Gly Arg 1 5 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 38: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 38: . . Ile Glu Gly Arg i ί l * c i .. (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 39: : 1 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: • ; (A) PITUUS: 4 aminohappoa ' (B) TYYPPI: aminohappoa (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 39:
Tyr Trp Thr Asp ; 1 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 40: * ·’ (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 113272 128 (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 40:
Ile Gin Gly Arg 1 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 41: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 41:
Ala Glu Gly Arg 1 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 42: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa ; (B) TYYPPI: aminohappo i : (C) SÄIKEISYYS: yksi : L (D) TOPOLOGIA: lineaarinen j . (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi : ·: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 42:
Ala Gin Gly Arg : 1 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 43: » 1 SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 43:
Ile Cys Gly Arg (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 44: 113272 129 (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappo (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 44:
Ala Cys Gly Arg 1 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 45: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAU: SEK ID NO: 45:
Ile Met Gly Arg : : l I * j ·.. (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 46: > * ί D (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ; '· (A) PITUUS: 4 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo : (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi :j (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 46: U": Ala Met Gly Arg » · 1 V (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 47: S i t (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 6 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 113272 130 (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 47:
His His His His His His 1 5 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 48: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 15 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 48:
Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Glu Gly Arg 15 10 15 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 49: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 119 aminohappoa *, (B) TYYPPI: aminohappo : (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ‘ · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini : 1 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 49:
Met Ser Arg Ser Vai Ala Leu Ala Vai Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser V : 1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gin Arg Thr Pro Lys Ile Gin Vai Tyr Ser Arg jv: 20 25 30 ' His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Vai Ser 35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Vai Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60
Arg Ile Glu Lys Vai Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 »1 Π3272
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gin Pro Lys lie 100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 50: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 119 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 50:
Met Ala Arg Ser Vai Thr Leu Vai Phe Leu Vai Leu Vai Ser Leu Thr 15 10 15
Gly Leu Tyr Ala Ile Gin Lys Thr Pro Gin Ile Gin Vai Tyr Ser Arg 20 25 30
His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Vai Thr 35 40 45
Gin Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gin Met Leu Lys Asn Gly Lys 50 55 60 : Lys Ile Pro Lys Vai Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp ; 65 70 75 80 ; · Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp ; . 85 90 95 ; Thr Tyr Ala Cys Arg Vai Lys His Asp Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr 100 105 110
Vai Tyr Trp Asp Arg Asp Met 115 : V (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 51: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: . (A) PITUUS: 217 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi ’ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen < « I * · 1 MOLEKYYLITYYPPI:' proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 51: 113272 132
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin 35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60
Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys 85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gin Ser Trp 100 105 110
Leu Glu Pro Vai Gin Phe Leu Arg Ser Vai Phe Ala Asn Ser Leu Vai 115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Vai Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140
Glu Gly Ile Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 : : Thr Gly Gin Ile Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser . · 165 170 175 : His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe |v. 180 185 190 • · • Arg Lys Asp Met Asp Lys Vai Glu Thr Phe Leu Arg Ile Vai Gin Cys 195 200 205 • * · t * ·
Arg Ser Vai Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 52: ;·*: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 4544 aminohappoa * ‘ (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi :.· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 52: "«72
Met Leu Thr Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Ala Leu 15 10 15
Val Ala Ala Ala lie Asp Ala Pro Lys Thr Cys Ser Pro Lys Gin Phe 20 25 30
Ala Cys Arg Asp Gin lie Thr Cys lie Ser Lys Gly Trp Arg Cys Asp 35 40 45
Gly Glu Arg Asp Cys Pro Asp Gly Ser Asp Glu Ala Pro Glu lie Cys 50 55 60
Pro Gin Ser Lys Ala Gin Arg Cys Gin Pro Asn Glu His Asn Cys Leu 65 70 75 80
Gly Thr Glu Leu Cys Val Pro Met Ser Arg Leu Cys Asn Gly Val Gin 85 90 95
Asp Cys Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly Pro His Cys Arg Glu Leu Gin 100 105 110
Gly Asn Cys Ser Arg Leu Gly Cys Gin His His Cys Val Pro Thr Leu 115 120 125
Asp Gly Pro Thr Cys Tyr Cys Asn Ser Ser Phe Gin Leu Gin Ala Asp 130 135 140
Gly Lys Thr Cys Lys Asp Phe Asp Glu Cys Ser Val Tyr Gly Thr Cys 145 150 155 160 ; ·. Ser Gin Leu Cys Thr Asn Thr Asp Gly Ser Phe lie Cys Gly Cys Val '· · 165 170 175 » · , ' Glu Gly Tyr Leu Leu Gin Pro Asp Asn Arg Ser Cys Lys Ala Lys Asn ; ·· 180 185 190 • ·' Glu Pro Val Asp Arg Pro Pro Val Leu Leu lie Ala Asn Ser Gin Asn ; j 195 200 205 * lie Leu Ala Thr Tyr Leu Ser Gly Ala Gin Val Ser Thr lie Thr Pro 210 215 220 : Thr Ser Thr Arg Gin Thr Thr Ala Met Asp Phe Ser Tyr Ala Asn Glu 225 230 235 240
Thr Val Cys Trp Val His Val Gly Asp Ser Ala Ala Gin Thr Gin Leu 245 250 255 fill
Lys Cys Ala Arg Met Pro Gly Leu Lys Gly Phe Val Asp Glu His Thr , !·. 260 265 270 * * · lie Asn lie Ser Leu Ser Leu His His Val Glu Gin Met Ala lie Asp 275 280 285
Trp Leu Thr Gly Asn Phe Tyr Phe Val Asp Asp lie Asp Asp Arg lie 113272 134 290 295 300
Phe Vai Cys Asn Arg Asn Gly Asp Thr Cys Val Thr Leu Leu Asp Leu 305 310 315 320
Glu Leu Tyr Asn Pro Lys Gly lie Ala Leu Asp Pro Ala Met Gly Lys 325 330 335
Val Phe Phe Thr Asp Tyr Gly Gin lie Pro Lys Val Glu Arg Cys Asp 340 345 350
Met Asp Gly Gin Asn Arg Thr Lys Leu Val Asp Ser Lys lie Val Phe 355 360 365
Pro His Gly lie Thr Leu Asp Leu Val Ser Arg Leu Val Tyr Trp Ala 370 375 380
Asp Ala Tyr Leu Asp Tyr lie Glu Val Val Asp Tyr Glu Gly Lys Gly 385 390 395 400
Arg Gin Thr lie lie Gin Gly lie Leu lie Glu His Leu Tyr Gly Leu 405 410 415
Thr Val Phe Glu Asn Tyr Leu Tyr Ala Thr Asn Ser Asp Asn Ala Asn 420 425 430
Ala Gin Gin Lys Thr Ser Val lie Arg Val Asn Arg Phe Asn Ser Thr 435 440 445
Glu Tyr Gin Val Val Thr Arg Val Asp Lys Gly Gly Ala Leu His lie 450 455 460 ·''· Tyr His Gin Arg Arg Gin Pro Arg Val Arg Ser His Ala Cys Glu Asn ; 465 470 475 480 : ·· Asp Gin Tyr Gly Lys Pro Gly Gly Cys Ser Asp lie Cys Leu Leu Ala 485 490 495 : Asn Ser His Lys Ala Arg Thr Cys Arg Cys Arg Ser Gly Phe Ser Leu 500 505 510
Gly Ser Asp Gly Lys Ser Cys Lys Lys Pro Glu His Glu Leu Phe Leu 515 520 525
Val Tyr Gly Lys Gly Arg Pro Gly lie lie Arg Gly Met Asp Met Gly 530 535 540
Ala Lys Val Pro Asp Glu His Met lie Pro lie Glu Asn Leu Met Asn ...,: 545 550 555 560 , /. Pro Arg Ala Leu Asp Phe His Ala Glu Thr Gly Phe lie Tyr Phe Ala 565 570 575 * ·
Asp Thr Thr Ser Tyr Leu lie Gly Arg Gin Lys lie Asp Gly Thr Glu 580 585 590 113272 135
Arg Glu Thr lie Leu Lys Asp Gly lie His Asn Vai Glu Gly Val Ala 595 600 605
Val Asp Trp Met Gly Asp Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Asp Gly Pro Lys 610 615 620
Lys Thr lie Ser Val Ala Arg Leu Glu Lys Ala Ala Gin Thr Arg Lys 625 630 635 640
Thr Leu lie Glu Gly Lys Met Thr His Pro Arg Ala lie Val Val Asp 645 650 655
Pro Leu Asn Gly Trp Met Tyr Trp Thr Asp Trp Glu Glu Asp Pro Lys 6 60 665 670
Asp Ser Arg Arg Gly Arg Leu Glu Arg Ala Trp Met Asp Gly Ser His 675 680 685
Arg Asp lie Phe Val Thr Ser Lys Thr Val Leu Trp Pro Asn Gly Leu 690 695 700
Ser Leu Asp lie Pro Ala Gly Arg Leu Tyr Trp Val Asp Ala Phe Tyr 705 710 715 720
Asp Arg lie Glu Thr lie Leu Leu Asn Gly Thr Asp Arg Lys lie Val 725 730 735
Tyr Glu Gly Pro Glu Leu Asn His Ala Phe Gly Leu Cys His His Gly 740 745 750
Asn Tyr Leu Phe Trp Thr Glu Tyr Arg Ser Gly Ser Val Tyr Arg Leu , , 755 760 765 * · ·. Glu Arg Gly Val Gly Gly Ala Pro Pro Thr Val Thr Leu Leu Arg Ser [;·’ 770 775 780 » * · !. . Glu Arg Pro Pro lie Phe Glu lie Arg Met Tyr Asp Ala Gin Gin Gin : 785 790 795 800
Gin Val Gly Thr Asn Lys Cys Arg Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser Ser : 805 810 815
Leu Cys Leu Ala Thr Pro Gly Ser Arg Gin Cys Ala Cys Ala Glu Asp 820 825 830
Gin Val Leu Asp Ala Asp Gly Val Thr Cys Leu Ala Asn Pro Ser Tyr 835 840 845 f » a »
Val Pro Pro Pro Gin Cys Gin Pro Gly Glu Phe Ala Cys Ala Asn Ser 850 855 860
Arg Cys lie Gin Glu Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Leu .·*·. 865 870 875 880
Asp Asn Ser Asp Glu Ala Pro Ala Leu Cys His Gin His Thr Cys Pro 885 890 895 X3« 113272
Ser Asp Arg Phe Lys Cys Glu Asn Asn Arg Cys lie Pro Asn Arg Trp 900 905 910
Leu Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asn Ser Glu Asp Glu Ser Asn 915 920 925
Ala Thr Cys Ser Ala Arg Thr Cys Pro Pro Asn Gin Phe Ser Cys Ala 930 935 940
Ser Gly Arg Cys lie Pro lie Ser Trp Thr Cys Asp Leu Asp Asp Asp 945 950 955 960
Cys Gly Asp Arg Ser Asp Glu Ser Ala Ser Cys Ala Tyr Pro Thr Cys 965 970 975
Phe Pro Leu Thr Gin Phe Thr Cys Asn Asn Gly Arg Cys lie Asn lie 980 985 990
Asn Trp Arg Cys Asp Asn Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu 995 1000 1005
Ala Gly Cys Ser His Ser Cys Ser Ser Thr Gin Phe Lys Cys Asn Ser 1010 1015 1020
Gly Arg Cys lie Pro Glu His Trp Thr Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys 1025 1030 1035 1040
Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Thr His Ala Asn Cys Thr Asn Gin Ala Thr 1045 1050 1055 ; ·. Arg Pro Pro Gly Gly Cys His Thr Asp Glu Phe Gin Cys Arg Leu Asp : : 1060 1065 1070 * *
Gly Leu Cys lie Pro Leu Arg Trp Arg Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys : '·· 1075 1080 1085 - ·' Met Asp Ser Ser Asp Glu Lys Ser Cys Glu Gly Val Thr His Val Cys ; 1090 1095 1100 V : Asp Pro Ser Val Lys Phe Gly Cys Lys Asp Ser Ala Arg Cys lie Ser 1105 1110 1115 1120 ; Lys Ala Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asn Ser Asp I 1125 1130 1135 ’ . Glu Glu Asn Cys Glu Ser Leu Ala Cys Arg Pro Pro Ser His Pro Cys *’G 1140 1145 1150
' i t I
Ala Asn Asn Thr Ser Val Cys Leu Pro Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gly 1155 1160 1165 ; Asn Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Gly Glu Leu Cys Asp Gin 1170 1175 1180
Cys Ser Leu Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Asn Cys Ser Val Ala Pro 113272 137 1185 1190 1195 1200
Gly Glu Gly Ile Val Cys Ser Cys Pro Leu Gly Met Glu Leu Gly Pro 1205 1210 1215
Asp Asn His Thr Cys Gin lie Gin Ser Tyr Cys Ala Lys His Leu Lys 1220 1225 1230
Cys Ser Gin Lys Cys Asp Gin Asn Lys Phe Ser Val Lys Cys Ser Cys 1235 1240 1245
Tyr Glu Gly Trp Val Leu Glu Pro Asp Gly Glu Ser Cys Arg Ser Leu 1250 1255 1260
Asp Pro Phe Lys Pro Phe lie lie Phe Ser Asn Arg His Glu lie Arg 1265 1270 1275 1280
Arg lie Asp Leu His Lys Gly Asp Tyr Ser Val Leu Val Pro Gly Leu 1285 1290 1295
Arg Asn Thr lie Ala Leu Asp Phe His Leu Ser Gin Ser Ala Leu Tyr 1300 1305 1310
Trp Thr Asp Val Val Glu Asp Lys lie Tyr Arg Gly Lys Leu Leu Asp 1315 1320 1325
Asn Gly Ala Leu Thr Ser Phe Glu Val Val lie Gin Tyr Gly Leu Ala 1330 1335 1340
Thr Pro Glu Gly Leu Ala Val Asp Trp lie Ala Gly Asn lie Tyr Trp 1345 1350 1355 1360 * · Val Glu Ser Asn Leu Asp Gin lie Glu Val Ala Lys Leu Asp Gly Thr . ·. 1365 1370 1375 • · : Leu Arg Thr Thr Leu Leu Ala Gly Asp lie Glu His Pro Arg Ala lie 1380 1385 1390
Ala Leu Asp Pro Arg Asp Gly He Leu Phe Trp Thr Asp Trp Asp Ala ;/ 1395 1400 1405 » * · » * ·
Ser Leu Pro Arg He Glu Ala Ala Ser Met Ser Gly Ala Gly Arg Arg 1410 1415 1420
Thr Val His Arg Glu Thr Gly Ser Gly Gly Trp Pro Asn Gly Leu Thr •‘...I 1425 1430 1435 1440
Val Asp Tyr Leu Glu Lys Arg He Leu Trp He Asp Ala Arg Ser Asp . 1445 1450 1455 • .t t s »
Ala He Tyr Ser Ala Arg Tyr Asp Gly Ser Gly His Met Glu Val Leu : ,V 1460 1465 1470 '··' Arg Gly His Glu Phe Leu Ser His Pro Phe Ala Val Thr Leu Tyr Gly 1475 1480 1485 113272 138
Gly Glu Vai Tyr Trp Thr Asp Trp Arg Thr Asn Thr Leu Ala Lys Ala 1490 1495 1500
Asn Lys Trp Thr Gly His Asn Vai Thr Vai Val Gin Arg Thr Asn Thr 1505 1510 1515 1520
Gin Pro Phe Asp Leu Gin Val Tyr His Pro Ser Arg Gin Pro Met Ala 1525 1530 1535
Pro Asn Pro Cys Glu Ala Asn Gly Gly Gin Gly Pro Cys Ser His Leu 1540 1545 1550
Cys Leu lie Asn Tyr Asn Arg Thr Val Ser Cys Ala Cys Pro His Leu 1555 1560 1565
Met Lys Leu His Lys Asp Asn Thr Thr Cys Tyr Glu Phe Lys Lys Phe 1570 1575 1580
Leu Leu Tyr Ala Arg Gin Met Glu lie Arg Gly Val Asp Leu Asp Ala 1585 1590 1595 1600
Pro Tyr Tyr Asn Tyr lie lie Ser Phe Thr Val Pro Asp lie Asp Asn 1605 1610 1615
Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Ala Arg Glu Gin Arg Val Tyr Trp Ser 1620 1625 1630
Asp Val Arg Thr Gin Ala lie Lys Arg Ala Phe lie Asn Gly Thr Gly 1635 1640 1645
Val Glu Thr Val Val Ser Ala Asp Leu Pro Asn Ala His Gly Leu Ala , . 1650 1655 1660 * · I · , ·. Val Asp Trp Val Ser Arg Asn Leu Phe Trp Thr Ser Tyr Asp Thr Asn 1665 1670 1675 1680
Lys Lys Gin lie Asn Val Ala Arg Leu Asp Gly Ser Phe Lys Asn Ala 1685 1690 1695 : Val Val Gin Gly Leu Glu Gin Pro His Gly Leu Val Val His Pro Leu 1700 1705 1710
Arg Gly Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Gly Asp Asn lie Ser Met Ala Asn ' ;* 1715 1720 1725
Met Asp Gly Ser Asn Arg Thr Leu Leu Phe Ser Gly Gin Lys Gly Pro ’! 1730 1735 1740 1 * Val Gly Leu Ala lie Asp Phe Pro Glu Ser Lys Leu Tyr Trp lie Ser 1745 1750 1755 1760 . Ser Gly Asn His Thr lie Asn Arg Cys Asn Leu Asp Gly Ser Gly Leu ’·* 1765 1770 1775
Glu Val lie Asp Ala Met Arg Ser Gin Leu Gly Lys Ala Thr Ala Leu 113272 139 1780 1785 1790
Ala Ile Met Gly Asp Lys Leu Trp Trp Ala Asp Gin Vai Ser Glu Lys 1795 1800 1805
Met Gly Thr Cys Ser Lys Ala Asp Gly Ser Gly Ser Vai Vai Leu Arg 1810 1815 1820
Asn Ser Thr Thr Leu Vai Met His Met Lys Vai Tyr Asp Glu Ser Ile 1825 1830 1835 1840
Gin Leu Asp His Lys Gly Thr Asn Pro Cys Ser Vai Asn Asn Gly Asp 1845 1850 1855
Cys Ser Gin Leu Cys Leu Pro Thr Ser Glu Thr Thr Arg Ser Cys Met 1860 1865 1870
Cys Thr Ala Gly Tyr Ser Leu Arg Ser Gly Gin Gin Ala Cys Glu Gly 1875 1880 1885
Vai Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Vai His Glu Gly Ile Arg Gly Ile 1890 1895 1900
Pro Leu Asp Pro Asn Asp Lys Ser Asp Ala Leu Vai Pro Vai Ser Gly 1905 1910 1915 1920
Thr Ser Leu Ala Vai Gly Ile Asp Phe His Ala Glu Asn Asp Thr Ile 1925 1930 1935
Tyr Trp Vai Asp Met Gly Leu Ser Thr Ile Ser Arg Ala Lys Arg Asp 1940 1945 1950 i Gin Thr Trp Arg Glu Asp Vai Vai Thr Asn Gly Ile Gly Arg Vai Glu : 1955 1960 1965 : ·· Gly Ile Ala Vai Asp Trp Ile Ala Gly Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Gin , ·. 1970 1975 1980
Gly Phe Asp Vai Ile Glu Vai Ala Arg Leu Asn Gly Ser Phe Arg Tyr 1985 1990 1995 2000 J ·
Vai Vai Ile Ser Gin Gly Leu Asp Lys Pro Arg Ala Ile Thr Vai His 2005 2010 2015 ; Pro Glu Lys Gly Tyr Leu Phe Trp Thr Glu Trp Gly Gin Tyr Pro Arg 2020 2025 2030
Ile Glu Arg Ser Arg Leu Asp Gly Thr Glu Arg Vai Vai Leu Vai Asn . 2035 2040 2045 '·, Vai Ser Ile Ser Trp Pro Asn Gly Ile Ser Vai Asp Tyr Gin Asp Gly 2050 2055 2060
Lys Leu Tyr Trp Cys Asp Ala Arg Thr Asp Lys Ile Glu Arg Ile Asp 2065 2070 2075 2080 113272 140
Leu Glu Thr Gly Glu Asn Arg Glu Vai Val Leu Ser Ser Asn Asn Met 2085 2090 2095
Asp Met Phe Ser Val Ser Val Phe Glu Asp Phe lie Tyr Trp Ser Asp 2100 2105 2110
Arg Thr His Ala Asn Gly Ser lie Lys Arg Gly Ser Lys Asp Asn Ala 2115 2120 2125
Thr Asp Ser Val Pro Leu Arg Thr Gly lie Gly Val Gin Leu Lys Asp 2130 2135 2140 lie Lys Val Phe Asn Arg Asp Arg Gin Lys Gly Thr Asn Val Cys Ala 2145 2150 2155 2160
Val Ala Asn Gly Gly Cys Gin Gin Leu Cys Leu Tyr Arg Gly Arg Gly 2165 2170 2175
Gin Arg Ala Cys Ala Cys Ala His Gly Met Leu Ala Glu Asp Gly Ala 2180 2185 2190
Ser Cys Arg Glu Tyr Ala Gly Tyr Leu Leu Tyr Ser Glu Arg Thr lie 2195 2200 2205
Leu Lys Ser lie His Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Asn Ala Pro Val 2210 2215 2220
Gin Pro Phe Glu Asp Pro Glu His Met Lys Asn Val lie Ala Leu Ala 2225 2230 2235 2240
Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Thr Ser Pro Gly Thr Pro Asn Arg lie Phe . , 2245 2250 2255 • I « · ♦ « · , Phe Ser Asp lie His Phe Gly Asn lie Gin Gin lie Asn Asp Asp Gly 2260 2265 2270
Ser Arg Arg lie Thr lie Val Glu Asn Val Gly Ser Val Glu Gly Leu : 2275 2280 2285 · Ala Tyr His Arg Gly Trp Asp Thr Leu Tyr Trp Thr Ser Tyr Thr Thr 2290 2295 2300
Ser Thr lie Thr Arg His Thr Val Asp Gin Thr Arg Pro Gly Ala Phe 2305 2310 2315 2320 »
Glu Arg Glu Thr Val lie Thr Met Ser Gly Asp Asp His Pro Arg Ala 2325 2330 2335 ' « · . Phe Val Leu Asp Glu Cys Gin Asn Leu Met Phe Trp Thr Asn Trp Asn 2340 2345 2350 141 113272
Asp His Arg Ala Glu Lys Leu Tyr Phe Ser Asp Ala Thr Leu Asp Lys 2385 2390 2395 2400
Ile Glu Arg Cys Glu Tyr Asp Gly Ser His Arg Tyr Vai Ile Leu Lys 2405 2410 2415
Ser Glu Pro Vai His Pro Phe Gly Leu Ala Vai Tyr Gly Glu His Ile 2420 2425 2430
Phe Trp Thr Asp Trp Vai Arg Arg Ala Vai Gin Arg Ala Asn Lys His 2435 2440 2445
Vai Gly Ser Asn Met Lys Leu Leu Arg Vai Asp Ile Pro Gin Gin Pro 2450 2455 2460
Met Gly Ile Ile Ala Vai Ala Asn Asp Thr Asn Ser Cys Glu Leu Ser 2465 2470 2475 2480
Pro Cys Arg Ile Asn Asn Gly Gly Cys Gin Asp Leu Cys Leu Leu Thr 2485 2490 2495
His Gin Gly His Vai Asn Cys Ser Cys Arg Gly Gly Arg Ile Leu Gin 2500 2505 2510
Asp Asp Leu Thr Cys Arg Ala Vai Asn Ser Ser Cys Arg Ala Gin Asp 2515 2520 2525
Glu Phe Glu Cys Ala Asn Gly Glu Cys Ile Asn Phe Ser Leu Thr Cys 2530 2535 2540 ; , Asp Gly Vai Pro His Cys Lys Asp Lys Ser Asp Glu Lys Pro Ser Tyr • : 2545 2550 2555 2560 • » , ' Cys Asn Ser Arg Arg Cys Lys Lys Thr Phe Arg Gin Cys Ser Asn Gly ; · 2565 2570 2575
Arg Cys Vai Ser Asn Met Leu Trp Cys Asn Gly Ala Asp Asp Cys Gly 2580 2585 2590 v · Asp Gly Ser Asp Glu Ile Pro Cys Asn Lys Thr Ala Cys Gly Vai Gly 2595 2600 2605
Glu Phe Arg Cys Arg Asp Gly Thr Cys Ile Gly Asn Ser Ser Arg Cys 2610 2615 2620
Asn Gin Phe Vai Asp Cys Glu Asp Ala Ser Asp Glu Met Asn Cys Ser : 2625 2630 2635 2640
Ala Thr Asp Cys Ser Ser Tyr Phe Arg Leu Gly Vai Lys Gly Vai Leu 2645 2650 2655
Phe Gin Pro Cys Glu Arg Thr Ser Leu Cys Tyr Ala Pro Ser Trp Vai 2660 2665 2670
Cys Asp Gly Ala Asn Asp Cys Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Arg Asp Cys 113272 142 2675 2680 2685
Pro Gly Vai Lys Arg Pro Arg Cys Pro Leu Asn Tyr Phe Ala Cys Pro 2690 2695 2700
Ser Gly Arg Cys lie Pro Met Ser Trp Thr Cys Asp Lys Glu Asp Asp 2705 2710 2715 2720
Cys Glu His Gly Glu Asp Glu Thr His Cys Asn Lys Phe Cys Ser Glu 2725 2730 2735
Ala Gin Phe Glu Cys Gin Asn His Arg Cys lie Ser Lys Gin Trp Leu 2740 2745 2750
Cys Asp Gly Ser Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ala His 2755 2760 2765
Cys Glu Gly Lys Thr Cys Gly Pro Ser Ser Phe Ser Cys Pro Gly Thr 2770 2775 2780
His Vai Cys Val Pro Glu Arg Trp Leu Cys Asp Gly Asp Lys Asp Cys 2785 2790 2795 2800
Ala Asp Gly Ala Asp Glu Ser lie Ala Ala Gly Cys Leu Tyr Asn Ser 2805 2810 2815
Thr Cys Asp Asp Arg Glu Phe Met Cys Gin Asn Arg Gin Cys lie Pro 2820 2825 2830
Lys His Phe Val Cys Asp His Asp Arg Asp Cys Ala Asp Gly Ser Asp 2835 2840 2845 : : Glu Ser Pro Glu Cys Glu Tyr Pro Thr Cys Gly Pro Ser Glu Phe Arg . . 2850 2855 2860 I ,. Cys Ala Asn Gly Arg Cys Leu Ser Ser Arg Gin Trp Glu Cys Asp Gly I 2865 2870 2875 2880
Glu Asn Asp Cys His Asp Gin Ser Asp Glu Ala Pro Lys Asn Pro His 2885 2890 2895
Cys Thr Ser Pro Glu His Lys Cys Asn Ala Ser Ser Gin Phe Leu Cys 2900 2905 2910 $ ; Ser Ser Gly Arg Cys Val Ala Glu Ala Leu Leu Cys Asn Gly Gin Asp ,: 2915 2920 2925 ! Asp Cys Gly Asp Ser Ser Asp Glu Arg Gly Cys His lie Asn Glu Cys . 2930 2935 2940
Leu Ser Arg Lys Leu Ser Gly Cys Ser Gin Asp Cys Glu Asp Leu Lys / 2945 2950 2955 2960 lie Gly Phe Lys Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe Arg Leu Lys Asp Asp 2965 2970 2975 113272 143
Gly Arg Thr Cys Ala Asp Val Asp Glu Cys Ser Thr Thr Phe Pro Cys 2980 2985 2990
Ser Gin Arg Cys lie Asn Thr His Gly Ser Tyr Lys Cys Leu Cys Val 2995 3000 3005
Glu Gly Tyr Ala Pro Arg Gly Gly Asp Pro His Ser Cys Lys Ala Val 3010 3015 3020
Thr Asp Glu Glu Pro Phe Leu lie Phe Ala Asn Arg Tyr Tyr Leu Arg 3025 3030 3035 3040
Lys Leu Asn Leu Asp Gly Ser Asn Tyr Thr Leu Leu Lys Gin Gly Leu 3045 3050 3055
Asn Asn Ala Val Ala Leu Asp Phe Asp Tyr Arg Glu Gin Met lie Tyr 3060 3065 3070
Trp Thr Asp Val Thr Thr Gin Gly Ser Met lie Arg Arg Met His Leu 3075 3080 3085
Asn Gly Ser Asn Val Gin Val Leu His Arg Thr Gly Leu Ser Asn Pro 3090 3095 3100
Asp Gly Leu Ala Val Asp Trp Val Gly Gly Asn Leu Tyr Trp Cys Asp 3105 3110 3115 3120
Lys Gly Arg Asp Thr lie Glu Val Ser Lys Leu Asn Gly Ala Tyr Arg 3125 3130 3135
Thr Val Leu Val Ser Ser Gly Leu Arg Glu Pro Arg Ala Leu Val Val ; 3140 3145 3150 • »
Asp Val Gin Asn Gly Tyr Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Asp His Ser 3155 3160 3165
Leu lie Gly Arg lie Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Ser Val lie Val • : 3170 3175 3180
Asp Thr Lys lie Thr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Val Thr ; : 3185 3190 3195 3200
Glu Arg lie Tyr Trp Ala Asp Ala Arg Glu Asp Tyr lie Glu Phe Ala 3205 3210 3215 • Ser Leu Asp Gly Ser Asn Arg His Val Val Leu Ser Gin Asp lie Pro 3220 3225 3230 • . His lie Phe Ala Leu Thr Leu Phe Glu Asp Tyr Val Tyr Trp Thr Asp : 3235 3240 3245 ,· Trp Glu Thr Lys Ser lie Asn Arg Ala His Lys Thr Thr Gly Thr Asn 3250 3255 3260
Lys Thr Leu Leu lie Ser Thr Leu His Arg Pro Met Asp Leu His Val 3265 3270 3275 3280 113272 144
Phe His Ala Leu Arg Gin Pro Asp Val Pro Asn His Pro Cys Lys Val 3285 3290 3295
Asn Asn Gly Gly Cys Ser Asn Leu Cys Leu Leu Ser Pro Gly Gly Gly 3300 3305 3310
His Lys Cys Ala Cys Pro Thr Asn Phe Tyr Leu Gly Ser Asp Gly Arg 3315 3320 3325
Thr Cys Val Ser Asn Cys Thr Ala Ser Gin Phe Val Cys Lys Asn Asp 3330 3335 3340
Lys Cys lie Pro Phe Trp Trp Lys Cys Asp Thr Glu Asp Asp Cys Gly 3345 3350 3355 3360
Asp His Ser Asp Glu Pro Pro Asp Cys Pro Glu Phe Lys Cys Arg Pro 3365 3370 3375
Gly Gin Phe Gin Cys Ser Thr Gly lie Cys Thr Asn Pro Ala Phe lie 3380 3385 3390
Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gin Asp Asn Ser Asp Glu Ala Asn Cys 3395 3400 3405
Asp lie His Val Cys Leu Pro Ser Gin Phe Lys Cys Thr Asn Thr Asn 3410 3415 3420
Arg Cys lie Pro Gly lie Phe Arg Cys Asn Gly Gin Asp Asn Cys Gly 3425 3430 3435 3440
Asp Gly Glu Asp Glu Arg Asp Cys Pro Glu Val Thr Cys Ala Pro Asn 3445 3450 3455 • * Gin Phe Gin Cys Ser lie Thr Lys Arg Cys lie Pro Arg Val Trp Val 3460 3465 3470
Cys Asp Arg Asp Asn Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu Pro Ala Asn 3475 3480 3485 ;, ·' Cys Thr Gin Met Thr Cys Gly Val Asp Glu Phe Arg Cys Lys Asp Ser 3490 3495 3500 ’.· Gly Arg Cys lie Pro Ala Arg Trp Lys Cys Asp Gly Glu Asp Asp Cys I 3505 3510 3515 3520 t »
Gly Asp Gly Ser Asp Glu Pro Lys Glu Glu Cys Asp Glu Arg Thr Cys 3525 3530 3535
Glu Pro Tyr Gin Phe Arg Cys Lys Asn Asn Arg Cys Val Pro Gly Arg 3540 3545 3550
Trp Gin Cys Asp Tyr Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Glu 3555 3560 3565
Ser Cys Thr Pro Arg Pro Cys Ser Glu Ser Glu Phe Ser Cys Ala Asn 113272 145 3570 3575 3580
Gly Arg Cys lie Ala Gly Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp His Asp Cys 3585 3590 3595 3600
Ala Asp Gly Ser Asp Glu Lys Asp Cys Thr Pro Arg Cys Asp Met Asp 3605 3610 3615
Gin Phe Gin Cys Lys Ser Gly His Cys lie Pro Leu Arg Trp Arg Cys 3620 3625 3630
Asp Ala Asp Ala Asp Cys Met Asp Gly Ser Asp Glu Glu Ala Cys Gly 3635 3640 3645
Thr Gly Val Arg Thr Cys Pro Leu Asp Glu Phe Gin Cys Asn Asn Thr 3650 3655 3660
Leu Cys Lys Pro Leu Ala Trp Lys Cys Asp Gly Glu Asp Asp Cys Gly 3665 3670 3675 3680
Asp Asn Ser Asp Glu Asn Pro Glu Glu Cys Ala Arg Phe Val Cys Pro 3685 3690 3695
Pro Asn Arg Pro Phe Arg Cys Lys Asn Asp Arg Val Cys Leu Trp lie 3700 3705 3710
Gly Arg Gin Cys Asp Gly Thr Asp Asn Cys Gly Asp Gly Thr Asp Glu 3715 3720 3725
Glu Asp Cys Glu Pro Pro Thr Ala His Thr Thr His Cys Lys Asp Lys 3730 3735 3740 • • Lys Glu Phe Leu Cys Arg Asn Gin Arg Cys Leu Ser Ser Ser Leu Arg 3745 3750 3755 3760 : .. Cys Asn Met Phe Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asp Cys ·' · 3765 3770 3775 > · » · • Ser lie Asp Pro Lys Leu Thr Ser Cys Ala Thr Asn Ala Ser lie Cys /· 3780 3785 3790 4 · I ·
Gly Asp Glu Ala Arg Cys Val Arg Thr Glu Lys Ala Ala Tyr Cys Ala 3795 3800 3805 > ·
Cys Arg Ser Gly Phe His Thr Val Pro Gly Gin Pro Gly Cys Gin Asp 3810 3815 3820
He Asn Glu Cys Leu Arg Phe Gly Thr Cys Ser Gin Leu Cys Asn Asn . 3825 3830 3835 3840 I » » » *
Thr Lys Gly Gly His Leu Cys Ser Cys Ala Arg Asn Phe Met Lys Thr 3845 3850 3855 ’*··* His Asn Thr Cys Lys Ala Glu Gly Ser Glu Tyr Gin Val Leu Tyr He 3860 3865 3870 113272 146
Ala Asp Asp Asn Glu Ile Arg Ser Leu Phe Pro Gly His Pro His Ser 3875 3880 3885
Ala Tyr Glu Gin Ala Phe Gin Gly Asp Glu Ser Vai Arg Ile Asp Ala 3890 3895 3900
Met Asp Vai His Vai Lys Ala Gly Arg Vai Tyr Trp Thr Asn Trp His 3905 3910 3915 3920
Thr Gly Thr Ile Ser Tyr Arg Ser Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro Thr 3925 3930 3935
Thr Ser Asn Arg His Arg Arg Gin Ile Asp Arg Gly Vai Thr His Leu 3940 3945 3950
Asn Ile Ser Gly Leu Lys Met Pro Arg Gly Ile Ala Ile Asp Trp Vai 3955 3960 3965
Ala Gly Asn Vai Tyr Trp Thr Asp Ser Gly Arg Asp Vai Ile Glu Vai 3970 3975 3980
Ala Gin Met Lys Gly Glu Asn Arg Lys Thr Leu Ile Ser Gly Met Ile 3985 3990 3995 4000
Asp Glu Pro His Ala Ile Vai Vai Asp Pro Leu Arg Gly Thr Met Tyr 4005 4010 4015
Trp Ser Asp Trp Gly Asn His Pro Lys Ile Glu Thr Ala Ala Met Asp 4020 4025 4030
Gly Thr Leu Arg Glu Thr Leu Vai Gin Asp Asn Ile Gin Trp Pro Thr . 4035 4040 4045 . Gly Leu Ala Vai Asp Tyr His Asn Glu Arg Leu Tyr Trp Ala Asp Ala ' ·' 4050 4055 4060 » · • # Lys Leu Ser Vai Ile Gly Ser Ile Arg Leu Asn Gly Thr Asp Pro Ile 4065 4070 4075 4080 •
Vai Ala Ala Asp Ser Lys Arg Gly Leu Ser His Pro Phe Ser Ile Asp ·' : 4085 4090 4095
Vai Phe Glu Asp Tyr Ile Tyr Gly Vai Thr Tyr Ile Asn Asn Arg Vai 4100 4105 4110 • Phe Lys Ile His Lys Phe Gly His Ser Pro Leu Vai Asn Leu Thr Gly 4115 4120 4125 > > · ,Gly Leu Ser His Ala Ser Asp Vai Vai Leu Tyr His Gin His Lys Gin ’ : 4130 4135 4140 ‘ Pro Glu Vai Thr Asn Pro Cys Asp Arg Lys Lys Cys Glu Trp Leu Cys 4145 4150 4155 4160
Leu Leu Ser Pro Ser Gly Pro Vai Cys Thr Cys Pro Asn Gly Lys Arg 4165 4170 4175 147 113272
Leu Asp Asn Gly Thr Cys Val Pro Val Pro Ser Pro Thr Pro Pro Pro 4180 4185 4190
Asp Ala Pro Arg Pro Gly Thr Cys Asn Leu Gin Cys Phe Asn Gly Gly 4195 4200 4205
Ser Cys Phe Leu Asn Ala Arg Arg Gin Pro Lys Cys Arg Cys Gin Pro 4210 4215 4220
Arg Tyr Thr Gly Asp Lys Cys Glu Leu Asp Gin Cys Trp Glu His Cys 4225 4230 4235 4240
Arg Asn Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ser Pro Ser Gly Met Pro Thr Cys 4245 4250 4255
Arg Cys Pro Thr Gly Phe Thr Gly Pro Lys Cys Thr Gin Gin Val Cys 4260 4265 4270
Ala Gly Tyr Cys Ala Asn Asn Ser Thr Cys Thr Val Asn Gin Gly Asn 4275 4280 4285
Gin Pro Gin Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Leu Gly Asp Arg Cys Gin 4290 4295 4300
Tyr Arg Gin Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Asn Phe Gly Thr Cys Gin Met 4305 4310 4315 4320
Ala Ala Asp Gly Ser Arg Gin Cys Arg Cys Thr Ala Tyr Phe Glu Gly 4325 4330 4335 . . Ser Arg Cys Glu Val Asn Lys Cys Ser Arg Cys Leu Glu Gly Ala Cys ' ; 4340 4345 4350 '· ·" Val Val Asn Lys Gin Ser Gly Asp Val Thr Cys Asn Cys Thr Asp Gly Γ .. 4355 4360 4365 : .· Arg Val Ala Pro Ser Cys Leu Thr Cys Val Gly His Cys Ser Asn Gly : ·. 4370 4375 4380 ; : Gly Ser Cys Thr Met Asn Ser Lys Met Met Pro Glu Cys Gin Cys Pro 4385 4390 4395 4400
Pro His Met Thr Gly Pro Arg Cys Glu Glu His Val Phe Ser Gin Gin 4405 4410 4415
Gin Pro Gly His lie Ala Ser lie Leu lie Pro Leu Leu Leu Leu Leu · 4420 4425 4430 •
Leu Leu Val Leu Val Ala Gly Val Val Phe Trp Tyr Lys Arg Arg Val 4435 4440 4445
Gin Gly Ala Lys Gly Phe Gin His Gin Arg Met Thr Asn Gly Ala Met 4450 4455 4460
Asn Val Glu lie Gly Asn Pro Thr Tyr Lys Met Tyr Glu Gly Gly Glu 148 113272 4465 4470 4475 4480
Pro Asp Asp Vai Gly Gly Leu Leu Asp Ala Asp Phe Ala Leu Asp Pro 4485 4490 4495
Asp Lys Pro Thr Asn Phe Thr Asn Pro Vai Tyr Ala Thr Leu Tyr Met 4500 4505 4510
Gly Gly His Gly Ser Arg His Ser Leu Ala Ser Thr Asp Glu Lys Arg 4515 4520 4525
Glu Leu Leu Gly Arg Gly Pro Glu Asp Glu Ile Gly Asp Pro Leu Ala 4530 4535 4540 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 53: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 487 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 53:
Met Ala Gly Leu Leu His Leu Vai Leu Leu Ser Thr Ala Leu Gly Gly 15 10 15
Leu Leu Arg Pro Ala Gly Ser Vai Phe Leu Pro Arg Asp Gin Ala His • . 20 25 30 - · »
Arg Vai Leu Gin Arg Ala Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Vai 35 40 45 • Lys Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu Ala Cys Ser Leu 50 55 60 *
Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe Glu Asp Ala Glu Gin Thr Asp Glu Phe /: 65 70 75 80
Trp Ser Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Glu Gly His Pro Cys Leu 85 90 95
Asn Gin Gly His Cys Lys Asp Gly Ile Gly Asp Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 • · • . Ala Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Phe Ser Thr Arg Glu Ile 115 120 125 ,· Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Asp Gin Phe Cys Arg Glu Glu Arg . 130 135 140
Ser Glu Vai Arg Cys Ser Cys Ala His Gly Tyr Vai Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 149 1 13272
Ser Lys Ser Cys Val Ser Thr Glu Arg Phe Pro Cys Gly Lys Phe Thr 165 170 175
Gin Gly Arg Ser Arg Arg Trp Ala lie His Thr Ser Glu Asp Ala Leu 180 185 190
Asp Ala Ser Glu Leu Glu His Tyr Asp Pro Ala Asp Leu Ser Pro Thr 195 200 205
Glu Ser Ser Leu Asp Leu Leu Gly Leu Asn Arg Thr Glu Pro Ser Ala 210 215 220
Gly Glu Asp Gly Ser Gin Val Val Arg lie Val Gly Gly Arg Asp Cys 225 230 235 240
Ala Glu Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu Leu Val Asn Glu Glu Asn 245 250 255
Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr lie Leu Asn Glu Phe Tyr Val Leu Thr 260 265 270
Ala Ala His Cys Leu His Gin Ala Lys Arg Phe Thr Val Arg Val Gly 275 280 285
Asp Arg Asn Thr Glu Gin Glu Glu Gly Asn Glu Met Ala His Glu Val 290 295 300
Glu Met Thr Val Lys His Ser Arg Phe Val Lys Glu Thr Tyr Asp Phe 305 310 315 320 . , Asp lie Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro lie Arg Phe Arg Arg Asn i : 325 330 335
Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Lys Asp Trp Ala Glu Ala Thr Leu : .. 340 345 350 .* Met Thr Gin Lys Thr Gly lie Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu 355 360 365 •_ : Lys Gly Arg Leu Ser Ser Thr Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val 370 375 380
Asp Arg Ser Thr Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Thr lie Thr Pro Asn \ 385 390 395 400
Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Gin Pro Glu Asp Ala Cys Gin Gly : 405 410 415 ‘ * Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val ^ 420 425 430
Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Phe 435 440 445
Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Asn Phe Leu Lys Trp lie Asp Lys lie 113272 150 450 455 460
Met Lys Ala Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly His Ser Glu Ala 465 470 475 480
Pro Ala Thr Trp Thr Val Pro 485 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 54: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 790 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 54:
Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Vai Asn Thr Gin Gly Ala Ser Leu Phe Ser 15 10 15
Vai Thr Lys Lys Gin Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30
Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gin Tyr His 35 40 45
Ser Lys Glu Gin Gin Cys Vai Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60
Ile Ile Arg Met Arg Asp Vai Vai Leu Phe Glu Lys Lys Vai Tyr Leu 65 70 75 80
Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser 85 90 95 • Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gin Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro : 100 105 110
His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu 115 120 125 it ·’ Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gin Gly Pro Trp Cys 130 135 140 ; » * « > . Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu 145 150 155 160 M,· Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys ' 165 170 175
Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gin Ala Trp Asp Ser Gin 180 185 190 113272 151
Ser Pro His Ala His Gly Tyr lie Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn 195 200 205
Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp 210 215 220
Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp lie Pro 225 230 235 240
Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gin Cys Leu 245 250 255
Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Vai Ala Vai Thr Val Ser 260 265 270
Gly His Thr Cys Gin His Trp Ser Ala Gin Thr Pro His Thr His Asn 275 280 285
Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys 290 295 300
Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser 305 310 315 320
Gin Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys lie Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro 325 330 335
Val Ser Thr Glu Glu Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro 340 345 350 . Val Val Gin Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gin Ser Tyr Arg Gly Thr • 355 360 365 « ·* Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gin Ser Trp Ser Ser Met 370 375 380 .· Thr Pro His Arg His Gin Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly 385 390 395 400 * : Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp 405 410 415
Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys 420 425 430 • > Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val ’·: 435 440 445 •
Leu Leu Pro Asn Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly 450 455 460 * , Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr ··’ 465 470 475 480
Pro Cys Gin Asp Trp Ala Ala Gin Glu Pro His Arg His Ser lie Phe 113272 152 485 490 495
Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg 500 505 510
Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro 515 520 525
Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gin Cys Ala Ala Pro Ser 530 535 540
Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gin Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg 545 550 555 560
Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gin Val 565 570 575
Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu lie 580 585 590
Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro 595 600 605
Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val lie Leu Gly Ala His Gin Glu Val Asn 610 615 620
Leu Glu Pro His Val Gin Glu lie Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu 625 630 635 640
Pro Thr Arg Lys Asp lie Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val 645 650 655 : : lie Thr Asp Lys Val lie Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val , *. 660 665 670 * · : .. Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe lie Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gin ‘ . 675 680 685 * · : Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gin Leu Pro Val lie : 690 695 700 t ·
Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gin 705 710 715 720 * * · ' Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys 725 730 735 ' ·; Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr . 740 745 750 1 - ’ » · lie Leu Gin Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn : 755 760 765 ' · '"· Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp lie Glu 770 775 780 113272 153
Gly Vai Met Arg Asn Asn 785 790 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 55: (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 153 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 55:
Vai Tyr Leu Gin Thr Ser Leu Lys Tyr Asn Ile Leu Pro Glu Lys Glu 15 10 15
Glu Phe Pro Phe Ala Leu Gly Vai Gin Thr Leu Pro Gin Thr Cys Asp 20 25 30
Glu Pro Lys Ala His Thr Ser Phe Gin Ile Ser Leu Ser Vai Ser Tyr 35 40 45
Thr Gly Ser Arg Ser Ala Ser Asn Met Ala Ile Vai Asp Vai Lys Met 50 55 60
Vai Ser Gly Phe Ile Pro Leu Lys Pro Thr Vai Lys Met Leu Glu Arg 65 70 75 80 , . Ser Asn His Vai Ser Arg Thr Glu Vai Ser Ser Asn His Vai Leu Ile - : 85 90 95 • ·* Tyr Leu Asp Lys Vai Ser Asn Gin Thr Leu Ser Leu Phe Phe Thr Vai : 100 105 110 : .* Leu Gin Asp Vai Pro Vai Arg Asp Leu Lys Pro Ala Ile Vai Lys Vai • *. 115 120 125 ; Tyr Asp Tyr Tyr Glu Thr Asp Glu Phe Ala Ile Ala Glu Tyr Asn Ala 130 135 140
Pro Cys Ser Lys Asp Leu Gly Asn Ala 145 150 • » » ·.*·: (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 56: • (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 2 02 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi ’·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 MOLEKYYLITYYPPI: proteini 113272 154 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 56:
Met Glu Leu Trp Gly Ala Tyr Leu Leu Leu Cys Leu Phe Ser Leu Leu 15 10 15
Thr Gin Vai Thr Thr Glu Pro Pro Thr Gin Lys Pro Lys Lys Ile Vai 20 25 30
Asn Ala Lys Lys Asp Vai Vai Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys 35 40 45
Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gin Glu Vai Ala Leu Leu Lys Glu Gin 50 55 60
Gin Ala Leu Gin Thr Vai Cys Leu Lys Gly Thr Lys Vai His Met Lys 65 70 75 80
Cys Phe Leu Ala Phe Thr Gin Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu 85 90 95
Asp Cys Ile Ser Arg Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gin Thr Gly Ser 100 105 110
Glu Asn Asp Ala Leu Tyr Glu Tyr Leu Arg Gin Ser Vai Gly Asn Glu 115 120 125
Ala Glu Ile Trp Leu Gly Leu Asn Asp Met Ala Ala Glu Gly Thr Trp 130 135 140
Vai Asp Met Thr Gly Ala Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu - . 145 150 155 160 ; Ile Thr Ala Gin Pro Asp Gly Gly Lys Thr Glu Asn Cys Ala Vai Leu , 165 170 175 • ? ·
Ser Gly Ala Ala Asn Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gin : ’ 180 185 190
Leu Pro Tyr Ile Cys Gin Phe Gly Ile Vai * : 195 200 (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 57: ..· (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: (A) PITUUS: 246 aminohappoa : (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi • (D) TOPOLOGIA: lineaarinen V (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 57:
Gin Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 113272 155 15 10 15
Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly His lie Tyr Pro Val Arg Ser lie Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Arg Gly Asp Gly Ser Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu 115 120 125
Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Ala Ser Pro Gly Gly Lys Val 130 135 140
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr 145 150 155 160
Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp lie Tyr Ala Thr Ser 165 170 175 : Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly *: 180 185 190 : ·· Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala 195 200 205
Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser 210 215 220
Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gin Lys Leu lie 225 230 235 240 ! Ser Glu Glu Asp Leu Asn / 245 * ,,: (2) INFORMAATIO SEKVENSSISTÄ SEK ID NO: 58: ’·, (i) SEKVENSSIN TUNNUSMERKIT: ’ (A) PITUUS: 101 aminohappoa ! (B) TYYPPI: aminohappo (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 156 113272 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEK ID NO: 58:
Met Ser Asn Thr Gin Ala Glu Arg Ser Ile Ile Gly Met Ile Asp Met 15 10 15
Phe His Lys Tyr Thr Arg Arg Asp Asp Lys Ile Asp Lys Pro Ser Leu 20 25 30
Leu Thr Met Met Lys Glu Asn Phe Pro Asn Phe Leu Ser Ala Cys Asp 35 40 45
Lys Lys Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Asp Vai Phe Glu Lys Lys Asp Lys 50 55 60
Asn Glu Asp Lys Lys Ile Asp Phe Ser Glu Phe Leu Ser Leu Leu Gly 65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Asp Tyr His Lys Gin Ser His Gly Ala Ala Pro Cys 85 90 95
Ser Gly Gly Ser Gin 100 » » - · * t » » i ·

Claims (42)

157 113 2 7 2
1. Menetelmä sellaisen käsitellyn polypeptidimolekyylijoukon tuottamiseksi, jossa esiintyvät konformaatiotilat sisältävät olennaisen osuuden polypeptidimolekyylejä yhdessä erityisessä laskostuneessa konformaatiotilassa, mikä käsitelty joukko tuotetaan alkuperäisestä joukosta polypeptidimolekyylejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin käsitellyllä joukolla polypeptidimolekyylejä, jolloin alkuperäisessä joukossa esiintyvät konformaatiotilat sisältävät olennaisen osuuden polypeptidimolekyylejä laskostumattomissa tai väärin laskostuneis-sa konformaatioissa tunnettu siitä, että alkuperäiseen polypeptidimolekyylijoukkoon kohdistetaan vähintään kolmen peräkkäisen kierroksen sarja, joista kierroksista kukin käsittää peräkkäiset vaiheet 1. vähintään yksi denaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on denaturoiva ja/tai laskokset avaava vaikutus polypeptidijoukon molekyyleihin siten, että osa joukon polypeptideistä denaturoituu ja/tai laskokset avautuvat, mitä seuraa , , 2) vähintään yksi renaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on * » ' · renaturoiva vaikutus polypeptidimolekyyleihin, joiden konfor- * · ’· ·’ maatiot ovat tulosta edellisestä vaiheesta, siten, että osa ; ·* joukon denaturoituneista ja/tai laskostumattomista polypepti- • deistä renaturoituu, » * · : siten, että vähintään kolme peräkkäistä kierrosta on sovitettu niin, että vähintään yhden denaturoivan vaiheen olosuhteet johtavat denaturoitumiseen ja/tai laskosten avautumiseen < · pienemmässä osassa polypeptidijoukkoa kuin denaturoivat olosuhteet sarjan aikaisemmassa denaturoivassa vaiheessa ja ·,'·· että prosessoidussa polypeptidimolekyyli j oukossa on suurempi » "·"· osuus polypeptidimolekyylejä erityisessä laskostuneessa muo- .dossa kuin a) alkuperäisessä joukossa ja » i 113272 158 b) vastaavassa alkuperäisessä joukossa, johon on kohdistettu vain yksi kierros.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että olennainen osuus käsitellyn joukon polypeptidimolekyylejä yhdessä erityisessä laskostuneessa tilassa muodostaa vähintään 5% (w/w) alkuperäisestä polypeptidimolekyylien joukosta.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellyn joukon polypeptidimolekyyleihin kuuluu kysteiinipitoisia molekyylejä, ja käsitelty joukko sisältää olennaisen osuuden polypeptidimolekyylejä, jotka ovat yhdessä erityisessä laskostuneessa muodossa ja joilla lisäksi on identtinen disulfidisidostopologia.
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit ovat molekyylejä, joilla on autenttisen polypeptidin aminohappo-sekvenssin kanssa identtinen aminohapposekvenssi, tai ovat molekyylejä, jotka käsittävät aminohapposekvenssin, joka vastaa autenttisen polypeptidin aminohapposekvenssiä liitet- I ·, tynä yhteen tai kahteen lisäpolypeptidijaksoon.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ' , että autenttisen polypeptidin sekvenssiä vastaava ' ’ aminohapposekvenssi liitetään lisäpolypeptidijaksoon tai jak- : soihin katkaistavan liitoskohdan välityksellä tai samanlaisten i v · tai erilaisten katkaistavien liitoskohtien välityksellä.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetel- i I mä, tunnettu siitä, että sarja käsittää vähintään 5 kierrosta, ,* , kuten vähintään 8, vähintään 10 tai vähintään 25 kierrosta ja ’ · enintään 2000 kierrosta, kuten enintään 1000, enintään 500, tilit enintään 200 kierrosta, enintään 100 tai enintään 50 kierro-·:·*: sta. » · 113272 159
7. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kunkin denaturoivan vaiheen kesto on vähintään 1 millisekunti ja enintään 1 tunti, ja kunkin renaturoivan vaiheen kesto on vähintään 1 sekunti ja enintään 12 tuntia.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kunkin yksittäisen denaturoivan vaiheen denaturoivat olosuhteet pidetään vakaina jokin ajanjakso, ja kunkin yksittäisen renaturoivan vaiheen renaturoivat olosuhteet pidetään vakaina jokin ajanjakso, ja ajanjaksoja, joina olosuhteet pidetään vakaina, erottaa siirtymäjaksot, joiden aikana olosuhteita muutetaan.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheiden, joiden aikana olosuhteet pidetään vakioina, välisten siirtymävaiheiden kesto on 0,1 sekuntia - 12 tuntia.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ajanjakson, jona denaturoivan vaiheen denaturoivat olosuhteet pidetään vakioina, kesto on l:n ja 10 :n minuutin : väliltä, ja ajanjakson, jona renaturoivan vaiheen renaturoivat ♦ * olosuhteet pidetään vakioina, kesto on 1 ja 45 minuutin . ' väliltä. • ·
11. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen : menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit ovat V * denaturoivien ja renaturoivien vaiheiden aikana kosketuksessa nestefaasiin ja nestefaasi on vesifaasi tai orgaaninen faasi. • ·
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, . että polypeptidimolekyylit ovat suljettuina ympäristöön, joka ' ; mahdollistaa nestefaasin muuttamisen tai vaihtamisen ilman, että polypeptidimolekyylit kulkeutuvat mukaan. » » · * t » · . 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidit ovat suljettuina dialyysilaitteeseen tai nestemäiseen kaksifaasijärjestelmään. 160 113272
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit ovat kiinnittyneet kiinteään tai puolikiinteään kantajaan, kuten suodattimen pintaan, onttoon kuituun tai pallosia sisältävään kromatograflamassaan, esim. agaroosi- tai polyakryyliamidigeeliin, kuituiseen selluloosamatriisiin, HPLC- tai FPLC-matriisiin, aineeseen, jonka molekyylit ovat sen kokoisia, että kun polypeptidimolekyylit ovat niihin sitoutuneina niiden ollessa liuenneina tai dispergoituneina nestefaasiin, ne voidaan ottaa talteen suodattimen avulla tai misellejä muodostamaan tai misellien muodostumiseen osallistumaan kykenevän aineen avulla, joka mahdollistaa nestefaasin muuttamiseen tai vaihtamisen misellien kulkeutumatta mukana, tai vesiliukoiseen polymeeriin.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit adsorboituvat kantajaan epäkovalenttisesti sellaisen osansa välityksellä, jolla on affiniteettia kantajan komponenttiin, kuten polypeptidin aminohappo-osaan sitoutuneen biotiiniryhmän tai sen analogin välityksellä, kun kantajassa on avidiinia, streptavidiinia tai : ·. niiden analogeja siihen kiinnittyneenä. . ’ 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ' , että osa on aminohapposekvenssi, joka on identtinen SEK ID NO: 47:lie, ja kantaja käsittää nitrilotriasetaattijohdannaista ί (NTA) varattuna Ni2+-ioneilla. 1 Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen ; ‘ : menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit sisältävät polypeptidijakson, joka kykenee suuntaamaan katkai-.' , sutekijällä suoritettavaa suosivaa katkaisemista spesifiseen ‘ ; peptidisidokseen. 113272 161
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katkaisemista suuntaava polypeptidijakso on sellainen, joka kykenee suuntaamaan spesifiseen peptidisidokseen suosivaa katkaisemista katkaisutekijällä, joka on valittu joukosta, johon kuuluvat syaanibromidi, hydroksyyliamiini, jodosobentsoehappo, N-bromosukkinimidi ja entsyymejä, kuten naudan hyytymistekijä Xa tai sen analogi ja/tai homologi ja naudan enterokinaasi tai sen analogi ja/tai homologi.
19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidijakso, joka suuntaa suosivaa katkaisemista, on sekvenssi, jonka naudan hyytymistekijä Xa tai sen analogi ja/tai homologi, kuten polypeptidijakso, jolla on aminohapposekvenssi, joka on valittu ryhmästä SEK ID NO: 38, SEK ID NO: 40, SEK ID NO: 41 ja SEK ID NO: 42 tunnistaa selektiivisesti.
20. Minkä tahansa edeltävistä patenttihakemuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit käsittävät polypeptidijakson, joka on in vitro -konvertoitavissa derivatisoiduksi polypeptidijaksoksi, joka kykenee suuntaa- : ·. maan katkaisutekijällä suoritettavaa suosivaa katkaisemista spesifiseen peptidisidokseen. * 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ·’ että in vitro -konvertoitava polypeptidijakso on : konvertoitavissa derivatisoiduksi polypeptidijaksoksi, jonka • · naudan hyytymistekijä Xa tai sen analogi ja/tai homologi tunnistaa selektiivisesti.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, .‘ . että in vitro -konvertoitavalla polypeptidijaksolla on » · Ί aminohapposekvenssi, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat ^ : SEK ID NO: 43, SEK ID NO: 44, SEK ID NO: 45 ja SEK ID NO: 46. 1 Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit käsittävät polypeptidisekvenssin, jolla on joko 113272 162 aminohapposekvenssi SEK ID NO: 4 3 tai SEK ID NO: 44, joka on konvertoitu derivatisoiduksi, naudan hyytymistekijän Xa tai sen analogin ja/tai homologin selektiivisesti tunnistamaksi polypeptidiksi antamalla kysteiinitähteen reagoida N-(2-mer-kaptoetyyli)morfolyyli-2-tiopyridyylidisulfidin tai merkapto-tioasetaatti-2-tiopyridyylidisulfidin kanssa, tai aminohapposekvenssi SEK ID NO: 45 tai SEK ID NO: 46, joka on konvertoitu derivatisoiduksi, naudan hyytymistekijän Xa selektiivisesti tunnistamaksi polypeptidiksi hapettamalla metioniinisivuketjun tioeetteriosa sulfoksidi- tai sulfoni-johdannaiseksi.
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 19, 22 tai 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidijakso, joka on valittu ryhmästä SEK ID NO: 38, SEK ID NO: 40, SEK ID NO: 41 ja SEK ID NO: 42 tai valittu ryhmästä SEK ID NO: 43, SEK ID NO: 44, SEK ID NO: 45 ja SEK ID NO: 46 on liitetty autenttisen polypeptidin N-päähän. : ' 25. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 8-24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että olosuhteiden muutos siirtymävaiheen aikana tuotetaan vaihtamalla nestefaasin, • “ johon polypeptidimolekyylit ovat kosketuksissa, kemiallinen koostumus. « ·' 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit denaturoidaan saattamalla polypeptidimolekyylit kosketuksiin sellaisen nestefaasin kanssa, johon on liuenneena vähintään yhtä denaturoivaa ,· > yhdistettä, ja siitä, että polypeptidit renaturoidaan saatta- maila polypeptidimolekyylit kosketuksiin nestefaasin kanssa, 1. joka sisältää joko vähintään yhtä liuennutta denaturoivaa 113272 163 yhdistettä sellaisena pitoisuutena, että kosketus nestefaasiin pyrkii renaturoimaan ennemmin kuin denaturoimaan edellisen vaiheen tuottamissa konformaatiotiloissaan olevia polypeptidi-molekyylejä, tai ei sisällä ollenkaan denaturoivaa yhdistettä.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylien denaturoituminen tuotetaan tai sitä tehostetaan pienentämällä tai suurentamalla nestefaasin pH:ta.
28. Patenttivaatimuksen 26 tai 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että denaturoiva yhdiste on valittu joukosta urea, guanidiini-HCl ja di-Ci_g alkyyliformamidi, kuten dimetyyliformamidi ja di-C^.g-alkyylisulfoni.
29. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 11 - 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yhdessä denaturoivista vaiheista ja/tai vähintään yhdessä renaturoi-vista vaiheista käytettävä nestefaasi sisältää vähintään yhden disulfideja uudelleen järjestävän systeemin. : 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, , ·. että vähintään yksi disulfideja uudelleen järjestävä systeemi » I : * on sellainen, jolla on kyky pelkistää ja/tai uudelleen • i järjestää väärin muodostuneita disulfidisidoksia laskostumattomissa ja/tai väärin laskostuneissa polypepti-• dimolekyyleissä suuremmallla tehokkuudella kuin se pelkistää V* ja/tai uudelleen järjestää oikein muodostuneita disulfidisidoksia laskostumattomissa ja/tai väärin laskos- · : tuneissa polypeptidimolekyyleissä olosuhteissa, jotka ; denaturoivan tekijän pitoisuuden suhteen ovat sellaiset, että laskostumattomat ja/tai väärin laskostuneet proteiinit « · ' \ denaturoituvat. » » · 113272 164
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että disulfideja uudelleen järjestävän systeemin läsnäolo vähintään yhdessä vaiheessa tuottaa pelkistyvien/ uudelleen järjestyvien, alun perin väärin muodostuneiden disulfidi-sidosten suhteellisen määrän ja pelkistyvien/uudelleen järjestyvien, alun perin oikein muodostuneiden disulfidisidosten suhteellisen määrän väliseksi suhteeksi vähintään 1,05.
32. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 29 - 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että disulfideja uudelleen järjestävä systeemi sisältää glutationia, 2-merkaptoetanolia tai tiokoliinia, kukin seoksena vastaavan symmetrisen disulfi-dinsa kanssa.
33. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 11 - 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaikki polypeptidimolekyylien kysteiinitähteet ovat konvertoituneet joko glutationin, tiokoliinin, merkaptoetanolin tai merkaptoetikkahapon sekasulfidituotteiksi vähintään yhden denaturointi/renaturoin-tikierroksen aikana.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ’!.* että kysteiinitähteiden konvertointi sekasulfidituotteiksi # · * · suoritetaan antamalla täysin denaturoituneen ja täysin • ” pelkistyneen polypeptidimolekyylijoukon reagoida ylimäärän t · kanssa reagenttia, joka on runsasenerginen sekadisulfidiyhdis- ; j te. ' · • > ·
35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, : ·’; että runsasenerginen sekadisulfidiyhdiste on alifaattis- aromaattinen. ♦ '· 36. Patenttivaatimuksen 34 tai 35 mukainen menetelmä, tunnettu * siitä, että runsasenergisellä sekadisulfidiyhdisteellä on -I yleinen kaava: * * > » 165 113272 R2 R2-S-S-C-R3 R4 missä Rl on 2-pyridyyli, R2, R3 ja R4 ovat vety tai valinnaisesti substituoitu lyhytketjuinen aromaattinen tai alifaatti-nen hiilivetyryhmä.
37. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 34 - 36 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että runsasenerginen sekadisulfidiyhdiste on valittu ryhmästä, joka koostuu yhdisteistä glutationyyli-2-tiopyridyylidisulfidi, 2-tiokolyyli-2-tiopyridyylidisulfidi, 2-merkaptoetanoli-2-tiopyridyylidisul-fidi ja merkaptoasetaatti-2-tiopyridyylidisulfidi.
38. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 11 - 37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidien renaturoimiseen käytettävän nestefaasin polaarisuutta on modifioitu lisäämällä suolaa, polymeeri ja/tai fluorivety-yhdistettä, kuten : ·, trifluoroetanolia. * · * ·
39. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-24 tai 29 - 38 ' / mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että > · *’ polypeptidimolekyylien denaturointi ja renaturointi tuotetaan : suorilla muutoksilla fysikaalisissa parametreissä, joille ·. · polypeptidimolekyylit on altistettu, kuten lämpötilassa tai paineessa, tai muutoksella fysikaalisissa parametreissä, joka ; tehostaa tai hillitsee denaturoivia ja renaturoivia , olosuhteita, kuten lämpötilassa tai paineessa. • * 40. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, » · että kemialliset nestefaasin muutokset tuotetaan vaihdoksilla i denaturoivan liuoksen B renaturoivan liuoksen A välillä. 113272 166
41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhden tai useamman denaturoivan yhdisteen pitoisuutta B:ssä säädetään kunkin kierroksen jälkeen.
42. Patenttivaatimuksen 41 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhden tai useamman denaturoivan yhdisteen pitoisuutta B:ssä pienennetään kunkin kierroksen jälkeen.
43. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhden tai useamman denaturoivan yhdisteen pitoisuus aineessa B pidetään vakiona kussakin kierroksessa.
44. Minkä tahansa edeltävistä vaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että joukon polypeptidimolekyyleillä on pituus, joka on vähintään 25 aminohappotähdettä ja enintään 5000 aminohappotähdettä.
45. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkuperäisen joukon polypeptidit ovat keinotekoisia polypeptidejä, jotka on tuotettu prokaryoottisoluissa yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. I · * * * ·
46. Patenttivaatimuksen 45 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, * · että alkuperäinen polypeptidimolekyylijoukko on ]* laskostumattomia tai väärin laskostuneita diabodymolekyylejä * » ·' (keinotekoisia kaksoisspesifisiä ja kahdenarvoisia ; : vasta-ainefragmenttejä) tai diabodymolekyylien · monomeerifragmentteja.
47. Menetelmä oikein laskostuneiden diabodymolekyylien tuotta- » miseksi, tunnettu siitä, että alkuperäiseen polypeptidimolekyylijoukkoon, joka käsittää laskostumattomia • ja/tai väärin laskostuneita polypeptidejä, joilla on I · * aminohapposekvenssit, jotka ovat samat kuin diabodymolekyylien ·· monomeerifragmenteillä, kohdistetaan vähintään kahden perättäisen kierroksen sarja, jossa kumpikin kierros käsittää peräkkäiset vaiheet 113272 167 1. vähintään yksi denaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on denaturoiva ja/tai laskokset avaava vaikutus polypeptidijoukon molekyyleihin siten, että osa joukon polypeptideistä denaturoituu, mitä seuraa 2. vähintään yksi renaturoiva vaihe, jonka olosuhteilla on renaturoiva vaikutus polypeptidimolekyyleihin, joiden konfor-maatiot ovat seurausta edellisestä vaiheesta, siten, että osa joukon denaturoituneista ja/tai laskostumattomista polypeptideistä renaturoituu siten, että kierrossarja on sovitettu niin, että olennainen osajoukko alkuperäisestä polypeptidimolekyylijoukosta konvertoituu osajoukoksi oikein laskostuneita diabodymolekyylejä.
48. Patenttivaatimuksen 47 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidimolekyylit ovat kosketuksissa nestefaasiin, joka sisältää vähintään yhden disulfideja uudelleen järjestävän systeemin vähintään yhdessä denaturointi/renatu-rointikierroksessa. t · • · « · * · - » - * · f * t • # » · * · ’ » · * * · ! i · » f » 113272
FI953705A 1993-02-04 1995-08-03 Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä FI113272B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK13093 1993-02-04
DK13093A DK13093D0 (da) 1993-02-04 1993-02-04 Processing of proteins
DK13993 1993-02-05
DK13993A DK13993D0 (da) 1993-02-05 1993-02-05 Processing of proteins
GB9302492 1993-12-03
PCT/GB1993/002492 WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1993-12-03 Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
PCT/DK1994/000054 WO1994018227A2 (en) 1993-02-04 1994-02-04 Improved method for the refolding of proteins
DK9400054 1994-02-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI953705A FI953705A (fi) 1995-08-03
FI953705A0 FI953705A0 (fi) 1995-08-03
FI113272B true FI113272B (fi) 2004-03-31

Family

ID=26063372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953705A FI113272B (fi) 1993-02-04 1995-08-03 Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5739281A (fi)
EP (1) EP0686162B1 (fi)
JP (1) JP3695467B2 (fi)
KR (1) KR100310739B1 (fi)
AT (1) ATE241642T1 (fi)
AU (1) AU674568B2 (fi)
CA (1) CA2155335C (fi)
DE (1) DE69432744T2 (fi)
DK (1) DK0686162T3 (fi)
ES (1) ES2199959T3 (fi)
FI (1) FI113272B (fi)
NO (1) NO316274B1 (fi)
NZ (1) NZ261571A (fi)
WO (1) WO1994018227A2 (fi)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69432744T2 (de) * 1993-02-04 2004-03-25 Borean Pharma A/S Verbessertes verfahren zur rückfaltung der proteine
AU6284896A (en) * 1995-06-22 1997-01-22 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
AU703145B2 (en) * 1995-11-07 1999-03-18 Toshio Tanaka Method for expression cloning of gene encoding ligand-bound protein
EP0917566B1 (de) * 1996-06-11 2004-09-22 Roche Diagnostics GmbH Rekombinante blutgerinnungsproteasen
DE69827507T2 (de) 1997-06-11 2006-03-09 Borean Pharma A/S Trimerisierendes modul
US20030207402A1 (en) * 1997-08-22 2003-11-06 Erhard Kopetzki Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
ES2531551T3 (es) * 2000-04-17 2015-03-17 Dyax Corp. Métodos para construir bibliotecas de presentación de paquetes genéticos para miembros de una familia diversa de péptido
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
AU2001280436A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-21 Eli Lilly And Company Process to increase protein stability
WO2002024929A2 (en) * 2000-09-22 2002-03-28 Ramot At Tel Aviv University Ltd A SOLUBLE BETA 2 MICROGLOBULIN (β2M)/HFE MONOCHAIN FOR BIOTECHNOLOGICAL AND THERAPEUTIC APPLICATIONS
JP4344136B2 (ja) 2000-11-10 2009-10-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・リミテッド アポリポタンパク質類似体
US20040132094A1 (en) 2000-12-13 2004-07-08 Michael Etzerodt Combinatorial libraries of proteins having the scaffold structure of c-type lectinlike domains
ATE431851T1 (de) 2000-12-13 2009-06-15 Anaphore Inc Methode zur identifikation und isolation von peptide die andere moleküle binden aus kombinatorische proteinbibliotheken mit einer c- typ lectin-ähnlichen domäne als gerüststruktur
DE60144063D1 (de) 2000-12-18 2011-03-31 Dyax Corp Gerichtete bibliotheken die genetisch verpackt sind
US20060252917A1 (en) * 2001-02-08 2006-11-09 University Of Utah Methods for refolding conformationally constrained peptides
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
WO2004004662A2 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1382614A1 (en) * 2002-07-15 2004-01-21 Bayer HealthCare AG Process for the purification of interleukin-4 and its muteins
US20040067532A1 (en) * 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US20040072262A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
EP1558640B1 (en) 2002-10-29 2011-04-13 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
AU2003300785A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Incyte Corporation Carbohydrate-associated proteins
ES2427974T3 (es) 2003-04-23 2013-11-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Corte de proteínas de fusión mediante la utilización de la proteasa granzima B
US20100028995A1 (en) * 2004-02-23 2010-02-04 Anaphore, Inc. Tetranectin Trimerizing Polypeptides
EP1745068A4 (en) * 2004-03-30 2009-11-04 Sudershan Biotech Ltd RECOMBINANT CALM CHYMOSIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
EP1805205A1 (en) * 2004-10-22 2007-07-11 Amgen Inc. Methods for refolding polypeptides
ATE509033T1 (de) * 2006-03-20 2011-05-15 Univ California Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting
EP1845103B1 (en) * 2006-04-10 2015-02-25 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Method for refolding a protein
US8940298B2 (en) 2007-09-04 2015-01-27 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting and detection
CA2697193C (en) * 2007-09-14 2017-06-06 Adimab, Inc. Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8324151B2 (en) * 2007-11-20 2012-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Treatment of sepsis and septic shock using ghrelin and growth hormone
US9873957B2 (en) 2008-03-13 2018-01-23 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs
DK2281078T3 (en) 2008-04-24 2015-02-02 Dyax Corp LIBRARIES OF RE-PACKAGES INCLUDING UNKNOWN HC-CDR1, -CDR2 AND -CDR3 AND UNKNOWN LC-CDR1, -CDR2 AND-CDR3 DESIGNS
US10865233B2 (en) * 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
WO2011032181A2 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
US8796431B2 (en) 2009-11-09 2014-08-05 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Efficient production of peptides
AU2011279073B2 (en) 2010-07-16 2016-06-09 Adimab, Llc Antibody libraries
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
EP2441776A1 (en) 2010-10-15 2012-04-18 Leadartis, S.L. Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen XVIII trimerization domain
EP2646465B1 (en) 2010-10-15 2018-09-12 Leadartis, S.L. Generation of multifunctional and multivalent polypeptide complexes with collagen xviii trimerization domain
EP3164417A1 (en) 2014-07-01 2017-05-10 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
CA3004148A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. An nkg2d-ig fusion protein for cancer immunotherapy
WO2019234187A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Leadartis, S.L. Trimeric polypeptide complexes and uses thereof
WO2022184937A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Leadartis, S.L. Trimeric polypeptides and uses thereof in the treatment of cancer

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
ATE107356T1 (de) * 1983-03-25 1994-07-15 Celltech Ltd Verfahren zur herstellung eines proteins.
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
GB8508340D0 (en) * 1985-03-29 1985-05-09 Creighton T E Production of protein
US4656255A (en) * 1985-09-09 1987-04-07 International Minerals & Chemical Corp. Protein recovery
CA1340522C (en) * 1987-03-10 1999-05-04 Heinz Dobeli Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification
US5074977A (en) * 1987-05-05 1991-12-24 The Washington Technology Center Digital biosensors and method of using same
US4999422A (en) * 1988-04-15 1991-03-12 Biogen, N.V. Continuous method of refolding proteins
US5231168A (en) * 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DK0432419T3 (da) * 1989-12-05 1994-11-14 American Cyanamid Co Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration
US5324436A (en) * 1991-12-13 1994-06-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Use of hydrate formation to control membrane mimetic systems
DE69432744T2 (de) * 1993-02-04 2004-03-25 Borean Pharma A/S Verbessertes verfahren zur rückfaltung der proteine

Also Published As

Publication number Publication date
KR100310739B1 (ko) 2002-05-30
NO952989L (no) 1995-10-03
NZ261571A (en) 1997-03-24
CA2155335C (en) 2001-06-05
NO952989D0 (no) 1995-07-28
FI953705A (fi) 1995-08-03
NO316274B1 (no) 2004-01-05
JP3695467B2 (ja) 2005-09-14
DK0686162T3 (da) 2003-09-22
JPH08506243A (ja) 1996-07-09
WO1994018227A3 (en) 1994-10-13
KR960701083A (ko) 1996-02-24
EP0686162A1 (en) 1995-12-13
CA2155335A1 (en) 1994-08-18
ES2199959T3 (es) 2004-03-01
EP0686162B1 (en) 2003-05-28
ATE241642T1 (de) 2003-06-15
DE69432744D1 (de) 2003-07-03
US5917018A (en) 1999-06-29
AU674568B2 (en) 1997-01-02
DE69432744T2 (de) 2004-03-25
AU6038094A (en) 1994-08-29
US5739281A (en) 1998-04-14
WO1994018227A2 (en) 1994-08-18
FI953705A0 (fi) 1995-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI113272B (fi) Parannettu proteiinien laskostamismenetelmä
JP7290305B2 (ja) 例外的なスプライシング活性を有するスプリットインテイン
JP6591511B2 (ja) スプリットインテイン、複合体およびそれらの使用
CA1339208C (en) Fusion proteins containing a hinge region for enhanced cleavage
Clonis Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop
CN101186940B (zh) 获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素或胰岛素衍生物的方法
US5302526A (en) Recombinant DNA enclosed amphiphilic leader sequences for the production and purification of fusion proteins
EP0305481A1 (en) LEADER SHARES FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS.
CN109072203B (zh) 镜像核酸复制体系
Jonasson et al. Single‐step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide
CN101985470B (zh) 胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用
CN102199214A (zh) 制备蛋白质的方法
WO1999007735A2 (en) Recombinant expression of insulin c-peptide
EP0437544A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
JPH07505626A (ja) 修飾タンパク質の製造方法
JP4088584B2 (ja) 融合タンパク質から目的タンパク質を分離する方法。
Moser et al. Applications of synthetic peptides
EP0527778B1 (en) Improved process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process
JP2561122B2 (ja) 機能性ポリペプチド
JPH07502723A (ja) 組み替えトランスフェリン、トランスフェリン半−分子、及びそれらの突然変異体
KR100535265B1 (ko) 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법
JPH03219892A (ja) タンパク質の製造法
Gutte et al. Design of polypeptides
JPH03506039A (ja) 転移防止性ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: ROCHE BIO DENMARK A/S

Free format text: ROCHE BIO DENMARK A/S

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: BOREAN PHARMA APS

Free format text: BOREAN PHARMA APS

Owner name: F.HOFFMANN-LA ROCHE LTD.

Free format text: F.HOFFMANN-LA ROCHE LTD.

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: F. HOFFMANN-LA ROCHE LTD.

Free format text: F. HOFFMANN-LA ROCHE LTD.

Owner name: ANAPHORE, INC.

Free format text: ANAPHORE, INC.

MM Patent lapsed